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WO2004051266A1 - 抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップ、抗原特異的リンパ球の検出法及び製造方法、並びに抗原特異的リンパ球抗原受容体遺伝子のクローニング方法 - Google Patents

抗原特異的リンパ球検出用マイクロウェルアレイチップ、抗原特異的リンパ球の検出法及び製造方法、並びに抗原特異的リンパ球抗原受容体遺伝子のクローニング方法 Download PDF

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WO2004051266A1
WO2004051266A1 PCT/JP2003/012500 JP0312500W WO2004051266A1 WO 2004051266 A1 WO2004051266 A1 WO 2004051266A1 JP 0312500 W JP0312500 W JP 0312500W WO 2004051266 A1 WO2004051266 A1 WO 2004051266A1
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WO
WIPO (PCT)
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antigen
lymphocyte
specific
lymphocytes
microwell
Prior art date
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Application number
PCT/JP2003/012500
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English (en)
French (fr)
Inventor
Atsushi Muraguchi
Hiroyuki Kishi
Eiichi Tamiya
Masayasu Suzuki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32473638&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2004051266(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Individual filed Critical Individual
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Priority to DK03812277.6T priority patent/DK1566635T3/da
Priority to US10/534,800 priority patent/US20060134704A1/en
Priority to AT03812277T priority patent/ATE536548T1/de
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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • Microphone orifice chip for detecting antigen-specific lymphocytes
  • the present invention relates to a microwell array chip used for detecting antigen-specific lymphocytes, a method for detecting antigen-specific lymphocytes, and a method for producing the same. Furthermore, the present invention relates to a method for cloning an antigen-specific lymphocyte antigen receptor gene.
  • Non-Patent Document 1 Low bulb function search method edited by Junichi Yano and Michio Fujiwara, edited by Chugai Medical Co., Ltd. (1994) (Non-Patent Document 1) and "Immunological Experiment Procedures I and II” Shunsuke Migita, Susumu Konda, Yusuke Honjo, Toshiyuki Hamaoka, edited by Nankodo (1995) (Non-Patent Document 2)).
  • the detection method is
  • an antigen-specific population of approximately 200,000 lymphocyte populations The presence of the lymphocytes was confirmed. However, it was not possible to identify individual antigen-specific lymphocytes present in the lymphocyte population.
  • a fluorescently labeled antigen is bound to the antigen receptor of the antigen-specific lymphocyte, and the lymphocyte to which the fluorescently labeled antigen is bound.
  • Have been developed and used Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Davis MM.
  • Non-Patent Document 3 Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 274: 94-96, 1996 (Non-Patent Document 3)). With this method, it is possible to identify a single lymphocyte that binds to the antigen. It is also possible to collect one lymphocyte that binds to the antigen.
  • the above-described detection method requires an expensive and complicated device such as a cell sorter for sorting, and has the following problems.
  • antigen molecules bound to magnetic beads are mixed with lymphocytes to bind the magnetic beads-bound antigen to the antigen receptor of antigen-specific lymphocytes, and a magnet is attached.
  • a method for sorting antigen-specific lymphocytes has also been developed (Abts H, Emmerich M, Miltenyi S, Radbruch A, Tesch H, CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter (MACS) can be induced Journal of Immunological Methods 125: 19-28, 1989 (Non-Patent Document 4)).
  • This method does not require complicated equipment, has a short cell sorting time, and confirms that antigen is bound. However, it has not been possible to analyze whether the lymphocytes bound with the antigen react to the antigen (cellular metabolic physiological reactions such as intracellular signaling, RNA synthesis, and protein synthesis). When the frequency of antigen-specific lymphocytes was 0.1% or less, no antigen-specific lymphocytes could be detected. Thus, the present invention does not require a complicated device, the time required for cell sorting is short, the antigen binding can be confirmed, and the infrequent antigen-specific lymphocyte (0.001% or more) can be detected.
  • Still another object of the present invention is to provide a microwell array chip for detecting antigen-specific lymphocytes used in the above-mentioned detection method, and a method for producing antigen-specific lymphocytes using the above-mentioned detection method. To provide.
  • the following methods are known as conventional methods for cloning an antigen-specific antibody gene.
  • peripheral B lymphocytes are transformed with EB virus, established and screened for cells producing antigen-specific antibodies, and the resulting antigen-specific lymphocyte cell lines are screened.
  • Method for Cloning Antibody Gene Power S (Roome AJ, Reading CL.The use of Epstein-Barr virus transformation for the production of human monoclonal antibodies.Exp Biol 43: 35-55, 1984 (Non-Patent Document 5), Carson DA , Freimark BD. Human lymphocyte hybridomas and monoclonal antibodies. Adv Immunol. 38: 275-311, 1986 (Non-Patent Document 6)).
  • mRNA is extracted from human lymphocytes, and cDNA libraries for immunoglobulin H and L chains are respectively prepared and integrated into one phage DNA. Express the L chain.
  • the combination of the heavy and light chains determines the antigen specificity.
  • the combination is random and the antigen is used to screen phage making antibodies that bind to the antigen.
  • the antigen-specific antibody gene can be cloned.
  • screening of antigen-specific antibody genes is very inefficient because the combination of H and L chains is random.
  • H cDNA of the H chain and the cDNA of the L chain of an antibody to an antigen are present in the library at a frequency of 1 / 10th power of the library, respectively.
  • H The combination of a chain and an L chain is 10 to the eighth power.
  • the obtained combination of H chain and L chain is the same as the combination of H chain and L chain actually formed in the human body.
  • the conventional method of cloning an antigen-specific antibody gene was a very inefficient method. Nevertheless, for antigen-specific lymphocytes that are relatively frequent, it was possible to clone an antigen-specific antibody gene using a conventional method with a considerable amount of effort.
  • the present invention provides a method for easily and specifically reacting a specific antigen to a specific antigen, even if the frequency of the antigen-specific lymphocyte is relatively high.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently cloning an antigen-specific antigen receptor gene from the selected antigen-specific lymphocytes.
  • the present invention provides a method for producing a monoclonal antibody from a cloned antigen-specific immunoglobulin gene, and a gene therapy material using the cloned antigen-specific T cell receptor gene. It is also an object to provide a method for producing the same.
  • the present invention for solving the above problems is as follows.
  • the first embodiment of the present invention has a plurality of microwells, each specimen contains one specimen lymphocyte, and is used for detecting antigen-specific lymphocytes in units of one.
  • the microwell array chip described above relates to a microwell array chip having a shape and a size such that only one lamp ball is stored in one micropore array.
  • the microwell has a cylindrical shape, a rectangular parallelepiped, an inverted cone shape, or an inverted pyramid shape, or a shape obtained by combining two or more of these.
  • a second aspect of the present invention relates to a microwell array chip for detecting antigen-specific lymphocytes, which has a plurality of microwells containing one test lymphocyte.
  • microwell array chip according to the second aspect of the present invention, the following aspects are preferable.
  • the microwell has a diameter of 5 to 100 ⁇ m and a depth of 5 to: LOO ⁇ m.
  • the subject lymphocytes are derived from blood
  • the subject lymphocyte is a B lymphocyte or a T lymphocyte.
  • an antigen is added to each microphone orifice of the microwell array chip according to the second aspect of the present invention to stimulate an analyte lymphocyte and react with the antigen.
  • the present invention relates to a method for detecting antigen-specific lymphocytes, including detecting spheres. In the method for detecting an antigen-specific lymphocyte according to the third aspect of the present invention, the following aspects are preferred.
  • Detection of cells that respond to the antigen is performed using an activation marker protein expressed on the surface of the subject lymphocyte cells stimulated and activated by the antigen as an indicator.
  • Detection of cells that react with the antigen is performed using the proliferation of the test lymphocyte cells or the antibody production as an index.
  • the antigen is a protein, peptide, DNA, RNA, lipid, sugar chain, or organic polymer compound
  • the antigen is a bacterium, virus, autoantigen, cancer antigen or allergen.
  • a fourth aspect of the present invention provides an antigen comprising recovering, from a microplate, a subject lymphocyte that reacts with an antigen detected by the antigen-specific lymphocyte detection method according to the third aspect of the present invention.
  • the present invention relates to a method for producing a specific lymphocyte.
  • one lymphocyte which specifically reacts with a certain antigen hereinafter referred to as an antigen-specific lymphocyte
  • the present invention relates to a method for cloning an antigen-specific antigen receptor gene from a heterologous lymphocyte.
  • the selection of the one antigen-specific lymphocyte is performed by selecting each microwell of a microwell array chip for detecting an antigen-specific lymphocyte having a plurality of microwells containing one analyte lymphocyte.
  • the antigen-specific lymphocytes reacted with the antigen are detected, and the detected antigen-specific lymphocytes are removed from the microwell.
  • RT—PCR is performed by preparing cDNA by reverse transcriptase and then performing PCR twice using a primer mix for the antigen receptor gene.
  • the antigen-specific lymphocytes are B lymphocytes or T lymphocytes
  • the antigen-specific antigen receptor gene is an immunoglobulin gene when the antigen-specific lymphocyte is a B lymphocyte, and a T cell receptor gene when the antigen-specific lymphocyte is a T lymphocyte. Is,
  • the antigen-specific lymphocyte is a B lymphocyte, and the antigen-specific immunoglobulin gene is cloned;
  • a sixth aspect of the present invention is a method for cloning an antigen-specific antigen receptor gene according to the fifth aspect of the present invention.
  • the antigen-specific lymphocyte is a B lymphocyte
  • the antigen-specific immunoglobulin is The present invention relates to a method for producing a monoclonal antibody using an antigen-specific immunoglobulin gene cloned by a method for cloning a gene.
  • a seventh aspect of the present invention is a method for cloning an antigen-specific antigen receptor gene according to the fifth aspect of the present invention.
  • the antigen-specific lymphocyte is a T lymphocyte
  • the antigen-specific T cell The present invention relates to a method for producing a material for gene therapy using an antigen-specific T cell receptor gene cloned by a method in which a receptor gene is cloned.
  • FIG. 1 is an explanatory view of a method for measuring a change in the concentration of intracellular Ca ions by using a Ca ion-dependent fluorescent dye.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating the steps from dispensing cells to a microarray chip, stimulating antigen, and removing cells in a method using a fluorescent dye.
  • Figure 3 shows a 96-well plate used for conventional antigen-specific lymphocyte measurement.
  • Figure 4 shows the results of a test on the efficiency of introduction of cells into microgels using a fluorescence microscope or a microarray scanner.
  • Figure 5 shows the results of detection of antigen-specific B lymphocytes by a microarray scanner.
  • FIG. 6 is a plot of the fluorescence intensity of 25 (5 ⁇ 5) cells surrounded by the frame shown in FIG.
  • FIG. 7 shows the frequency of cells (antigen-specific B lymphocyte) whose fluorescence signal was enhanced after antigen stimulation.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram showing the amplification of an antibody gene from an antigen-specific B lymphocyte by PCR.
  • FIG. 9 shows a comparison between the sequence of the antibody (L chain) gene obtained in the example and the sequence of the antibody gene contained in the existing database.
  • FIG. 10 shows a comparison between the sequence of the antibody (H chain) gene obtained in the example and the sequence of the antibody gene contained in the existing database.
  • the microwell array chip of the present invention has a plurality of microwells, stores one specimen lymphocyte in each microwell, and detects antigen-specific lymphocytes in units of one.
  • a microarray array chip used for: It has a shape and dimensions that allow only one lymphocyte to be stored in a container.
  • the shape of the microwell can be, for example, a cylindrical shape. (An inverted quadrangular pyramid, an inverted pentagonal pyramid, an inverted hexagonal pyramid, a heptagon or more inverted polygonal pyramid), or a combination of two or more of these shapes. For example, some may be cylindrical and the rest may be inverted conical.
  • the bottom surface is the opening of the microwell, but the inverted cone or the inverted pyramid is a part of which is cut off from the top (in this case, the bottom of the microphone port).
  • Cylindrical and rectangular parallelepipeds are usually flat at the bottom of the microwell, but can be curved (convex or concave).
  • the bottom of the microwell can be curved as in the case of an inverted cone or an inverted pyramid with a part cut off from the top.
  • the shape and dimensions of a microwell should be such that one microsphere is stored in one microwell, taking into consideration the type of lamp sphere to be stored in the microwell (shape and dimensions of the sphere). Is determined as appropriate.
  • the diameter of the largest circle inscribed in the plane shape of the microwell 1 to 2 times the diameter, preferably 1.1 to 1.9 times, more preferably 1.2 to 1.8 times the diameter It is appropriate that it is an enclosure.
  • the depth of the microwell is in the range of 1 to 2 times, preferably 1.1 to 1.9 times, more preferably 1 to 2 times the diameter of the lymph sphere to be stored in the microwell. It is appropriate to be in the range of 2 to 1.8 times.
  • the microwell is cylindrical, its dimensions can be, for example, 5-100 m in diameter; if the lymper sphere is a B-lymper sphere, preferably the diameter is 5-15 ⁇ m.
  • the depth can be, for example, 5 to 100 ⁇ m, and when the lymph sphere is a B lymph sphere, preferably, the depth can be 5 to 40 m.
  • the size of the microwell is appropriately determined in consideration of a suitable ratio of the diameter of the rim to be stored in the microwell to the size of the microphone orifice.
  • the number of Maikurouweru having one micro Ueno rare Ray chip is not specifically limited, from the viewpoint of the frequency of antigen-specific lymphocytes is the case often from 1 to 10 5 it is about 500, 1 For example, in the range of 2,000 to: 1,000,000 per cm 2 .
  • the microwell array chip for antigen-specific lymphocyte detection of the present invention has a plurality of microwells, and each microwell contains one specimen lymphocyte.
  • the microarray chip the microarray chip of the present invention described above can be used as it is.
  • the microwell array chip for detecting antigen-specific lymphocytes according to the present invention specifies antigen-specific lymphocytes at the level of individual cells, since each microphone port contains one specimen lymphocyte. It becomes possible.
  • the specimen lymphocyte reacting with the antigen is contained. Can be identified as a single cell.
  • an antigen-specific antibody gene can be cloned, it can be used to produce human monoclonal antibodies in large quantities. By administering this antibody to patients with infectious diseases, it is thought that it can be used for treatment and prevention of infectious diseases.
  • the same microwell may contain cells other than the lymphocytes together with the specimen lymphocytes.
  • the specimen lymphocytes are stored in the microwell together with, for example, a culture solution.
  • the culture solution include any of the following. 1.137 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 1.8 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , lmg / ml glucose, lmg / ml BSA, 20 mM HEPES (pH 7.4)
  • the subject lymphocytes can be derived from blood, for example, B lymphocytes or T lymphocytes.
  • Other examples include lymphocytes derived from lymphoid tissues such as tonsils (lymph node) and spleen, and lymphocytes infiltrating lesion sites such as cancer-infiltrating lymphocytes.
  • the method for detecting antigen-specific lymphocytes of the present invention comprises the steps of: adding an antigen to each of the micropores of the above-described microphone-mouthed array chip; stimulating the lymphocytes; and detecting lymphocytes that react with the antigen. Including doing.
  • the addition of the antigen to each microwell can be performed as follows.
  • the antigen detected by the method for detecting an antigen-specific lymphocyte according to the present invention is not particularly limited.
  • it can be a bacterium, virus, autoantigen, cancer antigen or allergen.
  • Culture of cells for example, by suspending the lymphocytes in culture, after dispensing the Maikurou Weru, at room temperature or 37 ° C, be carried out by culturing in air or C0 2 incubator in beta it can.
  • the detection of cells that react with the antigen can be performed, for example, by (1) using a Ca ion-dependent fluorescent dye. (2) Activation expressed on the surface of a subject lymphocyte stimulated and activated by the antigen. The marker protein is used as an index, (3) the degree of polarization of the fluorescence emitted from the fluorescent substance in the specimen lymphocyte is used as an index, or (4) the proliferation or antibody production of the specimen lymphocyte cells is used as an index. It can be done as More specifically, for example, when an antigen binds to an antigen receptor (immunoglobulin) of B lymphocyte, intracellular signal transduction first occurs, followed by cell proliferation and antibody production.
  • an antigen receptor immunoglobulin
  • cells that react with the antigen can be detected by detecting intracellular signal transduction, cell proliferation, and antibody production by various methods.
  • intracellular signaling occurs first, and Subsequently, cell proliferation and site force production occur. Therefore, cells that respond to an antigen can be detected by detecting intracellular signal transmission, cell proliferation, and site force-in production by various methods.
  • Detection of cells that respond to an antigen by detecting intracellular signal transduction can be performed, for example, by using a fluorescent dye that changes the concentration of intracellular Ca ions in a Ca ion.
  • a Ca ion-dependent fluorescent dye Fura-2 or Fluo-3
  • a fluorescence microscope or microarray scanner as a detector.
