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WO2004044570A1 - ハイブリダイゼーションの検出方法 - Google Patents

ハイブリダイゼーションの検出方法 Download PDF

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Publication number
WO2004044570A1
WO2004044570A1 PCT/JP2003/012499 JP0312499W WO2004044570A1 WO 2004044570 A1 WO2004044570 A1 WO 2004044570A1 JP 0312499 W JP0312499 W JP 0312499W WO 2004044570 A1 WO2004044570 A1 WO 2004044570A1
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WO
WIPO (PCT)
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nucleic acid
acid probe
dna
hybridization
stranded
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2003/012499
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takashi Terasawa
Masahiro Kadosaki
Megumi Makimura
Satoshi Fujiki
Katsumi Tanino
Akira Nakagawa
Takashi Mizuhara
Masanori Mizushima
Morihito Nakada
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyama Prefecture
Toyo Kako Co Ltd
Cosel Co Ltd
Tateyama Kagaku Kogyo Co Ltd
Original Assignee
Toyama Prefecture
Toyo Kako Co Ltd
Cosel Co Ltd
Tateyama Kagaku Kogyo Co Ltd
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Publication date
Application filed by Toyama Prefecture, Toyo Kako Co Ltd, Cosel Co Ltd, Tateyama Kagaku Kogyo Co Ltd filed Critical Toyama Prefecture
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Publication of WO2004044570A1 publication Critical patent/WO2004044570A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting hybridization between a nucleic acid of interest and a nucleic acid such as a gene of interest contained in a gene sample, and specifically detecting a specific gene or the like present in the sample. . Background art
  • genes Genetic information imprinted on genes (DNA) is expressed as proteins or enzymes via messenger RNA. By the action of these proteins and enzymes, biosynthesis and metabolism of various compounds necessary for maintaining life are performed. Thus, organisms exist as a dynamic equilibrium system of various substances controlled by genes. As a result of the human genome project, it was revealed that the total number of human genes was about 30,000. If any abnormality or change occurs in these genes, for example, deletion or duplication, the characteristics, type and amount of the produced protein will change, resulting in an imbalance in the biological system and causing disease . Therefore, by detecting a known gene that causes a disease, it is possible to identify or prevent a disease. Such a diagnosis is called gene diagnosis.
  • Genetic diagnosis allows diagnosis and prediction before the phenotypic change of the disease, that is, before the onset of the disease, in the latent period of the disease, or at an extremely early stage.
  • genetic diagnosis for hereditary diseases does not depend on the organ or tissue being analyzed. This is particularly important in fetal diagnosis, and it is possible to make a diagnosis simply by collecting amniotic fluid from a pregnant woman and examining fetal cells floating in the amniotic fluid.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 6-77099
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 25733443
  • This gene detection method a gene sample extracted from a sample and denatured to a single strand is reacted with a single-stranded nucleic acid probe having a base sequence complementary to the target gene to be detected, and then This is a gene detection method for detecting the presence of the target gene by detecting the nucleic acid probe hybridized with the gene.
  • the nucleic acid probe is immobilized on an electrode surface or an optical fiber tip, and a double-stranded recognizer that specifically binds to a double-stranded nucleic acid and is electrochemically or photochemically active.
  • a double-stranded form of the nucleic acid probe and the target gene is obtained.
  • a single-stranded oligo DNA is immobilized on an electrode, and a dye that specifically interacts with the double-stranded DNA to determine whether or not it becomes double-stranded DNA when the sample DNA is dropped. Is detected from an electrochemical redox reaction.
  • the measurement of the oxidation, reduction potential and peak current value of the intercalating dye used is affected by the sweep speed of the potential, and moreover, the measurement is repeated because the dye is oxidized in almost one measurement. Can not. As a result, measurement accuracy is reduced.
  • the dye may be immobilized on the single-stranded oligo DNA or the electrode, and it may be difficult to detect whether or not the dye has become double-stranded DNA by electrochemical measurement of the dye.
  • the present invention is to solve the problem in the above method, in which a nucleic acid probe such as a single-stranded DNA is immobilized on an electrode, and a double-stranded DNA or the like is added when a nucleic acid sample such as a sample DNA is added.
  • This method electrochemically measures whether or not to form a double-stranded DNA, which does not require the use of a dye, enables repeated measurement, and forms the double-stranded DNA with higher accuracy.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting hybridization capable of detecting chromosomes. Disclosure of the invention
  • the present invention that solves the above-mentioned problems is achieved by coexisting a single-stranded nucleic acid probe immobilized on an electrode surface and a single-stranded nucleic acid sample, and then includes the nucleic acid probe and the nucleic acid sample.
  • Detection of hybridization with nucleic acid A method for detecting the hybridization between the target nucleic acid and the nucleic acid probe, which is performed by measuring the AC impedance of the electrode having the probe immobilized thereon.
  • nucleic acid probe is DNA, RNA, or PNA
  • the nucleic acid sample is a gene sample, and the target nucleic acid is a target gene;
  • the target nucleic acid has a nucleotide sequence complementary to a nucleic acid probe
  • the target nucleic acid has at least one mismatch with the nucleic acid probe; in particular, the target nucleic acid has one mismatch with the nucleic acid probe; Measuring the AC impedance after coexisting for hybridization, then bringing the temperature to the range of 80 to 88 ° C, and then returning to room temperature; and
  • the measurement of the AC impedance is preferably performed using a comb-shaped counter electrode.
  • FIG. 1 shows a plan view of a measuring apparatus including a comb-shaped counter electrode.
  • FIG. 2 shows an enlarged view of a comb-shaped counter electrode.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of an AC impedance measuring method.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of an equivalent circuit used for AC impedance measurement.
  • FIG. 5 shows the results of AC impedance measurement in the example.
  • FIG. 6 shows the results of AC impedance measurement (expansion of l to 100 Hz) in the example.
  • a single-stranded nucleic acid probe immobilized on the electrode surface is prepared.
  • the nucleic acid probe can be, for example, DNA, RNA, or PNA.
  • the nucleic acid probe can have, for example, a base sequence complementary to a target nucleic acid such as a target gene to be detected.
