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WO2004058977A1 - Proteine chimerique pour le criblage d'agonistes et d'antagonistes des voies de signalisation cellulaire dependantes des recepteurs couples aux proteines g - Google Patents

Proteine chimerique pour le criblage d'agonistes et d'antagonistes des voies de signalisation cellulaire dependantes des recepteurs couples aux proteines g Download PDF

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Publication number
WO2004058977A1
WO2004058977A1 PCT/FR2003/003860 FR0303860W WO2004058977A1 WO 2004058977 A1 WO2004058977 A1 WO 2004058977A1 FR 0303860 W FR0303860 W FR 0303860W WO 2004058977 A1 WO2004058977 A1 WO 2004058977A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
subunit
chimeric protein
proteins
page
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2003/003860
Other languages
English (en)
Inventor
Michel De Waard
Alain Dupuis
Didier Grunwald
Guillaume Sandoz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority to JP2004563300A priority Critical patent/JP2006526982A/ja
Priority to US10/540,247 priority patent/US20070141665A1/en
Priority to CA002511213A priority patent/CA2511213A1/fr
Priority to AU2003303351A priority patent/AU2003303351A1/en
Priority to EP03813931A priority patent/EP1576162A1/fr
Publication of WO2004058977A1 publication Critical patent/WO2004058977A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a chimeric recombinant protein derived from the ai and ⁇ subunits of high-threshold calcium channels, as well as to its applications for the study of cell signaling pathways dependent on receptors coupled to G proteins (GPCR). and the identification of compounds modulating the activity of G proteins.
  • GPCR G proteins
  • the class of GPCR includes more than a thousand identified members, coded by genes representing 2 to 5% of the coding potential of the vertebrate genome (El Far and Betz, Biochem. J., 2002, 365, 329-336); there are 27 genes coding for G ⁇ subunits, 5 for G ⁇ subunits, and 14 for G ⁇ subunits (Albert and Robillard, Cell, 2002, 14, 407-418).
  • GPCRs are capable of ensuring recognition and transduction of messages as varied as those of amino acids (glutamic acid 7), peptides (angiotensin, neurotensin, somatostatin %), proteins (thyrotropin (TSH), follicle stimulating hormone (FSH) %) , amines (acetylcholine, adrenaline, serotonin %), lipids (prostaglandins, leukotrienes %), nucleotides and nucleosides (adenosine or ATP).
  • Ions Ca "1”
  • odorous and gustatory molecules odorous and gustatory molecules
  • photons and pheromones are also part of the extracellular signals recognized by GPCRs (for review, see Gether, Endocrine reviews, 2000, 21, 90-113 and Albert and Robillard, supra).
  • the extracellular signal is transduced inside the cell via the heterotrimeric G proteins binding the guanylic nucleotides (GDP and GTP), composed of subunits called G ⁇ , G ⁇ , G ⁇ ; recognition of the extracellular signal by the RCPG results in the activation of the G proteins, which results in the dissociation of the heterotrimer into G ⁇ and G ⁇ , and the binding of the G ⁇ subunit to GTP.
  • GDP and GTP guanylic nucleotides
  • the effectors controlled by the G ⁇ subunits can be enzymes (phospholipases A2 and C, adenylyl- and guanylylcyclases, c-jun kinase, tyrosine- phosphatase (SH-PTP2) ”), the activation of which will influence the rate of second messengers produced or released (phosphoinositides and diacyls-glycerols, Ca ++ , cAMP, cGMP Among channels (with potassium, calcium, sodium or chlorine conductances), ion exchangers (sodium / proton) or more recently kinases (Btk tyrosine kinases (Bruton's tyrosine kinase), MAP kinases (Mitogen-Activated protein kinase), (Albert and Robillard, supra).
  • enzymes phospholipases A2 and C, adenylyl- and guanylylcyclases, c-jun kin
  • G ⁇ can also modulate the activity of effectors at least as numerous as those controlled by G ⁇ , namely: channels (with sodium conductivity, calcium dependent on voltage (N and P / Q) or potassium with incoming rectification (GIRK: G protein inward rectifyer K + channel) Among, the so-called “classic” enzymes (phospholipases A2 and C, adenylyl-cyclase I, II, IV, tyrosine phosphatase (SH-PTP1) ”), as well as a number important kinases (phosphoinositide 3-kinase, ⁇ -adrenergic receptor kinases, c-jun kinase, MAP kinases, tyrosine kinases Btk and T-cell-specific kinase (Tsk), (for review see Albert and Robillard, supra).
  • channels with sodium conductivity, calcium dependent on voltage (N and P / Q) or potassium with incoming rectification
  • GIRK G
  • the calcium channels comprise channels of the low-threshold type, activating by weak depolarizations and channels of the high-threshold type, activating by strong depolarizations.
  • the high-threshold type channels represent a heteromultimeric complex ⁇ 2 ⁇ and ⁇ , in which the membrane ⁇ j subunit, constituting the channel proper, is associated with an intracellular regulatory subunit ⁇ (or Ca v ⁇ ), by through its interaction domain (AID domain for alpha interaction domain), with a conserved motif: QQ-E - L-GY-- WI - E (one-letter code; - representing any amino acid ; Pragnell et al., Nature, 1994, 368, 67-70; Figure 1) in which residues Y392, W395 and 1396 are essential for the binding of the ⁇ subunit (De Waard et al., FEBS, 1996, 380, 272-276).
  • the ⁇ regulatory subunit binds to the AID domain via its BID domain (bet ⁇ interaction domain; DeWaard et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 12056-12064) which is included in a domain GK-like (Hanlon et al., FEBS, 1999, 445, 366-370). Seven subunits have been identified: ⁇ i A (Ca v ⁇ 2 . ⁇ ), aie (Ca v a 2 .2) > aiE (Ca v a 2.
  • the high-threshold calcium channels of type N and P / Q are directly involved in triggering the functioning of the synapse: their opening under the effect of an action potential induces calcium entry into the presynaptic termination. This signal triggers the secretion of neuromediators such as glutamate in the synaptic cleft and, thus, the propagation of nerve impulses in postsynaptic dendrite.
  • the N and P / Q channels are regulated by receptors linked to trimeric G proteins (GPCR) such as metabotropic class III glutamate receptors (for review: El Far and Betz., Supra) or noradrenergic, muscarinic, GABAergic (GABA 5 ⁇ -aminobutyric acid), serotonergic, dopaminergic, and opioid receptors (for review: Hille, Trends NeuroSci., 1994, 17, 531-536) .
  • GPCR trimeric G proteins
  • G ⁇ subcomplex is directly responsible for an inhibition of the activity of P / Q channels which results from a direct fixation of G ⁇ on the intra-cytoplasmic loop connecting the membrane domains I and II (loop I-II) of the ⁇ j subunit (De Waard et al., Nature, 1997, 385, 446-450).
  • this loop has several interaction sites with G ⁇ , overlapping the binding domain with the regulatory subunit Ca v ⁇ (AID domain; Figure 1), including a consensus motif QQ - RL-GY included in the domain AID, is essential for the binding of G ⁇ ( Figure 1; De Waard et al., Nature 1997, 385, 446-450; Zamponi et al., Nature, 1997, 385, 442-446).
  • the Ca v ⁇ regulatory subunit seems to counteract the functional effect of G proteins (Bourinet et al, PNAS, 1996, 93, 1486-1491).
  • the inventors have constructed chimeric proteins by NH 2 and / or COOH terminal fusion: (i) of the loop I-II of the subunit ai of high-threshold calcium channels sensitive or insensitive to the G proteins (respectively, ⁇ i A or Ca v ⁇ . ⁇ constituting a P / Q type neural channel and ⁇ j c or Ca v ⁇ . 2 constituting a cardiovascular type L channel) or a fragment thereof; said loop corresponds to positions 367 to 487 with reference to the sequence of the Ca v ⁇ 2 . ⁇ subunit, and comprises the domain for binding to a ⁇ subunit of a calcium channel (or AID domain) and the sites of binding to a G ⁇ subunit of a G protein (FIG. 1), and
  • the inventors have shown that the chimeric protein derived from an ai subunit sensitive to G proteins exists in two "closed” or “open” forms, respectively in the absence or in the presence of G ⁇ subunit capable of binding to said fragment of the ⁇ j subunit, either in the form of G ⁇ monomer, either in the form of a G ⁇ heterodimer.
  • the chimeric protein is capable of folding, thus allowing the domains of interaction of the ai and ⁇ subunits of the calcium channel to associate by a stable intramolecular bond (closed form).
  • the intramolecular bond is destroyed and the domains of interaction of the ai and ⁇ subunits of the calcium channel dissociate (open form), thus allowing each of the domains to interact respectively with G ⁇ (interaction domain of the ai subunit: AID domain) and / or an ai subunit of a calcium channel (interaction domain of the ⁇ subunit: BID domain).
  • the chimeric protein derived from an ⁇ j subunit insensitive to G proteins is capable of folding, thus allowing the interaction domains of the ai and ⁇ subunits of the calcium channel to associate by a stable intramolecular bond. (closed form).
  • the intramolecular bond can also be destroyed and the interaction domains of the ai and ⁇ subunits of the calcium channel dissociate (open form), thus allowing each of the domains to interact respectively with said antagonist other than G ⁇ or G ⁇ (interaction domain of the ⁇ j subunit: AID domain) and / or an a subunit of a calcium channel (interaction domain of the ⁇ subunit: BID domain).
  • chimeric proteins derived from the ai and ⁇ subunits of high-threshold calcium channels represent tools that are simple to implement, sensitive, specific and useful for the following applications:
  • chimeric proteins derived from a subunit ai sensitive to G proteins make it possible to determine the variations in cell concentration in free G ⁇ subunits, ex vivo, in time and therefore to measure the activation of G proteins in cells: such chimeric proteins represent ubiquitous biosensors for the activation of G proteins perfectly suited to the study of cellular signaling and regulatory pathways dependent on receptors coupled to G proteins and to the screening of agonists / antagonists of these signaling pathways capable of increasing or decreasing the concentration of free G ⁇ subunits in cells and therefore of modulating the activity of these regulatory and cellular signaling dependent on receptors coupled to G proteins.
  • - chimeric proteins derived from a subunit ai sensitive or resistant to G proteins represent simple, sensitive and specific tools, perfectly suited to screening for antagonists of the interaction between the ai and ⁇ subunits, capable of modulating the activity of all high-threshold calcium channels.
  • the chimeric proteins derived from an ai subunit and from a ⁇ subunit of a high-threshold calcium channel as defined above are also useful for the systematic pharmaco-toxicological control of new drugs in phase I and the search for natural orphan receptor agonists.
  • the subject of the present invention is a chimeric protein derived from a high threshold calcium channel, characterized in that it comprises at least one ⁇ subunit or a fragment thereof including at least the BID domain, fused (e) at its NH 2 or COOH end with the loop I-II of an ⁇ j subunit or a fragment thereof including at least the AID domain.
  • the AID and BID domains are as defined above; the loop I-II of the ai subunit comprises the AID domain for binding to the ⁇ subunit and the sites for binding to the G ⁇ subunit of a G protein, including a consensus binding site which is included in this AID domain.
  • Figure 1 The invention encompasses chimeric proteins derived from the ai and ⁇ subunits of vertebrates, in particular from human or non-human mammals and from their orthologs in invertebrates.
  • loop I-II or its fragment is either fused directly to the NH 2 or COOH end of the ⁇ subunit or of its fragment, or the two sequences are separated by a spacer peptide, the size and amino acid sequence are such that the AID and BID domains of the chimeric protein containing said spacer are capable of interacting to form an intramolecular bond which is displaced in the presence of an antagonist (change from closed to open form) ; such a spacer peptide is in particular represented by a polyglycine sequence.
  • said chimeric protein comes from a high-threshold calcium channel sensitive to G proteins.
  • said chimeric protein comprises a fragment of a subunit ai selected from ctiA, "and ⁇ i £.
  • said ⁇ subunit is selected from the group consisting of ⁇ i, ⁇ 2 , ⁇ 3 and ⁇ 4 .
  • the invention also includes chimeric proteins constituted by sequences functionally equivalent to the sequences as defined above, that is to say of which the ⁇ subunit and the loop I-II of the ai subunit or their fragments as defined above are capable of forming an intramolecular bond via their interaction domains; said bond possibly being destroyed in the presence of free G ⁇ or G ⁇ subunits or other antagonists of the interaction between the ⁇ j and ⁇ subunits ("open form").
  • sequences there may be mentioned for example the sequences derived from the preceding sequences by: - mutation (substitution and / or deletion, and / or addition) of one or more amino acids of the sequences as defined above,
  • non-proteinogenic amino acid residue any amino acid which does not form part of a natural protein or peptide, in particular any amino acid whose carbon carrying the side chain R, namely the group - CHR-, located between -CO- and -NH- in the natural peptide chain, is replaced by a motif which does not form part of the constitution of a natural protein or peptide.
  • the subject of the present invention is in particular a variant chimeric protein derived from a chimeric protein as defined above, characterized in that it has a mutation of at least one amino acid in the sequences of said ⁇ subunit and / or loop I-II of a subunit ⁇ j.
  • said variant has a mutation which modifies the affinity of the ⁇ subunit for the loop I-II of the ai subunit and / or vice versa; such mutations make it possible to obtain a chimeric protein more or less sensitive to the concentration of free G ⁇ or G ⁇ subunit.
  • mutations in the AID domain of the loop I-II of the ⁇ ls subunit as described in Pragnell et al., Cited above and Waard et al. FEBS, 1996, 380, 272-276, namely: Q383A, Q384A, E386D, E386S, L389H, G391R, Y392S, Y392F, W395A, I396A and E400A.
  • said chimeric protein or its variant is coupled, preferably covalently, to at least one suitable marker allowing the detection and / or the purification and / or the immobilization of said protein, for example: an antigenic epitope, a label of the polyhistidine type, a luminescent compound (fluorophore such as GFP or one of its variants: CFP, YFP and BFP), radioactive, or enzymatic.
  • a suitable marker allowing the detection and / or the purification and / or the immobilization of said protein, for example: an antigenic epitope, a label of the polyhistidine type, a luminescent compound (fluorophore such as GFP or one of its variants: CFP, YFP and BFP), radioactive, or enzymatic.
  • said coupling is carried out by any suitable means, in particular by a peptide bond via the COOH and / or NH 2 functions which are terminal of the peptide chain, or else by another covalent bond, such as for example : an ester, ether, thioether, thioester bond, via reactive functions of the side chain of an amino acid of the peptide chain.
  • said chimeric protein comprises a fluorophore acceptor or donor respectively at its NH 2 and or COOH end.
  • the acceptor fluorophores for example CFP or BFP
  • CFP or BFP can be coupled either to the NH or COOH end of the chimeric protein
  • the donor fluorophores for example GFP or YFP are fused to the opposite end of said chimeric protein.
  • Such chimeric proteins are useful for the ex vivo study in real time of the activation of G proteins and the screening of molecules capable of modulating this activation by measurement of fluorescence transfer (FRET).
  • labeling with a luminescent compound has the advantage of obtaining a localized signal which does not require the presence of other reagents as is the case for enzymatic labeling.
  • This type of marking also allows the use of phenomena such as energy transfer which can be carried out by different mechanisms: energy transfer by resonance, transfer of radiative energy (the acceptor absorbs the light emitted by the donor ) and electron transfer.
  • D and A which are coupled at each end of the chimeric protein so that the energy transfer takes place only when the intramolecular intercation between the BID and AID domains takes place (closed form). This phenomenon results in a reduction or extinction of the luminescence of D and an emission of luminescence of A if the latter is luminescent, when D is excited. During these assays, the variation in the luminescence of A is measured, or the variation in the luminescence of D; the nature of A and D being variable.
  • two fluorescent proteins can be used as donor and acceptor, or else a rare earth complex (europium, terbium) with a chelate, cryptate or macrocycle as donor and a fluorescent protein as acceptor .
  • the measurement of the variation in luminescence of D is based on the ability of a compound (A) to decrease or suppress the luminescence of another compound (D) when these are sufficiently close (“Quench").
  • the range of molecules A that can be used is therefore more extensive and thus includes non-luminescent compounds such as heavy metals, heavy atoms, chemical molecules such as for example methyl red, nanoparticles such as those sold under the name Nanogold ® by the company Nanoprobes (USA), or even the molecules sold under the names DABCYL® (Eurogentec, Belgium), QSY Dyes (Molecular Probes Inc., USA), ElleQuencher® (Oswell / Eurogentec) or Black Hole Quenchers® ( Biosearch Technologies Inc., USA).
  • non-luminescent compounds such as heavy metals, heavy atoms, chemical molecules such as for example methyl red
  • nanoparticles such as those sold under the name Nanogold ® by the company Nanoprobes (USA)
  • DABCYL® Eurogentec, Belgium
  • QSY Dyes Molecular Probes Inc., USA
  • ElleQuencher® Oswell / Eurogentec
  • Black Hole Quenchers® Biosearch Technologies Inc., USA
  • the present invention also relates to a peptide, characterized in that it comprises a fragment of at least 7 amino acids of the sequence of the chimeric protein as defined above, located at the junction of the ⁇ subunit and of the loop I-II of the ai subunit or of their fragments as defined above; such peptides make it possible in particular to produce antibodies specific for the chimeric protein according to the invention.
  • the present invention also relates to antibodies, characterized in that they are directed against a chimeric protein or a peptide as defined above.
  • said antibodies are either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
  • These antibodies can be obtained by conventional methods, known per se, comprising in particular the immunization of an animal with a protein or a peptide in accordance with the invention, in order to make it produce antibodies directed against said protein or said peptide.
  • Such antibodies are useful in particular for immobilizing the chimeric protein on a solid support, purifying it or even detecting it.
  • the present invention also relates to a nucleic acid molecule, characterized in that it is selected from the group consisting of the sequences coding for a chimeric protein or a peptide as defined above and the sequences complementary to the preceding, sense or antisense.
  • the invention also relates to probes and primers, characterized in that they comprise a sequence of approximately 10 to 30 nucleotides corresponding to that located at the junction of the ⁇ subunit and of the I-II loop of the subunit ai or their fragments as defined above; these probes and these primers make it possible to specifically detect / amplify said nucleic acid molecules encoding the chimeric protein according to the invention.
  • the subject of the invention is also other primers making it possible to specifically amplify the ⁇ subunit and / or the loop I-II of the ai subunit or their fragments as defined above, characterized in that '' they are selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 7, 8 and 9.
  • nucleic acid molecules according to the invention are obtained by conventional methods, known in themselves, by following standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley andson lnc, L ⁇ brary ofCongress, USA).
  • sequences coding for a chimeric protein according to the invention can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR using an appropriate primer pair or else by screening of genomic DNA libraries by hybridization with a homologous probe.
  • the derivative nucleic acid molecules, coding for a variant of the chimeric protein according to the invention are obtained by conventional methods, making it possible to introduce mutations into a nucleic acid sequence, known in themselves, following the aforementioned standard protocols.
  • the sequence coding for a variant of the chimeric protein according to the invention can be obtained by site-directed mutagenesis according to the method of Kunkel et al., (PNAS, 1985, 82, 488-492).
  • the present invention also relates to a recombinant eukaryotic or prokaryotic vector, characterized in that it comprises an insert consisting of the nucleic acid molecules coding for a chimeric protein as defined above.
  • said recombinant vector is an expression vector in which said nucleic acid molecule or one of its fragments is placed under the control of regulatory elements for appropriate transcription and translation.
  • said vector may comprise sequences fused in phase with the 5 'and / or 3' end of said insert, useful for the immobilization, and / or the detection and / or the purification of the protein expressed from said vector.
  • nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell
  • choice of an appropriate vector depends on the envisaged use for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form or else integration into the chromosomal material of the 'host), as well as the nature of the host cell.
  • viral or non-viral vectors such as plasmids can be used.
  • vectors are constructed and introduced into host cells by conventional recombinant DNA and genetic engineering methods, which are known per se.
  • said recombinant vector it is a eukaryotic expression vector having a sequence selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 10;
  • the plasmid SEQ ID NO: 5 contains the loop I-II of the Ca v ⁇ 2 . ⁇ rabbit subunit fused to the C-terminal end of the Ca v ⁇ 3 subunit of rat, under the control of the promoter CMN and the plasmid SEQ ID ⁇ O: 10 contains an insert consisting of 5 'to 3' by the phase fusion of the following fragments: the sequence GAP-43, the AD ,c coding for EGFP (fluorescence donor), the GK-like domain of the rat Ca v ⁇ 3 subunit, the loop I-II of the rabbit Ca v ⁇ 2.
  • the present invention also relates to cells modified by a chimeric protein, a nucleic acid molecule or else a recombinant vector as defined above.
  • said cells are eukaryotic cells.
  • said cells express at least one receptor capable of binding to G proteins (RCPG); said cells are either cells constitutively expressing at least one RCPG, or modified cells which express a recombinant RCPG.
  • RCPG G proteins
  • Modified cells in accordance with the invention can be obtained by any means, known in themselves, making it possible to introduce a nucleic acid molecule or a protein into a host cell.
  • viral vectors such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses and ANAs, in which the sequence of interest has been inserted, can be used, among others.
