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WO2004046732A1 - Methodes de criblage de composes modulant le flux de cholesterol et utilisations - Google Patents

Methodes de criblage de composes modulant le flux de cholesterol et utilisations Download PDF

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WO2004046732A1
WO2004046732A1 PCT/FR2003/003303 FR0303303W WO2004046732A1 WO 2004046732 A1 WO2004046732 A1 WO 2004046732A1 FR 0303303 W FR0303303 W FR 0303303W WO 2004046732 A1 WO2004046732 A1 WO 2004046732A1
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WO
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adipophilin
cholesterol
compound
matrix
activity
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PCT/FR2003/003303
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Guilhem Larigauderie
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Genfit SA
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Publication date
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Publication of WO2004046732A8 publication Critical patent/WO2004046732A8/fr
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to methods for identifying, selecting or characterizing biologically active compounds, in particular compounds active on the vascular system, said methods being based on the modulation of the activity of adipophilin through cells or membrane preparations .
  • the methods of the invention can include in vitro binding tests, binding tests in the cellular system (or on natural or synthetic membrane preparations) or functional tests in the cellular or artificial system. It relates in particular to a method of selection, identification or characterization of compounds capable of modulating the flow of cholesterol comprising bringing into vitro or ex vivo contact, a test compound with a foam cell or a natural or synthetic membrane preparation expressing l adipophilin, and the demonstration of a modulation of the activity of said adipophilin. It also relates to the uses of the compounds thus selected, identified or characterized.
  • Atherosclerosis is a multifactorial disease of the vessels, of slow evolution, during which numerous genetic and / or environmental risk factors act to favor the development of lesions. It corresponds to a chronic inflammatory reaction of the arterial wall, transformed into an acute clinical event on the occasion of the rupture of an atheroma plaque and the formation of an occlusive thrombus. Atherosclerosis is a major cause of morbidity, mortality, myocardial infarction, cerebral ischemia, cardiovascular disease and peripheral vascularization. Hypercholesterolemia and cholesterol overload of macrophages, involved in vascular inflammation, are major factors that contribute to atherosclerosis. Hypercholesterolemia is currently treated through the combination of diet and drug intervention with, for example, bile acid sequestering agents or statins. The development of new therapeutic strategies is however necessary to overcome the limits of existing therapies.
  • HDLs High Density Lipoproteins
  • Lipoproteins of High Density make it possible to discharge the cholesterol which accumulates in peripheral tissues and ensures its metabolic elimination via the liver. It thus contributes to the protection of the organism against atherosclerosis.
  • Apolipoprotein A-1 is a fundamental constituent of HDL, responsible for their effectiveness. In this regard, the increased expression of apoA-1 has a protective effect against atherosclerosis.
  • Atherosclerosis is initiated by an infiltration, through the endothelium, of LDL (“Low Density Lipoproteins” or Lipoproteins of Low Density).
  • LDL particles bind to glycosaminoglycans and, once trapped in the extracellular matrix of the sub-endothelium, accumulate in certain preferred sites. In this wall microenvironment, the particles begin to undergo oxidative changes.
  • monocytes of the intima of the artery to which they adhere to the level of the extracellular matrix. They then differentiate into mature macrophages. These cells, thanks to specific receptors (“scavengers” receptors) capture and degrade the modified LDL accumulated in the intimal space of the artery.
  • Macrophages are present at all stages of atherogenesis. Their participation is predominant in the atheromatous process (as opposed to sclerosis) since they participate in the constitution of the lipido-necrotic nucleus, determining for the vulnerability of the plaque. The importance of macrophagic infiltration seems to be directly correlated to the instability and fragility of the plaque.
  • the functions of macrophages are manifold: presentation of antigens to T lymphocytes, purification of debris and toxic materials, secretion of an extraordinary variety of enzymes, cytokines and growth factors.
  • macrophages and foam cells trapped in the intima are active cells secreting multiple substances which modify the cellular and extracellular components of the wall. This is how a physiological phenomenon of purification is transformed into a local pathological process.
  • the participation of monocyte-macrophages in the development of atherosclerosis is broken down into three major stages: (a) penetration and activation in the intima, (b) interactions with smooth muscle cells and T lymphocytes, and (c) transformation into foam cells.
  • the activated endothelial cells produce chemo-attractants which recruit the circulating monocytes, migrating by diapedesis between the endothelial junctions.
  • the main chemotactic factors for monocytes are: "Monocyte Chemotactic Peptide-1” (MCP-1), “Colony Stimulating Factors” (CSFs), “Transforming Growth Factor- ⁇ ” (TGF- ⁇ ), and LDL oxidized.
  • monocytes exposed to modified lipoproteins, cytokines, chemo-attractive molecules and growth factors follows their penetration into arterial tissue. It is characterized by the acquisition of an ability to synthesize and express other factors which in turn will stimulate the activity of surrounding cells.
  • macrophages synthesize multiple proteases, growth factors, active oxygen species, peroxide lipids, chemotactic factors that can be toxic to other cell types and allow them to play an important role in the development of atherosclerosis .
  • macrophages into foam cells can be accompanied by significant modifications, for example shifting the balance towards pro-coagulants in the atheroma plaque.
  • the intracellular accumulation of free and esterified cholesterol induces stimulation of the expression of tissue factor, one of the main molecules initiating the extrinsic pathway of coagulation.
  • plaque macrophages are a marker for unstable plaques: the coronary plaques of patients with unstable angina contain more macrophages than those of stable coronary patients. In fact, 20% of plaques are responsible for 80% of symptoms.
  • Human adipophilin is a protein of around 50 kDa (437 amino acids) which is defined as a marker for lipid accumulation in cells. It was first called ADRP (for adipose differentiation-related protein) because its counterpart in mice was isolated from adipocytes in 1992 by Jiang et al. (Jiang and Serrera, 1992). Indeed, its messenger RNA is over-expressed during the differentiation of adipocytes. It has therefore been mainly described in adipocytes.
  • adipophilin has 83.5% identity with mouse ADRP, as well as 12 additional amino acids (Heid et al., 1998).
  • the N-terminal region of adipophilin has homologies with other proteins such as perilipins A / B and TIP47 (Londos et al., 1999). They form a family of proteins associating with lipid particles.
  • Adipophilin, TIP47 and perilipins co-localize in the lipid droplets (Miura et al., 2002). The binding of these proteins is hydrophobic (Wolins et al., 2001).
  • Adipophilin does not have an N-terminal signal sequence and does not appear to be glycosylated, but the presence of two forms having an isoelectric point of 7.0 and 7.2 suggests post-translational modifications. It would fix fatty acids thus increasing its hydrophobicity and its ability to fix lipid particles. Finally, the microsomal form of adipophilin is approximately 5 kDa smaller than the form associated with lipid particles (Heid et al., 1996; Mather, 2000). Adipophilin and perilipins cover the surface of the droplets to protect lipids from hydrolysis by lipases (Brasaemle et al., 2000; Shen et al., 1999; van Meer, 2001).
  • adipophilin is not detected in cells that express perilipins.
  • Adipophilin is found on the surface of small lipid droplets of preadipocytes and adipocytes during differentiation but is absent from adipocytes at the end of maturation.
  • perilipins are absent at the start of adipocyte differentiation, but are found on small and large droplets at the end of maturation ((Brasaemle et al., 1997).
  • the distribution of perilipins is strictly limited to adipocytes and steroid cells, this transition is not observed in other cell types.
  • Adipophilin although present in smaller quantities than in adipose tissue, has been detected in many cell lines in culture (epithelial, endothelial, hepatic cells HepG2, fibroblasts, monocytes, macrophages) and tissues (liver, testes, lung, kidney, heart, mammary epithelium, adrenal cortex) where it is associated with lipid particles (Brasaemle et al., 1997; Heid et al., 1998).
  • adipophilin is one of the rare proteins associated with lipid particles identified in cells capable of storing lipids. It could be involved in the formation and stabilization of lipid droplets. Adipophilin has thus been shown to promote the uptake of long carbon chain fatty acids in COS-7 cells and that these fatty acids stimulate the expression of its messenger RNA in adipocyte precursors (Gao and Serrera, 1999; Gao et al., 2000; Serrera et al., 2000).
  • adipophilin is induced in macrophagic foam cells (Wang et al., 1999).
  • its messenger RNA is strongly expressed at the level of the atheroma plaque in regions enriched in macrophages and modified low density lipoproteins (LDL) (Shiffman et al., 2000; Wang et al., 1999).
  • LDL low density lipoproteins
  • oxidized LDLox or acetylated LDLac induce both the expression of adipophilin and the transformation of macrophages into foam cells.
  • PPAR ⁇ peroxisome proliferator-activated receptor ⁇
  • PPAR ⁇ and ⁇ induce, for example, the expression of “scavengers” receptors at the level of macrophages, which facilitates the fixation of modified LDLs which are then taken up in excess by macrophages.
  • PPAR ⁇ is specifically involved in the accumulation of lipids in human macrophages and THP-1 cells (cells derived from a line of human monocytes) as well as in the control expression of adipophilin (Patel et al., 2002; Vosper et al., 2001).
  • adipophilin In macrophages that have not accumulated lipids, adipophilin is present in small quantities. Adipophilin is upregulated during lipid accumulation and negatively during lipolysis. The expression of adipophilin is therefore linked to the metabolism of lipid particles which is regulated by the activity of protein kinase C (PKC) (Chen et al., 2001).
  • PKC protein kinase C
  • PMA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate
  • calphostin C n have no effect on the distribution of ADRP on the surface of lipid droplets (Chen et al., 2002; Fong et al., 2002).
  • cyclooxygenase inhibitors are also activators of PPAR ⁇ . It may therefore be that the observed effect is not direct, but modulated by PPAR ⁇ or that the inhibitors act at the transcriptional level. Since other PPAR ⁇ agonists are not good stimulators of ADRP expression and no element of response to PPAR (PPRE) could be identified on the ADRP promoter or adipophilin, PPAR ⁇ does not seem to be involved. The mechanism therefore remains to be elucidated.
  • adipophilin The regulation of the gene encoding adipophilin was further studied in 1999 by Wang et al. They noted that the amount of adipophilin mRNA was increased in macrophages stimulated by oxidized LDL, but not by native LDL, suggesting a potential role of this protein in the formation of foam cells and in atherogenesis. . They also showed that pro-inflammatory factors did not induce the expression of adipophilin. Once again, the authors suggest an indirect role for LDLox, the overexpression of adipophilin may be the consequence of stimulation of PPAR ⁇ . In this article, the authors expand on the regulation of adipophilin by LDLox and its localization at the level of the atheroma plaque but do not study its function in macrophages.
  • Vosper et al. show that compound F (PPAR ⁇ agonist) induces the expression of receptors scavengers SR-A and CD36 (involved in the uptake of lipids) and negatively regulates genes such as apoE and cyp27 (involved in lipid efflux), which contributes to the accumulation of lipids.
  • the treatment of macrophages with compound F or the overexpression of PPAR ⁇ also induces opposite effects on another lipid efflux pathway (independent of apoE and cyp27) by stimulating the expression of ABCAl (involved in the efflux of cholesterol dependent on apoA-1).
  • ApoA-l is synthesized in the liver and intestine. It is mainly found in HDL (High Density Lipoprotein) but also in small quantities in chylomicrons (Least dense Lipoproteins) and VLDL (Very Low Density Lipoprotein). ApoA-1 promotes the efflux of membrane cholesterol, but is also involved in maintaining the structure of HDL and in the activation of Lecithin Cholesterol Acyltransferase (LCAT). LCAT is found in HDL and realizes, in plasma, the esterification of free cholesterol into cholesterol esters, participating in the maturation of HDL.
  • LCAT Lecithin Cholesterol Acyltransferase
  • Acyl CoA cholesterol acyltransferase (ACAT) inhibitors prevent the re-esterification of cholesterol in the endoplasmic reticulum and therefore the deposition of lipids in lipid droplets. Indeed, after their uptake, the components of the modified LDL, including the cholesterol esters, are hydrolyzed in the lysosomes. The free cholesterol is then transferred to the endoplasmic reticulum where it is re-esterified into a cholesterol ester by ACAT and then accumulates in the cytosol where it forms the lipid droplets ( Figure 1, (Brown and Goldstein, 1983).
  • ACAT cholesterol acyltransferase
  • FIG. 1 represents the flow of cholesterol at the macrophage level and the techniques used to modulate the activity of adipophilin at the level of the THP-1 macrophage cells.
  • the inventors therefore transiently transfected macrophages with a plasmid overexpressing adipophilin.
  • the results surprisingly show that if one acts selectively on adipophilin, the efflux of cholesterol dependent on apoA-1 is significantly reduced.
  • This result can be explained by the fact that the quantity of adipophilin present in the cells is directly modulated while the agonists of PPAR ⁇ act on many other genes involved at the same time in absorption, transport, metabolism and l efflux of lipids.
  • the article de Vosper et al. indicates that compound F increases the expression of adipophilin, none of their experiments demonstrates the implication of this protein in the retention or efflux of cholesterol.
  • the present invention is therefore based on the observation of the role of adipophilin in the modulation of the cholesterol efflux.
  • the present invention thus demonstrates for the first time a modulation of the efflux of cholesterol by adipophilin.
  • the present invention thus provides new targets and new approaches for the search for compounds capable of regulating the efflux of lipids, and in particular the efflux of cholesterol (reverse transport of cholesterol).
  • the invention also provides methods for increasing the reverse transport of cholesterol based on the use of compounds which decrease or even inhibit the activity of adipophilin.
