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WO2004060904A1 - Pyrroles substitues avec des oligonucleotides - Google Patents

Pyrroles substitues avec des oligonucleotides Download PDF

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Publication number
WO2004060904A1
WO2004060904A1 PCT/FR2003/003747 FR0303747W WO2004060904A1 WO 2004060904 A1 WO2004060904 A1 WO 2004060904A1 FR 0303747 W FR0303747 W FR 0303747W WO 2004060904 A1 WO2004060904 A1 WO 2004060904A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substituted
pyrrole
oligonucleotides
oligonucleotide
pyrroles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2003/003747
Other languages
English (en)
Inventor
Bernard Mandrand
Daniela Zsoldos
Alain Laurent
Carole Chaix
Nicolas Spinelli
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Apibio SAS
Original Assignee
Biomerieux SA
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Apibio SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Apibio SAS filed Critical Biomerieux SA
Priority to EP03814482A priority Critical patent/EP1578759A1/fr
Priority to JP2004564281A priority patent/JP2006518334A/ja
Priority to AU2003300628A priority patent/AU2003300628A1/en
Priority to US10/536,317 priority patent/US7446186B2/en
Publication of WO2004060904A1 publication Critical patent/WO2004060904A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to new pyrrole derivatives allowing the immobilization and the addressing of oligonucleotides by electropolymerization.
  • the invention also relates to the electroactive polymers thus obtained, as well as to their methods of use for the detection, identification and determination of analytes in a sample.
  • Conjugated polymers such as polypyrroles and their derivatives, are well known for their conductive and electroactive nature. It is also known that polypyrroles retain their conductivity and their electroactivity when certain pyrrole cycles are substituted in position 3 or 4 with functional groups. Polymers bearing this type of functional group are described in WO-A1- 95/29199, Garnier et al. (Synthetic Metals, 100: 89-94, 1999) Ho-Hoang et al. (Synthetic Metals, 62: 277-280, 1994), Ho-Hoang et al. (J. Mater. Chem., 6 (7), 1107-1112, 1996), and Korri-Youssoufi et al. (Materials Science and Engineering, C15, 265-268, 2001). Different anti-ligands can then be grafted onto the functional groups carried by the polypyrroles.
  • WO-A1 -95/29199 describes the synthesis of a precursor polypyrrole from the electrochemical polymerization of pyrroles substituted in position 3 of the pyrrole nucleus with functional groups.
  • This precursor polymer is deposited by electrochemical polymerization on a conductive substrate or in the form of a self-supporting film.
  • an anti-ligand such as a polynucleotide or a peptide is chemically grafted onto the functional groups of the precursor polymer.
  • the polymer thus obtained retains its conductive and electroactive properties.
  • These polymers can therefore be used to detect an analyte which interacts specifically with the anti-ligand grafted onto the polymer by measuring a potential difference or a current variation.
  • WO-A1 -00/77523 also describes the chemical grafting of an anti-ligand, such as an oligonucleotide, onto a precursor polymer carrying functional groups.
  • the polymers thus obtained can be used as biological sensors or "biosensors" for the capture and detection of an analyte.
  • the possibility of detecting an analyte, such as a molecule of biological interest, in a sample by a simple electrical measurement constitutes the main advantage of these polymers.
  • the processes for the preparation of these polymers involve chemical grafting which does not allow the synthesis in parallel of a large number of polymers carrying different anti-ligands.
  • the preparation of anti-matrices ligands require the immobilization and addressing of a large number of different anti-ligands.
  • the manufacture of "biochips" or DNA chips thus involves the immobilization and addressing of arrays of oligonucleotides on solid supports.
  • the methods of chemical grafting of oligonucleotides onto a precursor polymer do not make it possible to obtain ordered arrays of oligonucleotides.
  • EP-B1-0 691 978 and EP-B1-0912 593 also describe substituted pyrroles on which different ligands, such as oligonucleotides, are grafted onto the nitrogen of the pyrrole nucleus.
  • substituted pyrroles used as monomers, are electrochemically copolymerized with unsubstituted pyrrole.
  • the copolymers obtained also have the drawback of having weak conductive and electroactive properties.
  • the present invention provides new pyrroles substituted elsewhere than on the nitrogen atom by groups carrying oligonucleotides. These new substituted pyrroles allow the synthesis of copolymers by electrochemical polymerization when they are used as monomers, alone or in admixture with other monomers. The polymers or copolymers obtained are conductive and electroactive. Pyrroles substituted with oligonucleotides according to the invention offer the possibility of addressing and immobilizing oligonucleotides in a single step by polymerization electrochemical.
  • the copolymers according to the invention therefore make it possible to prepare ordered arrays of oligonucleotides. These matrices are particularly interesting tools for diagnosis and for the serial screening of molecules.
  • the copolymers according to the invention have electroactive properties for the detection by an electrical measurement of an analyte capable of interacting specifically with the oligonucleotides carried by the copolymer.
  • the present invention relates to pyrroles substituted with groups carrying an oligonucleotide. These substituted pyrroles according to the invention are defined below as “pyrrole substituted with an oligonucleotide” or “substituted pyrrole according to the invention".
  • a first object of the present invention is a pyrrole substituted with an oligonucleotide characterized in that it corresponds to the general formula (I):
  • Ri represents an oligonucleotide
  • Y represents S or O
  • X represents a spacer arm
  • spacer arm means a chemical group which allows the oligonucleotide to be moved away from the pyrrole nucleus.
  • the spacer arms are well known to those skilled in the art, any spacer arm making it possible to preserve the conductive and electroactive properties of the polymer can be used in the substituted pyrroles according to the invention.
  • the spacer arm represents a reduced bulk so as not to interfere with the polymerization of the substituted pyrrole.
  • X represents a spacer arm chosen from - (CH 2 ) lake- O-, - (CH 2 ) p -O - [(CH 2 ) 2 -O] q -, - (CH 2 ) r -CO-NR '- (CH 2 ) r - O-, - (CH 2 ) r -NCH 3 - (CH 2 > -O-, - (CH 2 ) r -CO-NR'- [(CH 2 ) 2 -O] s -, - (CH 2 ) r -NCH 3 - [(CH 2 ) 2 -
  • n is an integer between 1 and 5
  • p is an integer between 1 and 2
  • q is an integer between 1 and 4
  • r is an integer between 1 and 3
  • r ' is an integer between 1 and 3
  • s is an integer between 1 and 3
  • n, p, q, r, r' and s are the same or different, the pyrrole cycle is substituted in position 2, 3, 4 or 5.
  • oligonucleotide designates a sequence of at least 2 ⁇ ucleotides (deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or both), natural or modified, capable of hybridizing, under appropriate conditions of hybridization, with an oligonucleotide at least partially complementary.
  • nucleoside is meant an organic compound consisting of a purine or pyrimidine base linked to a ose (ribose or deoxyribose).
  • nucleotide is meant an organic compound consisting of a purine or pyrimidine base linked to a ose (ribose or deoxyribose) and to a phosphate group.
  • modified nucleotide is meant, for example, a nucleotide comprising a modified base and / or comprising a modification at the level of the internucleotide bond and / or at the level of the skeleton.
  • a modified base mention may be made of inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine and bromo-5-deoxyuridine.
  • modified internucleotide bond mention may be made of the phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate and alkylphosphotriester bonds.
  • alpha-oligonucleotides such as those described in FR-A-2 607 507 and the PNAs which are the subject of the article by M. Egholm et al. (J. Am. Chem. Soc, 114, 1895-1897, 1992) are examples of oligonucleotides consisting of nucleotides whose skeleton is modified.
  • the oligonucleotide is linked to the spacer arm by a phosphodiester bond. More specifically, the 3'-OH or 5'-OH of the oligonucleotide is linked to the atom oxygen from the spacer arm via a phosphorylated group.
  • the oligonucleotide comprises 2-70 nucleotides, preferably 20 nucleotides.
  • the oligonucleotide comprises, at the end linked to the spacer arm, a polynucleotide of sequence TTTTT comprising from 5 to 10 T, preferably 10 T.
  • TTTTT polynucleotide of sequence
  • This polyT allows the separation of the part of the analyte specific oligonucleotide to be detected from the pyrrole cycle.
  • the present invention also relates to a pyrrole substituted with an oligonucleotide of general formula (II):
  • Ri, Y and X are as described above.
  • X is - (CH) n -O- and n is equal to 2.
  • the present invention also relates to a pyrrole substituted with an oligonucleotide of general formula (III):
  • Ri, Y and X are as described above.
  • X is - (CH 2 ) n -O- and n is 2.
  • Another object of the present invention consists in methods for preparing an electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides comprising the following steps: a) there is at least one monomer chosen from pyrroles substituted with an oligonucleotide according to the invention of general formula (II), b) there is at least one monomer chosen from substituted pyrroles capable of copolymerizing with other pyrroles, c) the monomer of step a) is electrochemically copolymerized with the monomer of step b).
  • X is - (CH) n -O- and n is equal to 2 in the pyrrole substituted with an oligonucleotide of general formula (II).
  • the molar ratio between the pyrrole substituted with an oligonucleotide of general formula (II) according to the invention and the substituted pyrrole of step b) is from 1/1000 to 1/100000.
  • this molar ratio is from 1/5000 to 1/20000. Even more preferably, this molar ratio is 1/20000.
  • the term “monomer” means a chemical unit capable of a chemical or electrochemical polymerization reaction with other monomers to form a polymer.
  • polymerization is understood to mean a chemical or electrochemical reaction of units of the same chemical nature allowing the assembly of a certain number of monomers to form a macromolecule (nx M - »(M) n ). It is typically the condensation of pyrrole units to form the polypyrrole.
  • copolymerization means the simultaneous polymerization of different units, such as, for example, the simultaneous polymerization of a mixture of pyrrole substituted by groups not comprising oligonucleotides and of substituted pyrroles according to the invention.
  • electroropolymerization electrochemical reaction of units of the same chemical nature allowing the assembly of a certain number of monomers to form a macromolecule (nx M - »(M) n ). It is typically the condensation of pyrrole units to form the polypyrrole.
  • copolymerization means the simultaneous polymerization of different units, such as, for example, the simultaneous polymerization of a mixture of pyrrole substituted by groups not comprising oligon
  • Electropolymerization and “electrochemical polymerization” designate an electrochemical polymerization. Electropolymerization processes are well known to those skilled in the art. Examples include the techniques of cyclic voltammetry, chronopotentiometry (imposed current) and chronoamperometry (imposed potential). In a particular embodiment of the invention, the deposits are produced by chronoamperometry or deposit with controlled potential. This method consists in imposing a potential jump from the potential equilibrium (zero current) up to a fixed value at which the reaction takes place at the electrode and to measure the current as a function of time.
  • substituted pyrrole capable of polymerizing with other pyrroles means a pyrrole substituted in position 3 or 4 of the pyrrole ring which is capable of polymerizing or copolymerizing with other pyrroles in positions 2 and 5 and more particularly to copolymerize with pyrroles substituted with oligonucleotides according to the invention.
  • substituted pyrroles capable of polymerizing with other pyrroles, carry groups representing a molecular bulk sufficiently small to not interfere in a polymerization or copolymerization reaction. Typically, these substituted pyrroles do not carry substituent groups comprising oligonucleotides.
  • pyrroles substituted in position 3 or 4 of the pyrrole cycle with groups of small bulk allow, after polymerization or copolymerization with other pyrroles, to obtain conductive and electroactive polymers.
  • Substituted pyrroles capable of polymerizing with other pyrroles to form conductive polymers are well known to those skilled in the art and widely described in the literature. These include WO-A1-95 / 29199, Garnier et al. (Synthetic Metals, 100: 89-94, 1999) Ho-Hoang et al. (Synthetic Metals, 62: 277-280, 1994), Ho-Hoang et al. (J. Mater.
  • the pyrroles substituted with an oligonucleotide (ODN) according to the invention are copolymerized with the 3- (hydroxyethyl) pyrrole.
  • the substituted pyrrole capable of polymerizing with other pyrroles is therefore 3- (hydroxyethyl) pyrrole.
  • the electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides resulting from this copolymerization is shown below.
  • the copolymer functionalized with oligonucleotides is deposited or formed on a first conductive and electroactive polymer.
  • a first substituted pyrrole is polymerized or coploymerized to form a prefilm or a thin sublayer of conductive and electroactive polymer.
  • a second layer is produced with the copolymer functionalized with oligonucleotides.
  • the present invention therefore also relates to a process for the preparation of an electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides comprising the following steps: a) at least one monomer is chosen from substituted pyrroles capable of polymerizing with other pyrroles , b) this monomer from step a) is electrochemically polymerized to form a first electroactive conductive polymer, c) there is a monomer chosen from pyrroles substituted with an oligonucleotide of general formula (II), d) there is d '' at least one monomer chosen from substituted pyrroles capable of polymerizing with other pyrroles, e) the monomer of step c) is electrochemically copolymerized with the monomer of step d) on said first electroactive conductive polymer formed at l step b) to obtain an electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides.
  • the molar ratio between the substituted pyrrole from step c) and the substituted pyrrole from step d) is 1/20000.
  • the substituted pyrrole from step a) and from step d) is the
  • the invention also relates to a process for preparing an electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides comprising the following steps: a) at least one monomer chosen from substituted pyrroles capable of polymerizing with other pyrroles is available, b) this monomer from step a) is electrochemically polymerized to form a first electroactive conductive polymer, c) a monomer chosen from pyrroles substituted with an oligonucleotide of general formula (II) is available, d) the monomer is electrochemically polymerized step c) on said first electroactive conductive polymer formed in step b) to obtain an electroactive conductive polymer functionalized with oligonucleotides.
