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WO2004058789A9 - 糖鎖アスパラギン誘導体およびその製造方法 - Google Patents

糖鎖アスパラギン誘導体およびその製造方法

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Publication number
WO2004058789A9
WO2004058789A9 PCT/JP2003/016682 JP0316682W WO2004058789A9 WO 2004058789 A9 WO2004058789 A9 WO 2004058789A9 JP 0316682 W JP0316682 W JP 0316682W WO 2004058789 A9 WO2004058789 A9 WO 2004058789A9
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WO
WIPO (PCT)
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asparagine
man
4glcnac
compound
sugar chain
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2003/016682
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French (fr)
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WO2004058789A1 (ja
Inventor
Yasuhiro Kajihara
Kazuaki Kakehi
Kazuhiro Fukae
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Chemical Co Ltd
Original Assignee
Otsuka Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Otsuka Chemical Co Ltd filed Critical Otsuka Chemical Co Ltd
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Priority to JP2004562935A priority patent/JP4495598B2/ja
Priority to EP03768216A priority patent/EP1577316A4/en
Priority to CA002511205A priority patent/CA2511205C/en
Priority to US10/540,619 priority patent/US20060166929A1/en
Priority to AU2003292792A priority patent/AU2003292792A1/en
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    • B01D15/3804—Affinity chromatography
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Definitions

  • the present invention relates to a biotinylated sugar chain asparagine, a fluorescein isothiocyanate (FITC) -linked sugar chain asparagine, a method for producing the same, and uses thereof.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • sugar chains have attracted attention as a third chain biomolecule following nucleic acids (DNA) and proteins.
  • DNA nucleic acids
  • the human body is a large cell society consisting of about 60 trillion cells, and all cell surfaces are covered with sugar chain molecules.
  • the ABO blood group is determined by differences in sugar chains on the cell surface.
  • Sugar chains are extremely complex structures compared to nucleic acid and protein structures due to their diversity, such as the sequence, binding mode, site, chain length, branching mode, and overall higher-order structure of monosaccharides. Therefore, the biological information derived from its structure is more diverse than nucleic acids and proteins. Despite the recognition of the importance of research on sugar chains, the progress of research is slower than that of nucleic acids and proteins due to the complexity and diversity of their structures.
  • a sugar chain microchip can be easily manufactured simply by reacting a plurality of biotinylated sugar chains on an avidinized microplate. This makes it possible to elucidate proteins having a specific sugar chain-binding ability.
  • a specific avidinized affinity column is bound and immobilized on an avidinated affinity column, and it has specific binding ability to the biotinylated sugar chain. By passing the mixture containing the protein, only the target protein can be isolated.
  • asparagine-linked oligosaccharides that have been converted to FITC can be isolated even in a small amount by capillaries-electrophoresis. Further, the FITC can be removed therefrom to isolate the glycan asparagine itself.
  • An object of the present invention is to provide a sugar chain asparagine in which amino group nitrogen of asparagine is biotinylated or FITC, a method for producing the same, and a use thereof. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to the following inventions.
  • R 1 and R 2 are a hydrogen atom or a group represented by any one of formulas (2) to (6), and may be the same or different.
  • Q represents a biotin group or a FITC group.
  • a method for producing a biotinylated asparagine-linked sugar chain comprising the step of biotinylation of a sugar chain asparagine having 11 to 3 sugars represented by the formula (9).
  • a method for producing asparagine, a F ITC-modified sugar chain comprising converting asparagine having 11 to 3 sugars represented by 3 ⁇ 4 (9) into fluorescein isothiosinate (FITC).
  • FITC fluorescein isothiosinate
  • the method of this earlier application is, for example,
  • a method for producing a sugar chain asparagine derivative derived from sugar chain asparagine A method for producing a sugar chain asparagine derivative derived from sugar chain asparagine,
  • a method for producing asparagine sugar chain comprising:
  • step (b ') a step of hydrolyzing the asparagine derivative isolated in step (b) using a sugar hydrolase, and or
  • Step (10) Step (a) Force An F moc group is introduced into the asparagine sugar chain contained in a mixture containing one or more asparagine sugar chains having a sialic acid residue at the non-reducing end, and the sialic acid residue is introduced.
  • the method for producing the asparagine derivative of the sugar chain of the prior application is, for example, a method for producing a natural sugar chain.
  • Asparagine derived from a protein preferably a mixture of asparagine derivatives obtained by introducing (binding) a lipophilic protecting group to the asparagine contained in a mixture of asparagine obtained from an asparagine-linked glycan.
  • asparagine sugar chain refers to a sugar chain to which asparagine is bound.
  • asparagine-linked sugar chain refers to a group of sugar chains in which the N-acetyl darcosamine present at the reducing end is linked to the N-glycosidic acid of the asparagine (A sn) in a protein polypeptide.
  • M an (/ 3 1 — 4), G 1 c N ac (/ 3 1 — 4)
  • sugar chain asparagine derivative refers to a sugar chain asparagine in which a fat-soluble protecting group is bonded to an asparagine residue.
  • a c HN represents an acetoamide group.
  • a sugar chain derived from a natural glycoprotein is a mixture of sugar chains in which sugar residues at non-reducing terminals are randomly deleted.
  • the present inventors surprisingly introduced a fat-soluble protecting group into a sugar chain derived from a natural glycoprotein, specifically, the sugar chain asparagine contained in a mixture of sugar chains asparagine, whereby It has been found that a mixture of asparagine derivatives having a protective group introduced therein can be easily separated into individual asparagine derivatives using a known chromatography technique. As a result, it has become possible to prepare large amounts of asparagine-linked sugar chains having various structures.
  • sugar chain asparagine derivatives having similar structures, which were conventionally difficult to separate, and each of these compounds can be prepared easily and in large quantities.
  • various sugar chain asparagine derivatives can be synthesized based on the obtained sugar chain asparagine derivative, for example, by successively acting a sugar hydrolase to remove sugar residues.
  • Asparagine-linked oligosaccharide derivatives Asparagine-linked oligosaccharide derivatives, asparagine-linked oligosaccharides, and sugar chains obtained in the above-mentioned prior application were all ⁇ 2,6-conjugated.
  • sugar chain asparagine derivative the sugar chain asparagine, and the sugar chain obtained in the above-mentioned prior application were all sugar chain asparagine derivatives to which fucose was not bound.
  • the 2,3 conjugate and the ⁇ 2,6 conjugate represent the binding mode between sialic acid and galactose.
  • the former refers to an ⁇ -bond between the carbon at position 2 of sialic acid and the carbon at position 3 of galactose
  • the latter refers to the carbon at position 2 of sialic acid and the carbon at position 6 of galactose. It refers to those that are ⁇ '-bonded. These are the differences in the bonding carbon with galactose.
  • asparagine (9-saccharide-A sn-F moc) protected with a fat-soluble protecting group as a starting compound is converted to sialic acid or a sialic acid derivative using a sialyltransferase.
  • the obtained asparagine protected with a lipophilic protecting group is separated by subjecting it to chromatography, and the asparagine derivative of dicia mouth protected with a lipophilic protecting group and two monosialosaccharides are separated.
  • a chain asparagine derivative is obtained.
  • the obtained 9 to 7 sugar chain asparagine derivative having sialic acid or a sialic acid derivative is obtained by subjecting the obtained disia mouth sugar chain asparagine derivative and two kinds of monosial sugar chain asparagine derivative to sugar hydrolysis.
  • the above-obtained 11 to 7 asparagine sugar chain derivative and asparagine disia mouth sugar chain (2,6-11 saccharide-A sn-Fmoc) are used as starting materials to obtain a sugar hydrolyzate.
  • fucose to the obtained 10-6 sugar chain asparagine derivative using a glycosyltransferase a 13-7 sugar chain asparagine derivative containing fucose can be obtained.
  • the protective group is not particularly limited, and examples thereof include, for example, a carbonate-based compound such as 1110 (group ⁇ 1: —butyloxycarbonyl (Boc) group, benzyl group, aryl group, aryloxy group, ponyl group, and acetyl group). Or an amide-based protecting group, etc.
  • the protecting group may be an Fmoc group or a Boc group. And the like, and more preferably an Fmoc group.
  • the Fmoc group is particularly effective when a sugar that is unstable under relatively acidic conditions such as sialic acid is present in the sugar chain.
  • the method may be performed according to a method (for example, see Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0-47 6230 6).
  • an Fmoc group when used, an appropriate amount of acetone is added to asparagine sugar chain, and then 9-fluorenylmethyl-N-succinimidelcarbonate and sodium hydrogen carbonate are added and dissolved.
  • the F mo c group By carrying out the binding reaction of the Fmo c group to the asparagine residue, the F mo c group can be introduced into the asparagine residue of the asparagine in the sugar chain.
  • sialic acid commercially available sialic acid or chemically synthesized sialic acid can be used.
  • sialic acid derivative a commercially available sialic acid derivative or a chemically synthesized one can be used. Specifically, 7th and 8th positions of sialic acid Alternatively, examples thereof include those in which a hydroxyl group bonded to the carbon at position 9 is substituted with a hydrogen atom or a halogen atom. Examples of the halogen atom include fluorine, chlorine, and bromine, but fluorine is preferred.
  • sialyltransferase commercially available ones, naturally-occurring ones, and ones produced by gene recombination can be used, and are appropriately determined depending on the type of sialic acid or sialic acid derivative to be transferred. You can choose. Specific examples include those derived from the Rat2,3 transferase, which is RatRecombinant, and those derived from the ⁇ 2,6 transferase, RatLiVer. Alternatively, sialic acid or a sialic acid derivative may be transferred by shifting the equilibrium by pH adjustment or the like using sialic enzyme.
  • the above-mentioned asparagine-linked oligosaccharide derivative can be separated by chromatography, if necessary, by using known chromatography alone or in combination.
  • the resulting mixture of asparagine-linked oligosaccharides is purified by gel filtration column chromatography, and then purified by HPLC.
  • a reversed phase column is suitable as a column usable in HPLC.
  • ODS, Phenyl 1 type, nitrile type, or anion exchange type columns specifically, for example, Monomer manufactured by Pharmacia Co., Ltd. Q columns and beads columns manufactured by Jaato Kun can be used. Separation conditions and the like may be appropriately adjusted with reference to known conditions.
  • each desired sugar chain asparagine derivative can be obtained from the mixture of sugar chain asparagine derivatives.
  • a sugar chain asparagine derivative having a desired sugar chain structure can be efficiently obtained by hydrolyzing the sugar chain asparagine derivative separated above.
  • the type of the glycan asparagine derivative contained in the mixture is limited to roughly separate the glycan asparagine derivative, and then the hydrolysis is performed, for example, using a hydrolytic enzyme such as a sugar hydrolase.
  • a hydrolytic enzyme such as a sugar hydrolase.
  • the hydrolysis can be performed in the same manner as described above.
  • the compound to be hydrolyzed is dissolved in a buffer solution (for example, a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a good buffer solution, or the like), and galactose hydrolase is used under known conditions.
  • a buffer solution for example, a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a good buffer solution, or the like
  • galactose hydrolase is used under known conditions.
  • the compounds to be hydrolyzed may each be isolated or a mixture.
  • a commercially available known exo-type enzyme is preferably used.
  • a newly isolated enzyme or an enzyme created by genetic engineering may be used.
  • the reaction solution obtained after the reaction may be subjected to chromatography to obtain each sugar chain asparagine derivative.
  • Removal of the N-acetyl darcosamine residue is accomplished by dissolving the compound to be hydrolyzed in a buffer solution (for example, a phosphate buffer solution, an acetate buffer solution, a good buffer solution, and the like), and following a known condition. It can be achieved by performing a cleavage reaction of N-acetyldarcosamine residues using dalcosamine hydrolase. Also, N-acetylhexosaminidase hydrolase may be used.
  • the compounds to be hydrolyzed may each be isolated or a mixture. It is preferable to use a commercially available exo-type enzyme for each enzyme used in this reaction.
  • a newly isolated enzyme or an enzyme created by genetic engineering may be used as long as it has the same activity.
  • the reaction solution obtained after the reaction (a mixture of asparagine derivatives in which sugar residues have been cleaved) is subjected to chromatography, and each sugar chain is subjected to chromatography.
  • Asparagine derivative may be obtained.
  • the compound to be hydrolyzed is dissolved in a buffer solution (for example, phosphate buffer solution, acetate buffer solution, good buffer solution, etc.), and the mannose residue is removed using mannose hydrolase according to known conditions. This can be achieved by performing a cleavage reaction.
  • the compounds to be hydrolyzed may each be isolated or a mixture.
  • a commercially available exo-type enzyme is preferably used.
  • a newly isolated enzyme or an enzyme created by genetic engineering may be used.
  • the reaction solution obtained after the reaction may be subjected to chromatography to obtain each sugar chain asparagine derivative.
  • separation is performed by HPLC (ODS column, developing solvent is a buffer solution such as ammonium acetate of about 10 to 20 OmM and acetonitrile, or ethanol or methanol or oil such as butanol or propanol).
  • fucose is transferred to the non-reducing end of asparagine in which the amino group nitrogen of asparagine is protected by the lipophilic protecting group of the present invention. It is possible to produce a novel asparagine sugar chain derivative containing at least one or more fucose in N-acetyldarcosamine on the side.
  • fucose commercially available fucose or chemically synthesized fucose can be used.
  • fucose transferase commercially available ones, naturally occurring ones, and ones produced by gene recombination can be used, and can be appropriately selected depending on the type of fucose to be transferred. Specifically, it is an enzyme that transfers fucose to ⁇ -acetyldarcosamine on the non-reducing terminal side of the asparagine glycan
  • Fucosyl trans ferase V Human, Recombinant, from plasma, from serum, from milk, from liver
  • fucose may be transferred by shifting the equilibrium by pH adjustment or the like using fucose hydrolase.
  • the resulting mixture of asparagine-linked oligosaccharides is purified by gel filtration ram chromatography, and then purified by HPLC.
  • a reversed phase column is suitable as a column usable in HPLC.
  • ⁇ DS, Phenyl 1 type, nitrile type column or anion exchange type column specifically, for example, Pharmacia Co., Ltd.
  • Mono Q columns manufactured by Jatron and beads columns manufactured by Jatron are available. Separation conditions and the like may be appropriately adjusted with reference to known conditions.
  • the derivative is further hydrolyzed using various sugar hydrolases and the like to remove saccharide residues at the non-reducing terminal of the glycan, thereby obtaining, for example, saccharides.
  • various asparagine-derived sugar chain derivatives having heterogeneous branched structures at the chain ends can be obtained as single compounds. Further, by using various sugar hydrolyzing enzymes and changing the order of hydrolysis and the type of hydrolysis, it is possible to produce more types of asparagine-linked sugar chain derivatives.
  • the present invention is a sugar chain asparagine in which the amino group nitrogen of the sugar chain asparagine is biotinylated or FITC-converted.
  • biotinylated sugar chain asparagine of the present invention examples include compounds represented by the following formula.
  • R 1 and R 2 are ⁇ or a group represented by formulas (2) to (6), and may be the same or different. ]
  • Examples of the FITC-modified sugar chain asparagine of the present invention include a compound represented by the following formula.
  • the present invention is a method for producing a biotinylated or FITC-modified sugar chain asparagine in which the amino group nitrogen of the sugar chain asparagine is biotinylated or converted to FITC.
  • the method can be obtained by subjecting the amino group nitrogen of asparagine of the various isolated sugar chain asparagine described above to biotinylation or FITC conversion. Can be.
  • Examples of the asparagine sugar chain used in the present invention include a compound represented by the formula (7).
  • asparagine sugar chains include the compounds described in the prior application. That is, the ⁇ 2,6 compounds shown in FIGS. 3 to 4 of the prior application can be used in the same manner, and these encoded compounds are shown in Tables 1 to 3 of the present invention.
  • examples of the derivative of asparagine-linked oligosaccharide used for synthesizing the above-mentioned asparagine-linked oligosaccharide include the 2,6 compounds described in the prior application. That is, the compounds shown in FIGS. 1 and 2 of the prior application can be used in the same manner, and these encoded compounds are shown in Tables 4 to 6 of the present invention.
  • asparagine glycan described in the above-mentioned prior application asparagine having an ⁇ 2,3 conjugate, asparagine having an ( ⁇ 2,3) (2,6) conjugate, and furthermore, Asparagine sugar chain of these fucose conjugates can be used.
  • the biotinylation of the present invention can be performed according to a known method. For example, dissolve asparagine glycan in water, add sodium bicarbonate, add dimethylformamide in which D-(+)-piochelsuccinimide is dissolved, react at room temperature for 20 minutes, and purify with a gel filtration column. Asparagine, a biotinylated sugar chain can be obtained.
  • the microplate to which the biotinylated sugar chain asparagine of the present invention is bound can be produced by reacting the biotinylated sugar plate asparagine with a commercially available avidinized microplate (for example, Pierce).
  • affinity column to which the biotinylated sugar chain asparagine of the present invention is bound can be produced by reacting the biotinylated sugar chain asparagine with a commercially available avidinized affinity column. .
  • FITC of the present invention can be performed according to a known method. For example, dissolve asparagine glycan in water, add acetone and sodium bicarbonate, add fluorescein isothiocynate, react at room temperature for 2 hours, purify with gel filtration gel, etc., and convert to FITC Asparagine sugar chain can be obtained.
  • the FITC-linked asparagine obtained by the present invention is useful, for example, for studying the receptor for saccharides in living tissues, and for studying the sugar-binding specificity of lectins.
  • the present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • the iH-NMR data was obtained by setting the HOD to 4.8 ppm at 30 ° C for Examples 1 to 7 and Reference Example 45 and the internal standard at 30 ° C for Reference Examples 1 to 44. The value was obtained by measuring the signal of the methyl group of acetone as 2.225 ppm and the HOD as 4.718 ppm. The compound from which the Fmoc group had been removed was measured in the presence of 5 OmM ammonium bicarbonate in the measurement solvent.
  • Tris-HCl Calcium Chloride Buffer Solution Tris-HCl Calcium Chloride Buffer Solution (TRIZMA BASE 0.05 mo 1 Z1, chlorination ratio 0.01 mo 11 pH 7.5) was dissolved in 100 ml. This sodium azide 58mg (7 72 ⁇ mo 1) and Akuchinaze E (Kaken Co.) 526 mg was added and allowed to stand at 37 D C. After 65 hours, 2'63 mg of actinase-E was added again, and the mixture was further allowed to stand at 37 ° C for 24 hours.
  • Tris-HCl Calcium Chloride Buffer Solution Tris-HCl Calcium Chloride Buffer Solution
  • the physical data of the obtained sugar chain mixture is as follows.
  • Ne uAc sialic acid
  • Gal D—galactose
  • Glc NAc N—cetyldarcosamine
  • Man D—mannose As n: asparagine
  • the reaction solution was lyophilized, and then HP LC (YMC Packed Column D— ⁇ DS—5 S-5 12 0 A OD SN 0.20 2 0 1 7 8, 20 ⁇ 25 mm
  • the physical properties of the obtained compound are as follows.
  • Dissolve Compound 20 (12 mg, 7. nmo Y) and 1 .-- 0--m--g of serum albumin in HEPE S buffer solution (5 OmM, pH 5.0, 330 / L), and add —Galactosidase (Seomikagaku Co., Ltd., from Jack B an s, 12 L, 297 mU) was added. After the solution was allowed to stand at 37 ° C for 46 hours, completion of the reaction was confirmed by HPLC analysis. The reaction solution was converted to HP LC (YMC Packed Co 1 umn D— ODS-5S-5 120 A ODS No.
  • developing solvent was 50 mM ammonium acetate aqueous solution: acetonitrile At 80:20 and at a flow rate of 4 mLZmin). After desalting with an ODS column (Cosmo Seal 75 C18-OPN, 15 x 100 mm. First, 5 OmL of H 2 ⁇ was flowed and then eluted with 25% acetonitrile), and the desired compound 7 was obtained. 1 (6.6 mg, 61% yield) was obtained. The physical properties of the obtained compound are as follows. '
  • the Fmoc group was deprotected by the following procedure for all the asparagine derivatives of the sugar chains.
  • the mixture was cooled with ice water.
  • getyl ether 10 times the volume of the reaction solution and stirring for 15 minutes the deposited precipitate was separated by filtration. The obtained residue was dissolved in water and evaporated at 35 ° C.
  • the compound 10 (10.5 mg, 5.3 / ⁇ mo 1) was reacted for 7 hours by the above operation to obtain the desired compound 33 (7 mg, yield 76%).
  • the obtained compound was confirmed by 1 H-NMR that was consistent with the standard.
  • the compound 9 (7.7 mg, 4.4 no 1) was reacted for 23 hours by the above operation, and the desired compound 32 (5.2 mg, yield 78%) was obtained.
  • the physical properties of the obtained compound are as follows.
  • the compound 15 (5. lmg, 3.2 amo 1) was reacted for 11 hours by the above operation to obtain the desired compound 38 (4. Omg, yield: 91 ° /.). .
  • the physical properties of the obtained compound are as follows.
  • the compound 70 (4. Omg, 2.8 mo 1) was reacted for 13 hours by the above operation to obtain the target compound 72 (2.9 mg, yield 85%). Physical data of the obtained compound are as follows.
  • the compound 20 (5.4 mg, 3.3 mo 1) was reacted for 11 hours by the above operation to obtain the target compound 43 (4.1 mg, yield 87%).
  • Physical data of the obtained compound are as follows.
  • the compound 71 (4.Omg, 2.8 z ⁇ mo 1) was reacted for 13 hours by the above operation, and the desired compound 73 (2.9 mg, yield 85%) was obtained. .
  • the physical properties of the obtained compound are as follows.
  • the compound 17 (1.5 mg, 1.2 mo 1) was reacted for 14 hours by the above operation to obtain the desired compound 40 (1.1 mg, yield 89%).
  • Physical data of the obtained compound are as follows.
  • the compound 23 (1.6 mg, 1.5 mo 1) was reacted for 14 hours by the above operation, and the target compound 46 (1. lmg, 6.4 / 2 mo 1, yield 85%) was obtained. Obtained. Physical data of the obtained compound are as follows.
  • the compound 12 (12. Omg, 8.4 ⁇ mo 1) was reacted for 11 hours by the above-mentioned operation to obtain the desired compound 35 (7. Omg, yield 81?).
  • Physical data of the obtained compound are as follows.
  • a mixture of Compound 2 and Compound 6 (5.0 mg, 2.2 mol) was dissolved in water, and 100 L of a 22 mM cesium carbonate aqueous solution was added to adjust the pH to 7.0. This solution was lyophilized. To the solid after drying, 430 N, N-dimethylformamide was added, and further, 20 L of 6.6 ⁇ 1 benzylbutamide, / ⁇ , ⁇ -dimethylformamide solution was added. This solution was stirred under an argon atmosphere.
  • Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the compound 77 obtained in Reference Example 45 was used.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 33 obtained in Reference Example 7 was used.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1, except that the compound 26 obtained in Reference Example 24 was used.
  • the biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the compound 27 obtained in Reference Example 25 was used.
  • Example 2 Example 1 except that the compound was used ⁇ 2 ⁇ use ⁇ ! Tft? 3 ⁇ 4 "conversion.
  • Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the compound 30 obtained in Reference Example 27 was used.
  • Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the compound 31 obtained in Reference Example 28 was used.
  • the biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 37 obtained in Reference Example 30 was used.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 42 obtained in Reference Example 31 was used.
  • the biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 38 obtained in Reference Example 32 was used.
  • Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the compound 43 obtained in Reference Example 34 was used.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 39 obtained in Reference Example 36 was used.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 40 obtained in Reference Example 37 was used.
  • Example 19 Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the compound 41 obtained in Reference Example 38 was used.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 44 obtained in Reference Example 39 was used.
  • Piotin-dori was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 45 obtained in Reference Example 40 was used.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 46 obtained in Reference Example 41 was used.
  • Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the compound 34 obtained in Reference Example 42 was used.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the compound 36 obtained in Reference Example 44 was used.
  • Example 26 Disia-mouth ⁇ 2,3 sugar chain asparagine (C1-1) in which the amino group nitrogen of asparagine was protected by an Fmoc group and two monosialylamines in which the amino group nitrogen of asparagine was protected by an Fmoc group.
  • Asparagine and Asparagine Trisaccharides (C1-2 and C13-13)-Sialyltransferases to asparagine asparagine whose amino group nitrogen of asparagine is protected with the Fmoc group obtained in Reference Example 2 was used to transfer CMP-sialic acid.
  • sialyltransferase those derived from commercially available Rat and Recombinant which are 2,3 transferases were used.
  • Each of the obtained compounds (C-1) to (C-3) was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining asparagine sugar chain.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • Example 28 The compound (C 2) (1.8 mg, 0.86 zmol) obtained in Example 27 was added to a HEPES buffer solution (5 OmM, pH 5.0) together with 1 mg of bovine serum albumin.
  • the obtained compound (C3) was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining asparagine sugar chain.
  • Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • the residue was dissolved in water 200 1 ODS Karamukuro Mato chromatography; desalting process using (Cosmosil 75 C s - to perform - opn, first washed with water following Ide eluting with 25% Asetonitoriru solution) In this case, 0.6 / ig of the target compound (C4) was obtained.
  • the obtained compound (C4) was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group and obtain asparagine sugar chain. Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • the obtained compound (C5) was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining a sugar chain, athragine.
  • the biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the obtained asparagine sugar chain was used for J.
  • Compound (C 5) (l. Omg, 0.48 mol) obtained in Example 30 was converted into ⁇ HEPES buffer solution (50 mM, H5.0) was dissolved in 5 On 1 together with 1 mg of sera albumin, and N-acetyl-3 / 3-dalcosaminidase (Sigma Aldrich, from JackBeans) was added to the solution. 1 (250mU) added. The solution was allowed to stand at 37 ° C. for 22 hours, and then filtered with a membrane filter.
  • the obtained compound (C6) was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining asparagine sugar chain.
  • Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • the obtained compound (C7) was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining asparagine sugar chain.
  • Biotinylation was performed in the same manner as in Example 1 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • sialyltransferases those derived from commercially available Rat and Recombinant which are a few transferases were used.
  • the obtained compound (C 7 A) was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining asparagine sugar chain.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • the obtained compound (C 7 B) was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining asparagine sugar chain.
  • Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • Fucosyl transferase V Human, Recombinant
  • 20 mU of Fucosyl transferase V Human, Recombinant
  • Example 3 5 The obtained asparagine glycan derivative was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group to obtain asparagine glycan. Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1, except that the obtained asparagine sugar chain was used. The obtained biotinylated sugar chain asparagine is shown below.
  • Example 3 5 The obtained asparagine glycan derivative was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group to obtain asparagine glycan. Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1, except that the obtained asparagine sugar chain was used. The obtained biotinylated sugar chain asparagine is shown below.
  • Example 3 5 The obtained asparagine glycan derivative was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group to obtain asparagine glycan. Biotinylation was carried out in the same manner as in Example 1, except that the obtained as
  • Asparagine disia mouth sugar chain (compound 24) (11 sugars, 1.4 mg, 0.6 Ommo 1) was dissolved in 70 ml of purified water. Acetone 70m 1, N a HC0 3 ( 0. 76mg, 9mmo 1) was added to the ones, followed by stirring at room temperature,
  • FITC was carried out in the same manner as in Example 53, using Compound 76 instead of Compound 24.
  • FITC was carried out in the same manner as in Example 53, using Compound 30 instead of Compound 24.
  • FITC was performed in the same manner as in Example 53 using Compound 32 instead of Compound 24.
  • FITC was carried out in the same manner as in Example 53, using Compound 40 instead of Compound 24.
  • FITC was carried out in the same manner as in Example 53 using Compound 35 instead of Compound 24. Man a l-.
  • Example 26 Each of the compounds (C-11) to (C-13) obtained in Example 26 was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group to obtain asparagine sugar chain.
  • FITC conversion was performed in the same manner as in Example 53 except that the obtained sugar chain asparagine was used.
  • Example 27 Each compound of (C 2) obtained in Example 27 was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group to obtain asparagine sugar chain.
  • FITC conversion was carried out in the same manner as in Example 53 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • Example 28 Each compound of (C 3) obtained in Example 28 was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining asparagine sugar chain.
  • FITC conversion was carried out in the same manner as in Example 53 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used. / 3 l ⁇ HGlcNAc 3 l ⁇ GlcNAc + Asn- FITC
  • Example 29 Each compound of (C4) obtained in Example 29 was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group and obtain asparagine sugar chain.
  • FITC conversion was carried out in the same manner as in Example 53 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • Example 30 Each compound of (C5) obtained in Example 30 was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group and obtain asparagine sugar chain.
  • FITC conversion was carried out in the same manner as in Example 53 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • Example 31 Each compound of (C 6) obtained in Example 31 was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group and obtain asparagine sugar chain.