  • the invention also provides screening methods intended to identify therapeutic substances capable of modulating the efflux of cholesterol, in particular modulating the reverse transport of cholesterol, by determining in vitro or ex vivo the capacity of the substances tested to modulate the activity. adipophilin.
  • the present invention relates in particular to a method of selection, identification or characterization of compounds capable of modulating the efflux of cholesterol, in particular the efflux of cholesterol dependent on apoA-1, comprising contacting a test compound with adipophilin and determining the ability of said test compound to modify the activity of adipophilin.
  • bringing the test compound into contact with adipophilin consists in bringing the test compound into contact with a foam cell or a natural or synthetic membrane preparation expressing adipophilin.
  • the invention further relates to a method for producing an active compound, in particular a compound capable of modulating the flow of cholesterol, and potentially active on the vascular system, comprising:
  • Reverse cholesterol transport is a process that allows excess cellular cholesterol to exit into peripheral tissue. This is then esterified to be incorporated into HDL, which can then transfer it to low and very low density lipoproteins which will transport it to the liver where it will be eliminated or recycled. This process contributes to the maintenance of cellular cholesterol homeostasis.
  • the efflux of cholesterol can be defined as the exit of free cholesterol molecules from inside the cell to the outside through the plasma membrane , either by passive diffusion thanks to a concentration gradient between the plasma membrane and acceptor particles containing phospholipids (for example, HDL), or by a second route involving lipoproteins poor in lipids (pre ⁇ 1-HDL) and rich in apoA- l or finally by a route involving the SR-BI scavenger receptor.
  • another efflux pathway results from the hydroxylation of sterols by sterol 27-hydroxylase and is dependent on the endogenous expression of apoE.
  • Sterol 27-hydroxylase converts cholesterol to 27-hydroxycholesterol and to 3 ⁇ -hydroxy-5-cholestenoic acid. In the absence of cholesterol acceptors in the medium, these oxysterols cross the lipophilic membranes faster than free cholesterol and are transported to the liver to be converted into bile acids (Babiker et al., 1997).
  • Passive scattering does not necessarily require contact between the cell and an acceptor particle, but can be modulated by the size and composition of the acceptor HDLs. Passive efflux can be increased by LCAT activity which maintains a cholesterol gradient between the cell surface and the acceptor particles.
  • the SR-BI dependent efflux allows passive diffusion of cholesterol towards HDL but would be limited to regions of the plasma membrane rich in cholesterol. Thus, when the cells placed in the presence of LDLac are loaded with cholesterol via the scavenger SR-A receptor, the intracellular cholesterol pool is not accessible to SR-BI.
  • SR-BI The activity of ABCAl is inhibited by SR-BI which facilitates the return of cholesterol from nascent HDL to the cell.
  • This competitive role of SR-BI would allow the maintenance of a minimal level of cholesterol in the plasma membranes when ABCA1 is active.
  • macrophages loaded with cholesterol overexpress ABCA1 which leads to an increase in the efflux of cholesterol.
  • the expression of ABCAl in THP-1 macrophages can be stimulated by activators of the nuclear receptors PPAR ⁇ and ⁇ as well as by oxysterols.
  • SR-BI would stimulate the efflux of cholesterol towards HDL (Chen et al., 2000).
  • SR-BI is involved in the bidirectional flow of free cholesterol between cells and lipoproteins as a function of a concentration gradient, selectively pumps cholesterol esters from HDL, increases the cellular content of free cholesterol and acts on the membrane distribution of cholesterol pools (Bultel-Br Jardin et al., 2002; de la Llera-Moya et al., 1999; Jian et al., 1998).
  • the invention therefore relates to methods for identifying, selecting or characterizing biologically active compounds, in particular compounds active on the vascular system, said methods being based on the modulation of the activity of adipophilin and / or of the cholesterol flow to through cells or preparations membrane.
  • the methods of the invention can include in vitro binding tests, binding tests in the cellular system (or on membrane preparations, natural or synthetic) or functional tests in the cellular or artificial system.
  • the present invention relates to a method for selecting, identifying or characterizing compounds capable of modulating the flow of cholesterol comprising bringing into contact, optionally in the presence of cholesterol, in vitro or ex vivo, a test compound with a foam cell or a natural or synthetic membrane preparation expressing adipophilin, and the demonstration of a modulation of the activity of said adipophilin.
  • a particular method of selection, identification or characterization of compounds capable of modulating the flow of cholesterol comprises demonstrating a modulation of the activity of adipophilin, possibly in the presence of cholesterol, via the demonstration of a modulation of the cholesterol flow through a cell or membrane preparation expressing said adipophilin.
  • the determination of the modulation of adipophilin activity can be carried out by measuring the activity of adipophilin and comparing the activity with that obtained in the absence of test compound.
  • the demonstration of a modulation of the activity of adipophilin is preferably accomplished via the demonstration of the binding of the test compound to adipophilin.
  • adipophilin is meant, in the context of the present invention, the complete protein or a fragment thereof, in particular a fragment retaining the capacity for association with lipids, in particular the capacity for binding to cholesterol.
  • the compounds identified, selected or characterized according to the methods of the invention are compounds modulating the efflux of cholesterol, in particular at the level of macrophages or foam cells.
  • the cholesterol efflux corresponds more specifically to that dependent on apoA-1 as defined above.
  • the binding of the test compound can be demonstrated in different ways, such as for example by gel migration or electrophoresis of the complexes formed. Other methods based on luminescence or using the FRET technique (Fluorescence Resonance Energy Transfer) well known to those skilled in the art or the SPA technique (“Scintillation Proximity Assay”), can be implemented, within the framework of the present invention, to determine the possible binding of the test compound to adipophilin.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • SPA Scintillation Proximity Assay
  • the binding of the test compound to adipophilin can also be demonstrated for example by using a labeled test compound, a ligand labeled with adipophilin or a labeled antibody specific for a synthetic enzyme or for a transporter thereof. , displacement of the binding of the labeled ligand reflecting the binding of the test compound.
  • the labeled ligand can be any product binding the target molecule (antibody, agonist or antagonist, fragment or derivative of an endogenous ligand, etc.).
  • the ligand can be labeled by any technique known to those skilled in the art, in particular by incorporating a radioactive, fluorescent, luminescent, enzymatic, colorimetric element, etc.
  • the demonstration of the binding of the test compound to adipophilin is carried out in the presence of a ligand labeled with adipophilin by determining the displacement of the binding of the labeled ligand.
  • the ligand is a labeled antibody, specific for the molecular target considered.
  • the antibody can be polyclonal or monoclonal. It can also be a fragment or an antibody derivative, such as for example Fab, F (ab ') 2 , CDR fragments, etc.
  • Antibodies can be produced in a conventional manner, by immunization against the molecular target (or an immunogenic part thereof), and recovery of serum (polyclonal) or of spleen cells (to make hybridomas by fusion with an appropriate line), as described for example in Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis et al., 1971) or in Harlow et al. (Harlow and Lane, 1988).
  • the Fab or F (ab ') 2 fragments can be produced for example according to Riechmann et al. (Riechmann et al., 1988).
  • the adipophilin ligand is an endogenous ligand, a labeled agonist or antagonist.
  • marked cholesterol in particular radiolabelled, in particular tritiated, is used.
  • the method therefore comprises bringing a test compound into contact with a cell (or a natural or synthetic membrane preparation) expressing adipophilin and demonstrating a bond of the test compound to said adipophilin.
  • the method comprises bringing a test compound into contact with a cell (or a natural or synthetic membrane preparation) expressing adipophilin, in the presence of a labeled ligand of said adipophilin, and setting up evidence of binding of the test compound by determining the displacement of the binding of the labeled ligand.
  • Demonstration of this effect can be carried out by any appropriate means, such as measuring the expression of a reporter gene, measuring the membrane expression of adipophilin, measuring total cholesterol ( free and esterified) and triglycerides, ions or an electric current, etc.
  • the invention comprises a method of selection, identification or characterization of compounds comprising bringing into contact, optionally in the presence of cholesterol, in vitro or ex vivo, a test compound with a foam cell or a membrane preparation natural or synthetic expressing adipophilin, measuring the flow of said cholesterol through said cell or membrane preparation and comparing the measured flow to that obtained in the absence of test compound.
  • the cells used in the tests can be any cell expressing a target molecule involved in the activity of adipophilin, in particular adipophilin. They can be cells naturally expressing this molecule, or cells genetically modified or treated to overexpress said molecule. It is, in a preferred embodiment of the invention, endothelial cells, endothelial cells HUVEC, epithelial cells, hepatic HepG2, fibroblasts, monocytes, mammalian macrophages. Even more preferably, these cells are human cells. It can also be primary cultures or established lines (THP-1 cells differentiated into macrophages by PMA).
  • prokaryotic cells bacteria
  • yeast cells Sacharomyces, Kluyveromyces, etc.
  • These cells can be isolated, cultured and characterized according to known techniques, in particular those described in the examples.
  • a membrane preparation expressing adipophilin is used.
  • the membrane preparation can advantageously be of natural origin, that is to say produced from a cell expressing adipophilin.
  • Membrane preparations can be produced by mechanical, chemical, physical, electrical lysis, etc., and in particular by treatment with detergents, ultrasound, freezing / thawing, etc.
  • This membrane preparation is essentially characterized by the presence of membrane fragments, comprising a lipid bilayer in which all or part of the adipophilin is present.
  • These membrane preparations are generally devoid of intact cells. In addition, they can be enriched in membrane debris by appropriate treatments (centrifugation, etc.). It is also possible to use a membrane preparation of synthetic origin, such as for example a liposome into which all or part of the adipophilin has been introduced, or a supported membrane.
  • the compounds can be brought into contact with the cells (or membrane preparations) at different times, according to their effect (s), their concentration or the nature of the cells. and for various periods, which can be adjusted by a person skilled in the art.
  • the test can be carried out on any suitable support and in particular on a plate, a blade, a box, in a tube or a flange.
  • the contacting is carried out in a multi-well plate, which makes it possible to conduct, in parallel, numerous and varied tests.
  • the typical supports one finds microtitration plates and more particularly 96 or 384 well plates (or more), easy to handle.
  • variable amounts of cells can be used when implementing the methods described.
  • 10 2 to 2 * 10 6 cells are brought into contact with a type of test compound, in an appropriate culture medium, and preferably between 10 3 and 10 5 cells.
  • a membrane preparation When a membrane preparation is used, generally 0.01 to 50 mg of protein is applied per test, more preferably 0.05 to 2 mg of protein per test.
  • the tests can be carried out in any type of environment suitable, such as saline solutions, swabs, etc. Mention may in particular be made of Tris, Pipes, Hepes buffers, etc.
  • the temperature is typically close to room temperature.
  • the pH of the medium is advantageously between 5.5 and 8, more preferably between 7 and 8. It is understood that these parameters can be adjusted by a person skilled in the art, according to the indications provided in the examples.
  • test compound can also be adjusted by the user according to the type of compound (its toxicity, its cell penetration capacity, etc.), the length of the incubation period, etc. Generally, cells (or membranes) are exposed to amounts of test compounds which vary from 1 nM to 1 mM. It is of course possible to test other concentrations without deviating from the present invention. Each compound can, moreover, be tested, in parallel, at different concentrations and over different periods. Furthermore, adjuvants and / or vectors and / or products facilitating the penetration of the compounds into cells such as liposomes, cationic lipids, polymers, peptides derived from viruses, etc., can also be used, if necessary. Contact can be maintained for a period of between 1 hour and several hours (72 hours). In the case of transfection, contact is typically maintained from 4 hours to 48 hours. In the case of an infection, contact is typically maintained from 4 hours to 24 hours.
  • test compound can be any product which is in an isolated form or in admixture with other products.
  • the compound may be defined in terms of structure and / or composition or may not be defined.
  • the compound can, for example, be an isolated and structurally defined product, an isolated product of indefinite structure, a mixture of known and characterized products or an indefinite composition comprising one or more products.
  • indefinite compositions can be, for example, tissue samples, biological fluids, cell supernatants, plant preparations, etc.
  • test compounds capable of modulating the activity of adipophilin according to the invention can be of varied nature and origin.
  • the test compounds can be inorganic or organic products and in particular a polypeptide (or a protein or a peptide), a nucleic acid, more particularly an antisense nucleic acid or an RNAi (RNA interference), a lipid, a polysaccharide, a chemical or biological compound such as a nuclear factor, a cofactor or any mixture or derivative thereof.
  • the compound can be of natural or synthetic origin and include a combinatorial library, a clone or a library of nucleic acid clones expressing one or more DNA-binding polypeptide (s), etc.
  • RNAi type compounds have been identified and synthesized.
  • RNAi and the use of siRNAs (small RNA interference or small RNA interference) in mammalian cells are described in particular in the publication by Brummelkamp et al. (Brummelkamp et al., 2002).
  • RNAi of the present invention are adipophilin specific RNAi. They inhibit the activity, in particular the expression, of adipophilin by binding to a target sequence of the mRNA of adipophilin. This target sequence can be located in the coding regions or not of the adipophilin mRNA, the non-coding regions can be located for example in 5 ′ or 3 ′ UTR sequences.
  • the RNAi of the present invention are more specifically siRNA and are advantageously used in double-stranded form (antisense matrix and sense matrix).
  • the present invention therefore further relates to RNA interference from adipophilin.
  • the interference RNAs are constructed from the target sequences on the adipophilin mRNA, said target sequences on the adipophilin mRNA are chosen from the following sequences:
  • the siRNAs comprise an antisense matrix and a sense matrix, said antisense matrix comprising at least one sequence chosen from the sequences SEQ ID 1, 2, 3 and 4.