  • the substituted pyrrole from step a) is 3-
  • the present invention also relates to a process for the preparation of an electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides comprising the following steps: a) at least one monomer chosen from substituted pyrroles capable of polymerizing with other pyrroles is available, b) this monomer of step a is electrochemically polymerized to form a first electroactive conductive polymer, c) a pyrrole substituted with an oligonucleotide according to the general formula (III) is available, d) the substituted pyrrole of the is electrochemically coupled step c) on the first electroactive conductive polymer formed in step b) to obtain an electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides.
  • the substituted pyrrole from step a) is 3- (hydroxyethyl) pyrrole.
  • the pyrrole substituted with an oligonucleotide according to the invention is substituted in position 2 or 5 of the pyrrole ring, it is not capable of polymerizing or of copolymerizing with other pyrroles.
  • the pyrroles substituted with an oligonucleotide (ODN) of general formula (III) are therefore electrochemically coupled to a first electroactive conductive polymer of poly [3- (hydroxyethyl) pyrrole].
  • ODN oligonucleotide
  • the pyrrole substituted with an oligonucleotide according to the invention is therefore found at the end of the polymer chain.
  • the electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides resulting from this copolymerization is shown below.
  • Another object of the present invention consists of electroactive conductive copolymers functionalized with oligonucleotides capable of being obtained by a process according to the invention.
  • copolymers according to the invention are functionalized with oligonucleotides. These oligonucleotides are covalently grafted onto certain monomer units (pyrrole rings) forming the polymer, thus providing an additional function to these electroactive conductive polymers. Copolymers functionalized with oligonucleotides are for example suitable for the capture and detection of analytes.
  • conductive polymer is understood to mean a polymer whose electrons are highly delocalized, most often along a chain of single and double bonds (conjugate bonds), which leads it to behave like a micro-semiconductor. electronic.
  • electroactive polymer means a polymer whose electrochemical response is modified when an analyte interacts specifically with the oligonucleotides carried by the polymer. Thus, a modification of the electrochemical signal is observed following the specific interaction with the analyte.
  • the electroactive conductive copolymer therefore translates the interaction with the analyte into a modified electrochemical signal.
  • copolymers according to the invention can be used in all applications in which oligonucleotides are addressed and immobilized on a solid support.
  • the polymers according to the invention are obtained in the form of self-supporting films or in the form of a film on an electrode.
  • the electrode in fact makes it possible to control, by measuring the current delivered during the reaction, the progress of the polymerization reaction.
  • the electrode also makes it possible to measure the subsequent electrochemical responses of the copolymer.
  • the present invention therefore also relates to an electrode comprising a conductive support coated on the surface with at least one electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides according to the invention.
  • Conductive supports for electrodes are known from the state of the art, in particular, substrates made of metal or carbon derivatives.
  • the copolymer is generally deposited on the conductive support.
  • the electrochemical copolymerization is advantageously carried out on the surface of the electrode to obtain an electrode comprising a conductive support coated on the surface with a copolymer according to the invention.
  • the electrode is obtained by depositing a layer of copolymer on the surface of a gold or platinum support.
  • pyrroles substituted with an oligonucleotide according to the present invention allow the immobilization and the addressing of oligonucleotides on small surfaces.
  • This addressed electrocopolymerization makes it possible to produce a matrix of miniaturized and ordered points, each of the points carrying a defined oligonucleotide.
  • the invention therefore also relates to an electrode array.
  • the invention therefore also relates to an electrode matrix comprising at least one electrode according to the invention.
  • the different electrodes of the matrix carry different oligonucleotides.
  • the invention relates to a plurality of electrodes or microelectrodes fixed on a solid support, these electrodes are coated with a copolymer according to the invention and advantageously carry different oligonucleotides.
  • Such electrode arrays can advantageously be obtained by addressed electropolymerization of pyrroles substituted with an oligonucleotide according to the invention.
  • the copolymers, the electrodes and the electrode arrays according to the invention are in particular usable for the detection of analytes capable of being present in a sample and capable of reacting specifically with the oligonucleotides carried by the copolymer.
  • the invention therefore also relates to devices for detecting an analyte in a sample comprising at least one copolymer according to the invention and / or at least one electrode according to the invention.
  • the invention also relates to devices for detecting an analyte in a sample comprising at least one electrode array according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for detecting an analyte in a sample comprising the following steps: a) there is an electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides according to the invention or an electrode comprising a conductive support coated with an electroactive conductive copolymer functionalized with oligonucleotides according to the invention, b) the electroactive copolymer or the electrode of step a) is brought into contact with the sample under reaction conditions suitable for the specific interaction of the analyte with said oligonucleotides; c) the analyte, linked to said oligonucleotides, is detected by means of an electrical measurement.
  • the invention therefore relates to the use of a copolymer, an electrode or an electrode matrix according to the invention for detecting an analyte capable of being present in a sample and capable of interacting specifically with oligonucleotides according to the invention.
  • analyte means any molecule capable of interacting specifically with oligonucleotides and therefore capable of being detected with a copolymer according to the invention.
  • This analyte can be, for example, a biomolecule such as for example a protein, a peptide, a lipid, a steroid, a sugar or even a nucleic acid.
  • the oligonucleotide carried by the copolymer is specific for the analyte to be detected.
  • the oligonucleotide and the analyte to be detected form an anti-ligand / ligand pair (DNA / DNA, RNA / DNA, RNA / RNA or DNA / protein for example).
  • the present invention makes it possible to detect an analyte in any type of sample.
  • the sample is a biological sample.
  • this sample may have been taken from a patient for diagnostic purposes.
  • the sample can be, for example, urine, blood, serum, plasma, cell extracts or a body fluid.
  • a DNA and / or an RNA specifically hybridizing to the oligonucleotides of the electroactive conductive copolymer according to the invention is detected.
  • the copolymer of the present invention is an electroactive copolymer whose electrochemical response will be modified when an analyte interacts specifically with the oligonucleotides carried by the polymer.
  • the electroactive conductive copolymer according to the invention therefore translates the interaction with the analyte into an electrochemical signal.
  • the specific interaction of an analyte with the oligonucleotides carried by the copolymer generates a modification of the electro-chemical response of the copolymer studied with respect to a reference copolymer.
  • the detection of the analyte is therefore carried out by an electrical measurement.
  • the term "electrical measurement” means the measurement of a variation of potentiometric type such as the variation of the oxidation potential of the polymer or the measurement of a variation of amperometric type by variation of the oxidation current observed at a given potential. These variations are measured quickly, sensibly and quantitatively according to methods well known to those skilled in the art.
  • the electrical measurement consists in measuring a variation in potential or a variation in current.
  • cyclic voltammetry is used. It is an electroanalytical method which consists in scanning a range of potential in one direction then in the other, at constant speed. The voltammogram obtained gives the current response of the electrochemical system studied and allows its characterization.
  • the detection of the specific interaction between the analyte and the oligonucleotides carried by the copolymer can be done with the electrode which served for the electropolymerization of the polymer.
  • the hybridization of a nucleic acid complementary to the oligonucleotides of the copolymer can be detected by electrical measurement on the electrode which supports the copolymer according to the invention.
  • Another object of the present invention consists of a substituted pyrrole of general formula (IN):
  • R is a protecting group for the amine.
  • Different protecting groups for the amine can be used in the substituted pyrroles according to the invention. These amine protecting groups are well known to those skilled in the art (Kocienski P.J., Thieme Publishing Group, 1994; Hanson J.R., Protecting Groups in Organic Synthesis,
  • the amine protecting group is chosen from monomethoxytrityl, dimethoxytrityl, tosyle, triisopopyl silyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl and acetyl.
  • R 3 is a phosphorus group capable of reacting with a free hydroxyl group.
  • R 3 is chosen from a phosphotriester, H-phosphonate or phosphoramidite group,
  • X represents a spacer arm chosen from - (CH 2 ) n -O-, - (CH 2 ) p -O - [(CH 2 ) 2 -O] q -, -
  • R ' represents -H or -CH 3 , n is an integer between 1 and 5, p is an integer between 1 and 2, q is an integer between 1 and 4, r is an integer between 1 and 3, r 'is an integer between 1 and 3, s is an integer between 1 and 3, n, p, q, r, r' and s are the same or different, the pyrrole ring is substituted for position 2, 3, 4 or 5.
  • the invention relates to a substituted pyrrole of general formula (N):
  • R is a protecting group for the amine.
  • R 2 is chosen from monomethoxytrityl, dimethoxytrityl, tosyle, triisopropyl silyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl and acetyl.
  • R 3 is a phosphorus group capable of reacting with a free hydroxyl group.
  • R 3 is chosen from a phosphotriester, H-phosphonate or phosphoramidite group,
  • X represents a spacer arm chosen from - (CH 2 ) n -O-, - (CH 2 ) p -O - [(CH 2 ) 2 -O] q -, -
  • R ' represents -H or -CH 3 , n is an integer between 1 and 5, p is an integer between 1 and 2, q is an integer between 1 and 4, r is an integer between 1 and 3, r 'is an integer between 1 and 3, s is an integer between 1 and 3, n, p, q, r, r' and s are the same or different.
  • R 2 represents the monomethoxytrityl.
  • R 3 represents a phosporamidite group.
  • X represents - (CH 2 ) n -O- and n is equal to 2.
  • the substituted pyrrole corresponds to the general formula (NI):
  • R 2 is an amine protecting group, preferably chosen from monomethoxytrityl, dimethoxytrityl, tosyl, triisopropyl silyl, tert-butoxycarbonyl, 9-fluorenyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl and acetyl,
  • R 3 is a phosphorus group capable of reacting with a free hydroxyl group.
  • R is chosen from a phosphotriester, H-phosphonate or phosphoramidite group
  • X represents a spacer arm chosen from - (CH 2 ) n -O-, - (CH 2 ) p -O - [(CH 2 ) -O] q -, -
  • R ' represents -H or -CH
  • n is an integer between 1 and 5
  • p is an integer between 1 and 2
  • q is an integer between 1 and 4
  • r is an integer between 1 and 3
  • r ' is an integer between 1 and 3
  • s is an integer between 1 and 3
  • n, p, q, r, r' and s are the same or different.
  • R 2 represents the monomethoxytrityl.
  • R 3 represents a phosporamidite group.
  • X represents - (CH) n -O- and n is equal to 2.
  • Another object of the present invention consists in a process for the preparation of a pyrrole substituted with an oligonucleotide of general formula (I)
  • Ri, X and Y are as defined above, comprising the following steps: a) the synthesis cycles of an oligonucleotide are carried out, b) in the last synthesis cycle of said oligonucleotide, a substituted pyrrole of formula general (IN)
  • R, R 3 and X are as defined above in the last nucleotide 5 'or 3' of said oligonucleotide; c) said protective group R 2 is cleaved.
  • the protective group R 2 is the monomethoxytrityl and in step c) this protective group is cleaved by treatment in an acid medium.
  • the protective group R is the monomethoxytrityl and the oligonucleotide is purified by reverse phase chromatography before cleaving the protective group in step c).
  • substitution of a substituted pyrrole of general formula (IN) is carried out following the synthesis cycles of the oligonucleotide.
  • the nucleotide is replaced by a substituted pyrrole of general formula (IN).
  • the last nucleotide of this cycle is replaced by a substituted pyrrole of formula (IN) according to the invention in which the phosphorus group is an H-phosphonate.
  • the last nucleotide of this chain is replaced by the substituted pyrrole of formula (IV) according to the invention in which the phosphorus group is a phosphoramidite.
  • the free hydroxyl at the 5 ′ or 3 ′ end of the oligonucleotide reacts with the reactive phosphorus (phosphodiester, phosphoramidite, H-phosphonate) of the substituted pyrrole of general formula (IN).
  • Figure 1 Chromatograms of the oligonucleotide 5'OH before and after the incorporation of l- [ ⁇ - (tosyl)] - 3- [7-O- (2-cyanoethyl- ⁇ , N diisopropylphosphoramidityl) hydroxyethyl].
  • Figure 2 Monitoring by HPLC of the cleavage of the Tosyle group.
  • Fig 2 A Sequence of the oligonucleotide: 5 'Pyrrole Tosyl- ttt ttt ttt ttgg ce tga cga tac agc ta, Rt: 14.9 min.
  • oligonucleotides 5 'Pyrrole Tosyl- ttt ttt ttt ttgg ce tga cga tac agc ta (20%), Rt: 15.25 min, 5' Pyrrole - ttt ttt ttt ttgg ce tga cga tac agc ta (80%) , Rt: 13.48 min after 24 h in 0.5 M NaOH solution at 55 ° C.
  • Figure 3 Chromatogram of the purified oligonucleotide carrying the pyrrole substituted in 3 and synthesized from the pyrrole monomer carrying MMT.
  • Oligonucleotide sequence 5 'Pyrrole - at etc ggg aat etc aat gtt ag, Rt: 17.6 min.
  • Figure 5 Cyclic voltammetry curve of an electrode modified by a polymer film of 3- (hydroxyethyl) pyrrole transferred into the monomer-free electrolyte.
  • Figure 7 Cyclic voltammetry curve of an electrode modified by a film of pyrrole -ODN in 3 on a pre-film of 3- (hydroxyethyl) pyrrole, transferred into the electrolyte solution free of monomers.
  • Figure 8 Modification of the electrochemical signal of the modified electrode subjected to different media.
  • Figure 9 Cyclic voltammetry curve of an electrode modified by a copolymer on a prefilm transferred into the electrolyte solution free of monomers.