  • FITC conversion was carried out in the same manner as in Example 53 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • Example 32 Each compound of (C.7) obtained in Example 32 was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group to obtain asparagine sugar chain.
  • FITC conversion was carried out in the same manner as in Example 53 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • Example 33 Each compound of (C7A) obtained in Example 33 was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining asparagine sugar chain.
  • FITC was performed in the same manner as in Example 53 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.
  • Example 34 Each compound of (C 7 B) obtained in Example 34 was treated in the same manner as in Reference Example 7 to deprotect the Fmoc group, thereby obtaining asparagine sugar chain.
  • FITC was performed in the same manner as in Example 53 except that the obtained asparagine-linked sugar chain was used.

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Description

明 細 書 糖鎖ァスパラギン誘導体およびその製造方法 技術分野
本発明はピオチン化糖鎖ァスパラギン、フルォレセインイソチオシァネート（F I T C ) 化糖鎖ァスパラギン、 それらの製造方法及びその用途に関する。 背景技術
近年、 核酸 （D N A) 、 タンパク質に続く第三の鎖状生命分子として、 糖鎖分 子が注目されてきている。 ヒトの体は'、 約 6 0兆個の細胞から成っている一大細 胞社会であり、 全ての細胞表面は糖鎖分子によって覆われている。 例えば、 A B O式血液型は細胞表面の糖鎖の違いにより決定されている。
糖鎖は、 細胞間の認識や相互作用に関わる働きをもち、 細胞社会を成り立たせ る要となっている。 細胞社会の乱れは、 癌、 慢性疾患、 感染症、 老化などにつな がる。
例えば、細胞が癌化すると糖鎖の構造変化が起こることが分かっている。 また、 コレラ菌ゃィンフルェンザウィルスなどは、 ある特定の糖鎖を認識し結合するこ とにより、 細胞に侵入し感染することが知られている。
糖鎖は単糖の配列、 結合様式 ·部位、 鎖の長さ ·分岐様式、 全体の高次構造な どの多様性から、 核酸やタンパク質の構造と比べると非常に複雑な構造である。 従って、 その構造に由来する生物学的な情報は核酸やタンパク質に比べて多種多 様である。 糖鎖は、 研究の重要性を認識されながらも、 その構造の複雑さや多様 性により、 核酸やタンパク質に比べて研究の推進が遅れている状況にある。
上述のようにある特定の糖鎖とタンパク質とが認識し結合能を有しているかを 解明することにより、 新しい原理に基づく医薬品や食品の開発などをもたらし、 病気の予防、 治療に貢献するなど、 幅広い応用が期待されている。
そこで、 ピオチン ·アビジンの結合特異性を利用し、 ピオチン化した複数の糖 鎖をアビジン化されたマイクロプレート上で反応させるだけで簡単に糖鎖マイク 口チップを製造することができる。 これにより、 特定の糖鎖と結合能を有する夕 ンパク質を解明することができる。
また、 ある特定のタンパク質を分離精製する目的で、 アビジン化したァフィ二 ティ一カラムに特定のピオチン化した糖鎖を結合し固定化し、 そこに、 ピオチン 化した糖鎖と特異的結合能を有するタンパク質を含む混合物を通すことにより目 的とするタンパク質のみを単離することができる。
また F I T C化した糖鎖ァスパラギンは、 キヤビラリ一電気泳動法等により微 量であっても単離することができる。 更にそれから F I T Cをはずして糖鎖ァス パラギン自身を単離することもできる。
本発明の課題は、 ァスパラギンのアミノ基窒素をピオチン化又は F I T C化し た糖鎖ァスパラギン、 その製造方法及びその用途を提供することにある。 発明の開示
本発明は、 下記の発明に係る。
1 . 下記式 （1 ) で表される 1 1〜3糖を有する糖鎖ァスパラギン誘導体。
Figure imgf000004_0001
〔式中、 R 1および R 2は、 水素原子、 式 （2 ) 〜 （6 ) で示される基であり、 同 一でも異なっていてもよい。 Qはピオチン基又は F I T C基を示す。 〕 
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
Figure imgf000005_0004
2. ピオチン基又は F I TC基でァスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖鎖 ァスパラギンの非還元末端側の N—ァセチルダルコサミンに少なくとも 1個以上 のフコースを含む糖鎖ァスパラギン誘導体。
3. 式 （9) で表される 1 1〜3糖を有する糖鎖ァスパラギンをピオチン化する ことを特徴とするピオチン化糖鎖ァスパラギンの製造方法。
Figure imgf000006_0001
〔式中、 R1および R2は上記に同じ。 〕
4. ¾ (9) で表される 1 1〜3糖を有する糖鎖ァスパラギンをフルォレセイン イソチオシァネート （F I TC) 化することを特徴とする F I TC化糖鎖ァスパ ラギンの製造方法。
5. 上記のピオチン化糖鎖ァスパラギンを結合させたマイクロプレー卜。
6. 上記のピオチン化糖鎖ァスパラギンを結合させたァフィ二ティ一カラム。 本発明者は、 先に特願 2001— 185685号 （以下、 先願という） におい て、 種々の単離された糖鎖ァスパラギン誘導体を従来に比べて非常に容易かつ大 量に得ることができる、 糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギン、 糖鎖の製 造方法、 更には糖残基が任意に欠失した糖鎖が結合した新規な糖鎖ァスパラギン 誘導体、 糖鎖ァスパラギン、 糖鎖を開発した。
この先願の方法は例えば
(1) (a) 1種もしくは 2種以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物に含まれ る該糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖ァスパラギン誘導体混合 物を得る工程、
ならびに ( b ) 該糖鎖ァスパラギン誘導体混合物または該糖鎖ァスパラギン誘導体混合物 に含まれる糖鎖ァスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグ ラフィ一に供して各糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する工程、
を含む、 糖鎖ァスパラギン由来の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法、
(2) (b' ) 工程 （b) で分離された糖鎖ァスパラギン誘導体を糖加水分解 酵素を用いて加水分解する工程をさらに含む前記 （1) 記載の糖鎖ァスパラギン 誘導体の製造方法、
(3) 1種もしくは 2種以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物が、 下記式（A) の化合物および Zまたは該化合物において 1以上の糖残基が欠失した化合物を含 むものである、 前記 （1) または （2) 記載の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方 法、
(4) 脂溶性の保護基がフルォレニルメトキシカルボニル （Fmo c) 基であ る前記 （1) 〜 （3) いずれか記載の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法、
(5) 工程 （a) 力 非還元末端にシアル酸残基を有する 1種もしくは 2種以 上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖ァスパラギンに Fmo c基 を導入し、 かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖ァスパラギン誘導体混 合物を得る工程である、 前記 （1) 〜 （3) いずれか記載の糖鎖ァスパラギン誘 導体の製造方法、
(6) (a) 1種もしくは 2種以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物に含まれ る該糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入して糖鎖ァスパラギン誘導体混合 物を得る工程、
( b ) 該糖鎖ァスパラギン誘導体混合物または該糖鎖ァスパラギン誘導体混合物 に含まれる糖鎖ァスパラギン誘導体を加水分解して得られる混合物をクロマトグ ラフィ一に供して各糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する工程、 ならびに
(c) 工程 （b) で分離された糖鎖ァスパラギン誘導体の保護基を除去して糖鎖 ァスパラギンを得る工程、 を含む、 糖鎖ァスパラギンの製造方法、
(7) (b' ) 工程 （b) で分離された糖鎖ァスパラギン誘導体を糖加水分解 酵素を用いて加水分解する工程、 および または
(c ' ) 工程 （c) で得られた糖鎖ァスパラギンを糖加水分解酵素を用いて加水 分解する工程、
をさらに含む、 前記 （6) 記載の糖鎖ァスパラギンの製造方法、
(8) 1種もしくは 2種以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物が、 下記式（A) の化合物および/または該化合物において 1以上の糖残基が欠失した化合物を含 むものである、 前記 （6) または （7) 記載の糖鎖ァスパラギンの製造方法、
(9) 脂溶性の保護基が Fmo c基である前記 （6) 〜 （8) いずれか記載の 糖鎖ァスパラギンの製造方法、
(10) 工程 （a) 力 非還元末端にシアル酸残基を有する 1種もしくは 2種 以上の糖鎖ァスパラギンを含む混合物に含まれる該糖鎖ァスパラギンに F m o c 基を導入し、 かつシアル酸残基にベンジル基を導入して糖鎖ァスパラギン誘導体 混合物を得る工程である、 前記 （6) 〜 （8) いずれか記載の糖鎖ァスパラギン の製造方法などである。
Figure imgf000008_0001
これら糖鎖ァスパラギン誘導体及び糖鎖ァスパラギンの製造についての詳細は、 上記先願に述べられているので、 これを引用する。 しかし若干先願の内容につい て述べると、 先願の糖鎖ァスパラギン誘導体の製造方法は、 たとえば、 天然の糖 タンパク質に由来する糖鎖ァスパラギン、 好ましくはァスパラギン結合型糖鎖か ら得られる糖鎖ァスパラギンの混合物に含まれる当該糖鎖ァスパラギンに脂溶性 の保護基を導入 （結合） して糖鎖ァスパラギン誘導体の混合物を得た後に当該混 合物を各糖鎖ァスパラギン誘導体に分離することを 1つの大きな特徴とする。 な お、 本明細書において、 「糖鎖ァスパラギン」 とはァスパラギンが結合した状態 の糖鎖をいう。 また、 「ァスパラギン結合型糖鎖」 とはタンパク質のポリべプチ ド中のァスパラギン （A s n ) の酸ァミノ基に、 還元末端に存在する N _ァセチ ルダルコサミンが N—グリコシド結合した糖鎖群であって、 M a n ( /3 1 — 4 ) ， G 1 c N a c ( /3 1— 4 ) G 1 c N a cを母核とする糖鎖群をいう。 「糖鎖ァス パラギン誘導体」 とはァスパラギン残基に脂溶性の保護基が結合した状態の糖鎖 ァスパラギンをいう。 また、 化合物の構造式中、 「A c H N」 はァセトアミド基 を示す。
前記するように、 天然の糖タンパク質に由来する糖鎖は非還元末端の糖残基が ランダムに欠失した糖鎖の混合物である。 本発明者らは、 意外にも天然の糖タン パク質に由来する糖鎖、 具体的には糖鎖ァスパラギンの混合物に含まれる当該糖 鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入することで、 当該保護基が導入された糖 鎖ァスパラギン誘導体の混合物を公知のクロマトグラフィーの手法を用いて容易 に個々の糖鎖ァスパラギン誘導体に分離することができることを見出した。 それ により、 種々の構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体をそれぞれ大量に調製する ことが可能となった。 たとえば、 従来分離が困難であった類似構造の糖鎖ァスパ ラギン誘導体同士の分離が可能となり、 それらの化合物を各々、 容易かつ大量に 調製することができる。 また、 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体を元に、 たとえ ば、 糖加水分解酵素を順次作用させて糖残基を除去することにより、 さらに様々 な糖鎖ァスパラギン誘導体を合成することもできる。
このように、 糖鎖ァスパラギンに脂溶性の保護基を導入して誘導体化すること により個々の糖鎖ァスパラギン誘導体の分離が可能となったが、 これは、 脂溶性 の保護基を導入したことにより糖鎖ァスパラギン誘導体の全体の脂溶性が高まり、 たとえば、 好適に使用される逆相系カラムとの相互作用が格段に向上し、 その結 果、 より鋭敏に糖鎖構造の差を反映して個々の糖鎖ァスパラギン誘導体が分離さ れるようになったことによると考えられる。
さらに、 先願によれば、 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体の保護基を除去する ことにより種々の糖鎖ァスパラギンを、 人工的に容易かつ大量に得ることができ る。
上記先願で得られる糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギン及び糖鎖はい ずれも α 2 , 6結合体のものであった。
また、 上記先願で得られる糖鎖ァスパラギン誘導体、 糖鎖ァスパラギン及び糖 鎖はいずれもフコースが結合していない糖鎖ァスパラギン誘導体であった。
ここで、 α 2 , 3結合体とひ 2 , 6結合体の相異について以下に説明する。
ひ 2 , 3結合体、 α 2 , 6結合体とは、 シアル酸とガラクト一スとの結合様式を 表わすものである。 前者は、 シアル酸の 2位の炭素と、 ガラクトースの 3位の炭 素が α結合しているものをいい、 後者は、 シアル酸の 2位の炭素と、 ガラクト一 スの 6位の炭素が α'結合しているものをいう。 これらは、 ガラクト一スとの結合 炭素の違いではある。
本発明の方法においては先ず、 出発化合物である脂溶性の保護基で保護された 糖鎖ァスパラギン （9糖一 A s n— F m o c ) をシアル酸転移酵素を用いてシァ ル酸あるいはシアル酸の誘導体を転移させ、 得られた脂溶性の保護基で保護され た糖鎖ァスパラギンをクロマトグラフィーに供することにより分離し、 脂溶性の 保護基で保護されたジシァ口糖鎖ァスパラギン誘導体および 2種のモノシァロ糖 鎖ァスパラギン誘導体が得られる。
次いで、 得られたジシァ口糖鎖ァスパラギン誘導体および 2種のモノシァロ糖 鎖ァスパラギン誘導体を糖加水分解することにより、 シアル酸あるいはシアル酸 誘導体を有する 9〜 7糖鎖ァスパラギン誘導体が得られる。 また、 上記で得られた 1 1〜7糖鎖ァスパラギン誘導体やジシァ口糖鎖ァスパ ラギン（ 2, 6— 1 1糖一 A s n -Fmo c)を出発原料としそれを糖加水分解 することにより得られる 10〜 6糖鎖ァスパラギン誘導体に、 糖転移酵素により フコースを転移することによりフコースを含む 13〜 7糖鎖ァスパラギン誘導体 が得られる。
当該保護基としては特に限定されるものではなく、 例えば、 1110 (基ゃ 1:— ブチルォキシカルボニル （Bo c) 基、 ベンジル基、 ァリル基、 ァリルォキシ力 ルポニル基、 ァセチル基等の、 カーボネート系またはアミ ド系の保護基等を使用 することができる。 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体を直ちに所望の糖ペプチド の合成に使用できるという観点から、 当該保護基としては、 Fmo c基または B o c基などが好ましく、 Fmo c基がより好ましい。 Fmo c基はシアル酸等比 較的酸性条件に不安定な糖が糖鎖に存在する場合に特に有効である。 また、 保護 基の導入は公知の方法（たとえば、 Protecting groups in Organic chemistry, John Wiley & Sons INC., New York 1991, ISBN 0 - 47卜 6230卜 6を参照） に従って行え ばよい。
たとえば、 Fmo c基を用いる場合、 糖鎖ァスパラギンに対しアセトンを適量 加えた後、 さらに 9一フルォレニルメチルー N—スクシニミデルカーボネートと 炭酸水素ナトリウムを加えて溶解し、 25°Cにてァスパラギン残基への Fmo c 基の結合反応を行うことにより、 当該糖鎖ァスパラギンのァスパラギン残基に F mo c基を導入することができる。
以上の操作により、 脂溶性の保護基が導入された糖鎖ァスパラギン誘導体が得 られる。
シアル酸としては、 一般に市販されているシアル酸あるいは化学合成したもの を用いることができる。
シアル酸の誘導体としては、 一般に市販されているシアル酸の誘導体あるいは 化学合成したものを用いることができる。 具体的には、 シアル酸の 7位、 8位あ るいは 9位の炭素に結合している水酸基を水素原子あるいはハロゲン原子で置換 したものを挙げることができる。 ハロゲン原子としては、 フッ素、 塩素、 臭素等 を挙げることができるが、 好ましくはフッ素がよい。
シアル酸転移酵素としては、 一般に市販されているもの、 天然由来のもの、 遺 伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、 転移させるシアル酸ある いはシアル酸の誘導体の種類により適宜選択することができる。 具体的には、 α 2 , 3転移酵素である R a t R e c o m b i n a n t由来のもの、 α 2， 6転移 酵素である R a t L i V e r由来のものを挙げることができる。 また、 シァリ 夕一ゼをもちいて p H調整等により平衡をずらすことにより、 シアル酸あるいは シアル酸の誘導体を転移させてもよい。
上記糖鎖ァスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、 適宜、 公知 のクロマトグラフィーを単独でまたは複数組み合わせて用いることにより行うこ とができる。
たとえば、 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体混合物をゲル濾過カラムクロマト グラフィ一で精製後、 H P L Cを用いて精製する。 H P L Cにおいて用い得る力 ラムとしては逆相系のカラムが好適であり、 たとえば、 O D S、 P h e n y 1系、 二トリル系や、 陰イオン交換系のカラム、 具体的には、 たとえば、 フアルマシア 社製モノ Qカラム、ィャト口ン社製ィアト口ビーズカラムなどが利用可能である。 分離条件等は適宜、 公知の条件を参照して調整すればよい。 以上の操作により、 ' 糖鎖ァスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖ァスパラギン誘導体を得ること ができる。
次に、 上記で分離された糖鎖ァスパラギン誘導体を加水分解することにより、 所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を効率的に得ることができる。 たとえば、 糖鎖ァスパラギン誘導体を分離する段階においては混合物に含まれる 糖鎖ァスパラギン誘導体の種類を制限して糖鎖ァスパラギン誘導体を大まかに分 離し、 次いで加水分解、 たとえば、 糖加水分解酵素を用いて加水分解することに より所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を効率的に得ることができ る。 なお、 加水分解は前記と同様にして行うことができる。 特に、 所望の糖鎖構 造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体をより効率的に得る観点から、 糖残基の切断 様式が明確な糖加水分解酵素を用いて加水分解するのが好ましい。
たとえば、 ガラクトース残基の除去は、 加水分解される化合物を緩衝液 （たと えば、 リン酸緩衝溶液、 酢酸緩衝溶液、 グッド緩衝溶液など） に溶かし、 公知の 条件に従ってガラクト一ス加水分解酵素を用いてガラクトース残基の切断反応を 行うことにより成し得る。 なお、 加水分解される化合物は各々単離されたもので あっても混合物であってもよい。 この反応で用いるガラクトース加水分解酵素は 市販されている公知のェキソ型の酵素を利用するのが好ましい。 また、 同様の活 性を有するものであれば、 新たに単離された酵素、 遺伝子工学的に創製された酵 素であってもよい。 次いで、 前記と同様にして、 反応後に得られる反応液 （糖残 基が切断された糖鎖ァスパラギン誘導体の混合物）をクロマトグラフィーに供し、 各糖鎖ァスパラギン誘導体を得ればよい。 たとえば、 分離は H P L C (O D S力 ラム、 展開溶媒は 5 O mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリル = 8 2 ： 1 8 ) で行うのが好ましい。
N—ァセチルダルコサミン残基の除去は、 加水分解される化合物を緩衝液 （た とえば、 リン酸緩衝溶液、 酢酸緩衝溶液、 グッド緩衝溶液など） に溶かし、 公知 の条件に従って N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素を用いて N—ァセチルダ ルコサミン残基の切断反応を行うことにより成し得る。 また、 N—ァセチルへキ ソサミニダーゼ加水分解酵素を用いてもよい。なお、加水分解される化合物は各々 単離されたものであつても混合物であつてもよい。 この反応で用いる各酵素は巿 販されているェキソ型の酵素を利用するのが好ましい。 また、 同様の活性を有す るものであれば、 新たに単離された酵素、 遺伝子工学的に創製された酵素であつ てもよい。 次いで、 前記と同様にして、 反応後に得られる反応液 （糖残基が切断 された糖鎖ァスパラギン誘導体の混合物） をクロマトグラフィーに供し、 各糖鎖 ァスパラギン誘導体を得ればよい。 たとえば、 分離は HPLC (ODSカラム、 展開溶媒は 5 OmM酢酸アンモニゥム水溶液： メタノール =65 ： 35または 5 OmM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリル =82 : 18) で行うのが好ま しい。
マンノース残基の除去は、 加水分解される化合物を緩衝液 （たとえば、 リン酸 緩衝溶液、 酢酸緩衝溶液、 グッド緩衝溶液など） に溶かし、 公知の条件に従って マンノース加水分解酵素を用いてマンノース残基の切断反応を行うことにより成 し得る。 なお、 加水分解される化合物は各々単離されたものであっても混合物で あってもよい。 この反応で用いるマンノース加水分解酵素は市販されているェキ ソ型の酵素を利用するのが好ましい。 また、 同様の活性を有するものであれば、 新たに単離された酵素、遺伝子工学的に創製された酵素であってもよい。次いで、 前記と同様にして、 反応後に得られる反応液 （糖残基が切断された糖鎖ァスパラ ギン誘導体の混合物） をクロマトグラフィーに供し、 各糖鎖ァスパラギン誘導体 を得ればよい。 たとえば、 分離は HPLC (ODSカラム、 展開溶媒は、 1 0〜 20 OmM程度の酢酸アンモニゥムなどの緩衝溶液とァセ卜二卜リル、 あるいは エタノール、 あるいはメタノール、 あるいはブ夕ノール、 あるいはプロパノール などの脂溶性のある水溶性有機溶剤を適宜混ぜて用いることができる。 ここに例 示する場合、 展開溶媒としては 5 OmM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリ ル =82 ： 18が好適である） で行うのが好ましい。
このようにして得られた各糖鎖ァスパラギン誘導体を得た後、 フコースを転—移 させることにより本発明の脂溶性の保護基でァスパラギンのアミノ基窒素が保護 された糖鎖ァスパラギンの非還元末端側の N—ァセチルダルコサミンに少なくと も 1個以上のフコースを含む新規な糖鎖ァスパラギン誘導体を製造することがで さる。
フコースとしては、 一般に市販されているフコ一スあるいは化学合成したもの を用いることができる。 フコース転移酵素としては、 一般に市販されているもの、 天然由来のもの、 遺 伝子組換えにより生産されたものを用いることができ、 転移させるフコースの種 類により適宜選択することができる。 具体的には、 糖鎖ァスパラギンの非還元末 端側の Ν—ァセチルダルコサミンにフコースを転移させる酵素である
Fucosyl t rans ferase V (Human, Recombinan t , 血漿由来、 血清由来、 乳汁由来、 肝臓由来） などを挙げることができる。 また、 フコース加水分解酵素を用いて p H調整等により平衡ずらすことにより、 フコ一スを転移させてもよい。
上記糖鎖ァスパラギン誘導体のクロマトグラフィーによる分離は、 適宜、 公知 ί 3
のクロマトグラフィ一を単独でまたは複数組合せて用いることにより行うことが できる。
たとえば、 得られた糖鎖ァスパラギン誘導体混合物をゲル濾過力ラムクロマト グラフィ一で精製後、 H P L Cを用いて精製する。 H P L Cにおいて用い得る力 ラムとしては逆相系のカラムが好適であり、 たとえば、 〇D S、 P h e n y 1系、 二卜リル系や、 陰イオン交換系のカラム、 具体的には、 たとえば、 フアルマシア 社製モノ Qカラム、ィャトロン社製ィアト口ビーズカラムなどが利用可能である。 分離条件等は適宜、 公知の条件を参照して調整すればよい。 以上の操作により、 糖鎖ァスパラギン誘導体混合物から所望の各糖鎖ァスパラギン誘導体を得ること ができる。
このように、 各糖鎖ァスパラギン誘導体を得た後、 さらに各種糖加水分解酵素 等を用いて当該誘導体を加水分解し、 糖鎖の非還元末端の糖残基を除去すること により、 たとえば、 糖鎖の末端の分岐構造が不均一な様々な糖鎖ァスパラギン誘 導体をそれぞれ単一化合物として得ることができる。 また、 種々の糖加水分解酵 素を用い、 加水分解する順番やその種類を変えることで、 より多くの種類の糖鎖 ァスパラギン誘導体を製造することができる。
従来の方法によれば、 極限られた糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を 分析スケールで得るのにさえ膨大な時間とコス卜が必要であつたが、 本発明によ れば、 特別の装置や試薬を必要とすることなく、 慣用のゲルろ過カラム、 HPL Cカラムや、 少なくとも 3種類の糖加水分解酵素 （たとえば、 ガラクトース加水 分解酵素、 マンノース加水分解酵素、 N—ァセチルダルコサミン加水分解酵素） 等を使って、 2週間程度で所望の糖鎖構造を有する糖鎖ァスパラギン誘導体を 1 グラム程度調製することが可能である。
本発明では、 上記先願で得られた各種の糖鎖ァスパラギン、 上記先願に記載の ない 2, 3結合体の糖鎖ァスパラギン、 並びに （ひ 2, 3) (α 2, 6) 結合体の 糖鎖ァスパラギン、更にはこれらのフコース結合体の糖鎖ァスパラギンを用いて、 目的とするピオチン化又は F I TC化した糖鎖ァスパラギン誘導体を得るもので ある。
本発明は、 糖鎖ァスパラギンのアミノ基窒素をピオチン化又は F I TC化した 糖鎖ァスパラギンである。
本発明のピオチン化糖鎖ァスパラギンとしては、 例えば、 下記式で表される化 合物を挙げることができる。
Figure imgf000016_0001
〔式中、 R1および R2は、 Η、 又は式 （2) 〜 （6) で示される基であり、 同一 でも異なっていてもよい。 〕
本発明の F I TC化糖鎖ァスパラギンとしては、 例えば、 下記式で表される化 合物を挙げることができる。
Figure imgf000017_0001
( 9 )
〔式中、 R 1および R 2は上記と同じである。 〕
また、 本発明は、 糖鎖ァスパラギンのアミノ基窒素をピオチン化又は F I T C 化したピオチン化又は F I T C化糖鎖ァスパラギンの製造方法である。
本発明のピオチン化又は F I T C化糖鎖ァスパラギンの製造方法としては、 例 えば、 上記に示した種々の単離された糖鎖ァスパラギンのァスパラギンのァミノ 基窒素をピオチン化又は F I T C化することにより得ることができる。
本発明で使用される糖鎖ァスパラギンとしては、 例えば、 式 （7 ) で表される 化合物を挙げることができる。
Figure imgf000017_0002
(式中、 R 1および R 2は上記に同じ。 ）
-具体的な糖鎖ァスパラギンとしては、 .先願に記載された化合物を-挙げるこ上が できる。即ち、先願の第 3〜4図に示された α 2， 6化合物を同様に用いることが でき、 記号化したこれら化合物を本発明の表 1〜 3に示す。
また上記糖鎖ァスパラギンを合成するために用いられた糖鎖ァスパラギン誘導 体としても、 先願に記載された 2， 6化合物を挙げることができる。 即ち、 先願 の第 1〜 2図に示された化合物を同様に用いることができ、 記号化したこれら化 合物を本発明の表 4〜 6に示す。 また上記先願に記載された糖鎖ァスパラギン以外に、 α 2 , 3結合体の糖鎖ァス パラギン、 並びに （α 2， 3 ) ( 2 , 6 ) 結合体の糖鎖ァスパラギン、 更にはこ れらのフコース結合体の糖鎖ァスパラギンを用いることができる。
本発明のピオチン化としては、公知の方法に従って行うことができる。例えば、 糖鎖ァスパラギンを水に溶かし重炭酸ナトリウムを加え、 ここに、 D— （ + ) - ピオチェルスクシンイミドを溶かしたジメチルホルムアミドを加え、 室温で 2 0 分反応させ、 ゲルろ過カラム等で精製し、 ピオチン化糖鎖ァスパラギンを得るこ とができる。
本発明のピオチン化糖鎖ァスパラギンを結合させたマイクロプレートは、 市販 のアビジン化したマイクロプレート （例えば、 ピアス社製） に、 ピオチン化した 糖鎖ァスパラギンを反応させることにより製造することができる。
また、 本発明のピオチン化糖鎖ァスパラギンを結合させたァフィ二ティーカラ ムは、 市販のアビジン化したァフィ二ティーカラムに、 ピオチン化した糖鎖ァス パラギンを反応させることにより製造'することができる。
本発明の F I T C化としては、公知の方法に従って行うことができる。例えば、 糖鎖ァスパラギンを水に溶かし、 アセトン、 重炭酸ナトリウムを加え、 ここに、 フルォレセインイソチオシァネートを加え、 室温で 2時間反応させ、 ゲルろ過力 ラム等で精製し、 F I T C化糖鎖ァスパラギンを得ることができる。
本発明で得られた F I T C化糖鎖ァスパラギンは、 例えば生体組織中の糖類の 受容体の研究—、 レクチンの糖結合特異性の研究に有用である。 ― ' 発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げて説明するが、 本発明は何らこれら実施例に限定されるも のではない。 なお、 iH— NMRのデータは、 実施例 1〜7及び参考例 4 5につ いては 30°Cで HODを 4. 8 p pmとして、 参考例 1〜44については 3 0 °C で内部標準としてアセトンのメチル基のシグナルを 2. 22 5 p pm、 HODを 4. 7 1 8 p pmとして測定して得られた値である。 また、 Fmo c基が除去さ れた化合物については測定溶媒中に 5 OmMの炭酸水素アンモニゥムを共存させ て測定した。
参考例 1 ジシァ口糖鎖ァスパラギン （化合物 24) の合成
卵由来粗精製 SGP (シァリルグリコペプチド） 2. 6 gをトリス—塩酸 '塩 化カルシウム緩衝溶液 （TR I ZMA BASE 0. 0 5 m o 1 Z 1、 塩化力 レシゥム 0. 0 1 mo 1 1、 pH 7. 5) 1 0 0m lに溶解させた。 これにアジ 化ナトリウム 58mg (7 72 ^mo 1 ) とァクチナーゼー E (科研製薬社製） 526mgを加え、 37DCで静置した。 6 5時間後、 再びァクチナーゼー Eを 2 ' 63mg加え、 更に 37°Cで 24時間静置した。 この溶液を凍結乾燥した後、 残 留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー （S e p h a d e x G— 2 5、 2. 5 φΧ lm、 展開溶媒は水、 流速は 1. 0m 1 Zm i n - ) で 2回精製し、 ィ匕 合物 2.4を 1. 3 g (555 imo 1 ) 得た。
得られた化合物 24の物理的データは以下の通りである。
- -ュ H— NMR (D-2ひ,— 30°C) - - - 一