  • a Ca ion-dependent fluorescent dye Fura-2 or Fluo-3
  • the Ca ion concentration in the B lymphocytes increases.
  • Ca ions bind to the Ca ion-dependent fluorescent dye, and the fluorescence intensity is enhanced.
  • the color is bluish when the Ca ion concentration is low, and reddish when the Ca ion concentration is high.
  • B lymphocytes (antigen-specific) whose intracellular Ca ions have been increased by stimulation with an antigen can be detected using a microwell array chip.
  • Detection of cells that respond to the antigen by detecting cell proliferation can also be performed, for example, by counting the number of cells using a living cell-specific fluorescent dye.
  • This method is specifically based on antigen-mediated B lymphocyte 37 ° C, 3 days when cultured in the stimulated C0 within 2 Inkyubeta, cells proliferation. After the cells have proliferated, Fluorescein diacetate (FDA) is present in the culture broth. Get the solution calorie. These reagents penetrate the membranes of living cells and are degraded by esterases inside the cells, producing membrane-impermeable fluorescent dyes.
  • FDA Fluorescein diacetate
  • the number of living cells can be measured by measuring the sum of the fluorescence intensities emitted by the living cells in the well using a fluorescence microscope or a microarray scanner. . By measuring antibody production, cells that react with the antigen can be detected. Antibody production can be detected by measuring the antibody immunochemically.
  • signal transduction, cell proliferation, and antibody production can be detected using mitogens, lectins, antibodies, site force proteins, PMA, and Ca ionophores.
  • the microwell array chip for the method using a fluorescent dye is described below. The process from dispensing cells to the antigen, stimulating the antigen, and removing it will be described with reference to FIG.
  • the cells to be placed in the microwells can be obtained, for example, by separating a lymphocyte fraction from peripheral blood and then separating and purifying a B lymphocyte fraction.
  • the cells are suspended in a FluoS / AM ⁇ AtM) solution, kept at room temperature for 30 minutes, and the cells are further washed with a buffer to remove the dye not loaded into the cells.
  • the cells from which the dye has been removed are dispensed into microwells.
  • the fluorescence intensity (A) at that time is measured.
  • the antigen solution is poured into the gap between the slide glass and the cover glass, exchanged with a buffer solution, and the fluorescence of cells stimulated by the antigen is measured. Measure the fluorescence intensity (B) 1-2 minutes after the stimulation. Select cells with a high fluorescence intensity ratio (B / A) before and after stimulation.
  • the power The lath peels off easily.
  • Cells that responded to the antigen stimulation are selected based on the ratio (B / A) of the fluorescence intensity of the unstimulated cells to the fluorescence intensity of the cells stimulated with the antigen, and the antigen-specific lymphocytes are extracted. Can be collected.
  • the cloning method of the present invention selects one lymphocyte (antigen-specific lymphocyte) that specifically reacts with a certain antigen, and then extracts the antigen-specific antigen receptor from this one antigen-specific lymphocyte. This is a method of cloning a gene.
  • the cloning method of the present invention is particularly effective when the frequency of antigen-specific lymphocytes is 0.1% or less.
  • the antigen-specific lymphocyte can be, for example, a B lymphocyte or a T lymphocyte.
  • the antigen-specific antigen receptor gene is an immunoglobulin gene when the antigen-specific lymphocyte is a B lymphocyte, and a T cell receptor gene when the antigen-specific lymphocyte is a T lymphocyte.
  • Each lymphocyte in the blood reacts to a different antigen. Therefore, in the present invention, for example, a B lymphocyte that specifically reacts with an antigen is detected, and an immunoglobulin (antibody) gene that reacts with the antigen (pathogen) is detected from the B lymphocyte by RT-PCR. Can be amplified.
  • the ⁇ -cell receptor gene that responds to the antigen (pathogen) can be amplified by R-PCR. .
  • Selection of one antigen-specific lymphocyte can be performed, for example, by a method using a microwell array chip.
  • a microwell array chip for example, an antigen is placed in each microwell of an antigen-specific lymphocyte detection microwell array chip having a plurality of microwells containing one specimen lymphocyte. After the addition, the lymphocytes that have reacted with the antigen are detected, and the detected antigen-specific lymphocytes are removed from microwells, whereby one antigen-specific lymphocyte can be obtained. This method will be described more specifically. (Mic mouth ⁇ L array chip)
  • microwell array chip a chip having a plurality of microwells and each microphone port containing one specimen lymphatic ball can be used.
  • antigen-specific lymphocytes can be identified at the cellular level.
  • the sample lymphocyte contained in the microphone port is one, the sample lymphocyte that reacts with the antigen can be identified as one cell.
  • antigen-specific lymphocytes can be detected as a single cell. And detected Remove the single antigen-specific lymphocyte and clone the gene.
  • the same microwell may contain cells other than the lymphocytes together with the specimen lymphocytes. This is because cells other than lymphocytes do not react with the antigen and are not detected.
  • the microarray array chip include the microarray array chip of the present invention.
  • the sample lymphocytes are stored in the microwell together with the culture solution. Examples of the culture solution include the following.
  • the subject lymphocytes can be of blood origin, for example, B lymphocytes or T lymphocytes.
  • Other examples include lymphocytes derived from lymphoid tissues such as tonsils (lymph nodes) and spleen, and lymphocytes infiltrating a lesion site such as cancer-infiltrating lymphocytes. (Detection method for antigen-specific lymphocytes)
  • the method for detecting an antigen-specific lymphocyte includes adding an antigen to each microwell of the microwell array chip, stimulating cells, and detecting cells that respond to the antigen.
  • the addition of the antigen to each microwell can be performed as follows.
  • the antigen detected by this method is not particularly limited, and may be, for example, a protein, peptide, DNA, RNA, lipid, sugar chain, or organic compound.
  • the antigen can be a bacterium, virus, autoantigen, cancer antigen or allergen, or the like.
  • the cells can be cultured, for example, by suspending lymphocytes in a culture solution, dispensing into a well, and culturing at room temperature or at 37 ° C in the air or in a CO 2 incubator. Detection of cells that react with the antigen can be performed as follows.
  • an antigen binds to the antigen receptor (immunoglobulin) of B lymphocyte Then, intracellular signal transduction first occurs, followed by cell proliferation and antibody production. Therefore, cells that react with the antigen can be detected by detecting intracellular signal transduction, cell proliferation, and antibody production by various methods.
  • an antigen binds to an antigen receptor of a T lymphocyte
  • intracellular signal transduction first occurs, followed by cell proliferation and cytokine production. Therefore, cells that respond to the antigen can be detected by detecting intracellular signal transduction, cell proliferation, and site force production by various methods.
  • the detection of cells that respond to an antigen by detecting intracellular signal transduction can be performed, for example, by using a Ca ion-dependent fluorescent dye to change the concentration of intracellular Ca ions.
  • Flua_2 or Fluo-3 is used as a fluorescent dye, and a fluorescence microscope or microarray scanner is used as a detector.
  • a Ca ion-dependent fluorescent dye Fura-2 or F1uo_3 is introduced into the B lymphocyte.
  • B lymphocytes Subsequent stimulation of B lymphocytes with antigen increases intracellular Ca ion concentration.
  • the Ca ion binds to the Ca ion-dependent fluorescent dye, and the fluorescence intensity is enhanced.
  • the Ca ion concentration is low, the color is bluish, and when it is high, the color is reddish.
  • B lymphocytes (antigen-specific) whose intracellular C C ions have been increased by stimulation with an antigen are converted into microspheres. It can be detected using an L array chip. Detection of cells that react with an antigen by detecting cell proliferation can also be performed, for example, by counting the number of cells using a living cell-specific fluorescent dye.
  • B lymphocytes are stimulated with an antigen, and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 3 days, whereby the cells proliferate. After the cells have proliferated, there is Fluorescein diacetate (FDA) in the culture broth.
  • FDA Fluorescein diacetate
  • FDA Canolepoxy-phenolic diacetate
  • CFSE succinimidyl ester
  • the antibody when cultured 37 ° C, 1 week to stimulate B lymphocytes with antigen at C 0 2 incubator, the antibody is secreted into the culture medium.
  • Antigen-specific antibodies secreted into the culture are detected by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
  • signal transduction, cell proliferation, and antibody production can be detected by using mitogen, lectin, antibody, cytokine, PMA, and Ca ionophore.
  • the process of dispensing cells to a microarray chip, stimulating antigen, and removing the cells using a fluorescent dye is described below with reference to FIG.
  • the cells to be put into the well are obtained by separating the lymphocyte fraction from peripheral blood and then separating and purifying the B lymphocyte fraction.
  • the cells are suspended in an F1uo3 / AM (2 ⁇ M) solution, kept at room temperature for 30 minutes, and the cells are further washed with a buffer to remove the dye not loaded into the cells.
  • the cells from which the dye has been removed are dispensed into a microphone orifice.
  • the fluorescence of unstimulated cells is measured. Then, measure the fluorescence intensity ( ⁇ ) at that time.
  • the antigen solution is poured into the gap between the slide glass and the force glass, replaced with a buffer solution, and the fluorescence of cells stimulated by the antigen is measured.
  • thorn Measure the fluorescence intensity (B) 1 to 2 minutes after intensification. Sort cells with high fluorescence intensity ratio (B / A) before and after stimulation.
  • Cells that have responded to the antigen stimulation are selected based on the ratio (B / A) of the fluorescence intensity of unstimulated cells to the fluorescence intensity of cells stimulated by the antigen, and are removed.
  • the selected (detected) antigen-specific lymphocytes can be subjected to subsequent gene amplification in a microwell without being removed from the microwell.
  • the extracted antigen-specific lymphocytes are lysed using a cell lysing agent, and then, using RT-PCR, if the antigen-specific lymphocytes are B lymphocytes, antigen-specific immunoglobulins (antibodies) If the gene is cloned and the antigen-specific lymphocyte is a T lymphocyte, the antigen-specific T cell receptor gene is cloned.
  • Known cell lysing agents can be used as they are, and examples thereof include the following.
  • the antigen receptor gene in B lymphocytes is the same as the antibody gene, and is called immunoglobulin as a protein.
  • Antigen receptors are located on the membrane surface of B lymphocytes (membrane-type immunoglobulins), and antibodies are usually produced as secreted proteins (secretory immunoglobulins). The difference lies on the C-terminal side of the protein.
  • Membrane immunoglobulin has a membrane domain buried in the cell membrane and a portion sticking out to the cytoplasmic side. Secreted immunoglobulins are also produced from the same gene. However, due to alternative splicing, the C-terminal side of the protein does not have a membrane domain unlike membrane-type immunoglobulin. As a result, it is produced as a secreted protein. However, the antigen binding sites of the two proteins are the same. Therefore, in the case of B lymphocytes, the cloning of the antibody gene and the cloning of the antigen receptor gene are the same.
  • T lymphocytes In the case of T lymphocytes, there is no secreted form of the antigen receptor. Therefore, the antigen receptor gene will be cloned.
  • the present invention will be further described by taking the width of the antigen-specific immunoglobulin gene as an example.
  • cDNA is prepared using reverse transcriptase.
  • the desired antigen-specific immunoglobulin gene can be amplified (cloning) by performing PCR twice using the primer mix for the immunoglobulin gene.
  • Preparation of cDNA using reverse transcriptase is performed by a conventional method (for example, Sambrook J, Russell DW in Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3 rQed ( Cold Spring Harbor Laboratory Press , New York, 2001)). It can be carried out.
  • the antibody molecule is composed of a combination of heavy and light chains, and the heavy chain of the human antibody gene has about 200 V-region gene fragments, about 20 D-fragments, 6 It consists of two types of J fragments, and when differentiated into B lymphocytes, one type of V fragment, D fragment, and J fragment Combined (V / D / J rearrangement) to form one antigen binding site. The same applies to light chains.
  • Each B lymphocyte expresses one type of antibody molecule on the cell surface.
  • Antibody molecule H chains consist peptide chain L chain by two respective, left V region (H chain V H region, L chain have in V K is V 3 ⁇ 4 region) of the structural diagram shown in FIG. 8 Binds to antigen.
  • the numbers of H-chain and L-chain subfamilies are shown in the following table. table 1
  • the V region of the human antibody gene chain is classified into seven subfamilies. Since the sequences of the V fragments in the subfamily are very similar, it is possible to set a common primer.
  • C H region includes Cyl ⁇ 4, C ⁇ CS, Cal ⁇ 2, C £.
  • primers are designed for IgG and IgM, the main types of antibodies in serum, and One common sequence was used for C ⁇ 1 to 4. Two types of primers are used in combination with C. ** C ⁇ chain has C ⁇ 1 to CL7 chains, but one type of common sequence is used as a primer.
  • the gene in the V region is about 400 bp.
  • PCR1 cDNA of the C region is amplified from the leader sequence (L).
  • PCR2 approximately 400 bp of cDNA is amplified inside PCR1 (from the start of the V region to the start of the C region). Then, the sequence of the cDNA amplified in the second PCR reaction is analyzed. This will be further described.
  • the primers having different sequences are used for PCR 1 and PCR 2 for the following reasons.
  • the product amplified in PCR 1 is amplified again in PCR 2, and the products of PCR 1 are not only specific but also include non-specific amplification products.
  • PCR 2 Amplification with the primer will amplify specific DNA sequences, but will also amplify nonspecific sequences. Therefore, in PCR 2, a primer sequence that is slightly inside the position of the primer in PCR 1 in the DNA sequence to be amplified in PCR 1 is used. By doing so, it is possible to amplify a specific DNA sequence without amplifying the non-specific DNA sequence amplified in PCR 1.
  • the antigen-specific lymphocyte is a perrymocyte
  • the antigen-specific immunoglobulin (antibody) gene is cloned. Then, using the cloned gene, a monoclonal antibody can be produced. Monoclonal antibodies can be produced using the cloned gene by a conventional method. The cDNA sequence of the V region cDNA and the gene sequence of the C region amplified by PCR are combined, and the antibody is expressed using an expression vector. Create a molecule.
  • the gene to be introduced into the expression vector in the method for producing a monoclonal antibody may be not only the antibody molecule (whole) but only the V region or a part of the V region + C region.
  • H and L chains are usually cloned separately. In this case, perform the reaction in one tube until RT, and use two tubes for the H chain and the L chain in the subsequent PCR. In some cases, H and L chains can be synthesized in a single tube.However, since the width tends to increase mainly, it is often necessary to amplify the H and L chains. It is preferable to perform PCR separately in tubes. To obtain an antibody, it is necessary to express both the H chain and the L chain, and the expression vector contains both the H chain and the L chain.
  • the H chain and the L chain are introduced into separate expression vectors, and when expressing the protein, both expression vectors are simultaneously introduced into the same cell so that the H chain and the L chain can be expressed in one cell.
  • Expression of H and L chains in one cell by constructing an expression vector in which H and L chains are simultaneously inserted into one vector and introducing it into cells.
  • an expression vector is introduced into animal cells, the antibodies produced will be exactly the same as those produced in the human or mammalian body.
  • the amino acid sequence is exactly the same as above, but the sugar chain is not bound.
  • the antigen-specific lymphocyte is a T lymphocyte
  • the antigen-specific ⁇ -cell receptor gene is cloned.
  • Gene therapy can be performed using the cloned antigen-specific receptor gene. For example, by introducing a cloned T cell receptor gene into T lymphocytes or T lymphocyte precursor cells, T lymphocytes expressing a ⁇ cell receptor specific to a pathogen can be artificially transformed. Can be created. The immune function can be restored by administering the T lymphocyte produced in this way to a patient with reduced immune function.
  • Linno sphere fraction using Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden;) The B lymphocyte fraction was further separated and purified from the fraction.
  • Microarray chip See Fig. 2
  • This device basically uses a microarray scanner (CRBIO Ile-FITC) of Hitachi Software Engineering Co., Ltd. (Yokohama I), with the following changes.
  • the above-mentioned cell suspension was added to the above-mentioned microphone-mouth-type ELISA chip and allowed to stand for 5 minutes. RPMI1640 / 10 ° / cells that did not enter the microphone mouth. FCS solution And rinsed off.
  • the diameter of the lamp ball is about 8 ⁇ (8 ⁇ miliim), and the diameter of the microphone opening used is ⁇ , so one microphone ball contains one lymph ball.
  • a force par glass was placed on the seal and filled between the tip and the cover glass with RPMI1640 0% FCS solution.
  • the microarray array chip was inserted into a microarray scanner, scanned at a resolution of 10 ⁇ m, and the data was saved (fluorescence data before antigen stimulation: A).
  • Mouse linospheres were fluorescently labeled using CellTracker Orange (Molecular Probe).
  • Mouse lymphocytes were obtained as follows.
  • the spleen is removed from the mouse and transferred to a plastic Petri dish containing PBS.
  • PBS a plastic Petri dish containing PBS.
