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WO2003106675A1 - 翻訳テンプレートおよびそのライブラリー、それらから合成される蛋白質および蛋白質のライブラリー、ならびにそれらを構成する要素、ならびにそれらの製造法および利用方法 - Google Patents

翻訳テンプレートおよびそのライブラリー、それらから合成される蛋白質および蛋白質のライブラリー、ならびにそれらを構成する要素、ならびにそれらの製造法および利用方法 Download PDF

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WO2003106675A1
WO2003106675A1 PCT/JP2003/007508 JP0307508W WO03106675A1 WO 2003106675 A1 WO2003106675 A1 WO 2003106675A1 JP 0307508 W JP0307508 W JP 0307508W WO 03106675 A1 WO03106675 A1 WO 03106675A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
region
translation
molecule
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2003/007508
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
宮本　悦子
柳川　弘志
高嶋　秀昭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Keio University
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University filed Critical Keio University
Priority to JP2004513488A priority Critical patent/JP4747292B2/ja
Priority to AU2003242344A priority patent/AU2003242344A1/en
Publication of WO2003106675A1 publication Critical patent/WO2003106675A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently

Definitions

  • the present invention relates to a translation template and a library thereof, a protein synthesized therefrom, a library of proteins, elements constituting the same, and methods for producing and using the same.
  • the base sequences of the genomes of various organisms are being decoded.
  • the second act of post-sequence research involves analyzing the meaning of the decoded genomic information, that is, analyzing the structure and function of genes and proteins ⁇ Saegusa A. Japan boosts proteomics and cell biology. .. Nature 401, 6751 (1999), Dalton R, Abbott A. Can researchers find recipe for proteins and chips? Nature 402, 6763 (1999)), and analysis of protein-protein and nucleic acid-protein interactions. (Etsuko Takamoto, Hiroshi Yanagawa (2000) Series Genome Science of Post-sequence 3: Proteomics, pp.
  • the 3 'UTR is generally used to improve mRNA stability and translation efficiency (Sachs AB, Samow P, and Hentzw MW Starting at the Beginning, Middle, and Ena; Translation Initiation in Eukaryotes. (1997) Cell 89, 831-838) ⁇ Methods for substitution and modification of the chemical structure of mRNA (Ueda T, Tohda H, Chikazumi N, Use of Eckstein F, Watanabe K., Cell-free translation system usine phosphorothioate-containing mRNA. Nucleic Acids Symp Ser. 1991; (25): 151-2.) Has been devised.
  • protein analysis by cell-free translation system plays an important role in various analysis tools that have been developed for post-genome functional analysis research. The main ones are listed below. In all cases, large-scale expression of proteins is essential.
  • Methods for detecting molecular interactions include surface plasmon resonance, fluorescence resonance energy transfer, fluorescence depolarization, evanescent field imaging, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging, solid-phase enzyme immunoassay, etc. It has been known.
  • Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
  • EV0TEC is developing a device aimed at Ultra HTS, which screens more than 100,000 samples per day.
  • FCCS fluorescence cross-correlation spectroscopy
  • a protein interaction detection system it is necessary to modify a protein with a probe such as a fluorescent dye for immobilization.
  • the present inventors have previously proposed a method of modifying the C-terminus of a protein in a translation system using a nucleic acid derivative such as puromycin (Japanese Patent Laid-Open No. 11-322781, Japanese Patent Laid-Open No. 2000-139468). This method has advantages over the conventional chemical modification method and fluorescent protein fusion method in that the function of the protein is less likely to be impaired.
  • 3 'UTR is generally used to improve mRNA stability and translation efficiency.Sachs AB, Sarnow P., and Hentzw MW Starting at the Beginning, Middle, and Ena; Translation Initiation in Eukaryotes. (1997) Cell 89, 831-838), 3, UTRs are hundreds of bases long and cannot be easily primed by PCR. Therefore, in order to use a cell-free translation system with great effort, we decided to incorporate it into a vector with a 3 'UTR and use it (Madin K, Sawasaki T, Ogasawara III, Endo III. A highly efficient and robust cell-free protein synthesis).