  • the subject of the present invention is animals and in particular non-human transgenic mammals, characterized in that all or part of their cells are transformed by a nucleic acid molecule according to the invention.
  • These are, for example, animals into which a sequence coding for the chimeric protein according to the invention has been introduced under the control of the control of regulatory elements for appropriate transcription and translation.
  • Such transgenic animals are useful, in particular for the secondary screening stages: i) to evaluate the cellular or even tissue targeting of an active molecule on GPCRs or calcium channels, identified during a primary screening, ii) to study bioavailability of such a molecule, and iii) for research, as a first approach, for possible side effects of such a molecule.
  • the present invention also relates to the use of a product selected from the group consisting of chimeric proteins, nucleic acid molecules, recombinant vectors, modified cells and transgenic non-human mammals as defined above. above, for the study of cellular signaling and regulatory pathways dependent on receptors coupled to G proteins.
  • the present invention also relates to the use of a product selected from the group consisting of chimeric proteins, nucleic acid molecules, recombinant vectors, modified cells and transgenic non-human mammals as defined above. above, for the screening of agonists and / or antagonists of cellular signaling and regulatory pathways dependent on receptors coupled to G proteins.
  • the present invention also relates to the use of a product selected from the group consisting of chimeric proteins, nucleic acid molecules, recombinant vectors, modified cells and transgenic non-human mammals as defined above, for the screening of antagonists of the interaction between the ai and ⁇ subunits high-threshold calcium channels; such antagonists are useful for modulating the activity of all of the high-threshold calcium channels and therefore represent drugs capable of being used in the treatment of diseases linked to a dysfunction of calcium homeostasis and of pathologies where modulation calcium intake can compensate for a cellular deficit, in particular epilepsies, ataxias, migraines, muscular hypo- and hyper-calcemias, diabetes, and cardiovascular diseases.
  • the study of cellular signaling and regulatory pathways dependent on receptors coupled to G proteins is carried out by a method comprising at least the following steps: ai) the culture of modified cells expressing a chimeric protein derived from a calcium channel sensitive to G proteins and a receptor coupled to G protein, as defined above, bi) transducing a signal via said G protein-coupled receptor by any suitable means, and ci) determining, by any suitable means, the proportion of said chimeric protein expressed in said cells which is linked to a G ⁇ subunit.
  • the screening of agonists / antagonists of the cellular signaling and regulatory pathways dependent on receptors coupled to G proteins is carried out by a method comprising at least the following steps: a 2 ) the culture of modified cells expressing a chimeric protein originating from a calcium channel sensitive to G proteins and a receptor coupled to G proteins, as defined above, b 2 ) transduction of a signal via said coupled receptor to protein G, by any suitable means, c 2 ) the comparative determination, by any appropriate means, of the proportion of said chimeric protein expressed in cells which is linked to a G ⁇ subunit, before and after bringing said contacts into contact cells in b 2 ) with a molecule to be tested, and d 2 ) the identification of agonist / antagonist molecules of the signaling and regulatory pathways areas dependent on receptors coupled to G proteins, corresponding to those capable of respectively increasing and decreasing the cell concentration in free G ⁇ subunits.
  • said cells modified in ai ) or in a 2 ) express a chimeric protein as defined above coupled at its ends
  • the screening of antagonists of the interaction between the ⁇ j and ⁇ subunits of the high-threshold calcium channels is carried out by a method comprising at least the following steps: a) setting in contact with a molecule to be tested with a chimeric protein derived from a calcium channel sensitive or insensitive to G proteins as defined above and with a peptide comprising the AID domain of an ai subunit insensitive to G proteins, b 3 ) measuring, by any appropriate means, the binding of said chimeric protein to said peptide, and c 3 ) identifying the antagonists of the interaction between the subunits ai and ⁇ corresponding to those with which a binding of said chimeric protein to said peptide.
  • said peptide comprising the AID domain is immobilized on a solid support, and said chimeric protein is coupled to a marker allowing the measurement of said bond in b), as defined above, including a fluorophore.
  • the subject of the invention is also a kit for implementing the methods as defined above, characterized in that it includes at least one of the following products: a chimeric protein, an antibody, a recombinant vector, a modified cell or a transgenic non-human mammal, as defined above.
  • the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of use of the chimeric protein which is the subject of the present invention as well as to annexed drawings, in which:
  • FIG. 1 illustrates the overlap, in the loop I-II of the Ca v ⁇ . ⁇ j subunit of the binding domains to the ⁇ subunit (AID domain) and to the G ⁇ complex.
  • the AID domain is represented by a black box (positions 383 to 400).
  • the binding sites for the G ⁇ (G ⁇ ) subunit are represented by hatched boxes; the site in the central position (QQ - RL-GY) which is essential for the binding of the G ⁇ subunit (G ⁇ ) is included in the AID domain.
  • FIGS. 2 and 3 illustrate the displacement of the interaction Ca v ⁇ . ⁇ - Ca v ⁇ by the G ⁇ complex of the G proteins:
  • FIG. 2a illustrates the linkage of the ⁇ 3 subunit (1 to 3 pM) with the AID ⁇ domain. 2 of the GST-AID ⁇ fusion protein. 2 (1 ⁇ M),
  • FIG. 2b shows that the fusion of the ⁇ 3 subunit with the loop I-II of the ⁇ 2 . ⁇ subunit (Chimera Ca v ⁇ 3 - I-II 2 . ⁇ ) prevents its binding with the domain AIDj.2 of the GST-AID ⁇ .2 fusion protein,
  • FIG. 2c shows that the deletion of the 18 amino acids from the AID 2 . ⁇ domain (Chimera Ca v ⁇ 3 - I-II 2 . ⁇ AID) restores the bond of the ⁇ 3 subunit with the AID ⁇ .2 domain of the GST-AID ⁇ fusion protein .
  • - Figure 3 shows that the addition of G ⁇ complex displaces the intramolecular interaction between the Ca v ⁇ subunit and the loop I-II of the ⁇ 2.
  • ⁇ subunit of the chimera Ca v ⁇ 3 - I- II 2.1 thus allowing the ⁇ 3 subunit to bind with the domain AIDj. 2 of the fusion protein GST-AID1.2; the concentration of G ⁇ , capable of displacing 50% of the bond between the Ca v ⁇ subunit and the AID domain .
  • ⁇ (IC 50 ) is l60nM
  • FIGS. 4 to 7 illustrate the FRET analysis of the disassembly of the P / Q calcium channel, induced by the G ⁇ complex:
  • FIG. 4a illustrates the labeling with Cy3 of the purified His-Ca v ⁇ 3 subunit.
  • CB Coomassie blue staining of an SDS-PAGE gel illustrating the purity of the protein.
  • FS recording of the fluorescence of an uncolored gel showing the covalent labeling of the protein,
  • FIG. 4b illustrates the effect of the Ca v ⁇ subunit coupled to a fluorochrome (Cy3-Ca v ⁇ 3 ) on the current-voltage relationship of Ca v ⁇ 2 . ⁇ channels expressed in xenopus oocytes, by comparison with the unlabeled Ca v ⁇ 3 subunit (injection of cRNA),
  • FIG. 6 illustrates the kinetics of decrease in the fluorescence transfer induced by the injection of 100 nM of G ⁇ .
  • Upper panel variations in the fluorescence emission spectrum
  • lower panel variations in the ratio of fluorescence intensities (R f ) at 585 irai and 525 nm,
  • FIG. 7 illustrates the R f values of non-injected oocytes (-), injected with G ⁇ (100 nM) or with heat-inactivated G ⁇ (HI-G ⁇ ).
  • FIG. 8 illustrates the sequence of the plasmid pcDNA3Cav ⁇ 3- I-II2.1 (SEQ ID NO: 5) containing the loop I-II of the subunit Ca v ⁇ 2.
  • FIG. 9 illustrates the sequence of the plasmid pCHIC (SEQ ID NO: 10) derived from the vector pEYFPmemb.
  • PCR amplification and the cloning of the recombinant DNA are carried out by the conventional techniques known to those skilled in the art, following standard protocols such as those described for example in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000 , Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).
  • An expression plasmid containing a cDNA encoding a chimeric protein according to the invention constituted by the C-terminal fusion of the rat ⁇ 3 subunit with the intracellular loop I-II of the rabbit ai subunit and has been constructed as follows:
  • the cDNA of the rat Ca v ⁇ 3 subunit (corresponding to positions 98 to 1545 of the GENBANK M88755 sequence) is amplified by PCR using the following sense and antisense primers: - 5'-TTTGGTACCATGGATGACGACTCCTACGTGCCCGGGTTTGAGGACTCGGAGGCGGGTT- 3 '(SEQ ID NO: 1), and - ⁇ '-GCGGAATTCGTAGCTGTCCTTAGGCCAAGGCCGGTTACGCTGCCAGTT-S', (SEQ ID NO: 2).
  • the fragment thus obtained was cloned between the Kpn I and EcoR I sites of the expression plasmid (pcDNA3, IN VITROGEN) to give the recombinant plasmid pcDNA3-Ca v ⁇ 3.
  • the cDNA fragment corresponding to loop I-II of the Ca v ⁇ 2 . ⁇ rabbit subunit (positions 1383 to 1754 of the GENBANK X57477 sequence), the sequence is illustrated in FIG. 1, was amplified by PCR using the following sense and antisense primers:
  • the fragment obtained was cloned at the EcoR I site of the plasmid pcDNA3-Cav ⁇ 3 to give the recombinant plasmid pcDNA3-Ca v ⁇ 3-I-II 2 . ⁇ .
  • a control plasmid containing a cDNA encoding a chimeric protein constituted by the C-terminal fusion of the rat ⁇ 3 subunit with the intracellular loop I-II of the rabbit Cav ⁇ 2 . ⁇ subunit deleted from the AID domain has been constructed in the same way ; the recombinant plasmid thus obtained is called pcDNA3-Cav ⁇ 3-I-II 2 . ⁇ AID.
  • ⁇ has the sequence SEQ ID NO: 5.
  • ⁇ presents the expected sequence for a chimeric protein according to the invention.
  • ⁇ AID corresponds to that expected for a chimeric protein deleted from the AID domain.
  • ⁇ AID, and the subunit Ca v ⁇ 3 are transcribed and translated in vitro in the presence of [ 35 S] -methionine , from the plasmids as described in Example 1, using the TNT system PROMEGA kit, following the manufacturer's instructions.
  • FIG. 2b shows that the fusion of the ⁇ 3 subunit with the loop I-II of the ⁇ 2 . ⁇ subunit (Chimera Ca v ⁇ 3 - I-II 2.1 ) prevents its binding with the domain
  • FIG. 2c shows that the deletion of the 18 amino acids from the AID 2 domain. 1 (Chimera Ca v ⁇ 3 - I-II2.1 ⁇ AID) restore the binding of the ⁇ 3 subunit with the domain AID ⁇ .2 of the fusion protein GST-AID ⁇ .2 , - Figure 3 shows that the addition of G ⁇ complex displaces the intramolecular interaction between the Ca v ⁇ subunit and the I-II loop of the subunit ⁇ 2 . ⁇ of the chimera Ca v ⁇ 3 - I-II 2.1 , thus allowing the ⁇ 3 subunit to bind with the AID 1.2 domain of the fusion protein GST-AID ⁇ .
  • the IC 50 concentration of G ⁇ capable of displacing 50% of the bond between the Ca v ⁇ subunit and AID 2 domain .
  • ⁇ after 30 min of incubation at 30 ° C, is 160nM; this value is 2 to 3 times higher than that relating to the affinity of G ⁇ for the loop I-II 2 . ⁇ , previously reported (De Waard et al., Nature, 1997, 385, 446-450).
  • EXAMPLE 3 EX VIVO HIGHLIGHTING OF THE DISPLACEMENT OF THE INTERACTION Ca v ⁇ 2 . Ca v ⁇ THROUGH THE G ⁇ COMPLEX OF PROTEINS G. 1) Materials and methods a) Cy3 labeling of the purified recombinant His-Cay ⁇ 3 protein.
  • the purified His-Ca v ⁇ 3 recombinant protein (Geib et al., Biochem J., 2002, 364, 285-292; Fathallah et al., Eur. J. Neurosci., 2002, 16, 219-228) is coupled to the monoreactive Cy3 maleimide following the manufacturer's instructions (Amersham Pharmacia Biotech).
  • the oocytes are analyzed by confocal microscopy (TCS-SP2 microscope, LEICA, in "XY ⁇ ” mode), 4 to 7 days after the injection.
  • the fluorescence emission is recorded using an argon laser with an excitation at 488 nm and a dicliroic mirror (488/543/633). Fluorescence is measured through 14 filters (10 nm thick) to reconstruct the emission spectrum. For each measurement, two different regions are analyzed to ensure the reproducibility of the measurement. FRET levels are estimated by the ratio (585/525) between fluorescence at 585 nm (emission peak of the Cy3 acceptor) and fluorescence at 525 nm (emission peak of the GFP donor). 2) Results
  • Cav ⁇ 2 . ⁇ and Cy3-Cav ⁇ 3 induces a rapid disappearance of the fluorescence transfer ( Figure 6).
  • the injection of G ⁇ has no effect in cells containing only GFP-Cav ⁇ 2 . ⁇ or Cy3-Cav ⁇ 3 .
  • a chimeric protein containing a fluorescence donor fluorophore (EGFP) at its NH end and a fluorescence acceptor fluorophore (CFP) at its COOH end is constructed from the vector pEYFPmemb (CLONTECH).
  • This vector has the advantage of having:
  • Anchoring to the membrane has the advantage on the one hand of maintaining the protein on the membrane and on the other hand of increasing the probability of encounter between the chimeric protein and its ligand G ⁇ which is itself anchored to the membrane by a palmitoylation type bond, and
  • PCR amplification is carried out using the following sense and antisense primers: BsiWI Pvu 1 - 5'- AGCCGTACGCGATCGCATCTCTAGCCAAGCAGAAGCAAA - 3 '(SEQ ID NO: 6)
  • the cDNA coding for the ECP is amplified by PCR and then cloned into the preceding plasmid, 3 'to the insert ⁇ 3 -I-II. More specifically, the ECFP is amplified by PCR from the pECFP vector (Clontech), using the following sense and antisense primers: Spe l
  • the PCR product obtained is cloned between the Spe I and Hpa I sites of the plasmid pEYFmemChimBéta3I-II to give the plasmid pCHIC corresponding to the sequence SEQ ID NO: 10.

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Abstract

Protéine chimérique dérivée d'un canal calcique haut seuil, caractérisée en ce quelle comprend au moins une sous-unité beta ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine BID, fusionné(e) ô son extrémité NH<2#191 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité alpha1 ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine AID, et ses applications pour l'étude des voies de signalisation cellulaire dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et l'identification de composés modulant l'activité des protéines G.

Description

PROTEINE CHIMERIQUE POUR LE CRIBLAGE D'AGONISTES ET D'ANTAGONISTES DES VOIES DE SIGNALISATION CELLULAIRE DEPENDANTES DES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G
La présente invention est relative à une protéine recombinante chimérique dérivée des sous- unités ai et β de canaux calciques haut-seuil, ainsi qu'à ses applications pour l'étude des voies de signalisation cellulaire dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et l'identification de composés modulant l'activité des protéines G.
La classe des RCPG comprend plus de mille membres identifiés, codés par des gènes représentant 2 à 5 % du potentiel de codage du génome de vertébrés (El Far et Betz, Biochem. J., 2002, 365, 329-336) ; on dénombre 27 gènes codant pour des sous-unités Gα, 5 pour les sous-unités Gβ, et 14 pour les sous-unités Gγ, (Albert et Robillard, Cell, 2002, 14, 407-418).
De nombreux processus biologiques comme la régulation synaptique, la réponse aux hormones et aux phéromones, le guidage cellulaire (chémoattraction ou chémorépulsion) ou la vision impliquent les récepteurs couplés aux protéines G. En effet, les RCPG sont capables d'assurer la reconnaissance et la transduction de messages aussi variés que ceux des acides aminés (acide glutamique...), des peptides (angiotensine, neurotensine, somatostatine...), des protéines (thyrotropine (TSH), hormone folliculo-stimulante (FSH)...), des aminés (acétylcholine, adrénaline, sérotonine...), des lipides (prostaglandines, leukotriènes...), des nucléotides et des nucléosides (adénosine ou ATP). Les ions (Ca "1"), les molécules odorantes et gustatives, les photons et les phéromones font également partie des signaux extracellulaires reconnus par les RCPG (pour revue, voir Gether, Endocrine reviews, 2000, 21, 90-113 et Albert et Robillard, précités).
Le signal extracellulaire est transduit à l'intérieur de la cellule par l'intermédiaire des protéines G hétérotrimériques liant les nucléotides guanyliques (GDP et GTP), composées des sous-unités nommées Gα, Gβ, Gγ ; la reconnaissance du signal extracellulaire par le RCPG entraîne l'activation des protéines G qui se traduit par la dissociation de l'hétérotrimère en Gα, et Gβγ, et la liaison de la sous- unité Gα au GTP. Plusieurs effecteurs intracellulaires peuvent être modulés directement ou indirectement par l'activation des différentes sous-unités Gα et Gβγ, des protéines-G. Les effecteurs contrôlés par les sous-unités Gα peuvent être des enzymes (phospholipases A2 et C, adénylyl- et guanylylcyclases, c-jun kinase, tyrosine- phosphatase (SH-PTP2)...), dont l'activation va influer sur le taux de seconds messagers produits ou libérés (phosphoinositides et diacyls-glycérols, Ca++, cAMP, cGMP...), des canaux (à conductances potassiques, calciques, sodiques ou chlores), des échangeurs ioniques (sodium/proton) ou plus récemment des kinases (tyrosines kinases Btk (Bruton's tyrosine kinase), MAP kinases (Mitogen-Activated protein kinase), (Albert et Robillard, précité).
Gβγ peut également moduler l'activité d'effecteurs au moins aussi nombreux que ceux contrôlés par Gα, à savoir : les canaux (à conductances sodique, calcique dépendante du voltage (N et P/Q) ou potassique à rectification entrante (GIRK : G protein inward rectifyer K+ channel)...), les enzymes dites « classiques » (phospholipases A2 et C, adénylyl-cyclase I, II, IV, tyrosine-phosphatase (SH- PTP1)...), ainsi qu'un nombre important de kinases (phosphoinositide 3-kinase, récepteur β-adrénergique kinases, c-jun kinase, MAP kinases, tyrosine kinases Btk et T-cell-specific kinase (Tsk), (pour revue voir Albert et Robillard, précité).
Ainsi, l'étude de ces voies de signalisation et la recherche de drogues agissant sur ces voies de signalisation présentent un intérêt thérapeutique important pour la recherche de nouveaux médicaments.
Il ressort de ce qui précède que l'activation des protéines G et leur dissociation en sous-unités Gα et Gβγ est le carrefour d'un grand nombre de voies de signalisation et de régulation cellulaires. Par conséquent, l'analyse de l'activation de ces protéines G permet d'étudier les voies de signalisation cellulaire, dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G et de cribler des agonistes et des antagonistes de ces voies de signalisation.
Pour analyser l'activation des protéines G, Janetopoulos et al., (Science, 2001, 291, 2408-2411) ont décrit une technique de suivi, in vivo en temps réel, de l'interaction Gα-Gβ. Cette technique, mise au point chez l'amibe Dictyostelium discoideum, est basée sur la cotransfection de deux constructions codant pour deux protéines chimères fluorescentes : Gβ-YFP et Gα2-CFP. L'interaction entre les deux chimères induit un processus de transfert de fluorescence (FRET) qui permet un suivi en temps réel de leur interaction dans le cellule vivante. Les deux chimères construites par Janetopoulos et al. sont capables de former un complexe qui interagit de manière fonctionnelle avec le récepteur à l'AMPc et peut être activé par du GTPγS. Cette technique utilisant la fluorescence est adaptable aux approches de criblage à haut débit. Toutefois, du fait de la compétition avec des sous-unités Gα ou Gβγ endogènes supprimant le processus de FRET, cette approche ne peut fonctionner que dans des cellules délétées génétiquement de leur protéine G équivalente endogène. De plus, chez les vertébrés, les différents isoformes de protéines G sont impliquées dans la réponse à l'activation des différents récepteurs de type RCPG. En conséquence, l'approche de Janetopoulos et al. suppose la construction d'une chimère et d'une lignée cellulaire spécifiquement délétée pour chaque isotype de protéine G étudié.
Il ressort de ce qui précède qu'il n'existe pas d'outil ubiquitaire, simple à mettre en œuvre, pour évaluer l'activation des protéines G dans des cellules eucaryotes.
