WO2004061115A1

WO2004061115A1 - 免疫機能を有する可溶性β−グルカンの製造方法及び用途

Info

Publication number: WO2004061115A1
Application number: PCT/JP2003/016979
Authority: WO
Inventors: Shu Uemura; Teruhisa Kaneko; Chihiro Kaise; Robert Nakamura; John Vercellotti; Sharon Vercellotti
Original assignee: IMMUDYNE JAPAN Inc
Current assignee: IMMUDYNE JAPAN Inc
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2003-12-26
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2005-06-27
Also published as: JP2004210895A

Abstract

疫機能を有する可溶性β−グルカンの効果的な製造方法と顕著に優れた皮膚老化防止効果をもつ皮膚化粧料を提供する。β−グルカナーゼを用いて免疫機能を有する可溶性β−グルカン（可溶性酵母ベータ１，３／１，６−Ｄ−グルカン・酵母及び／又は酵母抽出物）を製造し、これを皮膚化粧料に用いる。

Description

明細書免疫機能を^ る可溶性 )3—クレカンの法及び用途

棚分野

本発明は艇機能を衬る可溶性 —ダルカンの方法及びその用途に関し、特に優れた皮膚老化防止機能をもつ皮膚化粧料とそれに用いるに適する免疫機能を有する可溶性 /3 一グルカンの S 方法に関する。

背景謹

グルカンはグルコースを構鮮位とする多糖類である。 β— (1， 6)分岐した )3— (1, 3) ダルカン。ン酵 §^他の酵母種、キノコ、植物およぴ々のバクテリア、；類や藻類 (Chemi s t ry and B i o l ogy o f (1→3) — β-G 1 u c an s, B. A. S t one and A. E. C l a rke, 1992, La Tr obe U n i v e r s i t y P r e s s, Au s t o r a l i aで総説されている）から抽出される天然にる多糖類種である。 β- (1, 6) 分岐した) 3— (1， 3) ダルカンは免疫碰およびコレステロール低下能を ί鹏することが示されてきた。酵母は少なくとも 3種の ;3—ダルカンを合る；難員状 3— 1, 3—D—ダルカン、麵状 /3— 1, 6— D—ダルカンそして β— (1, 6) 分岐した ]3— (1, 3) グルカン。しかし、直鎖状 — 1， 3- D—グルカン、直鎖状 ;3— 1， 6— D—ダルカンはマクロファ一ジや NK細胞あるいは好中球を活性化しないか、するとしても極僅かである。

多糖類種としての iS— (1， 6) 分岐した /3_ (1， 3) グルカンは、グルコースを単位とした連結 illと（1→6) 3配糖体化リンケージにより ¾1に結合する分險買から成る。酵母 — （1， 6) 分岐した /3— (1, 3) ダルカンは、 β— (1→6) 配糖体化リンケ一ジで糸給した数個の比較的短い側鎖（10%あるいはそ; Π¾下）をィ腊する（1→3) /3配糖体化リンケージで糸給したダルコ一スを単位とした員（90%ぁるぃはそ上）から成るのがほとんどである；このダルカンの化学名はポリ一（1， 3) — 3— D—ダルコピラノシリレー（1, 6) 一一D—クレコピラノースである。ベータグルカンには種々の異なつたタイプがある。それら員の糸！^、分岐タイプ、モノマ一タイプあるいは置換基で変化 •し、それはきわめて異なる物理的、生物学的特性を示す多糖類を生み出す。

β— 1, 3/1， 6— D—ダルカンは、脊椎動物と同様に無脊椎動物の免疫システムを活性化することが知られているが、酵母由来の i3— 1, 3/1， 6 _D—ダルカンがマクロファージ、 NK細胞及 ϋ¾子中球を活性化する上で最も効果的である。酵母由来の ;3グルカンはマクロファージの細胞膜表面にある特異的受容体に結合することで免疫システムを活性化する。活性化されたマクロファージはそれらの食細胞能や殺菌能と同様に様々なサイトカインの生産を増加させる。マクロファージゃ ΝΚ細胞の機能が羅されると、それらは酵母 iS グルカンの多数の有益な効果を司るようになれる。たとえば、細菌、ビールス、カビゃ原虫類の寄生による感染症への抵抗力を向上させることが"！?きる。さらに、マクロファージゃ N K細胞の機能が腿されると、それらは悪 'f»慮に対して宿主の關卩能を向上させることができる。