  • Figure 10 Modification of the electrochemical signal of the modified electrode subjected to different media.
  • Figure 11 Modification of the electrochemical signal of the electrode modified by a copolymer subjected to different media.
  • 1- (N-tosyl) -3- (hydroxyethyl) pyrrole was carried out as described by Korri-Youssoufi et al., Materials Science and Engineering C15 (2001) 265-268.
  • 1- (N-tosyl) pyrrole was synthesized from pyrrole using tosyl chloride in the presence of a strong base, potassium tert-butoxide.
  • the 1- (N-tosyl) -3- (hydroxyethyl) pyrrole (50 mg, 187.5 ⁇ mol, leq.) was coevaporated 3 times with anhydrous acetonitrile, then it was dissolved in 1 ml of acetonitrile.
  • the flask was placed under an inert atmosphere and 68 ⁇ L (48 mg, 375 ⁇ mol, 2 eq.) Of DIPEA (diisopropylethylamine) were added.
  • Chlorophosphine (48 ⁇ L, 72 mg, 275 ⁇ mol, 1.1 eq.) was added dropwise and the whole was left under stirring for 5 min.
  • the reaction mixture was then concentrated by half on a rotary evaporator and was deposited on a column of silica gel poured in a cyclohexane / triethylamine mixture (99: 1) and rinsed with cyclohexane.
  • the product was then eluted with a cyclohexane / ethyl acetate mixture (90:10). Then the good fractions were combined and concentrated.
  • the yellow oil obtained was taken up in acetonitrile, filtered through a 0.22 ⁇ M PVDF millex filter and reconcentrated to obtain 120 mg (205 ⁇ mol, 68%) of product.
  • the tosyl group was introduced in position 1 of 2-acetyl pyrrole by reaction with tosyl chloride, at 0 ° C. in dichloromethane, in the presence of n-butylammonium sulfate and sodium hydroxide. Then, methyl 2- [2- (1-tosyl-pyrrole)] acetate was obtained by oxidative transposition, using thallium nitrate in the presence of montmorillonite. A reduction step with LiBH leads to the desired product, 1- (N-tosyî) -2- (hydroxyethyl) pyrrole. The overall yield of the synthesis was 3%.
  • oligonucleotide was synthesized on a solid support (Controlled pore glass, CPG) by the phosphoramidite method described by Beaucage and Lyer, (Tetrahedron, 48, 223-2311, 1992).
  • the first nucleoside of the sequence to be synthesized is attached to the solid support (CPG) in the 3 'position, the 5' OH end of the nucleoside being protected by an acid labile dimethoxytrityl group (DMT).
  • CPG Controlled pore glass
  • DMT acid labile dimethoxytrityl group
  • an acid treatment (tri or dichloroacetic acid) makes it possible to remove the DMT group in order to generate the reactive 5 'OH end.
  • a second “coupling” step the phosphoramidite of the base to be added is condensed on this first nucleoside in order to generate a phosphite triester bond. Condensation takes place in the presence of a catalyst (tetrazole or S-thio ethyl tetrazole, or DCI, or 7)
  • the phosphite triester bond is oxidized to the phosphate triester bond by an oxidizing treatment (aqueous iodine).
  • the phosphite triester bond can also be oxidized by the Beaucage reagent in solution in acetonitrile to give a phosphorothioate triester bond.
  • Steps 1 to 4 are repeated as many times as necessary depending on the length of the sequence to be synthesized. . These 4 stages constitute a cycle of synthesis.
  • the solid support on which the oligonucleotide is located is incubated in a concentrated aqueous ammonia solution in order to cleave the oligonucleotide from the support, to deprotect the bases and the phosphate groups.
  • Example 8 Incorporation of pyrrole substituted in position 3. protected on nitrogen by a tosyl group. at the 5 'end of an oligonucleotide
  • a final synthesis cycle was carried out using the pyrrole monomer, 1- [N- (tosyl)] - 3- [7-O- (2-cyanoethyl-NNdiisopropylphosphoramidityl) hydroxyethyl] pyrrole, the synthesis of which is described in Example 3 above.
  • This monomer was used in exactly the same conditions as a conventional nucleotide synthon, with the only difference of the coupling time which is 15 minutes instead of 1.3 minutes in order to take into account possible incorporation problems.
  • the reaction scheme is shown below. After deprotection in 30% aqueous ammonia (16h at 55 ° C), the crude oligonucleotide was analyzed by ion exchange HPLC ( Figure 1).
  • Figure 1 shows the coinjection of oligo with and without pyrrole to highlight the incorporation. (Gradient from 400 to 640 mM NaCl in 20 min, Gen Pack Fax TM column (WATERS TM), 0.75 ml / min).
  • FIG. 2 represents the cleavage of tosyl in 0.5 M NaOH medium, 55 ° C. (Gradient from 440 to 680 mM NaCl in 20 min. Gen Pack Fax TM column (WATERS TM), 0.75 ml / min).
  • the sodium hydroxide can be eliminated by simple precipitation with acetone, and used as such for the copolymerization experiments.
  • a final synthesis cycle is carried out using the pyrrole monomer, the synthesis of which is described in Example 4 above.
  • This monomer is used in exactly the same conditions as a conventional base, with the only difference of the coupling time which is 15 minutes instead of 1.3 minutes in order to take account of possible incorporation problems.
  • the MMT group is kept on the oligonucleotide for the purpose of further purification.
  • the oligonucleotide is finally deprotected in concentrated ammonia (16 h at 55 ° C). reaction scheme is shown below.
  • Example 11 Cleavage of the monomethoxytrityl group and purification of the oligonucleotide
  • the great advantage of using the monomethoxytrityl monomer is that it can be used for the purification of the oligonucleotide and that it is very easily eliminated in an acid medium. It will therefore be preferred over the tosyle group.
  • the oligonucleotide is purified by a manual purification system using the hydrophobic properties of the MMT group. (CTGen MDP -WS 1000 TM column).
  • This system is similar to OPC TM cartridges (Applied Biosystems TM) in which the oligonucleotide carrying the MMT group is specifically retained on the reverse phase while the impurities not carrying the MMT group are eluted in the liquid phase.
  • the oligonucleotide carrying the MMT was eluted with an acetonitrile solution. After evaporation, the oligonucleotide was treated with an 80% acetic acid solution for one hour. The acid was evaporated in the cold and the oligonucleotide was precipitated with ethanol. The purity of this compound was checked by ion exchange chromatography on a Gen Pack Fax column (WATERS) in an NaCl gradient (FIG. 3).
  • WATERS Gen Pack Fax column
  • 3 represents the purified oligonucleotide carrying the pyrrole substituted in 3 and synthesized from the monomer carrying MMT (gradient from 340 to 580 mM NaCl in 20 min, Gen Pack Fax TM column (WATERS TM), 0.75 ml / min) .
  • the manipulations were all carried out in an aqueous medium, using an electrochemical assembly with three electrodes connected to an Autolab PGSTAT 100 TM potentiostat. This imposes a fixed potential difference between the reference electrode and the working electrode, the counter-electrode serving to modulate the current so as to obtain the desired stable potential difference between the working electrode and the reference. , whatever the electrical properties of the cell.
  • Lithium perchlorate is the electrolyte used in the study solutions.
  • the product is in the form of a powder (molar mass 106.39 g.mol "1 ) easily soluble in distilled water.
  • Electrolyte LiClO 4 0.5 M in H 2 O
  • ODN oligonucleotide
  • pyrrole substituted with an oligonucleotide according to the invention (or pyrrole-ODN) is represented below:
  • TH IX is the electrolytic medium used as a hybridization solution. It has the following composition:
  • oligonucleotide complementary to the ODN immobilized in the polypyrrole film was used at a concentration 0.1 ⁇ M in TH IX. 5 'TAGCTGTATCGTCAAGGC 3'
  • Example 14 Principle of detection
  • the polymers according to the invention can in particular be used for the detection of biologically active species liable to be present in a sample and to react with the ODN present on the polymer chain. Indeed, as shown below, it is observed that the conjugated polymers functionalized in position 3 of their heterocycle after reaction with one or more ligands, exhibit a modification of the electrochemical response compared to a reference polymer which has not reacted with the ligand (s) from a biological medium, visualized by a change in the oxidation potential.
  • This variation of the electrochemical signal of the polymer confers a sensor function, and can thus be used for a quantitative measurement of the biologically active species, either by the variation of the potential, with fixed current, or by the variation of the current with fixed potential.
  • the optimal polymerization parameters were established and the conditions of stability and electroactivity of the deposits in the solutions used were defined.
  • the essential point concerns the nature of the physicochemical properties of the polymer which are to be modified during recognition "ODN / AN” (oligonucleotide / nucleic acid).
  • ODN / AN oligonucleotide / nucleic acid
  • the aim of the present invention relates to the development of electroactive materials in a single step, the electrochemical response of which will be modified after hybridization "ODN / AN ".
  • the modification will concern a variation of potentiometric type, by variation of the current of the oxidation potential of the polymer, or amperometric, by variation of the oxidation (or reduction) current observed at a determined potential.
  • variations in electrochemical response can be measured quantitatively, the films of functionalized polymers being used either as electrochemical sensors of amperometric or potentiometric types.
  • the deposit is transferred to the hybridization buffer (solution (5)) then put in the presence of non-complementary targets (solution (6)), rinsed, then put in the presence of complementary targets (solution (7))
  • the deposit is analyzed (cycle) by cyclic voltammetry. The results are obtained in FIG. 8 which shows a drop in electroactivity of the oxidation peak as well as a potential offset of the oxidation peak.
  • the pyrrole-ODN polymer in 3 is therefore capable of translating the phenomenon of hybridization of these probes into an electrochemical signal.
  • the deposit is transferred to the hybridization buffer (solution (5)) then put in the presence of non-complementary targets (solution (6)), rinsed, then put in the presence of complementary targets (solution (7))
  • the deposit is analyzed (cycle) by cyclic voltammetry.
  • FIG. 10 shows a drop in electroactivity of the oxidation peak as well as a slight shift in potential of the oxidation peak.
  • FIG. 10 Modification of the electrochemical signal of the modified electrode subjected to a: Hybridization buffer b: Hybridization solution in the presence of non-complementary targets c: Hybridization solution in the presence of complementary targets 2004/060904
  • the 3- (hydroxyethyl) pyrrole / pyrrole-ODN copolymer in 3 is therefore capable of translating the phenomenon of hybridization of these probes into an electrochemical signal.
  • This solution was prepared with a ratio of 1 pyrrole-ODN unit per 20,000 pyrrole units.
  • the copolymerization takes place at 0.75V on a platinum electrode diameter 3mm, against platinum electrode, DHW reference, stirring and degassing under Argon 15 min before deposition, deposition time 20s, charge obtained ⁇ 7.39 mC
  • the deposition carried out is subsequently transferred to an electrolyte solution and to the hybridization buffer.
  • the shape of the cyclic voltammetry curve ( Figure 11) confirms the presence of an electroactive, stable and reversible film.

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Abstract

L'invention concerne de nouveaux dérivés du pyrrole de formule (I) permettant l'immobilisation et l'adressage d'oligonucléotides par électropolymérisation L'invention est également relative aux polymères électroactifs ainsi obtenus, ainsi qu'à leurs procédés d'utilisation pour la détection, l'identification et le dosage d'analytes dans un échantillon. dans laquelle Ri représente un oligonucléotide, Y représente S ou O, X représente un bras espaceur choisi parmi -(CH2) -O-, -(CH2)P O-[(CH2)2-O]q-, -(CH2),;"-CO-NR'-(CH2)r-0-, -(CH2)r-NCH3-(C"2)8'-O-, -(CH2)r CO-4R'­[(CH2)2-O]5-, -(CH2)r NCH3-[(CH2)2-O]S-, R' représente -H`ou -CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r' est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r' et s sont identiques ou différents, 1e.cyclé<->pyrrnle est substitué en position 2, 3<->,<->4-ou -5-.

Description

PYRROLES SUBSTITUES AVEC DES OLIGONUCLEOTIDES
La présente invention concerne de nouveaux dérivés du pyrrole permettant l'immobilisation et l'adressage d'oligonucléotides par électropolymérisation.
L'invention est également relative aux polymères électroactifs ainsi obtenus, ainsi qu'à leurs procédés d'utilisation pour la détection, l'identification et le dosage d'analytes dans un échantillon.
Les polymères conjugués, tels que les polypyrroles et leurs dérivés, sont bien connus pour leur caractère conducteur et électroactif. Il est également connu que les polypyrroles conservent leur conductivité et leur électroactivité lorsque certains cycles pyrrole sont substitués en position 3 ou 4 avec des groupements fonctionnels. Des polymères portant ce type de groupements fonctionnels sont décrits dans WO-A1- 95/29199, Garnier et al. (Synthetic Metals, 100 : 89-94, 1999) Ho-Hoang et al. (Synthetic Metals, 62 : 277-280, 1994), Ho-Hoang et al. (J. Mater. Chem., 6(7), 1107- 1112, 1996), et Korri-Youssoufi et al. (Materials Science and Engineering, C15, 265- 268, 2001). Différents anti-ligands peuvent ensuite être greffés sur les groupements fonctionnels portés par les polypyrroles.