  • the base sequence of such a single-stranded nucleic acid probe is determined automatically once the target nucleic acid such as the target gene to be detected is determined, and such a single-stranded nucleic acid probe can be obtained by, for example, a chemical synthesis method.
  • a chemical synthesis method can be prepared. Examples of the chemical synthesis method include, but are not limited to, a phosphoramidite method, a phosphoric acid triester method, and an H-phosphonate method.
  • the number of bases of the single-stranded nucleic acid probe is not particularly limited, but may be, for example, in the range of 20 to 100, and may be appropriately determined in consideration of the number of bases of the target gene to be detected. Can decide.
  • the immobilization of the electrode surface to the single-stranded nucleic acid probe can be performed, for example, by (1) introducing a thiol group to the end of the single-stranded nucleic acid probe, and via a gold-sulfur coordination bond between gold and sulfur. (2) Reactive functional groups such as amino group, carboxyl group, sulfone group, hapten molecule, biotin, avidin, etc. (See Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-79099).
  • (3) the method of immobilizing a single-stranded nucleic acid probe on the electrode surface by physical adsorption (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-199988), Immobilization of
  • the area of the region where the single-stranded nucleic acid probe is immobilized is, for example, ⁇ 4 to 6 ⁇ m, and the amount of the single-stranded nucleic acid probe immobilized on the electrode surface is 400 pmol to 6 It can be in the nmo 1 range. However, it is not limited to these ranges.
  • Examples of electrodes for immobilizing single-stranded nucleic acid probes include noble metal electrodes (for example, gold, platinum, palladium, and rhodium), carbon electrodes, and oxide electrodes (for example, titanium oxide, tin oxide, and manganese oxide). , Lead oxide, etc.) can be used. Further, the electrode for immobilizing the single-stranded nucleic acid probe can be, for example, a comb-shaped counter electrode.
  • FIG. 1 is a plan view of a measuring apparatus including a comb-shaped counter electrode
  • FIG. 2 is an enlarged view of the comb-shaped counter electrode. The apparatus shown in FIG.
  • the apparatus shown in FIG. 1 is provided with, for example, a resin cover except for the comb-shaped counter electrode portion, and the measurement solution supplied to the comb-shaped counter electrode portion is used as another component. Short-circuit with the comb-shaped counter electrode can be prevented.
  • the circular portion provided around the comb-shaped counter electrode in FIG. 2 is a hole for supplying a measuring solution provided on a resin force par.
  • a single-stranded nucleic acid sample is prepared.
  • Nucleic acid sun The pull can be, for example, a genetic sample.
  • nucleic acid samples other than gene samples include nucleic acids contained in blood, leukocytes, serum, urine, feces, semen, saliva, cultured cells, tissue cells, and the like.
  • a nucleic acid sample synthesized as a nucleic acid sample can also be used.
  • the single-stranded denatured gene sample can be obtained, for example, by the following method.
  • TE 10mM Tris / HCl (pH8.0), ImM EDTA
  • Tris (hydroxymethinole) amino methane A single-stranded nucleic acid probe immobilized on the electrode surface and a single-stranded nucleic acid sample are allowed to coexist for hybridization.
  • the nucleic acid sample is a gene sample.
  • the coexistence for the above hybridization can be performed, for example, by dropping a solution containing a single-stranded denatured gene sample onto a single-stranded nucleic acid probe immobilized on the electrode surface.
  • concentration of the gene sample in the solution containing the single-stranded denatured gene sample can be, for example, 10 to 100 / zmol / L.
  • a solution containing a single-stranded denatured gene sample needs to function as an electrolytic solution. Examples of such a solution include various buffers.
  • the buffer is a buffer containing EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), such as Tris buffer containing EDTA (TE buffer), Tris / acetate buffer containing EDTA (TAE buffer), or EDTA. Tris. Borate buffer (TBE buffer), standard sodium citrate buffer (SSC buffer) and the like.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • TBE buffer Tris buffer containing EDTA
  • TBE buffer Tris. Borate buffer
  • SSC buffer standard sodium citrate buffer
  • the hybridization temperature is the melting temperature (Tm)
  • Tm melting temperature
  • Tm can be adjusted by salt temperature or formamide concentration.
  • 1% formamide usually lowers Tm by about 0.6 ° C.
  • the hybridization in the method of the present invention is suitably performed, for example, at a temperature of 37 to 72 ° C.
  • measure the AC impedance of the electrode on which the nucleic acid probe is immobilized The measurement of the AC impedance can be performed as shown in FIG. Figure 3 shows the concept of the method for measuring whether the single-stranded DNA (probe DNA) immobilized on the gold electrode hybridized with the single-stranded DNA dropped on the sample from the AC impedance (Z).
  • a gold electrode is provided on the surface of a glass substrate, and there is a region on which a nucleic acid probe is fixed. Then, an electrolytic solution containing the target gene is dropped into the region where the nucleic acid probe is immobilized, and the mixture is placed under predetermined hybridization conditions. Specifically, for example, 40 ⁇ L (10 ⁇ 1 / L) of probe DNA with an SH group attached to the 5fe end is fixed onto the gold electrode by dropping, and the sample DNA is also 10 ⁇ L. Add 40 ⁇ L of mo1 / L. The diameter of the TE solution on the gold electrode is 4 mm (12.6 mm 2 ).
  • a platinum electrode as a counter electrode is brought into contact with the electrolyte, and for example, an AC impedance between a frequency of 0.01 Hz and 1 MHz is applied between the gold electrode and the platinum electrode.
  • the measurement of the AC impedance can be performed at room temperature. For example, when measuring the effect of temperature on hybridization, the measurement temperature can be appropriately changed.
  • Figure 4 shows the measurement of the AC impedance (Z) between the two electrodes in contact with the electrolyte. 5 shows an electrical equivalent circuit in a constant.
  • the interface 1 shows the state when the probe DNA and the sample DNA hybridize.
  • the impedance of the electrode, the interface 1, the electrolyte (TE solution), the interface 2, and the counter electrode is reduced.
  • the equation in the figure indicates the reaction resistance at the electrode interface, the resistance of the electrolyte, the capacitance, etc., and Z w in the figure is the so-called Warburg impedance, which indicates the diffusion of species that react at the electrode interface.