パン酵母あるいはビール酵母（ビール酵母菌)、同様に他の酵母から単離された3—1， 3/1, 6—D—グルカンは不溶性である。さらには /3— 1, 3/1， 6—D—ダルカンが側鎖を持った iS_ 1, 3/1， 6— D—グルカンなのか i3—l, 3— D_ダルカンと i3— 1, 6 _D—クレカンの混合物なのか、あるいはすベてのそれら 3種の 3—クレカンの混合物なのかどう力ゝを決 ¾ ることは、（酵母は嫌 3したように少なくともそれら 3種の /3—グルカンすべてを作りだす） ^ J能ではないが、 /3 - 1， 6側鎖の数の変異性により極端に溶解性が悪くなつている。分岐の ]3— 1, 3/1， 6— D—グルカンのみがマクロファ一ジを活性化するので、糸艘の高い /3— 1, 3/1, 6— D—ダルカンを用いることが望ましい。一方、不溶性 i3— 1， 3/1, 6— D—グルカンは非経口や局所投与鶴 IJへ処方組みすることは難しぐまた、経皮吸収もされにくいため、その効果を発揮させるには処方上の制限がある。可溶性グルカンの S¾iについても検討がなされている（特表平 5— 503952号公及び特表平 6— 107702号公報）が、可溶性の離カ坏十分であったり免疫機能がないカ坏十分である等の欠点をもっと共に、その用途も創傷治歸轉の医薬用途に限られている。一方、雞溶性3—グルカンを配合した皮膚化粧料は知られており、本出願人も既に驗している（特願 2000— 390953号)。しかし徹知られた化粧料用の膽容性 i3—ダルカンは配合が困難であるだけでなく皮膚老化防 lh¾¾ (荒れ肌改^ ¾果、角質改皆効果、タ —ンオーバ一避を正常化する効果、しわ防 ¾果）が必ずしも十分ではなぐ配^^の取り扱いが容易で優れた皮膚老化防止効果をもつ皮膚化粧料の開発がく求められている。発明の目的

本発明の目的は上記した術の問題点を解決することにある。

本発明の第 1の目的は免疫機能を有する可溶性 i3—ダル力ンの効果的な製造方法を提供することにある。

本発明の第 2の目的は取り扱いが容易にして ¾に優れた皮膚老化防 ¾果をもつ皮膚ィ匕 ffi料を提供することにある。

発明の開示

本発明は、第 1に、酵母由来の3—ダルカンの精纏程で3—ダルカナーゼを用いることを !敷とする免疫機能をる可溶性 iS—グルカン（可溶性酵母べ一夕 1 , 3Z1 , 6 -D —ダルカン.酵母及び Z又は酵母抽出物）の $¾ 方法にある。

本発明は、第 2に、機能を^ Tる可溶性 /3—グルカン（可溶性酵母べ一夕 1， 3/ 1 , 6— D—ダル力ン .酵母及び Z又は酵母抽出物）を含^ Tることを樹敷とする皮膚化粧料にある。

発明の実施の形 ϋ

本発明において「可溶 ttJと¾溶性と同義であり、棚において室温の水に溶解（コロイド状も含む）することをいう。棚難は化粧料の齢 1重量％でよい。換討れば Ϊ又得した β—グルカン含有物が室温で 1重量％濃度で水に完全に又はコロイド状に安定に溶解 (分散) するもの〖鉢発明にいう「可溶 ffij の規定に包含される。典型的には取得した] 3 ーグルカン含有物中における免疫機能を衬る可溶性酵母 /3—1， 3/ 1 , 6— D—ダル力ンの含有量が 9 5〜； L 0 0重量％のものが包含される。この可溶性酵母 i3 _ l , 3/ 1 , 6 —D—グリレカンの分は 2 5 0 0〜6 0 0 0 0であることが好ましい。

本発明の纖方法は酵母由来の纖（不溶' 14) 3—グルカンを精製する過程で加水響素として |3—ダルカナ一ゼを用いることに繊を^ る。

精製 i3—ダルカンをもたらす酵母（酵母抽出物も含む）は口られた麓のものを用いることができる。具体的には、酵母生菌体そのもの、酵母菌体を乾燥粉末化したものおよび酵母菌体を自己消化、熱水抽出、 mi iY , 酵素等の適当な条件下で可溶化、抽出、精製等を行つた可溶性の酵母エキス等が含まれる。