Ainsi, WO-A1 -95/29199 décrit la synthèse d'un polypyrrole précurseur à partir de la polymérisation électrochimique de pyrroles substitués en position 3 du noyau pyrrole avec des groupements fonctionnels. Ce polymère précurseur est déposé par polymérisation électrochimique sur un substrat conducteur ou sous la forme d'un film auto-supporté. Dans une deuxième étape, un anti-ligand tel qu'un polynucléotide ou un peptide est greffé chimiquement sur les groupements fonctionnels du polymère précurseur. Le polymère ainsi obtenu conserve ses propriétés conductrices et électroactives. Ces polymères peuvent donc être utilisés pour détecter un analyte interagissant spécifiquement avec l'anti-ligand greffé sur le polymère par la mesure d'une différence de potentiel ou d'une variation de courant. WO-A1 -00/77523 décrit également le greffage chimique d'un anti-ligand, tel qu'un oligonucleotide, sur un polymère précurseur portant des groupements fonctionnels.
Les polymères ainsi obtenus peuvent être utilisés comme des capteurs biologiques ou des « biocapteurs » pour la capture et la détection d'un analyte. La possibilité de détecter un analyte, tel qu'une molécule d'intérêt biologique, dans un échantillon par une simple mesure électrique constitue le principal avantage de ces polymères. Toutefois, les procédés de préparation de ces polymères font intervenir un greffage chimique qui ne permet pas la synthèse en parallèle d'un grand nombre de polymères portant des anti-ligands différents. Or, la préparation de matrices d'anti- ligands nécessite l'immobilisation et l'adressage d'un grand nombre d' anti-ligands différents. La fabrication des « biopuces » ou des puces à ADN fait ainsi intervenir l'immobilisation et l'adressage de matrices d' oligonucléotides sur des supports solides. Les procédés de greffage chimique d' oligonucléotides sur un polymère précurseur ne permettent pas d'obtenir des matrices ordonnées d'oligonucléotides.
Par ailleurs, il est connu d'effectuer l'adressage et l'immobilisation d'oligonucléotides de façon simultanée par copolymérisation électrochimique directe d'un mélange de pyrroles non substitués et de pyrroles substitués sur l'atome d'azote avec un groupement portant un oligonucleotide. Livache et al. (Ânalytical Biochemistry, 255 : 188-194, 1998) décrivent ainsi la synthèse de pyrroles substitués dans lesquels un groupement portant un oligonucleotide est substitué sur l'atome d'azote du cycle pyrrole. Ces pyrroles substitués portant un oligonucleotide sont copolymérisés électrochimiquement avec du pyrrole. Des réactions de copolymérisations électrochimiques successives permettent l'adressage et l'immobilisation de matrices d'oligonucléotides différents sur des électrodes différentes. Par électropolymérisation, on obtient des copolymères portant des oligonucléotides et pouvant être utilisés pour des réactions d'hybridation pour la détection d'ADN ou d'ARN spécifiques. Cependant, ces copolymères ont de faibles propriétés conductrices et électroactives. L'inconvénient de ces polymères est donc que la détection de l'hybridation est effectuée par l'intermédiaire d'un marquage supplémentaire et non par l'intermédiaire d'une mesure électrique directe.
EP-B1-0 691 978 et EP-B1-0912 593 décrivent également des pyrroles substitués sur lesquels différents ligands, tel que des oligonucléotides, sont greffés sur l'azote du noyau pyrrole. Ces pyrroles substitués, utilisés comme monomères, sont copolymérisés électrochimiquement avec du pyrrole non substitué. Toutefois, les copolymères obtenus présentent également l'inconvénient d'avoir des propriétés conductrices et électroactives faibles.
Pour remédier aux inconvénients de l'état de la technique, la présente invention propose de nouveaux pyrroles substitués ailleurs que sur l'atome d'azote par des groupements portant des oligonucléotides. Ces nouveaux pyrroles substitués permettent la synthèse de copolymères par polymérisation électrochimique lorsqu'ils sont utilisés comme monomères, seuls ou en mélange avec d'autres monomères. Les polymères ou copolymères obtenus sont conducteurs et électroactifs. Les pyrroles substitués avec des oligonucléotides selon l'invention offrent la possibilité d'adresser et d'immobiliser en une seule étape des oligonucléotides par polymérisation électrochimique. Les pyrroles substitués avec des oligonucléotides et les copolymères selon l'invention permettent donc de procéder à la préparation de matrices ordonnées d'oligonucléotides. Ces matrices constituent des outils particulièrement intéressants pour le diagnostic et pour le criblage en série de molécules. En outre, les copolymères selon l'invention possèdent des propriétés électroactives pour la détection par une mesure électrique d'un analyte susceptible d' interagir spécifiquement avec les oligonucléotides portés par le copolymère.
Description de l'invention
La présente invention concerne des pyrroles substitués avec des groupements portant un oligonucleotide. Ces pyrroles substitués selon l'invention sont définis ci-après comme « pyrrole substitué avec un oligonucleotide » ou « pyrrole substitué selon l'invention ». Un premier objet de la présente invention est un pyrrole substitué avec un oligonucleotide caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (I) :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle
Ri représente un oligonucleotide,
Y représente S ou O,
X représente un bras espaceur.
On entend par « bras espaceur », un groupement chimique qui permet l'éloignement de l' oligonucleotide par rapport au noyau pyrrole. Les bras espaceurs sont bien connus de l'homme du métier, tout bras espaceur permettant de conserver les propriétés conductrices et électroactives du polymère peut être utilisé dans les pyrroles substitués selon l'invention. Avantageusement le bras espaceur représente un encombrement réduit pour ne pas interférer avec la polymérisation du pyrrole substitué. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, X représente un bras espaceur choisi parmi -(CH2)„-O-, -(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-, -(CH2)r-CO-NR'-(CH2)r- O-, -(CH2)r-NCH3-(CH2>-O-, -(CH2)r-CO-NR'-[(CH2)2-O]s-, -(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-
O],-, R' représente -H ou -CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r' est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r' et s sont identiques ou différents, le cycle pyrrole est substitué en position 2, 3, 4 ou 5.
Le terme « oligonucleotide » désigne un enchaînement d'au moins 2 ήucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou les deux), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucleotide au moins partiellement complémentaire. Par nucléoside, on entend un composé organique consistant en une base purine ou pyrimidine liée à un ose (ribose ou deoxyribose). Par nucléotide, on entend un composé organique consistant en une base purine ou pyrimidine liée à un ose (ribose ou deoxyribose) et à un groupe phosphate. Par nucléotide modifié, on entend par exemple un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5-désoxyuridine. Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, N- alkylphosphoramidate, alkylphosphonate et alkylphosphotriester. Les alpha- oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A-2 607 507 et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Egholm et al. (J. Am. Chem. Soc, 114, 1895-1897, 1992), sont des exemples d'oligonucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié.
L' oligonucleotide est lié au bras espaceur par une liaison phosphodiester. De façon plus spécifique, le 3'-OH ou le 5'-OH de l 'oligonucleotide est lié à l'atome d'oxygène du bras espaceur par l'intermédiaire d'un groupe phosphorylé. Avantageusement, l' oligonucleotide comprend 2-70 nucléotides, préférentiellement 20 nucléotides.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l' oligonucleotide comprend, à l'extrémité liée au bras espaceur, un polynucléotide de séquence TTTTT comprenant de 5 à 10 T, préférentiellement 10 T. Ce polyT permet l'éloignement de la partie de l' oligonucleotide spécifique de l'analyte à détecter du cycle pyrrole.
La présente invention concerne également un pyrrole substitué avec un oligonucleotide de formule générale (II) :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle Ri, Y et X, sont tels que décrits précédemment. De préférence, X est -(CH )n-O- et n est égal à 2. La présente invention concerne également un pyrrole substitué avec un oligonucleotide de formule générale (III) :
Figure imgf000006_0002
dans laquelle Ri, Y et X, sont tels que décrits précédemment. De préférence, X est -(CH2)n-O- et n est égal à 2.
Un autre objet de la présente invention consiste en des procédés de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués avec un oligonucleotide selon l'invention de formule générale (II), b) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de copolymériser avec d'autres pyrroles, c) on copolymérise électrochimiquement le monomère de l'étape a) avec le monomère de l'étape b). Avantageusement, X est -(CH )n-O- et n est égal à 2 dans le pyrrole substitué avec un oligonucleotide de formule générale (II).
Dans un autre mode de réalisation avantageux, le rapport molaire entre le pyrrole substitué avec un oligonucleotide de formule générale (II) selon l'invention et le pyrrole substitué de l'étape b) est de 1/1000 à 1/100000. Préférentiellement, ce rapport molaire est de 1/5000 à 1/20000. Encore plus préférentiellement, ce rapport molaire est de 1/20000.
On entend par « monomère » une unité chimique susceptible d'une réaction de polymérisation chimique ou électrochimique avec d'autres monomères pour former un polymère.
On entend par "polymérisation" une réaction par voie chimique ou électrochimique d'unités de même nature chimique permettant l'assemblage d'un certain nombre de monomères pour former une macromolécule (n x M — » (M)n). Il s'agit typiquement de la condensation d'unités pyrrole pour former le polypyrrole. On entend par "copolymérisation" la polymérisation simultanée d'unités différentes, tel que, par exemple, la polymérisation simultanée d'un mélange de pyrrole substitués par des groupements ne comportant pas d'oligonucléotides et de pyrroles substitués selon l'invention. Les termes « électropolymérisation », « électrocopolymérisation »,
« copolymérisation électrochimique » et « polymérisation électrochimique » désignent une polymérisation par voie électrochimique. Les procédés d'électropolymérisation sont bien connus de l'homme du métier. On citera par exemple les techniques de la voltampèrométrie cyclique, la chronopotentiométrie (courant imposé) et la chronoampérométrie (potentiel imposé). Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les dépôts sont réalisés par chronoampérométrie ou dépôt à potentiel contrôlé. Cette méthode consiste à imposer un saut de potentiel à partir du potentiel d'équilibre (courant nul) jusqu'à une valeur fixe à laquelle s'effectue la réaction à l'électrode et à mesurer le courant en fonction du temps.
L' électropolymérisation du pyrrole par le mécanisme de Diaz (Sadki et al, Chem. Soc. Rev., 29 .283-293, 2000) conduit à la formation du polypyrrole. Cette polymérisation s'effectue au niveau des positions 2 et 5 des monomères pyrrole.
On entend par « pyrrole substitué susceptible de polymériser avec d'autres pyrroles», un pyrrole substitué en position 3 ou 4 du noyau pyrrole qui est susceptible de polymériser ou de copolymériser avec d'autres pyrroles au niveau des positions 2 et 5 et plus particulièrement de copolymériser avec des pyrroles substitués avec des oligonucléotides selon l'invention. Ces pyrroles substitués, susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, portent des groupements représentant un encombrement moléculaire suffisamment faible pour ne pas interférer dans une réaction de polymérisation ou de copolymérisation. Typiquement, ces pyrroles substitués ne portent pas de groupements substituants comportant des oligonucléotides. Par ailleurs, ces pyrroles substitués en position 3 ou 4 du cycle pyrrole avec des groupements de faible encombrement permettent, après polymérisation ou copolymérisation avec d'autres pyrroles, d'obtenir des polymères conducteurs et électroactifs. Des pyrroles substitués susceptible de polymériser avec d'autres pyrroles pour former des polymères conducteurs sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. On citera notamment WO-A1-95/29199, Garnier et al. (Synthetic Metals, 100 : 89-94, 1999) Ho-Hoang et al. (Synthetic Metals, 62 : 277-280, 1994), Ho-Hoang et al. (J. Mater. Chem., 6(7), 1107-1112, 1996), et Korri-Youssoufi et al. (Materials Science and Engineering, Cl 5, 265-268, 2001). La copolymérisation de pyrroles substitués avec un oligonucleotide selon l'invention avec des pyrroles substitués avec des groupements ne portant pas d'oligonucléotides permet de diminuer l'encombrement lors de la réaction de copolymérisation.
Ainsi, lorsque les pyrroles substitués avec un oligonucleotide de la présente invention sont substitués en position 3 et 4 du noyau pyrrole, un mélange de ces pyrroles selon l'invention avec des pyrroles substitués peut être copolymérisé directement.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les pyrroles substitués avec un oligonucleotide (ODN) selon l'invention sont copolymérisés avec le 3-(hydroxyéthyl)pyrrole. Dans ce mode de réalisation, le pyrrole substitué susceptible de polymériser avec d'autres pyrroles est donc le 3-(hydroxyéthyl)pyrrole. Le copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides résultant de cette copolymérisation est représenté ci-dessous.
Figure imgf000009_0001
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, le copolymère fonctionalisé avec des oligonucléotides est déposé ou formé sur un premier polymère conducteur et électroactif. Dans ces procédés, on polymérise ou coploymérise un premier pyrrole substitué pour former un préfilm ou une fine sous-couche de polymère conducteur et électroactif. Ensuite une deuxième couche est réalisée avec le copolymère fonctionnalisé avec des oligonucléotides. La présente invention se rapporte donc aussi à un procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, b) on polymérise électrochimiquement ce monomère de l'étape a) pour former un premier polymère conducteur électroactif, c) on dispose d'un monomère choisi parmi les pyrroles substitués avec un oligonucleotide de formule générale (II), d) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, e) on copolymérisé électrochimiquement le monomère de l'étape c) avec le monomère de l'étape d) sur ledit premier polymère conducteur électroactif formé à l'étape b) pour obtenir un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides. Les pyrroles substitués utilisés à l'étape a) et à l'étape d) sont identiques ou différents.