  • the species that react electrically include the electric conduction process in the cell, the Faraday charge transfer process, and the double-layer charging process.
  • the impedances corresponding to these electrochemical processes behave the same as simple passive elements such as resistors and capacitors (apart from Z w).
  • the reaction resistance at the interface 1 the resistance of the double layer, the solution, and the like can be obtained from the equations in the figure. Also, by decoding the low-frequency side below Equation 1 OKHz, it is possible to obtain the diffusion information of ions at the fixed probe DNA interface. Therefore, at interface 1, a reaction occurs as to whether or not the probe DNA and the sample DNA hybridize. Therefore, the presence or absence of hybridization can be analyzed by the AC impedance measurement method. The results obtained by the impedance measurement are generally displayed as a Bode plot or a complex plane plot (Cole-Cole-plot).
  • the horizontal axis is the frequency and the vertical axis is the logarithm of the absolute value of the impedance, showing the relationship between the frequency and the absolute value of the impedance.
  • the solution resistance Rsol is obtained from the high frequency band (several hundred kHz or more), the double layer capacitance Cdl from the middle frequency band (several lOOmHz to several kHz), and the reaction resistance r from the low frequency band (several lOOmHz or less).
  • the complex plane display Cold-Cole-plot
  • the imaginary component z '' is plotted on the axis.
  • the measured frequency is added to the plotted point, and Rsol, Cdl, and r can be obtained from the complex plane display as in 1.
  • Rsol, Cdl, and r can be obtained from the complex plane display as in 1.
  • the detection of the hybridization will be described in detail in Examples.
  • the resistance value r is obtained from the results shown in the above port diagram display (for example, the results shown in FIG. 5), and the hybridization is detected. Since r fluctuates depending on the presence or absence of the hybridization, hybridization can be detected.
  • the result at the same frequency depends on the presence or absence of hybridization. Since the absolute value of the impedance fluctuates, the hybridization can be detected.
  • hybridization can be detected as follows.
  • the optimal conditions for hybridization depend on the nucleotide sequence, length, nucleic acid concentration, etc. of the nucleic acid probe used.
  • the hybridization temperature is about 25 ° C lower than the melting temperature, usually in the range of 37 to 72 ° C.
  • the temperature is brought to a range of 80 to 88 ° C., and then the AC impedance is measured, and the hybridization can be detected as follows.
  • the target gene having a mismatch with the nucleic acid probe is dissociated from the nucleic acid probe. Therefore, the measurement results of AC impedance before and after the above temperature treatment (resistance) Appears in the image, and the presence of the mismatch can be detected.
  • the optimal temperature within the range of 80 to 88 ° C. can be appropriately determined according to the length and the base sequence of the target gene and the nucleic acid probe. Example .
  • the base sequence of the oligo DNA used is as follows.
  • aO Trp64 (fat-reduced type) gtggccatcgcctggactccgagac (SEQ ID NO: 1)
  • bO Arg64 (fat storage type) gtggccatcgcccggactccgagac (SEQ ID NO: 2)
  • al DNA complementary to Trp64 caccggtagcggacctgaggctctg (SEQ ID NO: 3)
  • bl Arg64 and complementary DNA Only one central base differs. (One is a lean type and the other is an obese type due to the difference of only one base.)
  • the combination of a0-a1 is a hybridizing yarn, and the combination of aO-bl is a non-hybridizing combination.
  • the impedance was measured while automatically sweeping the frequency from 0.01 Hz to 1 MHz.
  • the impedance / gain-phase analyzer 1260 manufactured by Solartron was used as the AC impedance measuring device.
  • Figure 5 shows the measurement results.
  • Fig. 5 (1) shows the results when only the gold electrode was used, (2) shows the results when TrpSH (aO) was immobilized as the probe DNA on the gold electrode, and (3) immobilized TrpSH (aO) as the probe DNA.
  • (4) is the result of hybridization of b1 with a single base difference to a gold electrode on which TrpSH (aO) was immobilized as probe DNA.
  • Is the result of The results of the AC impedance measurement shown in Fig. 5 are shown in a Bode diagram, where the horizontal axis is the frequency and the vertical axis is the logarithm of the absolute value of the impedance, showing the relationship between the frequency and the absolute value of the impedance.
  • the resistance r can be obtained by extrapolating this graph to the low frequency side.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • r ( ⁇ ) indicates the reaction resistance (charge transfer resistance) at the gold electrode interface where the probe DNA is immobilized. The measurement was performed between the gold electrode and the TE solution both when using only the gold electrode and when DNA was fixed on the gold electrode.
  • table 1 From Table 1, the reaction resistance r at the gold electrode interface is 3.6 ⁇ for the gold electrode only (when no DNA is present) and 3.7 3. ⁇ for the probe DNA only.
  • the r when hybridized is 5.1 ⁇ , and the r for a mismatched junction that does not originally hybridize is 5.1 ⁇ .
  • mismatched junctions can be converted to single-stranded DNA by heat treatment at 80 to 88 ° C, and those that have hybridized normally cannot be converted to single-stranded DNA at this temperature.
  • the presence or absence of hybridization can be determined by measuring after performing the temperature treatment described above.
  • the presence / absence of hybridization and the presence / absence of mismatch can be determined without using a labeling substance used for identifying double-stranded DNA. .
  • Fig. 6 shows the result of Fig. 5 expanded for the frequency range of 1 to 10 OHz. From the results in Fig. 6, the presence or absence of Can be specified.
  • heat treatment was performed at 84-88 ° C for 10 minutes, then the temperature was returned to room temperature.
  • the results of AC impedance measurement also showed that the frequency ranged from 1 to 10 OHz. Then, it is possible to determine the presence or absence of a mismatch.
  • a nucleic acid probe such as a single-stranded oligo DNA is immobilized on an electrode, and it is determined whether a double-stranded DNA or the like is formed when a nucleic acid sample such as a sample DNA is added.
  • a method of chemical measurement that does not require the use of dyes, can be repeated, and can detect the formation of double-stranded DNA with higher accuracy.
  • a detection method can be provided.