Les canaux calciques comprennent des canaux de type bas-seuil, s 'activant par de faibles dépolarisations et des canaux de type haut-seuil, s 'activant par de fortes dépolarisations. Les canaux de type haut-seuil représentent un complexe hétéromultimérique αια2δβ et γ, dans lequel la sous-unité αj membranaire, constituant le canal proprement dit, est associée à une sous-unité intracellulaire régulatrice β (ou Cavβ), par l'intermédiaire de son domaine d'interaction (domaine AID pour alpha interaction domain), présentant un motif conservé : QQ-E--L-GY-- WI — E (code à une lettre ; - représentant n'importe quel acide aminé ; Pragnell et al., Nature, 1994, 368, 67-70 ; figure 1) dans lequel les résidus Y392, W395 et 1396 sont essentiels pour la liaison de la sous-unité β (De Waard et al., FEBS, 1996, 380, 272- 276). La sous-unité régulatrice β se lie au domaine AID par l'intermédiaire de son domaine BID (betα interaction domain ; DeWaard et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 12056-12064) qui est inclus dans un domaine GK-like (Hanlon et al., FEBS, 1999, 445, 366-370). Sept sous-unités ont été identifiés : αiA(Cavα2.ι), aie (Cava2.2)> aiE (Cava2.3), formant respectivement les canaux neuronaux de type P/Q et N et les canaux de type R, régulés par les protéines G (canaux sensibles aux protéines G) et αis (Cavαι.ι), αιc(Cavαι.2), αjd (Cavαι.3) et αif (Cavαι.4), formant les canaux de type L, insensibles aux protéines G, incluant les canaux cardiovasculaires (αιc> et squelettiques (αιs), (Lory et al., m/s, 2001, 10, 979-988). Dans le système nerveux central, les canaux calciques haut-seuil de type N et P/Q sont directement impliqués dans le déclenchement du fonctionnement de la synapse : leur ouverture sous l'effet d'un potentiel d'action induit une entrée de calcium dans la terminaison présynaptique. Ce signal déclenche la sécrétion de neuromédiateurs tels que le glutamate dans la fente synaptique et, ainsi la propagation de l'influx nerveux dans la dendrite post-synaptique. Les canaux N et P/Q sont régulés par des récepteurs liés aux protéines G trimériques (RCPG) tels que les récepteurs métabotropiques de classe III du glutamate (pour revue : El Far et Betz., précité) ou les récepteurs noradrénergiques, muscariniques, GABAergiques (GABA 5 γ- aminobutyric acid), sérotoninergiques, dopaminergiques, et aux opiacées (pour revue : Hille, Trends NeuroSci., 1994, 17, 531-536). Il a été montré que le sous-complexe Gβγ est directement responsable d'une inhibition de l'activité des canaux P/Q qui résulte d'une fixation directe de Gβγ sur la boucle intra-cytoplasmique reliant les domaines membranaires I et II (boucle I-II) de la sous-unité αj (De Waard et al., Nature, 1997, 385, 446-450). De fait, cette boucle présente plusieurs sites d'interaction avec Gβγ, chevauchants le domaine de liaison à la sous-unité régulatrice Cavβ (domaine AID ; Figure 1), dont un motif consensus QQ--R-L-GY inclus dans le domaine AID, est essentiel pour la liaison de Gβγ (Figure 1 ; De Waard et al., Nature 1997, 385, 446-450 ; Zamponi et al., Nature, 1997, 385, 442-446). De plus, la sous- unité régulatrice Cavβ semble contrecarrer l'effet fonctionnel des protéines G (Bourinet et al, P.N.A.S., 1996, 93, 1486-1491). Ainsi, il semblerait que cet antagonisme implique une compétition physique entre la sous-unité Cavβ et la protéine Gβγ au niveau de la région AID de la boucle I-II (Dolphin et al., J. Physiol., 1998, 506, 3-11).
Les Inventeurs ont construit des protéines chimériques par fusion NH2 et/ou COOH terminale : (i) de la boucle I-II de la sous-unité ai de canaux calciques haut-seuil sensibles ou insensibles aux protéines G (respectivement, αiA ou Cavα .ι constitutive d'un canal neuronal de type P/Q et αjc ou Cavαι.2 constitutive d'un canal de type L cardiovasculaire) ou un fragment de celle-ci ; ladite boucle correspond aux positions 367 à 487 en référence à la séquence de la sous-unité Cavα2.ι, et comprend le domaine de liaison à une sous-unité β d'un canal calcique (ou domaine AID) et les sites de liaison à une sous-unité Gβ d'une protéine G (figure 1), et
(ii) d'une sous-unité β d'un canal calcique haut-seuil, capable de se lier audit fragment de la sous-unité ai. Ils ont montré que l'ensemble des protéines chimériques obtenues - comprenant la boucle I-II d'une sous-unité α] issue d'un canal calcique sensible ou insensible aux protéines G ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine AID,- possède des propriétés surprenantes d'interaction intramoléculaire entre les domaines de liaison des sous-unités ai et β du canal calcique, qui empêchent la fixation de la chimère sur le domaine AID d'une sous-unité αj. Ils ont confirmé que ce masquage du domaine de liaison de la sous-unité β était bien dû à son interaction intramoléculaire avec le domaine AID, car la délétion du domaine AID de la chimère rétablit cette fixation. Ils ont également montré que la fixation de la chimère comprenant la boucle I-II d'une sous-unité a "sensible aux protéines G", sur le domaine d'interaction de la sous-unité est rétablie par addition de Gβγ. Ce résultat a été confirmé par la mise en évidence ex vivo, de l'interaction d'une sous-unité β recombinante marquée avec un fluorophore de type Cy3 avec une chimère fluorescente de la sous-unité αiA (GFP-αiA), par mesure du transfert de fluorescence (FRET) en microscopie confocale. Ces propriétés leur ont permis de démontrer que de manière inattendue, la régulation des canaux P/Q passe par un déplacement, par le complexe Gβγ, de l'interaction entre la sous-unité régulatrice β et la sous-unité α du canal calcique et non par son inhibition comme cela avait été suggéré précédemment.
De manière plus précise, les Inventeurs ont montré que la protéine chimérique dérivée d'une sous-unité ai sensible aux protéines G existe sous deux formes "fermée" ou "ouverte", respectivement en l'absence ou en présence de sous- unité Gβ capable de se lier audit fragment de la sous-unité αj, soit sous forme de monomère Gβ, soit sous forme d'hétérodimère Gβγ. En l'absence de Gβ (ou Gβγ), la protéine chimérique est capable de se replier permettant ainsi aux domaines d'interaction des sous-unités ai et β du canal calcique de s'associer par une liaison intramoléculaire stable (forme fermée). En présence de Gβ (ou Gβγ), la liaison intra- moléculaire est détruite et les domaines d'interaction des sous-unités ai et β du canal calcique se dissocient (forme ouverte), permettant ainsi à chacun des domaines d'interagir respectivement avec Gβ (domaine d'interaction de la sous-unité ai : domaine AID) et/ou une sous-unité ai d'un canal calcique (domaine d'interaction de la sous-unité β : domaine BID). De façon similaire, la protéine chimérique dérivée d'une sous-unité αj insensible aux protéines G est capable de se replier permettant ainsi aux domaines d'interaction des sous-unités ai et β du canal calcique de s'associer par une liaison intramoléculaire stable (forme fermée). En conséquence, en présence d'antagonistes de cette liaison, autres que Gβ ou Gβγ, la liaison intramoléculaire peut également être détruite et les domaines d'interaction des sous-unités ai et β du canal calcique se dissocier (forme ouverte), permettant ainsi à chacun des domaines d'interagir respectivement avec ledit antagoniste autre que Gβ ou Gβγ (domaine d'interaction de la sous-unité αj : domaine AID) et/ou une sous-unité a d'un canal calcique (domaine d'interaction de la sous-unité β : domaine BID). En conséquence, du fait du remaniement de leur structure en présence de sous-unités Gβ ou Gβγ libres ou bien d'autres antagonistes de l'interaction entre les sous-unités ai et β (passage de la forme fermée à la forme ouverte), les protéines chimériques dérivées des sous-unités ai et β de canaux calciques haut-seuil représentent des outils simples à mettre en oeuvre, sensibles, spécifiques et utiles pour les applications suivantes :
- les protéines chimériques dérivées d'une sous-unité ai sensible aux protéines G (par exemple : α^, αiB et α^) permettent de déterminer les variations de la concentration cellulaire en sous-unités Gβγ libres, ex vivo, en temps réel et donc de mesurer l'activation des protéines G dans les cellules : de telles protéines chimériques représentent des biocapteurs ubiquitaires de l'activation des protéines G parfaitement adaptés à l'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G et au criblage d'agonistes/antagonistes de ces voies de signalisation capables d'augmenter ou de diminuer la concentration en sous-unités Gβγ libres dans les cellules et donc de moduler l'activité de ces voies de régulation et de signalisation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G. - les protéines chimériques dérivées d'une sous-unité ai sensible ou résistante aux protéines G (par exemple : αiA, αm, αjβ, αlc, αi , αis et αif) représentent des outils simples, sensibles et spécifiques, parfaitement adaptés au criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sous-unités ai et β, capables de moduler l'activité de l'ensemble des canaux calciques haut-seuil. - les protéines chimérique dérivées d'une sous-unité ai et d'une sous-unité β d'un canal calcique haut-seuil telles que définies ci-dessus, sont également utiles pour le contrôle systématique pharmaco-toxicologique de nouveaux médicaments en phase I et la recherche d'agonistes naturels de récepteurs orphelins. En effet, le clonage du génome humain a permis d'identifier environs 350 récepteurs RCPG. Parmi ceux-ci, seulement 200 ont un ligand identifié. Les autres, appelés récepteurs orphelins, constituent potentiellement des cibles clefs pour l'identification de nouvelles voies de signalisation et de régulation cellulaire. La recherche d'agonistes et d'antagonistes de ces récepteurs revêt donc un intérêt majeur tant sur le plan de la recherche fondamentale que sur le plan thérapeutique. En conséquence, la présente invention a pour objet une protéine chimérique dérivée d'un canal calcique haut seuil, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sous-unité β ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine BID, fusionné(e) à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité αj ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine AID. Conformément à l'invention les domaines AID et BID sont tels que définis ci-dessus ; la boucle I-II de la sous-unité ai comprend le domaine AID de liaison à la sous-unité β et les sites de liaison à la sous-unité Gβ d'une protéine G, dont un site consensus de liaison qui est inclus dans ce domaine AID. Ces différents domaines sont illustrés à la figure 1. L'invention englobe les protéines chimérique issues des sous-unités ai et β de vertébrés, notamment de mammifères humains ou non-humains et de leurs orthologues chez les invertébrés.
Des protéines chimériques conformes à l'invention sont représentées notamment par :
- une sous-unité β fusionnée à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité ai, et
- le domaine GK-like d'une sous-unité β incluant le domaine BID (Hanlon et al., précité), fusionné à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité α i .
Conformément à l'invention, la boucle I-II ou son fragment est, soit fusionné directement à l'extrémité NH2 ou COOH de la sous-unité β ou de son fragment, soit les deux séquences sont séparées par un peptide espaceur dont la taille et la séquence en acides aminés sont tels que les domaines AID et BID de la protéine chimérique contenant ledit espaceur sont aptes à interagir pour former une liaison intramoléculaire qui est déplacée en présence d'antagoniste (passage de la forme fermée à la forme ouverte) ; un tel peptide espaceur est notamment représenté par une séquence polyglycine.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite protéine chimérique, elle est issue d'un canal calcique haut-seuil sensible aux protéines G.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite protéine chimérique comprend un fragment d'une sous-unité ai sélectionnée parmi ctiA, « et αi£.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine chimérique, ladite sous unité β est sélectionnée dans le groupe constitué par βi, β2, β3 et β4.
L'invention englobe également les protéines chimériques constituées par des séquences fonctionnellement équivalentes aux séquences telles que définies ci- dessus, c'est-à-dire dont la sous-unité β et la boucle I-II de la sous-unité ai ou leurs fragments tels que définis ci-dessus sont capables de former une liaison intramoléculaire par l'intermédiaire de leurs domaines d'interaction ; ladite liaison étant éventuellement détruite en présence de sous-unités Gβ ou Gβγ libres ou bien d'autres antagonistes de l'interaction entre les sous-unités αj et β ("forme ouverte"). Parmi ces séquences, on peut citer par exemple les séquences dérivées des séquences précédentes par : - mutation (substitution et/ou suppression, et/ou addition) d'un ou plusieurs acides aminés des séquences telles que définies ci-dessus,
- modification d'au moins une liaison peptidique -CO-NH- de la chaîne peptidique de la protéine chimérique telle que définie ci-dessus, notamment par remplacement par une liaison différente de la liaison -CO-NH- (méthylène amino, carba, cétométhylène, thioamide....) ou par introduction d'une liaison de type rétro ou rétro-inverso, et/ou,
- substitution d'au moins un acide aminé de la chaîne peptidique de la protéine chimérique telle que définie ci-dessus, par un résidu d'acide aminé non protéinogénique. Par résidu d'acide aminé non protéinogénique, on entend tout acide aminé n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel, notamment tout acide aminé dont le carbone portant la chaîne latérale R, à savoir le groupe -CHR-, situé entre -CO- et -NH- dans la chaîne peptidique naturelle, est remplacé par un motif n'entrant pas dans la constitution d'une protéine ou d'un peptide naturel.
La présente invention a notamment pour objet une protéine chimérique variant issue d'une protéine chimérique telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle présente une mutation d'au moins un acide aminé dans les séquences de la dite sous-unité β et/ou de la boucle I-II d'une sous-unité αj. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine chimérique, ledit variant possède une mutation qui modifie l'affinité de la sous-unité β pour la boucle I-II de la sous-unité ai et/ou réciproquement ; de telles mutations permettent d'obtenir une protéine chimérique plus ou moins sensible à la concentration en sous-unité Gβ ou Gβγ libres. Parmi ces mutations on peut citer les mutations du domaine AID de la boucle I-II de la sous-unité αls telles que décrites dans Pragnell et al., précité et De Waard et al. FEBS, 1996, 380, 272-276, à savoir : Q383A, Q384A, E386D, E386S, L389H, G391R, Y392S, Y392F, W395A, I396A et E400A.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite protéine chimérique ou de son variant, elle est couplée, de préférence de manière covalente, à au moins un marqueur approprié permettant la détection et/ou la purification et/ou l'immobilisation de ladite protéine, par exemple : un épitope antigénique, une étiquette du type polyhistidine, un composé luminescent (fluorophore telle que la GFP ou l'un de ses variants : CFP,YFP et BFP), radioactif, ou enzymatique.
Conformément à l'invention le dit couplage est réalisé par tout moyen approprié, notamment par une liaison peptidique par l'intermédiaire des fonctions COOH et/ou NH2 terminales de la chaîne peptidique, ou bien par une autre liaison covalente, telle que par exemple : une liaison ester, éther, thioéther, thioester, par l'intermédiaire de fonctions réactives de la chaîne latérale d'un acide aminé de la chaîne peptidique. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la dite protéine chimérique comprend un fluorophore accepteur ou donneur respectivement à son extrémité NH2 et ou COOH.
Les fluorophores accepteurs, par exemple CFP ou BFP, peuvent être couplés indifféremment à l'extrémité NH ou COOH de la protéine chimérique, les fluorophores donneurs, par exemple GFP ou YFP sont fusionnés à l'extrémité opposée de ladite protéine chimérique. De telles protéines chimériques sont utiles pour l'étude ex vivo en temps réel de l'activation des protéines G et le criblage de molécules capables de moduler cette activation par mesure du transfert de fluorescence (FRET).
En effet, le marquage par un composé luminescent présente l'avantage d'obtenir un signal localisé qui ne nécessite pas la présence d'autres réactifs comme c'est le cas pour les marquages enzymatiques. Ce type de marquage permet également l'utilisation de phénomène tel que le transfert d'énergie qui peut s'effectuer selon différents mécanismes : transfert d'énergie par résonance, transfert d'énergie radiatif (l'accepteur absorbe la lumière émise par le donneur) et transfert d'électron. Ce transfert d'énergie, entre un composé "donneur" (D) luminescent et un composé "accepteur" (A) luminescent ou non, et qui est dépendant de la distance entre A et D, a été utilisé pour la réalisation de nombreux dosages. On choisit D et A, qui sont couplés à chaque extrémité de la protéine chimérique afin que le transfert d'énergie n'ait lieu que lorsque l'intercation intramoléculaire entre les domaines BID et AID a lieu (forme fermée). Ce phénomène se traduit par une diminution ou extinction de la luminescence de D et une émission de luminescence de A si celui-ci est luminescent, lorsque D est excité. Lors de ces dosages on mesure soit la variation de la luminescence de A, soit la variation de la luminescence de D ; la nature de A et de D étant variable. Par exemple, pour mesurer la variation de luminescence de A on peut utiliser comme donneur et accepteur deux protéines fluorescentes ou bien comme donneur un complexe de terres rares (europium, terbium) avec un chélate, un cryptate ou un macrocycle et comme accepteur une protéine fluorescente. La mesure de la variation de luminescence de D repose sur la capacité d'un composé (A) à diminuer ou supprimer la luminescence d'un autre composé (D) lorsque ceux-ci sont suffisamment proches ("Quench"). La gamme de molécules A pouvant être utilisées est donc plus étendue et inclut ainsi des composés non luminescents tels que des métaux lourds, des atomes lourds, des molécules chimiques comme par exemple le rouge de méthyle, des nanoparticules telles que celles vendues sous la dénomination Nanogold® par la société Nanoprobes (USA), ou bien encore les molécules vendues sous les dénominations DABCYL® (Eurogentec, Belgique), QSY Dyes (Molecular Probes Inc., USA), ElleQuencher® (Oswell/Eurogentec) ou Black Hole Quenchers® (Biosearch Technologies Inc., USA).
La présente invention a également pour objet un peptide, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment d'au moins 7 acides aminés de la séquence de la protéine chimérique telle que définie ci-dessus, situés à la jonction de la sous-unité β et de la boucle I-II de la sous-unité ai ou de leurs fragments tels que définis-ci-dessus ; de tels peptides permettent notamment de produire des anticorps spécifiques de la protéine chimérique selon l'invention.
La présente invention a également pour objet des anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une protéine chimérique ou un peptide tels que définis ci-dessus. Conformément à l'invention, lesdits anticorps sont soit des anticorps monoclonaux, soit des anticorps polyclonaux. Ces anticorps peuvent être obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, comprenant notamment l'immunisation d'un animal avec une protéine ou un peptide conforme à l'invention, afin de lui faire produire des anticorps dirigés contre ladite protéine ou ledit peptide. De tels anticorps sont utiles notamment pour immobiliser la protéine chimérique sur un support solide, la purifier ou bien la détecter.
La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences codant pour une protéine chimérique ou un peptide tels que définis ci- dessus et les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti-sens.
L'invention a également pour objet des sondes et des amorces, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'environ 10 à 30 nucléotides correspondant à celle située à la jonction de la sous-unité β et de la boucle I-II de la sous-unité ai ou de leurs fragments tels que définis-ci-dessus ; ces sondes et ces amorces permettent de détecter/amplifier spécifiquement lesdites molécules d'acide nucléique codant la protéine chimérique selon l'invention.
L'invention a également pour objet d'autres amorces permettant d'amplifier spécifiquement la sous-unité β et/ou la boucle I-II de la sous-unité ai ou leurs fragments tels que définis-ci-dessus, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1, 2, 4, 6, 7, 8 et 9.
Les molécules d'acide nucléique selon l'invention sont obtenues par des méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley andson lnc, Lïbrary ofCongress, USA).
Les séquences codant pour une protéine chimérique selon l'invention peuvent être obtenues par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT- PCR à l'aide d'une paire d'amorces appropriée ou bien par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue. Les molécules d'acides nucléiques dérivées, codant pour un variant de la protéine chimérique selon l'invention, sont obtenues par les méthodes classiques, permettant d'introduire des mutations dans une séquence d'acide nucléique, connues en elles-mêmes, suivant les protocoles standards précités. Par exemple, la séquence codant pour un variant de la protéine chimérique selon l'invention peut-être obtenue par mutagenèse dirigée selon la méthode de Kunkel et al., (P.N.A.S., 1985, 82, 488- 492). La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant eucaryote ou procaryote, caractérisé en ce qu'il comprend un insert constitué par les molécules d'acides nucléiques codant pour une protéine chimérique telle que définie ci-dessus.
De préférence, ledit vecteur recombinant est un vecteur d'expression dans lequel ladite molécule d'acide nucléique ou l'un de ses fragments sont placés sous le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. En outre, ledit vecteur peut comprendre des séquences fusionnées en phase avec l'extrémité 5' et/ou 3' dudit insert, utiles pour l'immobilisation, et/ou la détection et/ou la purification de la protéine exprimée à partir dudit vecteur. De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux- mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégra- tion dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des vecteurs viraux ou non-viraux comme des plasmides.
Ces vecteurs sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.
Selon un mode de réalisation dudit vecteur recombinant, il s'agit d'un vecteur d'expression eucaryote présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 10 ; le plasmide SEQ ID NO: 5 contient la boucle I-II de la sous-unité Cavα2.ι de lapin fusionnée à l'extrémité C-terminale de sous-unité Cavβ3 de rat, sous le contrôle du promoteur CMN et le plasmide SEQ ID ΝO: 10 contient un insert constitué de 5' en 3' par la fusion en phase des fragments suivants : la séquence GAP-43, l'ADΝc codant pour l'EGFP (donneur de fluorescence), le domaine GK-like de la sous-unité Cavβ3 de rat, la boucle I-II de la sous-unité Cavα2.ι de lapin et l'ADNc codant pour la CFP (accepteur de fluorescence).