  • the antisense matrices and the sense matrices of siRNAs comprise at least 21 bases, preferably have a length of 29 bases.
  • the siRNAs are chosen from the RNAs of the following sequences:
  • AAAAGGCGTCTTCACTGCTTTCCTGTCTC -3 "(SEQ ID 11) Meaning matrix:
  • siRNAs of the present invention which inhibit the expression of adipophilin modulate, and in particular increase, the efflux of cholesterol.
  • they can be used as a medicament, in particular for the preventive or curative treatment of atherosclerosis, hypercholesterolemia or cholesterol overload of macrophages. They can also preventively or curatively treat myocardial infarction, cerebral ischemia, cardiovascular diseases or pathologies of peripheral vascularization.
  • another subject of the invention therefore relates to a process for the production of an active compound, in particular a compound capable of modulating the flow of cholesterol, and potentially active on the vascular system, comprising: - the determination of the ability of a compound to modulate the activity of adipophilin, in particular to modulate the expression of adipophilin, in vitro or ex vivo, and
  • the invention also comprises a method for producing a medicament comprising a compound modulating the flow of cholesterol through foam cells expressing adipophilin, comprising:
  • Another subject of the invention relates to a process for producing a compound which modulates the cholesterol flow, comprising: - bringing a compound into contact with a cell or a cell membrane expressing adipophilin,
  • Another subject of the invention relates to a method for producing a medicament comprising an active compound, in particular on the vascular system, comprising: - determining the ability of a compound to modulate the flow of cholesterol through foam cells or natural or synthetic membrane preparations expressing adipophilin in vitro or ex vivo, and
  • adipophilin RNAi defined above were produced according to the methods defined above.
  • structural analog designates any molecule obtained by molecular modeling or structural variation from a test compound.
  • test compound preferentially measured is the ability of said compound to modulate the activity (i.e., action or expression) of adipophilin.
  • a particularly advantageous use of a compound modulating the activity of adipophilin consists in preparing a medicament intended to modulate the flow of cholesterol and the cholesterol concentration of the foam cells.
  • the compound decreases the activity of adipophilin to increase the efflux of cholesterol and decrease the cholesterol concentration of the foam cells.
  • the drug thus prepared is intended to limit the accumulation of lipids and / or the formation of foam cells and thus to treat atherosclerosis by limiting the formation of atheroma plaque.
  • the compound modulating the activity of adipophilin is advantageously chosen from an siRNA as defined above.
  • the compounds, compositions or medicaments according to the invention can be administered in different ways and in different forms.
  • they can be injected by the systemic or oral route, preferably systemic, such as for example by the intravenous, intramuscular, subcutaneous, trans-dermal, intra-arterial, intra-cerebral, intra-peritoneal, intra-cerebrovascular route. , etc.
  • the Compounds are usually packaged as liquid suspensions, which can be injected using syringes or infusions, for example.
  • the compounds are generally dissolved in saline, physiological, isotonic, buffered solutions, etc., compatible with pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
  • compositions can contain one or more agents or vehicles chosen from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Agents or vehicles which can be used in liquid and / or injectable formulations are in particular methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, vegetable oils, acacia, etc.
  • the compounds can also be administered in the form of gels, oils, tablets, suppositories, powders, capsules, capsules, etc., optionally by means of dosage forms or of devices ensuring sustained and / or delayed release.
  • an agent such as cellulose, carbonates or starches is advantageously used.
  • the preferred doses for achieving a decrease in atherosclerosis in animals are doses less than 50 mg / kg. A significant effect is advantageously obtained in animals at doses between 100 and 200 mg / kg
  • the invention also includes tools and kits for implementing these methods.
  • Figure 1 Cholesterol flow at the macrophage level and techniques used to modulate the activity of adipophilin at the level of THP-1 macrophage cells.
  • ACAT acyl CoA: cholesterol acyltransferase; CL, Free Cholesterol; EC,
  • Figure 4 Kinetics of the efflux of ApoA-1 dependent cholesterol in THP-1 macrophages after transfection, expression of the vector pCI-adipophilin then loading with the acetylated LDL tritiated for 48 h (C: control without ApoA-
  • Figure 6 Accumulation of triglycerides and cholesterol in THP-1 macrophages infected with control adenoviruses (ad-CMV-GFP) or overexpressing adipophilin (ad-CMV-adipophilin), after loading with acetylated LDL for 48 hours.
  • ad-CMV-GFP control adenoviruses
  • ad-CMV-adipophilin overexpressing adipophilin
  • Figure 7 Kinetics of cholesterol efflux dependent on ApoA-1 or HDL in THP-1 macrophages after infection, expression of adenoviruses then loading with tritiated acetylated LDL for 48 h.
  • FIG 8 Analysis by Western Blot of the inhibition of the expression of adipophilin by siRNA3-adipophilin (siRNA-adip) (transfection of macrophages THP-1 with jetSI) in the presence or absence of acetylated LDL.
  • Figure 9 Accumulation of triglycerides and cholesterol in macrophages
  • Figure 10 Kinetics of ApoA-1 dependent cholesterol efflux in THP-1 macrophages after transfection with siRNA, inhibition of adipophilin expression then loading with acetylated tritiated LDL for 48 h.
  • the macrophages used come from a continuous line (THP-1) of human monocytes.
  • the base medium corresponds to RPMI 1640 medium (Gibco) containing, 4 mM L-glutamine, 20 IU / ml of penicillin and 20 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • the cells in suspension multiply at 37 ° C in 5% CO 2 in base medium containing 10% of decomplemented fetal calf serum (complete medium).
  • the differentiation of monocytes into macrophage is obtained by depositing 2.10 6 cells / well (6-well dishes) in complete medium in the presence of 1.6.10 7 M of PMA (Phorbol 12-Myristate 13-acetate) for 72 hours.
  • the differentiated THP-1s adhere to the support.
  • Macrophages (0.7.10 e to 2.10 6 cells / well, 6-well dishes) are transiently transfected with 1 to 3 ⁇ g of plasmid using Effectene TM (Qiagen) or jetPEI TM -Man (Qbiogene) and / or per 2 to 3 ⁇ g of siRNA using jetSI TM
  • SiRNA design selection of targets on mRNA
  • Each AA dinucleotide sequence is scanned along the adipophilin mRNA (coding and non-coding regions). The next 19 nucleotides, adjacent to these two AA nucleotides, are selected as potential targets. Over a hundred sequences were selected, then compared (notably using www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) with human genome banks. All the target sequences, selected on the adipophilin mRNA, having significant homology with other coding sequences or a percentage of GC nucleotides not between 35 and 60% were eliminated.
  • siRNAs are produced with the “Silencer TM siRNA Construction Kit” (Ambion) according to the supplier's instructions.
  • Protein extraction and Western Blot analysis Total proteins are extracted from cells grown in 35 mm dishes. The cells are washed three times with PBS (phosphate buffered saline), lysed (Triton X100 1%, Deoxycholate 0.5%, 10 mM Na pyruvate phosphate, 2 mM Na vanadate, NaF 100 mM, Aprotinin, PMSF 0.5 mM, ICN inhibitor, PBS) and then centrifuged for 30 min at 10,000 g, 4 ° C. The protein concentration is determined by Peterson's method (Peterson, 1977).
  • the samples (20 ⁇ g of protein) are separated by SDS-PAGE (10% acrylamide) according to the Laemmli method ((Laemmli, 1970)), using the Mini Protean 3 tank system (Bio-Rad).
  • the proteins are then transferred to a nitrocellulose membrane by electrotransfer (10 mA / cm 2 ) (Amersham).
  • the membranes are saturated in basic buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20) containing 5% milk for 1 h at room temperature. They are incubated with a first antibody directed against the protein of interest, washed again with basic buffer and then incubated with a second antibody directed against the first antibody.
  • RNA samples were extracted according to the indications in the RNeasy Mini or Midi kits (Qiagen).
  • the RNA samples (15 ⁇ g / well) migrated 3 h at 100 V through a 1% formaldehyde-agarose gel and then were transferred to a nylon membrane (Pall Gelman Sciences).
  • the DNA probes were labeled with [ ⁇ - 32 P] dCTP (3000 Ci / mmol, EASYTIDES TM, PerkinElmer Life Sciences) using the random-priming DNA labeling kit (Boehringer, Mannheim).
  • the pre-hybridization, the hybridization and the washings were carried out according to the conditions described above (Tontonoz et al., 1994).
  • the dried membranes were then exposed on autoradiographic films (Kodak Biomax) at -80 ° C, the signal being quantified by densitometric analysis.
  • LDL density 1, 03-1, 063
  • the isolation of LDL was carried out from human plasmas by sequential ultracentrifugation as described previously (Havel et al., 1955).
  • the isolated LDLs were sterilized by membrane filtration (0.22 ⁇ m) and stored at 4 ° C in phosphate buffered saline containing 10 mM ethylenediaminetetraacetate disodium dihydrate (PBS-EDTA).
  • LDL LDL has been chemically modified at the protein level by acetic anhydride. This compound reacts on lysine residues to form an amide bond. Acetylation increases the load of LDL.
  • the acetylated LDLs were dialyzed for 24 hours, changing the medium regularly against PBS-EDTA. They were then filtered on a membrane (0.22 ⁇ m). The protein concentration was determined by the Peterson method (Peterson, 1977).
  • the LDLacs were labeled with 3 H by incubating 33.3 ⁇ Ci (per mg of LDLac proteins) of tritiated free cholesterol (1 ⁇ , 2 ⁇ (n) - [ 3 H] cholesterol, Amersham) in the presence of ethanol, for 24 h at 37 ° C.
  • the amounts of total and free cholesterol were measured according to the conditions of the FC-test kit (Wako Pure Chemicals).
  • the amount of esterified cholesterol was determined by calculating the difference between total cholesterol and free cholesterol.
  • the amount of triglycerides was measured according to the conditions of the PAP 1000 Triglycerides kit (Biomérieux).
  • the concentration of proteins extracted from the cells was determined by the method of Lowry (Lowry et al., 1951).
  • the assay results show a 40% increase for triglycerides and a 15% increase for total cholesterol in transfected cells overexpressing adipophilin compared to cells transfected with the empty pCI vector.
  • the assay results show a 40% increase in both triglycerides and esterified cholesterol as well as a 60% decrease in free cholesterol in infected cells overexpressing adipophilin compared to cells infected with the ad-CMV vector. - GFP. It has also been studied the effect of overexpression of adipophilin on the efflux of cholesterol dependent on ApoA-1 and HDL on the macrophages in culture (FIG. 7). The results obtained with the ad-CMV-adipophilin adenovirus are similar to those obtained with the expression vector pCI-adipophilin.
  • Adipose differentiation-related protein is an ubiquitously expressed lipid storage droplet-associated protein. J Lipid Res 38, 2249-2263.
  • Perilipin A increases triacylglycerol storage by decreasing the rate of triacylglycerol hydrolysis. J Biol Chem 275, 38486-38493.
  • Adipophilin is a sensitive marker for lipid loading in human blood monocytes.
  • Lipid free apolipoprotein E binds to the class B Type I scavenger receptor I (SR-BI) and enhances cholesteryl ester uptake from lipoproteins. J Biol Chem 277, 36092-36099.
  • SR-BI Type I scavenger receptor I
  • Scavenger receptor- Bl inhibits ATP-binding cassette transporter 1- mediated efflux cholesterol in macrophages. J Biol Chem 275, 30794-30800. 11 de la LIera-Moya, M., Rothblat, GH, Connelly, MA, Kellner-Weibel, G., Sakr, SW, Phillips, M. C, and Williams, DL (1999). Scavenger receptor Bl (SR-BI) mediates free cholesterol flux independently of HDL tethering to the cell surface. J Lipid Res 40, 575-580. 12 Fong, TH, Yang, C. C, Greenberg, AS, and Wang, SM (2002). Immunocytochemical studies on lipid droplet-surface proteins in adrenal cells. J Cell Biochem 86, 432-439.
  • ADRP Adipose differentiation related protein
  • ADRP adipose differentiation related protein
  • Hormone-sensitive lipase is responsible for the neutral cholesterol ester hydrolase activity in macrophages. FEBS Lett 247, 205-208.

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Abstract

L'invention décrit des méthodes de sélection, identification ou caractérisation de composés capables de moduler le flux de cholestérol comprenant la détermination d'une modulation de l'activité de l'adipophiline. Elle concerne également des procédés de prépar ations de médicaments.

Description

METHODES DE CRIBLAGE DE COMPOSES
MODULANT LE FLUX DE CHOLESTEROL ET UTILISATIONS.
La présente invention se rapporte à des méthodes pour identifier, sélectionner ou caractériser des composés biologiquement actifs, notamment des composés actifs sur le système vasculaire, lesdites méthodes étant basées sur la modulation de l'activité de l'adipophiline à travers des cellules ou préparations membranaires. Les méthodes de l'invention peuvent comprendre des tests de liaison in vitro, des tests de liaison en système cellulaire (ou sur des préparations membranaires naturelles ou synthétiques) ou des tests fonctionnels en système cellulaire ou artificiel. Elle concerne en particulier une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés capables de moduler le flux de cholestérol comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, et la mise en évidence d'une modulation de l'activité de ladite adipophiline. Elle concerne également les utilisations des composés ainsi sélectionnés, identifiés ou caractérisés.