De préférence, le rapport molaire entre le pyrrole substitué de l'étape c) et le pyrrole substitué de l'étape d) est de 1/20000. Avantageusement, le pyrrole substitué de l'étape a) et de l'étape d) est le
3-(hydroxyéthyl)pyrrole.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, b) on polymérise électrochimiquement ce monomère de l'étape a) pour former un premier polymère conducteur électroactif, c) on dispose d'un monomère choisi parmi les pyrroles substitués avec un oligonucleotide de formule générale (II), d) on polymérise électrochimiquement le monomère de l'étape c) sur ledit premier polymère conducteur électroactif formé à l'étape b) pour obtenir un polymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides. Avantageusement, le pyrrole substitué de l'étape a) est le 3-
(hydroxyéthyl)pyrrole.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, b) on polymérise électrochimiquement ce monomère de l'étape a) pour former un premier polymère conducteur électroactif, c) on dispose d'un pyrrole substitué avec un oligonucleotide selon la formule générale (III), d) on couple électrochimiquement le pyrrole substitué de l'étape c) sur le premier polymère conducteur électroactif formé à l'étape b) pour obtenir un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides. Avantageusement, le pyrrole substitué de l'étape a) est le 3- (hydroxyéthyl)pyrrole. Lorsque le pyrrole substitué avec un oligonucleotide selon l'invention est substitué en position 2 ou 5 du cycle pyrrole il n'est pas susceptible de polymériser ou de copolymériser avec d'autres pyrroles. Pour préparer un copolymère conducteur électroactif fonctionalisé avec des oligonucléotides à partir de pyrroles substitués avec un oligonucleotide de formule générale (III), il est donc nécessaire de préparer un premier polymère conducteur électroactif sur lequel est ensuite couplé électrochimiquement le pyrrole substitué avec un oligonucleotide en position 2 ou 5 selon l'invention.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, les pyrroles substitués avec un oligonucleotide (ODN) de formule générale (III) sont donc couplés électrochimiquement sur un premier polymère conducteur électroactif de poly[3- (hydroxyéthyl)pyrrole]. Dans ce mode de réalisation, le pyrrole substitué avec un oligonucleotide selon l'invention se retrouve donc à l'extrémité de la chaîne polymérique. Le copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides résultant de cette copolymérisation est représenté ci-dessous.
Figure imgf000011_0001
Un autre objet de la présente invention consiste en des copolymères conducteurs électroactifs fonctionnalisés avec des oligonucléotides susceptibles d'être obtenus par un procédé selon l'invention.
Les copolymères selon l'invention sont fonctionnalisés avec des oligonucléotides. Ces oligonucléotides sont greffés de manière covalente sur certaines unités monomères (noyaux pyrrole) formant le polymère apportant ainsi une fonction supplémentaire à ces polymères conducteurs électroactifs. Les copolymères fonctionnalisés avec des oligonucléotides sont par exemple appropriés pour la capture et la détection d'analytes.
On entend par « polymère conducteur », un polymère dont les électrons sont fortement délocalisés, le plus souvent le long d'un enchaînement de liaisons simples et doubles (liaisons conjuguées), ce qui le conduit à se comporter comme un semi-conducteur micro-électronique.
On entend par « polymère électroactif», un polymère dont la réponse électrochimique, est modifiée lorsqu'un analyte interagit de manière spécifique avec les oligonucléotides portés par le polymère. Ainsi, on observe une modification du signal électrochimique suite à l'interaction spécifique avec l'analyte. Le copolymère conducteur électroactif traduit donc l'interaction avec l'analyte en un signal électrochimique modifié.
Les copolymères selon l'invention peuvent être utilisés dans toutes les applications dans lesquelles des oligonucléotides sont adressés et immobilisés sur un support solide.
Plus particulièrement, les polymères selon l'invention sont obtenus sous forme de films auto-supportés ou sous forme de film sur électrode. L'électrode permet en effet de contrôler, par mesure du courant délivré au cours de la réaction, l'évolution de la réaction de polymérisation. L'électrode permet également de mesurer les réponses électrochimiques ultérieures du copolymère. La présente invention se rapporte donc également à une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'au moins un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon l'invention.
On connaît de l'état de la technique les supports conducteurs pour électrodes, on citera notamment les substrats en métal ou en dérivés de carbone. Pour la fabrication d'une électrode selon l'invention, le copolymère est généralement déposé sur le support conducteur. La copolymérisation électrochimique est effectuée avantageusement en surface de l'électrode pour obtenir une électrode comprenant un support conducteur revêtu en surface d'un copolymère selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'électrode est obtenue en déposant une couche de copolymère à la surface d'un support en or ou en platine. Etant donné qu'il est possible de limiter et de contrôler les réactions de polymérisations électrochimiques au niveau d'une électrode, les pyrroles substitués avec un oligonucleotide selon la présente invention permettent l'immobilisation et l'adressage d'oligonucléotides sur de petites surfaces. Cette électrocopolymérisation adressée permet de réaliser une matrice de points miniaturisés et ordonnées, chacun des points portant un oligonucleotide défini. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention se rapporte donc également à une matrice d'électrodes.
L'invention concerne donc également une matrice d'électrodes comprenant au moins une électrode selon l'invention. Dans un mode de réalisation avantageux, les différentes électrodes de la matrice portent des oligonucléotides différents. Selon un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une pluralité d'électrodes ou de microélectrodes fixées sur un support solide, ces électrodes sont revêtues d'un copolymère selon l'invention et portent avantageusement des oligonucléotides différents. De telles matrices d'électrodes peuvent avantageusement être obtenues par électropolymérisation adressée de pyrroles substitués avec un oligonucleotide selon l'invention.
Les copolymères, les électrodes et les matrices d'électrodes selon l'invention sont notamment utilisables pour la détection d'analytes susceptibles d'être présents dans un échantillon et susceptibles de réagir spécifiquement avec les oligonucléotides portés par le copolymère. L'invention se rapporte donc également à des dispositifs pour la détection d'un analyte dans un échantillon comprenant au moins un copolymère selon l'invention et/ou au moins une électrode selon l'invention. L'invention concerne également des dispositifs pour la détection d'un analyte dans un échantillon comprenant au moins une matrice d'électrodes selon l'invention. La présente invention a également pour objet un procédé de détection d'un analyte dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) on dispose d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon l'invention ou d'une électrode comprenant un support conducteur revêtu d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon l'invention, b) on met en contact le copolymère électroactif ou l'électrode de l'étape a) avec l'échantillon dans des conditions de réaction appropriées pour l'interaction spécifique de l'analyte avec lesdits oligonucléotides; c) on détecte l'analyte, lié aux dits oligonucléotides, au moyen d'une mesure électrique.
L'invention concerne donc l'utilisation d'un copolymère, d'une électrode ou d'une matrice d'électrodes selon l'invention pour détecter un analyte susceptible d'être présent dans un échantillon et susceptible d'interagir spécifiquement avec les oligonucléotides selon l'invention. On entend par « analyte », toute molécule susceptible d'interagir spécifiquement avec des oligonucléotides et donc susceptible d'être détecté avec un copolymère selon l'invention. Cet analyte peut être, par exemple, une biomolécule telle que par exemple une protéine, un peptide, un lipide, un stéroïde, un sucre ou encore un acide nucléique. L'oligonucléotide porté par le copolymère est spécifique de l'analyte à détecter. Avantageusement, l'oligonucléotide et l'analyte à détecter forment un couple anti-ligand/ligand (ADN/ADN, ARN/ADN, ARN/ARN ou ADN/protéine par exemple).
La présente invention permet de détecter un analyte dans tout type d'échantillon. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon est un échantillon biologique. Avantageusement, cet échantillon peut avoir été prélevé sur un patient à des fins de diagnostic. L'échantillon peut être, par exemple, l'urine, le sang, le sérum, le plasma, des extraits cellulaires ou un fluide corporel.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on détecte un ADN et/ou un ARN s'hybridant de manière spécifique aux oligonucléotides du copolymère conducteur électroactif selon l'invention.
Le copolymère de la présente invention est un copolymère électroactif dont la réponse électrochimique sera modifiée lorsqu'un analyte interagit de manière spécifique avec les oligonucléotides portés par le polymère. Le copolymère conducteur électroactif selon l'invention traduit donc l'interaction avec l'analyte en un signal électrochimique. L'interaction spécifique d'un analyte avec les oligonucléotides portés par le copolymère engendre une modification de la réponse électro chimique du copolymère étudié par rapport à un copolymère de référence. Avantageusement, la détection de l'analyte s'effectue donc par une mesure électrique.
On entend par « mesure électrique », la mesure d'une variation de type potentiométrique comme la variation du potentiel d'oxydation du polymère ou la mesure d'une variation de type amperométrique par variation du courant d'oxydation observé à un potentiel donné. Ces variations sont mesurées de manière rapide, sensible et quantitative selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la mesure électrique consiste en la mesure d'une variation de potentiel ou d'une variation de courant. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise la voltamétrie cyclique. Il s'agit d'une méthode électroanalytique qui consiste à balayer une gamme de potentiel dans un sens puis dans l'autre, à vitesse constante. Le voltampérogramme obtenu donne la réponse en courant du système électrochimique étudié et permet sa caractérisation. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la détection de l'interaction spécifique entre l'analyte et les oligonucléotides portés par le copolymère peut se faire avec l'électrode qui a servi à l' électropolymérisation du polymère. Par exemple, l'hybridation d'un acide nucléique complémentaire aux oligonucléotides du copolymère peut être détectée par mesure électrique sur l'électrode qui supporte le copolymère selon l'invention.
Les méthodes de détection par une mesure électrique sont préférées avec les copolymères selon l'invention. Cependant, d'autres méthodes traditionnelles de détection connues de l'homme du métier peuvent également être utilisées.
Un autre objet de la présente invention consiste en un pyrrole substitué de formule générale (IN) :
Figure imgf000016_0001
dans laquelle
R est un groupe protecteur de l'amine. Différents groupes protecteurs de l'amine peuvent être utilisés dans les pyrroles substitués selon l'invention. Ces groupes protecteurs de l'amine sont bien connus de l'homme du métier (Kocienski P.J., Thieme Publishing Group, 1994 ; Hanson J.R., Protecting Groups in Organic Synthesis,
Continuum International Publishing Group). De préférence, le groupe protecteur de l'amine est choisi parmi le monométhoxytrityle, le dimethoxytrityle, le tosyle, le triisopopyl silyle, le tert-butoxycarbonyle, le 9-fluorényloxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle et l'acétyle. R3 est un groupe phosphore susceptible de réagir avec un groupement hydroxyle libre.
De préférence, R3 est choisi parmi un groupement phosphotriester, H-phosphonate ou phosphoramidite,
X représente un bras espaceur choisi parmi -(CH2)n-O-, -(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-, -
(CH2)r-CO-ΝR'-(CH2)r-O-, -(CH2)r-NCH3-(CH2)r.-O-, -(CH2)r-CO-NR'-[(CH2)2-O]s-, - (CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-,
R' représente -H ou -CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r' est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r' et s sont identiques ou différents, le cycle pyrrole est substitué en position 2, 3, 4 ou 5. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention se rapporte à un pyrrole substitué de formule générale (N) :
Figure imgf000017_0001
dans laquelle
R est un groupe protecteur de l'amine. De préférence, R2 est choisi parmi le monométhoxytrityle, le dimethoxytrityle, le tosyle, le triisopropyl silyle, le tert- butoxycarbonyle, le 9-fluorényloxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle et l'acétyle. R3 est un groupe phosphore susceptible de réagir avec un groupement hydroxyle libre.
De préférence, R3 est choisi parmi un groupement phosphotriester, H-phosphonate ou phosphoramidite,
X représente un bras espaceur choisi parmi -(CH2)n-O-, -(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-, -
(CH2) CO-ΝR'-(CH2)r-O-, -(CH2)r-NCH3-(CH2)r.-O-, -(CH2)r-CO-NR'-[(CH2)2-O]s-, - (CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-,
R' représente -H ou -CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r' est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r' et s sont identiques ou différents.
Préférentiellement, R2 représente le monométhoxytrityle. De préférence, R3 représente un groupement phosporamidite. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, X représente -(CH2)n-O- et n est égal à 2.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le pyrrole substitué répond à la formule générale (NI) :
Figure imgf000018_0001
dans laquelle R2 est un groupe protecteur de l'amine, de préférence, choisi parmi le monométhoxytrityle, le diméthoxytrityle, le tosyle, le triisopropyl silyle, le tert- butoxycarbonyle, le 9-fluorényloxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle et l'acétyle,
R3 est un groupe phosphore susceptible de réagir avec un groupement hydroxyle libre.
De préférence, R est choisi parmi un groupement phosphotriester, H-phosphonate ou phosphoramidite,
X représente un bras espaceur choisi parmi -(CH2)n-O-, -(CH2)p-O-[(CH2) -O]q-, -
(CH2)r-CO-NR'-(CH2)r>-O-, -(CH2)r-NCH3-(CH2)r>-O-, -(CH2)r-CO-NR'-[(CH2)2-O]s-, -
(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-,
R' représente -H ou -CH , n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r' est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r' et s sont identiques ou différents.
Préférentiellement, R2 représente le monométhoxytrityle. De préférence,
R3 représente un groupement phosporamidite. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, X représente -(CH )n-O- et n est égal à 2. Un autre objet de la présente invention consiste en un procédé de préparation d'un pyrrole substitué avec un oligonucleotide de formule générale (I)
Figure imgf000019_0001
dans laquelle Ri, X et Y sont tels que définis précédemment, comprenant les étapes suivantes : a) on effectue les cycles de synthèse d'un oligonucleotide, b) on substitue, dans le dernier cycle de synthèse dudit oligonucleotide, un pyrrole substitué de formule générale (IN)
Figure imgf000019_0002
dans laquelle R , R3 et X , sont tels que définis précédemment au dernier nucléotide en 5' ou en 3' dudit oligonucleotide ; c) on clive ledit groupe protecteur R2.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le groupe protecteur R2 est le monométhoxytrityle et à l'étape c) on clive ce groupe protecteur par un traitement en milieu acide.