La présente invention a également pour objet des cellules modifiées par une protéine chimérique, une molécule d'acide nucléique ou bien un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites cellules sont des cellules eucaryotes.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdites cellules expriment au moins un récepteur capable de se lier aux protéines G (RCPG) ; lesdites cellules sont, soit des cellules exprimant constitutivement au moins un RCPG, soit des cellules modifiées qui expriment un RCPG recombinant.
Des cellules modifiées conformes à l'invention peuvent être obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d'introduire une molécule d'acide nucléique ou une protéine dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de cellules animales, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels que les adéno- virus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAN, dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence nucléotidique (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) ou peptidique avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de liposomes, de lipides ou de polymères cationiques, ou bien l'injecter directement dans la cellule hôte.
La présente invention a pour objet des animaux et en particulier des mammifères transgéniques non-humains, caractérisés en ce que tout ou partie de leurs cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique selon l'invention. Il s'agit par exemple d'animaux dans lesquels on a introduit une séquence codant pour la protéine chimérique selon l'invention sous contrôle le contrôle d'éléments régulateurs de la transcription et de la traduction appropriés. De tels animaux transgéniques sont utiles, notamment pour les étapes de criblages secondaires : i) pour évaluer le ciblage cellulaire, voire tissulaire d'une molécule active sur les RCPG ou les canaux calciques, identifiée lors d'un criblage primaire, ii) pour étudier la biodisponibilité d'une telle molécule, et iii) pour la recherche, en première approche, d'effets secondaires éventuels d'une telle molécule.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques, les molécules d'acides nucléiques, les vecteurs recombinants, les cellules modifiées et les mammifères non-humains transgéniques tels que définis ci-dessus, pour l'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques, les molécules d'acides nucléiques, les vecteurs recombinants, les cellules modifiées et les mammifères non-humains transgéniques tels que définis ci-dessus, pour le criblage d'agonistes et/ou d'antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques, les molécules d'acides nucléiques, les vecteurs recombinants, les cellules modifiées et les mammifères non-humains transgéniques tels que définis ci-dessus, pour le criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sous-unités ai et β des canaux calciques haut- seuil ; de tels antagonistes sont utiles pour moduler l'activité de l'ensemble des canaux calciques haut-seuil et représentent donc des médicaments susceptibles d'être utilisées dans le traitement des maladies liées à un dysfonctionnement de l'homéostasie calcique et des pathologies où la modulation de l'entrée calcique peut compenser un déficit cellulaire, notamment les épilepsies, les ataxies, les migraines, les hypo- et hyper-calcémies musculaires, le diabète, et les maladies cardiovasculaires.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G est réalisée par une méthode comprenant au moins les étapes suivantes : ai) la culture de cellules modifiées exprimant une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible aux protéines G et un récepteur couplé au protéine G, telles que définies ci-dessus, bi) la transduction d'un signal par l'intermédiaire dudit récepteur couplé aux protéine G, par tout moyen approprié, et ci) la détermination, par tout moyen approprié, de la proportion de ladite protéine chimérique exprimée dans lesdites cellules qui est liée à une sous-unité Gβγ.
Une telle détermination permet d'évaluer les variations de la concentration cellulaire en sous-unités Gβγ libres et donc de mesurer l'activation des protéines G dans les cellules.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le criblage d'agonistes/d 'antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G est réalisée par une méthode comprenant au moins les étapes suivantes : a2) la culture de cellules modifiées exprimant une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible aux protéines G et un récepteur couplé aux protéines G, telles que définies ci-dessus, b2) la transduction d'un signal par l'intermédiaire dudit récepteur couplé aux protéine G, par tout moyen approprié, c2) la détermination comparative, par tout moyen approprié, de la proportion de ladite protéine chimérique exprimée dans les cellules qui est liée à une sous-unité Gβγ, avant et après la mise en contact desdites cellules en b2) avec une molécule à tester, et d2) l'identification des molécules agonistes/antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G, correspondant à celles capables respectivement d'augmenter et de dimi- nuer la concentration cellulaire en sous-unités Gβγ libres.
De manière avantageuse, lesdites cellules modifiées en ai) ou en a2) expriment une protéine chimérique telle que définie ci-dessus couplée à ses extrémités
NH2 et COOH, respectivement à un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur de fluorescence et ladite détermination en ci) ou en c2) est effectuée par la technique de transfert de fluorescence (FRET). Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sous-unités αj et β des canaux calciques haut- seuil est réalisé par une méthode comprenant au moins les étapes suivantes : a ) la mise en contact d'une molécule à tester avec une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible ou insensible aux protéines G telle que définie ci-dessus et avec un peptide comprenant le domaine AID d'une sous-unité ai insensible aux protéines G, b3) la mesure, par tout moyen approprié, de la liaison de ladite protéine chimérique audit peptide, et c3) l'identification des antagonistes de l'interaction entre les sous- unités ai et β correspondant à ceux avec lesquels on observe une liaison de ladite protéine chimérique audit peptide.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, ledit peptide comprenant le domaine AID est immobilisé sur un support solide, et ladite protéine chimérique est couplée à un marqueur permettant la mesure de ladite liaison en b ), tel que défini ci-dessus, notamment un fluorophore.
L'invention a également pour objet une trousse pour la mise en œuvre des méthodes telles que définis ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle inclut au moins l'un des produits suivants : une protéine chimérique, un anticorps, un vecteur recombinant, une cellule modifiée ou un mammifère non-humain transgénique, tels que définis ci-dessus.
La protéine chimérique selon l'invention présente les avantages suivants :
- elle constitue un biocapteur ubiquitaire des sous-unités Gβγ libres endogènes, adapté à l'étude en temps réel des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés au protéine G, et au criblage systématique (criblage à haut-débit) de molécules capables de les moduler, potentiellement utilisables comme médicament pour le traitement des maladies dans lesquelles on observe un dysfonctionnement de ces voies, notamment des pathologies du système immunitaire (pour revue voir Lombardi et al, Crit. Rev. Immunology, 2002, 22, 141- 163 ; Onuffer et Horuk, Trends in Pharmacol, 2002, 23, 459-467) et des pathologies neuropsychiatriques et cardiovasculaires (Seifert et Wenzel-Seifert, Naumyn- Schmeideberg's Arch. Pharmacol. , 2002, 366, 381-416). En outre son utilisation est simple dans la mesure elle est permet de s'affranchir partiellement des problèmes de stoechiométrie puisque son utilisation ne fait intervenir que deux molécules (Cavβ/Cavα-Gβγ) au lieu de trois partenaires (Cavα/Cavβ/Gβγ) pour les méthodes de l'art antérieur.
- elle est adaptée au criblage systématique (criblage à haut-débit) de molécules capables de moduler l'activité des canaux calciques à haut-seuil, potentiellement utilisables comme médicament pour le traitement des maladies dans lesquelles on observe un dysfonctionnement de l'homéostasie calcique et des pathologies où la modulation de l'entrée calcique peut compenser un déficit cellulaire telles que définies ci-dessus.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de la protéine chimérique objet de la présente inven- tion ainsi qu'au dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 illustre le chevauchement, dans la boucle I-II de la sous-unité Cavα .ιj des domaines de liaison à la sous-unité β (domaine AID) et au complexe Gβγ. Le domaine AID est représenté par une boîte noire (positions 383 à 400). Les sites de liaison pour la sous-unité Gβ (Gβγ) sont représentés par des boîtes hachurées ; le site en position centrale (QQ--R-L-GY) qui est essentiel pour la liaison de la sous-unité Gβ (Gβγ) est inclus dans le domaine AID.
- les figures 2 et 3 illustrent le déplacement de l'interaction Cavα .ι- Cavβ par le complexe Gβγ des protéines G :
- la figure 2a illustre la liaison de la sous-unité β3 (1 à 3 pM) avec le domaine AIDι.2 de la protéine de fusion GST-AIDι.2 (1 μM),
- la figure 2b montre que la fusion de la sous-unité β3 avec la boucle I-II de la sous-unité α2.ι (Chimère Cavβ3- I-II2.ι) empêche sa liaison avec le domaine AIDj.2 de la protéine de fusion GST-AIDι.2,
- la figure 2c montre que la délétion des 18 acides aminés du domaine AID2.ι (Chimère Cavβ3- I-II2.ιΔAID) restore la liaison de la sous-unité β3 avec le domaine AIDι.2 de la protéine de fusion GST-AIDι. , - la figure 3 montre que l'addition de complexe Gβγ déplace l'interaction intramoléculaire entre la sous-unité Cavβ et la boucle I-II de la sous-unité α2.ι de la chimère Cavβ3- I-II2.1, permettant ainsi à la sous-unité β3 de se lier avec le domaine AIDj.2 de la protéine de fusion GST-AID1.2 ; la concentration de Gβγ, capable de déplacer 50 % de la liaison entre la sous-unité Cavβ et domaine AID .ι (IC50) est de l60nM,
- les figures 4 à 7 illustrent l'analyse en FRET, du désassemblage du canal calcique P/Q, induit par le complexe Gβγ :
- la figure 4a illustre le marquage au Cy3 de la sous-unité His-Cavβ3 purifiée. CB : coloration au bleu de Coomassie d'un gel SDS-PAGE illustrant la pureté de la protéine. FS = enregistrement de la fluorescence d'un gel non coloré montrant le marquage covalent de la protéine,
- la figure 4b illustre l'effet de la sous-unité Cavβ couplée à un fluorochrome (Cy3-Cavβ3) sur la relation courant-voltage de canaux Cavα2.ι exprimés dans des ovocytes de xénopes, par comparaison avec la sous-unité Cavβ3 non marquée (injection d'ARNc),
- la figure 5a illustre l'observation en microscopie confocale de deux régions distinctes, d'ovocytes de xénopes contenant Cavα2.j et Cy3-Cavβ3. T = transmission, F = fluorescence, - la figure 5b illustre le spectre d'émission de la fluorescence de
GFP-Cavα2.b Cy3-Cavβ3 et (GFP-Cavα2.ι + Cy3-Cavβ3),
- la figure 6 illustre la cinétique de diminution du transfert de fluorescence induit par l'injection de 100 nM de Gβγ. Panneau du haut : variations du spectre d'émission de la fluorescence et panneau du bas : variations du rapport des intensités de fluorescence (Rf) à 585 irai et 525 nm,
- la figure 7 illustre les valeurs Rf des ovocytes non-injectées (-), injectées avec Gβγ (100 nM) ou avec du Gβγ inactivé par la chaleur (HI- Gβγ).
- la figure 8 (a à c) illustre la séquence du plasmide pcDNA3Cavβ3- I-II2.1 (SEQ ID NO: 5) contenant la boucle I-II de la sous-unité Cavα2.ι de lapin fusionnée à l'extrémité C-terminale de sous-unité Cavβ3 de rat, sous le contrôle du promoteur CMN. - la figure 9 (a à c) illustre la séquence du plasmide pCHIC (SEQ ID NO: 10) dérivé du vecteur pEYFPmemb.(CLONTECH), contenant un insert constitué de 5' en 3' par la fusion en phase des fragments suivants : la séquence GAP-43, l'ADNc codant pour l'EGFP (donneur de fluorescence), le domaine GK-like de la sous-unité Cavβ3 de rat, la boucle I-II de la sous-unité Cavα2.ι de lapin et l'ADNc codant pour la CFP (accepteur de fluorescence).
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1: CONSTRUCTION D'UNE PROTEINE CHIMERIQUE RECOMBINANTE Cavβ3-I-II2.ι 1). Matériels et méthodes
L'amplification PCR et le clonage de l'ADN recombinant sont réalisés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, en suivant le protocoles standards tels que ceux décrits par exemple dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).
Un plasmide d'expression contenant un ADNc codant une protéine chimérique selon l'invention, constituée par la fusion C-terminale de la sous-unité β3 de rat avec la boucle intracellulaire I-II de la sous-unité ai de lapin et a été construit de la façon suivante:
L'ADNc de la sous-unité Cavβ3 de rat (correspondant aux positions 98 à 1545 de la séquence GENBANK M88755) est amplifiée par PCR à l'aide des amorces sens et anti-sens suivantes: - 5'-TTTGGTACCATGGATGACGACTCCTACGTGCCCGGGTTTGAGGACTCGGAGGCGGGTT-3' (SEQ ID NO: l), et - δ'-GCGGAATTCGTAGCTGTCCTTAGGCCAAGGCCGGTTACGCTGCCAGTT-S', (SEQ ID NO: 2).
Le fragment ainsi obtenu a été clone entre les sites Kpn I et EcoR I du plasmide d'expression (pcDNA3, IN VITROGEN) pour donner le plasmide recom- binant pcDNA3-Cavβ3.
Le fragment d'ADNc correspondant à la boucle I-II de la sous-unité Cavα2.ι de lapin (positions 1383 à 1754 de la séquence GENBANK X57477), dont la séquence est illustrée par la figure 1 , a été amplifié par PCR à l'aide des amorces sens et anti-sens suivantes :
- 5'-GGGGMTTCGCCAAAGAAAGGGAGCGGGTGGAGAAC-3' (SEQ ID NO: 3 ; De Waard et al., précité et Bichet et al., Neuron, 2001, 25, 177-190), et - S'-TTTGAATTCTTACTGAGTTTTGACCATGCGACGGATGTAGAAACGCATTCT-S' (SEQ ID NO: 4).
Le fragment obtenu a été clone au site EcoR I du plasmide pcDNA3-Cavβ3 pour donner le plasmide recombinant pcDNA3-Cavβ3-I-II2.ι.
Un plasmide contrôle contenant un ADNc codant une protéine chimérique constituée par la fusion C-terminale de la sous-unité β3 de rat avec la boucle intracellulaire I-II de la sous-unité Cavα2.ι de lapin délétée du domaine AID a été construit de façon similaire ; le plasmide recombinant ainsi obtenu est dénommé pcDNA3-Cavβ3-I-II2.ιΔAID.
2) Résultats
Le plasmide recombinant pcDNA3-Cavβ3-I-II2.ι présente la séquence SEQ ID NO: 5. La séquence peptidique déduite de la séquence nucléotique obtenue par séquençage automatique de l'insert clone dans le plasmide pcDNA3-
Cavβ3-I-II2.ι présente la séquence attendue pour une protéine chimérique selon l'invention. De même la séquence peptidique déduite de la séquence nucléotique obtenue par séquençage automatique de l'insert clone dans le plasmide pcDNA3- Cavβ3-I-II2.ιΔAID correspond à celle attendue pour une protéine chimérique délétée du domaine AID.
EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE IN VITRO DU DEPLACEMENT DE
L'INTERACTION Cavα2.ι-Cavβ PAR LE COMPLEXE Gβγ DES PROTEINES
G. 1) Matériels et méthodes
L'expression de l'ADN recombinant et l'analyse des protéines recombinantes sont réalisés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, en suivant le protocoles standards tels que ceux décrits par exemple dans
Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL,2000, Wiley and son Inc, Library ofCongress, USA) et dans Current protocols in Immunology (John E.
Coligan, 2000, Wiley and son Inc, Library ofCongress, USA). a) Expression des protéines chimériques recombinantes et de la fusion GST-AIDv?
Les protéines chimériques Cavβ3-I-II2.ι et Cavβ3-I-II2.ιΔAID, et la sous-unité Cavβ3, sont transcrites et traduites in vitro en présence de [35S]-méthionine, à partir des plasmides tels que décrits à l'exemple 1, à l'aide du kit TNT system PROMEGA, en suivant les instructions du fabricant.
La protéine de fusion GST-AIDι.2 décrite dans Pragnell et al., précité, est produite et purifiée comme décrit par les auteurs précédents. La protéine GST produite et purifiée dans les mêmes conditions est utilisée comme contrôle. b) Analyse in vitro de la régulation de l'interaction Cayα^-Cayβ par le complexe Gβγ des protéines G.
L'analyse in vitro de la régulation de l'interaction Cavα2.ι-Cavβ par le complexe Gβγ des protéines G, est réalisée en suivant les protocoles tels que décrits dans De Waard et al., Nature, 1997, 385, 446-450. De manière plus précise, la sous- unité β3 et les protéines chimériques marquées ([35S] Cavβ3, [35S] Cavβ3-I-II2.ι et [35S] Cavβ3-I-II2.ιΔAID) sont incubées en l'absence ou en présence de la protéine de fusion GST-AIDj.2 ou de la protéine GST, et éventuellement en présence de quantités croissantes de Gβγ (10 à 900 nM, CALBIOCHEM).
Le produit d'incubation est séparé par électrophorèse en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et le gel est autoradiographié. D Résultats
Les résultats illustrés dans les figures 2 et 3 sont les suivants:
- la figure 2a montre que la sous-unité β3 (1 à 3 pM) se lie avec le domaine AID1.2 de la protéine de fusion GST-AID]. (lμM),
- la figure 2b montre que la fusion de la sous-unité β3 avec la boucle I-II de la sous-unité α2.ι (Chimère Cavβ3- I-II2.1) empêche sa liaison avec le domaine
AIDι, de la protéine de fusion GST-AIDι.2,
- la figure 2c montre que la délétion des 18 acides aminés du domaine AID2.1 (Chimère Cavβ3- I-II2.1ΔAID) restore la liaison de la sous-unité β3 avec le domaine AIDι.2 de la protéine de fusion GST-AIDι.2, - la figure 3 montre que l'addition de complexe Gβγ déplace l'interaction intramoléculaire entre la sous-unité Cavβ et la boucle I-II de la sous-unité α2.ι de la chimère Cavβ3- I-II2.1, permettant ainsi à la sous-unité β3 de se lier avec le domaine AID1.2 de la protéine de fusion GST-AIDι.2 ; la concentration IC50 de Gβγ, capable de déplacer 50 % de la liaison entre la sous-unité Cavβ et domaine AID2.ι, après 30 min d'incubation à 30°C, est de 160nM; cette valeur est 2 à 3 fois plus élevée que celle relatives à l'affinité de Gβγ pour la boucle I-II 2.ι, précédemment rapportées (De Waard et al., Nature , 1997, 385, 446-450).
EXEMPLE 3 : MISE EN EVIDENCE EX VIVO DU DEPLACEMENT DE L'INTERACTION Cavα2. Cavβ PAR LE COMPLEXE Gβγ DES PROTEINES G. 1) Matériels et méthodes a) Marquage au Cy3 de la protéine recombinante His-Cayβ3 purifiée.
La protéine recombinante His-Cavβ3 purifiée (Geib et al., Biochem J., 2002, 364, 285-292 ; Fathallah et al., Eur. J. Neurosci., 2002, 16, 219-228) est couplée au maleimide de Cy3 monoréactif en suivant les instructions du fabricant (Amersham Pharmacia Biotech). b) Injection des ovocytes de xénope et enregistrements électrophysiologiques.
La préparation, l'injection des ovocytes de xénopes et les enregistrements électrophysiologiques sont réalisés comme décrit dans Geib et al., précité. Les effets des complexes Gβγ sur la relation courant- voltage et l'inactivation de l'état d'équilibre sont analysés 30 min après l'injection. c) Mesure du transfert de fluorescence (FRET).
Les ovocytes sont analysés en microscopie confocale (microscope TCS-SP2, LEICA, en mode « XYλ »), 4 à 7 jours après l'injection.
L'émission de fluorescence est enregistrée à l'aide d'un laser à argon avec une excitation à 488 nm et un miroir dicliroïque (488/543/633). La fluorescence est mesurée au travers de 14 filtres (10 nm d'épaisseur) pour reconstruire le spectre d'émission. Pour chaque mesure, deux régions différentes sont analysées afin d'assurer la reproductibilité de la mesure. Les niveaux de FRET sont estimés par le rapport (585/525) entre la fluorescence à 585 nm (pic d'émission de l'accepteur Cy3) et la fluorescence à 525 nm (pic d'émission du donneur GFP). 2) Résultats
- La sous-unité Cavβ3 couplée au Cy3 (figure 4a) est aussi active que la sous-unité Cavβ3 sur la régulation des canaux Cavα2.ι exprimés dans des ovocytes de xénope (Figure 4b). - L'injection de la protéine Cy3-Cavβ3 ou GFP-Cavα2.ι ou bien de l'ADNc codant pour ladite protéine, seul(e) ou en combinaison, résulte dans l'émission d'un signal de fluorescence élevé au niveau de la membrane plasmique (Figure 5 a).
L'analyse de l'émission de fluorescence entre 500 et 640 nm, après excitation à 488 nm (figure 5b), montre que GFP-Cavα2.ι produit un signal élevé avec un maximum à 525 nm alors que Cy3-Cavβ3 seul est peu excité et produit un signal faible avec un maximum à 585 nm. Lorsque les deux protéines sont dans les ovocytes, le signal émis à 525 nm diminue de façon drastique alors que celui à 585 nm augmente significativement. Ces changements sont facilement quantifiables par la détermination du rapport des signaux de fluorescence à 585 nm et 525 nm (Rf = 0,34 ± 0,03 pour GFP-Cavα2.ι (n=3), Rf = 1,9 ± 0,10 pour Cy3-Cavβ3 (n=3) et Rf = 3,9 ± 0,22 pour GFP-Cavα2.ι + Cy3-Cavβ3 (n=7). D'aussi grands changements résultant d'un transfert important de fluorescence, démontrent la proximité des fluorochromes GFP- Cavα2.ι et Cy3-Cavβ3. - L'injection de Gβγ dans les ovocytes contenant à la fois GFP-
Cavα2.ι et Cy3-Cavβ3 induit une disparition rapide du transfert de fluorescence (figure 6). Par comparaison, l'injection de Gβγ est sans effet dans les cellules contenant uniquement GFP- Cavα2.ι ou Cy3-Cavβ3.