L'athérosclérose est une maladie multifactorielle des vaisseaux, d'évolution lente, au cours de laquelle de nombreux facteurs de risque génétiques et/ou environnementaux agissent pour favoriser le développement des lésions. Elle correspond à une réaction inflammatoire chronique de la paroi artérielle, transformée en événement clinique aigu à l'occasion de la rupture d'une plaque d'athérome et de la formation d'un thrombus occlusif. L'athérosclérose est une cause majeure de morbidité, de mortalité, d'infarctus du myocarde, d'ischémie cérébrale, de maladies cardiovasculaires et de la vascularisation périphérique. L'hypercholestérolémie et la surcharge en cholestérol des macrophages, impliquée dans l'inflammation vasculaire, sont des facteurs majeurs qui contribuent à l'athérosclérose. L'hypercholestérolémie est actuellement traitée grâce à la combinaison d'un régime alimentaire et d'une intervention médicamenteuse avec, par exemple, des agents séquestrant les acides biliaires ou les statines. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est cependant nécessaire pour pallier aux limites des thérapies existantes.
Le transport inverse du cholestérol, mis en œuvre par les HDLs (« High Density Lipoproteins » ou Lipoprotéines de Haute Densité), permet de décharger le cholestérol qui s'accumule dans les tissus périphériques et assure son élimination métabolique via le foie. Il contribue ainsi à la protection de l'organisme contre l'athérosclérose. L'apolipoprotéine A-l est un constituant fondamental des HDL, responsable de leur efficacité. A cet égard, l'augmentation de l'expression de l'apoA-l a un effet protecteur contre l'athérosclérose.
L'athérosclérose est initiée par une infiltration, à travers l'endothélium, des LDL (« Low Density Lipoproteins » ou Lipoprotéines de Basse Densité). Les particules de LDL se lient aux glycosaminoglycanes et, une fois piégées dans la matrice extracellulaire du sous endothelium, s'accumulent dans certains sites de prédilection. Dans ce micro-environnement pariétal, les particules commencent à subir des modifications oxydatives. On observe également une infiltration massive par les monocytes circulants de l'intima de l'artère à laquelle ils adhèrent au niveau de la matrice extracellulaire. Ils se différencient ensuite en macrophages matures. Ces cellules, grâce à des récepteurs spécifiques (récepteurs « scavengers ») captent et dégradent les LDL modifiées accumulées dans l'espace intimai de l'artère.
Les macrophages sont présents à tous les stades de l'athérogénèse. Leur participation est prédominante dans le processus athéromateux (par opposition à la sclérose) puisqu'ils participent à la constitution du noyau lipido-nécrotique, déterminant pour la vulnérabilité de la plaque. L'importance de l'infiltration macrophagique semble en effet directement corrélée à l'instabilité et à la fragilité de la plaque. Les fonctions des macrophages sont multiples : présentation d'antigènes aux lymphocytes T, épuration de débris et de matériaux toxiques, sécrétion d'une extraordinaire variété d'enzymes, de cytokines et de facteurs de croissance.
Dans les modèles animaux, les macrophages sont en première ligne en cas "d'agression lipidique". La première réponse artérielle à une hypercholestérolémie diététique, observée en quelques jours, est une adhérence massive des monocytes sanguins à l'endothélium. Les monocytes assurent normalement un nettoyage régulier de l'intima. Devenus macrophages "éboueurs", ils débarrassent la zone sous- endothéliale des débris moléculaires (notamment lipoprotéiques) et retournent éventuellement dans le sang pour être captés par la rate, les ganglions ou le foie. Si la charge d'épuration qui leur est imposée devient excessive, ils s'accumulent, se transforment en macrophages spumeux, précurseurs de plaques d'athérome. En effet, les macrophages et les cellules spumeuses piégés dans l'intima sont des cellules actives sécrétant de multiples substances qui modifient les composantes cellulaires et extracellulaires de la paroi. C'est ainsi qu'un phénomène physiologique d'épuration se transforme en un processus pathologique local. La participation des monocytes-macrophages au développement de l'athérosclérose se décompose en trois grandes étapes : (a) pénétration et activation dans l'intima, (b) interactions avec les cellules musculaires lisses et les lymphocytes T, et (c) transformation en cellules spumeuses.
Les cellules endothéliales (CE) activées produisent des chimio-attractants qui recrutent les monocytes circulant, migrant par diapédèse entre les jonctions endothéliales. Les principaux facteurs chimiotactiques pour les monocytes sont: le "Monocyte Chemotactic Peptide-1" (MCP-1), les "Colony Stimulating Factors" (CSFs), le "Transforming Growth Factor-β" (TGF-β), et les LDL oxydées. Ces dernières induisent notamment la synthèse, par l'endothélium, de glycoproteines d'adhésion comme Plntercellular Adhésion Molecule-1 " (ICAM) ou la "Vascular Cell Adhésion Molecule-1 " (VCAM-1 ) qui provoquent l'adhérence des monocytes et sont abondamment exprimées dans les plaques athéroscléreuses humaines. L'expression par les cellules endothéliales de ces molécules d'adhésion est augmentée par des cytokines (IL-1 et TNF-α).
L'activation des monocytes exposés aux lipoprotéines modifiées, aux cytokines, aux molécules chimio-attractantes et aux facteurs de croissance, suit leur pénétration dans le tissu artériel. Elle est caractérisée par l'acquisition d'une capacité à synthétiser et à exprimer d'autres facteurs qui à leur tour stimuleront l'activité des cellules environnantes.
A priori, les capacités de phagocytose, d'épuration des lipides et des débris indésirables, et enfin la possibilité de retourner dans la circulation afin d'être épurés par le foie, confèrent aux macrophages un rôle protecteur. Cependant, les macrophages synthétisent de multiples protéases, des facteurs de croissance, des espèces actives d'oxygène, des lipides peroxydes, des facteurs chimiotactiques qui peuvent être toxiques pour d'autres types cellulaires et leur permettent de jouer un rôle important dans le développement de l'athérosclérose.
Toutes les cellules de l'organisme auto-régulent leurs besoins en cholestérol grâce aux récepteurs aux LDL exprimés sur leur membrane cellulaire et finement rétro-régulés. Elles sont donc naturellement mises à l'abri d'une surcharge en cholestérol. De la même manière, les macrophages mis en présence de LDL natives in vitro en concentration élevée ne se transforment pas en cellules spumeuses. Les macrophages disposent donc d'autres récepteurs, les récepteurs scavengers, capables de capter les LDL modifiées (LDL glycosylées ou oxydées) et d'accumuler ainsi d'énormes quantités de lipides. Le phénomène d'oxydation tient le rôle pathologique central au sein de la plaque. Tous les types cellulaires de la paroi artérielle peuvent oxyder les LDL.
La transformation des macrophages en cellules spumeuses peut s'accompagner de modifications importantes, déplaçant par exemple l'équilibre vers des agents pro-coagulants dans la plaque d'athérome. En effet, l'accumulation intracellulaire de cholestérol libre et esterifié induit une stimulation de l'expression du facteur tissulaire, une des principales molécules initiant la voie extrinsèque de la coagulation.
Le passage de la maladie silencieuse à la maladie symptomatique est pratiquement toujours la conséquence d'une rupture de la plaque, même si, à l'inverse, de nombreuses ruptures n'ont pas d'expression clinique et participent simplement -après incorporation du thrombus et cicatrisation- au mécanisme de croissance de la plaque. La richesse en macrophages des plaques est un marqueur des plaques instables: les plaques coronaires des patients atteints d'angor instable contiennent plus de macrophages que celles des patients coronariens stables. De fait, 20% des plaques seraient responsables de 80% des symptômes.
Les résultats concordants des grandes études de prévention secondaire ont montré que l'incidence des événements cliniques diminue très rapidement sous traitement par des hypolipidémiants (en quelques mois) malgré une très modeste régression anatomique des lésions (estimée par angiographie ou par échographie en mode B). Les traitements hypolipidémiants ont donc d'autres mécanismes d'action, notamment la stabilisation des plaques les rendant moins vulnérables mais pas forcément moins volumineuses. La vulnérabilité n'est pas une caractéristique permanente de la plaque: elle dépend de sa composition bien plus que de sa taille, et est donc susceptible de changer plus vite que le volume globale de la plaque. Les composants associés à la vulnérabilité (lipides et macrophages) sont susceptibles de régresser plus vite que les composants associés à la stabilité (collagènes et cristaux de cholestérol).
L'adipophiline humaine est une protéine d'environ 50 kDa (437 acides aminés) qui est définie comme un marqueur de l'accumulation des lipides dans les cellules. Elle a tout d'abord été nommée ADRP (pour adipose differentiation-related protein) car son homologue chez la souris a été isolé à partir d'adipocytes en 1992 par Jiang et al. (Jiang and Serrera, 1992). En effet, son ARN messager est sur-exprimé lors de la différenciation des adipocytes. Elle a donc été principalement décrite dans les adipocytes.
L'adipophiline humaine possède 83,5 % d'identité avec l'ADRP de souris, ainsi que 12 acides aminés supplémentaires (Heid et al., 1998). La région N-terminale de l'adipophiline présente des homologies avec d'autres protéines telles que les périlipines A/B et TIP47 (Londos et al., 1999). Elles forment une famille de protéines s'associant avec les particules lipidiques. L'adipophiline, TIP47 et les périlipines se co- localisent au niveau des gouttelettes lipidiques (Miura et al., 2002). La fixation de ces protéines est hydrophobe (Wolins et al., 2001 ). L'adipophiline ne possède pas de séquence signal N-terminale et ne semble pas être glycosylée mais la présence de deux formes ayant un point isoélectrique de 7,0 et de 7,2 suggère des modifications post-traductionnelles. Elle fixerait des acides gras augmentant ainsi son hydrophobicité et sa capacité à fixer les particules lipidiques. Enfin, la forme microsomale de l'adipophiline est plus petite d'environ 5 kDa que la forme associée aux particules lipidiques (Heid et al., 1996; Mather, 2000). L'adipophiline et les périlipines recouvrent la surface des gouttelettes afin de protéger les lipides d'une hydrolyse par des lipases (Brasaemle et al., 2000; Shen et al., 1999; van Meer, 2001 ). Cependant, l'adipophiline n'est pas détectée dans les cellules qui expriment les périlipines. L'adipophiline est retrouvée à la surface des petites gouttelettes lipidiques des préadipocytes et des adipocytes en cours de différentiation mais est absente des adipocytes en fin de maturation. Inversement, les périlipines sont absentes au début de la différentiation des adipocytes, mais sont retrouvées sur les petites et grosses gouttelettes à la fin de la maturation ((Brasaemle et al., 1997). La distribution des périlipines étant strictement limitée aux adipocytes et aux cellules stéroïdiennes, cette transition n'est pas observée dans les autres types cellulaires. L'adipophiline, bien que présente en plus faible quantité que dans les tissus adipeux, a été détectée dans de nombreuses lignées cellulaires en culture (cellules épithéliales, endothéliales, hépatiques HepG2, fibroblastes, monocytes, macrophages) et tissus (foie, testicules, poumon, rein, cœur, épithélium mammaire, cortex surrénalien) où elle est associée aux particules lipidiques (Brasaemle et al., 1997; Heid et al., 1998).
Cette distribution ubiquitaire de l'adipophiline implique donc un rôle essentiel dans le métabolisme et le stockage des lipides. De plus, l'adipophiline est une des rares protéines associées aux particules lipidiques identifiées dans les cellules capables de stocker les lipides. Elle pourrait être impliquée dans la formation et la stabilisation des gouttelettes lipidiques. Il a ainsi été démontré que l'adipophiline favorise la captation des acides gras à longue chaîne carbonée dans les cellules COS-7 et que ces acides gras stimulent l'expression de son ARN messager dans les précurseurs des adipocytes (Gao and Serrera, 1999; Gao et al., 2000; Serrera et al., 2000).
D'autres études récentes ont montré que l'adipophiline est induite dans les cellules spumeuses macrophagiques (Wang et al., 1999). De plus, son ARN messager est fortement exprimé au niveau de la plaque d'athérome dans les régions enrichies en macrophages et en lipoprotéines de basse densité (LDL) modifiées (Shiffman et al., 2000; Wang et al., 1999). Or, les LDL oxydées (LDLox) ou acétylés (LDLac) induisent à la fois l'expression de l'adipophiline et la transformation des macrophages en cellules spumeuses. Cette induction pourrait résulter de l'activation du récepteur hormonal nucléaire PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ) qui régule l'expression de gènes impliqués entre autres dans le métabolisme des lipides et dans la différentiation des monocytes en macrophages (Buechler et al., 2001). Les PPARγ et δ induisent, par exemple, l'expression de récepteurs « scavengers » au niveau des macrophages ce qui facilite la fixation des LDL modifiées qui sont alors captées en excès par les macrophages. Toutefois, parmi cette famille de récepteurs nucléaires, il semble que seul le PPARδ soit spécifiquement impliqué dans l'accumulation des lipides dans les macrophages humains et les cellules THP-1 (cellules dérivées d'une lignée de monocytes humains) ainsi que dans le contrôle de l'expression de l'adipophiline (Patel et al., 2002; Vosper et al., 2001 ).
Dans les macrophages qui n'ont pas accumulé de lipides, l'adipophiline est présente en faible quantité. L'adipophiline est régulée positivement lors de l'accumulation des lipides et négativement lors de la lipolyse. L'expression de l'adipophiline est donc liée au métabolisme des particules lipidiques qui est régulé par l'activité de la protéine kinase C (PKC) (Chen et al., 2001 ). Cependant, il a été montré chez les murins que la PKC n'est pas associée biochimiquement à l'ADRP et que l'activation de la PKC par le Phorbol 12-Myristate 13-Acétate (PMA) ou son inhibition par la calphostin C n'ont pas d'effet sur la distribution de l'ADRP à la surface des gouttelettes lipidiques (Chen et al., 2002; Fong et al., 2002).