Dans un mode de réalisation préféré, le groupe protecteur R est le monométhoxytrityle et l'oligonucléotide est purifié par chromatographie en phase inverse avant de cliver le groupe protecteur à l'étape c).
La substitution d'un pyrrole substitué de formule générale (IN) est réalisée à la suite des cycles de synthèse de l'oligonucléotide. Dans le dernier cycle de synthèse, on remplace le nucléotide par un pyrrole substitué de formule générale (IN). Selon un premier exemple, dans le cas du cycle en série « H- phosphonate » tel que représenté sur le schéma ci-dessous, le dernier nucléotide de ce cycle est remplacé par un pyrrole substitué de formule (IN) selon l'invention dans lequel le groupe phosphore est un H-phosphonate.
Cycle en série « H-phosphonate »
Figure imgf000020_0001
Selon un autre exemple, dans le cas du cycle de condensation phosphoramidite tel que représenté sur le schéma ci-dessous, le dernier nucléotide de cette chaine est remplacé par le pyrrole substitué de formule (IV) selon l'invention dans lequel le groupe phosphore est un phosphoramidite.
Y= O ou S
Figure imgf000021_0001
De même, selon un autre exemple, dans le cas du cycle de condensation « phosphotriester » tel que représenté sur le schéma ci-dessous, le dernier nucléotide de ce cycle est remplacé par un pyrrole substitué de formule (IN) selon l'invention dans lequel le groupe phosphore est un phosphodiester. Cycle de condensation phosphotriester
(n-1) cycles pour un oligonucleotide dg bases de long
Figure imgf000022_0001
Lavage (1) 5'-O détritylation
Acétonitrile acide trichloroacétique
- 30 secondes 2% dans CH2C12 - 2 minutes
Figure imgf000022_0002
A l'issue des cycles de synthèse de l'oligonucléotide, et après déprotection, l'hydroxyle libre à l'extrémité 5' ou 3' de l'oligonucléotide réagit avec le phospore réactif (phosphodiester, phosphoramidite, H-phosphonate) du pyrrole substitué de formule générale (IN).
Description des figures
Figure 1 : Chromatogrames de l'oligonucléotide 5'OH avant et après l'incorporation du l-[Ν-(tosyl)]-3-[7-O-(2-cyanoéthyl-Ν, N diisopropylphosphoramidityl)hydroxyéthyl].
Fig 1 A Séquence de l'oligonucléotide : 5 'ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta, temps de rétention (Rt) : 14.87 min. Fig 1 B Séquence de l'oligonucléotide: 5'Pyrrole Tosyl- ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta, Rt : 16.35 min.
Fig 1 C Co-injection des 2 oligonucléotides (Rt : 15.07 min et 17.40 min).
Figure 2 : Suivi par HPLC du clivage du groupement Tosyle.
Fig 2 A Séquence de l'oligonucléotide : 5 'Pyrrole Tosyl- ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta, Rt : 14.9 min.
Fig 2 B Séquence des oligonucléotides : 5 'Pyrrole Tosyl- ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta (20%), Rt : 15.25 min, 5 'Pyrrole - ttt ttt ttt ttg cet tga cga tac agc ta (80%), Rt : 13.48 min après 24h dans une solution 0.5 M NaOH à 55°C.
Figure 3 : Chromatograme de l'oligonucléotide purifié portant le pyrrole substitué en 3 et synthétisé à partir du monomère pyrrole portant le MMT.
Séquence de l'oligonucléotide : 5 'Pyrrole - at etc ggg aat etc aat gtt ag, Rt: 17.6 min.
Figure 4 : Premier cycle de voltamétrie cyclique d'une solution de 3-
(hydroxyéthyl)pyrrole sur une électrode de platine.
Figure 5 : Courbe de voltamétrie cyclique d'une électrode modifiée par un film polymérique de 3-(hydroxyéthyl)pyrrole transféré dans l'électrolyte exempte de monomères.
Figure 6 : Premier cycle de voltamétrie cyclique dans une solution de 5 μM de pyrrole
-ODN en 3 sur une électrode de platine.
Figure 7 : Courbe de voltamétrie cyclique d'une électrode modifiée par un film de pyrrole -ODN en 3 sur un pré-film de 3-(hydroxyéthyl)pyrrole, transférée dans la solution d'électrolyte exempte de monomères. Figure 8 : Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à différents milieux.
Figure 9 : Courbe de voltamétrie cyclique d'une électrode modifiée par un copolymère sur un préfilm transférée dans la solution d'électrolyte exempte de monomères. Figure 10 : Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à différents milieux.
Figure 11 : Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée par un copolymère soumis à différents milieux.
Exemples
Exemple 1 : Synthèse du l-(N-tosylV3-fhydroxyéthyl pyrrole
Le l-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl)pyrrole peut être obtenu selon la synthèse suivante:
Figure imgf000025_0001
66% 76%
Tl(ΝO3)3/K-10 CH3OH
Figure imgf000025_0002
La synthèse du l-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl)pyrrole a été effectuée comme décrit par Korri-Youssoufi et al., Materials Science and Engineering C15 (2001) 265-268. Dans une première étape, le l-(N-tosyl)pyrrole a été synthétisé à partir du pyrrole en utilisant du chlorure de tosyle en présence d'une base forte, le tertiobutylate de potassium. Puis, une acylation du l-(N-tosyl)pyrrole par de l'anhydride acétique a permis d'obtenir le 1- tosyl-3-acétyl-pyrrole, qui a été transformé en 2-[3-(l-N-tosyl-pyrrole)] acétate de méthyle par une transposition oxydative, en utilisant du nitrate de thallium en présence de montmorillonite. Une réduction sous conditions douces par du borane diméthylsulfide a conduit à l'obtention du produit recherché, le l-(N-tosyl)-3- (hydroxyéthyl)pyrrole. Le rendement global de la réaction a été de 21,8%. Exemple 2: Synthèse du l-rN- p-monométhoxytrityl 1-3-(hydroxyéthy pyrrole
Le l-[N-(p-monométhoxytrityl)]-3-(hydroxyéthyl)pyrrole a été obtenu selon la synthèse suivante :
Figure imgf000026_0001
L'azote du l-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl)pyrrole est déprotégée de façon classique par une solution de soude (2.5 M ΝaOH/Méthanol), deux heures à reflux. Puis, après extraction du 3-(hydroxyéthyl)pyrrole par de l'éther éthylique et concentration à sec du produit, une monométhoxytritylation de la fonction aminé est effectuée par du chlorure de monométhoxytrityle (1,2 équivalents), dans du dichlorométhane anhydride, en présence de 1 équivalent de TEA. Après purification sur colonne de silice, le produit attendu, le l-[N-(/?-monométhoxytrityl)]-3-(hydroxyéthyl)pyrrole a été obtenu avec un rendement de 25%.
RMΝ 1H du l-[N-(p-monométhoxytrityl)]-3-(hydroxyéthyl)pyrrole : δ ppm (CDC13) = 7,28-6,75 (m, 16 H, Ar MMtr, H-2, H-5) ; 5,88 (t, 1H, H-4) ; 3,79 (s,
3H, OCH3) ; 3,73 (t, 2H, 2xH-7); 2,7 (t, 2H, 2xH-6).
Exemple 3: Synthèse du HN-ftosvi -3-r7-O-(2-cvanoéthyl-N,Ndiisopropyl- phosphoramidityl hydroxyéthyl]pyrrole
Le 1 -[N-(tosyl)]-3-[7-O-(2-cyanoéthyl-NN diisopropylphosphoramidityl)hydroxyéthyl] pyrrole a été obtenu selon la synthèse suivante :
Figure imgf000027_0001
m
Figure imgf000027_0002
Le l-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl)pyrrole (50 mg, 187,5 μmol, leq.) a été coévaporé 3 fois à l'acétonitrile anhydre, puis il a été dissous dans 1 mL d'acétonitrile. Le ballon a été mis sous atmosphère inerte et 68 μL (48 mg, 375 μmol, 2 eq.) de DIPEA (diisopropyléthylamine) ont été ajoutés. La chlorophosphine (48 μL, 72 mg, 275 μmol, 1,1 eq.) a été ajoutée au goutte à goutte et le tout a été laissé sous agitation pendant 5 min. Le mélange réactionnel a ensuite été concentré de moitié à l'évaporateur rotatif et a été déposé sur une colonne de gel de silice coulé dans un mélange cyclohexane/triethyla ine (99 : 1) et rincé au cylohexane. Le produit a ensuite été élue avec un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (80 : 20). Puis les bonnes fractions ont été réunies et concentrées. L'huile jaune obtenue a été reprise dans de l'acétonitrile, filtrée sur filtre millex PNDF 0,22 μM et reconcentrée pour obtenir 67 mg (144 μmol, 77 %) de produit. C.C.M : Rf = 0,5 cyclohexane/acétate d'éthyle (50 : 50) RMΝ 31P : 148,32 ppm
RMN 1H : δ ppm (CD3CN) = 7,75 (d, 2H, J=8Hz, H-o); 7,35 (d, 2H, J=8Hz, H-m); 7,05 (m, 2H, H-2 + H-5); 6,20 (s, 1H, H-4); 3,69 (m, 6H, O-CH2-CH2-CN + 2 x NCH(CH3)2 + 2xH-7) 2,60 (m, 4 H, 2xH-6 + O-CH2-CH2-CN); 2,37 (s, 3H, CH3-PI1); 1,10 (m, 12 Η, 2 NCΗ(CHj)2). Exemple 4: Synthèse du l- N-(p-monométhoxytritvDl-3-[7-O-(2-cyanoéthyl-N,N- diisopropylphosphoramiditvDhydroxyéthylIpyrrole
La synthèse du l-[N-( ?-monométhoxytrityl)]-3-[7-O-(2-cyanoéthyl-NN-diisopropyl- phosphoramidityl)hydroxyéthyl]pyrrole a été réalisée selon le schéma suivant :
Figure imgf000028_0001
Le l-[N-(p-monométhoxytrityl)]-3-(hydroxyéthyl)pyrrole (120 mg, 300 μmol, leq.) a été coévaporé 3 fois à l'acétonitrile anhydre, puis dissous dans 2 mL d'acétonitrile. Le ballon a été mis sous atmosphère inerte et 160 μL (114 mg, 600 μmol, 2 eq.) de DIPEA (diisopropyléthylamine) ont été ajoutés. La chlorophosphine (82 μL, 87 mg, 330 μmol, 1,1 eq.) a été ajoutée au goutte à goutte et le tout a été laissé sous agitation pendant 5 min. Le mélange réactionnel a ensuite été concentré de moitié à l'évaporateur rotatif et a été déposé sur une colonne de gel de silice coulé dans un mélange cyclohexane/triethylamine (99 : 1) et rincé au cyclohexane. Le produit a ensuite été élue avec un mélange cyclohexane/acétate d'éthyle (90 : 10). Puis les bonnes fractions ont été réunies et concentrées. L'huile jaune obtenue a été reprise dans de l'acétonitrile, filtrée sur filtre millex PVDF 0,22 μM et reconcentrée pour obtenir 120 mg (205 μmol, 68 %) de produit.
C.C.M : Rf = 0,3 cyclohexane/acétate d'éthyle (50 : 50) RMΝ 31P : 147, 15 ppm RMN 1H : δ ppm (CD3CN) = 7,09 (m, 15 H, MMTr + H-5) ; 6,80 (d, IH, J= 8,9 Hz, H-2) ; 6,51 (s, IH, H-4) ; 3,63 (m, 9H, OCH3 + O-CH2-CH2-CN + 2 x NCH(CH3)2 + 2xH-7) ; 2,67 (m, 4 H, 2xH-6 + O-CH2-CH2-CN) ; 1,10 (m, 12 Η, 2x NCΗ(CH?)2).
Exemple 5: Synthèse du l-(N-tosyl)-3-[2-ftriéthyloxy)-hvdroxyéthvπipyrrole
Le l-(N-tosyl)-3-[2-(triéthyloxy)-hydroxyéthyl)]pyrrole a été synthétisé selon le schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000029_0001
La fonction alcool du l-(N-tosyl)-3-(hydroxyéthyl)pyrrole a été substituée par un brome en présence de CBr4 et de triphénylphosphine, à 0°C dans de l'acétonitrile anhydre. Puis le bras triéthylène glycol a été couplé par substitution nucléophile, en milieu basique. Le rendement global de la réaction a été de 24.6%. RMΝ 1H du l-(N-tosyl)-3-[2-(triéthyloxy)-hydroxyéthyl)]pynOle : δ ppm (CDC13) = 7,65 (d, 2H, 2xH Ts) ; 7,20 (d, 2H, 2xH Ts) ; 6,98 (t, IH, H-5) ; 6,9 (s, IH, H-2) ; 6,11 (d, IH, H-4) 3,65-3,5 (m, 14H, 7xCH2-O); 2,60 (t, 2H, 2xH-6) ; 2,33 (s, 3H, CH3 Ts).