5. 1 5 ( 1 H， s , M a n 4 - H 1), 5. 06 ( 1 H， d， G 1 c NA c 1一 HI), 4. 9 5 (1H, s， Ma n 4 ' -HI), 4. 82 ( 1 H, s， Ma n 3 — HI), 4. 69 (1H, d， G 1 c Ac 2 - H 1), 4. 67 (2H, d, G 1 c NAc 5, 5 ' -HI), 4. 53 (2H, d, G a 1 6, 6 ' 一 H I), 4. 34 (1 H, d， M a n 3 - H 2 ) , 4. 2 7 ( 1 H, d， M a n 4 ' 一 H 2), 4. 1 9 (1H， d, Ma n 4 _H2)， · 3. 03 (1H, d d, As η-β CH),
3. 00 (1 H, dd， As n - 3 CH), 2. 76 (2 H, cl d, Ne u A< 7 ' -H 3 e q), 2. 15 (18 H， s X 6, —Ac), 1. 79 (2 H, d Ne u Ac 7, 7 ' -H 3 a x)
Figure imgf000020_0001
参考例 2 化合物 1、 2、 6および 10の合成
参考例 1で得られた化合物 24 ( 609 mg, 261 m o 1；) を水 20. 7 m lに溶解させ、 さらに 0. 1規定塩酸 13. 8m 1を加えた。 この溶液を 70 °C で 35分間加熱した後速やかに氷冷し、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え p H7とした。 これを凍結乾燥した後、 残留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィ 一 （S e ph ad e x G— 25、 2. 5 X 1 m, 展開溶媒は水、 流速は 1. 0 m 1 , m i n - ) で精製したところ、 化合物 24、 化合物 25および 29、 化合 物 33の混合物— 534m gを得 。 こ—の 4成分はそれぞれを単離す！)^—ど¾ぐ次 の工程に進めた。
なお、 得られた糖鎖混合物の物理的データは以下の通りである。
!H-NMR (D20, 30。C)
5. 13 (s, Ma n 4 -H 1), 5. 12 (s, Ma n 4-H 1), 5. 01 (d， G l cNAc l - HI), 4. 94 (s， M a n 4 ' -HI), 4. 93 (s， Man 4， 一 HI), 4. 82 (s, Ma n 3 -H 1), . 60 (d, G l cNA c 2 - H l)， 4. 5 8 (d， G 1 c NAc 5, 5 ' 一 H l)， 4. 4 7 (d d, G a 1 6, 6 ' -H I), 4. 44 (d, G a 1 6, 6 ' 一 H I ), 4. 24 (d， M a n 3 -H 2), 4. 1 9 (d, M a n 4 ' 一 H 2), 4. 1 1 (d, Ma n 4 -H 2), 2. 9 7 (b d d， A s n - /3 CH), 2. 7 2 (d d, Ne uAc 7 -H 3 e q,' N e u A c 7 -H 3 e q), 2. 6 4 (b d d, A s n - jS CH), 2. 1 5 ( s X 5, —Ac), 1. 7 9 (d d， Ne uAc 7 -H 3 a x, Ne u Ac 7 ' -H3 a x)
得られた糖鎖の混合物 4 2 9mgをアセトン 1 6. 3 m 1 と水 1 1. 2m 1 に溶
9
解させた。 ここに 9一フルォレニルメチル _N—スクシ二ミデルカーボネート (1 5 5. 7mg, 4 6 1. 7 mo 1 ) と炭酸水素ナトリウム （8 0. 4mg， 9 5 7 iimo 1 ) を加え、 室温で 2時間攪拌した。 この溶液をエバポレー夕一に 供してアセトンを除き、 残りの溶液をゲル濾過カラムクロマトグラフィー （S e p h a d e x G— 2 5、 2. 5 φ X 1 m, 展開溶媒は水、 流速は 1. 0 m I Zm i n - ) で精製したところ、 化合物 1、 化合物 2および 6、 化合物 1 0の混合物 3 0 9mgが得られた。 この混合物を HPL C (OD Sカラム、 展開溶媒は 5 0 mM酢酸アンモニゥム水溶液： メタノール二 6 5 : 3 5、 2. O X 2 5 c m, 流速 3m l Zm i n) を用いて精製したところ、 5 1分後に化合物 1力 6 7分 後に化合物 2および 6の混合物が、 9 3分後に化合物 1 0が溶出した。 それぞれ を取り分け凍結乾燥を行った後、 ゲル濾過カラムクロマトグラフィー （S e p h ― — a d e x G - 2 5 , 2. 5 X 3" 0 cm, 展開溶媒は水、 流速は T:O mT7m i n - ) で脱塩することで目的の化合物 2および 6の混合物 1 5 Omgを得た。 なお、 得られた化合物 1の物理的データは以下の通りである。
^-NMR (D2〇， 3 0°C)
7. 9 9 (2 H, d， Fmo c)， 7. 7 9 (2 H, cl， Fmo c), 7. 5 5 (4 H， m, Fmo c), 5. 1 5 (1 H, s , Ma n 4— H I), 5. 06 ( 1 H， d, G l c NAc l— H I ), 4. 9 5 ( 1 H, s , M a n 4 ' 一 H I), 4. 8 2 ( 1 H， s， Ma n 3 -H1), 4. 69 (1 H, d， G 1 c NA c 2 -H 1 ),
4. 67 (2H, d, G 1 c NAc 5, 5 ' -H I), 4. 53 (2H， d， Ga l 6, 6 ' -H I), 4. 34 (1H， d, M a n 3 -H 2), 4. 27 (1 H， d， Man 4， -H2), 4. 1 9 (1 H， d, Ma n 4 -H2), 3. 03 (1 H, b d d， As n- $ CH), 3. 00 (1 H, b d d， As n— jS CH), 2.7 6 (2 H, d d， N e u Ac 7, 7 ' -H 3 e q), 2. 1 5 (1 8 H, s X 6 , - Ac), 1. 79 (2H, d d， N e u A c 7 , 7 ' -H 3 a x) ; HRMS C a l e d f o r C103H154N8N a 066 [M + N a +] 2 58 1. 883 8， f o un d, 258 1. 88 2 1
Figure imgf000022_0001
上記の糖鎖の構造を記号化すると次のようになる。 ここで
Ne uAc : シアル酸 Ga l : D—ガラクト一ス G l c NAc : N—ァ セチルダルコサミン Ma n : D—マンノース As n :ァスパラギン を示す。
NeuAc α' 2— 6Gal β 1— 4G1 cNAc β 1— 2Man a K
、 6
Man β 1— 4GlcNAc β 1— 4GlcNAc— Asn-Fmoc
NeuAca2— 6Gal β 1— 4GlcNAc/31— 2Mancd, また、 得られた化合物 2および 6の混合物の物理的データは以下の通りである。 JH-NMR (D20， 30。C)
7. 99 (d, Fmo c), 7. 79 (d, Fmo c), 7. 55 (m， Fmo c ), 5. 14 (s , M a n 4 -H 1 ), 5. 12 (s， Man 4 -H), 5. 00 (d， G l cNAc l - HI), 4. 94 ( s , M a n 4 ' —HI), 4. 93 (s , Ma n 4 ' 一 HI), 4. 82 (s， a n 3 - H 1 ) , 4. 60 (d, G 1 c NAc 2 一 HI), 4. 58 (d， G 1 c NA c 5, 5 ' 一 H I), 4.46 (d d, Ga l 6, 6， —HI), 4.44 (d， G a 1 6, 6 ' -HI), 4. 24 (d, Ma n 3 -H2), 4. 19 (d, Ma n 4 ' _H2), 4. 1 1 (d, Ma n 4 -H 2), 2. 97 (b dd， A s n - 3 CH), 2. 72 (dd, Ne uAc 7 -H3 e q, Ne uAc 7 -H3 e q), 2.64 (b dd, As n - j3 CH), 2. 15 ( s X 5, -Ac), 1. 79 (dd, Ne uAc 7 -H3 a x, N e u Ac 7 ' -H 3 a x )
また、 得られた化合物 10の物理的データは以下の通りである。
!H-NMR (D20， 30°C)
7. 99 (2 H, d, Fmo c), 7. 79 (2 H, d, Fmo c), 7. 55 (4 H, m， Fmo c), 5. 12 (1H， s , M a n 4 - H 1 ) , 5.06 ( 1 H， d, G l cNAc l - HI), 4. 93 ( 1 H， s， Ma n 4' 一 HI), 4. 82 ( 1 H， s， Ma n 3 -H 1), 4. 69 ( 1 H, d , G 1 c NAc 2 - H 1), 4. 6 7 (2 H, cl， G 1 c NA c 5, 5 ' -HI), 4. 53 (2 H, d， G a 1 6 , 6 ' —HI), 4. 34 (1H, d， Man 3_H2)， 4. 27 (1H, d, Ma n 4 ' -H2), 4. 19 ( 1 H, d， Ma n 4-H2), 3.03 (1 H， bd d, A s n - /3 CH), 3. 00 (1H， b dd, As n— iS CH), 2. 15 (1 2H， s X 4, -Ac) ; HRMS C a 1 c d f o r Cs lH12 ()N6Na〇5 C) [M + N a +] 1999. 6930, f oun d, 1999. 6939
参考例 3 化合物 3および 7の合成
参考例 2で得られた化合物 2および 6の混合物 （224mg, 97 / m o 1 ) とゥシ血清アルブミン 2 4mgを HE P E S緩衝溶液 （ 5 0 mM, H 6. 0) 2 2m lに溶角早させ、 さらに D i p l o c o c c u s p n e umo n i a e由 来 /3—ガラクトシダ一ゼ （1. 3 5 U) を加えた。 この溶液を 3' 7°Cで 1 5時間 静置した後、 凍結乾燥を行った。 残留物を HPL C (OD Sカラム、 2. 0 Φ Χ 2 5 c m, 展開溶媒は 5 OmM酢酸アンモニゥム水溶液： ァセトニトリル二 8 5 : 1 5、 流速 3m 1 , m i n) で精製したところ、 1 2 9分後に化合物 3が、 1 3 4分後に化合物 7が溶出した。 それぞれを取り分け、 凍結乾燥を行った。 続 いて HP L C 〔OD Sカラム、 2. 0 φ X 2 5 cm、 展開溶媒は最初の 1 5分間 が水、 1 6分後から 3 0分後までは水： ァセトニトリル （容量比） = 1 0 ： 0か ら 8 5 ： 1 5、 3 1分後から 4 5分後までは水：ァセトニトリル = 8 5 ： 1 5か ら 8 0 ： 2 0になるようにグラジェントを掛けた。 流速は 3. 0 m 1 Z'm i η ·〕 を用いて脱塩処理を行ったところ、 目的とする化合物 3が 8 lmg、 化合 物 7が 7 5mg得られた。
なお、 得られた化合物 3の物理的データは以下の通りである。
^-NMR (D20, 3 0。C)
7. 9 9 (2 H, d， Fmo c), 7. 7 9 (2 H, d， Fmo c), 7. 5 5 (4 H， m, Fmo c), 5. 1 5 ( 1 H, S, Ma n 4-H l ), 5. 0 6 ( 1 H, d， G 1 c NAc 1 -H 1 ), 4. 9 5 ( 1 H, s， M a n 4 ' 一 H I ), 4. 8 2 ( 1 H， s , Ma n 3 -H 1), 4. 6 9 ( 1 H, d, G 1 c NAc 2 -H 1), 4. 6 7 (2 H, d， G 1 c NA c 5, 5 ' 一 H I ), 4. 5 3 ( 1 H, d, G a 1 6 ' 一 H I ), 4. 3 4 ( 1 H， d， M a n 3 -H 2), 4. 2 7 ( 1 H， d, M a n 4， -H 2), 4. 1 9 ( 1 H, d, Ma n 4-H 2), 2. 9 7 (1 H, b d cl, A s n- /3 CH), 2. 7 6 (1 H, d d, N e uAc 7 ' -H 3 e q), 2. 6 1 (1 H， b d d, A s n— /3 CH), 2. 1 5 ( 1 5H, s X 5 , -Ac), 1. 7 9 ( 1 H， d d, N e u Ac 7 ' -H 3 a x) ； HRMS C a l c d f o r C86H127N7N a053 [M + N a +] 2 1 2 8. 7 3 5 6 , f o u n d, 2 1 2 8. 7 3 6 3
また、 得られた化合物 7の物理的データは以下の通りである。
^-NMR (D2〇， 3 0°C)
7. 9 9 (2 H， d， Fmo c), 7. 7 9 (2 H, d， Fmo c), 7. 5 5 (4 H, m， Fmo c), 5. 1 5 ( 1 H， S, Ma n 4 -H 1 ) 5. 0 6 ( 1 H， d G l c NAc l— H l)， 4. 9 5 ( 1 H， s , M a n 4 ' -H I), 4. 8 2 ( 1 H， s， Ma n 3 -H 1 ), 4. 6 9 (1 H， d, G 1 c NAc 2 -H 1 ), 4. 6 7 (2 H, d， G 1 c NAc 5, 5 ' 一 H I ), 4. 5 3 ( 1 H， d, G a 1 6 - H I), 4. 3 4 ( 1 H, d， Ma n 3 -H2), 4. 2 7 ( 1 H, d, Ma n 4 ' 一 H 2), 4. 1 9 ( 1 H, d, Ma n 4 -H2), 2. 9 7 (1 H， b d d， A s n- β Ο ), 2. 7 6 ( 1 H, d d， Ne uAc 7 -H 3 e q), '2. 6 0 (1 H b d d, A s n- /3 CH), 2. 1 5 ( 1 5H, s X 5, 一 Ac), 1. 7 9 ( 1 H d d, N e u A c 7 -H 3 a x) ; HRMS C a l c d f o r C86H125 N7N a 3053 [M + N a +] 2 1 7 2. 6 9 9 5 , f o u n d, 2 1 7 2. 7 0 8 4
参考例 4 化合物 4および 8の合成
参考例 3で得られた化合物 3および 7の混合物 （9 0mg, 4 7. 3 o 1 ) をそれぞれ分離することなく、 ゥシ血清アルブミン 8 mgと共に HE P E S 緩衝溶液 （ 5 0 mM， pH 6. 0) 8. 1 m l に溶解させ、 さらに B o v i n e k i d n e y由来 /3—ダルコサミニダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om B o v i n e k i d n e y) を 2. 8 8 U加えた。 この溶液を 3 7 で 1 8時 間静置した後凍結乾燥し、 残留物を HP L C (〇D Sカラム、 2. 0 <i) X 2 5 c m、 展開溶媒は 5 OmM酢酸アンモニゥム水溶液： メタノール = 6 5 ： 3 5、 流 速 3mし/ m i n) で精製したところ、 1 1 7分後に化合物 4が、 1 2 7分後に 化合物 8が溶出した。 それぞれを取り分け、 凍結乾燥を行った。 続いて HP L C (OD Sカラム、 2. 0 φ X 2 5 cm、 展開溶媒は最初の 1 5分間が水、 1 6分 後から 30分後までは水： ァセトニトリル= 10 ： 0から 85 ： 1 5、 3 1分後 から 45分後までは水： ァセトニトリル= 85 ： 1 5から 80 ： 20になるよう にグラジェントを掛けた。 流速は 3. Om l Zm i n · ) を用いて脱塩処理を行 つたところ、 目的とする化合物 4が 4 Omg、 化合物 8が 37mg得られた。 なお、 得られた化合物 4の物理的データは以下の通りである。
^-NMR (D2〇， 30°C)
8. 0 1 (2 H, d, Fmo c), 7. 80 (2 H, d， Fmo c), 7. 56 (4 H， m, Fmo c)， 5. 22 (1H, s, Man 4— HI), 5. 08 ( 1 H, cl : G 1 c NAc 1 -H 1), 4. 94 ( 1 H, s , Ma n 4 ' -HI), 4. 84 (1H， s , Ma n 3 -H 1 ), . 69 (1 H, d， G 1 c NAc 2 -H 1), 4. 67 (1 H， d, G 1 c NAc 5 -H 1), 4. 55 ( 1 H, d, G a 1 6 - HI), 4. 33 (1H， d d， Ma n 3 -H 2), 4. 20 ( 1 H， d d, Man 4 -H 2), 4. 15 ( 1 H, d d， Ma n 4 ' -H 2 ), 2. 97 ( 1 H, b d d， As n— 3 CH), 2. 76 (2 H, dd, Ne uAc 7, 7 ' -H3 e q), 2. 6 2 (1 H, b d d, A s n - /3 CH), 2. 1 5 ( 1 2 H, s X 4 , —A c), 1. 79 (2 H, dd, N e u A c 7 , 7 ' -H 3 a x) ; HRMS C a 1 c d
f o r C78H114N6N a 048 [M + N a +] 1 925. 6562, f o u n d， 1 925. 6539
また、 得られた化合物 Sの物理的データは以下の通りである。
^-NMR (D2〇， 30°C)
7. 99 (2 H, d, Fmo c), 7. 79 (2 H, d, Fmo c), 7. 55 (4 H， m， Fmo c), 5. 1 5 (1H, S, Man4-Hl), 5. 06 (1 H， d， G 1 c NAc 1 -H 1), 4. 95 (1H, s, Ma n 4 ' -HI), 4. 82 ( 1 H, s， Man 3-H1), 4. 69 (1H, d， G 1 c NAc 2 -H 1), 4. 6 7 (2 H, d, G 1 c NA c 5, 5 ' — H l)， 4. 53 ( 2 H, d, G 1 6, 6 ' 一 H I), 4. 34 ( 1 H, d, M a n 3 - H 2 ) , 4. 27 (1 H, d， Ma n 4 ' — H2), 2. 97 (1 H， b d d， As n— 3 CH2), 2. 76 (1 H, d d, N e u A c 7 ' -H 3 e q), 2. 6 1 ( 1 H, b d d, As n - j3 CH 2), 2. 1 5 ( 1 2 H, s X 4 , -Ac), 1. 7 9 ( 1 H, d d, N e u A c
7 ' -H 3 a x) ； HRMS C a l c d f o r Cy 8H1 14N6N a048 [M + N a +] 1 925. 6 56 2, f o un d, 1 925. 6533
参考例 5 化合物 5の合成
参考例 4で得られた化合物 4 ( 30 m , 473 m o 1 ) とゥシ血清アルブ ミン 3mgを HEPE S緩衝溶液 （ 50 mM， pH 6. 0) 6 m 1に溶解させ、 さらに J a c k B e an s由来ひ一マンノシダ一ゼを 1 0U加えた。 この溶液 を 37 Cで 2 1時間静置した後凍結乾燥し、 続いて HPLC (ODSカラム、 2. 0 Χ 2 5 cm, 展開溶媒は最初の 1 5分間が水、 1 6分後から 30分後ま では水： ァセトニトリル = 1 0 ： 0から 85 ： 1 5、 3 1分後から 45分後まで は水：ァセトニトリル= 85 ： 1 5から 80 ： 20になるようにグラジェン卜を 掛けた。 流速は 3. 0mし'' 'm i n · ) を用いて精製したところ、 目的とする化 合物 5が 2 Omg得られた。
なお、 得られた化合物 5の物理的データは以下の通りである。
^- MR (D2〇， 30°C)
8. 0 1 (2 H, d， Fmo c)， 7. 8 0 (2 H, d， Fmo c)， 7. 56 (4 H, m， Fmo c)， 5. 00 ( 1 H, d， G 1 c N A c 1 - H 1 ) , . 95 (1 H, s , Ma n 4 ' -H I), 4. 84 ( 1 H, s , M a n 3 -H 1 ), 4. 6 7 (1 H, cl, G 1 c NAc 2 -H1), 4. 56 (1 H, d， G 1 c NAc 5 -H
1) ,
4. 44 (1 H， d, G a 1 6 -H 1 ), 4. 1 1 (1 H, d d， Ma n 4 ' 一 H
2) , 4. 07 (1H， dd， Ma n 3 -H2), 2. 97 (1H， b d d, As n 一 /3 CH), 2. 76 (1H, d d， Ne uAc 7 ' -H3 e q), 2. 62 (1 H, b dd， As n-j3 CH), 2. 15 (1 2 H, s X 4, -Ac), 1. 79 ( 2 H, dd, Ne uAc 7 ' -H3 ax) ; HRMS C a 1 c cl f o r C72H10 4N6N a 043 [M + N a +] 1763. 6034, f o un d, 1 763. 60 74
参考例 6 化合物 9の合成 '
参考例 4で得られた化合物 8 (4 Omg, 630 zmo 1 ) とゥシ血清アルブ ミン 5 gを HE P E S緩衝溶液 （5 OmM, pH6. 0) 7. 8m lに溶解させ、 J a c k B e a n s由来 a—マンノシダ一ゼを 38 U加えた。 この溶液を 3 7°Cで 63時間静置した後凍結乾燥し、 続いて HPLCC (ODSカラム、 2. 0 φΧ 25 cm, 展開溶媒は最初の 1 5分間が水、 16分後から 30分後ま では水： ァセトニトリル = 10 ： 0から 85 ： 1 5、 31分後から 45分後まで は 85 ： 15から 80 ： 20になるようにグラジェントを掛けた。 流速は 3. 0 m l /m i n) を用いて精製したところ、 目的とする化合物 9が 30 mg得られ た。
なお、 得られた化合物 9の物理的デ一夕は以下の通りである。
JH-NMR (D20, 30°C)
8. 0 1 (2H， d， Fmo c), 7. 80 (2 H, d， Fmo c), 7. 56 (4 H， m， Fmo c), 5. 23 (1H， s , M a n 4 - H 1 ) , 5. 08 ( 1 H， d， G l cNAc l— HI), 4. 53 ( 1 H, d, G a 1 6 -H 1), 4. 32 ( 1 H， dd, Ma n 3 -H 2), 4. 28 (lH,— dd， Man 4-H27, 2. 8 i "( 1 H, b d d， As n - i3 CH)， 2. 76 ( 1 H, d d, Ne uAc 7 -H 3 e q), 2. 59 ( 1 H, b dd, As n - /3 CH)， 2. 13 ( 12 H, s X 4, 一 Ac), 1. 80 (1H, dd， Ne uAc 7H3 a x) ; HRMS C a l c d f o r C72H104N6N a 043 [M + N a +] 1 763. 6034, f o un d， 1763. 6041
参考例 7 Fmo c基の脱保護 （化合物 33の合成） 参考例 2で得られた化合物 10 (10. 5mg， 5. 27 xmo l ) を 50%モ ルホリンノ N， N—ジメチルホルムアミド溶液 1.4m 1に溶解させ、 室温 ·アル ゴン雰囲気下で 2時間反応させた。 この溶液にトルエン 3m 1を加え、 35°Cで エバポレーターに供した。 この操作を三回繰り返し、 反応溶媒を取り除いた。 残 留物をゲル濾過カラムクロマトグラフィー （S e p h a d e X G— 25、
2. 5 X 30 cm, 展開溶媒は水、 流速は 1. Om 1 z m i n · ) で精製したと ころ、 目的とする化合物 33が 7mg得られた （収率は 76%)。 なお、 得られ た化合物の構造は、 参考例 2から得られる化合物 33と1 H— NMRスぺクトル がー致したことから確認した。
化合物 33の物理的デ一夕は以下の通りである。
JH-NMR (30°C)
(55. 12 (s， 1H, Ma n 4-H- 1), 5. 07 (d, 1 H, J = 9. 7Hz , G l cNAc l - H - 1), . 92 (s， 1 H, M a n 4 ' -H- 1 ), 4. 76 (s , 1 H, Ma n 3 -H- 1 ), 4. 62 (d, 1 H, J = 8. 0Hz， G 1 c NAc 2 -H- 1), 4. 58 (d, 2 H, J = 7. 8 H z , G 1 c NAc 5, 5 ' — H - 1)， .47 (d, 2H, J = 7. 9Hz, G a 1 6, 6 ' — H - 1), 4. 24 (b d, 1H， Ma n 3 -H- 2), 4. 19 (b d d， 1H, J = 3. 2 Hz, 1.4Hz, Ma n 4' 一 H - 2), 4. 12 (b dd， 1 H, J = 3. 2 H z, 1.4Hz, Man4 - H - 2)， 2. 93 (dd, 1 H, J =4. 5Hz , 1 7. 0 Hz, A s n _ /3 CH), 2. 9— 3 (d d， 1 H, J = 6. 8Hz , 1 7. 0 Hz , As n- 3 CH), 2.08 (s, 3 H， Ac), 2. 05 (s, 6H， Ac X 2), 2. 01 ( s , 3H, Ac)
参考例 8 化合物 14の合成
化合物 3 (28mg, 21. 3 /mo 1 ) とゥシ血清アルブミン 1. 0 m gを H EPE S緩衝溶液 （5 OmM， pH5. 0， 454 L) に溶解させ、 ノイラミ ニダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om V i 1 i o Ch o l e r a e, 1 9 8mU) を加えた。 この溶液を 3 7 °Cで 2 0時間静置した後、 HPL C 分析により反応終了を確認した。 反応溶液を HP L C (YMC P a c k e d C o l umn D-OD S - 5 S - 5 1 2 0 A OD S No. 2 0 2 0 1 7 8、 2 0 X 2 5 0mm, 展開溶媒は 5 0 mM酢酸アンモニゥム水溶液： ァセトニ トリル = 8 0 ： 2 0、 流速 4mLZm i n) で精製した。 更に OD Sカラム （コ スモシール 7 5 C 1 8 _OPN、 1 5 1 0 0mm、 最初に H20を 5 OmL流 し、 次に 2 5 %ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的と する化合物 1 4 (1 7mg, 収率 7 0 %) が得られた。 得られた化合物の物理的 デ一夕は以下の通りである。
!H-NMR (3 0°C)
0 7. 9 1 (d, 2H， J = 7. 5 Hz , Fmo c ), 7. 7 1 (d, 2 H, J = 7. 5Hz , Fmo c), 7. 5 1 (d d, 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c ), 7. 4 3 (d d, 2 H, J = 7. 5H z， Fmo c), 5. 1 2 ( s， 1 H， M a n
4一 H— 1), 4. 9 9 (d， 1 H, J = 9. 5H z , G 1 c N A c 1— H - 1 ) , 4. 9 2 (s , 1 H， M a n 4 ' —H_ l)， 4. 7 6 ( s , 1 H, Ma n 3 -H - 1 ), 4. 5 8 (d， 1 H， J = 8. 0 H z , G 1 c N A c 2— H— 1 ) , 4. 5
5 (d, 1 H, J = 8. 4H z , G 1 c NAc 5 ' — H - 1)， 4. 4 7 ( cl , 1 H, J = 7. 8Hz , G a 1 6 ' 一 H— 1), 4. 34 ( t , 1 H， Fmo c),
4. 2 4 (b d, 1 H—， J = l. 9H z7 M n 3 -H- 2), 4. 1^8^ ( b d d , " 1 H， J = 1. 4Hz , 3. 3 Hz , Ma n 4-H- 2), 4. 1 1 (b d d， 1 H, J = 1. 4Hz , 3. 5H z , Ma n 4 ' 一 H_ 2)， 2. 7 2 (b d d， 1 H, J = 3. 0Hz , 1 5. 7H z , A s n_ /3 CH)， 2. 5 2 (b d d, 1 H， J = 8. 7 H z , 1 5. 7 Hz , A s n- β CH), 2. 0 6， 2. 0 5, 2. 0 4, 1. 8 9 (e a c h s , e a c h 3 H , A c ) ; H R M S C a 1 c d f o r C75H1 10N6N aO45 [M + N a +] 1 8 3 7. 64 0 2 , f o u n d 1 8 2003/016682
29
37. 6471
参考例 9 化合物 19の合成
化合物 7 (2 Omg, 9.4 mo l ) とゥシ血清アルブミン 1 · 6 m gを H E PES緩衝溶液 （5 OmM， pH 5. 0 , 323 /i L ) に溶解させ、 ノィラミニ ダ一ゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om V i b l i o Cho l e r a e, 14 lmU) を加えた。 この溶液を 37°Cで 18時間静置した後、 HPLC分析 により反応終了を確認した。 続いて HPLC (YMC P a c k e d Co l u mn D-OD S - 5 S - 5 1 20 A ODS No. 2020 1 7 8、 2 0 X 250mm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリル = 80 : 20、 流速 4mLZ'm i n) で精製した。 更に OD Sカラム （コスモシ —ル 75 C 1 8— OPN、 1 5 X 100 mm、 最初に H2〇を 5 OmL流し、 次 に 25? ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的とする化 合物 19 (1 3mg, 収率 76 %) を得た。 得られた化合物の構造は1 H— NM Rが標品と一致したことから確認した。
参考例 10 化合物 15の合成
化合物 4 (45mg, 24 mo l ) とゥシ血清アルブミン 1. 7 m gを H EPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH 5. 0 , 820 L) に溶解させ、 ノイラミ ニダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om V i b l i o Cho l e r a e， 134mU) を加えた。 この溶液を 37 °Cで 14時間静置した後、 HPLC 分析により反応終了を確認し 。 続 X、 反応溶液を HPLC て YMC P c k e d Co l umn D-OD S - 5 S— 5 120 A ODS No. 2 020 1 78、 20 X 250mm, 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶 液： ァセトニトリル =80 : 20、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に OD Sカラム （コスモシール 75 C 18—〇PN、 1 5 X 100 mm, 最初に H2〇 を 5 OmL流し、 次に 25 %ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したと ころ、 目的とする化合物 1 5 (28mg， 収率 74%) が得られた。 得られた化 合物の物理的データは以下の通りである。
^-NMR (30°C)
(57. 92 (d, 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c), 7. 71 (d， 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c)， 7. 51 (dd, 2 H, 1 = 7. 5H z , Fmo c), 7.44 (dd, 2H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 5. 10 (s, 1 H, Ma n
4一 H— 1), 4. 99 (d， 1H， J = 9. 5Hz, G 1 c N A c 1 _ H— 1 ) , 4. 92 (s， 1 H, M a n 4 ' — H - 1), 4. 76 (s， 1 H， M a n 3 -H - 1 ), 4. 58 (d， 2H， G 1 c NAc 2, 5 ' 一 H - 1), 4.47 (d, 1 H, J = 8. 0Hz， G a 1 6 ' — H - 1), 4. 35 (t, 1 H, Fmo c), 4. 24 (bd， 1H, J = 1. 9 H z , Man 3-H-2), 4. 1 1 (b s， 1 H， Ma n 4' 一 H_2)， 4. 07 (b s, 1 H, Man4— H—2), 2. 72
(b d, 1 H, J = 1 5. 5Hz， As n - 3 CH), 2. 52 (b d d， 1 H, J = 8. 7Hz , 1 5. 5Hz , As n - β CH), 2. 06， 2. 04, 1. 89
(e a c h s , e a c h 3 H, Ac) ; HRMS C a 1 c d f o r C 67H97N5NaO40 [M + Na+ 1634. 5608, f o und, 1634.