  • the removed lymphocytes were suspended in RPMI 1640, 10% FCS solution, and the number of lymphocytes was counted. Fluorescent labeling of mouse lymphocytes was performed as follows.
  • Microwells with a diameter of m and a depth of 12 m are arranged on a chip of 2 cm x 2.5 cm with a vertical and horizontal distance of 15 ⁇ m (the distance from the center of the microwell to 25 ⁇ m).
  • a chinore with a thickness of ⁇ ⁇ about 1 mm and a length of 2 cm was placed on each side of the microwell array chip.
  • the pipetting operation Outside cells were washed away. By repeating this series of cell seeding and washing operations several times, cells can be added to more cells. Finally, the cells were washed with a buffer (RPMI 1640/10 ° /. FCS solution) so that no cells remained outside the wells.
  • a buffer RPMI 1640/10 ° /. FCS solution
  • Fig. 4 shows the results. Lymphocytes are approximately 8 // m in diameter, and the microwell used is 10 ⁇ m in diameter, so one microwell contains one lymphocyte. 1 cluster (30 X 30).
  • the figure on the left is the result of observation with a fluorescence microscope, and it was confirmed that cells entered about 85% of the wells.
  • the right figure is the result of observing another sample with a microarray scanner, and it was confirmed that about 99% of the cells contained cells.
  • B lymphocyte was prepared from peripheral blood on the fourth or sixth day by a conventional method.
  • Human B lymphocytes were converted to calcium fluorescent indicator Fluo-4 / AM (Molecular Probes) 4 ⁇ M, Cell Tracker Orange (Molecular Probes ft) 1 ⁇ M, Pluronic F-127 (Molecular Probes 3 ⁇ 4 :) Buffer containing 0.02% (Loading Buffer (20raM HEPES, pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 1.8 mM CaCl 2 2H 20 , ImM MgCl 2 , lmg / mL glucos e, lmg / mL BSA)) to introduce Fluo-4 and Cel lTracker Orange into the cytoplasm.
  • B lymphocytes loaded with Fluo-4 and CellTracker Orange were seeded on the same microarray chip as in Example 2 in the same manner as in Example 2. Thereafter, B lymphocytes loaded with Fluo-4 and CellTracker Orange seeded on a microwell array chip were stimulated with the hepatitis B virus antigen HBs protein, and the fluorescence of the B lymphocytes before and after the stimulation was applied to the microarray. Observed at Reikiana. Fig. 5 shows the results.
  • hepatitis B virus antigen HBs protein Stimulation with the hepatitis B virus antigen HBs protein was given as follows. Hepatitis B, which was extracted from the microarray chip taken out from the microarray scanner with RPMI 1640 0% FCS solution by chip and diluted and dissolved in RPMI 1640/10% FCS solution to lOO ⁇ g / mL. The virus antigen HBs protein was added, reinserted into a microarray scanner, and scanned at a resolution of 2.5 ⁇ m about 1 minute later.
  • the left figure in FIG. 5 is a fluorescence image before stimulating lymphocytes. The image shows a pale light blue color because the lymphocytes into which Fluo-4 has been introduced emit a small amount of fluorescence, but the fluorescence intensity is quite low.
  • the right figure is a fluorescence image after stimulating lymphocytes with an antigen (hepatitis B virus antigen HBs protein 100 ⁇ g / mL). For most lymphocytes, the fluorescence intensity remains unchanged. However, the fluorescence of the antigen-specific B lymphocyte (indicated by the arrow) increased, and the image shows red.
  • an antigen hepatitis B virus antigen HBs protein 100 ⁇ g / mL
  • lymphocytes that did not respond to the stimulus had a mean of 52,000 (51683.875) before stimulation, an average of 39000 (38720.833) after stimulation, an average of 0.75 times the change, and a significant change in fluorescence intensity. No significant change is seen.
  • the center straight line shows the fluorescence intensity when the fluorescence intensity before and after stimulation does not change
  • the two straight lines (shaded lines) on both sides show the fluorescence intensity before stimulation and the fluorescence intensity after stimulation. Shows the fluorescence intensity when the fluorescence intensity increased by 4 times (upper straight line) or 1/4 times (lower straight line).
  • the fluorescence intensity of the antigen-specific B lymphocyte (point of the arrow) is located slightly above the upper straight line.
  • One microwell contains one lymphocyte
  • the B lymphocytes were labeled with 4 ⁇ M Fluo-4 (Molecular Probes) and 1 M CellTracker Orange (Molecular Probes II) in the same manner as in Example 3, and then seeded on a microarray chip. It was stimulated with hepatitis virus virus antigen (HBs protein ⁇ g / mL). The fluorescence of cells before and after antigen stimulation was measured using a microarray scanner, and the fluorescence signal of Fluo-4 was weak before stimulation, and the cells with enhanced fluorescence signal of Fluo-4 after stimulation (antigen-specific). B lymph spheres) were counted. Next, the fluorescence of CellTracker Orange was observed, and the total number of B lymphocytes was counted.
  • HBs protein ⁇ g / mL hepatitis virus virus antigen
  • the frequency (percentage) of the number of cells with increased Fluo-4 fluorescence in response to the antigen divided by the total number of B lymphocytes was calculated and shown in the graph.
  • Fig. 7 shows the results.
  • the number of cells (antigen-specific B lymphocyte) whose fluorescence signal was enhanced after stimulation was measured as follows. Obtain fluorescence images of Fluo-4 and CellTracker Orange before and after antigen stimulation using a microarray scanner.
  • Hepatitis B virus antigen-specific B lymphocyte in peripheral blood of healthy volunteers whose titer of antibody against HBs antigen of hepatitis B virus was increased by vaccination with hepatitis B virus vaccine.
  • the sphere is only 1-2 ° / of the total B-limb sphere. It is.
  • the ratio of antigen-specific B lymphocytes to total B lymphocytes increases at the peak 4 to 6 days after vaccination, and then decreases to the ratio before vaccination.
  • 2 ⁇ 10 6 B lymphocytes were added to 2 ⁇ MF 1 uo 3 / AM (Dojin, Kumamoto) / loading buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 1.8 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , lmg / mL glucose , Lmg / mL BSA, 20 mM HEPES (pH 7.4)) and incubated at room temperature for 30 minutes. Wash cells with loading buffer to remove F1uo3 / AM that was not introduced into cells. The cells were then RPMI1640 / 10 ° /. Suspended in FCS solution.
  • loading buffer 137 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 1.8 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , lmg / mL glucose , Lmg / mL BSA, 20 mM HEPES (pH 7.4)
  • the micro urea ray chip is fabricated using poly (dimethyl si loxane) (PDMS), and a microwell with a diameter of 10 m and a depth of 32 // m is placed on a 2 cm x 2 cm chip vertically and horizontally with a width of 30 ⁇ m. They are arranged at an interval of m (the distance from the center of the microphone to the center is 40 m). On both sides of the chip, a seal with a thickness of lmm, a width of about lmm and a length of 2cm was occupied.
  • PDMS poly (dimethyl si loxane)
  • Microarray scanner This device basically uses a microarray scanner (CRBIOlie) of Hitachi Software Engineering Co., Ltd. (Yokohama Corporation), with the following changes.
  • One of the installed lasers (for Cy3, 532 nm; for Cy5, 635 nm) is replaced with a 473 nm laser.
  • the above cell suspension is added to the above microarray chip and left for 5 minutes. Cells that did not enter the microspheres were washed away using RPMI1640 / 10% FCS solution.
  • the diameter of the limp sphere is about 8 ⁇ m, and the diameter of the velvet used is 10 / m, so that one limber sphere is contained in one mic velvet.
  • Fluorescence data before antigen stimulation A
  • RPMI1640 / 10 ° / between the chip and cover glass Remove the FCS solution and dissolve in RPMI1640 / 10% FCS solution.
  • the microarray chip was inserted into a microarray scanner, scanned at a resolution of 10 ⁇ m, and the data was saved (after antigen stimulation).
  • the cells were sorted under a microscope by using a glass cabinet with a micromanipulator.
  • the single antigen-specific B lymphocytes is added to the PCR tube (5 ⁇ L) 0 cells to a final concentration when diluted to 15.
  • 15 mu cell lysate L 25 ⁇ L: lx I st strand buffer [GIBC0- BRL, SuperScriptll [attached]], 0.2 mM dNTP, 0.25% NP-40, 0.1 nig / mL BSA, 10 mM DTT, Random Primer 0.05 ⁇ M, 1 U / ⁇ L RNasin [Promega , Madison, Wl]), add the reverse transcriptase SuperScriptll (GIBC0-BRL, Rockville, MD) (4.85 ⁇ L, 50U), and react at 37 ° C for 1 hour. Was synthesized.
  • RNase Inhibitor (RNasin 40U / ⁇ L) 0.625
  • cDNA was prepared from mRNA of one lymphocyte using reverse transcriptase. Amplification of antibody gene:
  • the V region of the H chain of the human antibody gene is classified into seven subfamilies. Since the sequences of the subfamily V fragments are very similar, it is possible to set a common primer. A primer was set for each H- and L-chain subfamily, and primers for all H- and L-chain subfamilies were mixed. The gene was amplified.
  • the DNA sequence from the Leader sequence of the immunoglobulin (antibody) gene to the constant region (C) region was amplified by the PCR1 reaction.
  • the sequence of the primer (for H chain) used in the above reaction is shown below.
  • Primer 1 5 Mix (10 ⁇ ⁇ each) (primer for ⁇ region--)
  • PCR 2 reaction mix the reaction solution 2 of PCR 1 with 18 // L PCR mix (final concentration: lx TAKARA ExTaq buffer, 0.25 mM dNTP, Prime for each subfamily: 0.5 ⁇ , ExTaq 0.05 U / ⁇ L), no calories, 94 ° C, 3 min; (94 ° C, 30 sec; 60 ° C, 1 min; 72 ° C, 1 min 30 sec) x 40 cycles; 72. C, 5 min; 10 ° C, ⁇ Reaction.
  • the DNA sequence from the variable (VH) region to the constant region of the immunoglobulin (antibody) gene amplified by the PCR1 was amplified by the PCR2 reaction.
  • the following shows the sequence of the primer (for H chain) used in the above reaction.
  • Primer 2 3: Mix (10 ⁇ M each)
  • the sequence of the primer (for L chain) used in the above reaction is shown below.
  • FIG. 9 shows the sequence of the L chain
  • FIG. 10 shows the sequence of the H chain.
  • the base sequence shown at the top is the sequence of the antibody gene that was actually amplified from one B lymphocyte by RT-PCR and sequenced
  • the base sequence shown at the bottom is the database It is an existing array registered in.
  • one lymphocyte in blood is added so as to enter one microwell, and these lymphocytes are stimulated with an antigen.
  • antigen refers to a pathogen such as bacteria or virus in an infectious disease.
  • Each lymphocyte in the blood reacts to a different antigen.
  • a B A sphere can be detected.
  • the detected antigen-specific B lymphocytes can be recovered. If antigen-specific B lymphocytes can be collected, an antibody gene that reacts with the antigen (pathogen) can be amplified, for example, by PCR in a tube separate from the microwell.
  • Antibody genes that respond to antigens can also be amplified in microwells where antigen-specific B lymphocytes have been detected.
  • the method for detecting antigen-specific lymphocytes of the present invention is performed using a microwell array chip. Therefore, since the detected antigen-specific lymphocytes are in the micropore, it is easy to process the cells (separation of cells / preparation of DNA / RNA). In addition, the response of the cell to the antigen can be detected. It is possible to analyze not only the antigen but also the response of cells to various stimuli, and the effects of various reagents and the like on the response of cells.
  • tumor-specific lymphocytes By detecting pathogen-specific lymphocytes for infectious diseases and cloning the pathogen-specific antibody gene, tumor-specific lymphocytes can be detected for cancer, and By cloning the tumor-specific T cell receptor gene, it is expected that antibody therapy using antibodies and gene therapy using T cell receptor genes will be possible.
  • autoimmune diseases by detecting autoreactive lymphocytes and cloning autoantibodies and autoantigen-specific T cell receptor genes
  • allergen-specific lymphocytes and cloning the IgE gene it is possible to accurately ascertain the etiology * of the disease state and to monitor the treatment corresponding to the etiology and monitor the therapeutic effect.
  • allergen-specific lymphocytes and cloning the IgE gene it is possible to accurately ascertain the etiology * of the disease state and to monitor the treatment corresponding to the etiology and monitor the therapeutic effect.