酵母には、酵母 jS— 1, 3グルカン、酵母 0—1, 3/1, 6—D—グルカン、ならびにビール酵母、パン酵母等 S acchar omy c e s属その他があり、また酵母抽出物を得る、鶴な菌体の破藝理として物理学的、ィ匕^ 0勺、生化学的方法が删されうる。本発明では、原料となる菌イ極、起源や抽出方法、精嫩、処理藤の S 法を問わず、 ί& に選択、棚できる。中でも、市販されている酵母の乾燥粉末、酵母エキスが扱いやすぐまた容易に入手でき蟒 (Jである。上記の酵酵母抽出物には、通常蛋白質、脂質、 m 有機酸、ビタミン、アミノ酸、核酸関»!質 ^用な^が含まれている。

本発明で用いるに適した酵母は分子量 2500〜40万以下、好ましくは 2500〜6万禾號からなる i3— 1, 3グルカン、 β— 1， 3/1, 6—D—グルカン、ならびにビール酵母、パン酵母等 S accharomyce s属その他が挙げられ、その J は 95 %以上のものである。

以下に、本発明の^ i方法の典型例について説明する。

酵働田胞を塩基性下で処理した後、不溶' 1 ' 紛を水で洗浄し、次いで酸で処理する。さらにその歹紛を ]3—ダルカナーゼで処理する。別法として、酵溺田月纖を酸で処理し、 7Kで洗浄し、次いで麵纏酸ナトリウムで処理する。その歹紛を洗浄した後、 /3—ダルカナーゼで処理する。酵素処理混合物を遠心分離し、その酵素処理歹紛は麟する。上澄みを 100， 000ダルトンの見かけの^ ^量カツト能を持つ膜を通してろ過し、高 "量と低^ *に分る。この後、 »物を 1000ダルトンの ^?4を持つ膜を通してろ過、？廳し、 β — 1， 3/1, 6-D-グルカンを析出させ、真空オーブン等での乾燥前に無水アルコールで洗浄する。

免疫機能を¾1"る可溶性 j8— 1， 3/1, 6— D—ダルカンは酵母あるいは /3— 1, 3/ 1 , 6-D-グルカンを含む他の微生物から次のようにして S¾tすることができる。

ここで述べる^ t工程は、マクロファージの活性化能（免疫機能）を保持する ίδ^ΐ*可溶性 )6— 1， 3/1, 6— D—クレカンの製造に関するものである。：^機をする可溶性 /3— 1, 3/1， 6— D—ダルカンの纖は、まず /3—ダルカンの成分をするためアルカリと酸性溶 /3— 1， 3/1, 6— D—グルカンを含る（酵鶴田胞ゃ酵母壁から成る）糸！！謝本を処理する。これにより酵素の作用に禾拥できる ;3—ダルカンが得られる。この処理の後、溶解した ;8— 1， 3X1, 6— D—ダルカンの ;3—ダルカナーゼによる酵素加水^^と精製を行う。ここで不純物の β―グルカンが除かれる。

上記の製造工程をまとめると次のようになる。

a. 酵働田胞あるいは酵纖田胞壁が /3— 1, 3,1, 6—D—グルカンを可溶化せず、細胞のアル力リ可溶性成分を可溶化する加温下に塩理する。

b. 7洗後、 β - 1' 3/1, 6— D—ダルカンを含 ¾ る歹纷を加温下に酸処理する。別の方法としては、

a-1. 酵删膽を醒理する。

b-1. 水洗後、 β-1, 3/1， 6— D—グレカンを含る歹紛を、酸ナトリウムで処理する。

c τΚ洗後、 bあるいは b—l中の歹紛をで酵母由来の —ダルカナ一ゼにより加水する。

d. 混合物を遠心分離し、歹紛は藤する。

e. 酵素^ »された /3—グルカンを含 ¾ る上澄みを、見かけの ¾¾ット能たとえば 1 00, 000ダルトンを持つ膜を通してろ過する。次いで、翻勿中の) 3—ダルカンを以下の gのように処理し、コロイド状一 1, 3/1, 6— D—ダルカンを得る。

f · 溶出液を見かけの^ *カツト能たとえば 1000ダルトンを持つ膜を通して過する。そして、ィ; ^勿を以下の gように処理し、可溶性 )3—ダルカンを得る。

g . eから ίまでのを?雄し、 100 %ェタノールでけん濁する。

h. 物をエタノールで洗浄し、慰喿する。もし必要なら、異なる ίΗ¾カット能を持つ H の膜を通してろ過することで、あるいはクロマトグラフィーによりさらに精製、分画することもできる。