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Abstract

一本鎖オリゴＤＮＡ等の核酸プローブを電極上に固定し、検体DNA等の核酸サンプルを添加した際に２本鎖DNA等の２本鎖を形成するか否かを電気化学的に測定する方法であって、色素の使用が不要で、繰り返し測定が可能で、より高い確度で２本鎖DNAの２本鎖の形成を検出することができるハイブリダイゼーションの検出法を提供する。電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、一本鎖に変性された核酸サンプルとを共存させた後、前記核酸プローブと前記核酸サンプルに含まれる目的核酸とのハイブリダイズの検出を、核酸プローブを固定化した電極の交流インピーダンスを測定することにより行う、前記目的核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法を開示する。

Description

明細書
ハイブリダイゼーションの検出方法 技術分野
本発明は、 遺伝子サンプルに含まれる目的遺伝子等の目的核酸と核酸プロ一 ブとのハイブリダィゼーションを検出し、 サンプル中に存在する特定の遺伝子- 等を特異的に検出するための方法に関する。 背景技術
遺伝子 （D N A) に刻み込まれた遺伝情報は、 メッセンジャー R NAを介し て蛋白質あるいは酵素として表現される。 この蛋白質や酵素の働きにより、 生 命の維持に必要な様々な化合物の生合成おょぴ代謝が行なわれる。このように、 遺伝子に支配された多様な物質の動的平衡系として、 生物が存在している。 ヒトゲノムプロジヱクトの成果として、 ヒトの遺伝子の総数は約 3万である ことが解明された。 これら遺伝子の中に、 例えば欠損や重複のような何等かの 異常や変化が生じると、生成される蛋白質の特性、種類および量などが変化し、 結果として生体系のバランスが崩れて疾病を引き起こす。 従って、 逆に病因と なる既知の遺伝子を検出することによって、 疾患の同定や予防が可能である。 このような診断を遺伝子診断と呼ぶ。 遺伝子発現の機構を考えると、 殆どの生化学レベルでの変化に先行して、 遺 伝子上での変化が生じていることが推定される。 従って、 遺伝子変化の検出に よる遺伝子診断では、 病気という表現型での変化に先だって、 即ち、 発症前や 病気の潜伏期あるいは極めて初期の段階で、 診断や予測ができる。 さらに、 生 体内の細胞では遺伝子は全て同一であるので、 遺伝性の疾患に関する遺伝子診 断法は、 分析する臓器や組織に依存しない。 このことは、 特に胎児での診断で は重要であり、 妊婦から羊水を採取し、 羊水中に浮遊している胎児の細胞を調 ベるだけで診断を行なうことが可能となる。 . 遺伝子診断法において使用可能な遺伝子検出法が幾つか提案されている。 そ の中で、 安全性および簡便性に優れると共に、 短時間で目的とする遺伝子の有 無を高感度に検出することを目的として、 特開平 6— 7 0 7 9 9号公報 （特許 文献 1 )及び特許第 2 5 7 3 4 4 3号公報（特許文献 2 )に記載の方法がある。 この遺伝子検出法は、 試料から抽出し、 一本鎖に変性された遺伝子サンプル を、 検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プ ローブと反応させた後、 遺伝子とハイブリダィズされた前記核酸プローブを検 出することによって前記目的遺伝子の存在を確認する遺伝子検出法である。 こ の方法では、 前記核酸プローブを電極表面、 または光ファイバ先端に固定化し て用いることと、 二本鎖核酸に特異的に結合し、 且つ電気化学的または光化学 的に活性な二本鎖認識体を、 前記核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に 添加することと、 さらに、 前記電極または前記光ファイバを介した電気化学的 または光化学的な測定により、 前記核酸プローブと目的遺伝子との二本鎖核酸 に結合した二本鎖認識体を検出することにより、 目的遺伝子とハイブリダイズ された前記核酸プローブの存在を検出する。 しかるに、 上記特許文献 1及び 2に記載の方法にも以下の問題がある。
上記の方法では、 一本鎖オリゴ D N Aを電極上に固定し、 検体 DNAを滴下し た時に 2本鎖 DNAとなるか否かを、 2本鎖 DNAに特異的にィンタ一力レーショ ンする色素を電気化学的な酸化還元反応から検出するものである。 使用される インターカレーシヨンする色素の酸化、 還元電位とピーク電流値の測定は、 電 位のスイープ速度に影響され、 その上、 ほぼ一回の測定で色素が酸化されてし まうため繰り返し測定ができない。 その結果、 測定確度の低下を招く。 また、 色素が一本鎖オリゴ D N Aや電極に固定化されることがあり、 色素の電気化学 的な測定で 2本鎖 DNAとなったか否かを検出することが困難な場合がある。 ま た、 残存する色素が電気化学的な測定に影響を与える場合もある。 そこで本発明は、 上記方法における問題を解決するものであり、 一本鎖オリ ^D N A等の核酸プローブを電極上に固定し、 検体 DNA等の核酸サンプルを添 加した際に 2本鎖 DNA等の 2本鎖を形成するか否かを電気化学的に測定する方 法であって、 色素の使用が不要で、 繰り返し測定が可能で、 より高い確度で 2 本鎖 DNAの 2本鎖の形成を検出することができるハイブリダィゼーションの検 出法を提供することを目的とする。 発明の開示
上記課題を解決する本発明は、 電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブ と、 一本鎖に変性された核酸サンプルとを共存させた後、 前記核酸プローブと 前記核酸サンプルに含まれる目的核酸とのハイブリダイズの検出を、 核酸プロ ーブを固定化した電極の交流インピーダンスを測定することにより行う、 前記 目的核酸と核酸プローブとのハイプリダイゼーションを検出する方法である。 上記本発明においては、
核酸プローブが D N A、 R N Aまたは P N Aであること、
前記核酸サンプルが、 遺伝子サンプルであり、 目的核酸が目的遺伝子である こと、
前記目的核酸が核酸プローブと相補的な塩基配列を有すること、
前記目的核酸が核酸プローブに対して少なくとも 1つのミスマッチを有す ること、 特に、 前記目的核酸が核酸プローブに対して 1つのミスマッチを有す ること、 この場合、 前記核酸プローブと核酸サンプルとをハイブリダィズのた めに共存させ、 次いで、 温度を 8 0〜 8 8 °Cの範囲にし、 次いで室温に戻した 後に、 前記交流インピーダンスの測定を行うこと、 及び