5564
参考例 1 1 化合物 70の合成
化合物 15 (1 lmg, 6. 8 iTio 1 ) とゥシ血清アルブミン 1. 5 m gを H E PE S緩衝溶液 （5 OmM, pH 5. 0, 2 6 9 L) に溶解させ、 β—ガラ ク卜シ—ダーゼ ¾ー化学工業社製一、 f— r om J a c k Be an s， 1 I n L, 275mU) を加えた。 この溶液を 37°Cで 14時間静置した後、 HPLC分析 により反応終了を確認した。 反応溶液を HPLC (YMC P a c k e d Co 1 umn D-OD S - 5 S - 5 120 A ODS No. 2020 1 78、 20 X 250mm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリ ル =80 ： 20、 流速 4mLZm i n) で精製した。 更に〇DSカラム （コスモ シール 75 C 18—〇PN、 1 5 100 mm, 最初に H2〇を 5 OmL流し、 次に 2 5 %ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的とする 化合物 7 0 (6. 3mg, 収率 6 4 %) が得られた。 得られた化合物の物理的デ —夕は以下の通りである。
^-NMR (3 0。C)
(57. 9 1 (d, 2H， J = 7. 5H z , Fmo c), 7. 7 0 (d, 2 H, J = 7. 5Hz , Fmo c), 7. 5 0 (d d, 2 H, J = 7. 5H z , Fmo c), 7. 4 3 (d d, 2H， J = 7. 5 H z , Fmo c), 5. 1 0 ( s， 1 H, Ma n 4一 H_ l)， 4. 9 9 (d, 1 H, J = 9. 5H z , G 1 c N A c 1 _ H— 1 ) ,
3
4. 9 1 ( s , 1 H, M a n 4 ' 一 H - 1)， 4. 7 6 ( s， 1 H， M a n 3 -H — 1 ), 4. 5 5 (d， 2 H, G 1 c NA c 2, 5 ' 一 H - 1 ), 4. 3 2 ( t , 1 H, Fmo c), 4. 24 (b s， 1 H, Ma n 3— H - 2), 4. 1 0 (b s , 1 H, Ma n 4— H - 2), 4. 0 6 (b s， 1 H, J = 1. 3 H z , M a n 4 ' - H - 2)， 2. 7 2 (b d, 1 H, J = 1 4. 0 H z , A s n - 3 CH)， 2. 5 2 (b d d， 1 H, J = 9. 5 H z , 1 4. 8 H z , A s n- CH), 2. 0 6, 2. 0 5, 1. 8 9 (e a c h s , e a c h 3H， Ac) ； MS (F a b), C a l c d f o r C61H8 sN5035 [M + H + ] 1 4 5 0. 5, f o u n d, 1 4 5 0. 4
参考例 1 2 化合物 2 0の合成
化合物 8 (4 7mg, 2 5 /xmo l ) とゥシ血清アルブミン 1. 9 mgを HE P E S緩 i溶 ίί¾— 5 OmM, p H 5: 0，― 840 nD に溶解きせ、— ノ Tラ I二 ダーゼ （シグマアルドリッチ社製、 f r om V i b 1 i o C h o 1 e r a e , 3 6 9mU) を加えた。 この溶液を 3 7°Cで 3 7時間静置した後、 HP L C分析 により反応終了を確認した。 反応溶液を凍結乾燥し、 続いて HP L C (YMC P a c k e d C o l umn D—〇D S— 5 S - 5 1 2 0 A OD S N 0. 2 0 2 0 1 7 8、 2 0 X 2 5 0 mm、 展開溶媒は 5 0 mM酢酸アンモニゥム 水溶液：ァセトニトリル = 8 0 : 2 0、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に ODSカラム （コスモシール 75 C 18— OPN、 15 X 100 mm, 最初に H 20を 50mL流し、 次に 25 %ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩し たところ、 目的とする化合物 20 (26mg, 収率 65¾') を得た。 得られた化 合物の物理的デ一夕は以下の通りである。
JH-NMR (30°C)
57. 92 (d， 2H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 71 (d， 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c), 7. 51 (d d, 2 H, J = 7. 5H z , Fmo c), 7.43 (d d, 2H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 5. 12 (s， 1 H, Man 4 -H- 1 ), 4. 99 (d, 1 H, J = 9.4 H z , G 1 c N A c 1 - H_ 1 ), 4. 9 1 (s , 1H， M a n 4 ' — H— 1), 4. 77 (s， 1 H, M a n 3 -H — 1)， 4. 57 (b d, 2 H, G 1 c NA c 2, 5 ' — H— 1)， 4. 46 (d， 1 H, J = 7. 5Hz， Ga l 6， 一 H— 1), 4. 34 (t, 3H, Fmo c), 4. 24 (b s， 1 H, Ma n 4 ' -H- 2), 4. 19 (b s , 1 H, M a n 4 -H- 2), 2. 72 (b d, 1 H, J = 1 5. 5Hz， As n— i3 CH), 2. 5 2 (bdd, 1H, J = 9. 2 H z , 1 5. 5Hz , As n-/3CH), 2. 06, 2. 05, 1. 89 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac) ; HRMS C a 1 c d f o r C67H97N5N aO40 [M + N a +] 1634. 5608， f o u n d , 1634. 5644
参考例 13 化合物 71の合成
一 化合物 20 (12mg, 7. n mo Y) とゥシ血清アルブミ 1.— 0— m— gを H EPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH 5. 0, 330 / L) に溶解させ、 /3—ガラ クトシダーゼ （生化学工業社製、 f r om J a c k B e an s, 12 L, 297mU) を加えた。 この溶液を 37°Cで 46時間静置した後、 HPLC分析 により反応終了を確認した。 反応溶液を HP LC (YMC P a c k e d Co 1 umn D— ODS - 5 S - 5 120 A ODS No. 2020178、 20 X 250mm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリ ル =80 ： 20、 流速 4mLZm i n) で精製した。 更に ODSカラム （コスモ シール 75 C 18— OPN、 1 5 X 100mm。 最初に H2〇を 5 OmL流し、 次に 25%ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的とする 化合物 7 1 (6. 6mg, 収率 61 %) が得られた。 得られた化合物の物理的デ 一夕は以下の通りである。 '
JH-NMR (30°C)
(57. 90 (d, 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c)， 7. 70 (d， 2H， J = 7. 5Hz, Fmo c)， 7.49 (d d， 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c),
7.42 (dd, 2H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 5. 1 1 (s , 1 H, Man 4— H— 1)， 4. 99 (d, 1H， J = 9.4Hz, G 1 c N A c 1— H— 1 )， 4. 9 1 (s , 1 H, M a n 4 ' 一 H - 1), . 76 (s , 1H, M a n 3 -H - 1), 4. 55 (d, 2H, G 1 c NAc 2， 5— H_ 1), 4. 31 (b, 1 H, Fmo c), 4. 24 (b s, 1 H, Man 3-H- 2), 4. 18 (b s , 1 H, M a n 4 -H- 2), 3. 97 (dd, 1 H, J = 1. 8Hz， 3. 3Hz， Man 4， -H- 2), 2. 72 (bd， 1H， J = 15. 5Hz, As n— /3CH)，
2. 52 (bdd, 1H， J = 8.0 H z , 15. 5Hz， As n - 3 /3CH), 2. 06, 2. 05， 1. 88 (e a c h s, e a c h 3H， Ac) ; MS (F a b), C a 1 c d f o r C61H88N5035 [M + H + ] 1450. 5, f ound, 1450. 3
参考例 14 —化合物 Ί 6の合成- ― -'
化合物 5 (32mg, 18.4 ^mo 1 ) とゥシ血清アルブミン 2. 5 m gを H EPES緩衝溶液 （5 OmM, H 5. 0, 7 1 3 /xL) に溶解させ、 ノイラミ ニダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om V i b l i o Cho l e r a e， 134mU) を加えた。 この溶液を 37 °Cで 1 7時間静置した後、 HPLC 分析により反応終了を確認した。 続いて、 反応溶液を HP LC (YMC P a c k e d Co l umn D— ODS— 5 S— 5 1 20 A ODS No. 2 02 0 1 7 8、 20 X 2 50 mm. 展開溶媒は 5 0 mM酢酸アンモニゥム水溶 液： ァセトニ卜リル = 80 : 20、 流速 4mLz m i n) で精製した。 更に〇D Sカラム （コスモシール 7 5 C 1 8— OPN、 1 5 1 0 0mm、 最初に H2〇 を 50mL流し、 次に 2 5？ ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したと ころ、 目的とする化合物 1 6 (1 3m g , 収率 52 ¾ が得られた。 得られた化 合物の物理的データは以下の通りである。
JH-NMR (30°C)
δ 7. 92 (d, 2H， J = 7. 5 H z , Fmo c), 7. 7 1 (d, 2H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 5 1 (d el, 2H， J = 7. 5Hz， Fmo c), 7. 44 (cl cl， 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c ), 5. 00 (d, 1 H， J = 9. 9Hz， G 1 c NA c 1 - H— 1 )， 4. 92 (s， 1 H， Ma n 4 ' 一 H_ 1), 4. 7 5 (s , 1 H, Ma n 3 - H— 1), 4. 58 (d, 2 H, J = 7. 5 Hz， G 1 c NAc 2, 5 ' 一 H - 1), 4. 47 (d， 1 H, J = 7. 8 H z , G a 1 6 ' 「H - 1)， 4. 34 ( t , 1 H, Fmo c), 4. 1 0 (b cl， 1 H, M a n 3 -H- 2), 4. 0 7 (b s， 1 H, Ma n 4 ' — H— 2)， 2. 72 (b d d, 1 H， J - 1 5. 5 H z , As n - ]3 CH), 2. 52 ( b d d , 1 H, J = 9. 2Hz， 1 5. 5Hz , A s n— /3 CH), 2. 07, 2. 05, 1. 89 (e a c h s , e a c h 3H, Ac) ; MS (F a b), C a l c cl f o r C6 jHgg gOgs [M + H + ] 1450. 5， f o u n d, 1450. 3
参考例 1 5 化合物 1 7の合成—
化合物 1 6 (9mg， 6. 2 zmo l ) とゥシ血清アルブミン 1. 6mgを HE PE S緩衝溶液 （5 OmM, pH 5. 0 , 6 1 3 / L) に溶解させ、 3—ガラク トシダ一ゼ （生化学工業社製、 f r om J a c k B e a n s, 1 86mU) を加えた。 この溶液を 37°Cで 32時間静置した後、 HPLC分析により反応終 了を確認した。 反応溶液を HPLC (YMC P a c k e d Co l umn D 一 ODS— 5 S - 5 1 2 0 A 〇DS No. 20 2 0 1 7 8、 20 X 2 5 0mm、 展開溶媒は 5 OmM酢酸アンモニゥム水溶液： ァセトニトリル =80 ： 20、 流速 4mL m i n) で精製した。 更に〇D Sカラム （コスモシール 75 C 18_OPN、 1 5 X 100 mm、 最初に H2〇を 5 OmL流し、 次に 25 % ァセ卜二トリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的とする化合物 1 7 (5. 4mg, 収率 68%) が得られた。 得られた化合物の物理的デ一夕は以下 の通りである。
JH-NMR (30°C)
(57. 89 (d， 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c)， 7. 68 (d, 2 H, J = 7. 5H z , Fmo c), 7.49 (dd, 2 H, J = 7. 5H z , Fmo c), 7.42 (dd， 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 4. 99 (d， 1 H, J = 9. 7Hz, G 1 cNAc 1 - H - 1), 4. 91 (s， 1 H, M a n 4 ' 一 H— 1)， 4. 55 (d, 1 H, J = 8. 1 H z , G 1 c NA c 2, 5 ' — H— 1), 4. 09, 4. 07 (s, 1H, Ma n 4 ' _H— 2， Ma n 3 -H- 2), 2. 7 2 (b d, 1 H, J = 15. 5 H z , A s n - /3 CH), 2. 56 (b dd， 1 H, J = 8. 1 H z , 1 5. 5Hz , As n - /3 CH), 2. 07, 2. 05, 1. 89 (e a c h s, e a c h 3H, Ac) ; MS (F a b), C a l c cl f o r C55H77N5NaO30 [M + N a +] 13 10. 5， f o un d, 1 310. 2 参考例 16 化合物 18の合成
化合物 17 (3.4mg, 2. 6 / mo 1 ) とゥシ血清アルブミン 1. 1 mgを HEP E S—緩衝溶液 ( 50 mM, Η^δΓθ， 257 / L ) に—溶解させ、—— N:ァ セチル— 3— D—ダルコサミニダーゼ （シグマアルドリッチ f r om J a c k B e an s, 144mU), 加えた。 この溶液を 37 °Cで 24時間静置した 後、 HPLC分析により反応終了を確認した。 反応溶液を HPLC (YMC P a c k e d Co l umn D— ODS— 5 S - 5 120 A 〇DS No. 2020178, 20 X 250 mm, 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶 液： ァセトニトリル =80 ： 20、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に〇D Sカラム （コスモシール 7 5 C 1 8— OPN、 1 5 1 0 0 mm。 最初に H20 を 5 0mL流し、 次に 2 5.°/。ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したと ころ、 目的とする化合物 1 8 (2. l mg, 収率 7 5 %) が得られた。 得られた 化合物の物理的データは以下の通りである。
^-NMR (3 0°C)
(5 7. 9 1 (d， 2 H, 1 = 7. 5H z , Fmo c ), 7. 7 1 (d, 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c)， 7. 5 1 (d d， 2 H, J = 7. 5 H z , 7. 5H z , F mo c), 7. 4 3 (d d, 2 H, J = 7. 5H z , 7. 5H z , Fmo c), 5. 0
0 (d， 1 H， J = 9. 7 Hz , G 1 c NAc 1— H - 1)， 4. 9 1 (d, 1 H, J = 1. 6 H z , M a n 4 ' — H— 1)， 4. 7 6 ( s , 1 H, M a n 3— H— 1)， 4. 5 8 (d， 1 H, J = 7. 8 H z , G 1 c N A c 2— H - 1 ) , 4. 3 4
( t , 1 H， Fmo c), 4. 0 7 (d, 1 H, J = 2. 7 H z， M a n 4 ' -H — 2)， 3. 9 7 (d d， 1 H, J = 1. 6 Hz , 3. 7H z , Ma n 3 -H- 2), 2. 7 2 (b d d, 1 H， J = 3. 2 H z , 1 5. 1 H z , A s n /3 CH)， 2. 5 2 (b d d, 1 H, J = 8. 9H z , 1 5. 1 H z , A s n _ /3 CH), 2. 0 7, 1. 8 9 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac) ； MS (F a b), C a 1 c d f o r C 7H65N4025 [M + N a +] 1 0 8 5. 4, f o u n d,
1 0 8 5. 3
参考例 1 7 化合物 2 1の合成 .
化合物 9 ( 2 8 m g , 1 6 m ο— Γ一と— シ血清アルブミン 1. 7 mg¾HE PE S緩衝溶液 （5 0mM， p H 5. 0 , 6 2 4 L) に溶解させ、 ノィラミニ ダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om V i b l i o C h o 1 e r a e , 1 1 7mU) を加えた。 この溶液を 3 7°Cで 1 7時間静置した後、 HP L C分析 により反応終了を確認した。 続いて、 反応溶液を HPLC (YMC P a c k e d C o l umn D—〇D S— 5 S— 5 1 2 0 A 〇D S No. 2 0 2 0 1 7 8、 2 0 X 2 5 0mm、 展開溶媒は 5 0 mM酢酸アンモニゥム水溶液： ァ セトニトリル =80 : 20、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に ODSカラ ム （コスモシール 7 5 C 1 8—〇PN、 1 5 X 1 00 mm。 最初に H2〇を 5 0 mL流し、 次に 25%ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的とする化合物 2 1 (1 4. 6mg, 収率 6 8 %) が得られた。 得られた化合 物の物理的デ一夕は以下の通りである。
JH-NMR (30°C)
(5 7. 92 (d, 2H， J = 7. 5Hz , Fmo c ), 7. 7 1 (d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 50 (d el, 2H， J = 7. 5Hz , Fmo c), 7. 43 (d d, 2H, J = 7. 5 H z , Fmo c), 5. 1 2 (s， 1 H, Ma n
4一 H_ l)， 4. 99 (d， 1H， J = 9. 5H z , G 1 c N A c 1 - H— 1 ) , 4. 7 7 (s , 1H， Ma n 3 -H- 1), 4. 57 (d， 2 H, J = 7. 2Hz， G 1 c NAc 2 -H- 1 ), 4. 46 (d, 1 H， J = 7. 8Hz , G 1 6 -H 一 1), 4. 34 ( t, 1H， Fmo c ), 4. 22 (b d, 1 H, J = 2. 7Hz , Ma n 3 -H- 2), 4. 1 9 (b, 1 H, Ma n 4_H - 2)， 2. 72 (b d d， 1H， J = 1 5. 5Hz, As n - CH), 2. 52 (b d d, 1 H, J = 9. 8 Hz, 1 5. 5Hz , A s n— 3 CH), 2. 0 5 (s， 6 H, A c X 2 ), 1. 8 9 (s , 3H, Ac) ； MS (F a b), C a 1 c d f o r C61HS8N503
5 [M + H+] 1450. 5, f o un d, 1450. 3
参考例 1 8 化合物 22の合成
化合物 2 1 (1 0mg, 6. 9 m o 1 ) とゥシ血清アルブミン 1. 6 m gを H EPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH5. 0， 6 7 2 L ) に溶解させ、 /3—ガラ ク卜シダーゼ （生化学工業社製、 f r om J a c k B e a n s , 2 0 5m U) を加えた。 この溶液を 37°Cで 20時間静置した後、 HPLC分析により反 応終了を確認した。 反応溶液を HP LC (YMC P c k e d C o l umn D-OD S - 5 S - 5 1 2 0 A ODS No. 202 0 1 78、 2 0 X 2 50mm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液： ァセトニ卜リル = 8 0 : 2 0、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に〇D Sカラム （コスモシール 7 5 C 1 8—〇PN、 1 5 1 0 0mm, 最初に H2〇を 5 OmL流し、 次に 2 5 ¾ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的とする化合物 2 2 ( 5. 6mg, 収率 6 4 %) が得られた。 得られた化合物の物理的データは 以下の通りである。
^- MR (3 0°C)
5 7. 8 7 (d， 2 H, J = 7. 5H z , Fmo c)' 7. 6 7 (d， 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c), 7. 4 8 (d d, 2 H, J = 7. 5H z , Fmo c), 7. 4 1 (d d， 2H, J = 7. 5Hz , Fmo c), 5. 1 2 (s , 1 H, Ma n
4一 H— 1), 4. 9 9 (d, 1 H, J = 9. 7H z， G l c N A c 1 - H— 1 )， 4. 7 6 (s , 1 H, M a n 3 - H - 1 ) , 4. 5 5 (d, 2 H, J = 8. 6 Hz， G 1 c NA c 2 , 5— H— 1 ), 4. 2 6 ( t , 1 H， Fmo c ), 4. 2 2 (d, 1 H, J = 2. 2 Hz， Ma n 3 - H - 2)， 4. 1 8 (b d d， 1 H, J = 1. 3 Hz , 3. 3 H z , Ma n 4 -H- 2), 2. 7 2 (b d, 1 H, J = 1 5. 5Hz， A s n - /3 CH)， 2. 54 (b d d, 1 H, J = 9. 5H z , 1 5. 5Hz , A s n— /3 CH), 2. 0 5 (s , 6 H, A c X 2), 1. 8 8 (s， 3 H, Ac ) ； M
5 (F a b), C a 1 c d f o r C55H78N5O30 [M + H+] 1 2 8 8. 5, f o u n d, 1 2 8 8. 3
参考例 1 9 化合物 2 3の合成
化合物 2 2 (3. 6mg, 2. 8 m o 1 ) とゥシ血清アルブミン 1. 2 m gを HE P E S緩衝溶液 （5 0mM, pH 5. 0, 2 7 7 L ) に溶解させ、 N—ァ セチル _iS _D—ダルコサミニダーゼ （シグマアルドリッチ f r om J a c k B e a n s , 1 9 5mU) を加えた。 この溶液を 3 7 °Cで 24時間静置した 後、 HPL C分析により反応終了を確認した。 反応溶液を HPL C (YMC P a c k e cl C o l umn D—〇D S— 5 S— 5 1 2 0 A 〇D S No. 2 0 2 0 1 7 8、 2 0 X 2 5 0mm、 展開溶媒は 5 0 mM酢酸アンモニゥム水溶 液：ァセトニトリル =80 : 20、 流速 4mL/m i n) で精製した。 更に OD Sカラム （コスモシール 7 5 C 1 8—〇PN、 1 5 X 1 00mm、 最初に H2〇 を 50mL流し、 次に 2 5%ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したと ころ、 目的とする化合物 2 3 (2. 3mg, 収率 7 7 ? ) が得られた。 得られた 化合物の物理的データは以下の通りである。
XH-NMR (30。C)
57. 9 1 (d， 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 70 (d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 50 (d d, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 43 (d d， 2 H, J = 7. 5 H z , Fmo c), 5. 1 1 (s , 1 H, Ma n
4一 H— 1)， 4. 99 (d， 1 H, J = 9. 7Hz， G 1 c NA c 1— H— 1 )， 4. 7 7 (s， 1 H, Ma n 3— H— 1)， 4. 57 (d, 1 H, J = 6. 5Hz , G l c NAc— H - 1)， 4. 33 ( t , 1 H， Fmo c), 4. 22 (d， 1 H， J = 3. 0 H z , Man 3 -H- 2), 4. 07 (b d d, 1H, J = 2. 1 Hz , M n -H- 2), 2. 7 2 (b d d, 1 H, J = 1 5. 5Hz , A s n— /3 C H)， 2. 52 (b d d, 1H， J = 8. 9Hz , 1 5. 5H z , As n- β CH), 2. 05, 1. 89 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac) ； MS (F ab),
C a 1 c d f o r C47H65N4025 [M + H + ] 1 085. 4, f o un d, 1 085. 3
参考例 20 化合物 1 1の合成
化合物 1 0 ( 1 2 3mg， 6 2 ^mo 1 ) とゥシ血清アルブミン （ 1. 1m g) を HEPES緩衝溶液 （50mM， H 5. 0, 2. 5mL) に溶解させ、 β 一ガラクトシダーゼ （生化学工業社製、 f r om J a c k B e a n s , 24 liL, 6 1 2mU) を加えた。 この溶液を 37 °Cで 6 1時間静置した後、 HPL C分析により反応終了を確認した。 反応溶液を凍結乾燥し、 続いて HPLC (Y MC P a c k e d C o l umn D-OD S - 5 S— 5 1 20 A OD
5 No. 20 20 1 7 8、 20 X 2 50 mm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモ ニゥム水溶液： ァセトニトリル = 80 ： 20、 流速 3. 5 m L /m i n ) で精製 した。 更に〇D Sカラム （コスモシール 75 C 1 8— OPN、 1 5 100 mm。 最初に H20を 5 OmL流し、 次に 25 %ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的とする化合物 1 1 (71mg， 収率 70%) が得られた。 得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
JH-NMR (30。C)
(57. 91 (d， 2H, J = 7. 5 H z , Fmo c), 7. 71 (d， 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 7. 50 (d d， 2H, J = 7. 5H z , Fmo c), 7.43 (dd, 2 H, J = 7. 5Hz, Fmo c), 5. 1 1 (s， 1 H， Man
4 - H - 1 ) , 4. 99 ( 1 H, d, J = 9. 9H z , G 1 c N A c 1— H— 1 ) , 4. 9 1 (s， 1 H, M a n 4 ' 一 H— 1)， 4. 76 ( s , 1 H， M a n 3 -H 一 1), 4. 55 (d， 2 H, J =8. 6Hz, G 1 c NA c 2 , 5—H— 1)， 4. 34 (t, 1 H, Fmo c), 4. 24 (s， 1 H, Ma n 3 -H- 2), 4. 1 8 (s, 1 H, M a n 4 -H- 2), 4. 10 (s, 1H, Ma n 4 ' 一 H 一 2), 2. 72 (b cl, 1 H， J = 1 5. 5H z , A s n - 3 CH), 2. 5 1
(bdd， 1 H, J = 9. 0 H z , 1 5. 5Hz, As n - 3 CH), 2. 06 (s , 3H， Ac), 2. 05 (s , 6H， A c X 2), 1. 88 (s , 3H, A c ) ; H RMS C a 1 c d f o r C 69 H ! 00 NQ N a O 40 [M + N a +] 1675.