酵溺田胞あるいは酵扇田胞壁全体を、アルカリ裔夜に分散し加熱する。その際のアルカリ τΚ溶液としては、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、たとえば、水酸化ナトリゥムゃ水酸化カリウムの 0. 05〜1 ONの水赚が好ましく用いられる。この工程は、 4°C 〜150°Cので行われるが、好ましくは約 80°Cで行われる。また、その工程雄常の i j , あるいは加圧下に行われるが、約 1 5パスカル Z1 2 rcが特に好ましい。処理時間は、通常 1 0分〜 4 8時間であるが、アルカリ^^ 、 ffi iK本の種類にも依^ る。一度アルカリ処理を行った後に、歹紛を適切な手段、たとえば理ゃ遠心分離などによって、水溶ら分寫 1 "る。このアルカリ処理は、 1回でも数回繰り返してもよい。歹紛又は酵碰田胞壁を 1回ないし数回水洗浄し、次いで、 «、ギ酸、酢酸などの酸によつて処理する。 ρ Η= 1〜5の酸性^ 、通常 4。 (：〜 1 5 0°Cで、 1 5分から 4 8時間処理する。特に 3 %の酢酉 ΙτΚ溶^ 8 5°C、 4 5分間処理を行い、抽出することが好ましい。不溶性の原料ーグルカン）は、適切な工程により、溶液から分 TTる。歹纷は、水で 1 回ないし数回洗い、適切な手段で再 it ^離を行う。

次いで残物を 1 5〜 7 5 %の次亜塩素酸ナトリゥムにより 4 ° (：〜 1 5 0 °Cで 1 5分から

4 8分間処理して取り出す。残分は、水で 1回ないし数回洗浄する。

歹紛を β一ダルカナ一ゼ，素で通常 1 0 °C〜 8 0 で 1 5分から 4 8時間処理する。この条件は、 ^^と激夜优態、酵素 ¾に依 fる。可溶性酵素消化分は、遠心分離や ¾¾1などの適切な方法により非消化原料から分 ITTる。可溶性消ィ [^料は!^議ゃク口マトグラフィ—、讀縛の方法により分画する。

かくして^ ¾機能をる可溶性、 ίδ^ΐΜ (2 5 0 0〜6万）の ]3— 1， 3/ 1 , 6 _ D—グルカンを取得することができる。これまでの S8t^法では約 1 6 %のマンノース等や不純物となりうる（搬機能を示さない））3—ダルカンが含有されるという問題点を有していたが、、本発明により免疫機能をる可溶性酵母) 3— 1 , 3/ 1 , 6 - D—グルカンが 9

5 %以上という高糸艘で含る可溶性 ;3—グルカンを取得すること力河能となった。

次に本発明の皮膚化粧料について説明する。

本発明の皮膚化粧料は、可溶性 |3—ダルカン（酵母及び Z又は酵母抽出物）を必須分として含有し、好ましくはリポゾ一 »として及び Z又は海？罙層水、皮膚化粧料に常用される成分を配合し、調製される。

本発明の皮膚化粧料は、その形態は、特に P腕されず、例えば、乳液、クリーム、化 ffi7_K、パック、洗顔料、マッサージ料などのスキンケア製品ならびにボディ用化粧料や乳化ファンデ一シヨン等の製品、医薬部外品等を挙げること力きる。いずれも水性であることが好ましい。化粧料の剤形も任意であり、例えば、可溶化系乳化剤形あるいは分 βの剤形をとることカ^きる。

本発明の皮膚化粧料において、可溶性 /3 -グルカンは 0. 0 0 1〜1 %配合すればよい。可溶性 /3—グルカンの配^ *が 0. 0 0 1 %未満では、可溶性 i3 _ダルカン特有の免疫活性向上効果が有 ¾1に発揮されず、また 1 %を越えて酉己合すると、変色、などの安定性に影響を及ぼす可能性があり、好ましくない。

本発明の皮膚化粧料に任意)^として配合される成分の例としては、油剤、粉体、界面活 '隐精低級アルコール、高肝化合物、ゲル化剤、紫外線吸籠紫外線散乱剤、酸化防 lh¾ 色素、防腐剤、香料、美容成分等の通常の化粧料に常用されている成分があり、これらを本発明の効果を損なわない範囲で MS択して用いることができる。