Exemple 6: Synthèse du l-(N-tosy -2-(hydroxyéthyl yrrole
Le l-(N-tosyl)-2-(hydroxyéthyl)pyrrole a été synthétisé selon le schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000030_0001
Le groupement tosyle a été introduit en position 1 du 2-acétyl pyrrole par réaction avec du chlorure de tosyle, à 0°C dans du dichlorométhane, en présence de sulfate de n- butylammonium et de soude. Puis, le 2-[2-(l-N-tosyl-pyrrole)] acétate de méthyle a été obtenu par transposition oxydative, en utilisant du nitrate de thallium en présence de montmorillonite. Une étape de réduction par LiBH conduit au produit recherché, le 1- (N-tosyî)-2-(hydroxyéthyl)pyrrole. Le rendement global de la synthèse a été de 3%. RMΝ 1H du l-(N-tosyl)-2-(hydroxyéthyl)pyrrole : δ ppm (CDC13) = 7,64 (d, 2H, 2xH Ts) ; 7,31 (d, 2H, 2xH Ts) ; 7,27 (d, IH, H-5) ; 6,22 (t, IH, H-4) ; 6,10 (s, IH, H-3) ; 3,80 (t, 2H, 2xH-6) ; 2,95 (t, 2H, 2xH-7) ; 2,40 (s, 3H, CH3 Ts).
Exemple 7: synthèse d'un oligonucleotide sur support solide
Un oligonucleotide, a été synthétisé sur support solide (Controlled pore glass, CPG) par la méthode aux phosphoramidites décrite par Beaucage et Lyer, (Tetrahedron, 48, 223- 2311, 1992). Le premier nucléoside de la séquence à synthétiser est fixé au support solide (CPG) en position 3', l'extrémité 5 'OH du nucléoside étant protégée par un groupement acido labile diméthoxytrityl (DMT).
- Dans une première étape de détritylation, un traitement acide (acide tri ou dichloroacétique) permet d'enlever le groupement DMT afin de générer l'extrémité 5 'OH réactive.
- Dans une deuxième étape de « coupling », le phosphoramidite de la base à ajouter est condensé sur ce premier nucléoside afin de générer une liaison phosphite triester. La condensation se fait en présence d'un catalyseur (le tétrazole ou le S-thio ethyl tétrazole, ou le DCI, ou ...)
- Dans une troisième étape de « capping » les extrémités 5 'OH qui n'auraient pas réagit lors de l'étape de condensation précédente sont bloquées par un réactif acylant (anhydride acétique) afin d'éviter des délétions dans la séquence.
- Dans une quatrième étape d'oxydation, la liaison phosphite triester est oxydée en liaison phosphate triester par un traitement oxydant (iode aqueux). La liaison phosphite triester peut également être oxydée par le réactif de Beaucage en solution dans l'acétonitrile pour donner une liaison phosphorothioate triester Les étapes 1 à 4 sont répétées autant de fois qu'il est nécessaire en fonction de la longueur de la séquence à synthétiser. Ces 4 étapes constituent un cycle de synthèse. Quand la séquence désirée est terminée, le support solide sur lequel se trouve l'oligonucléotide est mis à incuber dans une solution aqueuse d'ammoniaque concentrée afin de cliver l'oligonucléotide du support, de déprotéger les bases et les groupements phosphates.
Exemple 8: Incorporation de pyrrole substitué en position 3. protégé sur l'azote par un groupement tosyl. à l'extrémité 5' d'un l'oligonucléotide
Un dernier cycle de synthèse a été effectué en utilisant le monomère de pyrrole, le 1- [N-(tosyl)]-3-[7-O-(2-cyanoéthyl-NNdiisopropylphosphoramidityl)hydroxyéthyl] pyrrole, dont la synthèse est décrite à l'exemple 3 ci-dessus. Ce monomère a été utilisé exactement dans les mêmes conditions qu'un synthon nucléotidique classique, à la seule différence du temps de couplage qui est de 15 minutes au lieu de 1.3 minute afin de tenir compte d'éventuels problèmes d'incorporation. Le schéma réactionnel est représenté ci-dessous. Après déprotection dans l'ammoniaque 30% aqeux (16h à 55°C), l'oligonucléotide brut a été analysé par HPLC échangeuse d'ion (Figure 1). La figure 1 représente la coinjection de l'oligo avec et sans pyrrole pour mettre en évidence l'incorporation. (Gradient de 400 à 640 mM NaCl en 20 min, Colonne Gen Pack Fax™ (WATERS™), 0.75 ml/min).
Figure imgf000032_0001
Exemple 9: Clivage du groupement tosyle et purification de l'oligonucléotide
Le groupement tosyle est éliminé en 4 heures dans une solution d'hydroxyde de sodium 2.5 M à 75°C, mais dans ces conditions l'oligonucléotide se dégrade totalement. Nous avons donc utilisé des conditions d'hydrolyse plus douces (solution de NaOH 0.5 M à 55°C pendant 24°C) afin d'éviter la dégradation de l'oligonucléotide tout en clivant à 80% le groupement tosyle porté par le pyrrole. Il a alors été possible par HPLC de séparer les 2 oligonucléotides pour isoler l'oligonucléotide totalement déprotégé (Figure 2). La figure 2 représente le clivage du tosyl en milieu NaOH 0.5M, 55°C (Gradient de 440 à 680 mM NaCl en 20 min. Colonne Gen Pack Fax™ (WATERS™), 0.75 ml/min).
Dans le cas ou l'oligonucléotide n'est pas purifié par HPLC, on peut éliminer l'hydroxyde de sodium par simple précipitation à l'acétone, et l'utiliser tel quel pour les expériences de copolymérisation.
Exemple 10: Incorporation de pyrrole substitué en position 3. protégé sur l'azote par un groupement monométhoxytrityle, à l'extrémité 5' d'un l'oligonucléotide
Un dernier cycle de synthèse est effectué en utilisant le monomère du pyrrole, le dont la synthèse est décrite à l'exemple 4 ci-dessus. Ce monomère est utilisé exactement dans le mêmes conditions qu'une base classique, à la seule différence du temps de couplage qui est de 15 minutes au lieu de 1.3 minute afin de tenir compte d'éventuels problèmes d'incorporation.
D'autre part le groupement MMT est conservé sur l'oligonucléotide à des fins de purification ultérieure. L'oligonucléotide est finalement déprotégé dans l'ammoniaque concentrée (16h à 55°C). schéma réactionnel est représenté ci-dessous.
Figure imgf000034_0001
Exemple 11: Clivage du groupement monométhoxytrityle et purification de l'oligonucléotide
Le grand avantage à utiliser le monomère monométhoxytrityle est qu'il peut être utilisé pour la purification de l'oligonucléotide et qu'il est très facilement éliminable en milieu acide. Il sera donc préféré par rapport au groupement tosyle.
L'oligonucléotide est purifié par un système de purification manuel utilisant les propriétés hydrophobes du groupement MMT. (Colonne CTGen MDP -WS 1000 ™).
Ce système est similaire aux cartouches OPC™ (Applied Biosystems™) dans lequel l'oligonucléotide portant le groupement MMT est spécifiquement retenu sur la phase inverse alors que les impuretés ne portant pas le groupement MMT sont éluées dans la phase liquide.
Après élution des espèces avortées, l'oligonucléotide portant le MMT a été élue avec une solution d'acétonitrile. Après évaporation, l'oligonucléotide a été traité par une solution d'acide acétique à 80% pendant une heure. L'acide a été évaporé à froid et l'oligonucléotide a été précipité à l'éthanol. La pureté de ce composé a été contrôlée par chromatographie en échangeuse d'ion sur colonne Gen Pack Fax (WATERS) dans un gradient de NaCl (figure 3). La figure 3 représente l'oligonucléotide purifié portant le pyrrole substitué en 3 et synthétisé à partir du monomère portant le MMT (gradient de 340 à 580 mM NaCl en 20 min, colonne Gen Pack Fax™ (WATERS™), 0.75 ml/min).
Sa pureté est nettement supérieure à celle que l'on peut obtenir avec le monomère tosyle.
Exemple 12: Montage éléctrochimique
Les manipulations ont toutes été réalisées en milieu aqueux, à l'aide d'un montage électrochimique à trois électrodes relié à un potentiostat Autolab PGSTAT 100 ™. Celui-ci impose une différence de potentiel fixe entre l'électrode de référence et l'électrode de travail, la contre-électrode servant à moduler le courant de façon à obtenir la différence de potentiel stable voulue entre l'électrode de travail et la référence, quelque soit les propriétés électriques de la cellule. Les manipulations ayant lieu en milieu aqueux, les électrodes utilisées ont été les suivantes : électrode de référence = électrode au Calomel Saturé (ECS), contre-électrode = fil de platine et électrode de travail = disque de platine de 1 mm de diamètre.
Exemple 13: Solutions utilisées
(1) Electrolvte LiClO dans H2O
Le perchlorate de lithium est l'électrolyte utilisé dans les solutions d'étude. Le produit se présente sous forme de poudre (masse molaire 106,39 g.mol"1) facilement soluble dans l'eau distillée. électrolyte LiClO4= 0.5 M dans H2O
(2) Solution de polymérisation du 3-(hydroxyéthyl)pyrrole dans l'électrolyte 3-(hydroxyéthyl)pyrrole = 0.1 M électrolyte LJC1O4 = 0.5 M dans H2O
(3) Solution de copolymérisation du 3-flιydroxyéthyl)pyrrole avec le pyπOle-ODN (oligonucleotide) en 3
L'ODN (oligonucleotide) a pour séquence : 5' GCCTTGACGATACAGCTA 3'
Le pyrrole substitué avec un oligonucleotide selon l'invention (ou pyrrole-ODN) est représenté ci-dessous :
Figure imgf000036_0001
GC CTT GAC GAT ACA GCT A Cette solution a été préparée avec un ratio de 1 unité pyrrole-ODN pour 20000 unités pyrrole.
3-(hydroxyéthyl)pyrrole = 0.1 M [pyrrole-ODN] = 5 μM électrolyte LiCIO4 = 0.5 M dans H2O
(4) Solution de polymérisation du pyrrole-ODN en 3 [ pyrrole-ODN] = 5 μM électrolyte LiClO40.5 M dans H2O
(5) Tampon d'hybridation TH IX
Le TH IX est le milieu electrolytique utilise comme solution d'hybridation. Il a la composition suivante :
- Tampon phosphate 9.5 mM, - NaCl 0.515 M,
- KC1 2.6 mM,
- Tween 0.048 %,
- IX Denhardt,
- ADN de Saumon lOμg/mL.
(6) Solution d'hybridation de cibles non complémentaire
Un oligonucleotide non complémentaire de séquence par exemple:
5' CGCCAGCAGCTCCAA 3' a été utilisé à une concentration de 0,1 μM dans TH IX.
(7) Solution d'hybridation de cibles complémentaire (CP
Un oligonucleotide complémentaire à l'ODN immobilisé dans le film de polypyrrole a été utilisé à une concentration 0.1 μM dans du TH IX. 5' TAGCTGTATCGTCAAGGC 3'
Exemple 14: Principe de la détection Les polymères selon l'invention sont notamment utilisables pour la détection d'espèces biologiquement actives suceptibles d'être présentes dans un échantillon et de réagir avec l'ODN présent sur la chaîne polymérique. En effet, comme montré ci-après, on observe que les polymères conjugués fonctionnalisés en position 3 de leur hétérocycle après réaction avec un ou plusieurs ligands, présentent une modification de la réponse électrochimique par rapport à un polymère de référence n'ayant pas réagit avec le ou les ligands d'un milieu biologique, visualisée par un changement du potentiel d'oxydation. Cette variation du signal électrochimique du polymère confère une fonction de capteur, et peut ainsi être utilisée pour une mesure quantitative de l'espèce biologiquement active, soit par la variation du potentiel, à courant fixe, soit par la variation du courant à potentiel fixe.
Dans la première partie des manipulations, il a été vérifié que les monomères sont polymérisable, il a été établi les paramètres optimaux de polymérisation et a été défini les conditions de stabilité et d'électroactivité des dépôts dans les solutions utilisées. Le point essentiel concerne la nature des propriétés physico-chimiques du polymère appelées à être modifiés lors de la reconnaissance « ODN/ AN » (oligonucleotide / acide nucléique). En effet, afin de développer une méthode de mesure rapide, sensible et quantitative de la présence d'AN, le but de la présente invention concerne l'élaboration de matériaux électroactifs dans une seule étape, dont la réponse électrochimique sera modifiée après hybridation « ODN/ AN ». La modification concernera une variation de type potentiométrique, par variation du courant du potentiel d'oxydation du polymère, ou amperométrique, par variation du courant d'oxydation (ou de réduction) observé à un potentiel déterminé. Ces variations de réponse électrochimique pourront être mesurées quantitativement, les films de polymères fonctionnalisés étant utilisés soit comme capteurs électrochimique de types ampérométriques ou potentiométriques.