前記交流インピーダンスの測定を、 櫛形の対向電極を用いて行うことが好ま しレ、。 図面の簡単な説明
図 1は、 櫛形の対向電極を含む測定装置の平面図を示す。
図 2は、 櫛形の対向電極の拡大図を示す。
図 3は、 交流インピーダンス測定方法の説明図である。
図 4は、 交流インピーダンス測定に用いられる等価回路の説明図である。 図 5は、 実施例における交流インピーダンス測定結果である。
図 6は、 実施例における交流ィンピーダンス測定結果 （l〜1 0 0 H zを拡 大した結果） である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法では、 電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブを用意する。 核酸プローブは、 例えば、 D N A、 R N Aまたは P N Aであることができる。 核酸プローブは、 例えば、 検出すべき目的遺伝子等の目的核酸に対して相捕的 な塩基配列を有するものであることができる。
.そのような一本鎖の核酸プローブは、 検出すべき目的遺伝子等の目的核酸が 定まれば、その塩基配列は自ずと決まり、そのような一本鎖の核酸プローブは、 例えば、 化学合成法により用意することができる。 化学合成法としては、 例え ば、 ホスホルアミダイト法、 リン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法等を 挙げることができるが、 これらに限定されない。
一本鎖の核酸プローブの塩基数には、 特に制限はないが、 例えば、 2 0〜1 0 0 0の範囲であることができ、検出すべき目的遺伝子の塩基数等を考慮して、 適宜決定できる。 上記一本鎖の核酸プローブへの電極表面の固定化は、 例えば、 （1 ) 一本鎖 の核酸プローブの末端にチオール基を導入し、 金と硫黄との金—硫黄配位結合 を介して D N Aを電極に固定化する方法（特開平 9一 2 8 8 0 8 0号公報参照）、 ( 2 ) アミノ基、 カルボキシル基、 スルホン基等の反応性官能基、 ハプテン分 子、 ビォチン、 アビジン等の物質で修飾して固定化する方法 （特開平 6— 7 0 7 9 9号公報参照） を挙げることができる。 あるいは、 （3 ) —本鎖の核酸プ ロープを物理吸着により電極表面へ固定化する方法 （特開平 5— 1 9 9 8 9 8 号公報参照） により、 一本鎖の核酸プローブへの電極表面の固定化を行うこと もできる 一本鎖の核酸プローブを固定化してある領域の面積は、 例えば、 Φ 4〜6 ιη m、 電極表面の固定化される一本鎖の核酸プローブの量は、 4 0 0 p m o l〜 6 n m o 1の範囲とすることができる。 但し、 これらの範囲に限定されるもの ではない。 一本鎖の核酸プローブを固定化する電極としては、 例えば、 貴金属電極 （例 えば、 金、 白金、 パラジウム、 ロジウム等） 、 カーボン電極、 酸化物電極 （例 えば、 酸化チタン、 酸化スズ、 酸化マンガン、 酸化鉛等） 等を用いることがで きる。 さらに、 一本鎖の核酸プローブを固定化する電極は、 例えば、 櫛形の対 向電極とすることができる。 櫛形の対向電極を含む測定装置の平面図を図 1に 示し、 櫛形の対向電極の拡大図を図 2に示す。 図 1に示す装置には、 1〜8の 櫛形の対向電極が設けられ、 櫛形の対向電極を構成する 2つの電極は、 それぞ れ端子 2 0または 2 1と 1 1〜1 8のいずれかの端子に接続している。 端子 2 0及び 2 1並びに端子 1 1〜1 8は、交流インピーダンス測定装置に接続する。 また、 図 1に示す装置は、 図示されていないが、 櫛形の対向電極の部分以外 は、 例えば、 樹脂製のカバーが設けられ、 櫛形の対向電極の部分に供給された 測定用溶液が他の櫛形の対向電極と短絡するのを防止することができる。 図 2 の櫛形の対向電極の周囲に設けられた円部が樹脂製の力パーに設けられた測定 用溶液供給用の孔である。 本発明の方法では、 一本鎖に変性された核酸サンプルを用意する。 核酸サン プルは、 例えば、 遺伝子サンプルであることができる。 遺伝子サンプル以外の 核酸サンプルとして、 血液、 白血球、 血清、 尿、 糞便、 精液、 唾液、 培養細胞、 組織細胞等中に含まれる核酸を挙げることができる。 あるいは、 核酸サンプル として合成した核酸サンプルも用いることができる。 一本鎖に変性された遺伝子サンプルは、 例えば、 以下の方法により入手する ことができる。
く SD S/フヱノール法による DNAの精製 >
(1) 細胞を 50 mLチューブにいれる。
(2) リシスバッファー 10 mL、 プロテナーゼ K溶液 0. lmLを加え、 ゆつ • く りと振とうしながら 55°Cで 8時間インキュベートする。
(3) Tris/フエノールを 10mL加え、 30rpmで 1時間ゆっく り混合する。
(4) 3000rpm 10分間、 室温で遠心後、 広口のピペットで慎重に回収し、 新 しいチューブに移す。
(5) lOmL のフエノール Zクロ口ホルムを加え、 1時間ゆるやかに混合し、 3000rpmで 10分間、 室温で遠心する。
(6) 広口のピペットで水層を慎重に回収し、新しいチューブに移す。 フエノ ール /クロロホルム抽出をタンパク質層が無くなるまで繰り返す。
(7) 20mLの 100%エタノールをチューブの壁面に沿わせながら静かに重層 する。
(8) ガラス棒を水層とエタノール層の界面に挿入してゆつく りとかき回し、 析出した DNAを巻き取る。
(9) 70%エタノール 20mLの中に DNAを 30秒浸してリンスする。 ガラス棒 についた DNAを風乾する。
(1 0) 50mLのチューブに TEを 10mLとり、 卷き取った DNAを浸す。
(1 1) 4 °Cで一晩ゆるやかに振とう/攪拌して DNAを溶かす。
(1 2) RNaseAを終濃度 40 μ g/mLに加え、 37°Cで 1時間インキュベートす る。
(1 3) 分注して - 20°Cで保存する。
<DNA精製キットを用いる精製 >QIAGEN社 #69504 DNeasy Tissue Kit など
(1) 細胞を 50mLチューブに入れ、 180 Lの ATLバッファーを加える。
(2) プロティナーゼ Kを 20 加えて、 55°Cで保温しながら 1〜 3時間振と うし組織を完全に溶かす。
(3) 15秒間ボルテックスした後、 200 μ Lの ALバッファーを加えてよく混合 し、 70°Cで 10分間インキュベートする。
(4) 200/xLのエタノールを加えよく混合する。 .