リポソ一ムの膜形 /¾基材としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、スフインゴミエリン、卵黄レシチン、 ^ a レシチン等の天然もしくは合成のリン脂質また〖脉素添加リン脂質、コレステロール類、たとえばコレステロール、コレステロールのアルキルエステル、フィトステロール、フィトステロールのアルキルエステル、グリセ口糖脂質、セチルガラクトサイドの如きァシルダルコシド、ジァルキル型合赫面活' I4 、 N—ァシルースフインゴシン又はその硫酸エステル、 N—ァシルスフィンゴ糖脂質、 N—高級ァシルダルタチオンの一種また tt^S以上の混合物が挙げられる。この他、リボソームの安定化もしくは相転移の改善のために飾アルコ —ル、高級アルコール、高,徹旨肪酸等を必要に応じて配合できる。

海消罙層水は、表面海水が沈降していて層を形成しているもので低温、清浄で栄養塩に富む固有水であり、その ¾τΚ海域は 1 0 0 0〜4 0 0 0 m、好ましくは 2 0 0 0〜3 0 0 0 m であり、取水深度は 2 5 0〜5 0 0m、好ましくは 3 0 0〜4 0 0 mである。海洋深層水は、数知れない多くのミネラルを含有していることから、保湿性に優れ、また、？¾Sf生に優れていることから、化粧料に配合させている成分の皮膚内への?通を促すと考えられる。海觸層水の配^ *は通常 4 0 - 9 9 %であり、好ましくは 5 0〜 6 0 %である。

好ましい任意の酉己合成分をさらに具体的に説明する。油脂類としては、ホホパ、油、ヒマシ油、ォリーブ油、油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、ミンク油、タートル油等が挙げられる。

炭化水素類としては、 «Iパラフィン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス、スクヮラン等が挙げられる。

ロウ類としては、ミツロウ、ラノリン、カルナバロウ、キャンデリラロゥ等が挙げられる。月旨肪酸としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ォレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸等が、挙げられる。

合成エステル類としては、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ォレイン酸プチル、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸ォクチルドデシル、モノステアリン酸プロピレングリコール、？ L酸ミリスチル、リンゴ酸イソステアリル、モノステアリン酸グリセリン、塩化ジステアリルジメチルァンモニゥム等が挙げられる。

油脂類、炭化水素、ロウ類、月旨肪酸、合成エステは、通常あわせて。〜 5 Ow/w% の割合で配合される。

アルコール類としては、エタノール、 1， 3—ブチレングリコール、プロピレングリコール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、ォレイルアルコール等が挙げられる。

アルコール類は、通常 0〜1 OwZw%の割合で配合される。

界面活' I4^|Jとしては、グリセリン脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリォキシエチレン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリォキシエチレンアルキルェ一テル類、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、ポリオキシェチレン硬化ヒマシ油、ラウリル硫酸ナトリウム、ピログルタミン酸イソステアリン酸ポリオキシエチレンダリセリル、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリゥム、ポリォキシエチレンステァリルエーテル、ジアルキルスルホコハク酸、臭化セチルピリジニゥム、塩化— n—ォク夕デシルトリメチルアンモニゥム、モノアルキルリン酸、 N—ァシルスル夕ミン酸、 N—ァシルグルタミン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレ一ト、ポリォキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリゥム、ポリォキシエチレン ¾ラノリン等が挙げられる。界面活' 14^1は、通常 0〜2w/w%の割合で配合させる。

増粘剤としては、力ルポキシビ二ルポリマー、メチルポリシロキサン、デキストラン、力ルポキシメチルセルロース、カラギーンナン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等が挙げられる。

増粘剤は、通常 0〜 1 wZw%の割合で配合される。

保湿剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、 1 , 3—ブチレングリコ一ル、プ口グルタミン酸、ァセチルダルタミン酸、ヒアルロン酸、プロシァニジン等が挙げられる。保湿剤は、通常。〜 5 w/w%の割合で配合される。

防腐剤としては、安息香酸、サリチル酸、デヒドロ酢酸あるいはそれらの塩類、パラォキシ安息香酸エステル類のフエノール類、トリク口サンハロカルバン等カ攀げられる。

防腐剤は、通常 0〜0 · 3wZw%の割合で配合される。

香料は、通常化粧料にィ魏するものであればどのような香料を用いてもよい。

顔料としては、酸化鉄、二酸化チタン、酸ィ bffi鉛、カオリン、タルク等が挙げられる。鎮料は、通常 0〜 1 wZw%の割合で配合される。

觀 IJとしては、小麦油、ビタミン A、ビタミン B 2、ビタミン E、アスコリレビン酸一 2—リン酸マグネシウムあるいはナトリウム、 D—パントテールアルコール、グリチルリチン酸ジカリウム、ダルタチオン、 UV吸収剤、キレート剤、植物抽出物、微生物代謝物 Z抽出物等が挙げられる。