En 1998, Ye H. et Serrero G. ont montré que l'expression de l'ADRP est stimulée par des inhibiteurs de la cyclooxygénase dans les adipocytes de souris (Ye and Serrero, 1998). Cependant, les inhibiteurs de la cyclooxygénase sont aussi des activateurs du PPARγ. Il se peut donc que l'effet observé ne soit pas direct, mais modulé par le PPARγ ou que les inhibiteurs agissent au niveau transcriptionnel. Etant donné que d'autres agonistes du PPARγ ne sont pas de bons stimulateurs de l'expression de l'ADRP et qu'aucun élément de réponse aux PPAR (PPRE) n'a pu être identifié sur le promoteur de l'ADRP ou de l'adipophiline, le PPARγ ne semble pas être impliqué. Le mécanisme reste donc à élucider. Cet article montre que l'ibuprofen et l'indomethacin augmentent l'expression de l'ADRP dans les adipocytes de souris, mais les auteurs n'étudient pas l'effet de l'ADRP et se contentent d'étudier la régulation de son gène, qui est néanmoins une cible potentielle des inhibiteurs de la cyclooxygénase.
La régulation du gène codant pour l'adipophiline a été de nouveau étudiée en 1999 par Wang et al. Ces derniers ont remarqué que la quantité d'ARNm de l'adipophiline était augmentée dans les macrophages stimulés par des LDL oxydées, mais pas par les LDL natives, suggérant un rôle potentiel de cette protéine dans la formation des cellules spumeuses et dans l'athérogenèse. Ils ont également montré que les facteurs pro-inflammatoires n'induisaient pas l'expression de l'adipophiline. Une nouvelle fois les auteurs suggèrent un rôle indirect des LDLox, la surexpression de l'adipophiline pouvant être la conséquence de la stimulation du PPARγ. Dans cet article, les auteurs s'étendent sur la régulation de l'adipophiline par les LDLox et sa localisation au niveau de la plaque d'athérome mais n'étudient pas sa fonction dans les macrophages.
Dans un article plus récent, Vosper et al. (Vosper et al., 2001) montrent que le composé F (agoniste du PPARδ) induit l'expression des récepteurs scavengers SR-A et CD36 (impliqués dans la captation des lipides) et régule négativement des gènes tels que apoE et cyp27 (impliqués dans l'efflux des lipides), ce qui contribue à l'accumulation des lipides. En revanche, le traitement des macrophages par le composé F ou la sur-expression du PPARδ induit également des effets opposés sur une autre voie d'efflux des lipides (indépendante de apoE et cyp27) en stimulant l'expression d'ABCAl (impliquée dans l'efflux du cholestérol dépendant de l'apoA-l). L'efflux total est cependant bien diminué mais cette induction d'ABCAl par le traitement avec l'agoniste du PPARδ ou la sur-expression du PPARδ dans les macrophages a pour conséquence l'augmentation de l'efflux de cholestérol dépendant de l'apoA-l (voir aussi dans PNAS : (Oliver et al., 2001 )).
Les inventeurs ont cherché à savoir si l'adipophiline jouait un rôle dans le métabolisme et la régulation des flux (influx et efflux) de lipides à travers ces cellules. Ils ont décidé d'observer l'effet de l'augmentation de l'adipophiline dans les cellules macrophagiques. Pour cela, deux techniques ont été développées en parallèle :
- l'utilisation d'un vecteur d'expression exprimant l'adipophiline sous la dépendance d'un promoteur fort (CMV), et - l'utilisation d'un adénovirus exprimant l'adipophiline.
L'effet de la surexpression de l'adipophiline dans les macrophages a pu être observé par des techniques mesurant l'efflux du cholestérol en présence d'apoA-l, de HDL et de divers inhibiteurs, tels que les inhibiteurs de l'acyl CoA:cholesterol acyltransferase.
L'apoA-l est synthétisée dans le foie et l'intestin. Elle est principalement retrouvée dans les HDL (High Density Lipoprotein) mais aussi en faible quantité dans les chylomicrons (Lipoprotéines les moins denses) et les VLDL (Very Low Density Lipoprotein). L'apoA-l favorise l'efflux du cholestérol de la membrane, mais est également impliquée dans le maintien de la structure des HDL et dans l'activation de la Lécithine Cholestérol Acyltransferase (LCAT). La LCAT est retrouvée dans les HDL et réalise, dans le plasma, l'estérification du cholestérol libre en esters de cholestérol, participant à la maturation des HDL.
Les inhibiteurs de l'acyl CoA:cholesterol acyltransferase (ACAT) empêchent la re-estérification du cholestérol au niveau du reticulum endoplasmique et par conséquent le dépôt des lipides dans les gouttelettes lipidiques. En effet, après leur captation les composants des LDL modifiées, incluant les esters de cholestérol, sont hydrolyses dans les lysosomes. Le cholestérol libre est ensuite transféré dans le reticulum endoplasmique où il est re-estérifié en ester de cholestérol par l'ACAT puis s'accumule dans le cytosol où il forme les gouttelettes lipidiques (figure 1 , (Brown and Goldstein, 1983).
La présence dans le milieu de culture d'accepteurs de cholestérol, tel que l'apoA-l ou des HDL, permet l'efflux du cholestérol. Cependant, l'efflux de cholestérol n'est possible que si le pool d'ester de cholestérol stocké dans les particules lipidiques est hydrolyse par une hydrolase neutre (Small et al., 1989). La figure 1 représente le flux du cholestérol au niveau des macrophages et les techniques utilisées pour moduler l'activité de l'adipophiline au niveau des cellules macrophagiques THP-1.
Les inventeurs ont donc transfecté de façon transitoire des macrophages avec un plasmide surexprimant l'adipophiline. Les résultats montrent de façon surprenante que si l'on agit sélectivement sur l'adipophiline, l'efflux du cholestérol dépendant de l'apoA-l est réduit significativement. Ce résultat peut s'expliquer par le fait que la quantité d'adipophiline présente dans les cellules est directement modulée alors que les agonistes du PPARδ agissent sur de nombreux autres gènes impliqués à la fois dans l'absorption, le transport, le métabolisme et l'efflux des lipides. Bien que l'article de Vosper et al. (Vosper et al., 2001 ) indique que le composé F augmente l'expression de l'adipophiline, aucune de leurs expériences ne démontre l'implication de cette protéine dans la rétention ou l'efflux du cholestérol.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention est donc fondée sur l'observation du rôle de l'adipophiline dans la modulation de l'efflux de cholestérol.
La présente invention démontre ainsi pour la première fois une modulation de l'efflux de cholestérol par l'adipophiline. La présente invention fournit ainsi de nouvelles cibles et de nouvelles approches pour la recherche de composés capables de réguler l'efflux des lipides, et en particulier l'efflux de cholestérol (transport inverse du cholestérol).
L'invention fournit également des méthodes pour accroître le transport inverse du cholestérol basées sur l'utilisation de composés qui diminuent, voire inhibent, l'activité de l'adipophiline.
L'invention fournit aussi des méthodes de criblage destinées à identifier des substances thérapeutiques capables de moduler l'efflux de cholestérol, en particulier moduler le transport inverse du cholestérol, en déterminant in vitro ou ex vivo la capacité des substances testées à moduler l'activité de l'adipophiline.
La présente invention concerne en particulier une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés susceptibles de moduler l'efflux de cholestérol, en particulier l'efflux de cholestérol dépendant de l'apoA-l, comprenant la mise en contact d'un composé test avec l'adipophiline et la détermination de la capacité dudit composé test à modifier l'activité de l'adipophiline.
Selon une variante de l'invention, la mise en contact du composé test avec l'adipophiline consiste à mettre en contact le composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline. L'invention concerne par ailleurs un procédé de production d'un composé actif, en particulier un composé capable de moduler le flux de cholestérol, et potentiellement actif sur le système vasculaire, comprenant :
- la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de l'adipophiline in vitro ou ex vivo, et
- la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci.
Elle concerne également un procédé de production d'un composé modulateur du flux de cholestérol, comprenant : - la mise en contact d'un composé avec une cellule ou une membrane cellulaire exprimant l'adipophiline,
- la détermination de la capacité dudit composé à moduler le flux de cholestérol à travers ladite cellule ou la dite membrane cellulaire, et
- la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci.
Elle concerne en outre un procédé de production d'un médicament comprenant un composé actif, notamment sur le système vasculaire, comprenant :
- la détermination de la capacité d'un composé à moduler le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses ou de préparations membranaires naturelles ou synthétiques exprimant l'adipophiline in vitro ou ex vivo, et
- le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
Elle concerne par ailleurs un procédé de production d'un médicament comprenant un composé modulant le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses exprimant l'adipophiline, comprenant :
- la mise en contact d'un composé avec l'adipophiline,
- la détermination d'un effet dudit composé sur l'adipophiline, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique. Elle concerne enfin l'utilisation d'un composé modulant l'activité de l'adipophiline pour la préparation d'un médicament destiné à moduler le flux de cholestérol et/ou la concentration en cholestérol des cellules spumeuses.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Le transport inverse du cholestérol est un processus qui permet la sortie du cholestérol cellulaire en excès dans les tissus périphériques. Celui-ci est ensuite esterifié pour être incorporé aux HDL, qui peuvent ensuite le transférer aux lipoprotéines de basse et très basse densité qui vont le transporter jusqu'au foie où il sera éliminé ou recyclé. Ce processus contribue au maintien de l'homéostasie du cholestérol cellulaire. Etant donné qu'il n'y a pratiquement aucune sortie d'esters de cholestérol, l'efflux du cholestérol peut être défini comme la sortie des molécules de cholestérol libre de l'intérieur de la cellule vers l'extérieur à travers la membrane plasmique, soit par diffusion passive grâce à un gradient de concentration entre la membrane plasmique et des particules acceptrices contenant des phospholipides (par exemple, HDL), soit par une seconde voie impliquant des lipoprotéines pauvres en lipides (préβ1-HDL) et riches en apoA-l ou enfin par une voie impliquant le récepteur scavenger SR-BI. Au niveau des macrophages, une autre voie d'efflux résulte de l'hydroxylation des stérols par la sterol 27-hydroxylase et est dépendante de l'expression endogène de l'apoE. La sterol 27-hydroxylase convertit le cholestérol en 27-hydroxycholestérol et en acide 3β-hydroxy-5-cholesténoique. En absence d'accepteurs de cholestérol dans le milieu, ces oxystérols traversent les membranes lipophiles plus rapidement que le cholestérol libre et sont transportés vers le foie pour être convertis en acides biliaires (Babiker et al., 1997).
La diffusion passive ne requiert pas nécessairement de contact entre la cellule et une particule acceptrice, mais peut être modulée par la taille et la composition des HDL acceptrices. L'efflux passif peut être augmenté par l'activité de la LCAT qui maintient un gradient de cholestérol entre la surface cellulaire et les particules acceptrices.
L'efflux dépendant de SR-BI permet la diffusion passive du cholestérol vers les HDL mais serait limité aux régions de la membrane plasmique riches en cholestérol. Ainsi, lorsque les cellules mises en présence de LDLac se chargent en cholestérol via le récepteur scavenger SR-A, le pool intracellulaire de cholestérol n'est pas accessible à SR-BI.
La seconde voie d'efflux, dépendante de l'apoA-l, est reliée à l'activité d'un « ATP-binding transporter » nommé ABCA1 (Owen, 1999). ABCA1 permet l'efflux du cholestérol et des phospholipides, qu'ils soient situés au niveau de la membrane plasmique ou dans les pools intracellulaires, en facilitant leur transfert entre les feuillets interne et externe des membranes cellulaires. Une interaction entre ABCA1 et l'apoA-l est nécessaire pour obtenir l'efflux de cholestérol et de phospholipides. Ce mécanisme d'efflux du cholestérol est différent de celui dépendant de SR-BI qui passe préférentiellement par les HDL.
L'activité d'ABCAl est inhibée par SR-BI qui facilite le retour du cholestérol des HDL naissantes vers la cellule. Ce rôle compétitif de SR-BI permettrait le maintien d'un niveau minimal de cholestérol dans les membranes plasmiques lorsque ABCA1 est actif. En effet, les macrophages chargés en cholestérol surexpriment ABCA1 ce qui entraîne une augmentation de l'efflux de cholestérol. De même, l'expression d'ABCAl dans les macrophages THP-1 peut être stimulée par des activateurs des récepteurs nucléaires PPARα et γ ainsi que par les oxystérols. Inversement, quand les macrophages ne sont pas chargés en cholestérol et que l'expression d'ABCAl n'est pas augmentée, SR-BI stimulerait l'efflux du cholestérol vers les HDL (Chen et al., 2000). En résumé, SR-BI est impliqué dans le flux bidirectionnel du cholestérol libre entre les cellules et les lipoprotéines en fonction d'un gradient de concentration, pompe sélectivement les esters de cholestérol à partir des HDL, augmente le contenu cellulaire en cholestérol libre et agit sur la distribution membranaire des pools de cholestérol (Bultel-Brienne et al., 2002; de la Llera-Moya et al., 1999; Jian et al., 1998).
La présente invention propose donc d'identifier des composés modulant le transport inverse du cholestérol ou l'efflux de cholestérol et en particulier des composés modulant l'efflux de cholestérol dépendant de l'apoA-l ou des HDL.