  • An object of the present invention is to provide a translation template which can be prepared stably, stably and efficiently perform protein synthesis in order to solve the above problems.
  • This translation template high-throughput analysis of post-genomic structure and function can be performed.
  • C-terminal labeled proteins (Labeled protein and its oroducing methoa, labeling compound to be used in the method for analyzing function of genes, 2001, USPatent 6,228,994, H. Yanagawa, N. Nemoto, E.
  • Miyamoto protein interaction analysis, and assigning molecules (Molecule that homologizes genotype and phenotype ana utilization there, 1998, PCT / JP97 / 03766 (W098 / 16636) H. Yanagawa, N. Nemoto, E. Miyamoto, Y. Fusimi) can further improve the ability to analyze genome functions and apply it to evolutionary molecular engineering.
  • the first invention of the present invention is a translation template having a high translation efficiency in which a part of a PEG spacer is ligated to the 3 ′ end of a coding region containing information to be translated into a protein, and a method for synthesizing the PEG.
  • the present invention is characterized in that it can have a functional modifier on a part of the spacer, and provides a protein synthesized by using the template and a library thereof.
  • the second invention relates to a C-terminal labeled protein synthesized using the translation template of the first invention and a method for synthesizing the same.
  • a special sequence (3 XA sequence), characterized in that the C-terminal modifier can be provided with a functional modifier, and that the C-terminal modified protein synthesized with the template It provides the riparian.
  • the third invention relates to a translation template synthesized using the translation template of the first invention, a C-terminal modified protein (corresponding molecule) or a C-terminal modified protein with a PEG spacer part, and This method is characterized in that a special sequence (A sequence) is used at the 3 'end of the coding part of the translation template, and a functional modifier is added to a part of the PEG spacer. And a C-terminal-modified protein synthesized by the template and a library thereof.
  • the first invention of the present invention relates to a translation template comprising a code part having information to be translated into a protein and a part of a PEG spacer.
  • the coding part is information to be translated into a protein, and may have any sequence.
  • the coding part has an receptor region (A sequence) at the 3 ′ end region of the coding part, or the 3 ′ terminal region of the coding part. It has a receptor region (A sequence) and a translation-enhancing sequence (X sequence) 5 ′ upstream of the A sequence.
  • a sequence of the coding part it contains a short poly A sequence.
  • Some PEG spacers are polyethylene glycol Region, a donor region for linking to the code part, and a CCA region at the 3 'end.
  • a part of the PEG spacer may be a donor region alone or a CCA region alone, but preferably has a configuration including a PEG region containing polyethylene glycol as a main component.
  • the CCA region may be characterized by having no function of binding to a protein translated by the translation template by a peptide transfer reaction.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol in the PEG region may be characterized as being 400 or more.
  • the function imparting unit (F1 and / or F2) may be characterized by immobilizing or fluorescently labeling the translation template and / or the protein translated from the translation template.
  • Piotin or the like can be considered as the immobilizing substance
  • fluorescein, Cy5, or rhodamine green (RhG) can be considered as the fluorescent substance. It covers these coding molecules, translation templates, and their libraries, as well as proteins translated on ribosomes and their libraries.
  • the translation template may consist of only the code part (code molecule).
  • the second invention of the present invention relates to a protein translated by the translation template of the first invention and labeled with a C-terminal by a modifying agent.
  • the translation template consists of a coding part having information to be translated into a protein and a part of a PEG spacer mainly composed of polyethylene glycol.
  • the coding part has an A sequence and an X sequence, and includes a short poly A sequence as the A sequence. It is characterized in that it has a C (or G) marauding C (or G) sequence as the X sequence, for example, an Xhol sequence.
  • Part of the PEG spacer is characterized in that the polyethylene glycol has a molecular weight of 400 or more in the PEG region containing polyethylene glycol as a main component, and at least one in the donor region and / or the CCA region. It may be characterized in that it includes three function giving units (F).