Le rapport final des signaux de fluorescence (0,82 ± 0,06, n=7) est de l'ordre de celui observé dans les ovocytes contenant uniquement GFP- Cavα2 ou Cy3-Cavβ3 indiquant que la dissociation du canal de Cy3-Cavβ3 est importante (figure 7). Par comparaison, l'injection de Gβγ inactivé par la chaleur est sans effet (Rf= 3,74 ± 0,4, n=3).
Ces résultats démontrent que Gβγ est aussi capable de déplacer ex vivo la sous-unité Cavβ3 de son site de liaison au canal Cavα .ι. EXEMPLE 4 : CONSTRUCTION D'UN BIOCAPTEUR POUR MESURER L'ACTIVITE DES PROTEINES G PAR LA TECHNIQUE DE FRET
Une protéine chimérique contenant un fluorophore donneur de fluorescence (EGFP) à son extrémité NH et un fluorophore accepteur de fluorescence (CFP) à son extrémité COOH est construite à partir du vecteur pEYFPmemb (CLONTECH ). Ce vecteur présente l'avantage de posséder :
- une séquence GAP-43 qui permet un ancrage de la chimère à la membrane plasmique via son extrémité NH . L'ancrage à la membrane présente l'intérêt d'une part de maintenir la protéine à la membrane et d'autre part d'augmenter la probabilité de rencontre entre la protéine chimère et son ligand Gβγ qui est lui- même ancré à la membrane par une liaison de type palmitoylation, et
- une séquence EYFP en aval de GAP-43. La construction est réalisée en deux étapes :
- lere étape de clonage : Le fragment d'ADN codant pour le domaine GK-like de la sous-unité β (Hanlon et al, FEBS, 1999, 445, 366-370) fusionné à la boucle I-II de la sous-unité ai est amplifié par PCR à partir du plasmide pcDNA3-Cavβ3-I-II2.ι (exemple 1) puis il est clone en 3' du gène EYFP.
De manière plus précise, l'amplification PCR est réalisée à l'aide des amorces sens et anti-sens suivantes : BsiWI Pvu l - 5'- AGCCGTACGCGATCGCATCTCTAGCCAAGCAGAAGCAAA - 3' (SEQ ID NO: 6)
Hpa I Spe I
5'- CCCGTTAACCCCACTAGTCTGAGTTTTGACCATGCGACGGAT-3' (SEQ ID NO: 7) Le produit PCR obtenu est clone entre les sites BsiW I et Hpa I du plasmide pEYFPmemb pour donner le plasmide pEYFmemChimBéta3I-II.
- 2lème étape de clonage :
L' ADNc codant pour l'ECP est amplifié par PCR puis clone dans le plasmide précédent, en 3' de l'insert β 3 -I-II. De manière plus précise, l'ECFP est amplifiée par PCR à partir du vecteur pECFP (Clontech), à l'aide des amorces sens et anti-sens suivantes : Spe l
- 5'- GGGACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG- 3'(SEQ ID NO: 8)
Hpa l
- 5'- CCCGTTAACTGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGT-3' (SEQ ID NO: 9)
Le produit PCR obtenu est clone entre les sites Spe I et Hpa I du plasmide pEYFmemChimBéta3I-II pour donner le plasmide pCHIC correspondant à la séquence SEQ ID NO: 10.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Protéine chimérique dérivée d'un canal calcique haut seuil, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une sous-unité β ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine BID, fusionné(e) à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité ai ou un fragment de celle-ci incluant au moins le domaine AID.
2°) Protéine chimérique selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle est constituée par une sous-unité β fusionnée à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité ai. 3°) Protéine chimérique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est constituée par le domaine GK-like d'une sous-unité β fusionné à son extrémité NH2 ou COOH avec la boucle I-II d'une sous-unité αj.
4°) Protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la sous-unité β ou son fragment et la boucle I-II ou son fragment sont séparés par un peptide espaceur.
5°) Protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est issue d'un canal calcique haut-seuil sensible aux protéines G.
6°) Protéine chimérique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend la boucle I-II d'une sous-unité ai sélectionnée parmi αiA, ie et αiE ou un fragment de celle-ci.
7°) Protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend une sous-unité β sélectionnée dans le groupe constitué par βi, β2, β3 et β4 ou un fragment de celle-ci. 8°) Protéine chimérique variant issue d'une protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle présente une mutation d'au moins un acide aminé dans les séquences de la dite sous-unité β et/ou de la boucle I-II d'une sous unité \. 9°) Protéine chimérique variant selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite mutation modifie l'affinité de la sous-unité β pour le fragment de la boucle I-II de la sous-unité α et/ou réciproquement.
10°) Protéine chimérique variant selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce que lesdites mutations sont sélectionnées parmi les mutations suivantes du domaine AID de la boucle I-II de la sous-unité ai : Q383A, Q384A, E386D, E386S, L389H, G391R, Y392S, Y392F, W395A, I396A et E400A.
11°) Protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est couplée, de préférence de manière covalente, à au moins un marqueur approprié permettant la détection et/ou la purification et/ou l'immobilisation de ladite protéine.
12°) Protéine chimérique selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend un fluorophore accepteur ou donneur respectivement à son extrémité NH2 et/ou COOH. 13°) Protéine chimérique selon la revendication 12, caractérisée en ce que le fluorophore accepteur est la protéine fluorescente CFP ou BFP et le fluorophore donneur est la protéine fluorescente GFP ou YFP.
14°) Peptide, caractérisé en ce qu'il comprend un fragment d'au moins 7 acides aminés de la séquence de la protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 situés à la jonction de la sous-unité β et de la boucle I-II de la sous-unité ai d'un canal calcique ou de leurs fragments tels que définis à la revendication 1.
15°) Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une protéine selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 ou un peptide selon la revendication 14.
16°) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences codant pour une protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 ou un peptide selon la revendication 14, et les séquences complémentaires des précédentes, sens ou anti- sens. 17°) Sondes et amorces, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'environ 10 à 30 nucléotides correspondant à celle située à la jonction de la sous-unité β et de la boucle I-II de la sous-unité ai d'un canal calcique ou de leurs fragments tels que définis à la revendication 1. 18°) Amorces aptes à amplifier la sous-unité β et/ou la boucle I-II de la sous-unité ai d'un canal calcique ou leurs fragments tels que définis à la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont sélectionnées dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 7, 8 et 9.
19°) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend un insert sélectionné dans le groupe constitué par les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 16.
20°) Vecteur recombinant selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur d'expression eucaryote présentant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 10.
21°) Cellules modifiées par un vecteur recombinant selon la revendication 19 ou 20, par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 16 ou par une protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.
22°) Cellules modifiées selon la revendication 21, caractérisées en ce qu'il s'agit de cellules eucaryotes.
23°) Cellules modifiées selon la revendication 21 ou la revendication 22, caractérisées en ce qu'elles expriment au moins un récepteur capable de se lier aux protéines G.
24°) Mammifère transgénique non-humain, caractérisé en ce que tout ou partie de ses cellules sont transformées par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 16.
25°) Utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 16, les vecteurs recombinants selon la revendication 19 ou la revendication 20, les cellules modifiées selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 et les mammifères transgéniques non-humains selon la revendication 24, pour l'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G.
26°) Utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, les molé- cules d'acides nucléiques selon la revendication 16, les vecteurs recombinants selon la revendication 19 ou la revendication 20, les cellules modifiées selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 et les mammifères transgéniques non-humains selon la revendication 24 pour le criblage d'agonistes et/ou d'antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G. 27°) Utilisation d'un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 16, les vecteurs recombinants selon la revendication 19 ou la revendication 20, les cellules modifiées selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 et les mammifères transgéniques non-humains selon la revendication 24 pour le criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sous-unités ai et β des canaux calciques haut-seuil.
28°) Méthode d'étude des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : ai) la culture de cellules modifiées exprimant une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible aux protéines G et un récepteur couplé au protéine G selon la revendication 23, bi) la transduction d'un signal par l'intermédiaire dudit récepteur couplé aux protéine G, par tout moyen approprié, et ci) la détermination, par tout moyen approprié, de la proportion de ladite protéine chimérique exprimée dans lesdites cellules qui est liée à une sous-unité Gβγ.
29°) Méthode de criblage d'agonistes/d'antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a2) la culture de cellules modifiées exprimant une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible aux protéines G et un récepteur couplé aux protéines G selon la revendication 23, b2) la transduction d'un signal par l'intermédiaire dudit récepteur couplé aux protéines G, par tout moyen approprié,
C2) la détermination comparative, par tout moyen approprié, de la proportion de ladite protéine chimérique exprimée dans les cellules qui est liée à une sous-unité Gβγ, avant et après la mise en contact desdites cellules en b2) avec une molécule à tester, et d2) l'identification des molécules agonistes/antagonistes des voies de signalisation et de régulation cellulaires dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G, correspondant à celles capables respectivement d'augmenter et de diminuer la concentration cellulaire en sous-unités Gβγ libres.
30°) Méthode selon la revendication 28 ou la revendication 29, caractérisée en ce que lesdites cellules modifiées en ai) ou en a2) expriment une protéine chimérique couplée, à ses extrémités NH2 et COOH, respectivement à un fluorophore donneur et un fluorophore accepteur de fluorescence et ladite détermination en ci) ou en C2) est effectuée par la technique de transfert de fluorescence (FRET).
31°) Méthode de criblage d'antagonistes de l'interaction entre les sous-unités ai et β des canaux calciques haut-seuil, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a3) la mise en contact d'une molécule à tester avec une protéine chimérique issue d'un canal calcique sensible ou insensible aux protéines G selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, et avec un peptide comprenant le domaine AID d'une sous-unité αj insensible aux protéines G, b3) la mesure, par tout moyen approprié, de la liaison de ladite protéine chimérique audit peptide, et c3) l'identification des antagonistes de l'interaction entre les sous- unités αj et β, correspondant à ceux avec lesquels on observe une liaison de ladite protéine chimérique audit peptide.
32°) Méthode de criblage selon la revendication 31, caractérisée en ce que ledit peptide comprenant le domaine AID est immobilisé sur un support solide et ladite protéine chimérique est une protéine chimérique selon l'une quelconque des revendications 11 à 13.
33°) Trousse pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'une quelconque des revendications 28 à 32, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un produit sélectionné dans le groupe constitué par les protéines chimériques selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, les molécules d'acides nucléiques selon la revendication 16, les vecteurs recombinants selon la revendication 19 ou la revendication 20, les cellules modifiées selon l'une quelconque des revendications 21 à 23 et les mammifères transgéniques non-humains selon la revendication 24.
1/13
Figure imgf000035_0001
Figure 1
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Figure 2 3/13
Figure imgf000037_0001
T GST 0 10 30 1 10 400 900 Gβγ concentration (nM)
Figure imgf000037_0002
Gβγ concentration (nM)
Figure 3
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Figure imgf000038_0001
tz- ta J
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5/13
Figure imgf000039_0001
(•n-B) Λ-jisiiθjiπ
Figure imgf000039_0002
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H PΉ
Ratio F585/F525
Figure imgf000040_0001
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7/13
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Gβγ HI Gβγ
Figure 7 8/13
pcDNA3-Cavβ3-I-II2.1 (SEQ ID NO: 5)
1 ATGGATGACG ACTCCTACGT GCCCGGGTTT GAGGACTCGG AGGCGGGTTC 51 AGCCGACTCC TACACCAGCC GCCCCTCTCT GGACTCAGAC GTTTCCCTGG 101 AGGAGGACCG GGAGAGTGCC CGGCGAGAAG TGGAGAGTCA GGCTCAGCAG 151 CAGCTGGAAA GAGCCAAGCA CAAACCTGTG GCATTTGCTG TGAGGACCAA 201 TGTCAGCTAC TGTGGAGTTC TGGATGAGGA ATGCCCAGTC CAGGGCTCTG 251 GAGTCAACTT CGAGGCCAAA GATTTTCTGC ACATTAAAGA GAAGTACAGC 301 AATGACTGGT GGATCGGGAG GCTAGTGAAA GAAGGTGGCG ATATTGCCTT 351 CATCCCCAGC CCCCAACGCC TGGAGAGCAT CCGGCTCAAA CAGGAACAGA 401 AGGCCAGGAG ATCCGGGAAC CCTTCCAGCC TGAGTGACAT TGGCAACCGA 451 CGTTCCCCTC CTCCATCTCT AGCCAAGCAG AAGCAAAAGC AGGCGGAACA 501 TGTCCCCCCG TATGATGTGG TGCCCTCCAT GCGGCCTGTG GTGCTGGTGG 551 GACCCTCTCT GAAAGGTTAT GAGGTCACAG ACATGATGCA GAAGGCTCTC 601 TTCGACTTCC TTAAACACAG GTTTGATGGC AGGATCTCCA TCACCCGCGT 651 CACGGCTGAC CTCTCACTGG CCAAGCGCTC TGTGCTCAAC AATCCTGGCA 701 AGAGGACCAT CATCGAGCGC TCTTCTGCCC GCTCCAGCAT TGCTGAGGTG 751 CAGAGTGAGA TTGAGCGCAT ATTCGAGCTG GCCAAATCCC TGCAGCTAGT 801 GGTGTTGGAT GCTGACACCA TCAACCACCC AGCACAGCTA GCCAAGACCT 851 CACTGGCCCC CATCATCGTC TTCGTCAAAG TGTCCTCGCC AAAGGTACTG 901 CAGCGACTGA TCCGCTCCAG GGGGAAGTCC CAGATGAAGC ACCTCACTGT 951 ACAGATGATG GCATATGATA AGCTGGTTCA GTGCCCACCT GAGTCATTTG 1001 ATGTGATTCT GGATGAGAAC CAGCTGGACG ACGCCTGTGA GCACCTAGCT 1051 GAATACCTAG AGGTTTACTG GCGCGCTACC CACCACCCAG CACCGGGCCC 1101 CGGGATGCTG GGTCCGCCCA GTGCCATCCC TGGACTTCAG AACCAGCAGC 1151 TGCTGGGGGA GCGAGGTGAG GAGCATTCAC CCCTGGAGCG GGACAGTTTG 1201 ATGCCCTCGG ATGAGGCCAG TGAGAGCTCC CGCCAGGCCT GGACCGGATC 1251 TTCACAGCGC AGCTCCCGCC ATCTGGAGGA GGACTATGCA GATGCCTACC 1301 AGGACCTGTA CCAGCCTCAC CGTCAACACA CCTCGGGGCT ACCCAGTGCT 1351 AACGGGCATG ACCCCCAAGA CCGGCTCCTA GCCCAGGACT CGGAGCATGA 1401 CCACAATGAC CGGAACTGGC AGCGTAACCG GCCTTGGCCT AAGGACAGCT 1451 ACGAATTCGC CAAAGAAAGG GAGCGGGTGG AGAACCGGCG CGCATTCCTG 1501 AAGCTGCGGC GGCAGCAGCA GATTGAACGC GAGCTCAACG GGTACATGGA 1551 GTGGATCTCA AAAGCAGAAG AGGTGATCCT CGCAGAGGAC GAGACCGACG 1601 TGGAGCAGAG ACATCCCTTT GATGGAGCTC TGCGGAGAGC CACTATCAAG 1651 AAGAGCAAGA CGGACCTGCT CCACCCAGAG GAGGCGGAGG ATCAGCTGGC 1701 CGACATCGCC TCCGTGGGGT CTCCCTTTGC CCGAGCCAGC ATTAAAAGTG 1751 CCAAGCTGGA GAACTCGAGT TTTTTCCACA AAAAAGAGAG GAGAATGCGT 1801 TTCTACATCC GTCGCATGGT CAAAACTCAG TAAGAATTCT GCAGATATCC 1851 ATCACACTGG CGGCCGCTCG AGCATGCATC TAGAGGGCCC TATTCTATAG 1901 TGTCACCTAA ATGCTAGAGC TCGCTGATCA GCCTCGACTG TGCCTTCTAG 1951 TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG 2001 AAGGTGCCAC TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG 2051 CATTGTCTGA GTAGGTGTCA TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA 2101 CAGCAAGGGG GAGGATTGGG AAGACAATAG CAGGCATGCT GGGGATGCGG 2151 TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG GCGGAAAGAA CCAGCTGGGG CTCTAGGGGG 2201 TATCCCCACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT 2251 TACGCGCAGC GTGACCGCTA CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT 2301 TCGCTTTCTT CCCTTCCTTT CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA 2351 GCTCTAAATC GGGGCATCCC TTTAGGGTTC CGATTTAGTG CTTTACGGCA 2401 CCTCGACCCC AAAAAACTTG ATTAGGGTGA TGGTTCACGT AGTGGGCCAT 2451 CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC CACGTTCTTT 2501 AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGT 2551 CTATTCTTTT GATTTATAAG GGATTTTGGG GATTTCGGCC TATTGGTTAA 2601 AAAATGAGCT GATTTAACAA AAATTTAACG CGAATTAATT CTGTGGAATG 2651 TGTGTCAGTT AGGGTGTGGA AAGTCCCCAG GCTCCCCAGG CAGGCAGAAG 2701 TATGCAAAGC ATGCATCTCA ATTAGTCAGC AACCAGGTGT GGAAAGTCCC
Figure 8a 9/ 13