L'invention concerne donc des méthodes pour identifier, sélectionner ou caractériser des composés biologiquement actifs, notamment des composés actifs sur le système vasculaire, lesdites méthodes étant basées sur la modulation de l'activité de l'adipophiline et/ou du flux de cholestérol à travers des cellules ou préparations membranaires. Les méthodes de l'invention peuvent comprendre des tests de liaison in vitro, des tests de liaison en système cellulaire (ou sur des préparations membranaires, naturelles ou synthétiques) ou des tests fonctionnels en système cellulaire ou artificiel.
La présente invention concerne une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés susceptibles de moduler le flux de cholestérol comprenant la mise en contact, éventuellement en présence de cholestérol, in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, et la mise en évidence d'une modulation de l'activité de ladite adipophiline.
Une méthode particulière de sélection, identification ou caractérisation de composés susceptibles de moduler le flux de cholestérol comprend la mise en évidence d'une modulation de l'activité de l'adipophiline, éventuellement en présence de cholestérol, via la mise en évidence d'une modulation du flux de cholestérol à travers une cellule ou préparation membranaire exprimant ladite adipophiline.
La détermination de la modulation de l'activité de l'adipophiline peut être réalisée par la mesure de l'activité de l'adipophiline et la comparaison de l'activité à celle obtenue en l'absence de composé test.
La mise en évidence d'une modulation de l'activité de l'adipophiline est accomplie de préférence via la mise en évidence de la liaison du composé test à l'adipophiline.
Par « adipophiline », il faut entendre, dans le cadre de la présente invention, la protéine complète ou un fragment de celle-ci, notamment un fragment conservant la capacité d'association avec les lipides, en particulier la capacité de liaison au cholestérol.
Ainsi, les composés identifiés, sélectionnés ou caractérisés selon les procédés de l'invention sont des composés modulant l'efflux de cholestérol, en particulier au niveau des macrophages ou des cellules spumeuses. L'efflux de cholestérol correspond plus spécifiquement à celui dépendant de l'apoA-l tel que défini ci-dessus. La liaison du composé test peut être mise en évidence de différentes manières, comme par exemple par migration sur gel ou électrophorèse des complexes formés. D'autres méthodes basées sur la luminescence ou utilisant la technique FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer) bien connue de l'homme du métier ou la technique SPA (« Scintillation Proximity Assay »), peuvent être mises en œuvre, dans le cadre de la présente invention, pour déterminer la liaison éventuelle du composé test à l'adipophiline. La liaison du composé test à l'adipophiline peut également être mise en évidence par exemple en utilisant un composé test marqué, un ligand marqué de l'adipophiline ou un anticorps marqué spécifique d'une enzyme de synthèse ou d'un transporteur de cette dernière, le déplacement de la liaison du ligand marqué reflétant la liaison du composé test.
Le ligand marqué peut être tout produit liant la molécule cible (anticorps, agoniste ou antagoniste, fragment ou dérivé d'un ligand endogène, etc.). Le ligand peut être marqué par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par incorporation d'un élément radioactif, fluorescent, luminescent, enzymatique, colorimétrique, etc..
De manière préférée, la mise en évidence de la liaison du composé test à l'adipophiline est réalisée en présence d'un ligand marqué de l'adipophiline par détermination du déplacement de la liaison du ligand marqué.
Dans un mode de réalisation particulier, le ligand est un anticorps marqué, spécifique de la cible moléculaire considérée. L'anticorps peut être polyclonal ou monoclonal. Il peut également s'agir d'un fragment ou d'un dérivé d'anticorps, comme par exemple des fragments Fab, F(ab')2, CDR, etc. Les anticorps peuvent être produits de manière conventionnelle, par immunisation vis-à-vis de la cible moléculaire (ou une partie immunogène de celle-ci), et récupération du sérum (polyclonal) ou des cellules de la rate (pour fabriquer des hybridomes par fusion avec une lignée appropriée), comme décrit par exemple dans Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis et al., 1971 ) ou dans Harlow et al. (Harlow and Lane, 1988). Les fragments Fab ou F(ab')2 peuvent être produits par exemple selon Riechmann ét al. (Riechmann et al., 1988).
Dans un autre mode de réalisation particulier, le ligand de l'adipophiline est un ligand endogène, un agoniste ou un antagoniste, marqué. Dans un mode de mise en œuvre spécifique, on utilise du cholestérol marqué, notamment radiomarqué, en particulier tritié.
Selon un mode particulier, la méthode comprend donc la mise en contact d'un composé test avec une cellule (ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique) exprimant l'adipophiline et la mise en évidence d'une liaison du composé test à ladite adipophiline.
Selon un autre mode particulier, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec une cellule (ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique) exprimant l'adipophiline, en présence d'un ligand marqué de ladite adipophiline, et la mise en évidence d'une liaison du composé test par détermination du déplacement de la liaison du ligand marqué.
Dans une autre variante, le procédé de l'invention comprend la mise en contact d'un composé test avec une cellule ou une préparation membranaire exprimant l'adipophiline, et la mise en évidence d'une modulation d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique de ladite adipophiline. L'effet biologique ou pharmacologique peut être l'expression d'une ou plusieurs protéines cellulaires ou des ARNm correspondants, l'expression de l'adipophiline ou de l'ARNm de l'adipophiline, l'internalisation de l'adipophiline, l'activation d'un gène, l'apparition d'un courant électrique, d'un efflux ou d'un influx d'ions, d'un efflux ou d'un influx de cholestérol, de phospholipides, de triglycérides ou d'acides gras, etc.. La mise en évidence de cet effet peut être réalisée par tous moyens appropriés, comme la mesure de l'expression d'un gène rapporteur, la mesure de l'expression membranaire de l'adipophiline, le dosage du cholestérol total (libre et esterifié) et des triglycérides, des ions ou d'un courant électrique, etc..
Classiquement, l'effet du composé test est comparé à l'effet déterminé en l'absence dudit composé. En outre, l'effet du composé test peut être déterminé en présence de cholestérol, notamment lorsqu'une activité de modulation ou d'inhibition de l'activité de l'adipophiline est recherchée. L'invention comprend donc une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés comprenant la mise en contact in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, la mesure d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique de l'adipophiline et la comparaison de l'effet mesuré à celui obtenu en l'absence de composé test.
Selon une variante particulière, l'invention comprend une méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés comprenant la mise en contact, éventuellement en présence de cholestérol, in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, la mesure du flux dudit cholestérol à travers lesdites cellule ou préparation membranaire et la comparaison du flux mesuré à celui obtenu en l'absence de composé test.
Les cellules utilisées dans les tests peuvent être toute cellule exprimant une molécule cible impliquée dans l'activité de l'adipophiline, notamment l'adipophiline. Il peut s'agir de cellules exprimant naturellement cette molécule, ou de cellules modifiées génétiquement ou traitées pour sur-exprimer ladite molécule. Il s'agit, dans un mode préféré de l'invention, de cellules endothéliales, endothéliales HUVEC, de cellules épithéliales, hépatiques HepG2, de fibroblastes, de monocytes, de macrophages de mammifères. De manière encore plus préférée, ces cellules sont des cellules humaines. Il peut également s'agir de cultures primaires ou de lignées établies (cellules THP-1 différenciées en macrophages par le PMA). Dans un autre mode de mise en oeuvre, il est possible également d'utiliser des cellules procaryotes (bactéries), des cellules de levure (Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.), etc.. Ces cellules peuvent être isolées, cultivées et caractérisées selon des techniques connues, notamment celles décrites dans les exemples.
La découverte du rôle de l'adipophiline dans la modulation des flux de cholestérol permet, selon la présente invention, de mettre en évidence de nouveaux composés biologiquement actifs, capables de moduler le flux de cholestérol. La démonstration du rôle pharmacologique de l'adipophiline souligne l'importance de la mise à disposition de tels composés actifs. Dans un mode particulier, pour la mise en œuvre des procédés ci-dessus, on utilise une préparation membranaire exprimant l'adipophiline. La préparation membranaire peut être, avantageusement, d'origine naturelle, c'est-à-dire produite à partir d'une cellule exprimant l'adipophiline. On peut produire des préparations membranaires par lyse mécanique, chimique, physique, électrique, etc., et notamment par traitement avec des détergents, ultrasons, congélation/décongélation, etc.. Cette préparation membranaire se caractérise essentiellement par la présence de fragments de membrane, comprenant une bicouche lipidique dans laquelle tout ou partie de l'adipophiline est présente. Ces préparations membranaires sont généralement dépourvues de cellule intacte. En outre, elles peuvent être enrichies en débris membranaires par des traitements appropriés (centrifugation, etc.). On peut également utiliser une préparation membranaire d'origine synthétique, comme par exemple un liposome dans lequel tout ou partie de l'adipophiline a été introduit, ou une membrane supportée.
Pour les tests de liaison ou les tests fonctionnels mentionnés ci-dessus, les composés peuvent être mis au contact des cellules (ou des préparations membranaires) à différents moments, selon leur(s) effet(s), leur concentration ou la nature des cellules et pour des périodes variées, qui peuvent être ajustées par l'homme du métier. Le test peut être effectué sur tout support approprié et notamment sur une plaque, une lame, une boîte, dans un tube ou une flasque. Généralement, la mise en contact est réalisée dans une plaque multi-puits, ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais nombreux et variés. Parmi les supports typiques, on trouve des plaques de microtitration et plus particulièrement des plaques 96 ou 384 puits (ou plus), faciles à manipuler.
Selon le support et la nature du composé test, des quantités variables de cellules peuvent être utilisées lors de la mise en œuvre des méthodes décrites. De manière classique, 102 à 2*106 cellules sont mises en contact avec un type de composé test, dans un milieu de culture approprié, et de manière préférentielle entre 103 et 105 cellules. Lorsqu'une préparation membranaire est utilisée, on applique généralement 0,01 à 50 mg de protéine par essai, plus préférentiellement de 0,05 à 2 mg de protéine par essai. Les essais peuvent être réalisés dans tout type de milieu approprié, comme par exemple des solutions salines, des tampons, etc. On peut citer notamment des tampons Tris, Pipes, Hepes, etc. La température est, typiquement, proche de la température ambiante. Le pH du milieu est avantageusement compris entre 5,5 et 8, plus préférentiellement entre 7 et 8. Il est entendu que ces paramètres peuvent être ajustés par l'homme du métier, suivant les indications fournies dans les exemples.
La quantité (ou la concentration) de composé test peut également être ajustée par l'utilisateur selon le type de composé (sa toxicité, sa capacité de pénétration cellulaire, etc.), la longueur de la période d'incubation, etc. Généralement, les cellules (ou membranes) sont exposées à des quantités de composés test qui varient de 1 nM à 1mM. Il est bien sûr possible de tester d'autres concentrations sans dévier de la présente invention. Chaque composé peut, de plus, être testé, en parallèle, à différentes concentrations et sur différentes périodes. Par ailleurs, des adjuvants et/ou vecteurs et/ou produits facilitant la pénétration des composés dans les cellules tels que des liposomes, des lipides cationiques, des polymères, des peptides issus de virus, etc., peuvent, en outre, être utilisés, si nécessaire. Le contact peut être maintenu pendant une période comprise entre 1 heure et plusieurs heures (72 heures). Dans le cas de la transfection, le contact est maintenu typiquement de 4 heures à 48 heures. Dans le cas d'une infection, le contact est maintenu typiquement de 4 heures à 24 heures.
La présente invention peut être appliquée à tout type de composé test. Ainsi, le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou ne pas être défini. Le composé peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition indéfinie comprenant un ou plusieurs produits. De telles compositions indéfinies peuvent être, par exemple, des échantillons de tissus, des fluides biologiques, des surnageants cellulaires, des préparations végétales, etc.
Les composés test susceptibles de moduler l'activité de l'adipophiline selon l'invention peuvent être de nature et d'origine variées. Les composés test peuvent être des produits inorganiques ou organiques et notamment un polypeptide (ou une protéine ou un peptide), un acide nucléique, plus particulièrement un acide nucléique antisens ou un RNAi (ARN interférence), un lipide, un polysaccharide, un composé chimique ou biologique tel qu'un facteur nucléaire, un cofacteur ou tout mélange ou dérivé de ces derniers. Le composé peut être d'origine naturelle ou synthétique et inclure une banque combinatoire, un clone ou une banque de clones d'acides nucléiques exprimant un ou plusieurs polypeptide(s) liant l'ADN, etc.
Dans ce cadre, des composés de type RNAi ont été identifiés et synthétisés. Des RNAi et l'utilisation de siRNAs (small interférence RNA ou petits ARN interférence) dans les cellules de mammifères sont notamment décrits dans la publication de Brummelkamp et al. (Brummelkamp et al., 2002).
Les ARNi de la présente invention sont des ARNi spécifiques de l'adipophiline. Ils inhibent l'activité, en particulier l'expression, de l'adipophiline en se fixant sur une séquence cible de l'ARNm de l'adipophiline. Cette séquence cible peut se situer dans les régions codantes ou non de l'ARNm de l'adipophiline, les régions non codantes peuvent se situer par exemple dans des séquences 5' ou 3' UTR. Les ARNi de la présente invention sont plus spécifiquement des ARNsi et sont avantageusement utilisés sous forme double-brin (matrice antisens et matrice sens).