W , 通常 0〜 3 w/w%の割合で配合される。

水性謝の水としては、水道水、ミネラルウォーター、かん水、海水、超純水、極¾¾<由

¾ - ^ 精製水等が挙げられる。水は任意の割合で配合される。

酵母、酵母抽出液、なかでも酵母細胞壁である —ダルカンは、 ^mi動 I'生の高い高織造を有しているため、 T細胞、補体系などの免疫増強に関わる種々の細胞や活性化や増量が報告されており、錦な生物活性を持っているが、その一方で、物質、肝レベルでの作用 ¾|冓の角科斤は、ほとんどなされていない。しかし、皮膚免疫で主要な働きをするのは表皮ランゲル八ンス細胞であり、これは、外部からの等があると、その情報を Τ細胞に伝えるという提示機能を持つ。したがって、この Τ細胞をるものを化粧料に配合することは、 »の敲を中心としたケアによる老化防止とは異なり、生体系そのものの免疫機能の向上を示すものである。また、これらに皮膚への? ¾t性の高い海 ^層水、さらには保湿、柔果を有する成分ゃ抗酸化力を有する成分を配合することで皮膚免疫機能の一度の向上を図ることが^ =きる。

«の皮膚老化防止化粧料は、（季節的変化による）肌荒れや、皮膚機能の一時的な低下により生じる皮膚トラカレ等を中心に作用するものであつたが、近年増加する義肌人間等の生体系全体の失調に起因する腦れには、その人の生体系全体のバランスを改善する必要がある。本発明の P跪された) S—ダルカンを配合した皮膚化粧料は、艘系に作用し、生体系のバランスを肌機能内部より改善するものである。勿論その人体への影響は非常に線口なものである。

本発明の皮膚化粧料は徹用いられていた難溶性一グルカンでは配合不可能であった水溶性および透明な剤形の水性化粧料（たとえば化に関しても、配合可能となり、化粧料剤形を選ばずに用いることがij能である。また皮膚への霞に優れており、藤に優れた皮膚老化防果を示す。

さらに、低の β―グルカンを用いることにより、そのリポソームへの率が飛躍的に向上し、 β—ダルカンをより多く搬したリボソーム «の調製が初めて可能となる。これにより、 iS—ダルカンの皮膚への? 1¾量ならびに？！ MSヵ梗に向上し、より高いスキンケア効果（保湿、はり、しわ、皮膚のターンオーバー等）を得ること力河能となる。

実施例

次に本発明を実施例によって例証するが、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例 1 ：

酵胞からの可溶性 iS— 1 , 3/ 1 , 6— D—グレカンの調製

酵働睏に 1 0倍量の 1. 5 Nの水酸化ナトリゥムを攪拌下で添加し、次いで混合物を 6 0°Cで 3 0分間加熱を行った。この加熱混合物を、 1 5分間 1 5 p s iで 1 2 Cの条件の下、オートクレープで処理を行った。その後、加熱混合物を冷却し、遠心分離を行い、上澄みを歹紛から分離した。残分を、 1 0倍量の水で 1 5分間攪拌しながら、 zK洗した。遠心分離によって上澄み液を分離した後、 3 7°Cで 1 0倍量の 3 %酢 ¾ _Κ謹を加え、 8 5°Cで 4 5分間纖拌を行った。その後、混合物をし、遠心分離にて上澄みを歹紛から分離した。この譲の /3— 1, 3/1, 6— D—グルカン歹紛を、 15分間攪拌しながら水洗した。酵鶴細纏を 37°Cで 10倍量の 3%のアセトン水溶処理し、歹纷を添加し 85°Cに加温し 45分間攪拌した。水で残分を洗浄した後、 15-75 %の次亜: *酸ナトリゥムで処理した。（好ましい条件は 20%の濃度で、温度が 4〜150°C、更に好ましくは 50°C で 15分から 48時間の処理である）歹纷を数回水洗した。