(5) ピペットで全量 2mL サンプリングチューブにセットしたスピンカラム に移し、 1分間遠心後、 濾液の入ったサンプリングチューブを捨てる。
(6 ) スピンカラムを新しいサンプリングチューブにセットし、 500 の AWI バッファーを入れる。
(7) 1分間遠心後、 濾液の入ったサンプリングチューブを捨てる。
(8) スピンカラムに再度新しいサンプリングチューブをセッ トし、 500 し の AW2パッファーを入れる。
(9) 3分間 15000rpmで遠心し、 カラムから水分をできるだけ除く、 遠心後 濾液の入ったサンプリングチューブは捨てる。 (1 0) スピンカラムをエツペンチューブにセッ トし、 200 しの AEバッファ 一をピペットで直接シリカ膜上に载せ、 1分間放置する。
(1 1) 1分間遠心し、 濾液 （精製 DNA) を得る。
<制限酵素による断片化 >
(1) 1ひ のゲノム DNAが入ったエツペンチューブに、 10X制限酵素バッフ ァ （BSAまたは triton— X) を 40μ1、 制限酵素を 100〜1000unit加 え、 SP水で 400 /zLにする。
(2) 制限酵素の最適温度で 8時間以上反応させる。
(3) 400 μ L のフエノール/クロ口ホルムを加え、 ボルテックスミキサ一で 攪拌する。
(4) 室温、 15000rpm、 5分間遠心する。
(5) ピペットマンで上層を新しいエツペンチューブに移す （ （3) 、 （4) の繰り返し） 。
(6) 上層に 40 の 3M酢酸ナトリウムと ImLの冷 100%エタノールを加え、 混ぜる。 4°C、 15000rpm、 20分間遠心する。
(7) エタノールを捨て、 沈殿に 70°/。エタノールを加え、 4°C、 15000rpm、 5 分間遠心してリンスする。
(8) エタノールを捨て遠心乾燥機で乾燥させ、 lO^Lの TEに溶かす。
T Eは 10mM Tris/HCl (pH8.0)， ImM EDTA
Tris (ヒドロキシメチノレ）ァミノメタン 電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、 一本鎖に変性された核酸サ ンプルとを、 ハイプリダイゼーシヨンのために共存させる。 以下、 核酸サンプ ルが遺伝子サンプルの場合を例に説明する。
上記ハイブリダィゼーシヨンのための共存は、 例えば、 一本鎖に変性された 遺伝子サンプルを含む溶液を、 電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブ上 に滴下することで行うことができる。 一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含 む溶液中の遺伝子サンプルの濃度は、 例えば、 10〜100 /zmo l/Lとす ることができる。 また、 一本鎖に変性された遺伝子サンプルを含む溶液は、 電解液として機能 することが必要であり、 そのような溶液としては、 種々のバッファーを挙げる ことができ、 特に、 DNA分解酵素阻害剤である EDTA (エチレンジァミン 四酢酸） を含有する緩衝液であることが好ましく、 例えば、 EDTAを含むト リス緩衝液 （TEバッファー） 、 EDTAを含むトリス ·酢酸塩緩衝液 （TA Eバッファー）、 EDTAを含むトリス.ホウ酸塩緩衝液（T BEバッファー）、 標準クェン酸ナトリウム緩衝液 （S S Cバッファー） などを挙げることができ る。 核酸プローブと核酸サンプルとのハイブリダイズの条件は、 通常のハイプリ ダイゼーシヨンと同様である。 ハイブリダィゼーシヨンの最適温度、 塩濃度、 ホルムアミ ドを用いる場合はその濃度等は、 用いる核酸プローブの塩基配列及 び長さ、 核酸サンプルの種類と核酸サンプルに含まれる目的核酸の種類及ぴ配 列等に依存する。 一般には、ハイブリダィゼーシヨンの温度は融解温度 （Tm) より約 2 5 °C低い温度が用いられる。 Tmは、 塩温度またはホルムアミ ド濃度 により調節可能である。 例えば、 通常 1 %ホルムアミ ドは Tmを約 0. 6°C下 げる。本発明の方法におけるハイブリダィゼーシヨンは、例えば、 3 7〜7 2°C の範囲で行われることが適当である。 ハイブリダィズを行った後、 核酸プローブを固定化した電極の.交流インピ.一 ダンスを測定する。 交流インピーダンスの測定は、 図 3に示すようにして行う ことができる。 図 3は金電極上に固定された一本鎖 DN A (プローブ DNA) が、 その上に滴下された検体一本鎖 D N Aとハイブリダィズしたか否かを交流 インピーダンス （Z) から測定する方法の概念図を示している。 図 3中、 ガラ ス基板の表面に金電極が設けられ、 その上に核酸プローブが固定されている領 域が有る。 そして、 核酸プローブが固定されている領域に、 目的遺伝子を含有 する電解液を滴下して、 所定のハイブリダィゼーシヨン条件に置く。 具体的に は、 例えば、 金電極上には端 5feに SH基が付けてあるプローブ DNAを 40 μ L (1 0 μ πιο 1 /L) 滴下して固定されており、 検体 DNAも 1 0 μ m o 1 /Lのものを 4 0 μ L滴下する。 金電極上の TE溶液の径は 4 mm (1 2. 6 mm2) である。 ハイプリダイゼーシヨン条件においた後、 電解液に対極とな る白金電極を接触させて、 金電極と白金電極との間で、 例えば、 周波数 0. 0 1 H zから 1MH zまでの交流インピーダンスを測定する。 交流インピーダン スの測定は、 室温で行うことができるが、 例えば、 ハイブリダイズへの温度の 影響を測定する場合などは、 測定温度を適宜変更することができる。 図 4に電解液が接触している 2つの電極間の交流インピーダンス （Z) の測 定における電気的等価回路を示す。