  • the CCA region may be characterized in that it has no function of binding to a protein translated by the translation template by a transpeptidation reaction.
  • the functional modifier (F1 and / or F2) may be characterized by immobilizing or fluorescently labeling the translation template and / or a protein translated from the translation template. Piotin and the like are considered as immobilizing substances, and fluorescein, Cy5, or Rhodamine Green (RhG) can be considered.
  • the modifying agent is composed of a modifying portion for labeling the C-terminus of the protein, a peptide acceptor portion containing puromycin, and a nucleotide linker connecting them. Further, the modifying agent may be characterized in that the modifying portion contains a functional modifying substance (F3).
  • the F3 is characterized in that the protein translated by the translation template is immobilized or fluorescently labeled. Biotin and the like can be considered as immobilizing substances, and fluorescein, Cy5, or rhodamine green (RhG) can be considered as fluorescent substances.
  • the present invention relates to a protein and a library of proteins characterized in that the coding part, the translation template, and the library thereof are synthesized by being translated on a ribosome in the presence of a modifying agent.
  • the third invention of the present invention relates to a protein (two associating molecules) C-terminal modified by a translation template.
  • a translation template is composed of a coding part having information to be translated into a protein and a part of a PEG controller. It has an A sequence at the 3 'end of the coding region, and the A sequence includes a short poly A sequence.
  • Part of the PEG spacer is characterized in that polyethylene glycol has a molecular weight of 400 or more in the PEG region containing polyethylene glycol as a main component, and at least one in the donor region and / or the CCA region. And two modifiers (F1 and / or F2).
  • the CCA region is characterized in that it has a function of binding to a protein translated by the translation template by a peptide transfer reaction, and typically has pieuromycin in the CCA region.
  • the modifying substance (F1 and / or F2) may be characterized in that the translation template and / or the protein translated from the translation template is immobilized or fluorescently labeled. Biotin and the like can be considered as immobilizing substances, and fluorescein, Cy5, or rhodamine green (RhG) can be considered as fluorescent substances.
  • the present invention relates to a protein (two-mapping molecule) and a library of proteins (two-mapping molecule) synthesized by translating the coding part, the translation template, and the library on the ribosome.
  • a protein two-mapping molecule
  • a library of proteins two-mapping molecule synthesized by translating the coding part, the translation template, and the library on the ribosome.
  • it is possible to synthesize proteins in cell-free translation systems and cells using coding molecules, translation templates, and their libraries, and realize protein structure and function analysis. it can.
  • mapped molecules can be used to create functional substances based on molecular evolution engineering and to analyze genomic functions ( Figure 4).
  • protein-substance interaction analysis characterized by fluorescently labeling and / or immobilizing the translation template and its library and / or the protein and its library is also possible ( ( Figure 5).
  • various types of affinity screening, microarrays and protein groups are examples of immobilization
  • FCCS analysis is an example of fluorescent labeling ( Figure 5). The above analysis can be used in combination with in vitro cotranslation and cotranslation screening methods.
  • the present invention more specifically provides the following.
  • a coding molecule comprising:
  • the coding molecule according to 1, wherein the except region comprises a poly.A sequence having a length of 2 to 10 bases.
  • a library of the coding molecules according to any one of 1 to 4 ′.
  • a PEG spacer having a coding part having information to be translated into a protein and at least a PEG spacer having a donor region for linking to the coding part, wherein the coding part is described in any one of 1 to 4. Translation template derived from the coding molecule.
  • a PEG spacer characterized in that a part of the spacer has a donor region for linking to the coding part, a PEG region containing polyethylene glycol as a main component, and a CCA region at the 3 ′ end. 6. Translation template according to 6 derived from molecule.
  • the CCA region comprises a protein translated by the translation template and a peptide.
  • a library of proteins which is synthesized by translating a library of translation templates described in 17.15 on ribosomes.
  • a protein wherein the translation template according to any one of 8.6 to 14 comprises a modifying portion, a peptide acceptor portion containing a pure mouth mycin, and a nucleotide linker connecting them.