  • comprehensively monitoring all antibody genes and T cell receptor genes possessed by individuals for all lymphocytes it is possible to monitor the

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Description

明細書
抗原特異的リ ンパ球検出用マイク口ゥェルァレイチップ、
抗原特異的リ ンパ球の検出法及ぴ製造方法、 並びに 抗原特異的リ ンパ球抗原受容体遺伝子のクローニング方法 技術分野
本発明は、 抗原特異的リ ンパ球検出に用いるマイクロウェルアレイ チップ及び抗原特異的リ ンパ球の検出方法及び製造方法に関する。 さ らに本発明は、 抗原特異的リ ンパ球抗原受容体遺伝子のクローニング 方法に関する。 背景技術
従来、 抗原特異的リ ンパ球は図 3に示すような 9 6穴プレー トを用 いて、 1穴あたり約 200， 000個のリ ンパ球を加えて 3 日から 1週間、抗 原の存在下で培養することにより検出していた （「リ ンパ球機能検索 法」 矢野純一、 藤原道夫編著、 中外医学社 （ 1 9 9 4年） （非特許文献 1 )及び 「免疫実験操作法 I、 I I」 右田俊介、 紺田進、 本庶佑、 濱岡 利之編集、 南江堂 （ 1 9 9 5年） （非特許文献 2 ) )。
検出方法は
1. 細胞の増殖 （3H- thymidineの取り込み、 生細胞の検出）
2. 抗体 · サイ トカインの産生
を測定することによる。
この方法では、 約 200, 000 個と言う リ ンパ球集団の中に抗原特異的 リ ンパ球が存在することは確認できた。 しかし、 リ ンパ球集団中に存 在する個々の抗原特異的リ ンパ球を同定することはできなかった。 これに対して近年、 蛍光色素で標識した抗原分子をリ ンパ球と混ぜ 合わせることにより、 抗原特異的リ ンパ球の抗原受容体に蛍光標識抗 原を結合させ、 蛍光標識抗原を結合したリンパ球を、 フローサイ トメ ータを用いるこ とによ り検出する方法が開発され利用されている (Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer - Williams MG， Bell JI, McMichael AJ, Davis MM. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes, Science, 274:94-96, 1996 (非特許 文献 3 ) )。 この方法では抗原に結合する 1個のリンパ球を同定するこ とが可能である。 さらに抗原に結合する 1 個のリンパ球を分取するこ とも可能である。 しかしながら、 上記検出方法では、 分取するためにはセルソーター という高価で複雑な機器が必要である上に、 以下の問題も有る。
( 1 ) 分取するための機器の条件設定が難しく、 細胞を分取するため には機器操作の熟練を要する。
( 2 ) バックグラウンドが高いため抗原特異的リンパ球の頻度が 0. 1 %以下の場合は抗原特異的リ ンパ球を検出できない。
( 3 ) 細胞を分取する効率は低い。 '
( 4 ) 頻度の低い細胞を分取するのに時間がかかる。
( 5 ) 抗原が結合することは確認できるが、 抗原が結合したリンパ球 の反応を解析することは難しい。 別の抗原特異的リ ンパ球検出法として、 磁気ビーズに結合した抗原 分子をリンパ球と混ぜ合わせることにより、 抗原特異的リ ンパ球の抗 原受容体に磁気ビーズ結合抗原を結合させ、 磁石を用いて抗原特異的 リ ンパ球を分取する方法も開発されている （Abts H, Emmerich M, Miltenyi S, Radbruch A, Tesch H， CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of Immunological Methods 125:19-28， 1989 (非特許文献 4 ) )。 この方法では、 複雑な装置は必要とせず、 細胞の分取の時間は短時 間であり、 抗原が結合することも確認できる。 しかし、 抗原が結合し たリ ンパ球が抗原に反応（細胞内シグナル伝達、 RNA合成、 タンパク質 合成などの細胞の代謝生理反応）するかを解析することはできなかつ た。 また、 抗原特異的リ ンパ球の頻度が 0. 1 %以下の場合は抗原特 異的リ ンパ球を検出できなかった。 そこで本発明は、 複雑な装置は必要とせず、 細胞の分取の時間は短 時間であり、 抗原が結合することも確認でき、 頻度の低い抗原特異的 リ ンパ球（0.001%以上）も検出でき、 抗原が結合したリ ンパ球が抗原に 反応するかを解析することができ、 しかも抗原特異的リ ンパ球を分取 できる抗原特異的リ ンパ球検出法を提供することを第 1の目的とする。 さ らに本発明の別の目的は、 上記検出法に使用する抗原特異的リ ン パ球検出用マイ クロウェルアレイチップ、 及ぴ上記検出法を利用した 抗原特異的リ ンパ球の製造方法を提供することにある。 ところで、 従来の抗原特異的抗体遺伝子のクローニング方法と して、 以下の方法が知られている。
( 1 ) 人の場合、 末梢 B リ ンパ球を E B ウィルスで形質転換させ株化 して抗原特異的抗体を産生している細胞をスク リーニングし、 得られ た抗原特異的リ ンパ球細胞株から抗体遺伝子をクローニングする方法 力 Sある ( Roome AJ, Reading CL. The use of Epstein-Barr virus transformation for the production of human monoclonal antibodies. Exp Biol 43:35 - 55, 1984 (非特許文献 5 )、 Carson DA, Freimark BD. Human lymphocyte hybridomas and monoclonal antibodies. Adv Immunol. 38:275-311， 1986 (非特許文献 6 ) )。 この方法の場合、 抗原特異的リ ンパ球細胞株をスク リ一ユングするのが非効率的であり、 かつ細胞培 養に 1 力月程度かかることから時間がかかり、 面倒である。 マウスの 場合はハイプリ ドーマを作製するこ とができるが、 人の場合は効率の よいハイプリ ドーマの系は作成されていない。
( 2 ) 別の方法と して、 パクテリオファージを用いて抗原特異的抗体 遺伝子をク ロ ーニングする方法；^ある (Huston JS, Levinson D， Mudgett-Hunter M, Tai MS, Novotny J, Margolies MN, Ridge RJ, Bruccoleri RE, Haber E, Crea R, et al. Protein engineering of antibody binding sites： recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85:5879-5883， 1988 (非特許文献 7 ) ；)。 この場合、 人のリ ンパ球より mRNAを抽出し、 免疫グロブリ ンの H鎖と L鎖の c D NAライブラリーをそれぞれ作製し、 一つのファージ D N Aに組み込むことにより、 ファージで抗体の H鎖と L鎖を発現させる。 この H鎖と L鎖の組合せで抗原特異性が決まる。 しかし、 この系の場 合、 その組合せはランダムであり、 抗原を使ってその抗原に結合する 抗体を作っているファージをスク リーニングする。 その結果、 抗原に 結合する抗体を作っているファージが得られれば、 抗原特異的抗体遣 伝子がクローニングでる。 しかし、 H鎖と L鎖の組合せはランダムな ので抗原特異的抗体遺伝子のスク リ一二ングは非常に非効率的である。 例えば、 ある抗原に対する抗体の H鎖の c D N Aと L鎖の c D NAが ライブラリーの中に 1 0の 4乗分の 1の頻度でそれぞれ存在している とすると、 その抗原に結合できる H鎖と L鎖の組合せは 1 0の 8乗分 の 1になる。 また、 この系の場合、 得られた H鎖と L鎖の組合せが、 実際にヒ トの体の中でつく られている H鎖と L鎖の組合せと同じであ るかどうかも分からない。 上述のように、 従来の抗原特異的抗体遺伝子のクローニング方法は、 非常に効率の悪い方法であった。 それでも、 頻度が比較的高い抗原特 異的リ ンパ球については、 従来の方法でも、 相当量の労力を投入すれ ば、 抗原特異的抗体遺伝子をクローニングすることは可能であった。 しかし、 従来の方法では頻度の低い抗原特異的リ ンパ球を同定、 選別 するということは不可能であった。 そこで本発明は、 頻度が比較的高い抗原特異的リ ンパ球は勿論のこ と、 頻度の低い抗原特異的リ ンパ球であっても、 簡便に特定の抗原に 特異的に反応する リ ンパ球を選択し、 この選択された抗原特異的リ ン パ球から、 抗原特異的抗原受容体遺伝子を効率的にクローニングする 方法を提供することを目的とする。 さらに、 本発明は、 クローニング された抗原特異的免疫グロプリ ン遺伝子からモノクローナル抗体を製 造する方法を提供すること、 及びクローニングされた抗原特異的 T細 胞受容体遺伝子を用いて、 遺伝子治療用材料を製造する方法を.提供す ることも目的とする。 ， 発明の開示
上記課題を解決する本発明は以下の通りである。
本発明の第 1の態様は、 複数個のマイクロウェルを有し、 各マイク ロウェルに 1個の被検体リ ンパ球を格納し、 抗原特異的リ ンパ球を 1 個単位で検出するために用いられるマイクロウェルアレイチップであ つて、 前記マイ ク ロ ウエノレは、 1 つのマイ ク ロ ウヱノレに 1 つの リ ンパ 球のみが格納される形状及ぴ寸法を有するマイクロウヱルアレイチッ プに関する。
上記本発明の第 1の態様のマイクロゥエルアレイチップにおいては 以下の態様が好ましい。 ( 1 ) 前記マイクロウェルは、 円筒形、 直方体、 逆円錐形、 若しく は逆角錐形またはこれらの 2つ以上を組合せた形状である、
( 2 ) マイクロウェルの平面形状に内接する最大円の直径が、 マイ ク口ゥヱルに格納しょう とするリンパ球の直径の 1〜2倍の範囲であり、 かつマイクロ ウェルの深さは、 マイクロウェルに格納しょう とするリ ンパ球の直径の 1〜 2倍の範囲である。 本発明の第 2の態様は、 1つの被検体リンパ球が含まれるマイクロ ゥェルを複数有する抗原特異的リ ンパ球検出用マイクロウエルアレイ チップに関する。
上記本発明の第 2の態様のマイクロウェルアレイチップにおいては、 以下の態様が好ましい。
( 1 )前記マイクロウエルは、 直径 5〜100 μ mであり、 深さ 5〜： LOO ^ m である、
( 2 )前記被検体リ ンパ球は培養液と ともにマイク口ゥエルに格納され ている、
( 3 )前記被検体リ ンパ球は血液由来である、
( 4 )前記被検体リ ンパ球は Bリ ンパ球または Tリ ンパ球である。 本発明の第 3の態様は、 上記本発明の第 2の態様のマイクロウエル アレイチップの各マイク口ゥヱルに抗原を添加し、 被検体リ ンパ球を 刺激し、 抗原に反応する被検体リ ンパ球を検出するこ とを含む、 抗原 特異的リンパ球の検出方法に関する。 上記本発明の第 3の態様の抗原特異的リ ンパ球の検出方法において は、 以下の態様が好ましい。
( 1 )抗原に反応する細胞の検出を、 C aイオン依存性蛍光色素を用い て行う、
( 2 ) 抗原に反応する細胞の検出を、 抗原により刺激され活性化した 被検体リ ンパ球細胞の表面に発現する活性化マーカータンパク質を指 標として行う、
( 3 ) 抗原に反応する細胞の検出を、 被検体リ ンパ球細胞内蛍光物質 が発する蛍光の偏光度を指標と して行う、
( 4 ) 抗原に反応する細胞の検出を、 被検体リ ンパ球細胞の増殖また は抗体産生を指標として行う、
( 5 ) 抗原がタンパク質、 ペプチド、 DNA、 RNA、 脂質、 糖鎖、 または 有機高分子化合物である、
( 6 )抗原が、 細菌、 ウィルス、 自己抗原、 がん抗原またはアレルゲン である。 本発明の第 4の態様は、 上記本発明の第 3の態様である抗原特異的 リ ンパ球の検出方法により検出された抗原に反応する被検体リンパ球 をマイクロゥヱルから回収することを含む、 抗原特異的リ ンパ球の製 造方法に関する。 本発明の第 5態様は、ある抗原に特異的に反応するリ ンパ球（以下、 抗原特異的リ ンパ球という） を 1個選択し、 次いでこの 1個の抗原特 異的リ ンパ球から抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングする方 法に関する。
上記本発明の第 5の態様の抗原特異的抗原受容体遺伝子のクローニ ング方法においては、 以下の態様が好ましい。
( 1 ) 前記 1個の抗原特異的リ ンパ球の選択は、 1個の被検体リ ンパ 球が含まれるマイクロゥエルを複数有する抗原特異的リ ンパ球検出用 マイクロウェルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、 次 いで、 抗原に反応したリ ンパ球を検出し、 検出された抗原特異的リ ン パ球をマイクロウェルから取り出すことにより行う、
( 2 ) 抗原特異的リ ンパ球は、 頻度が 0. 1 %以下である、
( 3 ) 抗原特異的リ ンパ球を、 細胞溶解剤を用いて溶解し、 R T— P C Rを用いて抗原特異的抗原受容体遺伝子を増幅する、
(4 ) R T— P C Rは、 逆転写酵素による c D N A調製の後、 抗原受 容体遺伝子用のプライマーミ ックスを用いて P C Rを 2回行うことに より行う、
( 5 ) 抗原特異的リ ンパ球が B リンパ球または Tリ ンパ球である、
( 6 ) 抗原特異的抗原受容体遺伝子が、 抗原特異的リ ンパ球が B リ ン パ球である場合には免疫グロブリ ン遺伝子であり、 Tリ ンパ球である 場合には T細胞受容体遺伝子である、
( 7 ) 抗原特異的リ ンパ球が B リ ンパ球であり、 抗原特異的免疫グロ ブリ ン遺伝子がクローニングされる、
( 8 ) 抗原特異的リ ンパ球が Tリ ンパ球であり、 抗原特異的 T細胞受 容体遺伝子がクローニングされる、 ( 9 ) 遺伝子の増幅を、 検出された抗原特異的リ ンパ球をマイクロウ ヱルから取り出すことなく、 マイクロゥヱル中で行う。 本発明の第 6の態様は、 本発明の第 5の態様である抗原特異的抗原 受容体遺伝子のクローニング方法、 特に、 抗原特異的リ ンパ球が B ンパ球であり、 抗原特異的免疫グロブリ ン遺伝子がクローニングされ る方法によりクローニングされた抗原特異的免疫グロプリ ン遺伝子を 用いて、 モノ ク ローナル抗体を製造する方法に関する。 本発明の第 7の態様は、 本発明の第 5の態様である抗原特異的抗原 受容体遺伝子のクローニング方法、 特に、 抗原特異的リ ンパ球が Tリ ンパ球であり、 抗原特異的 T細胞受容体遺伝子がク口一二ングされる 方法により クローニングされた抗原特異的 T細胞受容体遺伝子を用い て、 遺伝子治療用材料を製造する方法に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 細胞内 Ca イオンの濃度変化を Ca イオン依存性の蛍光色素 を用いることによ り測定する方法の説明図である。 特に、 F l u o 3 色素の細胞への導入と抗原特異的リ ンパ球の検出法について説明する。 図 2は、 蛍光色素を用いる方法におけるマイクロゥヱルアレイチッ プへの細胞の分注、抗原刺激、取り出しまでについての説明図である。 特に、 F 1 u o 3色素を導入した細胞のマイクロウェルへの分注につ いて説明する。 図 3は、 従来の抗原特異的リ ンパ球測定に用いられている 9 6穴プ レートである。
図 4は、 蛍光顕微鏡またはマイクロアレイスキャナーを用いての細 胞のマイクロゥヱルへの導入効率の試験結果である。
図 5は、 抗原特異的 B リ ンパ球のマイクロアレイスキャナーによる 検出結果である。
図 6は、 図 5に示す枠に囲まれた 25 (5 X 5)個の細胞についての蛍光 強度のプロッ トである。
図 7は、抗原刺激後に蛍光のシグナルが増強した細胞 （抗原特異的 B リ ンパ球） の頻度を示す。
図 8は、 抗原特異的 B リ ンパ球からの抗体遺伝子の P C Rによる增 幅についての説明図である。
図 9は、 実施例において得られた抗体（L鎖）遺伝子の配列と既存の データベースに入っている抗体遺伝子の配列との比較を示す。 図 1 0は、 実施例において得られた抗体（H鎖）遺伝子の配列と既存 のデータベースに入っている抗体遺伝子の配列との比較を示す。
発明を実施するための最良の形態
[マイクロゥヱルアレイチップ]
本発明のマイクロゥエルアレイチップは、 複数個のマイクロウエル を有し、 各マイクロウェルに 1個の被検体リ ンパ球を格納し、 抗原特 異的リ ンパ球を 1個単位で検出するために用いられるマイクロゥヱル アレイチップであって、 前記マイクロゥヱルは、 1つのマイクロゥェ ルに 1つのリンパ球のみが格納される形状及び寸法を有する。 マイクロゥヱルの形状や寸法には特に制限はないが、 マイクロウヱ ルの形状は、 例えば、 円筒形であることができ、 円筒形以外に、 直方 体、 逆円錐形、 逆角錐形 （逆三角錐形、 逆四角錐形、 逆五角錐形、 逆 六角錐形、 七角以上の逆多角錐形） 等であることもでき、 これらの形 状の二つ以上を組み合わせた形状であることもできる。 例えば、 一部 が円筒形であり、 残りが逆円錐形であることができる。 また、 逆円錐 形、 逆角錐形の場合、 底面がマイクロ ウェルの開口となるが、 逆円錐 形、 逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状である （その場合、 マ イク口ゥエルの底部は平坦になる） こともできる。 円筒形、 直方体は、 マイクロウェルの底部は通常、 平坦であるが、 曲面 （凸面や凹面） と することもできる。 マイクロウヱルの底部を曲面とすることができる のは、 逆円錐形、 逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も 同様である。 マイクロウェルの形状や寸法は、 マイクロウヱルに格納されるべき リ ンパ球の種類 （リ ンパ球の形状や寸法等） を考慮して、 1つのマイ クロウエルに 1つのリ ンパ球が格納されるように、 適宜決定される。