5873, f oun d, 1675. 5841
参 例 2： f 化合物' 12の合成
化合物 1 1 (50mg, 30 ^mo 1 ) とゥシ血清アルブミン 2. 0 m gを H EPE S緩衝溶液 （5 OmM, H 5. 0 , 920 ^L) に溶解させ、 N—ァセ チルー β— D—ダルコサミニダーゼ （シグマアルドリッチ社製、 f r om J a c k B e an s, 2. 1 U) を加えた。 この溶液を 37 °Cで 48時間静置した 後、 HPLC分析により反応終了を確認した。 反応溶液を HPLC (YMC P a c k e d Co l umn D— ODS— 5 S— 5 120 A OD S No. 2020 1 7 8、 20 X 250mm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶 液： ァセトニトリル =80 ： 20、 流速 AmLz m i n) で精製し、 凍結乾燥を 行った。 この残留物を ODSカラム （コスモシール 7 5 C 1 8—〇PN、 1 5 X 1 00mm, 最初に H2〇を 5 OmL流し、 次に 2 5 %ァセトニトリルを流して 溶出させた） で脱塩したところ、 目的とする化合物 1 2 (2 5mg, 収率 6 6%) が得られた。 得られた化合物の物理的デ一夕は以下の通りである。
JH-NMR (30。C)
0 7. 9 1 (d， 2H， J = 7. 5H z , Fmo c), 7. 70 (d, 2 H, J = 7. 5Hz， Fmo c)， 7. 50 (d d， 2H， J = 7. 5H z , Fmo c ), 7. 43 (d d， 2 H, 1 = 7. 5 H z , Fmo c ), 5. 10 (s， 1 H, Ma n 4一 H_ l)， 4. 99 (d, 1 H, J =9. 7Hz， G 1 c N A c 1— H— 1 ) , 4. 9 1 (b d， 1H, J = 1. 6Hz, M a n 4 ' - H - 1 ) , 4. 77 (s， 1 H, M a n 3 -H- 1 ), 4. 58〜 4. 52 (b， 1H, G 1 c NA c 2 - H- 1), 4. 33 ( t , 1 H, Fmo c ), 4. 24 (b s , 1 H, M a n 3 -H- 2), 4. 06 (d d, 1 H, J = 1. 6H z, 3. 2H z , Ma n 4 -H- 2), 3. 97 (d d, 1H, J - 1. 6Hz, 3. 5Hz , Ma n 4 ' — H— 2), 2. 7 2 (b d， 1 H, J = 1 5. 5Hz， A s n - /3 CH), 2. 53 (b d d， 1 H, J = 9. 0 H z , 1 5. 5Hz , As n - /3 CH), 2. 0 5, 1. 8 8 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac),
— 参考例 22 化合物 1 3の合成
化合物 1 2 (1 Omg, 1 1 ^mo 1 ) とゥシ血清アルブミン 0. 9 m gを H E P E S緩衝溶液 （5 OmM, H 5. 0 , 440 ^ L) に溶解させ、 ひ一マン ノシダーゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om J a c k B e a n s , 30 L, 3. 2U) を加えた。 この溶液を 3 7°Cで 2 1時間静置した後、 HPLC 分析により反応終了を確認した。 続いて HPLC (YMC P a c k e d C o 1 umn D-OD S - 5 S— 5 1 2 0 A ODS No. 202 0 1 7 8、 2 0 X 2 5 0 mm, 展開溶媒は 5 0 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリ ル = 8 0 ： 2 0、 流速 4mLZm i n) で精製を行った。 更に OD Sカラム （コ スモシール 7 5 C 1 8—〇PN、 1 5 X 1 0 0 mm, 最初に H20を 5 OmL流 し、 次に 2 5 %ァセトニトリルを流して溶出させた） で脱塩したところ、 目的と する化合物 1 3 (3mg, 収率 43 %) を得た。 得られた化合物の物理的データ は以下の通りである。
一 NMR (3 0。C)
6 7. 9 2 (d, 2 H， J = 7. 5H z， Fmo c)， 7. 7 1 (d, 2 H, J = 7. 5Hz , Fmo c), 7. 5 1 (d d, 2 H, 1 = 7. 5H z , Fmo c), 7. 4 3 (d d, 2H， J = 7. 5H z , Fmo c), 4. 9 9 (d， 1 H， J = 9. 5 H z , G l c NA c l - H— 1 )， 4. 7 6 ( s , 1 H, M a n 3 - H - 1 ), 4. 5 7 (1 H, G 1 c NAc 2— H— 1 ), 4. 0 6 (d， 1 H, J = 3. 2 Hz， Ma n 3 -H- 2), 2. 7 2 (b d, 1 H, J = 1 5. 5Hz , A s n - β CH), 2. 5 2 (b d d， 1 H, J = 8. 3H z， 1 5. 5Hz , A s n - β CH), 2. 0 5, 1. 8 9 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac),
(糖鎖ァスパラギン誘導体の Fmo c基の脱保護）
全ての糖鎖ァスパラギン誘導体において、 以下の手順で Fmo c基の脱保護を 行った。 まず、 糖鎖ァスパラギン Fmo c体 1 mo 1あたりに 24 0 Lの N, N—ジメチルホルムアミド、 1 6 0 Lのモルホリンを加え、 室温 'ァルゴ ン雰囲気下で反応させた。 TL C (展開溶媒として 1 M 酢酸アンモニゥム：ィ ソプロパノール = 8 ： 5を用いた） にて反応終了を確認した後、 氷水で冷却した。 ここにジェチルエーテルを反応溶液の 1 0倍量加えて 1 5分間攪拌した後、 析出 した沈殿物をろ別した。 得られた残渣を水に溶解させ、 3 5°Cでエバポレー卜し た。 更にトルエンを 3 m L加えエバポレートするという操作を三回繰り返した。 残留物を逆相カラムクロマトグラフィー （コスモシール 7 5 C 1 8 _OPN、 1 5 X 1 0 0mm, 展開溶媒は水） により精製した。 参考例 2 3 化合物 3 3の合成
化合物 1 0 ( 1 0. 5mg， 5. 3 /^mo 1 ) を上記の操作で 7時間反応させた ところ、 目的とする化合物 3 3 (7mg， 収率 7 6 %) が得られた。 得られた化 合物は1 H— NMRが標品と一致したことから確認した。
参考例 24 化合物 2 6の合成
化合物 3 (8. 0mg， 3. 8 ^mo 1 ) を上記の操作で 2 1時間反応させたと ころ、 目的とする化合物 2 6 (6. 3mg, 収率 8 8 %) が得られた。 得られた 化合物の物理的データは以下の通りである。
^-NMR (3 0。C)
(5 5. 1 3 ( s , 1 H, Ma n 4 - H - 1)， 5. 0 7 (d， 1 H, J = 9. 9Hz , G 1 c NAc 1 _H - 1 )， 4. 9 5 (s， 1 H, Ma n 4 ' 一 H— 1)， 4. 7 8
(s , 1 H, M n 3 -H- 1 ), 4. 6 2 (2 H, G 1 c NA c 2, 5 ' 一 H— 1)， 4. 5 6 (d, 1 H， J = 8. 1 H z , G 1 c N A c 5 - H _ 1 )， 4. 5 2
(d， 1 H， 1 = 7. 8 H z , G a 1 6 ' 一 H— 1 ), 4. 2 5 (b s , 1 H， M a n 3 -H- 2), 4. 1 9 (b s , 1 H, Ma n 4 ' — H— 2)， 4. 1 2 (b s， 1 H, Ma n 4 -H- 2), 2. 94 (d el, 1 H, J =4. 5H z , 1 7. 0Hz , A s n - /3 CH), 2. 8 5 (d d, 1 H, J = 6. 8 H z , 1 7. 0Hz , A s n - i3 CH), 2. 6 8 (d d， 1 H， J = 4. 6 H z , 1 2. 4H z , N e uA c 7 ' -H- 3 e q), 2. 0 8 , 2. 0 7， 2. 0 6 , 2. 0 4, 2. 0 2 (e a c h s , e a c h 3H， A c), 1. 7 2 (d d, 1 H， J = 1 2. 1 H z , 1 2. 1 Hz , N e uAc 7 ' -H- 3 a x) ; MS (F a b), C a l c cl f o r C 71H118N7051 [M + H + ] 1 8 84. 7, f o u n d, 1 8 8 4. 5
参考例 2 5 化合物 2 7の合成
化合物 4 ( l l. Omg, 5. 8 /zmo l ) を上記の操作で 2 3時間反応させた ところ、 目的とする化合物 2 7 (8. 5mg, 収率 8 8 %) で得られた。 得られ た化合物の物理的データは以下の通りである。 JH-NMR (30°C)
5 5. 1 1 (s， 1H, Ma n 4 - H— 1), 5. 08 (d, 1 H, J = 9. 7Hz , G 1 c NAc 1 -H- 1 ), 4. 95 (s , 1 H， Ma n 4 ' - H - 1), 4. 7 8
(s , 1 H， Ma n 3 -H- 1 ), 4. 62 (d, 2H， G 1 c NAc 2, 5 ' 一 H - 1), 4. 45 (d, 1 H, J = 7. 6 H z , G a 1 6 ' 一 H— 1)， 4. 26
(b d， 1 H, Ma n 3 -H- 2), 4. 1 2 (b d, 1 H, Ma n 4 ' 一 H— 2), 4. 08 (bd d， 1 H, J = 1. 6Hz, 3. 3H z , M a n 4 - H - 2 ) , 2. 94 (d d, 1 H, J = 4. 0 H z , 1 7. 2 H z , A s n - /3 CH), 2. 8 5 (d d, 1H, J = 7. 2Hz, 1 7. 2 H z , As n— /3 CH), 2. 68 (d d, 1H， J = 4. 1 H z , 1 2. 1 Hz, N e u A c 7 ' - H - 3 e q ) , 2. 0 9, 2. 07, 2. 04, 2. 02 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac), 1. 7 2 (d d, 1 H, J = 1 2. 1 H z , 1 2. 1 H z , N e u A c 7 ' 一 H— 3 a x ) , ； M S (F a b), C a 1 c d f o r C63H104N6NaO46 [M + N a +] 1 703. 6, f o un d, 1 703. 1
参考例 26 化合物 28の合成
化合物 5 (7. 0mg， 4. 0 mo 1 ) を上記の操作で 2 1時間反応させたと ころ、 目的とする化合物 2 8 (5. 3mg, 収率 8 7 %) が得られた。 得られた 化合物の物理的データは以下の通りである。
一 NMR (30°C)
5 5. 07 (d， 1 H, J = 9. 4H z , G 1 cNAc 1 -H- 1), 4. 94 (s， 1 H, Ma n 4 ' 一 H - 1), 4. 76 (s， 1 H, Ma n 3— H— 1), 4. 61, 4. 59 (e a c h d, e a c h 1 H, G 1 c NA c 2, 5 ' — H - 1), 4. 44 (d, 1 H, J = 7. 8 H z , G a 1 6 ' 一 H - 1), 4. 1 0, 4. 07 (e a c h 1 H, Ma n 4 ' , 3 -H- 2), 2. 93 (d d, 1 H, J =4. 6 Hz , 1 7. 5Hz, As n- /3 CH), 2. 85 (d d， 1 H, 1 = 7. 0Hz , 1 7. 5Hz, A s n— 3 CH), 2. 6 7 (d d, 1 H, J =4. 6Hz , 1 2. 2Hz， N e u Ac 7 ' 一 H - 3 e q)， 2. 08， 2. 06, 2. 02, 2. 0 1 (e a c h s， e a c h 3H， Ac), 1. 7 1 ( 2 H, d d， J = 1 2. 2 Hz , 1 2. 2Hz, N e u A c 7 ' 一 H_ 3 a x) ; MS (F a b), C a l c d f o r C57H94N6N a041 [M + N a +] 1 541. 5, f o u n d, 1 54 1. 3
参考例 27 化合物 30の合成
化合物 7 ( 1 3. 9mg, 6. 6 iimo 1 ) を上記の操作で 7時間反応させたと ころ、 目的とする化合物 3 0 (8. Omg, 収率 64%) を得た。 得られた化合 物の物理的データは以下の通りである。
!H-NMR (30。C)
δ 5. 1 3 (s , 1H, Ma n 4 -H- 1 ), 5. 06 (d， 1 H， J = 9. 9 H z , G 1 c NA c 1 -H- 1 ), 4. 9 1 (s , 1 H， M a n 4 ' — H - 1)， 4. 77 (s , 1 H, Ma n 3 -H- 1 ), 4. 6 1 , 4. 60 (e a c h d , e a c h 1H， J = 8. 0 H z , G 1 c NA c 2, 5 -H- 1 ), 4. 55 (d， 1 H, J = 8. 4Hz, G 1 c NAc 5 ' — H— 1), 4. 44 (d, 1 H, J = 8. OH z , Ga 1 6 -H- 1), 4. 24 (b d， 1 H, Ma n 3— H— 2), 4. 1 9 (b d d, 1 H， J = 1. 3 H z , 3. 2Hz, M a n 4 ' - H - 2 ) , 4. 10 (b d d, 1 H， J = 1. 4H z , 3. 2Hz, Man 4— H— 2)， 2. 90 (d d, 1 H， J =4. 5Hz, 16. 7Hz, As n - |8 CH)， 2. 80 (d d， 1 H， J = 7. 5Hz , 1 6. 7Hz , A s— n— /3 CH), 2. 66 ( d cl , 1—H—， J = 4. 6 Hz， 1 2. 4Hz, Ne uAc 7 -H- 3 e q), 2. 07, 2. 06, 2. 05, 2. 02, 2. 0 1 (e a c h s， e a c h 3 H, Ac), 1. 7 1 (d d, 1 H, J = 1 2. 4Hz， 1 2. 4Hz , Ne uAc 7 -H- 3 a x) ; MS (F a b), C a l c d f o r C71H117N7Na051 [M + N a +] 1 906. 7, f o u n d, 1 906. 1
参考例 28 化合物 3 1の合成 化合物 8 (8. Omg, 4. 2 mo 1 ) を上記の操作で 1 2時間反応させたと ころ、 目的とする化合物 3 1 (6. Omg, 収率 8 6.%) を得た。 得られた化合 物の物理的データは以下の通りである。
XH-NMR (3 0°C)
(5 5. 1 2 (s , 1 H, Ma n 4 -H- 1 ), 5. 0 6 (d, 1 H, J = 9. 5Hz , G 1 c NAc 1— H— 1 ), 4. 9 1 (s , 1 H, Ma n 4 ' —H— 1)， 4. 7 7
( s， l H, M a n 3— H— 1)， 4. 6 1 , 4. 5 9 (e a c h d, e a c h 1 H， G 1 c NAc 2, 5 _H - 1 ), 4. 4 3 (d， 1 H， J = 8. 0Hz , G a
1 6—H— l), 4. 24 (b d， 1 H, M a n 3 - H - 2), 4. 1 8 (b d d， 1 H, M a n 4 ' 一 H— 2), 2. 9 1 (b d, 1 H， J = 1 7. 0H z , A s n - 3 CH), 2. 8 1 (d d, 1 H, J = 6. 5H z , 1 7. OH z , A s n - /3 C H), 2. 6 6 (d d， 1 H, J =4. 6 Hz， 1 2. 6 H z , e uAc 7 -H- 3 e q ) , 2. 0 6 , 2. 0 6 , 2. 0 2 , 2. 0 0 (e a c h s， e a c h 3 H, Ac), 1. 7 0 (d d, 1 H, J = 1 2. 6 H z , 1 2. 6 H z , Ne uAc 7 -H- 3 a x) ； MS (F a b), C a 1 c cl f o r C63H104N6N aO 46 [M + N a +] 1 7 0 3. 6, f o u n d, 1 7 0 3. 0
参考例 2 9 化合物 3 2の合成
化合物 9 (7. 7mg， 4. 4 n o 1 ) を上記の操作で 2 3時間反応させたと ころ、 目的とする化合物 3 2 (5. 2mg, 収率 7 8 %) で得られた。 得られた 化合物の物理 テ'一夕は以下め通 である。
W - NMR (3 0°C)
5 5. 1 4 (s， 1 H， Ma n 4 -H- 1), 5. 0 7 (cl, 1 H, J = 9. 4Hz， G 1 c NAc 1 - H - 1)， 4. 7 8 ( s， 1 H， Ma n 3 -H- 1), 4. 6 1， 4, 6 0 (e a c h d, e a c h 1 H， G 1 c NAc 2, 5 -H- 1 ), 4. 44 (d,' l H, J = 8. 0Hz , G a l 6— H— 1 ), 4. 2 3 (d， 1 H, J = 3. 0H z , Ma n 3— H— 2), 4. 1 9 (b d d， 1 H, J = 1. 3Hz , 2. 9Hz , Ma n 4 -H- 2), 2. 9 2 (d d, 1 H, J =4. 1 Hz ,
1 7. 2 H z , A s n - /3 CH), 2. 8 3 (d d, 1 H， J = 7. 5Hz ,
1 2. 7 H z , A s n - /3 CH), 2. 6 7 (d d, 1 H, J =4. 6Hz ,
1 2. 7 Hz , Ne uAc 7 -H- 3 e q), 2. 0 6 (s， 6 H, Ac X 2), 2. 0 3 , 2. 0 1 (e a c h s e a c h 3 H， Ac), 1. 7 1 (d d， 1 H， J = 1 2. 7 H z , 1 2. 7 H z , Ne uA c 7 -H- 3 x) ; MS (F a b), C a 1 c d f o r C 57H94N6N a 04ュ [M + N a +] 1 54 1. 5, f o u n d, 1 54 1. 2
参考例 3 0 化合物 3 7の合成
化合物 1 4 (9. lmg, 5. 0 mo l ) を上記の操作で 1 3時間反応させた ところ、 目的とする化合物 3 7 (6. 5mg， 収率 7 7 %) で得られた。 得られ た化合物の物理的デ一夕は以下の通りである。
^-NMR (3 0°C)
(5 5. 1 1 (s , 1 H， Ma n 4 -H- 1 ), 5. 0 6 (d, 1 H, J = 9. 5Hz , G 1 c NAc 1 - H— 1 )， 4. 9 2 (s , 1 H， Ma n 4 ' _H - 1), 4. 7 5
( s， 1 H, Ma n 3— H— 1 ), 4. 6 1， 4. 5 7 , 4. 5 5 (e a c h d, e a c h 1 H, J = 7. 5 H z , G 1 c NA c 2, 5, 5 ' 一 H - 1 ), 4. 46
(d， 1 H， J = 7. 3 H z , G a 1 6 ' — H - 1 ), 4. 2 3 (b s , 1 H, M a n 3 -H- 2), 4. 1 8 (b s， 1 H, Ma n 4 ' — H— 2)， 4. 1 0 (b s , 1 H， Ma n 4 -H- 2), 2. 8 7 (d d， 1 H, J =— 4. 8 H z： 1—7 0 H z， A s n - /3 CH), 2. 7 6 (d d, 1 H, J = 7. 2 H z , 1 7. 0Hz , A s n - ]3 CH), 2. 0 7 (s , 3H， Ac), 2. 0 4 ( s， 6 H, Ac X 2), 2. 0 0 (s , 3 H, Ac ) ； MS (F a b), C a l c d f o r C60H10。N6N a043 [M + N a +] 1 6 1 5. 6， f o u n d, 1 6 1 5. 0
参考例 3 1 化合物 42の合成
化合物 1 9 (9. 8mg， 5. 4 m o 1 ) を上記の操作で 1 3時間反応させた JP2003/016682
48 ところ、 目的とする化合物 42 (8. Omg, 収率 8 8 %) で得られた。 得られ た化合物の物理的データは以下の通りである。
!H-NMR (30°C)
55. 1 1 (s， 1H， Ma n 4 -H- 1), 5. 06 (d， 1 H, J = 9. 5Hz , G 1 cNAc 1— H— 1), 4. 9 1 (s， 1 H， Ma n 4 ' 一 H - 1), 4. 76 (s， 1 H， Ma n 3 -H- 1 ), 4. 60, 4. 57, 4. 55 (e a c h d, e a c h 1 H, G 1 c NAc 2, 5, 5 ' — H - 1), 4. 46 (d， 1 H， J = 7. 8Hz, G a 1 6 -H- 1 ), 4. 2 8 (s， 1 H, Man 3 -H- 2), 4. 1 8 (s , 1 H， M a n 4 ' —H - 2)， 4. 1 0 (s , 1 H， M a n 4 - H 一 2)， 2. 8 8 (d d, 1 H, J =4. OHz , 1 6. 6Hz, As n— /3 CH), 2. 7 7 (d d， 1H， J = 7. 5H z , 1 6. 6Hz， A s n— /3 CH), 2. 0 7 (s , 3H， Ac), 2. 04 (s， 6H, Ac X 2), 2. 00 (s , 3H， A c ) ； M S (F a b), C a 1 c d f o r C 60 H 0 i N 6 O 43 [M+H + ] 1 593. 6， f o und, 1 593. 8
参考例 32 化合物 38の合成
化合物 1 5 (5. lmg, 3. 2 a mo 1 ) を上記の操作で 1 1時間反応させた ところ、 目的とする化合物 38 (4. Omg, 収率 9 1 °/。） が得られた。 得られ た化合物の物理的デ一夕は以下の通りである。
— NMR (30°C)
(55. 1 0 (s , 1U, Ma n 4 - H- 1)； 5. 07 (d, Ή'— J = 9. 4 Hz， G 1 c NAc 1— H - 1)， 4. 9 2 (s， 1 H, M a n 4 ' 一 H - 1)， 4. 76 (s， 1 H, Ma n 3 -H- 1 ), 4. 6 1， 4. 57 (e a c h d， e a c h 1 H, J = 7. 8Hz, G 1 c NAc 2, 5 ' 一 H— 1), 4. 47 (d， 1 H, J =7. 8Hz, G a 1 6 ' — H - 1)， 4. 24 (d, 1 H， J = 2. 3Hz， M n 3 -H- 2), 4. 1 0， 4. 0 6 (e a c h b d， e a c h 1 H， Ma n 4 ' , 4 -H- 2), 2. 90 (cl d, 1 H， J =4. 2Hz , 1 6. 8Hz , A s n - /3 CH), 2. 8 1 (d el, 1H, J = 7. 3Hz , 1 6. 8Hz , A s n ~ β CH), 2. 0 7, 2. 04， 2. 0 1 (e a c h s， e a c h 3H, Ac) ； MS (F a b), C a 1 c d f o r C52H88N5〇38 [M + H + ] 1 3 90. 5, f o un d, 1 390. 1
参考例 33 化合物 72の合成
化合物 70 (4. Omg, 2. 8 mo 1 ) を上記の操作で 1 3時間反応させた ところ、 目的とする化合物 72 (2. 9mg, 収率 8 5 %) で得られた。 得られ た化合物の物理的データは以下の通りである。
】H - NMR (30。C)
(55. 09 (s， 1H， Ma n 4-H- 1), 5. 06 (d, 1 H, J = 9. 8Hz , G 1 c NAc 1— H— 1 )， 4. 9 1 (s , 1 H， Ma n 4 ' — H - 1), 4. 76 (s， 1 H, Ma n 3 -H- 1), 4. 6 1 , 4. 54 (e a c h d， e a c h 1 H, G 1 c NAc 2, 5— H_ l), 4. 24 (s， 1 H， Ma n 3 -H- 2), 4. 1 0, 4. 0 6 (e a c h b s， e a c h 1 H, M a n 4 , 4 ' — H— 2), 2. 87 (d d, 1 H, J = 1 7. 2 Hz , As n— /3 CH), 2. 76 (d d, 1 H, J = 6. 5 H z , 1 7. 2Hz, As n— i3 CH), 2. 07, 2. 04， 2. 0 0 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac) ； MS (F a b), C a l c cl f o r C46H78N 5033 [M + H+] 1 22 8. 5, f o u n d, 1 2 28. 3
参考例 34 化合物 43の合成
化合物 20 (5. 4mg, 3. 3 mo 1 ) を上記の操作で 1 1時間反応させた ところ、 目的とする化合物 43 (4. lmg, 収率 8 7 %) で得られた。 得られ た化合物の物理的データは以下の通りである。
^-NMR (30。C)
(55. 1 1 (s , 1H, Ma n 4-H- 1), 5. 07 (d, 1 H， J = 9. 5Hz , G 1 c NAc 1 -H- 1 ), 4. 9 1 (s , 1 H， Ma n 4 ' 一 H— 1)， 4. 77 ( s , 1 H, Ma n 3 -H- 1 ), 4. 6 1 , 4. 5 7 (e a c h d, e a c h 1 H， G 1 c NAc 2, 5— H— 1 ), 4. 46 (d, 1 H, G a l 6— H— 1)， 4. 2 4 ( s , 1 H, M a n 3 -H- 2), 4. 1 8 (b s , 1 H， M a n 4 - H 一 2), 2. 9 0 (d d， 1 H, J =4. 0 Hz， 1 7. 0 H z , A s n- /3 CH), 2. 8 0 (d d， 1 H， J = 7. 3 H z , 1 7. OH z , A s n- β CH), 2. 0 7 , 2. 0 4， 2. 0 1 (e a c h s， e a c h 3 H, A c ) ； M S (F a b)， C a 1 c cl f o r C52H88N503 S [M + H + ] 1 3 9 0. 5， f o u n d, 1 3 9 0. 2
参考例 3 5 化合物 7 3の合成
化合物 7 1 (4. Omg, 2. 8 z^mo 1 ) を上記の操作で 1 3時間反応させた ところ、 目的とする化合物 7 3 (2. 9mg, 収率 8 5 %) で得られた。 得られ た化合物の物理的デ一夕は以下の通りである。
JH-NMR (3 0°C)
δ 5. 1 1 (s , 1 H, Ma n 4-H- 1), 5. 0 6 (cl, 1 H, J = 9. 9Hz , G 1 c NAc 1— H - 1), 4. 9 1 ( s , 1 H， Ma n 4 ' 一 H— 1 ), 4. 7 7
( s , 1 H， M a n 3 -H- 1 ), 4. 6 0 , 4. 54 (e a c h d, e a c h 1 H, J = 7. 9 H z , G 1 c NA c 2, 5— H— 1 ), 4. 24 (s , 1 H, M a n 3 - H- 2), 4. 1 8 (d d, 1 H， J = 1. 6H z , 1. 6 H z , Ma n 4 - H— 2)， 3. 9 6 ( 1 H, d d, J = 1. 6 H z , 1. 6 H z， M a n 4 -H- 2), 2. 8 8 (d d, 1 H， J = 4. 3 H z , 1 6. 8 H z , A s n_ /3 CH)， 2. 7 7 (d d, 1 H, J = 7. 2 H z , 1 6. 8H z , A s n - β Ο ), 2. 0 6 , 2. 0 4 , 2. 0 0 (e a c h s， e a c h 3 H, A c ) ; MS (F a b), C 1 c d f o r C46H78N5033 [M + H+] 1 2 2 8. 5 , f o u n d, 1 2 2 8. 3
参考例 3 6 化合物 3 9の合成
化合物 1 6 (2. 2mg， 1. 5 mo 1 ) を上記の操作で 7時間反応させたと ころ、 目的とする化合物 3 9 ( 1. 6 m g , 収率 84%) で得られた。 得られた 化合物の物理的データは以下の通りである。
!H-NMR (30°C)
(5 5. 07 (d, 1 H, J = 9. 7Hz, G 1 c NA c 1 _H - 1 )， 4. 92 ( s 1 H, M a n 4 ' — H— 1)， 4. 7 5 (s , 1 H， Man 3 _H— 1)， 4. 62 4. 58 (e a c h d， e a c h 1 H， G 1 c N A c 2 , 5— H _ 1 )， 4. 0 9， 4. 08 (e a c h s， e a c h 1 H, Ma n 3, 4 ' -H- 2), 2. 9 1 (d d， 1H， J =4. 1 Hz , 1 6. 9Hz , As n- 3 CH), 2. 8 1 (d d， 1 H, J = 6. 8 H z , 1 6. 9Hz , As n - j3 CH), 2. 08, 2. 04， 2. 0 1 (e a c h s , e a c h 3 H, 'Ac) ； MS (F a b), C a 1 c d f o r C46H77N5N aOS 3 [M + N a +] 1 2 50. 4, f o u n d, 1 2 50. 3