2751 CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA 2801 GCAACCATAG TCCCGCCCCT AACTCCGCCC ATCCCGCCCC TAACTCCGCC 2851 CAGTTCCGCC CATTCTCCGC CCCATGGCTG ACTAATTTTT TTTATTTATG 2901 CAGAGGCCGA GGCCGCCTCT GCCTCTGAGC TATTCCAGAA GTAGTGAGGA 2951 GGCTTTTTTG GAGGCCTAGG CTTTTGCAAA AAGCTCCCGG GAGCTTGTAT 3001 ATCCATTTTC GGATCTGATC AAGAGACAGG ATGAGGATCG TTTCGCATGA 3051 TTGAACAAGA TGGATTGCAC GCAGGTTCTC CGGCCGCTTG GGTGGAGAGG 3101 CTATTCGGCT ATGACTGGGC ACAACAGACA ATCGGCTGCT CTGATGCCGC 3151 CGTGTTCCGG CTGTCAGCGC AGGGGCGCCC GGTTCTTTTT GTCAAGACCG 3201 ACCTGTCCGG TGCCCTGAAT GAACTGCAGG ACGAGGCAGC GCGGCTATCG 3251 TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTGCGCA GCTGTGCTCG ACGTTGTCAC 3301 TGAAGCGGGA AGGGACTGGC TGCTATTGGG CGAAGTGCCG GGGCAGGATC 3351 TCCTGTCATC TCACCTTGCT CCTGCCGAGA AAGTATCCAT CATGGCTGAT 3401 GCAATGCGGC GGCTGCATAC GCTTGATCCG GCTACCTGCC CATTCGACCA 3451 CCAAGCGAAA CATCGCATCG AGCGAGCACG TACTCGGATG GAAGCCGGTC 3501 TTGTCGATCA GGATGATCTG GACGAAGAGC ATCAGGGGCT CGCGCCAGCC 3551 GAACTGTTCG CCAGGCTCAA GGCGCGCATG CCCGACGGCG AGGATCTCGT 3601 CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG GAAAATGGCC 3651 GCTTTTCTGG ATTCATCGAC TGTGGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCTAT 3701 CAGGACATAG CGTTGGCTAC CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA 3751 ATGGGCTGAC CGCTTCCTCG TGCTTTACGG TATCGCCGCT CCCGATTCGC 3801 AGCGCATCGC CTTCTATCGC CTTCTTGACG AGTTCTTCTG AGCGGGACTC 3851 TGGGGTTCGA AATGACCGAC CAAGCGACGC CCAACCTGCC ATCACGAGAT 3901 TTCGATTCCA CCGCCGCCTT CTATGAAAGG TTGGGCTTCG GAATCGTTTT 3951 CCGGGACGCC GGCTGGATGA TCCTCCAGCG CGGGGATCTC ATGCTGGAGT 4001 TCTTCGCCCA CCCCAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG TTACAAATAA 4051 AGCAATAGCA TCACAAATTT CACAAATAAA GCATTTTTTT CACTGCATTC 4101 TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGTATAC 4151 CGTCGACCTC TAGCTAGAGC TTGGCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT 4201 GTGTGAAATT GTTATCCGCT CACAATTCCA CACAACATAC GAGCCGGAAG 4251 CATAAAGTGT AAAGCCTGGG GTGCCTAATG AGTGAGCTAA CTCACATTAA 4301 TTGCGTTGCG CTCACTGCCC GCTTTCCAGT CGGGAAACCT GTCGTGCCAG 4351 CTGCATTAAT GAATCGGCCA ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT TGCGTATTGG 4401 GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG GTCGTTCGGC 4451 TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG GTTATCCACA 4501 GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG GCCAGCAAAA 4551 GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC 4601 GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA 4651 AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT 4701 CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT 4751 TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC AATGCTCACG CTGTAGGTAT 4801 CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG TGCACGAACC 4851 CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT 4901 CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC 4951 AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG 5001 GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGGAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC 5051 TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC TTGATCCGGC 5101 AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA AGCAGCAGAT 5151 TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG 5201 GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG 5251 AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG 5301 TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA AACTTGGTCT GACAGTTACC 5351 AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT ATTTCGTTCA 5401 TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG 5451 CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC 5501 CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC
Figure 8b 10/13
5551 AGAAGTGGTC CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG 5601 CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT TAATAGTTTG CGCAACGTTG 5651 TTGCCATTGC TACAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT TGGTATGGCT 5701 TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT 5751 GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA 5801 GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT 5851 TCTCTTACTG TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA 5901 CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT GCGGCGACCG AGTTGCTCTT 5951 GCCCGGCGTC AATACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG AACTTTAAAA 6001 GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT 6051 ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT 6101 CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA 6151 AGGCAAAATG CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT 6201 ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG AAGCATTTAT CAGGGTTATT 6251 GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA TAAACAAATA 6301 GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGACG TCGACGGATC 6351 GGGAGATCTC CCGATCCCCT ATGGTCGACT CTCAGTACAA TCTGCTCTGA 6401 TGCCGCATAG TTAAGCCAGT ATCTGCTCCC TGCTTGTGTG TTGGAGGTCG 6451 CTGAGTAGTG CGCGAGCAAA ATTTAAGCTA CAACAAGGCA AGGCTTGACC 6501 GACAATTGCA TGAAGAATCT GCTTAGGGTT AGGCGTTTTG CGCTGCTTCG 6551 CGATGTACGG GCCAGATATA CGCGTTGACA TTGATTATTG ACTAGTTATT 6601 AATAGTAATC AATTACGGGG TCATTAGTTC ATAGCCCATA TATGGAGTTC 6651 CGCGTTACAT AACTTACGGT AAATGGCCCG CCTGGCTGAC CGCCCAACGA 6701 CCCCCGCCCA TTGACGTCAA TAATGACGTA TGTTCCCATA GTAACGCCAA 6751 TAGGGACTTT CCATTGACGT CAATGGGTGG ACTATTTACG GTAAACTGCC 6801 CACTTGGCAG TACATCAAGT GTATCATATG CCAAGTACGC CCCCTATTGA 6851 CGTCAATGAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCA TTATGCCCAG TACATGACCT 6901 TATGGGACTT TCCTACTTGG CAGTACATCT ACGTATTAGT CATCGCTATT 6951 ACCATGGTGA TGCGGTTTTG GCAGTACATC AATGGGCGTG GATAGCGGTT 7001 TGACTCACGG GGATTTCCAA GTCTCCACCC CATTGACGTC AATGGGAGTT 7051 TGTTTTGGCA CCAAAATCAA CGGGACTTTC CAAAATGTCG TAACAACTCC 7101 GCCCCATTGA CGCAAATGGG CGGTAGGCGT GTACGGTGGG AGGTCTATAT 7151 AAGCAGAGCT CTCTGGCTAA CTAGAGAACC CACTGCTTAC TGGCTTATCG 7201 AAATTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCC AAGCTTGGTA CC
Figure 8c 11/13 pCHIC (SEQ ID NO: 10)
1 ATGCTGTGCT GTATGAGAAG AACCAAACAG GTTGAAAAGA ATGATGAGGA 51 CCAAAAGATC ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC 101 CCATCCTGGT CGAGCTGGAC GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG 151 TCCGGCGAGG GCGAGGGCGA TGCCACCTAC GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT 201 CATCTGCACC ACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC CTCGTGACCA 251 CCTTCGGCTA CGGCCTGCAG TGCTTCGCCC GCTACCCCGA CCACATGAAG 301 CAGCACGACT TCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG 351 CACCATCTTC TTCAAGGACG ACGGCAACTA CAAGACCCGC GCCGAGGTGA 401 AGTTCGAGGG CGACACCCTG GTGAACCGCA TCGAGCTGAA GGGCATCGAC 451 TTCAAGGAGG ACGGCAACAT CCTGGGGCAC AAGCTGGAGT ACAACTACAA 501 CAGCCACAAC GTCTATATCA TGGCCGACAA GCAGAAGAAC GGCATCAAGG 551 TGAACTTCAA GATCCGCCAC AACATCGAGG ACGGCAGCGT GCAGCTCGCC 601 GACCACTACC AGCAGAACAC CCCCATCGGC GACGGCCCCG TGCTGCTGCC 651 CGACAACCAC TACCTGAGCT ACCAGTCCGC CCTGAGCAAA GACCCCAACG
701 AGAAGCGCGA TCACATGGTC CTGCTGGAGT TCGTGACCGC CGCCGGGATC 751 ACTCTCGGCA TGGACGAGCT GTACGCGATC GCATCTCTAG CCAAGCAGAA
801 GCAAAAGCAG GCGGAACATG TCCCCCCGTA TGATGTGGTG CCCTCCATGC 851 GGCCTGTGGT GCTGGTGGGA CCCTCTCTGA AAGGTTATGA GGTCACAGAC 901 ATGATGCAGA AGGCTCTCTT CGACTTCCTT AAACACAGGT TTGATGGCAG 951 GATCTCCATC ACCCGCGTCA CGGCTGACCT CTCACTGGCC AAGCGCTCTG
1001 TGCTCAACAA TCCTGGCAAG AGGACCATCA TCGAGCGCTC TTCTGCCCGC 1051 TCCAGCATTG CTGAGGTGCA GAGTGAGATT GAGCGCATAT TCGAGCTGGC 1101 CAAATCCCTG CAGCTAGTGG TGTTGGATGC TGACACCATC AACCACCCAG 1151 CACAGCTAGC CAAGACCTCA CTGGCCCCCA TCATCGTCTT CGTCAAAGTG 1201 TCCTCGCCAA AGGTACTGCA GCGACTGATC CGCTCCAGGG GGAAGTCCCA 1251 GATGAAGCAC CTCACTGTAC AGATGATGGC ATATGATAAG CTGGTTCAGT 1301 GCCCACCTGA GTCATTTGAT GTGATTCTGG ATGAGAACCA GCTGGACGAC 1351 GCCTGTGAGC ACCTAGCTGA ATACCTAGAG GTTTACTGGC GCGCTACCCA 1401 CCACCCAGCA CCGGGCCCCG GGATGCTGGG TCCGCCCAGT GCCATCCCTG 1451 GACTTCAGAA CCAGCAGCTG CTGGGGGAGC GAGGTGAGGA GCATTCACCC 1501 CTGGAGCGGG ACAGTTTGAT GCCCTCGGAT GAGGCCAGTG AGAGCTCCCG 1551 CCAGGCCTGG ACCGGATCTT CACAGCGCAG CTCCCGCCAT CTGGAGGAGG 1601 ACTATGCAGA TGCCTACCAG GACCTGTACC AGCCTCACCG TCAACACACC 1651 TCGGGGCTAC CCAGTGCTAA CGGGCATGAC CCCCAAGACC GGCTCCTAGC 1701 CCAGGACTCG GAGCATGACC ACAATGACCG GAACTGGCAG CGTAACCGGC 1751 CTTGGCCTAA GGACAGCTAC GAATTCGCCA AAGAAAGGGA GCGGGTGGAG 1801 AACCGGCGCG CATTCCTGAA GCTGCGGCGG CAGCAGCAGA TTGAACGCGA 1851 GCTCAACGGG TACATGGAGT GGATCTCAAA AGCAGAAGAG GTGATCCTCG 1901 CAGAGGACGA GACCGACGTG GAGCAGAGAC ATCCCTTTGA TGGAGCTCTG 1951 CGGAGAGCCA CTATCAAGAA GAGCAAGACG GACCTGCTCC ACCCAGAGGA 2001 GGCGGAGGAT CAGCTGGCCG ACATCGCCTC CGTGGGGTCT CCCTTTGCCC 2051 GAGCCAGCAT TAAAAGTGCC AAGCTGGAGA ACTCGAGTTT TTTCCACAAA 2101 AAAGAGAGGA GAATGCGTTT CTACATCCGT CGCATGGTCA AAACTCAGAC 2151 TAGTATGGTG AGCAAGGGCG AGGAGCTGTT CACCGGGGTG GTGCCCATCC 2201 TGGTCGAGCT GGACGGCGAC GTAAACGGCC ACAGGTTCAG CGTGTCCGGC 2251 GAGGGCGAGG GCGATGCCAC CTACGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCATCTG 2301 CACCACCGGC AAGCTGCCCG TGCCCTGGCC CACCCTCGTG ACCACCCTGA 2351 CCTGGGGCGT GCAGTGCTTC AGCCGCTACC CCGACCACAT GAAGCAGCAC 2401 GACTTCTTCA AGTCCGCCAT GCCCGAAGGC TACGTCCAGG AGCGCACCAT 2451 CTTCTTCAAG GACGACGGCA ACTACAAGAC CCGCGCCGAG GTGAAGTTCG 2501 AGGGCGACAC CCTGGTGAAC CGCATCGAGC TGAAGGGCAT CGACTTCAAG 2551 GAGGACGGCA ACATCCTGGG GCACAAGCTG GAGTACAACT ATATCAGCCA 2601 CAACGTCTAT ATCACCGCCG ACAAGCAGAA GAACGGCATC AAGGCCAACT 2651 TCAAGATCCG CCACAACATC GAGGACGGCA GCGTGCAGCT CGCCGACCAC 2701 TACCAGCAGA ACACCCCCAT CGGCGACGGC CCCGTGCTGC TGCCCGACAA
Figure 9a 12/13
2751 CCACTACCTG AGCACCCAGT CCGCCCTGAG CAAAGACCCC AAGGAGAAGC
2801 GCGATCACAT GGTCCTGCTG GAGTTCGTGA CCGCCGCCGG GATCACTCTC
2851 GGCAGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA
2901 GCATCACAAA TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT
2951 GGTTTGTCCA AACTCATCAA TGTATCTTAA GGCGTAAATT GTAAGCGTTA
3001 ATATTTTGTT AAAATTCGCG TTAAATTTTT GTTAAATCAG CTCATTTTTT
3051 AACCAATAGG CCGAAATCGG CAAAATCCCT T TAAATCAA AAGAATAGAC
3101 CGAGATAGGG TTGAGTGTTG TTCCAGTTTG GAACAAGAGT CCACTATTAA
3151 AGAACGTGGA CTCCAACGTC AAAGGGCGAA AAACCGTCTA TCAGGGCGAT
3201 GGCCCACTAC GTGAACCATC ACCCTAATCA AGTTTTTTGG GGTCGAGGTG
3251 CCGTAAAGCA CTAAATCGGA ACCCTAAAGG GAGCCCCCGA TTTAGAGCTT
3301 GACGGGGAAA GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA AGGAAGGGAA GAAAGCGAAA
3351 GGAGCGGGCG CTAGGGCGCT GGCAAGTGTA GCGGTCACGC TGCGCGTAAC
3401 CACCACACCC GCCGCGCTTA ATGCGCCGCT ACAGGGCGCG TCAGGTGGCA
3451 CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA
3501 CATTCAAATA'TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA
3551 ATAATATTGA AAAAGGAAGA GTCCTGAGGC GGAAAGAACC AGCTGTGGAA
3601 TGTGTGTCAG TTAGGGTGTG GAAAGTCCCC AGGCTCCCCA GCAGGCAGAA
3651 GTATGCAAAG CATGCATCTC AATTAGTCAG CAACCAGGTG TGGAAAGTCC
3701 CCAGGCTCCC CAGCAGGCAG AAGTATGCAA AGCATGCATC TCAATTAGTC
3751 AGCAACCATA GTCCCGCCCC TAACTCCGCC CATCCCGCCC CTAACTCCGC
3801 CCAGTTCCGC CCATTCTCCG CCCCATGGCT GACTAATTTT TTTTATTTAT
3851 GCAGAGGCCG AGGCCGCCTC GGCCTCTGAG CTATTCCAGA AGTAGTGAGG
3901 AGGCTTTTTT GGAGGCCTAG GCTTTTGCAA AGATCGATCA AGAGACAGGA
3951 TGAGGATCGT TTCGCATGAT TGAACAAGAT GGATTGCACG CAGGTTCTCC
4001 GGCCGCTTGG GTGGAGAGGC TATTCGGCTA TGACTGGGCA CAACAGACAA
4051 TCGGCTGCTC TGATGCCGCC GTGTTCCGGC TGTCAGCGCA GGGGCGCCCG
4101 GTTCTTTTTG TCAAGACCGA CCTGTCCGGT GCCCTGAATG AACTGCAAGA
4151 CGAGGCAGCG CGGCTATCGT GGCTGGCCAC GACGGGCGTT CCTTGCGCAG
4201 CTGTGCTCGA CGTTGTCACT GAAGCGGGAA GGGACTGGCT GCTATTGGGC
4251 GAAGTGCCGG GGCAGGATCT CCTGTCATCT CACCTTGCTC CTGCCGAGAA
4301 AGTATCCATC ATGGCTGATG CAATGCGGCG GCTGCATACG CTTGATCCGG
4351 CTACCTGCCC ATTCGACCAC CAAGCGAAAC ATCGCATCGA GCGAGCACGT
4401 ACTCGGATGG AAGCCGGTCT TGTCGATCAG GATGATCTGG ACGAAGAGCA
4451 TCAGGGGCTC GCGCCAGCCG AACTGTTCGC CAGGCTCAAG GCGAGCATGC
4501 CCGACGGCGA GGATCTCGTC GTGACCCATG GCGATGCCTG CTTGCCGAAT
4551 ATCATGGTGG AAAATGGCCG CTTTTCTGGA TTCATCGACT GTGGCCGGCT
4601 GGGTGTGGCG GACCGCTATC AGGACATAGC GTTGGCTACC CGTGATATTG
4651 CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGCTGACC GCTTCCTCGT GCTTTACGGT
4701 ATCGCCGCTC CCGATTCGCA GCGCATCGCC TTCTATCGCC TTCTTGACGA
4751 GTTCTTCTGA GCGGGACTCT GGGGTTCGAA ATGACCGACC AAGCGACGCC
4801 CAACCTGCCA TCACGAGATT TCGATTCCAC CGCCGCCTTC TATGAAAGGT
4851 TGGGCTTCGG AATCGTTTTC CGGGACGCCG GCTGGATGAT CCTCCAGCGC
4901 GGGGATCTCA TGCTGGAGTT CTTCGCCCAC CCTAGGGGGA GGCTAACTGA
4951 AACACGGAAG GAGACAATAC CGGAAGGAAC CCGCGCTATG ACGGCAATAA
5001 AAAGACAGAA TAAAACGCAC GGTGTTGGGT CGTTTGTTCA TAAACGCGGG 5051 GTTCGGTCCC AGGGCTGGCA CTCTGTCGAT ACCCCACCGA GACCCCATTG 5101 GGGCCAATAC GCCCGCGTTT CTTCCTTTTC CCCACCCCAC CCCCCAAGTT 5151 CGGGTGAAGG CCCAGGGCTC GCAGCCAACG TCGGGGCGGC AGGCCCTGCC 5201 ATAGCCTCAG GTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA AACTTCATTT 5251 TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA 5301 AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA 5351 AAGATCAAAG GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG 5401 CTTGCAAACA AAAAAACCAC CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC 5451 AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG 5501 ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC ACCACTTCAA
Figure 9b 13/13
5551 GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG
5601 TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA
5651 CGATAGTTAC CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG
5701 CACACAGCCC AGCTTGGAGC GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC
5751 AGCGTGAGCT ATGAGAAAGC GCCACGCTTC CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC 5801 AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT
5851 TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC
5901 TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA
5951 TGGAAAAACG CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG
6001 GCCTTTTGCT CACATGTTCT TTCCTGCGTT ATCCCCTGAT TCTGTGGATA
6051 ACCGTATTAC CGCCATGCAT TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC
6101 ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA
6151 ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA
6201 ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA
6251 ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT
6301 ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC
6351 GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA
6401 GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC
6451 AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT
6501 CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG
6551 GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG
6601 GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC
6651 CGTCAGATCC GCTAGCGCTA CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA
6701 ATTCTGCAGT CGACGGTACC GCGGGCCCGG GATCCACCGG TCGCCACC
Figure 9c SEQUENCE LISTING
<110> Commissariat à l'Energie Atomique
Institut National de la santé et de la Recherche Médicale
DE WAARD, Michel DUPUIS, Alain GRUNWALD, Didier SANDOZ, Guillaume
<120> Protéine chimérique pour le criblage d'agonistes et d'antagonistes des voies de signalisation cellulaire dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G
<130> 263PCT87
<160> 10
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> amorce
<400> 1 tttggtacca tggatgacga ctcctacgtg cccgggtttg aggactcgga ggcgggtt 58
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> amorce
Page 1 <400> 2 gcggaattcg tagctgtcct taggccaagg ccggttacgc tgccagtt 48
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> arti fi ci al séquence
<220>
<223> amorce
<400> 3 ggggaattcg ccaaagaaag ggagcgggtg gagaac 36
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> amorce
<400> 4 tttgaattct tactgagttt tgaccatgcg acggatgtag aaacgcattc t 51
<210> 5
<211> 7242
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> plasmide recombinant
<400> 5 atggatgacg actcctacgt gcccgggttt gaggactcgg aggcgggttc agccgactcc 60 tacaccagcc gcccctctct ggactcagac gtttccctgg aggaggaccg ggagagtgcc 120 cggcgagaag tggagagtca ggctcagcag cagctggaaa gagccaagca caaacctgtg 180 gcatttgctg tgaggaccaa tgtcagctac tgtggagttc tggatgagga atgcccagtc 240 cagggctctg gagtcaactt cgaggccaaa gattttctgc acattaaaga gaagtacagc 300 aatgactggt ggatcgggag gctagtgaaa gaaggtggcg atattgcctt catccccagc 360 ccccaacgcc tggagagcat ccggctcaaa caggaacaga aggccaggag atccgggaac 420
Page 2 ccttccagcc tgagtgacat tggcaaccga cgttcccctc ctccatctct agccaagcag 480 aagcaaaagc aggcggaaca tgtccccccg tatgatgtgg tgccctccat gcggcctgtg 540 gtgctggtgg gaccctctct gaaaggttat gaggtcacag acatgatgca gaaggctctc 600 ttcgacttcc ttaaacacag gtttgatggc aggatctcca tcacccgcgt cacggctgac 660 ctctcactgg ccaagcgctc tgtgctcaac aatcctggca agaggaccat catcgagcgc 720 tcttctgccc gctccagcat tgctgaggtg cagagtgaga ttgagcgcat attcgagctg 780 gccaaatccc tgcagctagt ggtgttggat gctgacacca tcaaccaccc agcacagcta 840 gccaagacct cactggcccc catcatcgtc ttcgtcaaag tgtcctcgcc aaaggtactg 900 cagcgactga tccgctccag ggggaagtcc cagatgaagc acctcactgt acagatgatg 960 gcatatgata agctggttca gtgcccacct gagtcatttg atgtgattct ggatgagaac 1020 cagctggacg acgcctgtga gcacctagct gaatacctag aggtttactg gcgcgctacc 1080 caccacccag caccgggccc cgggatgctg ggtccgccca gtgccatccc tggacttcag 1140 aaccagcagc tgctggggga gcgaggtgag gagcattcac ccctggagcg ggacagtttg 1200 atgccctcgg atgaggccag tgagagctcc cgccaggcct ggaccggatc ttcacagcgc 1260 agctcccgcc atctggagga ggactatgca gatgcctacc aggacctgta ccagcctcac 1320 cgtcaacaca cctcggggct acccagtgct aacgggcatg acccccaaga ccggctccta 1380 gcccaggact cggagcatga ccacaatgac cggaactggc agcgtaaccg gccttggcct 1440 aaggacagct acgaattcgc caaagaaagg gagcgggtgg agaaccggcg cgcattcctg 1500 aagctgcggc ggcagcagca gattgaacgc gagctcaacg ggtacatgga gtggatctca 1560 aaagcagaag aggtgatcct cgcagaggac gagaccgacg tggagcagag acatcccttt 1620 gatggagctc tgcggagagc cactatcaag aagagcaaga cggacctgct ccacccagag 1680 gaggcggagg atcagctggc cgacatcgcc tccgtggggt ctccctttgc ccgagccagc 1740 attaaaagtg ccaagctgga gaactcgagt tttttccaca aaaaagagag gagaatgcgt 1800 ttctacatcc gtcgcatggt caaaactcag taagaattct gcagatatcc atcacactgg 1860 cggccgctcg agcatgcatc tagagggccc tattctatag tgtcacctaa atgctagagc 1920 tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 1980 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 2040 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 2100 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 2160 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag 2220 cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 2280 cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 2340 tccccgtcaa gctctaaatc ggggcatccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 2400 cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 2460
Page 3 gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 2520 aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttggg 2580 gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt 2640 ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagg caggcagaag 2700 tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc 2760 agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct 2820 aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 2880 actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa 2940 gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat 3000 atccattttc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 3060 tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 3120 acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 3180 ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 3240 gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 3300 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tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 5880 ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 5940 agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 6000 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 6060 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 6120 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 6180 gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 6240 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 6300 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgacggatc gggagatctc 6360 ccgatcccct atggtcgact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt 6420 atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg cgcgagcaaa atttaagcta 6480 caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct gcttagggtt aggcgttttg 6540 Page 5 cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt 6600 aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 6660 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<212> DNA