La présente invention a donc en outre pour objet les ARN interférence de l'adipophiline. En particulier, les ARN interférence sont construits à partir des séquences cibles sur l'ARNm de l'adipophiline, lesdites séquences cibles sur l'ARNm de l'adipophiline sont choisies parmi les séquences suivantes :
- dans le 5' UTR :
5'- AATGGCATCCGTTGCAGTTGA -3' (SEQ ID 1 ),
- dans la séquence codante :
5'- AAGCTAGAGCCGCAAATTGCA -3' (SEQ ID 2) 5'- AATTGCCCGCAACCTGACTCA -3' (SEQ ID 3)
- dans le 3'UTR :
5'- AAAAGGCGTCTTCACTGCTTT -3' (SEQ ID 4) De préférence, les ARNsi comprennent une matrice antisens et une matrice sens, ladite matrice antisens comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID 1 , 2, 3 et 4.
Avantageusement, les matrices antisens et les matrices sens des ARNsi comprennent au moins 21 bases, de préférence présentent une longueur de 29 bases.
Avantageusement, les ARNsi sont choisis parmi les ARNs de séquences suivantes :
- ARNsil -adipophiline : Matrice antisens :
5'- AATGGCATCCGTTGCAGTTGACCTGTCTC -3' (SEQ ID 5)
Matrice sens :
5'- AATCAACTGCAACGGATGCCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 6)
- ARNsi2-adipophiline
Matrice antisens :
5'- AAGCTAGAGCCGCAAATTGCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 7)
Matrice sens :
5'- AATGCAATTTGCGGCTCTAGCCCTGTCTC -3' (SEQ ID 8)
- ARNsi3-adipophiline Matrice antisens :
5'- AATTGCCCGCAACCTGACTCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 9) Matrice sens : 5'- AATGAGTCAGGTTGCGGGCAACCTGTCTC -3' (SEQ ID 10)
- ARNsi4-adipophiline Matrice antisens :
5'. AAAAGGCGTCTTCACTGCTTTCCTGTCTC -3" (SEQ ID 11 ) Matrice sens :
5'- AAAAAGCAGTGAAGACGCCTTCCTGTCTC -3" (SEQ ID 12)
Les ARNsi de la présente invention qui inhibent l'expression de l'adipophiline modulent, et en particulier augmentent, l'efflux de cholestérol. A ce titre, ils peuvent être utilisés en tant que médicament, notamment pour traiter de manière préventive ou curative l'athérosclérose, l'hypercholestérolémie ou la surcharge en cholestérol des macrophages. Ils peuvent également traiter de manière préventive ou curative l'infarctus du myocarde, l'ischémie cérébrale, les maladies cardiovasculaires ou les pathologies de la vascularisation périphérique.
De manière générale, un autre objet de l'invention concerne donc un procédé de production d'un composé actif, en particulier un composé capable de moduler le flux de cholestérol, et potentiellement actif sur le système vasculaire, comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de l'adipophiline, en particulier à moduler l'expression de l'adipophiline, in vitro ou ex vivo, et
- la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci.
L'invention comprend également un procédé de production d'un médicament comprenant un composé modulant le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses exprimant l'adipophiline, comprenant :
- la mise en contact d'un composé avec l'adipophiline,
- la détermination d'un effet dudit composé sur l'adipophiline, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un composé modulateur du flux de cholestérol, comprenant : - la mise en contact d'un composé avec une cellule ou une membrane cellulaire exprimant l'adipophiline,
- la détermination du flux de cholestérol à travers ladite cellule ou ladite membrane cellulaire, la modulation dudit flux indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et - la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'un médicament comprenant un composé actif, notamment sur le système vasculaire, comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses ou de préparations membranaires naturelles ou synthétiques exprimant l'adipophiline in vitro ou ex vivo, et
- le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
Les ARNi de l'adipophiline définis ci-dessus ont été produits selon les procédés définis ci-dessus.
Dans le contexte de l'invention, le terme « analogue structural » désigne toute molécule obtenue par modélisation moléculaire ou variation structurale à partir d'un composé test.
L'effet du composé test préférentiellement mesuré est la faculté dudit composé à moduler l'activité (i.e., l'action ou l'expression) de l'adipophiline.
Une utilisation particulièrement avantageuse d'un composé modulant l'activité de l'adipophiline consiste à préparer un médicament destiné à moduler le flux de cholestérol et la concentration en cholestérol des cellules spumeuses. De manière préférée, le composé diminue l'activité de l'adipophiline pour augmenter l'efflux de cholestérol et diminuer la concentration en cholestérol des cellules spumeuses.
De manière préférée le médicament ainsi préparé est destiné à limiter l'accumulation des lipides et/ou la formation des cellules spumeuses et à ainsi traiter l'athérosclérose en limitant la formation de la plaque d'athérome.
Le composé modulant l'activité de l'adipophiline est avantageusement choisi parmi un ARNsi tel que défini précédemment.
Les composés, compositions ou médicaments selon l'invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être injectés par voie systémique ou orale, de préférence systémique, comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, intra-cérébrale, intra-péritonéale, intra-cérébrovasculaire, etc. Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. A cet égard, les composés sont généralement dissous dans des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Ainsi, les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations liquides et/ou injectables sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc. Les composés peuvent également être administrés sous forme de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons.
Il est entendu que le débit et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie, du mode d'administration, etc. Typiquement, les composés sont administrés à des doses pouvant varier entre 0,1 μg et 1000 mg/kg de poids corporel, plus généralement de 0,01 à 500 mg/kg, typiquement entre 1 et 200 mg/kg. En outre, des injections répétées peuvent être réalisées, le cas échéant. D'autre part, pour des traitements chroniques, des systèmes retard ou prolongés peuvent être avantageux.
Les doses préférées pour obtenir une diminution de l'athérosclérose chez l'animal sont des doses inférieures à 50 mg/kg. Un effet significatif est avantageusement obtenu chez l'animal à des doses comprises entre 100 et 200 mg/kg
L'invention comprend en outre des outils et kits pour la mise en œuvre de ces méthodes.
La faisabilité, la réalisation et d'autres avantages de l'invention sont illustrés plus en détails dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs. LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Flux du cholestérol au niveau des macrophages et techniques utilisées pour moduler l'activité de l'adipophiline au niveau des cellules macrophagiques THP-1. ACAT, acyl CoA:cholesterol acyltransferase ; CL, Cholestérol Libre ; EC,
Cholestérol Esterifié ; CEHn, Cholestéryl ester hydrolase neutre ; LDLac, LDL acétylées ; SR, Récepteurs scavengers.
Figure 2 : Analyse par (A) Western Blot de l'expression de l'adipophiline après transfection des macrophages THP-1 par l'Effectene et (B) Northern blot de l'expression de l'ARNm de l'adipophiline après transfection des macrophages
THP-1 par le jetPEI-Man.
Figure 3 : Accumulation des triglycérides et du cholestérol dans les macrophages
THP-1 après charge avec les LDL acétylées pendant 48h.
Figure 4 : Cinétique de l'efflux du cholestérol dépendant de l'ApoA-l dans les macrophages THP-1 après transfection, expression du vecteur pCI-adipophiline puis charge avec les LDL acétylées tritiées pendant 48h (C : contrôle sans ApoA-
I)-
Figure 5 : Analyse par (A) Western Blot de l'expression de l'adipophiline après infection des macrophages THP-1 par les adenovirus témoin (ad-CMV-GFP) ou surexprimant l'adipophiline (ad-CMV-adipophiline) et (B) RT-PCR de l'expression de l'ARNm de l'adipophiline après infection des macrophages THP-1 par les adenovirus témoin (ad-CMV-GFP) ou surexprimant l'adipophiline (ad-CMV- adipophiline).
Figure 6 : Accumulation des triglycérides et du cholestérol dans les macrophages THP-1 infectés par les adenovirus témoin (ad-CMV-GFP) ou surexprimant l'adipophiline (ad-CMV-adipophiline), après charge avec les LDL acétylées pendant 48h.
Figure 7 : Cinétique de l'efflux du cholestérol dépendant de l'ApoA-l ou des HDL dans les macrophages THP-1 après infection, expression des adenovirus puis charge avec les LDL acétylées tritiées pendant 48h.
Figure 8 : Analyse par Western Blot de l'inhibition de l'expression de l'adipophiline par le siRNA3-adipophiline (siRNA-adip) (transfection des macrophages THP-1 avec le jetSI) en présence ou absence de LDL acétylées. Figure 9 : Accumulation des triglycérides et du cholestérol dans les macrophages
THP-1 transfectés par les siRNA, après charge avec les LDL acétylées pendant
48h.
Figure 10 : Cinétique de l'efflux du cholestérol dépendant de l'ApoA-l dans les macrophages THP-1 après transfection avec des siRNA, inhibition de l'expression de l'adipophiline puis charge avec les LDL acétylées tritiées pendant 48h.
EXEMPLES
Culture cellulaire
Les macrophages utilisés proviennent d'une lignée continue (THP-1 ) de monocytes humains. Le milieu de base correspond à du milieu RPMI 1640 (Gibco) contenant, 4 mM de L-glutamine, 20 Ul/ml de pénicilline et 20 μg/ml de streptomycine. Les cellules en suspension se multiplient à 37°C dans 5% de CO2 dans du milieu de base contenant 10% de sérum de veau foetal décomplémenté (milieu complet). La différenciation des monocytes en macrophage est obtenue en déposant 2.106 cellules/puits (boîtes à 6 puits) dans du milieu complet en présence de 1.6.107 M de PMA (Phorbol 12-Myristate 13-acétate) pendant 72 heures. Les THP-1 différenciées adhèrent au support.
Transfection des macrophages
Les macrophages (0,7.10e à 2.106 cellules/puits, boîtes à 6 puits) sont transfectés transitoirement par 1 à 3 μg de plasmide en utilisant l'Effectene™ (Qiagen) ou le jetPEI™-Man (Qbiogene) et/ou par 2 à 3 μg de siRNA en utilisant le jetSI™
(Qbiogene) comme produits de transfection. Les macrophages sont incubés de 24 à
72 h puis analysés.
Infection des macrophages Les macrophages (0,7.10e à 2.10e cellules/puits, boîtes à 6 puits) sont infectés par 10 à 2000 pfu (plaque-forming units) d'adénovirus contenant soit l'ADNc codant l'adipophiline (ad-CMV-adipophiline) soit un adenovirus contrôle contenant la séquence codant pour la GFP (" green fluorescent protein ") (ad-CMV-GFP) pendant 4 à 24 h. Constructions des plasmides
Il a été choisi de cloner l'ADNc de l'adipophiline humaine dans le vecteur d'expression pCI (Promega) sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire CMV. Après amplification de la séquence codante à partir d'ARNm macrophagique par RT-PCR, ce vecteur a été séquence et nommé pCI-adipophiline. Une transfection des THP-1 différenciées en macrophages par le PMA a été ensuite réalisée. L'efficacité de la transfection a été étudiée en réalisant des co-transfections avec un plasmide rapporteur pEGFP-C3 permettant de visualiser la protéine autofluorescente GFP (" green fluorescent protein ").
Design des ARNsi : sélection des cibles sur l'ARNm
Chaque séquences de dinucléotides AA sont scannées tout le long de l'ARNm de l'adipophiline (régions codantes et non codantes). Les 19 nucleotides suivants, adjacents à ces deux nucleotides AA, sont sélectionnés comme cibles potentielles. Plus d'une centaine de séquences ont été sélectionnées, puis comparées (notamment à l'aide de www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) avec les banques du génome humain. Toutes les séquences cibles, sélectionnées sur l'ARNm de l'adipophiline, ayant une homologie importante avec d'autres séquences codantes ou un pourcentage de nucleotides GC non compris entre 35 et 60% ont été éliminées.
Après cette étape de sélection, quatre séquences de 21 nucleotides (voir la description des séquences) ont été retenues pour la production de siRNA afin d'inhiber l'expression de l'adipophiline.
Production in vitro de ARNsi
Les siRNA sont produits avec le kit « Silencer™ siRNA Construction Kit » (Ambion) selon les instructions du fournisseur.
Extraction des protéines et analyse par Western Blot Les protéines totales sont extraites à partir de cellules cultivées dans des boîtes de 35 mm. Les cellules sont lavées trois fois au PBS (tampon phosphate salin), lysées (Triton X100 1%, Deoxycholate 0,5%, 10 mM Na pyruvate phosphate, 2 mM Na vanadate, NaF 100 mM, Aprotinine, PMSF 0,5 mM, inhibiteur ICN, PBS) puis centrifugées 30 min à 10000 g, 4°C. La concentration en protéines est déterminée par la méthode de Peterson (Peterson, 1977). Les échantillons (20 μg de protéines) sont séparés par SDS-PAGE (10% d'acrylamide) selon la méthode de Laemmli ((Laemmli, 1970)), en utilisant le système Cuve Mini Protean 3 (Bio-Rad). Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose par électrotransfert (10 mA/cm2) (Amersham). Les membranes sont saturées dans du tampon de base (10 mM Tris, 150 mM NaCI, 0,05% Tween 20) contenant 5% de lait pendant 1 h à température ambiante. Elles sont incubées avec un premier anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt, lavées à nouveau par du tampon de base puis incubées avec un second anticorps dirigé contre le premier anticorps. Après lavage, les protéines d'intérêt sont révélées par chimioluminescence (ECL, Amersham), puis quantifiées par analyse densitométrique. L'expression de la protéine β-actine étant constante dans nos conditions expérimentales, les inventeurs ont utilisé cette protéine pour normaliser les différences entre chaque échantillon.