参考例 3 7 化合物 40の合成
化合物 1 7 (1. 5mg, 1. 2 mo 1 ) を上記の操作で 14時間反応させた ところ、 目的とする化合物 40 (1. lmg, 収率 8 9 %) で得られた。 得られ た化合物の物理的データは以下の通りである。
!H-NMR (30。C)
0 5. 07 (d, 1H， J = 9. 5Hz, G 1 c N A c 1 _ H— 1 )， 4. 9 1 ( s , 1 H, a n 4 ' 一 H— 1)， 4. 76 (s , 1H， Man 3 -H- 1), 4. 62, 4. 55 (e a c h d, e a c h 1 H, G 1 c N A c 2 , 5 - H- 1 ), 4. 1 0， 4. 07 (e a c h s , e a c h 1H， Ma n 4 ' , 3 -H- 2), 2. 8 9 (d d， l H, J = 3. 7Hz, 1 7. 0Hz , As n- β CH), 2. 79 (d d， 1 H, J = 7. 0 H z , 1 7. 0Hz, As n - jS CH), 2. 07, 2. 05， 2. 0 1 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac) ； MS (F a b), C a l c d f o r C40H67N5Na〇28 [M + N a +] 1 08 8. 4, f o u n d, 1 0 88. 2 参考例 38 化合物 41の合成
化合物 1 8 (1. 3mg, 1. 2 ^mo 1 ) を上記の操作で 14時間反応させた ところ、 目的とする化合物 4 1 (0. 8mg, 収率 80 %) で得られた。 得られ た化合物の物理的データは以下の通りである。
^-NMR (30°C)
(55. 07 (d, 1 H, J = 9. 5 H z , G 1 c N A c 1— H— 1 )， 4. 9 1 (s , 1 H, M a n 4 ' — H— 1)， 4. 76 (s， 1 H, Man 3 - H - 1)， 4. 62 (d, 1H， J = 7. 8 Hz , G 1 c NAc 2 - H— 1 ), . 08 (d, 1 H, J = 2. 9Hz, Ma n 3— H - 2), 2. 92 (d d, 1 H, J = 3. 9Hz , 1 7. 3Hz , A s n - /3 CH), 2. 83 (d d, 1 H， J = 7. 0Hz , 1 7. 3 Hz, A s n - /3 CH), 2. 07, 2. 0 1 (e a c h s , e a c h 3 H, Ac) ； MS (F a b)， C a l c d f o r C32H55N4027 [M+H+] 863. 3, f o un d 863. 2
参考例 39 化合物 44の合成
化合物 2 1 (2. 3mg, 1. 6 mo 1 ) を上記の操作で 7時間反応させたと ころ、 目的とする化合物 44 ( 1. 6 m g , 収率 84%) で得られた。 得られた 化合物の物理的データは以下の通りである。
2H-NMR (30。C)
ό、 5. 1 1 (s， 1H, Ma n 4-H- 1), 5. 06 (d， 1 H， J = 9. 8Hz , G 1 c NAc 1— H— 1 )， 4. 7 7 (s， 1 H, M a n 3 - H- 11, 4. 6 1 , 4. 5 7 (e a c h d， e a c h 1 H, G 1 c NA c 2, 5 - H - 1 ), 4. 46 (d， 1H， J = 7. 8Hz, Ga l - H— 1), 4. 22, 4. 1 8 ( e a c h b s , e a c h 1H， Ma n 3, 4— H - 2), 2. 9 1 (d d， 1 H， J =4. 1 H z , 1 7. 3Hz, As n - |3 CH), 2. 82 (dd， 1 H, J =7. 0Hz, 1 7. 3Hz, As n— /3 CH)， 2. 05, 2. 04, 2. 0 1 ( e a c h s , e a c h 3 H, A c ) ; MS (F a b), C a l c d f o r C46H78N5033 [M + H+] 1 228. 5, f o un d, 1 228. 3 参考例 40 化合物 45の合成
化合物 22 (1. 6mg, 1. 3 ΠΊΟ 1 ) を上記の操作で 14時間反応させた ところ、 目的とする化合物 45 (1. lmg, 収率 8 5 %) で得られた。 得られ た化合物の物理的データは以下の通りである。
JH - NMR (30°C)
(5 5. 1 (s , 1H, Ma n 4-H- 1), 5. 07 (d， 1 H, J = 9. 7 H z ; G 1 cNAc 1 - H— 1), . 7 7 (s , 1 H, Man 3 - H— 1)， 4. 6 1, 4. 54 (e a c h d， e a c h 1 H, G 1 cNAc 2, 5— H— 1)， 4. 22 (d， 1H， 1 = 2. 5Hz , Ma n 3— H - 2), 4. 1 8 (d d, 1 H; J = 1. 4Hz, 3. OH z , Ma n 4 ' 一 H_2)， 2. 89 (d d, 1 H, J = 4. 3Hz, 1 6. 9Hz , A s n - 3 CH), 2. 78 (d d， 1 H， J = 7. 5 Hz， 1 6. 9Hz, A s n- 3 CH), 2. 06, 2. 0 5， 2. 0 1 (e a c h s， e a c h 3 H, Ac) ； MS (F a b)， C a l c d f o r C40H67 N5N a 028 [M + N a +] 1 088.4， f o un d, 1 088. 3
参考例 41 化合物 46の合成
化合物 23 (1. 6mg， 1. 5 mo 1 ) を上記の操作で 14時間反応させた ところ、 目的とする化合物 46 (1. lmg, 6. 4 /2 m o 1 , 収率 8 5 %) で得 られた。 得られた化合物の物理的データは以下の通りである。
JH-NMR (30。C)
(5 5. 1 0 (s， 1H, Ma n 4 - H— 1)， 5. 06 (d, 1 H, J = 9. 5Hz, G 1 c NAc 1 - H - 1 ), 4. 7 7 (s , 1 H, Ma n 3 _H - 1), 4. 6 1 (d， 1 H, 1 = 7. 3 H z , G 1 c NAc 2 - H— 1)， 4. 22 (d, 1 H, J = 2. 4Hz , Man 3 - H - 2)， 4. 07 (d d， 1 H， J = 1. 6Hz , 3. 0Hz, Ma n 4' 一 H - 2), 2. 90 (el d, 1 H, J =4. 3Hz , 1 7. 0Hz, A s n - /3 CH), 2. 80 (d d， 1H， J = 7. 0Hz, 1 7. 2 H z , As n - ]3 CH), 2. 05, 2. 01 (e a c h s , e a c h
3 H, Ac) ； M S (F a b), C a 1 c d f o r C 32 H 55 N 4 O 23 [M + H + ] 863. 3, f o un d 863. 3
参考例 42 化合物 34の合成
化合物 1 1 (12.4mg, 7. 5 /mo 1 ) を上記の操作で 1 1時間反応させ たところ、 目的とする化合物 34 (9. 2mg, 収率 86 %) で得られた。 得ら れた化合物の物理的データは以下の通りである。
1H— NMR (30°C)
δ 5. 1 1 (s, 1H, Ma n 4-H- 1), 5. 07 (d， 1 H, J = 10. 0 H z， G 1 c NAc 1 -H- 1 ), 4. 91 (s， 1 H， Ma n 4 ' 一 H - 1), 4. 77 (s, 1H， Man 3— H— 1), 4. 61 (d， 1 H, J = 6. 8Hz , G l c NAc 2 _H— 1)， 4. 55 (d, 2 H, G 1 c NA c 5, 5 ' — H— 1)， 4. 24 (b s, 1H, Man 3-H~2), 4. 18 (b s , 1 H， Man
4 ' -H- 2), 4. 10 (b s , l H， Man 4— H— 2)， 2. 80 (d d, 1 H, J = 3. 8Hz, 15. 6 H z , A s n ~ 3 CH), 2. 63 (dd, 1 H, J =8. 2Hz, 15. 6Hz, As n— /3CH), 2. 07 (s, 3 H, Ac), 2. 05 (s , 6H， Ac X 2), 2. 0 1 (s , 3H, Ac) ； M S (F a b), C a 1 c d f o r C54H90N6N a 038 [M + N a +] 1453. 5， f o u n d, 1453. 2
参考例 43 化合物 35の合成
化合物 12 (12. Omg, 8.4 ^mo 1 ) を上記の操作で 1 1時間反応させ たところ、 目的とする化合物 35 (7. Omg, 収率 81 ?も'） で得られた。 得ら れた化合物の物理的データは以下の通りである。
— NMR (30。C)
(55. 10 (s, 1H， Man 4-H- 1), 5. 07 (d, 1 H， J = 9. 7Hz, G l cNAc l— H— 1), 4. 9 1 (s， 1 H, Ma n 4 ' — H— 1), 4. 78 (s， 1 H, Ma n 3 -H- 1 ), 4. 6 1 (cl, 1 H, J = 8. 0 H z , G l c NA c 2 -H- 1 ), 4. 2 5 (b s， 1 H， M a n 3 -H- 2), 4. 06 (b s , 1H， M a n 4 ' _H - 2), 3. 97 (b s， 1 H, Ma n 4 -H- 2), 2. 7 9 (d d， 1 H, J = 5. 0 H z , 1 7. 0 H z , As n- β CH), 2. 6 1 (d d, 1 H, J = 7. 3Hz， 1 7. 0Hz , A s n- β CH), 2. 07, 2. 0 1
(e a c h s , e a c h 3H, Ac) ; MS (F a b), C a l c d f o r C3SH65N4〇28 [M + H + ] 1 02 5. 4， f o un d, 1 02 5. 2
参考例 44 化合物 36の合成
化合物 1 3 (8. 4 /mo 1 ) を上記の操作で 1 1時間反応させたところ、 目 的とする化合物 36で得られた。
参考例 45 化合物 76、 77の合成および単離
化合物 2及び化合物 6の混合物 （5. 0mg, 2. 2 m o 1 ) を の 水に溶解させ、 22mMの炭酸セシウム水溶液を 1 00 L加え、 pH7. 0と した。 この溶液を凍結乾燥した。 乾燥後の固形物に N, N—ジメチルホルムアミ ドを 430 加え、 更に 6. 6 ιιτ ο 1のベンジルブ口マイド,/ Ν, Ν—ジメチ ルホルムアミド溶液を 20 L加えた。 この溶液をアルゴン雰囲気下で攪拌した。
48時間後、 TLC (展開溶媒は 1M NH40AC ：イソプロパノール = 1 ： 2を用いた） にて原料の消失を確認した後、 4. 4mLのジェチルエーテルを加 えて化合物を沈殿させた。 沈殿した糖鎖を濾過し、 残った糖鎖を水に溶解させ凍 結 乞燥 ί こ。—凍^乾^ ί の ¾¾¾¾ 、敢 tlP L C (YMC P a c k e d C o 1 umn D— ODS— 5 S— 5 1 20 A OD S No. 202 0 1 7 8、 20 X 2 50 mm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセトニトリ ル = 7 8 ： 22、 流速 4. OmL/m i n) で精製したところ、 S 8分後に化合 物 7 7が、 9 1分後に化合物 76が溶出した。 それぞれを取り分け、 更に ODS カラム （コスモシール 75 C 1 8—〇PN、 1 5 X 1 00mm, 最初に H 2 Oを
50mL流し、 次に 2 5%ァセ卜二トリルを流して溶出させた） で脱塩したとこ 2003/016682
56 ろ、 化合物 2のべンジル体が 1. 6mg、 化合物 6のべンジル体が 1. 8mg得ら れた。
化合物 2のベンジル体 （1 0糖、 1 3. 6mg、 5. 8mmo 1 ) を、 氷冷下に N aOHa q. (pH= 1 2) 1. 4m 1に溶解させた。 反応を H P L Cでモニタ 一しながら約 8時間撹拌した。 反応の進行が終了した時点で、 反応液を 40mM HC 1にて pH= 7. 0に調整した。 中和後の液を、 メンブランフィルターで濾 過した後、 濃縮、 次いで HP L C (YMC- P a c k OD S— AM, SH— 3 4 3 - 5 AM, 2 0 X 2 5 0mm, AN/2 5mM Ac ONH4 b u f f e r = 2 0 /' 8 0 , 7. 0m l ,m i n. , wa v e l e n g t h ; 2 7 4 n m) にて分取 ·精製を行った。 分取した液を濃縮後、 OD Sカラム （コスモシー ル 7 5 C 1 8—〇PN, ナカライテスク社製） にて脱塩処理を行い、 濃縮、 凍 結乾燥を行うと、 化合物 2の単品 （6. 2mg， 4 7. 4 %) が得られた。
得られた化合物 2 ( 4. 0 m g , 1. 7 6mmo 1 ) に、 DMS〇 2 8 2m lを 加え溶解させた。 この反応液に、 モルホリン 2 8 2 m lを加えて室温下に撹拌を 行った。 反応を、 TLCにてモニターしながら約 1時間反応を行った。 原料が消 失したことを確認した後、 反応液にアセトン/ 'ジイソプロピルエーテル （ I P E) = 1 /1の溶液 5 m lを加える。 このスラリーを、 メンブランフィルターに てろ過を行った後、 残渣を精製水で溶出させた。 水層を濃縮後、 ゲルカラムクロ マトグラフィー （S e p h a d e x G- 2 5, H 20) にて精製を行った。 目 的物の含まれる分 Ϊ「を集め ¾縮後-、 凍結乾燥を行うと、 目的とするモノシァロ翁 鎖ァスパラギン （化合物 7 6) (3. 3mg, 9 1. 5 % y i e 1 d ) が得られた。 化合物 7 6の NMRデータを以下に示す。 . JH-NMR (40 0MHz , D2〇， 3 0°C， HOD = 4. 8 1 )
δ 5. 2 2 (s , 1 H， Ma n 4-H 1), 5. 1 5 (d， 1 H, J = 1 0. 0, G l c NA c l - H l)， 5. 0 1 ( s , 1 H, M a n 4 ' — H— 1)， 4. 8 5 (s , 1 H)， 4. 6 5 - 4. 7 5 (m, 3 H)， 4. 54 (d d, 2H， J a= 1 0. 8 , J b = 7. 6)， 4. 3 3 (s， 1 H), 4. 2 7 (b d, 1 H, J = 2. 4, Ma n 4-H 2), 4. 1 9 (b d, 1 H, 1 = 2. 4), 2. 9 5 (d d， 1 H, J a= 1 6. 8 , J b = 4. 4, A s n— /3 CH), 2. 8 2 (d d， 1 H, J a = 1 6. 8， J b = 7. 2 , A s n - 3 CH) 2. 7 4 (d d, 1 H, J a= 1 2. 4 J b = 4. 4, Ne uAc 7 -H3 e q), 2. 1 6 , 2. 1 5， 2. 1 3, 2. 1 1 2. 0 9 (e a c h s , 1 5 H， Ac x 5), 1. 8 3 (d d， 1 H， J a= 1 2. 4， J b= 1 2. 0, Ne uA c 7 -H 3 a x) .
化合物 6のベンジル体 （1 0糖、 5 0mg、 2. lmmo 1 ) を、 氷冷下に N aOH a q. (pH= 1 2) 2. 0 m 1に溶解させた。 反応を H P L Cでモニター しながら約 5時間撹拌した。 反応の進行が終了した時点で、 反応液を 4 0mM HC 1 にて pH= 7. 0に調整した。 中和後の液を、 メンブランフィルターで濾 過した後、 濃縮、 次いで HP L C (YMC— P a c k 〇D S— AM, SH— 3 4 3 - 5 AM, 2 0 X 2 5 0 mm, AN/' 2 5mM A c ONH4 b u f f e r = 2 0/8 0 , 7. 0m l /m i n. , wa v e l e n g t h ; 2 7 4 n m) にて分取 ·精製を行った。 分取した液を濃縮後、 OD Sカラム （コスモシー ル 7 5 C 18— OPN, ナカライテスク社製） にて脱塩処理を行い、 濃縮、 凍 結乾燥を行うと、 化合物 6の単品 （ 2. 5 m g， 5 2. 0 % ) が得られた。
得られた化合物 6 (1. 5mg, 0. 6 7mmo 1 ) に、 DMSO 1 0 5m 1を 加え溶解させた。 この反応液に、 モルホリン 1 0 5m 1を加えて室温下に撹拌を 行った。 反応を「― ΤΓ5にてモ Ξ夕—一 b¾がら約 1時間—反応—を 。—原料力消 失したことを確認した後、 反応液にアセトン Ζジイソプロピルエーテル （ I P E) = 1/1の溶液 5m 1を加えた。 このスラリーを、 メンブランフィルターに てろ過を行った後、 残渣を精製水で溶出させた。 水層を濃縮後、 ゲルカラムクロ マトグラフィー （S e p h a d e x G- 2 5, H 20) にて精製を行った。 目 的物の含まれる分画を集め濃縮後、 凍結乾燥を行うと、 目的とするモノシァロ糖 鎖ァスパラギン （化合物 7 7) (1. 4mg， 9 9 %y i e 1 d) が得られた。 化合物 77の NMRデータを以下に示す。
1H— NMR (400MHz, D2〇， 30°C, HOD= 4. 8 1 )
δ 5. 20 (s， 1H, M n 4-H 1), 5. 1 5 (d, 1 H， J - 9. 6, G l c NAc l - H I), 5. 0 2 (s , 1 H, M a n 4 ' 一 H_ l), 4. 8 5 (s， 1 H), 4. 63 -4. 73 (m, 3H)， 4. 53 (d d， 2 H, J a = 7. 6, J b= 7. 2), 4. 33 (s , 1 H), 4. 27 (b cl， 1 H， J = 2. 4, Ma n 4 -H 2), 4. 1 9 (d, 1 H, J = 2. 0), 2. 83 (dd， 1 H，
J a = 1 6. 0, J b = 4. 0, As n - 3 CH), 2. 75 (d d， 1 H， J a = 1 2. 4, J b = 4. 8, Ne uAc 7 -H3 e q) 2. 62 (d d, 1 H, J a - 1 6. 0 J b= 8. 0 , A s n - j3 CH), 2. 1 6, 2. 14, 2. 1 3, 2. 1 1， 2. 09 ( e a c h s , 1 5 H, A c x 5 ), 1. 79 (d d, 1 H, J a = 1 2. 4, J b= 1 1. 6, Ne uAc 7 -H3 a x) .
実施例 1
参考例 1で得られた化合物 24 ( 6 m g , 2. 58 mm o 1 ) を水 （300m L) 溶かし重炭酸ナトリウム （2. Img, 24. 9 mm o 1 ) を加えた。 ここに、 D— （ + ) —ピオチニルスクシンイミド （4. 2mg, 1 2. 3 mm o 1 ) を溶か したジメチルホルムアミド （300mL) を加え、 室温で 20分反応させた。 原 料消失を TLC (イソプロパノール： 1M 酢酸アンモニゥム水溶液 = 3 ： 2) で確認後、 エバポレー夕一を用いて濃縮した。 残渣をゲルろ過カラム （f 20m mX 300 mm, S e p h a cl el— 二— 2 5， 水） で精製 ΧΓ「Έ ず ¾化合 物 （6. 2mg， 94%) を得た。 得られた化合物の物理的データは以下の通り である。
Figure imgf000061_0001
JH-NMR (40 OmH z , D20， 30°C, HOD= 4. 81 )
d 5. 22 (s， 1H， Ma n 4-H 1), 5. 14 (d, 1 H, G l cNAc l -H I), 5. 03 ( s , 1 H， M a n 4 ' — H - 1)， 4. 59 (d d, 1 H), 4. 86 (s， 1H, Ma n 3 -H 1 ), 4. 74 - 4. 66 (m， 3H，， G l c NAc 2, 5, 5 ' —H I), 4. 53 (d, 2H, G a 1 6, 6 ' _H 1)， 4. 3 4 (s, 1 H, Ma n 3 -H 2), 4. 28 (b s , 1 H， M a n 4 - H 2 ) , 4. 1 9 (b s , 1H， Ma n 4' - H2)， 3. 09 (d d, 2H, Ne uAc 7, 7 ' -H 3 e q), 2. 94 - 2.86 (m, 2 H, b i o t i n), 2. 78 - 2. 71 (m, 2 H, b i o t i n), 2. 37 ( t， 1 H, b i o t i n), 2. 17, 2. 16, 2. 13， 2. 1 1 (e a c h s， Ac), 1. 80 (d d， 2 H, Ne uAc 7, 7 ' - H 3 a x ) , 1. 80— 1. 67 (m, b i o t i n), 1. 52 - 1.47 (m， b i o t i n), 1. 32 (dd, b i o t i n) 実施例 2
—参考例 4— 5 得られた化合物一 7 ¥ί吏 1た以外は実施例 Γΐ向濯 Tこピ矛 ン 化を行った。
Figure imgf000062_0001
実施例 3
参考例 4 5で得られた化合物 7 7を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000062_0002
実施例 4
参考例 7で得られた化合物 3 3を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン化 を行った。
Figure imgf000062_0003
実施例 5
参考例 2 4で得られた化合物 2 6を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000063_0001
実施例 6
参考例 2 5で得られた化合物 2 7を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000063_0002
実施例 7
参 ¾例 2 6 られた化合 ¥2 ¥使 ¥した以外は実施例 1 ！ Tft?¾" ン 化を行った。
Figure imgf000063_0003
実施例 8
参考例 2 7で得られた化合物 3 0を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000064_0001
実施例 9
参考例 2 8で得られた化合物 3 1を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000064_0002
実施例 1 0
参考例 2 9 ΓΪ导ら—れた化合 を —した以外は実; —厂と オ^ 化を行った。
Figure imgf000064_0003
実施例 1 1
参考例 3 0で得られた化合物 3 7を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000065_0001
実施例 1 2
参考例 3 1で得られた化合物 4 2を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000065_0002
実施例 1 3
参考例 3 2で得られた化合物 3 8を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000066_0001
実施例 1 4
参考例 3 3で得られた化合物 7 2を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン
Figure imgf000066_0002
実施例 1 5
参考例 3 4で得られた化合物 4 3を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000066_0003
実施例 1 6
参考例 3 5で得られた化合物 7 3を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000067_0001
実施例 1 7
参考例 3 6で得られた化合物 3 9を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000067_0002
実施例 1 8
参考例 3 7で得られた化合物 4 0を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000067_0003
実施例 1 9 参考例 3 8で得られた化合物 4 1を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000068_0001
実施例 2 0
参考例 3 9で得られた化合物 4 4を使用した以外は実施例 1と同様にビォチン 化を行った。
Figure imgf000068_0002
実施例 2 1
参考例 4 0で得られた化合物 4 5を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン ィ匕を行つ 。
Figure imgf000068_0003
実施例 2 2
参考例 4 1で得られた化合物 4 6を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000069_0001
5
実施例 2 3
参考例 4 2で得られた化合物 3 4を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000069_0002
0
実施例 2 4
—一― —参考例 4 3—で られた化合 ¾—3一 5を ¾1 た以外は実施 Γど同裰 ίこピ牙 化を行った。
Figure imgf000069_0003
5 実施例 25
参考例 44で得られた化合物 36を使用した以外は実施例 1と同様にピオチン 化を行った。
Figure imgf000070_0001
実施例 26 Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシァ口 α 2, 3糖鎖ァスパラギン （C 1— 1) および Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒 素を保護した 2種のモノシァロひ 2, 3糖鎖ァスパラギン （C 1一 2及び C 1一 3) の合成 - 参考例 2で得られた Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したァシ ァロ糖鎖ァスパラギンにシアル酸転移酵素を用いて CM P—シアル酸を転移させ た。
シアル酸転移酵素としてひ 2, 3転移酵素である市販の R a t , R e c o m b i n a n t由来のものを用いた。
参考例 2で得られたァシァ口 9糖 （2 Omg， 1 0. 1 m o 1 ) を 50 mM —一力コジリ— 夜一 Tp Η= 6.— 0—，一 m Π1こ一溶解させた後、 ¥"テ)レヲミーンー— (B SA, 5mg) を加える。 これに、 CMP—シアル酸 （26mg, 40. 4 βτηο 1 ), A 1 k a 1 i n e p h o s ph a t a s e (5 1.. 1 2 5 u n i t ) を加え均一化する。 最後に、 α 2, 3— S i a l y l t r an s f e r a s e (CALB I OCHEM社製、 1 00 1 ) を加え 37 °Cで 48時間静置さ せる。 HP LCで反応をモニタ一しながら原料が目的量まで減少した時点で反応 を終了させ、 反応液をメンブランフィル夕一にて濾過する。 濾液を濃縮し液量を 減じた後、 HPLC分取カラムにて精製した （YMC— P a c k R&D 〇D S, D-OD S - 5 -A, 2 0 X 2 5 0mm， AN./ 2 5mM Ac ONH4 b u f f e r =1 8 /8 2, 7. 5m l , m i n. , wa v e 1 e n g t h ; 2 7 4 nm) ところ、 2 5分後にジシァ口 1 1糖 化合物 （C 1— 1) が、 それぞ れ 3 0分後、 34分後に各モノシァロ 1 0糖 化合物 （C 1一 2) 及び （C 1一 3) が溶出してきた。 それぞれを分取した後、 脱塩処理、 次いで凍結乾燥を行う と、 各化合物 1、 2、 3がそれぞれ 0. 7mg (2. 7 ¾ 、 1. 9mg ( 8.
3 %)、 3. 5mg ( 1 5. 3 %) 得られた。 各化合物の NMRデータは以下のと おりである。 ·
化合物 （C 1一 1)
JH NMR (40 0MHz , D2〇， 3 0°C， HOD=4. 8 1 )
δ 7. 90 (d, 2H， Fmo c ), 7. 6 9 (d, 2 H, Fmo c), 7. 4 9 (d d, 2 H, Fmo c), 7. 4 2 (cl d， 2 H, Fmo c), 5. 1 0 ( s， 1 H, Ma n 4— H I ), 4. 9 7 (d, 1 H, G l c NAc l— H l)， 4. 9 1 (s， 1 H， Ma n 4 ' — H_ l)， 4. 5 0— 4. 6 0 (m， 4H)， 4. 34 ( 1 H, Fmo c), 4. 2 4 (b s , 1 H， Ma n 3 -H2), 4. 1 8 (b s , 1 H, Ma n 4 -H 2), 4. 1 0 (m, 2 H), 2. 74 (m, 3 H， A s n - ;3 CH， Ne uAc 7 , 7 ' -H 3 e q), 2. 40 - 2. 6 0 (m, 1 H, A s n 一 /3 CH)， 2. 0 5, 2. 0 3, 2. 0 2 (e a c h s， Ac), 1. 7 7 (d d, 2H， Ne uAc 7 , 7 ' -H3 a x) .