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<400> 7 cccgttaacc ccactagtct gagttttgac catgcgacgg at 42
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<212> DNA
Page 6 <213> arti fi ci al séquence
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<223> amorce
<400> 8 gggactagta tggtgagcaa gggcgaggag ctg 33
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<212> DNA
<213> artificial séquence
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<223> amorce
<400> 9 cccgttaact gccgagagtg atcccggcgg cggt 34
<210> 10
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<213> artificial séquence
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<223> plasmide recombinant
<400> 10 atggatgacg actcctacgt gcccgggttt gaggactcgg aggcgggttc agccgactcc 60 tacaccagcc gcccctctct ggactcagac gtttccctgg aggaggaccg ggagagtgcc 120 cggcgagaag tggagagtca ggctcagcag cagctggaaa gagccaagca caaacctgtg 180 gcatttgctg tgaggaccaa tgtcagctac tgtggagttc tggatgagga atgcccagtc 240 cagggctctg gagtcaactt cgaggccaaa gattttctgc acattaaaga gaagtacagc 300 aatgactggt ggatcgggag gctagtgaaa gaaggtggcg atattgcctt catccccagc 360 ccccaacgcc tggagagcat ccggctcaaa caggaacaga aggccaggag atccgggaac 420 ccttccagcc tgagtgacat tggcaaccga cgttcccctc ctccatctct agccaagcag 480 aagcaaaagc aggcggaaca tgtccccccg tatgatgtgg tgccctccat gcggcctgtg 540 gtgctggtgg gaccctctct gaaaggttat gaggtcacag acatgatgca gaaggctctc 600 ttcgacttcc ttaaacacag gtttgatggc aggatctcca tcacccgcgt cacggctgac 660 ctctcactgg ccaagcgctc tgtgctcaac aatcctggca agaggaccat catcgagcgc 720
Page 7 tcttctgccc gctccagcat tgctgaggtg cagagtgaga ttgagcgcat attcgagctg 780 gccaaatccc tgcagctagt ggtgttggat gctgacacca tcaaccaccc agcacagcta 840 gccaagacct cactggcccc catcatcgtc ttcgtcaaag tgtcctcgcc aaaggtactg 900 cagcgactga tccgctccag ggggaagtcc cagatgaagc acctcactgt acagatgatg 960 gcatatgata agctggttca gtgcccacct gagtcatttg atgtgattct ggatgagaac 1020 cagctggacg acgcctgtga gcacctagct gaatacctag aggtttactg gcgcgctacc 1080 caccacccag caccgggccc cgggatgctg ggtccgccca gtgccatccc tggacttcag 1140 aaccagcagc tgctggggga gcgaggtgag gagcattcac ccctggagcg ggacagtttg 1200 atgccctcgg atgaggccag tgagagctcc cgccaggcct ggaccggatc ttcacagcgc 1260 agctcccgcc atctggagga ggactatgca gatgcctacc aggacctgta ccagcctcac 1320 cgtcaacaca cctcggggct acccagtgct aacgggcatg acccccaaga ccggctccta 1380 gcccaggact cggagcatga ccacaatgac cggaactggc agcgtaaccg gccttggcct 1440 aaggacagct acgaattcgc caaagaaagg gagcgggtgg agaaccggcg cgcattcctg 1500 aagctgcggc ggcagcagca gattgaacgc gagctcaacg ggtacatgga gtggatctca 1560 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cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 2460 gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 2520 aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttggg 2580 gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt 2640 ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagg caggcagaag 2700 tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc 2760 Page 8 agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct 2820 aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 2880 actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa 2940 gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat 3000 atccattttc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 3060 tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 3120 acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 3180 ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 3240 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gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 4140 gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 4200 gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 4260 aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 4320 gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 4380 agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 4440 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 4500 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 4560 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 4620 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 4680 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 4740 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 4800 Page 9 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 4860 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 4920 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 4980 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 5040 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 5100 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 5160 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 5220 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 5280 cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 5340 gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 5400 tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 5460 ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 5520 ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 5580 atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 5640 cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 5700 tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 5760 aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 5820 tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 5880 ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 5940 agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 6000 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 6060 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 6120 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 6180 gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 6240 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 6300 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgacggatc gggagatctc 6360 ccgatcccct atggtcgact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt 6420 atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg cgcgagcaaa atttaagcta 6480 caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct gcttagggtt aggcgttttg 6540 cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt 6600 aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 6660 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 6720 taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 6780 actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 6840
Page 10 cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgaect 6900 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 6960 tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 7020 gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 7080 caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 7140 aggtctatat aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg 7200 aaattaatac gactcactat agggagaccc aagcttggta ce 7242
11/11 1/13
Figure imgf000059_0001
Figure 1
2/13
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000060_0002
Figure 2 3/13
Figure imgf000061_0001
T GST 0 10 30 1 10 400 900 Gβγ concentration (nM)
Figure imgf000061_0002
Gβγ concentration (nM)
Figure 3
4/13
Figure imgf000062_0001
tz- ta J
Figure imgf000062_0002
5/13
Figure imgf000063_0001
(•n-B) Λ-jisiiθjiπ
Figure imgf000063_0002
Figure imgf000063_0003
H PΉ
Ratio F585/F525
Figure imgf000064_0001
7/13
Figure imgf000065_0001
Gβγ HI Gβγ
Figure 7 8/13
pcDNA3-Cavβ3-I-II2.1 (SEQ ID NO: 5)
1 ATGGATGACG ACTCCTACGT GCCCGGGTTT GAGGACTCGG AGGCGGGTTC 51 AGCCGACTCC TACACCAGCC GCCCCTCTCT GGACTCAGAC GTTTCCCTGG 101 AGGAGGACCG GGAGAGTGCC CGGCGAGAAG TGGAGAGTCA GGCTCAGCAG 151 CAGCTGGAAA GAGCCAAGCA CAAACCTGTG GCATTTGCTG TGAGGACCAA 201 TGTCAGCTAC TGTGGAGTTC TGGATGAGGA ATGCCCAGTC CAGGGCTCTG 251 GAGTCAACTT CGAGGCCAAA GATTTTCTGC ACATTAAAGA GAAGTACAGC 301 AATGACTGGT GGATCGGGAG GCTAGTGAAA GAAGGTGGCG ATATTGCCTT 351 CATCCCCAGC CCCCAACGCC TGGAGAGCAT CCGGCTCAAA CAGGAACAGA 401 AGGCCAGGAG ATCCGGGAAC CCTTCCAGCC TGAGTGACAT TGGCAACCGA 451 CGTTCCCCTC CTCCATCTCT AGCCAAGCAG AAGCAAAAGC AGGCGGAACA 501 TGTCCCCCCG TATGATGTGG TGCCCTCCAT GCGGCCTGTG GTGCTGGTGG 551 GACCCTCTCT GAAAGGTTAT GAGGTCACAG ACATGATGCA GAAGGCTCTC 601 TTCGACTTCC TTAAACACAG GTTTGATGGC AGGATCTCCA TCACCCGCGT 651 CACGGCTGAC CTCTCACTGG CCAAGCGCTC TGTGCTCAAC AATCCTGGCA 701 AGAGGACCAT CATCGAGCGC TCTTCTGCCC GCTCCAGCAT TGCTGAGGTG 751 CAGAGTGAGA TTGAGCGCAT ATTCGAGCTG GCCAAATCCC TGCAGCTAGT 801 GGTGTTGGAT GCTGACACCA TCAACCACCC AGCACAGCTA GCCAAGACCT 851 CACTGGCCCC CATCATCGTC TTCGTCAAAG TGTCCTCGCC AAAGGTACTG 901 CAGCGACTGA TCCGCTCCAG GGGGAAGTCC CAGATGAAGC ACCTCACTGT 951 ACAGATGATG GCATATGATA AGCTGGTTCA GTGCCCACCT GAGTCATTTG 1001 ATGTGATTCT GGATGAGAAC CAGCTGGACG ACGCCTGTGA GCACCTAGCT 1051 GAATACCTAG AGGTTTACTG GCGCGCTACC CACCACCCAG CACCGGGCCC 1101 CGGGATGCTG GGTCCGCCCA GTGCCATCCC TGGACTTCAG AACCAGCAGC 1151 TGCTGGGGGA GCGAGGTGAG GAGCATTCAC CCCTGGAGCG GGACAGTTTG 1201 ATGCCCTCGG ATGAGGCCAG TGAGAGCTCC CGCCAGGCCT GGACCGGATC 1251 TTCACAGCGC AGCTCCCGCC ATCTGGAGGA GGACTATGCA GATGCCTACC 1301 AGGACCTGTA CCAGCCTCAC CGTCAACACA CCTCGGGGCT ACCCAGTGCT 1351 AACGGGCATG ACCCCCAAGA CCGGCTCCTA GCCCAGGACT CGGAGCATGA 1401 CCACAATGAC CGGAACTGGC AGCGTAACCG GCCTTGGCCT AAGGACAGCT 1451 ACGAATTCGC CAAAGAAAGG GAGCGGGTGG AGAACCGGCG CGCATTCCTG 1501 AAGCTGCGGC GGCAGCAGCA GATTGAACGC GAGCTCAACG GGTACATGGA 1551 GTGGATCTCA AAAGCAGAAG AGGTGATCCT CGCAGAGGAC GAGACCGACG 1601 TGGAGCAGAG ACATCCCTTT GATGGAGCTC TGCGGAGAGC CACTATCAAG 1651 AAGAGCAAGA CGGACCTGCT CCACCCAGAG GAGGCGGAGG ATCAGCTGGC 1701 CGACATCGCC TCCGTGGGGT CTCCCTTTGC CCGAGCCAGC ATTAAAAGTG 1751 CCAAGCTGGA GAACTCGAGT TTTTTCCACA AAAAAGAGAG GAGAATGCGT 1801 TTCTACATCC GTCGCATGGT CAAAACTCAG TAAGAATTCT GCAGATATCC 1851 ATCACACTGG CGGCCGCTCG AGCATGCATC TAGAGGGCCC TATTCTATAG 1901 TGTCACCTAA ATGCTAGAGC TCGCTGATCA GCCTCGACTG TGCCTTCTAG 1951 TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG 2001 AAGGTGCCAC TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG 2051 CATTGTCTGA GTAGGTGTCA TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA 2101 CAGCAAGGGG GAGGATTGGG AAGACAATAG CAGGCATGCT GGGGATGCGG 2151 TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG GCGGAAAGAA CCAGCTGGGG CTCTAGGGGG 2201 TATCCCCACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT 2251 TACGCGCAGC GTGACCGCTA CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT 2301 TCGCTTTCTT CCCTTCCTTT CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA 2351 GCTCTAAATC GGGGCATCCC TTTAGGGTTC CGATTTAGTG CTTTACGGCA 2401 CCTCGACCCC AAAAAACTTG ATTAGGGTGA TGGTTCACGT AGTGGGCCAT 2451 CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC CACGTTCTTT 2501 AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGT 2551 CTATTCTTTT GATTTATAAG GGATTTTGGG GATTTCGGCC TATTGGTTAA 2601 AAAATGAGCT GATTTAACAA AAATTTAACG CGAATTAATT CTGTGGAATG 2651 TGTGTCAGTT AGGGTGTGGA AAGTCCCCAG GCTCCCCAGG CAGGCAGAAG 2701 TATGCAAAGC ATGCATCTCA ATTAGTCAGC AACCAGGTGT GGAAAGTCCC
Figure 8a 9/ 13
2751 CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATGCATCT CAATTAGTCA 2801 GCAACCATAG TCCCGCCCCT AACTCCGCCC ATCCCGCCCC TAACTCCGCC 2851 CAGTTCCGCC CATTCTCCGC CCCATGGCTG ACTAATTTTT TTTATTTATG 2901 CAGAGGCCGA GGCCGCCTCT GCCTCTGAGC TATTCCAGAA GTAGTGAGGA 2951 GGCTTTTTTG GAGGCCTAGG CTTTTGCAAA AAGCTCCCGG GAGCTTGTAT 3001 ATCCATTTTC GGATCTGATC AAGAGACAGG ATGAGGATCG TTTCGCATGA 3051 TTGAACAAGA TGGATTGCAC GCAGGTTCTC CGGCCGCTTG GGTGGAGAGG 3101 CTATTCGGCT ATGACTGGGC ACAACAGACA ATCGGCTGCT CTGATGCCGC 3151 CGTGTTCCGG CTGTCAGCGC AGGGGCGCCC GGTTCTTTTT GTCAAGACCG 3201 ACCTGTCCGG TGCCCTGAAT GAACTGCAGG ACGAGGCAGC GCGGCTATCG 3251 TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTGCGCA GCTGTGCTCG ACGTTGTCAC 3301 TGAAGCGGGA AGGGACTGGC TGCTATTGGG CGAAGTGCCG GGGCAGGATC 3351 TCCTGTCATC TCACCTTGCT CCTGCCGAGA AAGTATCCAT CATGGCTGAT 3401 GCAATGCGGC GGCTGCATAC GCTTGATCCG GCTACCTGCC CATTCGACCA 3451 CCAAGCGAAA CATCGCATCG AGCGAGCACG TACTCGGATG GAAGCCGGTC 3501 TTGTCGATCA GGATGATCTG GACGAAGAGC ATCAGGGGCT CGCGCCAGCC 3551 GAACTGTTCG CCAGGCTCAA GGCGCGCATG CCCGACGGCG AGGATCTCGT 3601 CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG GAAAATGGCC 3651 GCTTTTCTGG ATTCATCGAC TGTGGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCTAT 3701 CAGGACATAG CGTTGGCTAC CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA 3751 ATGGGCTGAC CGCTTCCTCG TGCTTTACGG TATCGCCGCT CCCGATTCGC 3801 AGCGCATCGC CTTCTATCGC CTTCTTGACG AGTTCTTCTG AGCGGGACTC 3851 TGGGGTTCGA AATGACCGAC CAAGCGACGC CCAACCTGCC ATCACGAGAT 3901 TTCGATTCCA CCGCCGCCTT CTATGAAAGG TTGGGCTTCG GAATCGTTTT 3951 CCGGGACGCC GGCTGGATGA TCCTCCAGCG CGGGGATCTC ATGCTGGAGT 4001 TCTTCGCCCA CCCCAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG TTACAAATAA 4051 AGCAATAGCA TCACAAATTT CACAAATAAA GCATTTTTTT CACTGCATTC 4101 TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGTATAC 4151 CGTCGACCTC TAGCTAGAGC TTGGCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT 4201 GTGTGAAATT GTTATCCGCT CACAATTCCA CACAACATAC GAGCCGGAAG 4251 CATAAAGTGT AAAGCCTGGG GTGCCTAATG AGTGAGCTAA CTCACATTAA 4301 TTGCGTTGCG CTCACTGCCC GCTTTCCAGT CGGGAAACCT GTCGTGCCAG 4351 CTGCATTAAT GAATCGGCCA ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT TGCGTATTGG 4401 GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC GCTGCGCTCG GTCGTTCGGC 4451 TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG GTTATCCACA 4501 GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG GCCAGCAAAA 4551 GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC 4601 GCCCCCCTGA CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA 4651 AACCCGACAG GACTATAAAG ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT 4701 CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT TACCGGATAC CTGTCCGCCT 4751 TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC AATGCTCACG CTGTAGGTAT 4801 CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG TGCACGAACC 4851 CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT 4901 CCAACCCGGT AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC 4951 AGGATTAGCA GAGCGAGGTA TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG 5001 GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGGAC AGTATTTGGT ATCTGCGCTC 5051 TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC TTGATCCGGC 5101 AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA AGCAGCAGAT 5151 TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG 5201 GGTCTGACGC TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG 5251 AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG 5301 TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA AACTTGGTCT GACAGTTACC 5351 AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT ATTTCGTTCA 5401 TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG 5451 CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC 5501 CGGCTCCAGA TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC
Figure 8b 10/13
5551 AGAAGTGGTC CTGCAACTTT ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG 5601 CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT TAATAGTTTG CGCAACGTTG 5651 TTGCCATTGC TACAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT TGGTATGGCT 5701 TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT 5751 GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA 5801 GTAAGTTGGC CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT 5851 TCTCTTACTG TCATGCCATC CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA 5901 CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT GCGGCGACCG AGTTGCTCTT 5951 GCCCGGCGTC AATACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG AACTTTAAAA 6001 GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT 6051 ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT 6101 CTTCAGCATC TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA 6151 AGGCAAAATG CCGCAAAAAA GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT 6201 ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG AAGCATTTAT CAGGGTTATT 6251 GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA TAAACAAATA 6301 GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGACG TCGACGGATC 6351 GGGAGATCTC CCGATCCCCT ATGGTCGACT CTCAGTACAA TCTGCTCTGA 6401 TGCCGCATAG TTAAGCCAGT ATCTGCTCCC TGCTTGTGTG TTGGAGGTCG 6451 CTGAGTAGTG CGCGAGCAAA ATTTAAGCTA CAACAAGGCA AGGCTTGACC 6501 GACAATTGCA TGAAGAATCT GCTTAGGGTT AGGCGTTTTG CGCTGCTTCG 6551 CGATGTACGG GCCAGATATA CGCGTTGACA TTGATTATTG ACTAGTTATT 6601 AATAGTAATC AATTACGGGG TCATTAGTTC ATAGCCCATA TATGGAGTTC 6651 CGCGTTACAT AACTTACGGT AAATGGCCCG CCTGGCTGAC CGCCCAACGA 6701 CCCCCGCCCA TTGACGTCAA TAATGACGTA TGTTCCCATA GTAACGCCAA 6751 TAGGGACTTT CCATTGACGT CAATGGGTGG ACTATTTACG GTAAACTGCC 6801 CACTTGGCAG TACATCAAGT GTATCATATG CCAAGTACGC CCCCTATTGA 6851 CGTCAATGAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCA TTATGCCCAG TACATGACCT 6901 TATGGGACTT TCCTACTTGG CAGTACATCT ACGTATTAGT CATCGCTATT 6951 ACCATGGTGA TGCGGTTTTG GCAGTACATC AATGGGCGTG GATAGCGGTT 7001 TGACTCACGG GGATTTCCAA GTCTCCACCC CATTGACGTC AATGGGAGTT 7051 TGTTTTGGCA CCAAAATCAA CGGGACTTTC CAAAATGTCG TAACAACTCC 7101 GCCCCATTGA CGCAAATGGG CGGTAGGCGT GTACGGTGGG AGGTCTATAT 7151 AAGCAGAGCT CTCTGGCTAA CTAGAGAACC CACTGCTTAC TGGCTTATCG 7201 AAATTAATAC GACTCACTAT AGGGAGACCC AAGCTTGGTA CC
Figure 8c 11/13 pCHIC (SEQ ID NO: 10)
1 ATGCTGTGCT GTATGAGAAG AACCAAACAG GTTGAAAAGA ATGATGAGGA 51 CCAAAAGATC ATGGTGAGCA AGGGCGAGGA GCTGTTCACC GGGGTGGTGC 101 CCATCCTGGT CGAGCTGGAC GGCGACGTAA ACGGCCACAA GTTCAGCGTG 151 TCCGGCGAGG GCGAGGGCGA TGCCACCTAC GGCAAGCTGA CCCTGAAGTT 201 CATCTGCACC ACCGGCAAGC TGCCCGTGCC CTGGCCCACC CTCGTGACCA 251 CCTTCGGCTA CGGCCTGCAG TGCTTCGCCC GCTACCCCGA CCACATGAAG 301 CAGCACGACT TCTTCAAGTC CGCCATGCCC GAAGGCTACG TCCAGGAGCG 351 CACCATCTTC TTCAAGGACG ACGGCAACTA CAAGACCCGC GCCGAGGTGA 401 AGTTCGAGGG CGACACCCTG GTGAACCGCA TCGAGCTGAA GGGCATCGAC 451 TTCAAGGAGG ACGGCAACAT CCTGGGGCAC AAGCTGGAGT ACAACTACAA 501 CAGCCACAAC GTCTATATCA TGGCCGACAA GCAGAAGAAC GGCATCAAGG 551 TGAACTTCAA GATCCGCCAC AACATCGAGG ACGGCAGCGT GCAGCTCGCC 601 GACCACTACC AGCAGAACAC CCCCATCGGC GACGGCCCCG TGCTGCTGCC 651 CGACAACCAC TACCTGAGCT ACCAGTCCGC CCTGAGCAAA GACCCCAACG
701 AGAAGCGCGA TCACATGGTC CTGCTGGAGT TCGTGACCGC CGCCGGGATC 751 ACTCTCGGCA TGGACGAGCT GTACGCGATC GCATCTCTAG CCAAGCAGAA
801 GCAAAAGCAG GCGGAACATG TCCCCCCGTA TGATGTGGTG CCCTCCATGC 851 GGCCTGTGGT GCTGGTGGGA CCCTCTCTGA AAGGTTATGA GGTCACAGAC 901 ATGATGCAGA AGGCTCTCTT CGACTTCCTT AAACACAGGT TTGATGGCAG 951 GATCTCCATC ACCCGCGTCA CGGCTGACCT CTCACTGGCC AAGCGCTCTG