1つのマイクロウェルに 1つのリ ンパ球が格納されるようにするた めには、 例えば、 マイクロウ :ルの平面形状に内接する最大円の直径 が、 マイクロゥエルに格納しょう とするリ ンパ球の直径の 1〜2倍の範 囲、 好ましくは 1. 1〜1. 9倍の範囲、 より好ましくは 1. 2〜1 · 8倍の範 囲であることが適当である。
また、 マイクロウェルの深さは、 マイクロウェルに格納しよ う とす る リ ンパ球の直径の 1〜2倍の範囲、 好ましく は 1. 1〜1. 9倍の範囲、 よ り好ましく は 1. 2〜 1. 8倍の範囲であることが適当である。 マイクロウェルが円筒形の場合、 その寸法は、 例えば、 直径 5〜100 mであることができ、 リ ンパ球が B リ ンパ球の場合、 好ましく は、 直径は 5〜15 μ mである。 また、 深さは、 例えば、 5〜100 μ mであるこ とができ、 リ ンパ球が B リ ンパ球の場合、 好ましく は、 深さは 5〜40 mであることができる。 但し、 マイクロ ウェルの寸法は、 上述のよ う に、 マイクロウェルに格納しょ う とする リ ンパ球の直径とのマイク 口 ゥエルの寸法の好適な比を考慮して適宜決定する。
1つのマイクロウエノレアレイチップが有するマイクロウヱルの数は、 特に制限はないが、抗原特異的リ ンパ球の頻度が 105個に 1個から多い 場合には約 500個であるという観点から、 1 cm2当たり、 例えば、 2， 000 〜： 1 , 000, 000個の範囲であることができる。 本発明の抗原特異的リ ンパ球検出用マイクロ ウヱルアレイチップは、 複数のマイクロウェルを有し、 かつ各マイクロウヱルが被検体リ ンパ 球を 1個含むことを特徴とする。 マイクロゥヱルアレイチップは、 上 記の本発明のマイクロ ゥヱルアレイチップをそのまま用いるこ とがで きる 本発明の抗原特異的リ ンパ球検出用マイクロウエルアレイチップは 各マイク口ゥエルが被検体リ ンパ球を 1個含むことで、 抗原特異的リ ンパ球を 1個 1個の細胞レベルで特定することが可能になる。 即ち、 本発明のマイクロゥエルアレイチップを用いる抗原特異的リ ンパ球の 検出方法では、 マイクロゥヱルに含まれる被検体リ ンパ球が 1個であ ることから、 抗原に反応する被検体リ ンパ球を 1個の細胞と して特定 できる。 その結果、 検出された抗原特異的リ ンパ球を取り出して、 抗原特異 的抗体遺伝子や τ細胞受容体遺伝子をクローニングすることが可能に なる。 例えば、 抗原特異的抗体遺伝子がクローニングできると、 それ を用いて大量にヒ ト型モノクローナル抗体を生産することがでる。 こ の抗体を感染症などの患者へ投与することにより、感染症などの治療、 予防に用いることができると考えられる。 但し、 同一のマイクロウヱルには、 リ ンパ球以外の細胞が被検体リ ンパ球と ともに含まれていても良い。 リ ンパ球以外の細胞であれば、 抗原に反応せず、 検出されることもないからである。 マイクロウヱルには、 被検体リ ンパ球は、 例えば、 培養液と ともに 格納される。 培養液としては、 例えば、 以下のいずれかのものを挙げ ることができる。 1. 137mM NaCl, 2. 7 mM KC1, 1. 8mM CaCl2, 1 mM MgCl2, lmg/ml グ ルコース， lmg/ml BSA, 20mM HEPES (pH7. 4)
2. 10% FCS (牛胎仔血清）含有 RPMI 1640培地
3. lmg/ml BSA含有 RPMI 1640培地
4. 10% FCS (牛胎仔血清）含有 Dulbecco ' s MEM培地
5. lmg/ml BSA含有 Dulbecco ' s MEM培地 被検体リ ンパ球は血液由来であるこ とができ、 例えば、 B リ ンパ球 または Tリ ンパ球であることができる。 それ以外に扁桃腺（リ ンパ節）、 脾臓等のリ ンパ組織由来リ ンパ球、 がん浸潤リ ンパ球などの病変部位 浸潤リ ンパ球等を挙げることができる。
[抗原特異的リ ンパ球の検出方法]
本発明の抗原特異的リ ンパ球の検出方法は、 上記本発明のマイク口 ゥエルアレイチップの各マイ ク ロゥエルに抗原を添加し、 リ ンパ球を 刺激し、 抗原に反応するリンパ球を検出することを含む。 各マイクロウエルへの抗原の添加は、 以下のように行うことができ る。
1. ピぺッ トを用いてマイク口ゥヱルアレイチップ全面を覆う よ う に抗原液を添加する。
2. 1 ゥエルずつ自動スポッターを用いて抗原液を添加する。 本発明の抗原特異的リ ンパ球の検出方法により検出される抗原には、 特に制限はないが、 例えば、 タンパク質、 ペプチド、 DNA、 RNA、 脂質、 糖鎖、 または有機高分子化合物（例えば、 環境ホルモン）等であること ができる。 あるいは、 細菌、 ウィルス、 自己抗原、 がん抗原またはァ レルゲン等であることができる。 細胞の培養は、 例えば、 リ ンパ球を培養液に懸濁させ、 マイクロウ ヱルに分注後、 室温あるいは 37°Cにて、 空気中あるいは C02インキュ ベータ内にて培養することで行うことができる。 抗原に反応する細胞の検出は、 例えば、 （1) C aイオン依存性蛍光色 素を用いて行う、 （2)抗原により刺激され活性化した被検体リンパ球細 胞の表面に発現する活性化マーカータンパク質を指標として行う、 （3) 被検体リ ンパ球細胞内蛍光物質が発する蛍光の偏光度を指標と して行 う、 または（4)被検体リ ンパ球細胞の増殖または抗体産生を指標と して 行うことができる。 より具体的には、例えば、 B リ ンパ球の抗原受容体（免疫グロブリ ン） に抗原が結合するとまず細胞内シグナル伝達が起こり 、 それに続いて 細胞増殖、 抗体産生が起こる。 従って、 細胞内シグナル伝達、 細胞増 殖、 抗体産生を種々の方法により検知することにより、 抗原に反応す る細胞を検出することができる。 あるいは、 例えば、 T リ ンパ球の抗原 受容体に抗原が結合するとまず細胞内シグナル伝達が起こり 、 それに 続いて細胞増殖、 サイ ト力イン産生が起こる。 従って、 細胞内シグナ ル伝達、 細胞増殖、 サイ ト力イン産生を種々の方法により検知するこ とにより、 抗原に反応する細胞を検出することができる。 細胞内シグナル伝達を検出することによる、 抗原に反応する細胞の 検出は、 例えば、 細胞内 Caイオンの濃度変化を Caイオン依存性の蛍 光色素を用いることにより行うことができる。
細胞内 Caイオン濃度変化は、 蛍光色素として Fura- 2、 Fluo-3 ある いは Fluo- 4を用い、検出装置として蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレ ィスキャナーを用いる。 具体的には、 図 1 に示すように、 B リ ンパ球に Caイオン依存性蛍光 色素である Fura- 2あるいは Fluo- 3 を導入する。 次いで抗原で B リ ン パ球を刺激すると、 B リンパ球内 Caイオン濃度が上昇する。その結果、 Caイオンが Caイオン依存性蛍光色素に結合し、蛍光強度が増強される。 Caイオン濃度が低いと青っぽい色、高いと赤っぽい色で示されている。 この方法では、抗原で刺激されることにより細胞内 Caイオンが上昇し た B リ ンパ球 （抗原特異的） をマイクロウェルアレイチップを用いて 検出できる。 細胞増殖を検出することによる、 抗原に反応する細胞の検出は、 例 えば、 細胞数を、 生細胞特異的蛍光色素を用いて計測することによつ ても行うことができる。 この方法は、 具体的には、 抗原で B リンパ球 を刺激し C02ィンキュベータ内にて 37°C、 3 日間培養すると、細胞が増 殖する。 細胞が増殖後、 培養液中にフルォレツセイン . ジアセテート (Fluorescein diacetate (FDA) )ある ヽ ίまカノレポキシ · フノレオレツセィ ン - ジァセテ一ト 'サクシンィ ミ ジノレ ·エステノレ（Carboxy— fluorescein diacetate, succiniraidyl ester (CFSE) )溶液をカロえる。 これらの試薬 は生細胞の膜を透過し、 細胞内でエステラーゼによって分解され、 膜 不透過性の蛍光色素を生成する。 この蛍光色素の発光は細胞数に比例 するためゥエル内の生細胞が発光する蛍光強度の和を蛍光顕微鏡ある いはマイクロア レイスキャナーを用いて計測することにより生細胞数 を測定することができる。 抗体産生を計測することによつても、 抗原に反応する細胞の検出を 行うことができる。 抗体産生は抗体を免疫化学的に計測することによ り検出できる。
具体的には、 抗原で B リ ンパ球を刺激し C02イ ンキュベータ内にて 37°C、 1週間培養すると、 抗体が培養液中に分泌される。 培養液中に分 泌された抗原特異的抗体を ELISA法（酵素標識免疫吸着法）により検出 する。
あるいは、 マイ トゲン、 レクチン、 抗体、 サイ ト力イン、 PMA、 Ca ィオノフォアを用いても、 シグナル伝達、 細胞増殖、 抗体産生を検出 することができる。 以下に、 蛍光色素を用いる方法におけるマイクロ ウェルアレイチッ プへの細胞の分注、 抗原刺激、 取り出しまでについて図 2に基づいて 説明する。
( 1 ) 細胞の分注
マイク口ウ エノレ 1つずつに細胞を入れる。
マイクロウェルに入れる細胞は、 例えば、 末梢血からリ ンパ球画分 を分離後、 B リ ンパ球画分をさらに分離精製して得られる。
次に、 FluoS/AM ^ At M)溶液に細胞を懸濁させ、 室温に 30分置き、 さ らに緩衝液で細胞を洗浄し、 細胞内に負荷されなかった色素を除去す る。
色素を除去した細胞をマイクロウェルに分注する。
マイク口ゥエルアレイチップの両彻 Jにシーノレを貼り、 その上にカバ 一グラスを乗せ、 緩衝液を満たすことで、 乾燥を防ぐ。
( 2 ) 蛍光測定
まず、 未刺激の細胞の蛍光を測定する。 その際の蛍光強度（A)を測定 する。
次いで抗原溶液をスライ ドグラスとカバーグラスの隙間に流し入れ 緩衝液と交換し、 抗原による刺激を受けた細胞の蛍光を測定する。 刺 激後 1〜 2分後の蛍光強度（B)を測定する。 刺激前後の蛍光強度比 (B/A)の高いゥェルの細胞を選別する。
( 3 ) 抗原刺激に反応した細胞の取り出し （回収）
スライ ドグラスと力パーグラスの隙間に空気を入れると、 力バーグ ラスは容易に剥がれる。 抗原刺激により反応した細胞を、 未刺激の細 胞の蛍光強度と抗原による刺激を受けた細胞の蛍光強度の比（B/A)に より選別し、 取り出すことで、 抗原特異的リ ンパ球を回収することが できる。
[抗原特異的抗原受容体遺伝子のク口一二ング方法]
本発明のクローニング方法は、 ある抗原に特異的に反応するリ ンパ 球 （抗原特異的リ ンパ球） を 1個選択し、 次いでこの 1個の抗原特異 的リ ンパ球から抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングする方法 である。
本発明のクローニング方法は、抗原特異的リ ンパ球の頻度が 0 . 1 % 以下である場合に特に有効である。
しかし、 頻度が 0 . 1 %を超える場合にも適用できることは勿論で ある。
抗原特異的リ ンパ球は、 例えば、 B リ ンパ球または T リ ンパ球であ ることができる。 さらに、 抗原特異的抗原受容体遺伝子は、 抗原特異 的リ ンパ球が B リ ンパ球である場合には免疫グロプリ ン遺伝子であり Tリ ンパ球である場合には T細胞受容体遺伝子である。 血液中のリ ンパ球は 1個 1個がそれぞれ別々の抗原に反応する。 そ こで、 本発明では、 例えば、 抗原に特異的に反応した B リ ンパ球を検 出し、 この B リ ンパ球から、 抗原 （病原体） に反応する免疫グロプリ ン （抗体） 遺伝子を R T— P C Rにより増幅できる。 同様に、 抗原に 特異的に反応した T リ ンパ球を検出し、 この Τ リ ンパ球から、抗原 （病 原体） に反応する Τ細胞受容体遺伝子を R Τ— P C Rにより増幅でき る。 .
[抗原特異的リ ンパ球の選択]
1個の抗原特異的リ ンパ球の選択は、 例えば、 マイクロウェルァレ ィチップを用いた方法により行うことができる。 マイクロウェルァレ ィチップを用いた方法では、 例えば、 1個の被検体リ ンパ球が含まれ るマイクロゥエルを複数有する抗原特異的リ ンパ球検出用マイクロウ エルアレイチップの各マイクロウェルに抗原を添加し、 次いで、 抗原 に反応したリ ンパ球を検出し、 検出された抗原特異的リ ンパ球をマイ クロウエルから取り出すことにより、 1個の抗原特異的リ ンパ球を得 ることができる。 この方法について、 より具体的に説明する。 (マイク口ゥエルアレイチップ）
マイクロウエノレアレイチップと しては、 複数のマイクロウエノレを有 し、 かつ各マイク口ゥエルが被検体リ ンパ球を 1個含むことができる ものを使用することができる。 各マイク口ゥエルが被検体リ ンパ球を
1個含むことで、 抗原特異的リ ンパ球を細胞レベルで特定することが 可能になる。 即ち、 このマイクロウェルアレイチップを用いると、 マ イク口ゥエルに含まれる被検体リ ンパ球が 1個であることから、 抗原 に反応する被検体リンパ球を 1個の細胞として特定でき、結果として、 抗原特異的リ ンパ球を 1個の細胞と して検出できる。 そして、 検出さ れた 1個の抗原特異的リ ンパ球を取り出して、 遺伝子をクローニング する。 伹し、 同一のマイクロウェルには、 リ ンパ球以外の細胞が被検体リ ンパ球と ともに含まれていても良い。 リ ンパ球以外の細胞であれば、 抗原に反応せず、 検出されることもないからである。 マイクロゥヱルアレイチップと しては、 上記本発明のマイクロウヱ ルアレイチップを挙げることができる。 マイクロゥヱルには、 被検体リ ンパ球は培養液と ともに格納されて いる。 培養液としては、 例えば、 以下のものを挙げることができる。
1. 137mM NaCl, 2. 7 mM KC1, 1. 8mM CaCl2, 1 mM MgCl2, lmg/ml グ ノレコース， lmg/ml BSA, 20mM HEPES (pH7. 4)
2. 10% FCS (牛胎仔血清）含有 RPMI 1640培地
3. lmg/ml BSA含有 RPMI 1640培地
4. 10% FCS (牛胎仔血清）含有 Dulbecco ' s MEM培地
5. lmg/ml BSA含有 Dulbecco ' s MEM培地 被検体リ ンパ球は血液由来であることができ、 例えば、 B リ ンパ球 または Tリンパ球であることができる。 それ以外に扁桃腺（リンパ節）、 脾臓等のリ ンパ組織由来リ ンパ球、 がん浸潤リ ンパ球などの病変部位 浸潤リ ンパ球等を挙げることができる。 (抗原特異的リンパ球の検出方法）
抗原特異的リ ンパ球の検出方法は、 上記マイクロウエルアレイチッ プの各マイクロウェルに抗原を添加し、 細胞を刺激し、 抗原に反応す る細胞を検出することを含む。 各マイクロウエルへの抗原の添加は、 以下のように行うことができ る。
1. ピぺッ トを用いてマイク口ゥエルアレイチップ全面を覆う よ う に抗原液を添加する。
2. 1 ゥエルずつ自動スポッターを用いて抗原液を添加する。 この方法により検出される抗原には、 特に制限はないが、 例えば、 タンパク質、 ペプチド、 D N A、 R N A、 脂質、 糖鎖または有機化合 物等であることができる。 また、 抗原は、 細菌、 ウィルス、 自己抗原、 がん抗原またはァレルゲン等であることができる。 細胞の培養は、 例えば、 リ ンパ球を培養液に懸濁させ、 ゥエルに分 注後、 室温あるいは 37°Cにて、 空気中あるいは C O 2インキュベータ 内にて培養することで行うことができる。 抗原に反応する細胞の検出は、 以下のように行うことができる。 例えば、 B リ ンパ球の抗原受容体 （免疫グロブリ ン） に抗原が結合 するとまず細胞内シグナル伝達が起こり、 それに続いて細胞増殖、 抗 体産生が起こる。 従って、 細胞内シグナル伝達、 細胞増殖、 抗体産生 を種々の方法により検知することにより、 抗原に反応する細胞を検出 することができる。 あるいは、 例えば、 T リ ンパ球の抗原受容体に抗原 が結合するとまず細胞内シグナル伝達が起こ り、 それに続いて細胞增 殖、 サイ トカイン産生が起こる。 従って、 細胞内シグナル伝達、 細胞 増殖、 サイ ト力イン産生を種々の方法により検知することによ り、 抗 原に反応する細胞を検出することができる。 細胞内シグナル伝達を検出することによる、 抗原に反応する細胞の 検出は、 例えば、 細胞内 C aイオンの濃度変化を C aイオン依存性の 蛍光色素を用いることにより行うことができる。
細胞内 C aイオン濃度変化は、 蛍光色素と して F u r a _ 2あるい は F l u o— 3を用い、 検出装置と して蛍光顕微鏡あるいはマイクロ ァレイスキャナーを用いる。 具体的には、 図 1に示すように、 B リ ンパ球に C aイオン依存性蛍 光色素である F u r a — 2あるいは F 1 u o _ 3を導入する。 次いで 抗原で B リ ンパ球を刺激すると、 細胞内 C aイオン濃度が上昇する。 その結果、 C aイオンが C aイオン依存性蛍光色素に結合し、 蛍光強 度が増強される。 C aイオン濃度が低いと青つぼい色、 高いと赤っぽ い色で示されている。 この方法では、 抗原で刺激されることにより細 胞内 C άイオンが上昇した B リ ンパ球 （抗原特異的） を、 マイクロウ エルアレイチップを用いて検出できる。 細胞増殖を検出することによる、 抗原に反応する細胞の検出は、 例 えば、 細胞数を、 生細胞特異的蛍光色素を用いて計測することによつ ても行う ことができる。 この方法は、 具体的には、 抗原で B リ ンパ球 を刺激し C O 2ィンキュベータ内にて 37°C、 3 日間培養すると、 細胞が 増殖する。 細胞が増殖後、 培養液中にフルォレツセイ ン ' ジァセテ一 卜 （Fluorescein diacetate (FDA) )ある ヽ fまカノレポキシ - フノレオレツセ イ ン · ジ ア セ テ ー ト · ス ク シ ン ィ ミ ジ ル ' エ ス テ ル (Carboxy- fluorescein diacetate, succinimidyl ester (CFSE) )溶被 ¾ 加える。 これらの試薬は生細胞の膜を透過し、 細胞内でエステラーゼ によって分解され、 膜不透過性の蛍光色素を生成する。 この蛍光色素 の発光は細胞数に比例するためゥ ル内の生細胞が発光する蛍光強度 の和を蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用いて計測す ることにより生細胞数を測定する。 抗体産生を計測することによつても、 抗原に反応する細胞の検出を 行うことができる。 抗体産生は抗体を免疫化学的に計測することによ り検出できる。