図 4において、 界面 1がプローブ D N Aと検体 D N Aとがハイブリダィズす る時の状態を示しており、 本測定法では電極、 界面 1、 電解液 （T E液） 、 界 面 2、 対向電極のインピーダンスが測定できる。 図中の式は電極界面の反応抵 抗ゃ電解液の抵抗、 静電容量等を示す式であり、 図中の Z wは電極界面で電極 反応する種の拡散などを表すワールブルグインピーダンスと呼ばれるものであ り、 電気反応する種とはセル内の電気伝導過程、 ファラデー電荷移動過程、 二 重層充電過程等である。 これら電気化学的過程に対応するィンピーダンスは、 抵抗やコンデンサのような簡単な受動素子と同じ振る舞いをする（ Z wは別）。 すなわち、 図中の式より界面 1での反応抵抗や二重層、 溶液の抵抗等を求める ことが出来る。 また、 数 1 O K H z以下の低周波側を解読することにより、 固 定化されたプローブ D N A界面でのイオンの拡散情報を得ることが出来る。 従 つて、 界面 1ではプローブ D N Aと検体 D N Aがハイブリダィズするか否かの 反応が起きるため、 ハイブリダィズの有無を交流インピーダンス測定法から解 析できる。 インピーダンス測定によって得られた結果は、 一般に①ボード線図表示また は②複素平面表示 （Cole- Cole- plot) される。 ①のボード線図表示では、 横軸 は周波数、 縦軸はインピーダンスの絶対値の対数であり、 周波数とインピーダ ンスの絶対値の関係がわかる。 高周波数（数 100kHz 程度以上）帯から溶液抵抗 Rsol、 中間の周波数帯（数 lOOmHz〜数 kHz程度）から二重層容量 Cdl、 低周波数 帯（数 lOOmHz程度以下）から反応抵抗 r等がそれぞれ求まる。②の複素平面表示 (Cole-Cole- plot) では、 インピーダンス（Z=Z， + jZ， ， ）の実数成分 Z， を横 軸に、 虚数成分 z' ' を縦軸に描いたものである。 周波数との関係が読み取り にくいため、 プロットした点に測定周波数を付記し、 ①と同様に複素平面表示 により、 Rsol、 Cdl、 rをそれぞれ求めることができる。 電解液が接触している 2つの電極間の交流インピーダンスの内、 数 1 0 KH z以下の低周波数域を解読することにより、 電極に固定化された核酸プローブ 界面におけるイオンの拡散情報を得ることができ、 上記交流インピーダンスを 測定することにより、 目的遺伝子と核酸プローブとのハイプリダイゼーシヨン を検出することができる。
ハイブリダィゼーシヨンの検出は、 実施例で詳述するが、 例えば、 上記ポー ド線図表示で表された結果（例えば、図 5に示す結果）から、抵抗値 rを求め、 ハイブリダィゼーシヨンの有無によって rが変動することから、 ハイプリダイ ゼーションを検出できる。
あるいは、 ボード線図表示で表された結果であって、 l〜100Hzのデータを拡 大した結果 （例えば、 図 6に示す結果） において、 ハイブリダィゼーシヨンの 有無によつて同一周波数でのィンピーダンスの絶対値が変動することから、 ハ イブリダィゼーシヨンを検出できる。 目的遺伝子が核酸プローブと相補的である場合、 以下のようにハイブリダィ ゼーシヨンを検出することができる。
ハイプリダイゼーシヨンの最適条件は、 前述のように、 用いる核酸プローブ の塩基配列、 長さ、 核酸濃度等に依存する。 一般に、 ハイブリダィズの温度は 融解温度より約 2 5 °C低い温度が用いられ、 通常、 3 7〜 7 2 °Cの範囲で行う ことができる 目的遺伝子が核酸プローブに対して少なくとも 1つのミスマッチを有する場 合、特に、目的遺伝子が核酸プローブに対して 1つのミスマッチを有する場合、 例えば、 核酸プローブと目的遺伝子とのハイプリダイズさせるための反応を行 つた後、 温度を 8 0〜8 8°Cの範囲にした後に、 交流インピーダンスの測定を 行い、 以下のようにハイブリダィゼーシヨンを検出することができる。 温度を 8 0〜8 8°Cの範囲にすることで、 核酸プローブに対してミスマッチを有する 目的遺伝子は、 核酸プローブから解離するので、 上記温度処理の前後で交流ィ ンピーダンスの測定結果 （抵抗） に変化が現れ、 ミスマッチの存在を検出でき る。 上記温度を 8 0〜8 8°Cの範囲内のどの温度にするのが最適かは、 目的遣 伝子及び核酸プローブの長さや塩基配列に応じて適宜決定できる。 実施例 .