  • the translation template described in 23.15 labeled the C-terminus of the protein, including the modified part, the peptide acceptor containing Beauomycin, and the linker of the nucleotide linking them.
  • a library of proteins which is synthesized by being translated on a ribosome in the presence of a modifying agent.
  • coding part 30 includes a coding part having information to be translated into protein and at least a PEG spacer part having a donor region for linking to the coding part, and the coding part is derived from the coding molecule described in 28. Translation template to do.
  • a part of the donor has a donor region for connection to the code part, a PEG region mainly composed of polyethylene glycol, and a PEG region characterized by having a CCA region at the end.
  • the protein according to any one of 16, 16, 18 to 23, 35, and 37, or the protein according to any one of 17, 23 to 27, 36, and 38 A method for analyzing the interaction between a protein and a substance, comprising analyzing the interaction by causing a substance to interact with a library of proteins.
  • Interaction analysis can be performed by fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or solid-phase enzyme immunoassay.
  • 40 The method for analyzing interaction between a protein and a substance according to 40.
  • the interaction between the protein and the substance is detected by amplifying the base sequence of the coding region linked to the C-terminal of the protein.
  • FIG. 1 shows the structure of the translation template (A) of the present invention and the constituent molecules of the coding molecule (B) and the spanner molecule (C).
  • the translation template consists of a coding part derived from a code molecule and a part of a spacer derived from a spacer molecule.
  • F1 and F2 are fluorescent dyes.
  • FIG. 2 shows the configurations of the C-terminal modified protein (C-terminal labeled protein) (A), the translation template (B) of the present invention, and the modifying agent (C).
  • FIG. 3 shows the configurations of the C-terminal modified protein (assigning molecule) (A), the translation template (B) of the present invention, and the modifying agent (C).
  • FIG. 4 is an explanatory diagram of the primary screening of the interaction analysis of substances and proteins by the assigning molecule of the present invention.
  • Assignment molecules can be applied to the creation of substances that have evolved progressively from random libraries, etc., and have acquired desired functions, as evolutionary molecular engineering.
  • genome function analysis a group of gene sequences having an interaction with a desired substance / protein can be comprehensively analyzed from a cDNA library.
  • a cell-free cotranslation screening method can also be used.
  • FIG. 3 shows explanatory diagrams of primary screening and secondary screening of action analysis.
  • C-terminal modified protein synthesized from the translation template of the present invention protein modified at the C-terminal with a modifying agent, protein modified at the C-terminal with a translation template (assigning molecule), and protein modified at the C-terminal with PEG is used.
  • the screened protein in Fig. 4 can be used as a primary screening to further analyze the details of the interaction with the substance-protein using FCCS, microarray, etc. is there.
  • Figure 2 shows a comparison of the translation amount when the translation template has no PEG spacer part and when the translation template has a different PEG spacer part.
  • FIG. 8 shows the translation amount and stability of the translation template.
  • FIG. 9 shows a comparison of the amount of translation when the translation template of the present invention has a different part of PEG (including the results of electrophoresis (photograph)).
  • mapping molecule Formation of the mapping molecule due to the difference in the amount of translation template added when the coding molecule (XA sequence, A sequence) having the C-jun gene sequence and dCdCT (Flu) PEG4000 dCdCPuro-Boc are compared. efficiency.
  • FIGS. 10 to 14 show one PEG spacer molecule used in the present invention and a synthesis scheme thereof.
  • FIGS. 15 to 18 show the modifying agents used in the present invention and their synthesis schemes.
  • Figure 19 outlines the structures of the assigning molecule, the spacer molecule and the coding molecule.
  • FIG. 20 shows a detailed configuration of an example of the spacer molecule.
  • D Donor area
  • X2 and XI Functional unit
  • PEG PEG area
  • A Peptide accept area.
  • Bio Piotin
  • F1 Fluorescent dye.
  • FIG. 21 shows a detailed configuration of an example of a coding molecule.