具体的には、抗原で Bリ ンパ球を刺激し C 02インキュベータ内にて 37°C、 1週間培養すると、 抗体が培養液中に分泌される。 培養液中に分 泌された抗原特異的抗体を ELISA法（酵素標識免疫吸着法）により検出 する。 尚、 この検出方法では、 マイ トゲン、 レクチン、 抗体、 サイ トカイ ン、 P M A、 C aィオノフォアを用いても、 シグナル伝達、 細胞増殖、 抗体産生を検出することができる。 以下に、 蛍光色素を用いる方法におけるマイクロゥヱルアレイチッ プへの細胞の分注、 抗原刺激、 取り出しまでについて図 2に基づいて 説明する。
( 1 ) 細胞の分注
ゥエル 1つずつに細胞を入れる。
ゥエルに入れる細胞は、 末梢血からリ ンパ球画分を分離後、 B リ ン パ球画分をさらに分離精製して得られる。
次に、 F 1 u o 3 /A M (2 μ M)溶液に細胞を懸濁させ、 室温に 30 分 置き、 さらに緩衝液で細胞を洗浄し、 細胞内に負荷されなかった色素 を除去する。
色素を除去した細胞をマイク口ゥェルに分注する。
マイクロウェルアレイチップの両側にシールを貼り、 その上にカバ 一グラスを乗せ、 緩衝液を満たすことで、 乾燥を防ぐ。
( 2 ) 蛍光測定
まず、 未刺激の細胞の蛍光を測定する。，その際の蛍光強度（Α )を測 定する。
次いで抗原溶液をスライ ドグラスと力パーグラスの隙間に流し入れ 緩衝液と交換し、 抗原による刺激を受けた細胞の蛍光を測定する。 刺 激後 1 〜 2分後の蛍光強度（B )を測定する。 刺激前後の蛍光強度比（B /A )の高いゥヱルの細胞を選別する。
( 3 ) 抗原刺激に反応した細胞の取り出し
スライ ドグラスとカバーグラスの隙間に空気を入れると、 力バーグ ラスは容易に剥がれる。 抗原刺激により反応した細胞を、 未刺激の細 胞の蛍光強度と抗原による刺激を受けた細胞の蛍光強度の比（B / A ) により選別し、 取り出す。
但し、 選別（検出）された抗原特異的リ ンパ球は、 マイクロウェルか ら取り出すことなく、 そのままマイクロウェル中で行う、 次の遺伝子 増幅に供することもできる。
(遺伝子増幅）
取り出された抗原特異的リ ンパ球は、 細胞溶解剤を用いて溶解した 後、 R T— P C Rを用いて、 抗原特異的リ ンパ球が B リ ンパ球であれ ば抗原特異的免疫グロブリ ン （抗体） 遺伝子がクローユングされ、 抗 原特異的リ ンパ球が Tリ ンパ球であれば抗原特異的 T細胞受容体遺伝 子がクローニングされる。
細胞溶解剤と しては、 公知の物をそのまま使用でき、 例えば、 以下 のものを挙げることができる。
lx 1st strand buffer [ GIBCO-BRL, SuperScript l l ίこ添付されて ヽ る] ， 0. 2 mM dNTP, 0. 25% NP-40, 0. 1 mg/mL BSA, 10 mM DTT, Random Primer 0. 05 μ M, 1U/ μ L RNas in B リ ンパ球における抗原受容体遺伝子は抗体遺伝子と同一のもので あり、 タンパク質と しては免疫グロブリ ンと呼ばれる。 抗原受容体は B リ ンパ球の膜表面に存在し （膜型免疫グロブリ ン）、 抗体は普通分泌 蛋白 （分泌型免疫グロブリ ン） と して産生される。 その違いはタンパ ク質の C末端側にある。 膜型免疫グロプリ ンは細胞膜に埋もれる膜ド メィンおよび細胞質側につきでる部分を持っている。 分泌型免疫グロ ブリ ンも同じ遺伝子から産生される。 しかし、 オルタナティブ · スプ ライシング （alternat ive spl i cing) によ り タンパク質の C末端側が 膜型免疫グロブリ ンと異なり膜ドメインを持たない。 その結果、 分泌 蛋白と して産生される。 しかし、 この二つの蛋白の抗原結合部位は同 一である。 したがって、 B リ ンパ球の場合、 抗体遺伝子のクローニン グと抗原受容体遺伝子のク ローニングは同じである。
T リ ンパ球の場合は、 抗原受容体の分泌型という ものはない。 従つ て、 抗原受容体遺伝子をク ローニングするこ とになる。 Tリ ンパ球の 場合には B リ ンパ球で設計したプライマーと同じ考え方でプライマー を設計する。 これは、 Tリ ンパ球の抗原受容体 （T C R ) の遺伝子構 成は B リ ンパ球の免疫グロブリ ン遺伝子の遺伝子構成とほとんど同じ だからである。 そのため、 同じ考え方でプライマーを設計することが できる。 したがって、 抗体遺伝子がクローニングできれば、 ほとんど 同じ方法で T C R遺伝子もクローニングすることができる。 以下、 抗原特異的免疫グロブリ ン遺伝子の增幅を例にさらに説明す る。
取り出された抗原特異的リ ンパ球を細胞溶解剤で溶解して得られた 溶液を用い、 逆転写酵素による c D N Aの調製を行う。 次いで、 免疫 グロブリ ン遺伝子用のプライマーミ ックスを用いて 2回 P C Rするこ とにより、 所望の抗原特異的免疫グロブリ ン遺伝子を増幅 （クロー二 ング） することができる。 逆転写酵素による c D N Aの調製は、 常法 （例えば、 Sambrook J， Russ el l DW in Mol ecular Cl oning： A Laboratory Manual 3rQ ed (Col d Spring Harbor Laboratory Pres s, New York, 2001) ) により行うこと ができる。
本発明では細胞から抽出 · 精製した R N Aを用いて R T反応をする のではなく、 細胞溶解液を用いて直接 R T反応を行うことが適当であ る。
( P C R法による抗体遺伝子の増幅）
P C R法による抗体遺伝子の増幅では、 P C R反応を 2回実施する ことにより抗体遺伝子の V領域遺伝子を増幅することが適当である。 抗体分子は H鎖おょぴ L鎖の組合せによりできており、 ヒ ト抗体遺伝 子の H鎖は生殖細胞系列では約 2 0 0種類の V領域遺伝子断片、 約 2 0 種類の D断片、 6種類の J断片より構成されており、 B リ ンパ球に分化 するときに遺伝子再構成により各々 1種類の V断片、 D断片、 J断片が 組み合わさることにより （V/D/ J再構成） ひとつの抗原結合部位を形 成する。 L鎖も同様である。
各 B リ ンパ球は細胞表面に 1種類の抗体分子を発現している。 抗原特 異的 B リ ンパ球よ り抗原特異的抗体遺伝子を増幅するためにはそれぞ れの V断片の配列に一致したプライマーを用いる必要がある。 抗体分子は H鎖、 L鎖それぞれ 2本ずつのペプチド鎖からなり、 図 8に示す構造図の左側の V領域 （H鎖は VH領域、 L鎖は V Kあるい は V ¾領域） で抗原と結合する。 H鎖及ぴ L鎖のサブフアミ リーの数を 以下の表に示す。 表 1
Figure imgf000032_0001
上記表 1に示すように、 ヒ ト抗体遺伝子の Η鎖の V領域は 7種類のサ ブファミ リーに分類される。 サブファ ミ リー内の V断片の配列はよく似 ているので共通したプライマーを設定することが可能である。（*CH領域 には C y l〜 4、 C μ C S、 C a l〜 2、 C £ があるが、 このうち 血清中の抗体の主な種類である IgG， IgMについてプライマーを設計し、 P C Rに用いた。 C γ 1〜 4については共通配列 1種類を用いているた めに C と合わせて 2種類のプライマーを用いている。 **C λ鎖には C λ 1〜C L 7鎖があるが、 プライマーと しては共通配列の 1種類を用い ている。)
L鎖の V領域おょぴ C領域の各サブファ ミ リーについても同様のこ とが言えるので、 各サブファミ リー毎にプライマーを設定し、 P C R反 応には、 H鎖あるいは L鎖の全サブファ ミ リ一に対するプライマーをミ ッタス したプライマーミ ックスを用いる。 即ち、 プライマーと しては、 H鎖、 L鎖それぞれの全種類のミ ックスを用いる。 以下のように P C R反応を 2回行い、 抗体遺伝子を増幅する。
H鎖及び L鎖の V領域のァミノ酸数が 1 1 0〜 1 2 0前後であるこ とから、 V領域の遺伝子は、 約 4 0 0 b p程度である。
そこで、 図 8に示すように、 1回目の P C R反応である P C R 1で は、 リーダーシークェンス （L) から C領域の c DNAが増幅される。
2回目の P C R反応である P C R 2では、 P C R 1の内側 （V領域 の始まりから C領域の始まり） 約 400 b p の c DNAが増幅される。 そして、 2回目の P C R反応で増幅した c D N Aの配列を分析する。 この点に関して、 さらに説明する。
本発明において、 P C R 1 と P C R 2 とでは、 異なる配列のプライ マーミ ックスを用いるのは、 以下の理由による。 P C R 1 で増幅した ものを再度 P C R 2で増幅するが、 P C R 1 の産物は特異的なものば かりでなく、 非特異的な増幅産物も含まれている。 P C R 2を同じプ ライマーで増幅すると特異的な DN A配列も増幅するが、 非特異的な 配列も増幅してしま う。 そこで、 P C R 2では P C R 1で増幅する D N A配列で P C R 1のプライマーの位置より少し内側の配列をプライ マーに用いる。 そうすることで、 P C R 1で増幅した非特異的な D N A配列は増幅せずに、 特異的な DN A配列を増幅できるようになる。 尚、 このように、 特異的な D N A配列を増幅するためにプライマーを 変えて 2 回目の P C R 2を行う という以外に、 1個の B リ ンパ球から 抗体遺伝子を増幅する場合、 1回の P C Rでは増幅が量的に不十分で あるという理由力 らも、 P C R反応を 2回行うことが適当である。 上記方法では、 2回目の P C R反応で増幅した c D N Aの配列を分 析するが、 その際、 1回目の P C R反応生成物と 2回目の P C R反応 生成物とは、 分離する必要はない。 これは、 通常、 P C R 1の産物は P C R 2で増幅した産物に較べると無視できる量だからである。 抗原特異的リ ンパ球が Tリ ンパ球である場合には抗原特異的 T細胞 受容体遺伝子がクローニングされるが、 クローニング方法は、 上記 B リ ンパ球の場合と同様に行う ことができる。 Tリ ンパ球の抗原受容体 (T C R) のサブファミ リーを以下の表に示す。 表 2
Figure imgf000035_0001
本発明のクローニング方法では、 抗原特異的リ ンパ球が Β リ ンパ球 である場合、 抗原特異的免疫グロブリ ン （抗体） 遺伝子がクローニン グされる。 そしてクローニングされた遺伝子を用いて、 モノ ク ローナ ル抗体を製造することができる。 クローニングされた遺伝子を用いて のモノクローナル抗体の製造は常法により行うことができ、 P C R法 で増幅した V領域の c D Ν Αと C領域の遺伝子配列を結合し、 発現べ クターを用いて抗体分子を作成する。
モノ ク ローナル抗体の製造は、 例えば、 Kanda H, Mori K, Koga H， Tanigucm K, Kobayashi H, Sakahara H， Konishi J, Endo K, Watanabe T. Construction and expression of chimeric antibodies by a simple replacement of heavy and light chain V genes into a single cassette vector. 13:359-366， 1994に記載の方法により行うことができる。 尚、本発明の方法においては、抗体分子全体を製造する必要はなく、 V領域が得られれば良い。 また、 上記 P C R法で得られる遺伝子配列 は V領域と C領域の一部である。 そこで、 モノ ク ローナル抗体の製造 方法において発現ベクターに導入する遺伝子は、 抗体分子 （全体） で はなく、 V領域のみまたは V領域 + C領域の一部であってもよい。 H鎖と L鎖とは、 通常は、 別々にクローニングする。 この場合、 R Tまでは 1本のチューブで反応を行い、 以後の P C Rでは H鎖用と L 鎖用の 2本のチューブを用いる。 H鎖と L鎖を 1本のチューブで合成 できることもあるが、 增幅しゃすい方が主に増えてしまう ということ がしばしば起こるので、確実に H鎖、 L鎖を増幅させるという意味から 2本のチューブで別々に P C Rを行うことが好ましい。 抗体を得るには、 H鎖と L鎖を両方とも発現させる必要が有り、 上 記発現べクターには H鎖と L鎖の両方を入れておく。
その場合、 H鎖と L鎖を別々の発現 ベクターに揷入し、 蛋白を発現 させる際に、 同じ細胞に両方の発現べクターを同時に導入することに より、 1個の細胞で H鎖と L鎖を発現させるという方法、 および、 H 鎖と L鎖を 1つのべクターに同時に挿入した発現べクターを構築し、 それを細胞に導入することにより、 H鎖と L鎖を一つの細胞で発現させ るという 2通りがある。 動物細胞に発現ベクターを導入した場合は、 産生された抗体はヒ ト あるいはほ乳類の体の中で作られる抗体と全く同じものになる。 大腸 菌で作らせた場合は、 ァミノ酸の配列は上記のものと全く同じだが、 糖鎖が結合していないものが作られる。 本発明の方法では、 産生され た抗体がヒ トあるいはほ乳類の体の中で作られる抗体と全く 同じもの になることから、 動物細胞で抗体を産生させることが好ましい。 本発明のクローニング方法は、 抗原特異的リ ンパ球が Tリンパ球で ある場合、 抗原特異的 τ細胞受容体遺伝子がクローニングされる。 ク ローニングされた抗原特異的受容体遺伝子を用いて、 遺伝子治療を行 うことができる。 例えば、 クローニングした T細胞受容体遺伝子を T リ ンパ球あるいは Tリ ンパ球前駆細胞に導入してやることにより、 病 原体等に特異的な τ細胞受容体を発現した T リ ンパ球を人為的に作り 出すことができる。 このようにして作り出した Tリ ンパ球を免疫機能 の低下した患者に投与することにより免疫機能を回復させることが可 能となる。 実施例
以下、 本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例 1
1. By ンパ球の分離
末ネ肖血力 b Ficoll— Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden; を用レヽてリ ン ノ 球画分を分離し、 さ ら ίこ AutoMACS ( Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) を用いてリ ンパ球画分から B リ ンパ球画分をさら に分離精製した。
2. Fluo3の細胞への導入 （図 1参照）
2 X 106個の Bリ ンノ 球を 2μ M Fluo3/AM (同仁、 熊本） /RPMI 1640/10% FCS 溶液に懸濁し、 室温に 30分イ ンキュベーショ ンする。 RPMI1640/10°/。 FCS 溶液で細胞を洗浄し、 細胞内に導入されなかった Fluo3/AMを除いた。 そ の後、 細胞を1^¾111640/10°/。 FCS溶液に懸濁した。
3. マイクロ ゥヱルアレイチップ （図 2参照)
マイクロゥェルァレイチッ - ¾poly (dimethylsiloxane) (PDMS)を用い て作製されており、 直径 1θ ίΐη、 深さ 32 ί mのマイクロウェルが 2 cm x 2 cmのチップ上に縦 ·横 30 μ mの間隔 （マイクロウエノレの中心から中心ま での距離は 40μ ηι) で配置されている。 マイクロ ゥヱルアレイチップの 両側には厚さ ΙΙΜΙ畐約 1mm長さ 2cmのシールを貼った。
4. マイクロアレイスキャナー
本装置は基本的に日立ソフ トウェアエンジニアリ ング （株） （横浜巿） のマイクロアレイスキャナー （CRBIO Ile-FITC) を用いており、 以下の 変更を加えている。
( 1 ) 搭載されているレーザー （Cy3用， 532 nm; Cy5用， 635 nra) の う ちの 1本を 473nmのレーザーと置換してある。
( 2 ) 焦点深度も従来のものは ±25μ πιであるが、 本装置は ±50μ ηιに変 更してある。
5. マイクロゥヱルァレイチップを用いた活性化 B ンパ球の検出 （図 2 参照）
上記マイク口ゥエルァレイチップに上記細胞懸濁液を添加し、 5分間静 置した。 マイク口ゥエルに入らなかつた細胞を RPMI1640/10°/。 FCS溶液を 用いて洗い流した。 リ ンパ球の直径は約 8μ ηι(8μ milii m)であり、 使用 するマイク口ゥヱノレの直径が ΙΟμ πιであるためにひとつのマイク 口 ゥヱ ルにはリ ンパ球は 1個入る。 力パーグラスを上記シールの上に置き、 チ ップとカバーグラスの間に RPMI1640 0% FCS溶液を満たした。 このマイ クロウエルアレイチップをマイクロアレイスキャナ一に挿入し、 解像度 10μ mでスキャンし、データを保存した（抗原刺激前の蛍光のデータ ： A)。 次に、 チップとカバーグラスの間の RPMI1640/10°/。 FCS溶液を除き、 そ こへ RPMI1640/10% FCS溶液に溶解させた抗原 （10// g/mL) を加えた。 抗 原を加えて 1分後にマイク口ゥヱルァレイチップをマイクロアレイスキ ャナ一に挿入し、 解像度 10μ mでスキャンし、 データを保存した （抗原 刺激後の蛍光のデータ ： B)。 刺激前後の蛍光強度の比（B/A)を計算し、 比の大きいゥエルを特定し た。 このゥヱルの中に抗原特異的 B リ ンパ球が存在した。 実施例 2