化合物 （C I— 2)
' NMR (40 0MHz , D2〇， 3 0。C, HOD = 4. 8 1 )
6 7. 9 0 (d, 2 H, Fmo c)， 7. 6 9 (d， 2H, Fmo c), 7. 49
(d d， 2 H, Fmo c), 7. 4 2 (d d, 2 H, Fmo c), 5. 1 0 ( s， 1 H， Ma n 4 -H I ), 4. 9 7 (d, 1 H, G l c NAc l - H I), 4. 9 0
(s， 1 H， Ma n 4， 一 H— 1)， 4. 4 7 - 4. 6 0 (m)， 4. 43 (d, 1 (ζ - ι ο) 篇 J— っ
^ ( T -j_o)
(x B SH - o vn 9N Ή T 'P P) L L Ί '(つ V ' s qつ o 0 '2 ' 20 '2 'S O 'S ' 90 "2 '(HO £/ - u s v 'HT 'ui) 09 'S— S 'ε ' ^ £ U- I ^ V ^ ^ H 'HO -u s v Ή Z 'LU) L 'Z '(H Z '^ΐ) 60 · '(SH-^ u B ^ 'HT ' s q) L T - '(H Z 'ui) z Z ^ '(つ omj Ή T) £ £ ' '(H T 'P) '(u) 09 · ー O S ' '(X -H- ^ ^^ i Ή T ' s)
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H I ' s q) T - '(HS ' s q) z z ' '( OUIJ Ή T) S ^ '(H
OZ
Z899l0/C00Zdf/X3d 68ム8 00Z OAV NeuAc 2→-3Gal β l+4GlcNAc β l+2Man
cNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
Gal β l-»-4GlcNAc/3 l→-2Mana
Figure imgf000073_0001
(C 1一 3)
得られた （C一 1) 〜 （C— 3) の各化合物を参考例 7と同様に処理して Fm o c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用 した以外は実施例 1と同様にピオチン化を行った。
NeuAc a-2→-3Gal β l+4GkNAc β l-^2Man lv
Man 3 H GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- Biotin
. 3
NeuAca2→-3Gal β l-^4GlcNAc ;3 l→-2Man α Γ
Gal β l→HGlcNAc β l+2Man
、6
3Man/3 l→-4GlcNAci3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biotin
NeuAca2→-3Gal β l+4GlcNAc β l→-2 an a NeuAc 2→-3Gal β l+4GlcNAc β l+2Man a
Manj3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biotin
Gal l+4GlcNAc j3 l→-2Man a 実施例 27
実涵 6一で得られた化合物— (C 1 - 2 ) ( 2 m g , 0. 88"z"mo^ ΓΓ一とゥンー 血清ァルブミン1111 を11£?£3緩衝溶液 （50111 ， ρΗ 5. 0) 100 1に溶解させ、 さらに /3—ガラクトシダーゼ （生化学工業社製、 f r om J a c k B e an s, 5 ^L, l O OmU) を加えた。 この溶液を 37 °Cで 1 5時 間静置した後、 メンブランフィルタ一でろ過を行った。 ろ液を HPLC (ODS カラム、 2. 0 ci)X 25 cm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液： ァ セトニトリル =82 ： 18、 流速 7. 5m 1 /m i n) で精製した後、 溶媒を濃 2
72 縮、 次いで凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 1に溶解させ ODS—力ラム クロマトグラフィ一 （コスモシール 75 Cls—o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次いで 25%ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用いて脱塩処理を行ったと ころ、 目的とする化合物 （C 2) が 0. 5 i g得られた。 NMRデ一夕は以下の とおりである。
lH NMR (40 OMH z , D20, 30°C, HOD= 4. 81 )
δ 7. 90 (cl， 2 H, Fmo c ), 7. 69 (d， 2 H, Fmo c ), 7.49
(dd, 2H, Fmo c), 7.42 (d d, 2 H, Fmo c), 5. 10 (s， 1 H, Ma n 4 -H 1), 4. 98 (d, 1 H, G l cNAc l— HI), 4. 90
(s， 1H, Ma n 4 ' 一 H - 1)， 4. 50 -4. 60 (m)， 4. 33 ( 1 H, Fmo c), 4. 22 (m， 2H), 4. 17 (b s， 1 H, Ma n 4-H2), 4. 10 (m, 2 H), 2. 74 (m, 2 H, As n - 3 CH， Ne u Ac 7 -H 3 e q), 2.45 - 2. 60 (m， 1 H, As n— j3 CH)， 2. 05, 2. 03, 2. 01 (e a c h s, Ac), 1. 78 (d d, 1H， N e u Ac 7 -H 3 a x)
GlcNAc 31→-2Manalv
Man/3 l+4GlcNAc3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
NeuAc a'2→-3Gal β l+4GlcNAc β】+2Man
(C 2)
.得—ら她— (C2)„の化會一物きき考 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護し て糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用した以外は実施例 1と同様にピオチン化を行った。
GlcNAc/3 l→-2Manalv
6
Man/3 l→^4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biotin
NeuAca2→-3Gal β l+4GlcNAc β l+2Man a 1, 実施例 28 実施例 27で得られた化合物 （C 2) (1. 8mg, 0. 86 zmo l ) を、 ゥ シ血清アルブミン lmgと共に HEPES緩衝溶液 （5 OmM, pH 5. 0) 9
0 a 1に溶解させ、 さらに N—ァセチル - |3—ダルコサミニダ一ゼ （シグマアル ドリツチ社製、 f r om J c k B e a n s) を 4 z l (25 OmU) 加え た。 この溶液を 37°Cで 24時間静置した後、 メンブランフィルターでろ過を行 つた。 ろ液を HPLC (ODSカラム、 2. 0 φ Χ 2 5。πι、 展開溶媒は 50m M酢酸アンモニゥム水溶液： ァセトニトリル = 82 ： 1 8、 流速 7. 5m 1 /m
1 n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次いで凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 H 1に溶解させ ODS—力ラムクロマトグラフィー （コスモシール 7 5 C18- o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次いで 25 %ァセトニトリル水溶液で溶出させ る） を用いて脱塩処理を行ったところ、 目的とする化合物 （C 3) が 0. 9 g 得られた。
lH NMR (40 OMH z , D20， 30°C， H〇D = 4. 8 1)
δ 8. 0 1 (d, 2H， J = 7. 6, Fmo c), 7. 80 (d， 2H， J = 7. 6, Fmo c), 7. 60 (d d, 2 H, J - 7. 6, Fmo c), 7. 53 (d d， 2H， J = 7. 6, Fmo c), 5. 2 1 (s , 1 H, Ma n 4 -H 1 ), 5. 09 (d， 1 H， J = 8. 8 , G l cNAc l - H I), 5. 00 (s , 1 H， M a n 4 ' _H - 1), 4. 8 7 (s， 1H)， 4. 60— 4. 78 (m, 5H), 4. 40 -4. 50 (bm, 2 H), 4. 34 (s , 1 H), 4. 28 (b s , 1 H， Ma n 4 -H 2), 4. 20 (d d， 1 H， J a = 3. 0， J b = 9. 9), 2. 80 -2. 9 5 (m, 2H, As n- β CH, Ne uAc 7 -H3 e q), 2. 65- 2. 75 (m, 1 H， As n - /3 CH)， 2. 16, 2. 14, 2. 1 2 (e a c h s， Ac x 3), 1. 98 (s , 3H, Ac), 1. 89 (d d， 1 H， J a = 1 2. 1， J b= l 1. 9， Ne uAc 7— H3 ax) . Man lv
6
Man/31+4G1CNACJ3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
NeuAc 2→-3Gal β l-*-4GlcNAc β l→-2Man
(C 3)
得られた （C 3) の化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護し て糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用した以外は実施例 1と同様にピオチン化を行った。
Man lv
、 6
Man/31→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc-*-Asn-Biotin
NeuAc a2+3Gal β l-^4GlcNAc β l→-2Man a 実施例 29
実施例 28で得られた化合物 （C 3) (0. 8mg, 0.42 ^mo 1 ) とゥシ 血清アルブミン 1 mgを HE P E S緩衝溶液 （5 OmM, pH 5.0) 50 ^ 1 に溶解させ、 ひ—マンノシダ一ゼ （シグマアルドリツチ社製、 f r om J a c k B e an s) 30 1 (2. 9 U) 加えた。 この溶液を 37 °Cで 63時間静 置した後、 メンブランフィルターでろ過を行った。 ろ液を HPLC (ODSカラ ム、 2. 0 ci)X 25 cm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセト 二トリル =80 ： 20、 流速 7. 5mし 'm i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次いで凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 1に溶解させ ODS—カラムクロ マトグラフィー （コスモシール 75 C s— o p n、 最初に水で洗浄—を行い； 次 いで 25%ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用いて脱塩処理を行ったとこ ろ、 目的とする化合物 （C4) が 0. 6 /i g得られた。
H NMR (400MHz, D2〇， 30 o C, H〇D = 4. 81)
(5 8. 00 (d， 2 H, J = 7. 2 , Fmo c), 7. 79 (d, 2H, J = 7. 2， Fmo c), 7. 59 (dd， 2 H, J = 7. 2 , Fmo c), 7. 52 (d d, 2H, J = 7. 2, Fmo c), 5. 21 (s, 1 H， Ma n 4 -H 1 ), 5. 0 9 (d, 1 H， J = 1 0. 0 , G l c NAc l— H I ), 4. 6 0 - 4. 7 5 (m丄 4. 4 0— 4. 5 0 (m, 2H)， 4. 3 2 (b d, 1 H, J = 2. 3), 4. 2 8 (b s , 1 H)， 4. 2 2 (b d d， 1 H, J a = 9. 7, J b = 2. 8, Ma n 4 -H 2), 2. 8 0 - 2. 9 5 (m， 2 H， A s n- β CH, Ne uAc
7 -H 3 e q), 2. 6 0 - 2. 7 5 (m， 1 H, A s n - β CH), 2. 1 4, 2. 1 4, 2. 1 2 (e a c h s , Ac x 3), 1. 9 8 (s， 3 H， Ac), 1. 8
8 (d el, 1 H, J = 1 2. 1 , J b - 1 2. 0 , Ne uAc 7 -H 3 a x) .
Man/31+4G1CNACJ8 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc ズ 3
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
(C 4)
得られた （C 4) の化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護し て糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用した以外は実施例 1と同様にピオチン化を行った。
Mani3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biotin
NeuAc a 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man f 実施例 3 0
実施例 2 6で得られた化合物 （C 1一 3) ( lmg, 0. 44 mo 1 ) とゥシ 血清ァルブミンlmgをHEPE S緩衝溶液 （5 0mM， pH 5. 0) 5 0 /^ 1 に ¾解きせ、 さらに β—ガラクトシダ一ゼ—（生化学'工業社 MT1 r o'm " J a c k B e a n s , 5 (i L, l O OmU) を加えた。 この溶液を 3 7 °Cで 1 5時間 静置した後、 メンブランフィルターでろ過を行った。 ろ液を HPL C (OD S力 ラム、 2. 0 φ Χ 2 5 cm、 展開溶媒は 5 0 mM酢酸アンモニゥム水溶液：ァセ トニトリル = 8 2 : 1 8、 流速 7. 5 m 1 /m i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次いで凍結乾燥を行った。 残留物を水 2 0 0 Iに溶解させ〇D S—力ラムクロ マトグラフィー （コスモシール 7 5 Cl s_ o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次 いで 2 5 %ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用いて脱塩処理を行ったとこ ろ、 目的とする化合物 （C 5) が 0. 3 M g得られた。
Ή NMR (40 0MHz , D2〇， 3 0°C, H〇D = 4. 8 1 )
δ 8. 0 1 (d, 2 H, J = 7. 2 , Fmo c), 7. 8 1 (d, 2H， J = 7. 2, Fmo c), 7. 6 0 (d d, 2 H, J = 7. 2 , Fmo c), 7. 5 3 (d d, 2 H， J = 7. 2 , Fmo c), 5. 2 1 (s， 1 H, Ma n 4 -H 1 ), 5. 0 9 (d, 1 H, J = 9. 6 , G l c NAc l— H I), 5. 0 2 ( s， 1 H, Ma n 4 ' — H - 1 ), 4. 5 5 - 4. 7 0 (m)， 4. 44 ( 1 H， Fmo c), 4. 3 0 - 4. 3 8 (bm， 2 H), 4. 2 8 (b d， 1 H, M a n 4 - H 2 ) , 4. 1 7 - 4. 2 5 (m, 2 H), 2. 7 8 - 2. 9 5 (m， 2H, A s n - /3 CH, Ne uAc 7— H 3 e q)， 2. 5 5— 2. 7 0 (m, 1 H, A s n— /3 CH)， 2. 1 6 , 2. 1 5, 2. 1 4, 2. 1 2 ( e a c h s , 1 2 H, Ac x 4), 1. 9 8 (s , 3H， Ac), 1. 8 9 (d d, 1 H, J a= 1 2. 2, J b = 1 2. 0, Ne uAc 7 -H 3 a ) .
l→-4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
Figure imgf000078_0001
(C 5)
得られた （C 5) の化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護し —て糖鎖ァス ラギンを得た。 ¾れた糖鎖ァスパラギンを J 用 —た以外は実施例 1と同様にピオチン化を行った。
NeuAc a 2-*-3Gal β 1+4G1 cNAc β l~^2Man α lv
Man/31+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- Biotin 3
GlcNAc/31-^2Manar 実施例 3 1
実施例 3 0で得られた化合物 （C 5) (l. Omg, 0. 48 mo l ) を、 ゥ シ血清アルブミン lmgと共に HEPES緩衝溶液 （50mM， H 5. 0) 5 On 1に溶解させ、 さらに N—ァセチルー /3—ダルコサミニダーゼ （シグマアル ドリッチ社製、 f r om J a c k B e an s) を 4 1 (250mU) 加え た。 この溶液を 37°Cで 22時間静置した後、 メンブランフィルタ一でろ過を行 つた。 ろ液を HPLC (ODSカラム、 2. 0 d)X 25 cm、 展開溶媒は 50m IV [酢酸アンモニゥム水溶液： ァセトニ卜リル = 82 ： 18、 流速 7. 5m l Zm i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次いで凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 H 1に溶解させ ODS—カラムクロマトグラフィー （コスモシール 75 C1S- o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次いで 25 %ァセトニトリル水溶液で溶出させ る） を用いて脱塩処理を行ったところ、 目的とする化合物 （C 6) が 0. 6 g 得られた。
lH NMR (400MHz, D20, 30°C, HOD = 4. 81 )
δ 8. 01 (d， 2 H, J = 7. 6 , Fmo c)， 7. 80 (d， 2H, J = 7. 6， Fmo c), 7. 60 (el d, 2 H, J = 7.6, Fmo c), 7. 53 (d d, 2H， J = 7.6, Fmo c), 5. 19 (s, 1 H, M a n 4 -H 1 ), 5. 09 (d, 1 H, J = 9. 2 , G 1 cNAc 1 -HI), 5. 02 (s， 1 H， Ma n 4 ' 一 H— 1), 4. 85 (s， 1 H) 4. 58 - 4. 75 (m， 5H), 4. 38 -4.48 (m， 2 H, Fmo c)， 4.40 (b d, J = 2.4, 1H)， 4. 18-4. 25 (m, 2 H), 4. 1 5 (ni， 1H)， 2. 80 - 2. 95 (m, 2 H, As n-/3CH, N e u Ac 7 -H 3~e q), 2. 65 - 2. 75 Tm, 1H， A s n - ]3 CH), 2. 16, 2. 1 3, 2. 12 (e a c h s, 9 H, ■ A c x 3 ) , 1. 98 (s, 3H, Ac), 1. 89 (dd， 1 H， J a= 12. 2, J b = 12. 0 , Ne uAc 7-H3 ) . NeuAc 2+3Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man a
、6
Man/3 l-*-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc-*^Asn-Fraoc
Man
(C 6)
得られた （C 6) の化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護し て糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用した以外は実施例 1と同様にピオチン化を行った。
NeuAc 2-^3Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a k 、
Man/3 l+4GlcNAc 3 l+4GlcNAc+Asn- Biotin
Man a 1 実施例 32
実施例 31で得られた化合物 （C 6) (1. Omg, 0. 53 mo 1 ) とゥシ 血清アルブミン lmgを HEPE S緩衝溶液 （5 OmM, pH 5. 0) 50 // 1 に溶解させ、 a—マンノシダーゼ （シグマアルドリッチ社製、 f r om J a c k B e an s) 10 x 1 (0. 9U) 加えた。 この溶液を 37 °Cで 20時間静 置した後、 メンブランフィルターでろ過を行った。 ろ液を HPLC (ODSカラ ム、 2. 0 ci>X 25 cm、 展開溶媒は 50 mM酢酸アンモニゥム水溶液： ァセト 二トリル =80 : 20、 流速 7. 5m l /m i n) で精製した後、 溶媒を濃縮、 次いで凍結乾燥を行った。 残留物を水 200 /2 1に溶解させ ODS_カラムクロ マトグラフィ一 （コスモシール 75 C18— o p n、 最初に水で洗浄を行い、 次 いで 25%ァセトニトリル水溶液で溶出させる） を用いて脱塩処理を行ったとこ ろ、 目的とする化合物 （C 7) が 0. 5 /2 g得られた。
lH NMR (400MHz, D2〇， 30。C, HOD = 4. 81 )
δ 8. 01 (d， 2 H, J = 7. 6 , Fmo c), 7. 81 (d， 2H， J = 7. 6, Fmo c), 7. 60 (dd, 2 H, J = 7. 2 , Fmo c), 7. 53 (cl d, 2H， J = 7. 6, Fmo c), 5. 09 (d, 1 H， J = 9. 2 , G 1 c NA c 1 -H 1 ), 5. 0 1 (s , 1 H， Ma n 4 ' 一 H_ l), 4. 84 ( s , 1 H), 4. 5 5 - 4. 7 0 (m， 5H)， 4. 4 ( t， 1 H, J = 6. 0 , Fmo c ), 4. 3 0 -4. 3 8 (b s , 1 H), 4. 1 5 - . 2 5 (m， 2H), 4. 1 7 ( s， 1 H), 2. 8 0 - 2. 9 5 (m, 2 H, A s n— 3 CH， Ne uAc 7 -H 3 e q), 2. 5 5 - 2. 7 0 (m, 1 H, A s n— ^S CH), 2. 1 6, 2. 1 3, 2. 1 2 ( e a c h s , Ac x 3)， 1. 9 8 (s , 3H， Ac) 1. 8 9 (d d, 1 H, J a= 1 2. 2 , J b= 1 2. 3 , Ne uAc 7 -H 3 a x) .
NeuAca2-^3Gal β l+4GlcNAc /3 l+2Man a
Man/3 l→-4GlcNAc /3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fraoc
(C 7)
得られた （C 7) の化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護し て糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用した以外は実施例 1と同様にピオチン化を行った。
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man a g
Man/3 l→-4GlcNAc 3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biot in 実施例 3 3
Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシァ口 （ひ 2, 6) ( 2, 3) 糖鎖ァスパラギンの合成
参考例 45で得られた Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したモ ノシァ口； テスパラギン （化合！ 2ΤΤこシアル酸転移酵素を用 て C¾TP—シ アル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素として 2 , 3転移酵素である市販の R a t , R e c omb i n a n t由来のものを用いた。
参考例 4 5で得られた化合物 2 (1. 7mg, 0. 7 5 ^mo 1 ) を 5 0mM力 コジル酸緩衝液 （pH= 5. 0, 8 5 1 ) に溶解させた後、 牛血清アルブミン (B SA, 1 mg) を加える。 これに、 CMP—シアル酸 （4. 8mg, 7. 5 ," mo l)、 Al ka l i ne pho s pha t a s e (Ι , ΐ, 75 u n i t ) を加え均一化する。 最後に、 ひ2, 3— S i a l y l t r an s f e r a s e (CALB I OCHEM社製、 7 34 mU) を加え 37 °Cで 3.5時 間静置させる。 HP LCで反応をモニターしながら原料が消失した時点で反応を 終了させ、 反応液をメンブランフィル夕一にて濾過する。 濾液を濃縮し液量を減 じた後、 HP LC分取カラムにて精製した （YMC— Pac k R&D 〇DS, D—〇DS— 5— A， 20 X 250mm, AN/ 25mM A c ONH4 b u f f e r = 18/82, 7.5ml /m i n., wave l eng t h ; 274 nm) ところ、 25分後に化合物 （C 7 A) が溶出してきた。 分取した後、 脱塩 処理、 次いで凍結乾燥を行うと、 化合物 （C7A) が 1.3mg (67.8 %) 得 られた。 化合物の NMRデータは以下のとおりである。
XH NMR (40 OMH z , D20, 30°C, HOD = 4.81 )
δ 8.00 (d, 2H， J = 7.2 , Fmoc), 7.79 (d， 2 H, J = 7.2, Fmo c), 7.60 (dd， 2 H, J = 7.2， Fmo c), 7.52 (d d, 2 H, J=7.2， Fmo c), 5.21 (s, 1 H, Man4— HI), 5.09 (d， 1H， J = 8.8 , G l cNAc l_Hl), 5.03 (s, 1 H, Ma n 4 ' 一 H - 1), 4.86 (s, 1 H), 4.58 - 4.72 (m， 5 H), 4.54 (d， 1H, J = 8.0), 4.38— 4.48 (m, 2 H) 4.34 (b s, 1H)， 4.28 (b s, 1 H), 4.15-4.25 (m， 2 H), 2.80-2.8 6 (d d , 1 H , J a = 4.4，一了 b =Ί'2 \ 4, N e u A c 7^Ti~3 e Q ) , 2.73— 2.83 (m, dd, 3H, J a = 4.4, J b= 12.4, A s n _ /3 CH, Ne uAc 7 -H3 e q), 2.60 - 2.72 (m， 1 H, A s n - /3 C H)， 2. 16， 2. 15， 2.14, 2. 12 (e ac h s, Ac x5)， 1.98 (s， 3 H, Ac), 1.89 (dd, 1 H, J a= 12.4, J b = 12.0, Ne u Ac 7 -H3 a x), 1.81 (dd， 1 H, J a= 12.4, J b=12.0, NeuAc 7-H3 ax) . NeuAca2-^6Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man a K
Man 3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fraoc
NeuAc a 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a 1,
(C 7 A)
得られた （C 7 A) の化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護 して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用した以外は実施 例 1と同様にピオチン化を行った。
NeuAca2+6Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man α 1
g
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biotin
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc )3 l→-2Man α Γ 実施例 3 4
Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したジシァ口 （ひ 2， 3) ( a 2, 6) 糖鎖ァスパラギンの合成
参考例 4 5で得られた Fmo c基でァスパラギンのアミノ基窒素を保護したモ ノシァ口糖鎖ァスパラギン （化合物 6) にシアル酸転移酵素を用いて CMP—シ アル酸を転移させた。
シアル酸転移酵素として a 2, 3転移酵素である市販の R a t , R e c omb - in a n t ώ来 . を甩ぃ卞乙。一 .
参考例 4 5で得られた化合物 6 ( 1. 2mg, 0. 5 3 m o 1 ) を 5 0 mM力 コジル酸緩衝液 （pH= 5. 0 , 6 0 1 ) に溶解させた後、 牛血清アルブミン (B SA， lmg) を加える。 これに、 CMP—シアル酸 （3. 4mg， 5. 3 mo l )、 A 1 k a 1 i n e p h o s p h a t a s e (1 ^ 1 , 7 5 u n i t ) を加え均一化する。 最後に、 ο; 2， 3— S i a l y l t r a n s f e r a s e (CALB I OCHEM社製、 5 2. 9 2 4mU) を加え 3 7。Cで 3時 間静置させる。 HP LCで反応をモニターしながら原料が全て消費された時点で 反応を終了させ、 反応液をメンブランフィルタ一にて濾過する。 濾液を濃縮し液 量を減じた後、 HPLC分取カラムにて精製した （YMC— P a c k R&D 〇D S, D-OD S - 5 -A, 2 0 X 2 5 0 mm, AN/2 5mM A c ONH 4 b u f f e r = 1 8./8 2, 7. 5m l Zm i n. , wa v e 1 e n g t h ； 2 7 4 nm) ところ、 2 3分後に化合物 （C 7 B) が溶出してきた。 分取し た後、 脱塩処理、 次いで凍結乾燥を行うと、 各化合物 （C 7 B) が 1. Img (8 1. 2 %) 得られた。 各化合物の NMRデータは以下のとおりである。
]H NMR (40 0MHz , D20， 3 0。C, HOD = 4. 8 1 )
δ 8. 0 0 (d, 2H, J = 7. 6 , Fmo c), 7. 7 9 (d, 2H, J = 7. 6 , Fmo c), 7. 5 9 (d d， 2H， 1 = 7. 6, Fmo c), 7. 5 1 (d d， 2 H, J = 7. 6 , Fmo c), 5. 2 1 ( s , 1 H, M a n 4 -H 1 ), 5. 0 8 (d, 1 H, J = 1 0. 0， G l c NAc l - H l)， 5. 0 0 ( s , 1 H, Ma n 4 ' — H - 1 ), 4. 8 4 (s , 1 H), 4. 6 0 - 4. 7 2 (m, 5H), 4. 5 2 (d, 1 H, J = 7. 6), 4. 3 5 - 4. 45 (m， 2 H), 4. 3 3 (b s， 1 H), 4. 2 7 (b s , 1 H)， 4. 1 5 - 4. 2 5 (m, 2 H), 2. 8 0 -
2. 8 6 (d d, 1 H， J a = 4. 8 , J b= 1 2. 4， N e u A c 7 -H 3 e q), 2. 7 3 - 2. 8 3 (b s， el d, 3 H, J a = 4. 8, J b = 1 2. 4, A s n - 3 CH, N e uAc 7 -H 3 e q), 2. 6 0 - 2. 7 2 (m, 1 H, A s n— 3 CH)， 2. 1 5, 2.'Ϊ , 271 0 (e a c h s「X— c ~x 5 )，一一―
1. 9 7 (s , 3 H, Ac), 1. 8 8 (d d， 1 H, J a= 1 2. 4, J b = 1 2. 4, N e uAc 7 -H 3 a x), 1. 8 0 (d d, 1 H， J a= 1 2. 4, J b= 1 2. 4, Ne uAc 7 -H3 a x) . NeuAc 2+3Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a g
Man/3 l+4GlcNAc /3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
NeuAc 2→-6Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man 1,
(C 7 B)
得られた （C 7 B) の化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護 して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用した以外は実施 例 1と同様にピオチン化を行った。
NeuAc a2+3Gal β l→-4GIcNAc β l→-2Man Iv
、6
Mani3 l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-Biot in
NeuAc 2→-6Gal β l+4GlcNAc β Man a 1, 実施例 35〜 52
参考例 2、 8〜： 10、 12、 14、 17、 45、 実施例 26〜 32で製造した 各 Fmo c—糖鎖ァスパラギン 2 nmo lを、 トリス塩酸緩衝液 約 1 0m l に溶解させた。 このものに、 GDP—フコース 200 nmo l、
Fucosyl transferase V (Human, Recombinant) 0. 5mUを加え、 37°Cで約 2 時間静置、 反応させた。 反応液を超純水 20m 1で希釈したのち、 キヤピラリー—一 電気泳動. (fused silica capillajy, 50mm i . d.， 60 cm, buffer； 1 0 OmM Tris-borate, pH=8. 3, 10 OmM Heptane sulfonate, 印加電 圧 27 k ， 温度 25°C, 214mm) で分離を行いフコースを含む糖鎖ァスパ ラギン誘導体を得た。 得られた上記糖鎖ァスパラギン誘導体を参考例 7と同様に 処理して Fmo c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパ ラギンを使用した以外は実施例 1と同様にピオチン化を行った。 得られたビォチ ン化糖鎖ァスパラギンを以下に示す。 実施例 3 5
Fuc lv
3
NeuAc 2+6Gal β l+4GlcNAc β l→^2Man l
Man/3 l→-4GlcNAc /3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biot in 3
Gal β l+4GlcNAc β l+2Man Γ
Fuc 1
Fuc lv
NeuAcひ' 2+6Gal β l→-4Gl
tin
Gal β 1→-4G1
Figure imgf000086_0001
NeuAc a2→-6Gal β l-^4GlcNAc β l→-2Man l
、 g
Man/3 l+4GlcNAc 3 l+4GlcNAc+Asn- Biot in
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a 1,
Fuc a 1
実施例 3 6
Fuc 1'
Gal 31→-4G 、3
lcNAc/31-<-2Mana
Mani3 l→-4GlcNAc/3 l-»-4GlcNAc→-Asn-Biotin
NeuAca2→-6Gal β l→-4GlcNAc 0 l→-2Man a
,3
Fuc a 1-
Fuc lv
Gal jS l+4Gl
/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biotin
NeuAc 2+ 6Gal β H Gl
Figure imgf000086_0002
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
Man 3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- Biotin
NeuAc 2+ 6Gal β l→^4GlcNAc β l→-2Man Γ
Fuc a 1,
実施例 37
Fuc a
3
Gal β l+4Glc.NAc β l→-2Man
Man/3 l-^4GlcNAci3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biotin
Gal β l-^4GlcNAc β l→-2Man
Fuc a r
Fuc 1、
3
Gal β l-^4GlcNAc β l+2Man a 1
Man/3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- Biotin
Gal β l→-4GlcNAc/31→-2Mano;r
Gal β l→-4GlcNAc l→-2Man β
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biotin
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man 1,
Fuc a 1
実施例 38
Fuc l
3
Gal β 1→-4G1CNACJ3 l→-2Manak
、6
Manj3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biotin
GlcNAc/3 l→-2Manal/ 91
Figure imgf000088_0001
z m oi
、1 Ό UE[¾
l υ
、い WW 0 3
Figure imgf000088_0002
Figure imgf000088_0003
6 ε \m
98
/X3d 68ん8 0請 Z OAV 実施例 43
Man/3 l→-4GlcNAci3 l→^4GlcNAc→-Asn-Biotin
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man Γ
Fuc a 1
実施例 44
Fuc l
3
NeuAc l→- 3Ga 1 β 1+4G1 cNAc β MMm l
6
ani3 l-*-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc-»- As n-B iotin 3
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
3
Fuc r
Fuc a
3
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man l
Man β】+4Gl cNAc β cNAc+Asn- B iotin
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β MMau a K
、6
Man β l→-4GlcNAc β 1+4G1 cNAc+Asn- B iotin
NeuAc 2→-3Gal β l+4GlcNAc β M an Γ
Fuc α 1
実施例 45
Fuc K
3
NeuAca2→-3Gal β l~ GlcNAc β l→-2Man a lv
、6
sMan/31→-4Gl cNAc 31+ 4G 1 cNAc+ As n- B iotin
Gal β l→-4GlcNAc β h^2Um a
Fuc a Γ Fuc a l\
3
NeuAc 2+3Gal β l+4GlcNAc β l+2Man
、6
Man/3 l-*-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-*-Asn-Biotin 3
Gal/31→-4GlcNAci31→-2Manar
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc /3 l→^2Man l
、6
Man/3 l→-4GlcNAc 3 l→-4GlcNA(^Asn-Biotin
^3
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
Fuc 1
実施例 46
Fuc
3
Gal l+4GlcNAc β l→-2Man
、6
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-^Asn-Biotin
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc β MMan Γ
3
Fuc a r
Fuc a lv
3
Gal β l+4GlcNAc β MMa a l
Man/31→-4GlcNAci31→-4Gl cNAc+As n- B iotin 3
NeuAc a l→- 3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
Gal β l-^4GlcNAc β MMan a
、6
Man/3 l-^4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-B iotin 3
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a Γ
Fuc a Γ 、1 Ώ onj
o 9 imm oi
Figure imgf000091_0001
6
9
Figure imgf000091_0002
8 m
I TO onj
Figure imgf000091_0003
68
Z899T0/C00Zdf/X3d 68ム8 00Z OAV 実施例 51
Fuc a 1、
NeuAca2→-3Gal β l+4Gl
l→-4GlcNAc 3 l→-4GlcNAc→-Asn-Biot in
Figure imgf000092_0001
実施例 52
Fuc 1
3
NeuAc a 2+3Gal β 1+4G1 cNAc β l+2Man a- lx
、6
Man 3 l→-4GlcNAci31→-4GlcNAc→-Asn-Biotin 実施例 53
ジシァ口糖鎖ァスパラギン （化合物 24) (1 1糖、 1.4mg、 0. 6 Omm o 1 ) を、 精製水 70m lに溶解させた。 このものにアセトン 70m 1、 N a HC03 (0. 76mg, 9mmo 1 ) を加え、 室温下に撹拌した後、
Fluorescein isothiocyanate (F I TC， 0. 95 m g , 2.4mm o 1 , A 1 d r i c h社製） を加え約 2時間撹拌した。 2時間後、 TLCにて反応の終了を確 認した後、 アセトンを減圧下に留去させ、 残った水溶液をゲルカラムクロマトグ ラフィー （S e p h ad e x G- 25, H2〇） にて精製し目的物の含まれる 分画を集めた—。—集めた分画を濃縮後 HP LC (YMC— P a c k ODS- AM, SH- 343 - 5 AM, 20 X 250 mm, AN./ 25 mM A c ONH 4 bu f f e r = 10/ 90, 7. 5m l m i n. , wa v e 1 e n g t h ； 274 nm) で分取した後、 ゲルカラムクロマトグラフィー （S e p h a d e x G-25, H20) にて脱塩処理を行った。 目的物の含まれる分画を集め、 濃縮後、 凍結乾燥を行うと目的とする F I TC化されたジシァ口糖鎖誘導体 （1. 2mg, 73. 5 % y i e l d) が得られた。 NeuAc 2+6Gal l+4GlcNAc β l+2Man
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc-^Asn-FITC 3
NeuAca2→-6Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man Γ
'H NMR (400MHz, D20, 30。C， HOD = 4. 81 )
δ 7. 86 (d, 1H， J =2. 0, F I TC), 7. 75 (dd， 1 H, J a = 8. 0, J b = 2. 0, F I TC), 7.46 (d， 1 H, J = 8.0, F I TC), 7.41 (d, 1 H, J = 9. 6 , F I TC), 6. 71 -6. 83 (bm, 4H, F I TC), 5. 22 (s , 1 H, Ma n 4 -H 1 ), 5. 10 -5. 0 (bm,
9
1
2H， G l cNAc l— HI), 5. 03 (s, 1 H, M a n 4 ' 一 H— 1), 4. 70— 4. 80 (m， 3H)， 4. 53 (d， 2H， J = 8. 0), 4. 33 (s， 1H， Ma n 3 -H- 2), 4.27 (b s , 1 H， Ma n 4 - H - 2)， 4. 18 (s , 1H, Man 4-H- 2), 2. 90 - 3. 00 (m, 1 H, A s n - 3 C H), 2. 85 - 2. 95 (m, 1 H， As n— /3 CH), 2. 75 (d d, 2 H, J a= 12. 0, J b = 2. 8 , N e u A c 7 -H 3 e x), 2. 15, 2. 14， 2. 12, 2. 09 (e a c h s, 18H, Ac x 6), 1. 80 (dd， 2 H, J a = 1 2. 0, J b= 12. 0 , Ne uAc 7 -H3 a ) .