Exemple 15: Modification de la réponse électrochimique suite à l'hybridation
A- Polymérisation des pyrrole-ODN en 3 sur un pré-film polymérique de 3- (hydroxyéthyl)pyrrole
1- Réalisation d'un pré-film polymérique de 3-(hydroxyéthyl)pyrrole On applique un courant de 0.75 N pendant 2.4 secondes (charges de 51 mC.cm"2) à partir de la solution (2)
Figure 4: Premier cycle de voltamétrie cyclique d'une solution de monomères 3- (hydroxyéthyl)pyrrole 0.1 M sur une électrode de platine(diamètre 1mm) (électrolyte LiClO40,5 M dans H2O), v = 50 mV-s-1)
Figure 5: Courbe de voltamétrie cyclique d'une électrode modifiée par un film polymérique de 3-(hydroxyéthyl)pyrrole transféré dans l'électrolyte exempte de monomère
(LiClO40,5 M dans H2O, v = 50 mV.s-1) II a été supposé que ce polymère homogénéise la surface et sert de points d'ancrage pour démarrer la deuxième couche de polymérisation des pyrroles substitués en 3 par des ODΝ. Actuellement il n'est pas possible de réaliser une homopolymérisation de pyrroles substitués en 3 par des ODΝ directement sur l'électrode. Ainsi la polymérisation de pyrrole-ODΝ seuls sur ce pré-film polymérique permettrait d'augmenter la quantité de sondes ODΝ immobilisées sur le support et donc d'observer une modification de la réponse électro chimique du polymère plus évidente. 2- La polymérisation du pyrrole-ODΝ en 3 sur le pré-film est conduite à 0.6 N pendant 115 secondes ( Charges de 19 mC.cm-2) à partir de la solution (4) Figure 6: Premier cycle de voltamétrie cyclique dans une solution de 5 μM de pyrrole -ODΝ en 3 sur une électrode de platine (diamètre 1 mm), (électrolyte LiClO4 0.5 M dans H2O), v = 50 mN.s-l
Le transfert du polymère double couche dans la solution d' électrolyte LiClO4 est présentée dans la voltamétrie cyclique Figure 7: Cycles dans LiClO 0,5 M dans H O, (a) de la sous-couche polymérique de 3- (hydroxyéthyl)pyrrole (Q = 57 mC.cm"2), (b) de la sous-couche et du polypyrrole-ODΝ en 3 (Q = 15 mC.cm 2).v=50 mN.s-1.
Le dépôt est transféré dans le tampon d'hybridation (solution (5)) puis mis en présence de cibles non complémentaires (solution (6)), rincé, puis mis en présence de cibles complémentaires (solution (7)) Dans ces différentes solutions le dépôt est analysé (cycle) par voltampérométrie cyclique. On obtient les résultats de la figure 8 qui montre une baisse d' électroactivité du pic d'oxydation ainsi qu'un décalage de potentiel du pic d'oxydation.
Figure 8: Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à différentes solutions. Cycles dans TH IX, v = 50 mV.s'1. a : 3 jours dans TH IX ; b : 1 h dans M5 ; c : 2 h dans CP.
Le polymère pyrrole-ODN en 3 est donc capable de traduire le phénomène d'hybridation de ces sondes en un signal électrochimique.
B- Copolymérisation du 3-(hydroxyéthyl)pyrrole/pyrrole-ODN en 3 sur un pré-film polymérique de 3-(hydroxyéthyl)pyrrole 1- Réalisation d'un pré-film polymérique de 3-(hydroxyéthyl)pyrrole
On applique un courant de 0.75 N pendant 0.5 secondes (charges de 9 mC.cm"2) à partir de la solution (2)
2- La copolymérisation 3-(hydroxyéthyI)pyrrole/pyrrole-ODΝ en 3 sur le pré-film est conduite à 0.75 N pendant 1.3 secondes ( Charges de 30 mC.cm~2) à partir de la solution (3)
Figure 9: Courbes de voltamétrie cyclique du film contenant deux couches des polymères dans LiClO4 0,5 M dans H2O ; (a) de la sous-couche polymérique de 3-
(hydroxyéthyl)pyrrole
(Q = 37 mC.cm"2), (b) de la sous-couche et du copolymère substitué en 3 (Q = 60 mC.cm"2). v=50 mN.s .
Le dépôt est transféré dans le tampon d'hybridation (solution (5)) puis mis en présence de cibles non complémentaires (solution (6)), rincé, puis mis en présence de cibles complémentaires (solution (7))
Dans ces différentes solutions le dépôt est analysé (cycle) par voltampérométrie cyclique.
On obtient les résultats de la figure 10 qui montre une baisse d' électroactivité du pic d'oxydation ainsi qu'un léger décalage de potentiel du pic d'oxydation.
Figure 10: Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à a : Tampon d'hybridation b : Solution d'hybridation en présence de cibles non complémentaires c : Solution d'hybridation en présence de cibles complémentaires 2004/060904
40
Le copolymère 3-(hydroxyéthyl)pyrrole / pyrrole-ODN en 3 est donc capable de traduire le phénomène d'hybridation de ces sondes en un signal électrochimique.
C- Copolymérisation directe du 3-(hydroxyéthyl)pyrrole avec /pyrrole ODN en 3 directement sur l'électrode de platine Solution de copolymérisation du 3-(hydroxyéthyl)pyrrole avec le pyrrole-ODN en
3
Cette solution a été préparée avec un ratio de 1 unité pyrrole-ODN pour 20000 unités pyrrole.
3-(hydroxyéthyl)pyrrole = 0.1 M [pyrrole-ODN] - 5 μM électrolyte LiClO4= 0.5 M dans H2O
La copolymérisation a lieu à 0.75V sur une électrode de platine diamètre 3mm, contre électrode de platine, référence ECS, agitation et dégazage sous Argon 15 min avant dépôt, temps de dépôt 20s, charge obtenue^ 7.39 mC Le dépôt réalisé est par la suite transféré dans une solution d' électrolyte et dans le tampon d'hybridation. L'allure de la courbe de voltamétrie cyclique (figure 11) confirme la présence d'un film électroactif, stable et réversible.
Modification du signal électrochimique de l'électrode modifiée soumise à a : voltamétrie cyclique dans le tampon d'hybridation à 20m V/s b : voltamétrie cyclique dans le tampon d'hybridation à 20m V/s en présence des sondes non-complémentaires après 20 min c : voltamétrie cyclique dans le tampon d'hybridation à 20m V/s en présence des sondes complémentaires t=5min d : voltamétrie cyclique dans le tampon d'hybridation à 20m Vs en présence des sondes complémentaires après 20 min
L'ajout de cibles non complémentaires montre un faible décalage de potentiel de 10 mV.
La présence de cibles complémentaires conduit à un déplacement d'environ 60mV au bout de 20 min.

Claims

REVENDICATIONS
1. Pyrrole substitué avec un oligonucleotide caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (I) :
Figure imgf000042_0001
dans laquelle
Ri représente un oligonucleotide,
Y représente S ou O,
X représente un bras espaceur choisi parmi -(CH )n-O-, -(CH2)p-O-[(CH2)2-O]q-,
-(CH2)r-CO-NR'-(CH2)r.-O-, -(CH2)r-NCH3-(CH2)r-O-, -(CH2)r-CO-NR'-
[(CH2)2-O]s-, -(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-,
R' représente -H ou -CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r' est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r' et s sont identiques ou différents, le cycle pyrrole est substitué en position 2, 3, 4 ou 5.
2. Pyrrole substitué avec un oligonucleotide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (II) :
Figure imgf000043_0001
dans laquelle Ri, Y et X sont tels que décrits précédemment.
3. Pyrrole substitué avec un oligonucleotide selon la revendication 2 caractérisé en ce que X est -(CH2)n-O- et n est égal à 2.
4. Pyrrole substitué avec un oligonucleotide selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (III) :
Figure imgf000043_0002
dans laquelle Ri, Y et X sont tels que décrits précédemment.
5. Pyrrole substitué avec un oligonucleotide selon la revendication 4 caractérisé en ce que X est -(CH2)n-O- et n est égal à 2.
6. Procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués avec un oligonucleotide selon l'une des revendications 2 ou 3, b) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, c) on copolymérisé électrochimiquement le monomère de l'étape a) avec le monomère de l'étape b).
7. Procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon la revendication 6 caractérisé en ce que le rapport molaire entre le pyrrole substitué de l'étape a) et le pyrrole substitué de l'étape b) est compris entre 1/1000 et 1/100000.
8. Procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, b) on polymérise électrochimiquement ce monomère de l'étape a) pour former un premier polymère conducteur électroactif, c) on dispose d'un monomère choisi parmi les pyrroles substitués avec un oligonucleotide selon l'une des revendications 2 ou 3, d) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, e) on copolymérisé électrochimiquement le monomère de l'étape c) avec le monomère de l'étape d) sur ledit premier polymère conducteur électroactif formé à l'étape b) pour obtenir un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides.
9. Procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon la revendication 8 caractérisé en ce que le rapport molaire entre le pyrrole substitué de l'étape c) et le pyrrole substitué de l'étape d) est compris entre 1/1000 et 1/100000.
10. Procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, b) on polymérise électrochimiquement ce monomère de l'étape a) pour former un premier polymère conducteur électroactif, c) on dispose d'un monomère choisi parmi les pyrroles substitués avec un oligonucleotide selon l'une des revendications 2 ou 3, d) on polymérise électrochimiquement le monomère de l'étape c) sur ledit premier polymère conducteur électroactif formé à l'étape b) pour obtenir un polymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides.
11. Procédé de préparation d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dispose d'au moins un monomère choisi parmi les pyrroles substitués susceptibles de polymériser avec d'autres pyrroles, b) on polymérise électrochimiquement ce monomère de l'étape a) pour former un premier polymère conducteur électroactif, c) on dispose d'un pyrrole substitué avec un oligonucleotide selon l'une des revendications 4 ou 5, d) on couple électrochimiquement le pyrrole substitué de l'étape c) sur ledit premier polymère conducteur électroactif formé à l'étape b) pour obtenir un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides.
12. Copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'une des revendications 6-11.
13. Electrode caractérisée en ce qu'elle comprend un support conducteur revêtu en surface d'au moins un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon la revendication 12.
14. Matrice d'électrodes caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une électrode selon la revendication 13.
15. Dispositif pour la détection d'un analyte dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend au moins un copolymère selon la revendication 12 et/ou au moins une électrode selon la revendication 13.
16. Dispositif pour la détection d'un analyte dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend au moins une matrice d'électrodes selon la revendication 14.
17. Procédé de détection d'un analyte dans un échantillon caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on dispose d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon la revendication 12 ou d'une électrode comprenant un support conducteur revêtu d'un copolymère conducteur électroactif fonctionnalisé avec des oligonucléotides selon la revendication 13 ; b) on met en contact ledit copolymère électroactif ou ladite électrode de l'étape a) avec l'échantillon dans des conditions de réaction appropriées pour l'interaction spécifique de l'analyte avec lesdits oligonucléotides; c) on détecte l'analyte, lié auxdits oligonucléotides, au moyen d'une mesure électrique.
18. Procédé selon la revendication 17 caractérisé en ce que l'on détecte à l'étape c) un ADN ou un ARN s'hybridant de manière spécifique auxdits oligonucléotides du copolymère conducteur électroactif.
19. Procédé selon l'une des revendications 17 ou 18 caractérisé en ce que l'on mesure à l'étape c) une variation de potentiel ou une variation de courant.
20. Pyrrole substitué caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (IV) :
Figure imgf000047_0001
dans laquelle
R2 est un groupe protecteur de l'amine choisi parmi le monométhoxytrityle, le diméthoxytrityle, le tosyle, le triisopopyl silyle, le tert-butoxycarbonyle, le 9- fluorényloxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle et l'acétyle.
R3 est un groupe phosphore susceptible de réagir avec un groupement hydroxyle libre choisi parmi un groupement phosphotriester, H-phosphonate ou phosphoramidite, X représente un bras espaceur choisi parmi -(CH2)n-O-, -(CH2)P-O-[(CH ) -O]q-,
-(CH2)r-CO-NR'-(CH2)r-O-, -(CH2) NCH3-(CH2)r>-O-, -(CH2)r-CO-NR'-
[(CH2)2-O]s-, -(CH2)r-NCH3-[(CH2)2-O]s-,
R' représente -H ou -CH3, n est un nombre entier compris entre 1 et 5, p est un nombre entier compris entre 1 et 2, q est un nombre entier compris entre 1 et 4, r est un nombre entier compris entre 1 et 3, r' est un nombre entier compris entre 1 et 3, s est un nombre entier compris entre 1 et 3, n, p, q, r, r' et s sont identiques ou différents, le cycle pyrrole est substitué en position 2, 3, 4 ou 5.
21. Pyrrole substitué selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (V) :
Figure imgf000048_0001
dans laquelle R2, R3 et X sont tels que définis précédemment.
22. Pyrrole substitué selon la revendication 21 caractérisé en ce que R2 est le monométhoxytrityle.
23. Pyrrole substitué selon l'une des revendications 21 à 22 caractérisé en ce que R3 est un groupement phosporamidite.
24. Pyrrole substitué selon l'une des revendications 21 à 23 caractérisé en ce que X est -(CH2)n-O- et n est égal à 2.
25. Pyrrole substitué selon la revendication 20 caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (VI) :
Figure imgf000048_0002
dans laquelle R2, R3 et X sont tels que définis précédemment.
26. Pyrrole substitué selon la revendication 25 caractérisé en ce que R est le monométhoxytrityle.
27. Pyrrole substitué selon l'une des revendications 25 à 26 caractérisé en ce que R3 est un groupement phosporamidite.
28. Pyrrole substitué selon l'une des revendications 25 à 27 caractérisé en ce que X est -(CH2)n-O- et n est égal à 2.
29. Procédé de préparation d'un pyrrole substitué avec un oligonucleotide de formule générale (I)
Figure imgf000049_0001
dans laquelle Ri, X et Y sont tels que décrits précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on effectue les cycles de synthèse d'un oligonucleotide, b) on substitue, dans le dernier cycle de synthèse dudit oligonucleotide, un pyrrole substitué de formule générale (IV)
Figure imgf000049_0002
dans laquelle R2, R3 et X sont tels que définis précédemment, au dernier nucléotide en 5' ou en 3' dudit oligonucleotide ; c) on clive ledit groupe protecteur R2.
0. Procédé selon la revendication 29 caractérisé en ce que à l'étape b) le groupe protecteur R2 est le monométhoxytrityle et en ce que à l'étape c) on clive le groupe protecteur par un traitement en milieu acide.
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