蛍光顕微鏡あるいはマイクロアレイスキャナーを用いて細胞のマイ クロウヱノレへの導入の効率を調べた。
CellTracker Orange (Molecular Probe社） を用レヽてマウスリ ンノ 球 を蛍光標識した。
マウスリ ンパ球は、 以下のよ うに入手した。
マウスよ り脾臓を摘出し、 PBSが入ったプラスチックシャーレに移し た。 脾臓を 2 枚のメ ッシュの間に挟み、 すりつぶすことによ り リ ンパ 球を脾臓より取り 出す。 取り 出したリ ンパ球は RPMI 1640, 10% FCS 溶 液に懸濁し、 リ ンパ球の数を数えた。 マウスリ ンパ球の蛍光標識は、 以下のよ う に行った。
2 106個 の B リ ンノヽ0 球 を 1 M Ce l lTracker Orange (Mol ecular Probes, USA) 0. 02% Pluroni c F - 127 (Mol ecular Probes, USA) を含む Loading Buffer (20 mM HEPES, pH7. 4, 137 mM NaCl, 2. 7 mM KC1 ， 1. 8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2， 1 mg/ml Glucose, 1 mg/ml BSA)に懸淘し、 室温 で振盪しながら 30分ィンキュベーショ ンした。 RPMI 1640/ 10% FCS溶液で 細胞を洗浄し、細胞内に導入されなかった Ce l lTracker Orangeを除いた。 その後細胞を RPMI 1640/ 10% FCS溶液に懸濁した。
蛍光標識したマウスリ ンパ球 （105個/ / i L) の細胞懸濁液（100 μ L) を、 マイクロゥヱルアレイを覆う よ うに加え、 細胞を播種した。 ここで使用したマイク ロウェルアレイの形状や寸法等は、 以下の通 りである。
直径 m、 深さ 12 mのマイクロウェルが 2 cm x 2. 5 cmのチップ上 に縦 · 横 15 μ mの間隔 （マイクロウヱルの中心から中心までの距離は 25 μ m) で配置されている。 マイクロウェルアレイチップの両側には厚さ Ιηπηφ畐約 lmm長さ 2cmのシーノレを貝 った。 細胞がゥヱル内に沈むのを待ったあと、 ピぺッ ト操作によ り ゥエル 外の細胞を洗い流した。 この細胞播種、 洗浄の一連の操作を数回繰り 返すことでより多くのゥヱルに細胞を入れることができる。 最後にバ ッファー （RPMI 1640/ 10°/。 FCS溶液） で洗浄しゥエル外に細胞が残らな いようにした。 カバーガラスをかぶせ、 乾燥を防ぐと同時に液面を均 一にして読み取りの精度を高めた。これを蛍光顕微鏡（BX_URA2/BX51W、 ォリ ンパス光学工業、 日本） 下で観察し、 またマイクロアレイスキヤ ナー（CRBIO l i e- FITC、 日立ソフ トウェアエンジニアリ ング、 日本）に 揷入し蛍光を読みとつた。 結果を図 4に示す。 リンパ球の直径は約 8 // mであり、使用したマイクロゥエルの直径が 10 μ mであるために、ひとつのマイクロウェルにはリンパ球は 1個入る, 図 4では、 チップの一部である 1クラスター（30 X 30)を示す。
左図は蛍光顕微鏡で観察した結果であり、約 85%のゥエルに細胞が入つ ていることが確認された。 右図は別のサンプルをマイクロアレイスキ ャナ一で観察した結果であり、約 99%のゥヱルに細胞が入っていること が確認された。 実施例 3
[抗原特異的 B リ ンパ球のマイクロアレイスキャナーによる検出] 健常人に B型肝炎ウィルスヮクチンを接種し、 常法により、 4 日 目あ るいは 6 日 目に末梢血より B リ ンパ球を調製した。 ヒ ト B リンパ球を カルシウム蛍光指示薬 Fluo- 4/AM ( Mo l ecular Probes 社） 4 μ M， Cel lTracker Orange ( Molecular Probes ft ) 1 μ M ， Pluroni c F-127 (Mol ecular Probe s ¾：) 0. 02%を含むノ ッファー ( Loading Buffer ( 20raM HEPES, pH7. 4, 137mM NaCl, 2. 7mM KC1, 1. 8mM CaCl22H20, ImM MgCl2, lmg/mL glucos e, lmg/mL BSA) ) に懸獨することにより、 Fluo— 4 および Cel lTracker Orange を細胞質内に導入した。 Fluo- 4 および Ce l lTracker Orangeを負荷した B リ ンパ球を実施例 2 と同様のマイク 口ゥヱルァレイチップに実施例 2 と同様の方法で播種した。 その後、 マイクロ ウェルア レイチップに播種した Fluo- 4 および Ce l lTracker Orange を負荷した B リンパ球に、 B型肝炎ゥィルス抗原 HBsタンパクによる刺激を与え、刺激前後での B リ ンパ球の蛍光をマイ クロウエルアレイキヤナ一で観察した。 結果を図 5に示す。
B型肝炎ゥィルス抗原 HBsタンパクによる刺激は、以下のようにして 与えた。 マイクロアレイスキャナーより取り出したマイクロゥヱルアレイチ ップから RPMI 1640 0% FCS 溶液をチップにより抜き取り、 かわりに RPMI 1640/ 10% FCS溶液に lOO ^ g/mLになるように希釈溶解した B型肝 炎ウイルス抗原 HBs タンパクを添加し、 再びマイクロアレイスキャナ 一に挿入し、 約 1分後に解像度 2. 5 μ mでスキャンした。 図 5の左図はリ ンパ球を刺激する前の蛍光画像である。 Fluo - 4を導 入したリンパ球がわずかな蛍光を発しているため画像では淡い水色を 示すが、 蛍光強度はかなり低かった。 一方、右図はリ ンパ球を抗原（ B型肝炎ゥィルス抗原 HBs タンパク 100 μ g/mL) で刺激した後の蛍光画像である。 大部分のリ ンパ球では、 蛍 光強度に変化はない。 しかし、 抗原特異的 B リ ンパ球 （矢印の部分） の蛍光が増加し、 画像では赤色を示している。
さらに、 Ce l lTracker Orangeの蛍光を観察することにより、 刺激前 後で各ゥエルに細胞が 1 個ずつ入っており、 刺激前後で細胞のゥ ル 間の移動がないことを確認している （データなし）。 図 5に示す枠に囲まれた 25 (5 X 5)個の細胞について、 それぞれの蛍 光強度の測定値をプロッ トし、 図 6に示す。 抗原特異的 B リ ンパ球（矢印のボイント）の蛍光強度は刺激前およそ 77000 (77454)であった力 S、 朿 lj激後およそ 350000 (349242)になり、 4. 5 倍の増加を示した。 それに対して、 刺激に反応しない 24個のリ ンパ球 は刺激前平均 52000 (51683. 875)、 刺激後平均 39000 (38720. 833) 、 平 均 0. 75倍の変化であり、 蛍光強度に有意な変化はみられない。 図 6で、 中央の直線 （斜線） は刺激前後の蛍光強度が変化しない場 合の蛍光強度を示しており、 両側の 2本の直線 （斜線） は刺激前の蛍 光強度に対して刺激後の蛍光強度が 4 倍 （上側の直線） あるいは 1/4 倍 （下側の直線） に増加した場合の蛍光強度を示している。 抗原特異 的 B リ ンパ球（矢印のポイント）の蛍光強度は、 上側の直線のやや上に 位置している。 ひとつのマイクロウェルにはリ ンパ球が 1個入ってお り、本方法で、 B型肝炎ウィルス抗原 HBsタンパクで刺激された 1個の 抗原特異的 B リ ンパ球を検出できることが分かる。 実施例 4
[マイク口ゥエルァレイチップを用いた抗原特異的 Bリ ンパ球の検出] これまでに B型肝炎ウィルスヮクチンを接種することにより B型肝炎 ウィルスの HBs 抗原に対する抗体の力価が上昇していた健常人ボラン ティア (#1、 #2) に常法により、 B型肝炎ウィルスのヮクチン（HBs抗原 10μ g)を接種し、 接種前およぴ後 （ 4 日、 6 日、 8 日、 1 0 日後） の 末梢血を採取し、 リ ンパ球を分離、 さらに B リ ンパ球を分離調製.した。 その B リンパ球を、 実施例 3 と同様にして Fluo- 4 (Molecular Probes 社） 4μ Mおよび CellTracker Orange (Molecular Probes ¾：) 1 Mで 標識後、 マイ ク ロゥエルァレイチップに播種し、 B型肝炎ウィルス抗原 (HBs タンパク ΙΟΟμ g/mL)で刺激した。 マイ ク ロアレイスキャナーを用 いて抗原刺激前後の細胞の蛍光を測定し、刺激前には Fluo- 4の蛍光の シグナルが弱く、刺激後に Fluo-4の蛍光のシグナルが増強した細胞（抗 原特異的 B リ ンパ球） の数を計測した。 次に、 CellTracker Orange の 蛍光を観察し、 B リ ンパ球の総数を計測した。 抗原に反応して Fluo- 4 の蛍光が増加した細胞の数を B リンパ球の総数で割った頻度 （百分率） を計算してグラフに示した。 結果を図 7に示す。 刺激後に蛍光のシグナルが増強した細胞 （抗原特異的 B リ ンパ球） の数の計測は、 以下のように行った。 マイクロアレイスキャナーを用いて抗原刺激前後の Fluo- 4 および Ce l lTracker Orange の蛍光画像を得る。 これらを比較し、 Cel lTracker Orangeの蛍光シグナルにより、 抗原刺激の前後で細胞の位置が移動し ていないもので、刺激前には Fluo- 4 の蛍光シグナルが弱く青色で表示 され、刺激後に Fluo - 4 の蛍光シグナルが増強し赤色で表示される細胞 を、 シグナルが増強した細胞 （抗原特異的 B リ ンパ球） として計数し た。 頻度を計算するために、 任意に選んだ 5 クラスター（4500 ゥエル） について、 Fluo-4 の蛍光シグナルが増強した細胞 （抗原特異的 B リ ン パ球） を数えた。 また同じ 5クラスター（4500 ゥヱル）に含まれる全細 胞数を Cel lTracker Orange ( Mol ecul ar Probe 社） の蛍光画像を用レヽ て計測した。 図 7に示す結果から以下のことが分かる。
1. B 型肝炎ウィルスワクチンを接種することにより B 型肝炎ウィル スの HBs 抗原に対する抗体の力価が上昇していた健常人ポランテ ィァの末梢血中の B型肝炎ゥィルス抗原特異的 B リ ンパ球は全 B リ ンパ球のわずか 1〜2°/。である。
2. また、 ヮクチン接種後 4〜6 日後をピークに全 B リ ンパ球に対する 抗原特異的 B リ ンパ球の割合が上昇し、 その後ワクチン接種前の 割合にまで下がることが分かる。
3. このよ うに本方法により ヒ ト末梢血中の抗原特異的 B リンパ球の 有無、 頻度おょぴその変化を検出することができる。 実施例 5
1. ンパ球の分離
末ネ肖血力 ら Ficoll— Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden) を用レヽてリ ンノヽ0球画分を分離し、 さ ら ίこ AutoMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) を用いてリ ンパ球画分から B リ ンパ球画分をさ ら に分離精製した。
2. F 1 o 3の細胞への導入 （図 1参照）
2 X 106個の B リ ンパ球を 2 μ M F 1 u o 3 / AM (同仁、熊本） /loading buffer (137mM NaCl, 2.7 mM KC1, 1.8mM CaCl2, 1 mM MgCl2, lmg/mLグ ルコース， lmg/mL BSA, 20mM HEPES (pH7.4) )に懸濁し、 室温に 30分ィ ンキュベーシヨ ンした。 loading bufferで細胞を洗浄し、 細胞内に導入 されなかった F 1 u o 3 /AMを除く。 その後細胞を RPMI1640/10°/。 F C S溶液に懸濁した。
3. マイクロウェルアレイチップ （図 2参照）
マイクロウエノレア レイチップは poly (dimethyl si loxane) ( P D M S ) を用いて作製されており、直径 10 m、深さ 32// mのマイクロウェルが 2 cm X 2 cmのチップ上に縦 ' 横 30 μ mの間隔 （マイク ロ ウヱノレの中心力 ら中 心までの距離は 40 m) で配置されている。 チップの両側には厚さ lmm幅 約 lmm長さ 2cmのシールを貝占った。
4. マイクロアレイスキャナー 本装置は基本的に日立ソフ トウェアエンジニアリ ング （株） （横浜巿） のマイクロアレイスキャナー （CRBIO lie) を用いており 、 以下の変更 を加えている。 搭載されているレーザー （Cy3用， 532 nm; Cy5用， 635 nm) のうちの 1本を 473nmのレーザーと置換してある。
5. マイクロウェルアレイチップを用いた活性化 B リ ンパ球の検出 （図 2参照）
上記マイク口ゥヱルァレイチップに上記細胞懸濁液を添加し、 5分間 静置する。 マイク ロ ウヱルに入らなかった細胞を RPMI1640/10% F C S 溶液を用いて洗い流した。 リ ンパ球の直径は約 8μ mであり、 使用するマ ィク口 ウエノレの直径が 10/ mであるためにひとつのマイク口ウエノレには リ ンパ球は 1個入る。 カバーグラスを上記シールの上に置き、 チップと カバーグラスの間に RPMI164(VlO°/。 F C S溶液を満たした。 このマイク 口 ゥエルアレイチップをマイクロアレイスキャナ一に挿入し、 解像度 10 μ mでスキャンし、データを保存した（抗原刺激前の蛍光のデータ ： A)。 次に、 チップとカバーグラスの間の RPMI1640/10°/。 F C S溶液を除き、 そこへ RPMI1640/10% F C S溶液に溶解させた抗原 （10/z g/mL) を加え た。 抗原を加えて 1分後にマイクロ ゥヱルアレイチップをマイクロアレ ィスキャナーに揷入し、 解像度 10μ mでスキャンし、 データを保存した (抗原刺激後の蛍光のデータ ： B)。 刺激前後の蛍光強度の比（B/A)を計算し、比の大きいゥエルを特定し た。 このゥエルの中に抗原特異的 B y ンパ球が存在した。
6. マイクロウエノレからの細胞の分取。
マイクロマニピュレータを用いてガラスキヤビラ リーを用いるこ と により顕微鏡下で細胞を分取した。
7. 抗原特異的 B リ ンパ球からの抗体遺伝子の P C Rによる増幅 （図 8 参照）
1個の抗原特異的 B リ ンパ球を P C R用チューブに添加する（5 μ L)0 細胞に 15. 15 μ Lの細胞溶解液 (25 μ Lに希釈された時の最終濃度： lx Ist strand buffer [GIBC0— BRL, SuperScriptll【こ添付されてレヽる ] , 0.2 mM dNTP, 0.25% NP-40, 0.1 nig/mL BSA, 10 mM DTT, Random Primer 0.05 μ M, 1U/ μ L RNasin [Promega, Madison, Wl]) をカロえ、 そこへ逆転写酵 素 SuperScriptll (GIBC0-BRL, Rockville, MD) を (4.85 μ L, 50U) 添 加し 37°C、 1時間反応させ m R N Aより c D N Aを合成した。
R T-P C R反応
Cell sol. (1 cell) 5.0 ^ L
1st strand buffer (5x) 5.0
2.5 mM dNTP 2.0
2.5 % NP-40 2.5
1 mg/ml BSA 2.5
0.1M DTT 2.5 Random primer (50 pmol/ μ L) 0.025
RNase Inhibitor ( RNasin 40U/ μ L) 0.625
Super Script II 4.85 (50U)
Total 25.0 μ L
37°C 1 h
上記反応により 1個のリ ンパ球の m R N Aから逆転写酵素を用いて c D N Aを作製した。 抗体遺伝子の増幅 ：
ヒ ト抗体遺伝子の H鎖の V領域は 7種類のサブファ ミ リ一に分類さ れる。 サブフアミ リーの V断片の配列はよく似ているので共通したプラ イマ一を設定することが可能である。 H鎖および L鎖の各サブファ ミ リ 一ごとにプライマーを設定し、 H鎖あるいは L鎖の全サブフアミ リーに 対するプライマーをミ ックス したものを用い、 以下のように P C R反応 を 2回行い、 抗体遺伝子を増幅した。
P C R 1の反応は、 上記 c D N A5 μ Lを 15 μ Lの PCR mix (最終濃度 ： lx TAKARA ExTaq buffer, 0.25 mM dNTP, 各サブフア ミ リーに対する Primer 1 0.5 μ M, 0.05U/ μ L ExTaq [Takara, 京都]) にカロ免、 9 °C, 3 min; (94°C, 30 sec; 60°C， 1 min; 72。C， 1 min 30 sec) x 40 cycles; 72°C, 5 min; 10°C， ∞反応させた。
P C R 1 cDN onA (上記 RT反応液） 5.0
10x ExTaq buffer 2.0
2.5 mM dNTP 2.0
Primer 1 5' Mix (10 μ M each) 1.0
Primer 1 3' Mix (10 μ M each) 1.0
H20 7.0
Takara ExTa¾. (0.5 U/ a L) 2.0
Total 20.0 μ L
94 °C, 3 min.