粗製（不溶'附の /3— 1， 3/1， 6— D—グルカンを、 3倍量の水に分散し、 40 でさらに 20〜25倍量の水に满口した。この混合' 夜に、 NovoNard i sk, Far nk 1 i t on, N. C. より '購入した V i s c o zyme L-β-Ι, 3/1, 6— D —ダルカナ一ゼ (B i oc a t a lys t s Ltd. Pon ty r i dd, UK製の T P654/2 Pその他の /3—ダルカナーゼでもよい）を 100m 1加え、 80 で加赛機拌した。次いでこの蜀液を 100000ダルトンの ίΗ¾をカツトするフィルターを備えた糸纖隹状フィルターを通して分離した。これを 10時間繰り返し行い、常に 80°Cの水を通す

(加える) ことで、反応管内を一定舗に保った。濾過物を 10時間以 ¾镜的に集めた。ィ翻をコロイド状の 0— 1， 3/1, 6— D—グルカンを調製するために用いた。減つていく糖の量は、 1リットルごとに採取した ½¾i物内で確認した。濾過物を、 1 500の ^Τ*をカットする中空の繊佳内を通して分画し、塩や低^ «の色素、糖を透析した。透析は、外側の中空繊隹を水速 800ml /m i ηの速さで通して水を汲み上げることで行った。そして 10Β寺間後、 14. 5リットルの險物を採取した。 Ρ跳濾過物を逆浸透膜で濃縮し、次いでロータリ一エバポレイターによって?謹した。 10倍量の 95% エタノールで键過物を一日免御することで、 β-1, 3/1, 6— D_ダルカンを?顱宿品から物として得た。

物を集め、 95%エタノールで洗诤し、乾燥した。（髓機能を有する完全可溶性 jS — 1， 3/1, 6 - D—グルカン：^? ¾3、布 4141〜250208、平均籽量 =47 457ダルトン、分散率 =1. 43。このうち 75%は 37121〜83902ダリレトンの範囲の^ ¾であった） ' ΛΙ 00000のカツト能を持つ膜の保論からの3— 1， 3 /1, 6—D—グルカンを 10倍量の 95%エタノールを用いて、一晩中低温下で灕宿し限外濾過物から沈降させた。耀物を集め 95%エタノールで洗浄し、乾燥した（コロイド状の β -グルカン；： ^布 13148〜473616タレトン、平均: 1474 20ダルトン、、散率 =1. 90。このうち 75%は 91510〜256863タレトンの範囲の: であった)。

乾燥した沈殿物は、さらにクロマトグラフィー（親和力、透析、クロマトなど)、または様々な^ ¾を選択! ^できるフィル夕一を用いた透析などによって精製される。

完全可溶性 /3— 1, 3/1, 6— D—ダルカンの物性値を示す。

免疫機能をる可溶性 /3—1， 3/1, 6—D—グルカンの物性値

^ Μ: 12000— 60000タリレトン

可溶性； 2. 5 gm/ml

水中での色；明るいベージュ

280 nmでの ¾¾¾ ; 2632

1%水溶液の pH 7. 0

β— 1, 3結合％ 83

β - 1, 6結合％ 17

β-l, 4 ％無し（測定不能)

実施例 2：

雄例 1の方法に従つた方法で調製した繊機能を^ る可溶性 β―ダル力ン約

50000タレトン）を 0. 05 %配合した化 ¾τΚを作成し、女性 100人の顔に朝晚、 8 週間^した結果を示す。なお、本試験は被^¹としてスペシャリストを起用し、細人が棚後どのように感じたカゝをモニタ一した結果である

(処方例. 1) 酵母抽出物（可溶性 —ダルカン；

肝量約 50000タレトン） 0. 05

赤ワイン酵母抽出液 0. 1

海觀層水（逆浸透膜麵済み） 50. 0 レシチン 1. 0

コレステロール 0. 5

才レイン酸 0. 5

グリセリン 3. 0

1, 3—ブチレングリコール 7. 0

L—アルギニン 0. 25

飽和脂肪酸グリセリル 1. 0

グリセリン脂肪酸エステル 1. 5

高級アルコール 0. 5

雜アルコール脂肪酸エステル 0. 5

保湿剤 0. 5

防腐剤 0. 5

を 100に調整

® 方法は、定法に従い調製し、乳液とした。

なお、ここで用いた海消荣層水（逆疆縢慮過済み）とは、海荣層水原水を逆羅膨慮過によって処理された水である。

功果改善率 (%)

28日後（4週間衝 56日後（8週間^)