1001 TGCTCAACAA TCCTGGCAAG AGGACCATCA TCGAGCGCTC TTCTGCCCGC 1051 TCCAGCATTG CTGAGGTGCA GAGTGAGATT GAGCGCATAT TCGAGCTGGC 1101 CAAATCCCTG CAGCTAGTGG TGTTGGATGC TGACACCATC AACCACCCAG 1151 CACAGCTAGC CAAGACCTCA CTGGCCCCCA TCATCGTCTT CGTCAAAGTG 1201 TCCTCGCCAA AGGTACTGCA GCGACTGATC CGCTCCAGGG GGAAGTCCCA 1251 GATGAAGCAC CTCACTGTAC AGATGATGGC ATATGATAAG CTGGTTCAGT 1301 GCCCACCTGA GTCATTTGAT GTGATTCTGG ATGAGAACCA GCTGGACGAC 1351 GCCTGTGAGC ACCTAGCTGA ATACCTAGAG GTTTACTGGC GCGCTACCCA 1401 CCACCCAGCA CCGGGCCCCG GGATGCTGGG TCCGCCCAGT GCCATCCCTG 1451 GACTTCAGAA CCAGCAGCTG CTGGGGGAGC GAGGTGAGGA GCATTCACCC 1501 CTGGAGCGGG ACAGTTTGAT GCCCTCGGAT GAGGCCAGTG AGAGCTCCCG 1551 CCAGGCCTGG ACCGGATCTT CACAGCGCAG CTCCCGCCAT CTGGAGGAGG 1601 ACTATGCAGA TGCCTACCAG GACCTGTACC AGCCTCACCG TCAACACACC 1651 TCGGGGCTAC CCAGTGCTAA CGGGCATGAC CCCCAAGACC GGCTCCTAGC 1701 CCAGGACTCG GAGCATGACC ACAATGACCG GAACTGGCAG CGTAACCGGC 1751 CTTGGCCTAA GGACAGCTAC GAATTCGCCA AAGAAAGGGA GCGGGTGGAG 1801 AACCGGCGCG CATTCCTGAA GCTGCGGCGG CAGCAGCAGA TTGAACGCGA 1851 GCTCAACGGG TACATGGAGT GGATCTCAAA AGCAGAAGAG GTGATCCTCG 1901 CAGAGGACGA GACCGACGTG GAGCAGAGAC ATCCCTTTGA TGGAGCTCTG 1951 CGGAGAGCCA CTATCAAGAA GAGCAAGACG GACCTGCTCC ACCCAGAGGA 2001 GGCGGAGGAT CAGCTGGCCG ACATCGCCTC CGTGGGGTCT CCCTTTGCCC 2051 GAGCCAGCAT TAAAAGTGCC AAGCTGGAGA ACTCGAGTTT TTTCCACAAA 2101 AAAGAGAGGA GAATGCGTTT CTACATCCGT CGCATGGTCA AAACTCAGAC 2151 TAGTATGGTG AGCAAGGGCG AGGAGCTGTT CACCGGGGTG GTGCCCATCC 2201 TGGTCGAGCT GGACGGCGAC GTAAACGGCC ACAGGTTCAG CGTGTCCGGC 2251 GAGGGCGAGG GCGATGCCAC CTACGGCAAG CTGACCCTGA AGTTCATCTG 2301 CACCACCGGC AAGCTGCCCG TGCCCTGGCC CACCCTCGTG ACCACCCTGA 2351 CCTGGGGCGT GCAGTGCTTC AGCCGCTACC CCGACCACAT GAAGCAGCAC 2401 GACTTCTTCA AGTCCGCCAT GCCCGAAGGC TACGTCCAGG AGCGCACCAT 2451 CTTCTTCAAG GACGACGGCA ACTACAAGAC CCGCGCCGAG GTGAAGTTCG 2501 AGGGCGACAC CCTGGTGAAC CGCATCGAGC TGAAGGGCAT CGACTTCAAG 2551 GAGGACGGCA ACATCCTGGG GCACAAGCTG GAGTACAACT ATATCAGCCA 2601 CAACGTCTAT ATCACCGCCG ACAAGCAGAA GAACGGCATC AAGGCCAACT 2651 TCAAGATCCG CCACAACATC GAGGACGGCA GCGTGCAGCT CGCCGACCAC 2701 TACCAGCAGA ACACCCCCAT CGGCGACGGC CCCGTGCTGC TGCCCGACAA
Figure 9a 12/13
2751 CCACTACCTG AGCACCCAGT CCGCCCTGAG CAAAGACCCC AAGGAGAAGC
2801 GCGATCACAT GGTCCTGCTG GAGTTCGTGA CCGCCGCCGG GATCACTCTC
2851 GGCAGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA
2901 GCATCACAAA TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT
2951 GGTTTGTCCA AACTCATCAA TGTATCTTAA GGCGTAAATT GTAAGCGTTA
3001 ATATTTTGTT AAAATTCGCG TTAAATTTTT GTTAAATCAG CTCATTTTTT
3051 AACCAATAGG CCGAAATCGG CAAAATCCCT T TAAATCAA AAGAATAGAC
3101 CGAGATAGGG TTGAGTGTTG TTCCAGTTTG GAACAAGAGT CCACTATTAA
3151 AGAACGTGGA CTCCAACGTC AAAGGGCGAA AAACCGTCTA TCAGGGCGAT
3201 GGCCCACTAC GTGAACCATC ACCCTAATCA AGTTTTTTGG GGTCGAGGTG
3251 CCGTAAAGCA CTAAATCGGA ACCCTAAAGG GAGCCCCCGA TTTAGAGCTT
3301 GACGGGGAAA GCCGGCGAAC GTGGCGAGAA AGGAAGGGAA GAAAGCGAAA
3351 GGAGCGGGCG CTAGGGCGCT GGCAAGTGTA GCGGTCACGC TGCGCGTAAC
3401 CACCACACCC GCCGCGCTTA ATGCGCCGCT ACAGGGCGCG TCAGGTGGCA
3451 CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA
3501 CATTCAAATA'TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA
3551 ATAATATTGA AAAAGGAAGA GTCCTGAGGC GGAAAGAACC AGCTGTGGAA
3601 TGTGTGTCAG TTAGGGTGTG GAAAGTCCCC AGGCTCCCCA GCAGGCAGAA
3651 GTATGCAAAG CATGCATCTC AATTAGTCAG CAACCAGGTG TGGAAAGTCC
3701 CCAGGCTCCC CAGCAGGCAG AAGTATGCAA AGCATGCATC TCAATTAGTC
3751 AGCAACCATA GTCCCGCCCC TAACTCCGCC CATCCCGCCC CTAACTCCGC
3801 CCAGTTCCGC CCATTCTCCG CCCCATGGCT GACTAATTTT TTTTATTTAT
3851 GCAGAGGCCG AGGCCGCCTC GGCCTCTGAG CTATTCCAGA AGTAGTGAGG
3901 AGGCTTTTTT GGAGGCCTAG GCTTTTGCAA AGATCGATCA AGAGACAGGA
3951 TGAGGATCGT TTCGCATGAT TGAACAAGAT GGATTGCACG CAGGTTCTCC
4001 GGCCGCTTGG GTGGAGAGGC TATTCGGCTA TGACTGGGCA CAACAGACAA
4051 TCGGCTGCTC TGATGCCGCC GTGTTCCGGC TGTCAGCGCA GGGGCGCCCG
4101 GTTCTTTTTG TCAAGACCGA CCTGTCCGGT GCCCTGAATG AACTGCAAGA
4151 CGAGGCAGCG CGGCTATCGT GGCTGGCCAC GACGGGCGTT CCTTGCGCAG
4201 CTGTGCTCGA CGTTGTCACT GAAGCGGGAA GGGACTGGCT GCTATTGGGC
4251 GAAGTGCCGG GGCAGGATCT CCTGTCATCT CACCTTGCTC CTGCCGAGAA
4301 AGTATCCATC ATGGCTGATG CAATGCGGCG GCTGCATACG CTTGATCCGG
4351 CTACCTGCCC ATTCGACCAC CAAGCGAAAC ATCGCATCGA GCGAGCACGT
4401 ACTCGGATGG AAGCCGGTCT TGTCGATCAG GATGATCTGG ACGAAGAGCA
4451 TCAGGGGCTC GCGCCAGCCG AACTGTTCGC CAGGCTCAAG GCGAGCATGC
4501 CCGACGGCGA GGATCTCGTC GTGACCCATG GCGATGCCTG CTTGCCGAAT
4551 ATCATGGTGG AAAATGGCCG CTTTTCTGGA TTCATCGACT GTGGCCGGCT
4601 GGGTGTGGCG GACCGCTATC AGGACATAGC GTTGGCTACC CGTGATATTG
4651 CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGCTGACC GCTTCCTCGT GCTTTACGGT
4701 ATCGCCGCTC CCGATTCGCA GCGCATCGCC TTCTATCGCC TTCTTGACGA
4751 GTTCTTCTGA GCGGGACTCT GGGGTTCGAA ATGACCGACC AAGCGACGCC
4801 CAACCTGCCA TCACGAGATT TCGATTCCAC CGCCGCCTTC TATGAAAGGT
4851 TGGGCTTCGG AATCGTTTTC CGGGACGCCG GCTGGATGAT CCTCCAGCGC
4901 GGGGATCTCA TGCTGGAGTT CTTCGCCCAC CCTAGGGGGA GGCTAACTGA
4951 AACACGGAAG GAGACAATAC CGGAAGGAAC CCGCGCTATG ACGGCAATAA
5001 AAAGACAGAA TAAAACGCAC GGTGTTGGGT CGTTTGTTCA TAAACGCGGG 5051 GTTCGGTCCC AGGGCTGGCA CTCTGTCGAT ACCCCACCGA GACCCCATTG 5101 GGGCCAATAC GCCCGGGTTT CTTCCTTTTC CCCACCCCAC CCCCCAAGTT 5151 CGGGTGAAGG CCCAGGGCTC GCAGCCAACG TCGGGGCGGC AGGCCCTGCC 5201 ATAGCCTCAG GTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA AACTTCATTT 5251 TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA 5301 AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA 5351 AAGATCAAAG GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG 5401 CTTGCAAACA AAAAAACCAC CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC 5451 AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG 5501 ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC ACCACTTCAA
Figure 9b 13/13
5551 GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG
5601 TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA
5651 CGATAGTTAC CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG
5701 CACACAGCCC AGCTTGGAGC GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC
5751 AGCGTGAGCT ATGAGAAAGC GCCACGCTTC CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC 5801 AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT
5851 TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC
5901 TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA
5951 TGGAAAAACG CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG
6001 GCCTTTTGCT CACATGTTCT TTCCTGCGTT ATCCCCTGAT TCTGTGGATA
6051 ACCGTATTAC CGCCATGCAT TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC
6101 ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA
6151 ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA
6201 ATGACGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA
6251 ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT
6301 ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC
6351 GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA TGGGACTTTC CTACTTGGCA
6401 GTACATCTAC GTATTAGTCA TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC
6451 AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT
6501 CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG
6551 GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG
6601 GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG GTCTATATAA GCAGAGCTGG TTTAGTGAAC
6651 CGTCAGATCC GCTAGCGCTA CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA
6701 ATTCTGCAGT CGACGGTACC GCGGGCCCGG GATCCACCGG TCGCCACC
Figure 9c SEQUENCE LISTING
<110> Commissariat à l'Energie Atomique
Institut National de la santé et de la Recherche Médicale
DE WAARD, Michel DUPUIS, Alain GRUNWALD, Didier SANDOZ, Guillaume
<120> Protéine chimérique pour le criblage d'agonistes et d'antagonistes des voies de signalisation cellulaire dépendantes des récepteurs couplés aux protéines G
<130> 263PCT87
<160> 10
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> amorce
<400> 1 tttggtacca tggatgacga ctcctacgtg cccgggtttg aggactcgga ggcgggtt 58
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> amorce
Page 1 <400> 2 gcggaattcg tagctgtcct taggccaagg ccggttacgc tgccagtt 48
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> amorce
<400> 3 ggggaattcg ccaaagaaag ggagcgggtg gagaac 36
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> amorce
<400> 4 tttgaattct tactgagttt tgaccatgcg acggatgtag aaacgcattc t 51
<210> 5
<211> 7242
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> plasmide recombinant
<400> 5 atggatgacg actcctacgt gcccgggttt gaggactcgg aggcgggttc agccgactcc 60 tacaccagcc gcccctctct ggactcagac gtttccctgg aggaggaccg ggagagtgcc 120 cggcgagaag tggagagtca ggctcagcag cagctggaaa gagccaagca caaacctgtg 180 gcatttgctg tgaggaccaa tgtcagctac tgtggagttc tggatgagga atgcccagtc 240 cagggctctg gagtcaactt cgaggccaaa gattttctgc acattaaaga gaagtacagc 300 aatgactggt ggatcgggag gctagtgaaa gaaggtggcg atattgcctt catccccagc 360 ccccaacgcc tggagagcat ccggctcaaa caggaacaga aggccaggag atccgggaac 420
Page 2 ccttccagcc tgagtgacat tggcaaccga cgttcccctc ctccatctct agccaagcag 480 aagcaaaagc aggcggaaca tgtccccccg tatgatgtgg tgccctccat gcggcctgtg 540 gtgctggtgg gaccctctct gaaaggttat gaggtcacag acatgatgca gaaggctctc 600 ttcgacttcc ttaaacacag gtttgatggc aggatctcca tcacccgcgt cacggctgac 660 ctctcactgg ccaagcgctc tgtgctcaac aatcctggca agaggaccat catcgagcgc 720 tcttctgccc gctccagcat tgctgaggtg cagagtgaga ttgagcgcat attcgagctg 780 gccaaatccc tgcagctagt ggtgttggat gctgacacca tcaaccaccc agcacagcta 840 gccaagacct cactggcccc catcatcgtc ttcgtcaaag tgtcctcgcc aaaggtactg 900 cagcgactga tccgctccag ggggaagtcc cagatgaagc acctcactgt acagatgatg 960 gcatatgata agctggttca gtgcccacct gagtcatttg atgtgattct ggatgagaac 1020 cagctggacg acgcctgtga gcacctagct gaatacctag aggtttactg gcgcgctacc 1080 caccacccag caccgggccc cgggatgctg ggtccgccca gtgccatccc tggacttcag 1140 aaccagcagc tgctggggga gcgaggtgag gagcattcac ccctggagcg ggacagtttg 1200 atgccctcgg atgaggccag tgagagctcc cgccaggcct ggaccggatc ttcacagcgc 1260 agctcccgcc atctggagga ggactatgca gatgcctacc aggacctgta ccagcctcac 1320 cgtcaacaca cctcggggct acccagtgct aacgggcatg acccccaaga ccggctccta 1380 gcccaggact cggagcatga ccacaatgac cggaactggc agcgtaaccg gccttggcct 1440 aaggacagct acgaattcgc caaagaaagg gagcgggtgg agaaccggcg cgcattcctg 1500 aagctgcggc ggcagcagca gattgaacgc gagctcaacg ggtacatgga gtggatctca 1560 aaagcagaag aggtgatcct cgcagaggac gagaccgacg tggagcagag acatcccttt 1620 gatggagctc tgcggagagc cactatcaag aagagcaaga cggacctgct ccacccagag 1680 gaggcggagg atcagctggc cgacatcgcc tccgtggggt ctccctttgc ccgagccagc 1740 attaaaagtg ccaagctgga gaactcgagt tttttccaca aaaaagagag gagaatgcgt 1800 ttctacatcc gtcgcatggt caaaactcag taagaattct gcagatatcc atcacactgg 1860 cggccgctcg agcatgcatc tagagggccc tattctatag tgtcacctaa atgctagagc 1920 tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 1980 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 2040 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 2100 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 2160 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag 2220 cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 2280 cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 2340 tccccgtcaa gctctaaatc ggggcatccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 2400 cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 2460 Page 3 gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 2520 aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttggg 2580 gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt 2640 ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagg caggcagaag 2700 tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc 2760 agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct 2820 aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 2880 actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa 2940 gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat 3000 atccattttc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 3060 tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 3120 acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 3180 ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 3240 gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 3300 tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 3360 tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 3420 gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 3480 tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 3540 cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 3600 cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 3660 attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 3720 ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 3780 tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 3840 agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat 3900 ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc 3960 ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg 4020 tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 4080 gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 4140 gtctgtatac cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 4200 gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 4260 aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 4320 gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 4380 agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 4440 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 4500 Page 4 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 4560 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 4620 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 4680 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 4740 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 4800 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 4860 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 4920 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 4980 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 5040 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 5100 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 5160 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 5220 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 5280 cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 5340 gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 5400 tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 5460 ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 5520 ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 5580 atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 5640 cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 5700 tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 5760 aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 5820 tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 5880 ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 5940 agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 6000 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 6060 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 6120 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 6180 gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 6240 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 6300 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgacggatc gggagatctc 6360 ccgatcccct atggtcgact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt 6420 atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg cgcgagcaaa atttaagcta 6480 caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct gcttagggtt aggcgttttg 6540 Page 5 cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt 6600 aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 6660 aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 6720 taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 6780 actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 6840 cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgaect 6900 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 6960 tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 7020 gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 7080 caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 7140 aggtctatat aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg 7200 aaattaatac gactcactat agggagaccc aagcttggta ce 7242
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> artifi ci al séquence
<220>
<223> amorce
<400> 6 agccgtacgc gategeatet ctagccaagc agaagcaaa 39
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> amorce
<400> 7 cccgttaacc ccactagtct gagttttgac catgcgacgg at 42
<210> 8 <211> 33 <212> DNA
Page 6 <213> artifi cial séquence
<220>
<223> amorce
<400> 8 gggactagta tggtgagcaa gggcgaggag ctg 33
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> amorce
<400> 9 cccgttaact gccgagagtg atcccggcgg cggt 34
<210> 10
<211> 7242
<212> DNA
<213> artificial séquence
<220>
<223> plasmide recombinant
<400> 10 atggatgacg actcctacgt gcccgggttt gaggactcgg aggcgggttc agccgactcc 60 tacaccagcc gcccctctct ggactcagac gtttccctgg aggaggaccg ggagagtgcc 120 cggcgagaag tggagagtca ggctcagcag cagctggaaa gagccaagca caaacctgtg 180 gcatttgctg tgaggaccaa tgtcagctac tgtggagttc tggatgagga atgcccagtc 240 cagggctctg gagtcaactt cgaggccaaa gattttctgc acattaaaga gaagtacagc 300 aatgactggt ggatcgggag gctagtgaaa gaaggtggcg atattgcctt catccccagc 360 ccccaacgcc tggagagcat ccggctcaaa caggaacaga aggccaggag atccgggaac 420 ccttccagcc tgagtgacat tggcaaccga cgttcccctc ctccatctct agccaagcag 480 aagcaaaagc aggcggaaca tgtccccccg tatgatgtgg tgccctccat gcggcctgtg 540 gtgctggtgg gaccctctct gaaaggttat gaggtcacag acatgatgca gaaggctctc 600 ttcgacttcc ttaaacacag gtttgatggc aggatctcca tcacccgcgt cacggctgac 660 ctctcactgg ccaagcgctc tgtgctcaac aatcctggca agaggaccat catcgagcgc 720
Page 7 tcttctgccc gctccagcat tgctgaggtg cagagtgaga ttgagcgcat attcgagctg 780 gccaaatccc tgcagctagt ggtgttggat gctgacacca tcaaccaccc agcacagcta 840 gccaagacct cactggcccc catcatcgtc ttcgtcaaag tgtcctcgcc aaaggtactg 900 cagcgactga tccgctccag ggggaagtcc cagatgaagc acctcactgt acagatgatg 960 gcatatgata agctggttca gtgcccacct gagtcatttg atgtgattct ggatgagaac 1020 cagctggacg acgcctgtga gcacctagct gaatacctag aggtttactg gcgcgctacc 1080 caccacccag caccgggccc cgggatgctg ggtccgccca gtgccatccc tggacttcag 1140 aaccagcagc tgctggggga gcgaggtgag gagcattcac ccctggagcg ggacagtttg 1200 atgccctcgg atgaggccag tgagagctcc cgccaggcct ggaccggatc ttcacagcgc 1260 agctcccgcc atctggagga ggactatgca gatgcctacc aggacctgta ccagcctcac 1320 cgtcaacaca cctcggggct acccagtgct aacgggcatg acccccaaga ccggctccta 1380 gcccaggact cggagcatga ccacaatgac cggaactggc agcgtaaccg gccttggcct 1440 aaggacagct acgaattcgc caaagaaagg gagcgggtgg agaaccggcg cgcattcctg 1500 aagctgcggc ggcagcagca gattgaacgc gagctcaacg ggtacatgga gtggatctca 1560 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