94 °C， 30 sec; 60。C, 1 min; 72 °C, 1.5 min. 40 cycles
72 °C， 5 min.
10 °C
P C R 1の反応により免疫グロブリ ン （抗体） 遺伝子の L e a d e r 配列から定常部 （C) 領域までの DN A配列を増幅した。 以下に上記反応で用いたプライマー（H鎖用）の配列を示す。
Primer 1 5 Mix (各 10 ίί Μ) (ν領域用プライマ - -)
hVH17a.1 atggactgsayytggagvdtc (SEQ ID No =1)
hVH2a.1 tccacrctcctgctrctgac (SEQ ID No =2)
hVH3a.1 gggcygagstggvttttyct (SEQ ID No =3)
hVH4a.1 tcctcctsctggtggcagct (SEQ ID No =4)
tcaaccgccatcctcgccct (SEQ ID No= 5) hVH6.1 ctccttcctcatcttcctgcc (SEQ ID No=6)
Primer 1 3， Mix (10 μ M each) (C領域用プライマー） hIGHGl-4out agtccttgaccaggcagccca (SEQ ID No=7) hIGHMout attctcacaggagacgagggg (SEQ ID No=8) 以下に上記反応で用いたプライマー（L鎖用）の配列を示す
PCR 1
5 primer
hKV12 .1 atgaggstcccygctcagctc (SEQ ID No=9)
1 i—
hKV3. 1 ctcttcctcctgctactctggc (SEQ ID No=10)
O o〇
1 1 II
hKV45 .1 C]S
ct stt sctytggat ctctg (SEQ ID No=ll)O C
hKV6. 1 tgggtttctgctgctctggg (SEQ ID No=12) hKV7. 1 atagggtccggggctcctttg (SEQ
hし V12 - 1 cykctsctcctcactctcctc (SEQ ID No-14) hLV3. 1 ttctcctcctcggcctcctct (SEQ ID No=15) hLV4. 2-2 ccagcytgtgctgactcaatc (SEQ ID No=16) hLV789.2 tcycagmctgtgstgacycag (SEQ ID No=17) hLV6. 1 ttttatgctgactcagcccc (SEQ ID No=18) hLV7. 1 gg cctggactcctctctttctg (SEQ ID No=19) hLV8. 1 ggcctggatgatgcttctcctc (SEQ ID No=20) hLV9. 1 tcctctgctcctcaccctcct (SEQ
hLVIO .1 cctgggtcatgctcctcctga (SEQ
hLVll .1 gcctgggctccactacttctc (SEQ ID No=23) 3 ' primer
hlGKl ctgctcatcagatggcggga (SEQ ID No=24)
hlGLl gacacacyagtgtggccttgt (SEQ ID No=25)
P C R 2 の反応は P C R 1 の反応溶液 2 を 18 // Lの P C R m i x (最終濃度 ： lx TAKARA ExTaq buffer, 0.25 mM dNTP, 各サブファ ミ ジ 一に対する Prime:r2 0.5 μ ΙΙί, ExTaq 0.05U/ μ L) にカロ免、 94°C, 3 min; (94°C, 30 sec; 60°C, 1 min; 72°C， 1 min 30 sec) x 40 cycles; 72。C， 5 min; 10 °C, ∞反応させた。
P C R 2
PCR 1 sol. 2.0
lOx ExTaq buffer 2.0
2.5 mM dNTP 2.0
Primer 2 5 ' Mix (10 μ M each) 1.0
Primer 2 3' Mix (10 μ M each) 1.0
H20 10.0
Takara ExTag (0.5 U/ a L) 2.0
Total 20.0
94 °C, 3 min.
94 °C, 30 sec; 60 °C, 1 min; 72 °C， 1.5 min. 40 cycles
72 °C， 5 min. 10 °c
P C R 2の反応により P C R 1で増幅した免疫グロプリ ン （抗体） 遺 伝子の可変部 （V H) 領域から定常部領域までの D N A配列を増幅し た。 以下に上記反応で用いたプライマー（H鎖用）の配列を示す <
Primer2 Mix
Primer 2 ¾ Mix (10 μ Μ each)
hVH17a. 2 ggtgcagctkgtrcartctgg (SEQ ID No=26)
hVH2a. 2 caccttgarggagtctggtcc (SEQ ID No=27)
hVH3a. 2 aggtdcarctgktggagtcyg (SEQ ID No=28)
hVH4a. 2 ggtcctgtcycagstgcagct (SEQ ID No=29)
hVH5a. 2 gtgcagctggtgcagtctgg (SEQ ID No=30)
hVH6. 2 gcagcagtcaggtccaggact (SEQ ID No=31)
Primer 2 3: Mix (10 μ M each)
hIGHGl-4s aagacsgatgggcccttggtg (SEQ ID No=32)
hIGHM aagggttgggcggatgcact (SEQ ID No=33) 以下に上記反応で用いたプライマー（L鎖用）の配列を示す。
PCR 2
5 ' primer
hKVl. 2 ccagatgacccagtctccatc (SEQ ID No=34) ぶ
>
hKV2.2 ccagtggggatattgtgatgac (SEQ ID ' o =35) KV3.2 cagtctccagccaccctgtct (SEQ ID No= 36) hKV4.2 gtgatgacccagtctccagac (SEQ ID No= 37) hKV 5.2 acactcacgcagtctccagca (SEQ ID No: 38) hKV67.2 ttgtgctgacycagtctccag (SEQ ID No= 39) agtctgtgctgacgcagccgc (SEQ ID No- 40) hLV23.2 tgactcagccwcyctcmgtgtc (SEQ ID 1 No =41) hLV4.2-3 caatcatcctctgcmtctgc (bEQ ID No=42) hLV5.2-2 gactcagccaacctccctctc (SEQ ID No= 43) hLV6.2 gactcagccccactctgtgtc (SEQ ID No= 44) hLV789.2 tcycagmctgtgstgacycag (SEQ ID No = 45) hLVlOll.2 tgactcagccmcmctckgtgtc (SEQ ID 1 No =46)
3 ' primer hIGK2 gacagatggtgcagccacagt (SEQ ID No= 47) hIGL2 cttgragctcctcagaggaggg (SEQ IE I No =48)
P C R産物を、 ァガロースゲルを用いて解析、 精製し、 p T 7 B 1 u e — T v e c t o r (Novagen, Madison, WI) にクロー -ングし、 抗体遺伝子配列を決定した。 既存のデータベースに入っている抗体遣 伝子の配列と比較したものを図 9及び 1 0に示す。 図 9は L鎖の配列 であり、 図 1 0は H鎖の配列である。 各図ともに、 上側に示した塩基 配列が実際に 1個の B リ ンパ球から R T— P C Rで増幅し、 配列決定 した抗体遺伝子の配列であり、 下側に示した塩基配列がデータベース に登録されていた既存の配列である。 図 9
1st 塩基配列 （配列決定した抗体遺伝子） '
File Name: LI (SEQ ID No=49)
2nd 塩基配列（既存の配列）
File Name: L33038 (SEQ ID No=50)
図 1 0
1st 塩基配列 （配列決定した抗体遺伝子）
File Name: HI (SEQ ID No=51)
2nd 塩基配列（既存の配列）
File Name: AF062204(SEQ ID No=52) 図 9及び 1 0中の 94。/。および 98 %は、 配列決定した抗体遺伝子と既 存の配列との相同性を意味する。 相同性の値から、 配列決定した抗体 遺伝子は既存の配列とは異なる抗原に対応した抗体だと推測された。 産業上の利用可能性
本発明では、 血液中のリ ンパ球 1個が 1つのマイクロウェルに入る ように添加し、 これらのリ ンパ球を抗原で刺激する。 ここでいう抗原 とは感染症における細菌やゥィルスなどの病原体をさす。 血液中のリ ンパ球は 1個 1個がそれぞれ別々の抗原に反応する。 本発明のマイク ロウヱルアレイチップを用いれば、 例えば、 抗原に反応する B リ ンパ 球を検出することができる。 さらに、 検出された抗原特異的 B リ ンパ 球を回収することができる。 抗原特異的 B リ ンパ球を回収できると、 マイクロウェルとは別のチューブ中で、 抗原 （病原体） に反応する抗 体遺伝子を、 例えば、 PCRなどにより増幅できる。 抗原特異的 B リ ンパ 球を検出したマイクロウェル中で抗原 （病原体） に反応する抗体遺伝 子を増幅することもできる。 本発明の抗原特異的リ ンパ球の検出法は、 マイクロウェルアレイチ ップを用いて行う。 そのため、 検出した抗原特異的リ ンパ球はマイク 口ゥ -ルの中にあるため、 その細胞の加工（細胞の分取 · DNA/RNAの調 製）が容易である。 また、 細胞の抗原に対する応答を検出できる。 抗原 だけでなく、 様々な刺激に対する細胞の応答、 また、 細胞の応答に対 する様々な試薬等の影響を解析することが可能である。 感染症に対しては、 病原体特異的リ ンパ球を検出し、 病原体特異的 抗体遺伝子をクローニングすることにより、 がんに対しては腫瘍特異 的リ ンパ球を検出し、 腫瘍特異的抗体遺伝子、 腫瘍特異的 T細胞受容 体遺伝子をクローニングすることにより、 抗体を用いた抗体療法、 ま た、 T細胞受容体遺伝子を用いた遺伝子治療が可能になると期待され る。 自己免疫疾患においては自己反応性リ ンパ球を検出し、 自己抗体、 自己抗原特異的 T細胞受容体遺伝子をクローニングすることにより、 アレルギーにおいてはアレルゲン特異的リ ンパ球を検出し、 IgE遺伝子 をクローニングすることにより、 正確な病因 *病態の把握を行い、 病 因に対応した治療や治療効果のモニターを行うことができる。 さらに、 すべてのリ ンパ球を対象に網羅的に個人の持つすべての抗 体遺伝子や T細胞受容体遺伝子をモニターすることにより、 和漢薬の 免疫機能に対するモニターや病原体に対する免疫応答を予測すること によりテーラーメード医療に応用することができる。

Claims

請求の範囲
1 複数個のマイクロ ウヱルを有し、 各マイク ロウヱルに 1個の被検 体リ ンパ球を格納し、 抗原特異的リ ンパ球を 1個単位で検出するため に用いられるマイクロゥヱルアレイチップであって、 前記マイクロウ エルは、 1つのマイクロウェルに 1つのリ ンパ球のみが格納される开 状及ぴ寸法を有するマイクロウエルアレイチップ。
2 前記マイクロウェルは、 円筒形、 直方体、 逆円錐形、 若しく は逆 角錐形またはこれらの 2 つ以上を組合せた形状である、 請求項 1 に記 載のマイク口ゥヱノレアレイチップ。
3 マイクロウェルの平面形状に内接する最大円の直径が、 マイクロ ゥヱルに格納しょ う とする リ ンパ球の直径の 1〜2倍の範囲であり、 か つマイクロウェルの深さは、 マイク ロウェルに格納しょ う とする リ ン パ球の直径の 1〜2倍の範囲である、 請求項 1 または 2に記載のマイク 口ゥヱノレアレイチップ。
4 1個の被検体リ ンパ球が含まれるマイクロ ゥエルを複数有する抗 原特異的リ ンパ球検出用マイク口ゥヱルァレイチップ。
5 前記マイクロウエルは、 直径 5〜； 100 μ mであり、 深さ 5〜100 μ m である請求項 4に記載のマイクロウエルアレイチップ。 6 前記被検体リ ンパ球は培養液とともにマイク口ゥエルに格納され ている請求項 4又は 5に記載のマイク口ゥエルァレイチップ。
7 前記被検体リ ンパ球は血液由来である請求項 4〜 6のいずれか 1 項に記載のマイクロゥヱルアレイチップ。
8 前記被検体リ ンパ球は B リ ンパ球または Tリ ンパ球である請求項 4〜 7のいずれ力、 1項に記載のマイクロウエノレアレイチップ。
9 請求項 4〜 8のいずれか 1 項に記載のマイクロゥヱルアレイチッ プの各マイクロウェルに抗原を添加し、 被検体リ ンパ球を刺激し、 抗 原に反応する被検体リ ンパ球を検出することを含む、 抗原特異的リ ン パ球の検出方法。
1 0 抗原に反応する細胞の検出を、 C aイオン依存性蛍光色素を用 いて行う請求項 9に記載の方法。
1 1 抗原に反応する細胞の検出を、 抗原により刺激され活性化した 被検体リ ンパ球細胞の表面に発現する活性化マーカータンパク質を指 標として行う請求項 9に記載の方法。 1 2 抗原に反応する細胞の検出を、 被検体リ ンパ球細胞内蛍光物質 が発する蛍光の偏光度を指標として行う請求項 9に記載の方法。
1 3 抗原に反応する細胞の検出を、 被検体リ ンパ球細胞の增殖また は抗体産生を指標として行う請求項 9に記載の方法。
1 4 抗原がタンパク質、 ペプチド、 DNA、 RNA、 脂質、 糖鎖、 または 有機高分子化合物である請求項 9〜 1 3のいずれか 1項に記載の方法
1 5 抗原が、 細菌、 ウィルス、 自己抗原、 がん抗原またはアレルゲ ンである請求項 9〜 1 3のいずれか 1項に記載の方法。
1 6 請求項 9〜 1 5のいずれか 1項に記載の方法により、 検出され た抗原に反応する被検体リ ンパ球をマイクロウェルから回収すること を含む、 抗原特異的リ ンパ球の製造方法。
1 7 ある抗原に特異的に反 するリ ンパ球 （以下、 抗原特異的リ ン パ球という） を 1個選択し、 次いでこの 1個の抗原特異的リ ンパ球か ら抗原特異的抗原受容体遺伝子をクローニングする方法。
1 8 前記 1個の抗原特異的リ ンパ球の選択は、 1個の被検体リ ンパ 球が含まれるマイク口ゥエルを複数有する抗原特異的リ ンパ球検出用 マイクロゥヱルアレイチップの各マイク口ゥエルに抗原を添加し、 次 いで、 抗原に反応したリンパ球を検出し、 検出された抗原特異的リ ン パ球をマイクロウェルから取り出すことによ り行う請求項 1 7に記載 の方法。
1 9 抗原特異的リ ンパ球は、 頻度が 0. 1 %以下である請求項 1 7 に記載の方法。
2 0 抗原特異的リ ンパ球を、 細胞溶解剤を用いて溶解し、 RT— P C Rを用いて抗原特異的抗原受容体遺伝子を増幅する請求項 1 7〜 1 9のいずれか 1項に記載の方法。
2 1 RT— P C Rが、 逆転写酵素による c D NA調製の後、 抗原受 容体遺伝子用のプライマーミ ックスを用いて P C Rを 2回行うことに より行う請求項 2 0に記載の方法。
2 2 抗原特異的リ ンパ球が B リ ンパ球または Tリ ンパ球である請求 項 1 7〜 2 1のいずれか 1項に記載の方法。
2 3 抗原特異的抗原受容体遺伝子が、 抗原特異的リ ンパ球が B リン パ球である場合には免疫グロプリ ン遺伝子であり、 Tリ ンパ球である 場合には T細胞受容体遺伝子である請求項 2 2に記載の方法。
2 4 抗原特異的リ ンパ球が B リンパ球であり、 抗原特異的免疫グロ ブリン遺伝子がクローニングされる請求項 1 7〜 2 3のいずれか 1 項 に記載の方法。
2 5 抗原特異的リ ンパ球が Tリンパ球であり、 抗原特異的 T細胞受 容体遺伝子がクローニングされる請求項 1 7〜 2 3のいずれか 1 項に 記載の方法。
2 6 遺伝子の増幅を、 検出された抗原特異的リ ンパ球をマイクロウ エルから取り出すことなく、 マイクロゥヱル中で行う請求項 1 8〜 2 5のいずれか 1項に記載の方法。
2 7 請求項 2 4に記載の方法により クローニングされた抗原特異的 免疫グロプリ ン遺伝子を用いて、モノクローナル抗体を製造する方法。
2 8 請求項 2 5に記載の方法により クローユングされた抗原特異的 T細胞受容体遺伝子を用いて、 遺伝子治療用材料を製造する方法。
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