64% 80%

肌のはり 45% 68%

肌のこじわ 22% 66%

以上の結果から明らかなように、約 4週間の使用で半分以上の人が肌の保湿感の改善効果があると ¾ し、さらに 8週間 ί®1することで 80%の人が保湿感の改奢効果が見られることがわかった。

また、肌のはりに関しても 8週間翻することによって半分以上の人に改善が見られ肌の小皺においてはかなりの改善が認められた。

実施例 3：実施例 1の方法に従った方法で調製した可溶性グルカン約 8 0 0 0〜1 0 0

0 0ダルトン）を0. 0 5 %配合した乳液を作成し、女性 1 0 0人の顔に朝晩、 8週間使用したのち、その肌のしわ状態を目視によりを行い、改善度合いをグラフにした結果を図 1に示す。（なお、は雄例 2に示したとおりである。）

グラフからも明らカよように、 8週間の細によって、肌におけるしわ力溝くなり改善されたことがわかった。

実施例 4：

実施例 1の方法に従つた方法で調製した可溶性ダル力ン钓 1 0 0 0 0ダルトン）を 0. 0 5 %配合した乳液を作成し、女 I生 1 0 0人の顔に朝晩、 8週間使用したのち、その肌表面の怃態をレプリカに取り、改善率を検討した結果を図²に示す。（なお、は実施例 2に示したとおりである。）

いずれの場合においても、使用前には確認された斜めに存在している f i n e w r

1 n k 1 eの線が、翻後 8週間後には殆ど目立たなくなつていることがわかり、肌の保麵果が善され、 f i n e w r i n k 1 eが目立たなくなつていることがわかつた。

難例 5：

実施例 1の方法に従つた方法で調製した可溶' I生クレカン ½H¾約 5 0 0 0 0夕レ卜ン）を 0. 0 5 %配合した乳液を作成し、女性 1 0 0人の顔に朝晩、 8週間使用したのち、その肌の角質層の状態に関して、テープストリッピング試験を行い、その改善率につき検討を行った結果を図 3に示す。（なお、処方は実施例 2に示したとおりである。）このテープストリツビングの結果から、いずれのにおいても、翻前にはケラチノサイトの被が認されたが、使用後 8週間後には殆ど目立たなくなつていることがわかり、角質層が健常な状態に改善されていることがわかった。

なお、ケラチノサイトの部分が多く; i¾Tるほど角質層の重層剥離を示しており、肌状態は健常でないことを示す。

実施例 6：

実施例 1の方法に従った方法で調製した可溶性ダルカン約 5 0 0 0 0ダルトン）を 0. 0 5 %配合した乳液を作成し、女性 1 0人の上腕に朝晩、 4週間翻したのち、その肌のターンオーバーの状態について、テープストリッピング法により試験を行つた。その改善率の結果を図 4に示す。（なお、処方は実施例 2に示したとおりである。）テープストリッビングによって採取した角質層を顕微鏡でした結果にも示されるように、予め肌を荒らした態では角質層の重層剥離（色が濃くなつている部分）が見られその後何も塗布しなぃ態では肌細胞の態は更に匕し、細胞の核までが黒点状になってみられたが、可溶性 )3—グルカンを配合した乳液を塗; flfTることにより、その角質層の犹態は改善され健常な肌態に近づき、角質層のターン才ーパ、一が、 «されていることがわかった。

図面の簡単な説明

図 1は実施例 3のしわの改善結果（目視による）を示すグラフ。

図 2は実施例 4のしわの改善結果（レプリカによる鶴）を示すグラフ。

図 3は実施例 5の角質層の改善結果を示すグラフ。

図 4は実施例 6の角歸田胞の改善結果を示すダラフ。

Claims

請求の範囲

1. 酵母由来の β—ダル力ンの精 M程で /3—ダルカナーゼを用いることを樹敫とする免疫機能をる可溶性 jS—グルカン（可溶性酵母べ一夕 1， 3Z 1 , 6—D—ダルカン.酵母及び/又は酵母抽出物）の法。

2. 免疫機能を ¾Tる可溶性 /3—グルカン（可溶性酵母ベータ 1 , 3/ 1 , 6— D— グルカン .酵母及び ζ又は酵母抽出物）を含^ ることを精敷とする皮膚化粧料。

3. 水敝膚化粧料である請求項 2記載の皮膚化粧料。

4. リポソーム分散液の状態にある請求項 2又は 3記載の皮膚化粧料。

5. さらに海洋深層水を含有する請求項 2〜 4のレ ^ずれか 1項記載の皮膚化粧料。