Extraction des ARN, analyse par Northern Blot et RT-PCR
Les ARN totaux ont été extraits en suivant les indications des kits RNeasy Mini ou Midi (Qiagen). Les échantillons d'ARN (15 μg/puits) ont migré 3 h à 100 V à travers un gel de formaldéhyde-agarose 1% puis ont été transférés sur une membrane de nylon (Pall Gelman Sciences). Les sondes d'ADN ont été marquées au [α-32P]dCTP (3000 Ci/mmol, EASYTIDES™ , PerkinElmer Life Sciences) en utilisant le kit de marquage random-priming DNA labeling kit (Boehringer, Mannheim). La pré- hybridation, l'hybridation et les lavages ont été réalisés suivant les conditions décrites précédemment (Tontonoz et al., 1994). Les membranes séchées ont ensuite été exposées sur des films autoradiographiques (Kodak Biomax) à -80°C, le signal étant quantifié par analyse densitométrique.
L'expression du gène de la GAPDH étant constante dans ces conditions expérimentales, les inventeurs l'ont utilisée pour normaliser les différences entre chaque échantillon.
Préparation des lipoprotéines
L'isolement des LDL (densité 1 ,03-1 ,063) a été réalisé à partir de plasmas humains par ultracentrifugation séquentielle comme décrit précédemment (Havel et al., 1955). Les LDL isolées ont été stérilisées par filtration sur membrane (0,22 μm) et conservées à 4°C dans du tampon phosphate salin contenant 10 mM d'éthylènediaminetetraacétate disodium dihydrate (PBS-EDTA).
Modification des LDL Les LDL ont été modifiées chimiquement au niveau des protéines par l'anhydride acétique. Ce composé réagit sur les résidus lysines pour former une liaison amide. L'acétylation augmente la charge des LDL. Les LDL acétylées ont été dialysées pendant 24 heures en changeant le milieu régulièrement contre du PBS- EDTA. Elles ont ensuite été filtrées sur membrane (0,22 μm). La concentration protéique a été déterminée par la méthode de Peterson (Peterson, 1977).
Les LDLac ont été marquées au 3H en incubant 33,3 μCi (par mg de protéines LDLac) de cholestérol libre tritié (1α, 2α (n)-[3H] cholestérol, Amersham) en présence d'éthanol, pendant 24 h à 37°C.
Mesure de triglycérides, du cholestérol cellulaire et du contenu en protéines
Les quantités de cholestérol total et libre ont été mesurées suivant les conditions du kit FC-test (Wako Pure Chemicals). La quantité de cholestérol esterifié a été déterminée par le calcul de la différence entre le cholestérol total et le cholestérol libre. La quantité de triglycérides a été mesurée suivant les conditions du kit Triglycérides enzymatique PAP 1000 (Biomérieux). La concentration en protéines extraites des cellules a été déterminée par la méthode de Lowry (Lowry et al., 1951 ).
Efflux de cholestérol
Les macrophages THP-1 , transfectés par le plasmide d'intérêt, ont été chargés en lipides par incubation pendant 48 h avec 100 μg/ml de LDLac-cholestérol libre-[3H] dans du milieu de base contenant 10% de sérum de veau fœtal. Les cellules ont ensuite été lavées au PBS puis incubées pendant 24 h dans du milieu de base contenant 2 mg/ml de BSA. L'efflux de cholestérol (ou lipides) des cellules vers le milieu de culture a été réalisé dans du milieu de base sur une période de 24 h, en prélevant 120 μl d'échantillon (milieu d'efflux) à 0, 2, 4, 8, 12 et 24 h. Les échantillons ont été centrifugés et 100 μl de ces différents surnageants ont été comptés dans du liquide de scintillation (compteur β Wallac 1410). RESULTATS
L'approche consiste soit à surexprimer l'adipophiline ou au contraire à l'inhiber. La surexpression est obtenue dans un premier temps à partir d'un vecteur d'expression puis grâce à un vecteur adénoviral au niveau de macrophages en culture. Ce travail permet d'évaluer l'impact de la surexpression de l'adipophiline à la fois sur la charge lipidique et sur l'efflux de cholestérol.
Il a été choisi de cloner l'ADNc de l'adipophiline humaine dans le vecteur d'expression pCI (Promega) sous le contrôle d'un promoteur ubiquitaire CMV. Après amplification de la séquence codante à partir d'ARNm macrophagique par RT-PCR, ce vecteur a été séquence et nommé pCI-adipophiline. Une transfection des THP-1 différenciées en macrophages par le PMA a été réalisée. L'étude de l'expression du vecteur dans ces cellules est représentée à la figure 2.
Il a ensuite été évalué l'impact de cette surexpression de l'adipophiline sur la charge lipidique en dosant le cholestérol et les triglycérides (figure 3).
Les résultats du dosage montrent une augmentation de 40% pour les triglycérides et de 15% pour le cholestérol total dans les cellules transfectees surexprimant l'adipophiline par rapport aux cellules transfectees par le vecteur pCI vide.
L'accumulation du cholestérol intracellulaire se traduit par une augmentation du cholestérol esterifié.
Il a également été étudié l'effet de la surexpression de l'adipophiline sur l'efflux du cholestérol dépendant de l'ApoA-l au niveau des macrophages en culture (figure 4). L'ApoA-l a été utilisée comme accepteur de cholestérol et il a été suivi l'efflux pendant 24 h, en réalisant des prélèvements aux temps 2, 4, 8, 12 et 24h. A également été mesuré le cholestérol tritié présent dans cellules au temps to. Les résultats ont été comparés avec ceux obtenus avec des macrophages THP-1 ayant subi les mêmes traitements mais incubés dans du milieu sans ApoA-l (témoin RPMI). Après incubation des cellules chargées en lipides, on observe une diminution significative de l'efflux dans les cellules transfectees avec le vecteur exprimant l'adipophiline en comparaison aux cellules témoins (pCI). L'efflux de cholestérol est en effet réduit de 47% après 24 h d'incubation avec l'apoA-l (figure 4) confirmant le rôle de l'adipophiline dans le stockage et la rétention des lipides. Toutes ces expériences de surexppression de l'adipophiline ont été également reproduites et vérifiés en utilisant un adenovirus (ad-CMV-adipophiline) permettant d'augmenter l'expression cellulaire de l'adipophiline jusqu'à 40 fois (figure 5). L'impact de cette surexpression a été évalué sur la charge lipidique en dosant le cholestérol total, le cholestérol libre et les triglycérides (figure 6). Les résultats du dosage montrent une augmentation de 40% à la fois pour les triglycérides et le cholestérol esterifié ainsi qu'une diminution de 60% du cholestérol libre dans les cellules infectées surexprimant l'adipophiline par rapport aux cellules infectées par le vecteur ad-CMV- GFP. II a également été étudié l'effet de la surexpression de l'adipophiline sur l'efflux du cholestérol dépendant de l'ApoA-l et des HDL au niveau des macrophages en culture (figure 7). Les résultats obtenus avec l'adénovirus ad-CMV-adipophiline sont similaires à ceux obtenus avec le vecteur d'expression pCI-adipophiline.
Les résultats de l'analyse par Western Blot de l'inhibition de l'expression de l'adipophiline par le ARNsi3-adipophiline (transfection des macrophages THP-1 avec le jetSI) en présence ou absence de LDL acétylées sont donnés à la figure 8.
L'impact de l'inhibition de l'expression de l'adipophiline a été évalué sur la charge lipidique en dosant le cholestérol total, le cholestérol libre et les triglycérides (figure 9). L'inhibition de l'expression de l'adipophiline entraîne une diminution de 50% pour les triglycérides et de 44% pour le cholestérol total dans les cellules transfectees par le siRNA-adipophiline par rapport aux cellules transfectees par le siRNA-GAPDH. La diminution du cholestérol intracellulaire se traduit par une baisse significative du cholestérol esterifié.
Il a également été étudié l'effet de l'inhibition de l'expression de l'adipophiline sur l'efflux du cholestérol dépendant de l'ApoA-l au niveau des macrophages en culture (figure 10). Après incubation des cellules chargées en lipides, on observe une diminution significative de l'efflux dans les cellules transfectees avec le siRNA- adipophiline en comparaison aux cellules témoins. Cette diminution de l'efflux du cholestérol par rapport aux cellules témoins, peut s'expliquer par la forte diminution du cholestérol total accumulé dans les cellules n'exprimant plus l'adipophiline (figure 9). REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés susceptibles de moduler l'efflux de cholestérol comprenant la détermination in vitro ou ex Vo de la capacité des substances testées à moduler l'activité de l'adipophiline.
2. Méthode selon la revendication 1 , comprenant la mise en contact, éventuellement en présence de cholestérol, d'un composé test avec l'adipophiline.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant la mise en contact d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, et la mise en évidence d'une modulation de l'activité de ladite adipophiline.
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la mise en évidence d'une modulation de l'activité de ladite adipophiline est réalisée par la mise en évidence d'une modulation du flux de cholestérol à travers une cellule ou préparation membranaire exprimant ladite adipophiline.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la mise en évidence d'une modulation de l'activité de l'adipophiline comprend la mise en évidence de la liaison du composé test à l'adipophiline.
6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la liaison du composé test est mise en évidence par migration sur gel, électrophorèse, FRET, SPA ou par détermination du déplacement d'un ligand marqué par le composé test.
7. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que la mise en évidence de la liaison du composé test à l'adipophiline est réalisée en présence d'un ligand marqué de l'adipophiline par détermination du déplacement de la liaison du ligand marqué.
8. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la mise en évidence d'une modulation de l'activité de l'adipophiline comprend la mise en évidence d'une modulation d'un effet biologique ou pharmacologique caractéristique de l'adipophiline.
9. Méthode de sélection, identification ou caractérisation de composés comprenant la mise en contact, éventuellement en présence de cholestérol, in vitro ou ex vivo, d'un composé test avec une cellule spumeuse ou une préparation membranaire naturelle ou synthétique exprimant l'adipophiline, la mesure du flux dudit cholestérol à travers lesdites cellule ou préparation membranaire et la comparaison du flux mesuré à celui obtenu en l'absence de composé test.
10. Procédé de production d'un composé actif, en particulier un composé capable de moduler le flux de cholestérol, comprenant :
- la détermination de la capacité d'un composé à moduler l'activité de l'adipophiline, en particulier à moduler l'expression de l'adipophiline, in vitro ou ex wVo, et
- la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci.
11. Procédé de production d'un composé modulateur du flux de cholestérol, comprenant :
- la mise en contact d'un composé avec une cellule ou une membrane cellulaire exprimant l'adipophiline,
- la détermination du flux de cholestérol à travers ladite cellule ou la dite membrane cellulaire, la modulation dudit flux indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et
- la synthèse dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci.
12. Procédé de production d'un médicament comprenant un composé actif, notamment sur le système vasculaire, comprenant : - la détermination de la capacité d'un composé à moduler le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses ou de préparations membranaires naturelles ou synthétiques exprimant l'adipophiline in vitro ou ex vivo, et - le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
13. Procédé de production d'un médicament comprenant un composé modulant le flux de cholestérol au travers de cellules spumeuses exprimant l'adipophiline, comprenant :
- la mise en contact d'un composé avec l'adipophiline,
- la détermination d'un effet dudit composé sur l'adipophiline, ledit effet indiquant que le composé est un modulateur du flux de cholestérol, et
- le mélange dudit composé ou d'un analogue structural de celui-ci avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'effet du composé est la faculté dudit composé à moduler l'activité de l'adipophiline.
15. Utilisation d'un composé modulant l'activité de l'adipophiline pour la préparation d'un médicament destiné à moduler le flux de cholestérol et/ou la concentration en cholestérol des cellules spumeuses.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que le composé diminue l'activité de l'adipophiline pour augmenter l'efflux de cholestérol et/ou diminuer la concentration en cholestérol des cellules spumeuses.
17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que le médicament est destiné à traiter l'athérosclérose.
18. ARN interférence de l'adipophiline.
19. ARN interférence de l'adipophiline comprenant une matrice antisens et une matrice sens, ladite matrice antisens comprenant au moins une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID 1 , 2, 3 et 4.
20. ARN interférence de l'adipophiline comprenant une matrice antisens et une matrice sens qui présentent une longueur d'au moins 21 bases, de préférence qui présentent une longueur de 29 bases.
21. ARNi choisis parmi les double-brins d'ARNs de séquences suivantes : - ARNsM -adipophiline :
Matrice antisens :
5'- AATGGCATCCGTTGCAGTTGACCTGTCTC -3' (SEQ ID 5)
Matrice sens :
5'- AATCAACTGCAACGGATGCCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 6)
- ARNsi2-adipophiline Matrice antisens :
5'- AAGCTAGAGCCGCAAATTGCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 7) Matrice sens : 5'- AATGCAATTTGCGGCTCTAGCCCTGTCTC -3' (SEQ ID 8)
- ARNsi3-adipophiline Matrice antisens :
5'- AATTGCCCGCAACCTGACTCACCTGTCTC -3' (SEQ ID 9) Matrice sens :
5'- AATGAGTCAGGTTGCGGGCAACCTGTCTC -3' (SEQ ID 10)
- ARNsi4-adipophiline Matrice antisens : 5'- AAAAGGCGTCTTCACTGCTTTCCTGTCTC -3' (SEQ ID 11 ) Matrice sens : 5-. AAAAAGCAGTGAAGACGCCTTCCTGTCTC -3" (SEQ ID 12)
22. Utilisation selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisée en ce que le composé modulant l'activité de l'adipophiline est un ARNi tel que défini dans l'une des revendications 18 à 21.
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