実施例 54
化合物 24の代わりに、 化合物 76を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
NeuAca2-^6Gal β l→-4GlcNAc /3 l-«^2Man α lv
6
Man;31→-4G1CNACI3 l-^4GlcNAc→-Asn-FITC
Gal/31→-4GlcNAc/31→-2Manar 実施例 55
化合物 24の代わりに、 化合物 77を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。 Gal β l+4GlcNAc β l+2Man a K
Man/3 l-^4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-^Asn-FITC
NeuAca2→-6Gal j3 l→-4GlcNAc/3 l→-2Man α Γ 実施例 56
化合物 24の代わりに、 化合物 33を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- FITC
Figure imgf000094_0001
得られた F I TC化糖鎖ァスパラギンの NMRデータを以下に示す。
JH-NMR (400MHz, D 2 O, 30°C, HOD = 4. 81 )
δ 7. 88 (d， 1H， J = 2. 0, F I TC), 7. 76 (d d, 1 H, J a- 8. 0, J b = 2. 0, F I TC), 7.46 (d， 1 H, J = 8. 0, F I TC), 7.45 (d, 1H, J = 8. 8 , F I TC), 6. 85 - 6. 93 (m, 4H, F I TC), 5. 21 (s, 1 H, M a n 4 -H 1 ), 5. 05 - 5. 20 (b d， 2H, G 1 c NAc 1 -H 1), 5. 01 (s, 1 H， M a n 4 ' — H - 1)， 4. 67 (d， 3 H, J = 7. 6), 4. 55 (d， 2 H), 4. 34 (s , 1 H， Man 3— H_2), 4. 28 (b s， 1 H， Man 4 -H- 2), 4. 20 (s , 1H, Ma n 4-H- 2), 3. 00 - 3. 10 (bm， 1 H, A s n - /3 CH), 2. 90 - 3. 00 (m， 1 H， A s n - /3 CH), 2. 75 (dd, 2 H, J a二 12. 0, J b= 2. 8, Ne u Ac 7 -H3 e x), 2. 14， 2. 13， 2. 1 2 2. 08 (e a c h s, 12 H, A c x 4) .
実施例 57
化合物 24の代わりに、 化合物 26を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。 NeuAc 2-^6Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a l
、 6
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc-^Asn-FITC
GIcNAc/3 l-^2Man r 実施例 58
化合物 24の代わりに、 化合物 27を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
NeuAc a 2+6Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man a
6Man β l+4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- FITC 3
Man 1 実施例 59
化合物 24の代わりに、 化合物 28を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
NeuAc 2+6Gal β l+4GlcNAc β l+2Man
、6
Mani3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC 実施例 60
化合物 24の代わりに、 化合物 30を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
GlcNAc/3 l→-2Manals. ―
Man β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- FITC
NeuAc a2→-6Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man α Γ 実施例 61
化合物 24の代わりに、 化合物 31を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。 Man a 1、
6Man 31→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC 3
NeuAc a 2+6Gal β l→-4GlcNAc β l-»-2Man Γ 実施例 62
化合物 24の代わりに、 化合物 32を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
NeuAc 2→-6Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a 実施例 63
化合物 24の代わりに、 化合物 37を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
Gal β l→-4GlcNAc β MMan a lv
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
3
GlcNAc/31-^2Mana!r 実施例 64
化合物 24の代わりに、 化合物 42を用いて実施例 53と同様 (
ィ匕 ¾ri了った。
GlcNAc/31-^2Manalv
、6
Man/3 l→-4GlcNAc /3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man 実施例 65
化合物 24の代わりに、 化合物 38を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。 Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man l
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc→-Asn-FITC
実施例 6 6
化合物 24の代わりに、 化合物 7 2を用いて実施例 5 3と同様にして F I TC 化を行った。
GlcNAc/31+2Manalゝ
Man/3 l→-4GlcNAc 3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
Man a 1' 実施例 6 7
化合物 24の代わりに、 化合物 4 3を用いて実施例 5 3と同様にして F I TC 化を行った。
Man lv
。
3Man/3 l→-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc→-Asn-FITC
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a 実施例 6 8
化合物 24の代わりに、 化合物 7 3を用いて実施例 5 3と同様にして F I TC 化を 'ί了った。
Man α 1
、 6
Manj3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
GlcNAcj31→-2Manar 実施例 6 9
化合物 2 4の代わりに、 化合物 3 9を用いて実施例 5 3と同様にして F I TC 化を行った。
Gal β l+4GlcNAc β l+2Man a
、 fi
Man /3 l-^4GlcNAc 3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC 実施例 70
化合物 24の代わりに、 化合物 40を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
GlcNAc/3 l→-2Manalv
、
Man l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-FITC 実施例 71
化合物 24の代わりに、 化合物 41を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
Man l
Man/31→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc-^Asn-FITC 実施例 72
化合物 24の代わりに、 化合物 44を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。
Man/3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- FITC
Gal 31→-4GlcNAc^l—2Manal/ 実施例 73
化合物 24の代わりに、 化合物 45を用いて実施例 53と同様にして F I TC 化を行った。 3Man/3 l-^4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
GlcNAc/31→-2 ana;l 実施例 7 4
化合物 2 4の代わりに、 化合物 4 6を用いて実施例 5 3と同様にして F I T C 化を行った。
Man β l+4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
Man a 1 実施例 7 5
化合物 2 4の代わりに、 化合物 3 4を用いて実施例 5 3と同様にして F I T C 化を行った。
GlcNAc/3 2Manal、
6Man/3 H GlcNAc)3 l+4GlcNAc+Asn - FITC
GlcNAc/31→-2 an r 実施例 7 6
化合物 2 4の代わりに、 化合物 3 5を用いて実施例 5 3と同様にして F I T C 化を行った。 Man a l - . 一 一 … — 一 一 .....一—… 一 一
、6
Manj3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcMc~^Asn- FITC
Man r 実施例 7 7
化合物 2 4の代わりに、 化合物 3 6を用いて実施例 5 3と同様にして F I T C 化を行った。
Man/3 l+4GlcNAc(3 l+4GlcNAc+Asn- FITC 実施例 78
実施例 26で得られた （C一 1) 〜 （C一 3) の各化合物を参考例 7と同様に 処理して Fmo c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパ ラギンを使用した以外は実施例 53と同様に F I TC化を行った。
NeuAc 2+3Gal β l+4GlcNAc β l+2Man l
Man^ l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC 3
NeuAc 2+3Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a 1,
Gal β l→-4GlcNAc β MMan a
• 6
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
NeuAc 2→-3Gal β l+4GlcNAc β l+2Man
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man a l
6Man/3 l→-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc→-Asn-FITC
Gal β l-^4GlcNAc β l-^2Man a Γ 実施例 79
実施例 27で得られた （C 2) の各化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用し た以外は実施例 53と同様に F I TC化を行った。
^ ― GlcNAc 3 l→-2Mano; ― ―
、6
Man/3 l→^4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→^Asn-FITC 3
NeuAc a 2→-3Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man 実施例 8 0
実施例 28で得られた （C 3) の各化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用し た以外は実施例 53と同様に F I TC化を行った。 /3 l→HGlcNAc 3 l→ GlcNAc+Asn- FITC
NeuAc o;2+3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2
Figure imgf000101_0001
実施例 81
実施例 29で得られた （C4) の各化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用し た以外は実施例 53と同様に F I TC化を行った。
Man 3 l-^4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc→-Asn-FITC
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc i3 l→-2Man α Γ 実施例 82
実施例 30で得られた （C 5) の各化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用し た以外は実施例 53と同様に F I TC化を行った。
NeuAca2→-3Gal β l+4GlcNAc β l+2Man a l
、fi
Man β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- FITC
GlcNAc/3 l→-2Manar 実施例 8 3
実施例 31で得られた （C 6) の各化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用し た以外は実施例 53と同様に F I TC化を行った。 NeuAc 2→-3Gal β l+4GlcNAc β MMa a
Manj3 l→-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc→-Asn-FITC
実施例 84
実施例 32で得られた （C.7) の各化合物を参考例 7と同様に処理して Fmo c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用し た以外は実施例 53と同様に F I TC化を行った。
NeuAc 2+3Gal β l+4GlcNAc β MMan α
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc→-Asn-FITC 実施例 85
実施例 33で得られた （C 7A) の各化合物を参考例 7と同様に処理して Fm o c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用 した以外は実施例 53と同様に F I TC化を行った。
NeuAc 2+6Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man I.
- g
Man/3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- FITC
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ 実施例 86
実施例 34で得られた （C 7 B) の各化合物を参考例 7と同様に処理して Fm o c基を脱保護して糖鎖ァスパラギンを得た。 得られた糖鎖ァスパラギンを使用 した以外は実施例 53と同様に F I TC化を行った。
NeuAc 2+3Gal β l→-4GlcNAc β MUa
、
Man/31+4G1CNAC0 l+4GlcNAc+Asn- FITC
NeuAc 2-*-6Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man 実施例 8 7〜： L 04
実施例 35〜52で得られたフコースを含む糖鎖ァスパラギン誘導体を用いて 実施例 53と同様にして F I TC化を行った。 実施例 8 7
F
NeuAca2→-6Gal β
l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
Gal β
F
Figure imgf000103_0001
Fuc a
3
NeuAca2+6Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man α 1
、
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
NeuAc a 2→-6Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man
Man β 1→-4G1 cNAc /31+ 4G 1 cNAc+Asn- F I TC
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man
Fuc 1 実施例 8 8
Fuc a
3
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man
Man/31— 4GlcNAc/3 l-*-4GlcNAc→-Asn-FITC
NeuAc a 2→- 6Gal β l→-4GlcNAc β l→-2 an Γ
Fuc 1, Fuc K
3
Gal/31-^4GlcNAci31-^2Mano;lv
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc-^Asn-FITC
NeuAc 2+ 6Gal (3 H GlcNAc β l-^2Man Γ
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a
Man 3 l+4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- FITC 3
NeuAc a 2→-6Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man α Γ
y3
Fuc a 1
- - o
実施例 8 9
Fuc K
3
Gal β l→-4GlcNAc β l-^2Man k
6
Man β 1 →-4GlcNAc/31→-4GlcNAc→-Asn-FITC
3
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man Γ
' 3
Fuc \
Fuc l
Gal β l→-4Gl
1- -4GlcNAc 3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
Gal β l→-4Gl
Figure imgf000104_0001
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a l 、
. . Man 3 l→-_4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
3
Gal β l~ GlcNAc β l+2Man a
Fuc a Γ 実施例 90
Fuc lv
3
Gali31-^4GlcNAc/31→-2Manalx
6
3Man/3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- FITC
GlcNAc^l-^ZManal^ 実施例 91
GlcNAc/31→-2Manalx
6Man/3 l+4GlcNAc /3 l+4GlcNAc+Asn- FITC 3
Gal β l~ GlcNAc β l+2Man a 1,
Fuc a Γ
実施例 92
Fuc l
3
Gal β 1+4G1 cNAc β l→^2Man
6Man/31→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn-FITC メ 3
Man a Γ 実施例 93
Man l
6
sMan β l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc-^Asn-FITC
Gal β l→-4GlcNAc β l-^2Man a
Fuc r 実施例 9 4
Fuc l
3
Gal l-^4GlcNAc β l+2Man a
、fi
Man/3 l-^4GlcNAc/31-^4GlcNAc-^Asn-FITC 実施例 9 5
Man/31→-4GlcNAc j3 l+4GkNAc+Asn- FITC
3
Gal β l→-4GlcN fAAcc ββ ll+-^22MMaanna Γ
3
Fuc 1'
実施例 9 6
Fuc a
3
NeuAc a2+3Gal l+4GlcNAc β l→-2Man
、fi
Man/3 l-^4GlcNAc 3 l→-4GlcNAc-^Asn-FITC 3
NeuAc 2→-3Gal β l→-4GlcNAc β l-*-2Man a Γ
y3
Fuc r
NeuAca2→-3Gal
Figure imgf000106_0001
… -
Man/3 l→-4GlcNAc 3 H-4GlcNAc→-Asn-FITC
NeuAc 2→-3Gal β l+4GlcNAc β l→^2Man a Γ
NeuAc a'2+3Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man a 、
Man/31+4G1CNACJ3 l+4GlcNAc+Asn- FITC
NeuAca2-^3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
Fuc 1
Figure imgf000107_0001
。 νΞv寸wl寸 -夺 A us。i。。.l—
Figure imgf000107_0002
：：ズ
Fuc l
3
Gal β l→-4GlcNAc β MUan
Man/3 l+4GlcNAc β l→-4GlcNAc-*-Asn-FITC y3
NeuAc l→- 3Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a Γ
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man K
、fi
Figure imgf000108_0001
3
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man α Γ
Fuc Γ
実施例 9 9
GlcNAc^ l→-2Man lv
3Man/3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- FITC
NeuAc 2→- 3Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man
Fuc Γ
実施例 100
Man 1、
——― Man/31 4GlcNAc β l→-4GLcNAc→-Asn-FIJC.
NeuAc 2→-3Gal β l-^4GlcNAc β l→-2Man Γ
Fuc r
実施例 10 Man 3 l+4GlcNAc 3 l+4GlcNAc+Asn- FITC
NeuAc 2-^3Gal β l→-4GlcNAc β 1— 2Man a
Fuc 1
実施例 1 0 2
Fuc l
3
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc /3 l-^2Man a l
Man β 1+4G1 cNAc β 1→-4G1 cNAc+Asn- FITC
Figure imgf000109_0001
実施例 1 0 3
Fuc a lv
3
NeuAca2→-3Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man αΊ
6
Man/31' 4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc-^Asn-FITC
Man 1
実施例 1 0 4 '― —― ΡικΓο: 1 " ―' —― - '
3
NeuAcct;2→-3Gal l→-4GlcNAc/3 l→-2Man a k
、6
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-FITC
実施例 1 0 5 (マイクロプレートの製造）
9 6穴 BDバイオコ一トス卜レブ卜アビジン （BDバイオサイエンス社製：バ ィオアッセィ用、 結合能： 5ngZl穴） に、 実施例 1のピオチン化糖鎖ァスパ ラギン 100 x g (ピオチン結合能の約 10倍相当量） を蒸留水に溶かし 1 00 0 a 1とした。 この調整溶液を 1穴当り 10 1となるように各ゥエルに加え、 蒸留水で 3回洗浄し、 マイクロプレートを製造した。 各ピオチン化糖鎖ァスパラ ギンの結合収率は 95%以上であった。 固定化率の確認は、 洗い出された非固定 化糖鎖残量より算出した。
実施例 106 (ァフィニティーカラムの製造）
アビジンコートビーズ （日立ソフトウェアーエンジニアリング社製、 xMAP LumAvidin Development Microspheres lml) 10m lと実施例 1のピオチン化糖 鎖ァスパラギン 3 Omgをスラリー状態で撹拌し、 ビーズをろ過、 洗浄した。 洗 浄は、 ビーズ体積の 2倍量の蒸留水を使用して、 3回ろ紙上で洗浄した。 固定化の 確認は、 洗浄回収されたピオチン化糖鎖ァスパラギンの残量により確認した。 次 に上記のピオチン化糖鎖ァスパラギン固定ビーズ 10m 1を 30m 1の蒸留水で スラリー状態のまま、 ガラス製のオープンクロマトカラム （* 20mm、 長さ 3 00mm) に充填し、 ァフィ二ティーカラムを製造した。
( S Z )
Figure imgf000111_0001
! 7+1 £/UBJ¾
—― ( L Z∑
Figure imgf000111_0002
(92)
Figure imgf000111_0003
(S 6 )
d 3 +【 g
Figure imgf000111_0004
( S) d
ΐ拏
601
O df/IOd 68ム8 0請 OAV
(I ε)
usv +。 0 £/UE
、1
(08)
(6 Z)
Figure imgf000112_0001
on
i899T0/C00Zdf/X3d 68ム8 OOZ OAV 表 2
Man/3 l→-4GlcNAc /3 l→-4GlcNAc→-Asn
NeuAca2→-6Gal β l→-4GlcNAc/3 l→-2Man Γ
( 3 2 )
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man K
、6
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn
3
Gal β l+4GlcNAc β l-^2Man
( 3 3 )
GlcNAciSl→-2ManQ!l
g
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn
GlcNAc/31→-2Man tr .
( 3 4)
Man/31→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc→-Asn ( 3 5)
Man β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn
( 3 6 ) Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man a
、g
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l—4GlcNAc→-Asn
GlcNAci31→-2Manar
(37)
Gal β 4GlcNAc β MUm a
Man β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn
Man Γ
(38)
Gal β l→-4GlcNAc β l-^2Man lx
、 Γ
Mani31→-4GlcNAcj3 l→-4GlcNAc→-Asn (39)
表 3
GlcNAc/3 l→-2Man lx
6
Man/3 l+4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn
(40)
Man l
6
Man β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn
(41)
GlcNAc/3 l-^2Mano;lx
Man β】+4GlcNAc β l→-4GlcNAc→-Asn 3
Gal 13 l→-4GlcNAc β l-^2 an a 1,
(42)
Man a W
6
Man/3 h GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn
Gal β l~ GlcNAc β l→-2Man 1,
(43)
Man 3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn 3
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man
(44) (9 Z)
I UBW2^-I g。VN。 +1 d 1^0
Figure imgf000116_0001
( S L )
υ u
(6 L )
Figure imgf000116_0002
(9
(S V )
Figure imgf000116_0003
HI
0∑;df/X3I 68ム SSO/fOOZ
{ L ί )
911
i899T0/C00Zdf/X3d 68ム8 00Z OAV 表 4
NeuAca2-»-6Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man a k
、 6
Marii3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc-^Asn-Fraoc
NeuAca2-«-6Gal β l→-4GlcNAc β l-^2Man a 1,
( 1 )
NeuAca2→-6Gal j3 l→-4GlcNAc /3 l-*-2Man α 1χ
、 6
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc 3
Gal β l+4GlcNAc β l—2Man Γ
( 2 )
NeuAc 2→-6Gal β l→-4GlcNAc /3 l→-2Man
6
Man β l→-4GlcNAc β l→-4GlcNAc-^Asn-Fmoc 3
GlcNAc/3 MManar
( 3 )
NeuAc 2+6Gal β l→-4GlcNAc β l+2Man a lv
Man 3 l→-4GlcNAc/3 l-^4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Man a 1
( 4 ) 一 一
NeuAc 2→-6Gal j3 l→-4GlcNAc β l→-2Man lv
、6
Man/31→-4G1CNACJ3 l→-4GlcNAc-*-Asn-Fmoc
( 5 )
(9)
Figure imgf000119_0001
ZII
J899l0/£00Zdf/X3d 68.8S0/ 00Z OAV OAVZさ 68:71>d/S0zfc S99s
、
Figure imgf000120_0001
GT„ glg 0 A UB a"l
s、
()0! . Man W
Man/3 l→-4GlcNACi8 l→-4GlcNAc→-Asn-Fmoc
Man r
( 1 2)
Man β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
( 1 3)
Gal β l+4GlcNAc β l→-2Man l
6
Man 3 l→-4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn- Fmoc 3
GlcNAc31→-2Manar
( 1 4)
Gal β l+4GlcNAc β MMan α
、 6
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn— Fmoc 3
Man a 1
(1 5)
表 6
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man a l
、6
Man/3 l→-4GlcNAci3 ]→-4GlcNAc-^Asn-Fmoc ( 1 6)
GlcNAc/3 l-^2Manalv
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l+4GlcNAc+Asn - Fmoc
( 1 7)
Man R
、
Man β l+4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
( 1 8)
GlcNAc<31→-2Manal
、6
Man/3 l→-4GlcNAc/3 l→-4GlcNAc-*^Asn-Fnioc 3
Gal β l→-4GlcNAc β l→-2Man Γ
一 - ( 1 9) ― 一一
β l→-4GlcNAc β l+4GlcNAc+Asn- Fmoc
Gal β l+4GlcNAc β l+2
Figure imgf000122_0001
(2 0) ( I D
、1 Ώ UBJij
(0 L )
9、
(S S)
Ώ UBJ¾
，
i Z Z)
Figure imgf000123_0001
( T Z )
Figure imgf000123_0002
\Z\
Z899T0/C00Zdf/X3d 68ム8 00Z OAV 産業上の利用可能性
本発明によれば、 ァスパラギンのアミノ基窒素をピオチン化又は F I T Cィ匕し た糖鎖ァスパラギンが得られる。
更に本発明によれば、 ピオチン ·アビジンの結合特異性を利用し、 ピオチン化 した複数の糖鎖をアビジン化されたマイクロプレー卜上で反応させるだけで簡単 に糖鎖マイクロチップを製造することができる。 これにより、 特定の糖鎖と結合 能を有するタンパク質を解明することができる。
また、 ある特定のタンパク質を分離精製する目的で、 アビジン化したァフィ二 ティーカラムに特定のピオチン化した糖鎖を結合し固定化し、 そこに、 ピオチン 化した糖鎖と特異的結合能を有するタンパク質を含む混合物を通すことにより目 的とするタンパク質のみを単離することができる。
更に本発明で得られた F I T C化糖鎖ァスパラギンは、 例えば生体組織中の糖 類の受容体の研究、 レクチンの糖結合特異性の研究に有用である。

Claims

請求の範囲
1. 下記式 （1) で表される 1 1〜 3糖を有する糖鎖ァスパラギン誘導体。
Figure imgf000125_0001
〔式中、 1^ぉょび1^2は、 水素原子、 式 （2) 〜 （6) で示される基であり、 同 一でも異なっていてもよい。 Qはピオチン基又は F I TC基を示す。〕
Figure imgf000125_0002
Figure imgf000125_0003
Figure imgf000126_0001
Figure imgf000126_0002
Figure imgf000126_0003
2. 式 （1 ) において、 R1および R 2の一方は必ず式 （2) 又は式 （3) で示 さ—ねる基である 1 1〜ヱ—糖 _¾有: 2, 3) 又 （α' 2, 6 糖鎖ァ―スパラギ ン誘導体。
3. 式 （1 ) において、 R1は式 （2) で示される基であり、 R2は式 （3) で 示される基である 1 1糖を有する （α 2, 3) ( 2, 6)糖鎖ァスパラギン誘導体。
4. 式 （1) において、 R1は式 （3) で示される基であり、 R2は式 （2) で 示される基である 1 1糖を有する （ 2, 3) ( a 2, 6)糖鎖ァスパラギン誘導体。
5. ピオチン基又は F I TC基でァスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖 鎖ァスパラギンの非還元末端側の N—ァセチルダルコサミンに少なくとも.1個以 上のフコースを含む糖鎖ァスパラギン誘導体。
6. ピオチン基又は F I TC基でァスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖 鎖ァスパラギンが、 式 （ 1) で表される 1 1〜 3糖を有する糖鎖ァスパラギン誘 導体である請求項 5に記載のフコースを含む糖鎖ァスパラギン誘導体。
7. ピオチン基又は F I TC基でァスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖 鎖ァスパラギンが、 請求の範囲第 3項の 1 1糖を有する （α 2, 3) (α 2, 6) ϋ 鎖ァスパラギン誘導体である請求項 5に記載のフコースを含む糖鎖ァスパラギン 誘導体。
8. ピオチン基又は F I TC基でァスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖 鎖ァスパラギンが、 請求の範囲第 4項の 1 1糖を有する （Q; 2， 3) (Q; 2, 6)糖 鎖ァスパラギン誘導体である請求項 5に記載のフコースを含む糖鎖ァスパラギン 誘導体。
9. ピオチン基又は F I TC基でァスパラギンのアミノ基窒素が修飾された糖 鎖ァスパラギンが、 式 （1) において R1および R 2は、 水素原子、 式 （2) で示 される基、 または式 （4) 〜 （6) で示される基であり、 R1および R 2の一方は 必ず式 （2) 又は式 （4) で示される基である、 1 1〜6糖を有する 0； 2, 3糖鎖 ァスパラギン誘導体である請求項 5に記載のフコースを含む糖鎖ァスパラギン誘 導体。
1 0. ピオチン基又は F I TC基でァスパラギンのァ . 基窒素が修飾され 糖鎖ァスパラギンが、 式 （1) において R1および R2は、 水素原子、 式 （3) で 示される基、 または式 （4) 〜 （6) で示される基であり、 R1および R2の一方 は必ず式 （3) 又は式 （4) で示される基である、 1 1〜 6糖を有する a 2, 6糖 鎖ァスパラギン誘導体である請求項 5に記載のフコースを含む糖鎖ァスパラギン 誘導体。
1 1. 式 （7) で表される 1 1〜3糖を有する糖鎖ァスパラギンをピオチン化 することを特徴とするピオチン化糖鎖ァスパラギンの製造方法。
Figure imgf000128_0001
〔式中、 R1および R2は上記に同じ。〕
12. 式 （7) で表される 1 1〜3糖を有する糖鎖ァスパラギンをフルォレセ インイソチオシァネート （F I TC) 化することを特徴とする F I TC化糖鎖ァ スパラギンの製造方法。
13. 請求の範囲第 1〜10項に記載のピオチン化糖鎖ァスパラギンを結合さ せたマイクロプレ一ト。
14. 請求の範囲第 1〜10項に記載のピオチン化糖鎖ァスパラギンを結合さ せたァフィ二ティーカラム。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI466897B (zh) * 2005-07-19 2015-01-01 Glytech Inc 癌細胞之檢測方法、糖鏈之構造解析方法，以及糖鏈衍生物
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07224082A (ja) * 1994-02-14 1995-08-22 Rikagaku Kenkyusho アスパラギン結合型糖誘導体及びその製法
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