以下、 本発明の方法を実施例によりさらに説明する。
(実施例）
図 3に示す装置において、 プローブ DNA= aO が固定されている金電極上 に、 検体 DNA= a l もしくは b lを滴下し、 4 3 °Cの雰囲気中に 1時間程度 放置することによってハイプリダイズ処理をする。 使用したオリゴ DNAの塩 基配列は以下の通りである。
aO = Trp64 (脂肪減少型） gtggccatcgcctggactccgagac (配列番号 1 ) bO = Arg64 (脂肪蓄積型） gtggccatcgcccggactccgagac (配列番号 2 ) al = Trp64と相補的な DNA caccggtagcggacctgaggctctg (配列番号 3) bl=Arg64とネ目補的な DNA caccggtagcgggcctgaggctctg (配歹 [J番号 4 ) a 0=Trp64と b 0=Arg64とでは中心の一塩基だけが異なっており、これらに対 応した相捕的 DNAも中心の一塩基だけが異なる。 （たった一塩基の違いで一 方はやせ型となり、 他方は肥満型となる。 ）
. ここで、 a 0— a 1 の組合せはハイブリダィズする糸且合せであり、 aO—bl の組合せはハイブリダイズしない組合せである。
ハイブリダィズ処理をした後、 周波数を 0. 0 1 H zから 1MH zまで自動 掃引しながらインピーダンスを測定した。 交流インピーダンス測定装置にはソ 一ラートロン社製インピーダンス/ゲイン一フェイズ ·アナライザー 1 260 型を用いた。 測定結果を図 5に示す。
図 5中、 （1) は金電極のみの結果、 （2) は金電極にプローブ DNAとし て TrpSH (aO) を固定化した場合の結果、 （3) はプローブ D N Aとして TrpSH (aO) を固定化した金電極に完全相補性の a 1をハイブリダィズさせた場合の 結果、 （4) はプローブ DNAとして TrpSH (aO) を固定化した金電極に 1塩 基違いの b 1をハイプリダイズさせた場合の結果である。 図 5に示す交流インピーダンス測定の結果は、 ボード線図表示したものであ り、 横軸は周波数、 縦軸はインピーダンスの絶対値の対数であり、 周波数とィ ンピーダンスの絶対値の関係がわかる。
このグラフを低周波側へ外揷することにより、 抵抗 rを求めることができる。 その結果を表 1に示す。 表中 r (ΜΩ) はプローブ DNAが固定されている金 電極界面の反応抵抗 （電荷移動抵抗） を示している。 なお、 測定は金電極のみ の場合も金電極上に DNAが固定してある場合も、 金電極と T E溶液間で実施 している。 表 1
Figure imgf000018_0001
表 1より、 金電極界面の反応抵抗 rは、 金電極のみの場合は （DNAが存在 しない場合） 、 3. 6ΜΩ、 プローブ DNAのみの場合の rは 3. 7ΜΩ、 プ ローブ DNAと検体 DNAがハイブリダィズした時の rは 5. 1ΜΩ、 本来な らハイプリダイズしないミスマッチ接合の場合の rは 5. 1ΜΩである。 これから明らかであるように、 ハイブリダィズしない場合とハイプリダイズ したものの rの間にははつきりと差があり、 ハイブリダィズした場合は、 rは 大きくなる。 一方、 ハイプリダイズしたものとミスマッチ接合の場合は rに差 は見られない。 しかし、 ミスマッチ接合は 80〜88°Cの熱処理を施すことに よって一本鎖 DNAとすることができ、 正規にハイブリダイズしたものはこの 温度では一本鎖 DN Aとすることができないので、 所定の温度処理をした後に 測定することによってハイブリダィズの有無を判定することが出来る。 上記の点を確認するために、ハイプリダイズ後、 84〜88°Cで熱処理を 1 0分間行った後に、 上記と同様にして周波数を 0. 01 Hzから 1 MHzまで 自動掃引しながらインピーダンスを測定した。 得られた交流インピーダンス測 定結果から求めた抵抗値 rを以下の表 2に示す。 表 2
Figure imgf000019_0001
完全相補性 （ホモ接合） である a 0— a 1では、 r (ΜΩ) が 5. 1と表 1 の結果と変化なかったのに対して、 1塩基ミスマッチ接合 （ヘテロ接合） であ る a 0— b lでは、 r (ΜΩ) が 3. 7となり、 ハイブリダィゼーシヨンが解 消していることが分かる。
これらの結果から、 本発明の方法によれば、 二本鎖 DNAを識別するために 用いられている標識物質を使用しなくてもハイブリダィズの有無やミスマッチ の有無を判定することが出来ることが分かる。
なお、 上記測定は、 それぞれ 5回繰り返し実施したが、 ほぼ同じ測定結果が 得られた。 上記表 1及ぴ 2に示すように、 交流インピーダンス測定結果から求めた抵抗 値 を比べることで、 ハイブリダイズの有無やミスマッチの有無を判定するこ とが出来るが、 それ以外にもハイブリダイズの有無やミスマッチの有無を判定 することが出来る。 例えば、 図 6に図 5の結果を、 周波数が 1〜10 OHzの 範囲について拡大した結果を示す。 図 6の結果からハイプリダイズの有無を判 定することが出来る。 また、 ハイブリダィズ後、 8 4〜8 8 °Cで熱処理を 1 0 分間行った後に室温に戻し、 交流インピーダンス測定を行った結果からも、 周 波数が 1〜1 0 O H zの範囲の結果に注目すれば、 ミスマッチの有無を判定す ることが出来る。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 一本鎖オリゴ D N A等の核酸プローブを電極上に固定し、 検体 DNA等の核酸サンプルを添加した際に 2本鎖 DNA等の 2本鎖を形成するか 否かを電気化学的に測定する方法であって、 色素の使用が不要で、 繰り返し測 定が可能で、 より高い確度で 2本鎖 DNAの 2本鎖の形成を検出することができ るハイプリダイゼーシヨンの検出法を提供することができる。

Claims

請求の範囲
1 電極表面に固定化した一本鎖の核酸プローブと、 一本鎖に変性された核酸 サンプルとを共存させた後、 前記核酸プローブと前記核酸サンプルに含まれる 目的核酸とのハイブリダィズの検出を、 核酸プローブを固定化した電極の交流 インピーダンスを測定することにより行う、 前記目的核酸と核酸プローブとの ハイブリダィゼーシヨンを検出する方法。
2 核酸プローブが D N A、R N Aまたは P N Aである請求項 1に記載の基板。
3 前記核酸サンプルが、 遺伝子サンプルであり、 目的核酸が目的遺伝子であ る請求項 1または 2に記載の方法。
4 前記目的核酸が核酸プローブと相補的な塩基配列を有する請求項 1〜3の いずれか 1項に記載の方法。
5 前記目的核酸が核酸プローブに対して少なくとも 1つのミスマッチを有す る請求項 1 ~ 3のいずれか 1項に記載の方法。
6 前記目的核酸が核酸プローブに対して 1つのミスマッチを有する請求項 5 に記載の方法。
7 前記核酸プローブと核酸サンプルとをハイプリダイズのために共存させ、 次いで、 温度を 8 0〜8 8 °Cの範囲にし、 次いで室温に戻した後に、 前記交流 ィンピーダンスの測定を行う請求項 5または 6に記載の方法。
8 前記交流インピーダンスの測定を、 櫛形の対向電極を用いて行う請求項 1 〜 7のいずれか 1項に記載の方法。
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