  • FIG. 22 is a diagram showing the structures of the C-terminal modified protein (A), the modifying agent (B), and the translation template (C).
  • the assigning molecule means a molecule that associates a phenotype with a genotype.
  • the assigning molecule is a combination of a gene type molecule containing a nucleic acid having a nucleotide sequence reflecting a genotype and a phenotype molecule containing a protein involved in phenotypic expression.
  • a genotype molecule is formed by combining a coding molecule having a base sequence reflecting a genotype in such a form that the base sequence can be translated, and a part of a spacer.
  • the part derived from the phenotype molecule, the part derived from the spacer molecule, and the part derived from the coding molecule are called a decoding part, a part of the spacer, and a coding part, respectively.
  • a portion derived from a spacer molecule and a portion derived from a coding molecule are referred to as a spacer portion and a coding portion, respectively.
  • Figure 19 shows the rough structure of an example of the assigning molecule, one spacer molecule, and one example of the coding molecule.
  • This assigning molecule is composed of a base sequence (called a coding part) that reflects the phenotypic code and a primer (called a part of the spacer) containing puromycin.
  • This assigning molecule is linked to a coding molecule by a method and a part of a peptide containing puromycin to form a genotype molecule, which is linked to a phenotype molecule on a liposome in a cell-free translation system. Has a configuration.
  • One spacer molecule is composed of a PEG region composed mainly of polyethylene glycol, a CCA region composed of at least puromycin or puromycin and one or more residues of DNA and / or RNA, and MA and / or at least one residue. Or a donor region containing A, and a function-imparting unit (X) in which at least one base of DNA and / or RNA is functionally modified.
  • the coding molecule includes a DNA and / or RNA poly-A sequence consisting of a part of the sequence of the decoding region and a terminal region, and a transcription promoter and a translation enhancer consisting of DNA and / or RNA.
  • the spacer molecule consists of a donor region that can bind to the 3 'end of nucleic acid, a PEG region containing polyethylene glycol as a main component, which is bound to a donor region, and a peptide that is bound to the PEG region by a transpeptidation reaction. And a peptide receptor region containing a group capable of binding.
  • the donor region that can bind to the 3 'end of a nucleic acid usually consists of one or more nucleotides.
  • the number of nucleotides is usually 1-15, preferably 1-2.
  • the sequence at the 5 'end of the nucleic acid donor region determines the ligation efficiency.
  • at least one residue dC is required. (Doxycytidylic acid) or two residues of dC dC (dideoxycytidylic acid) are preferred.
  • the type of base is preferably in the order of C> U or T> G> A.
  • the PEG region is mainly composed of polyethylene glycol.
  • the term “main component” means that the total number of nucleotides contained in the PEG region is 20 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 400 or more. Preferably, it means that the total number of nucleotides is 10 bp or less, or the average molecular weight of polyethylene glycol is 1000 or more.
  • the average molecular weight of polyethylene glycol in the PEG region is usually from 400 to 30,000, preferably from 1,000 to 10,000, more preferably from 2,000 to 8,000.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol is lower than about 400, when the genotype molecule containing a part of the spacer derived from this one spacer is mapped and translated, the post-processing of the mapped translation is performed.
  • the peptide region is not particularly limited as long as it can bind to the C-terminus of the peptide.
  • puromycin 3, -N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (3, -N-Aminoacy lpurorayc in aiinonucleoside)
  • PANS-Gly whose amino acid portion is glycine, PANS-Val of palin, PANS-Ala of alanine, and PANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used.
  • 3'-N-aminoacyl adenosine aminonucleoside 3, -Aminoacyladenosine aminonucleosiae, AAN
  • AANS-Gly of glycine, AANS-Val of palin, AANS-Ala of alanine, and other AANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used.
  • nucleosides or those in which a nucleoside and an amino acid are ester-linked can also be used.
  • all of the nucleosides or substances having a chemical structure skeleton similar to nucleosides and substances having a chemical structure skeleton similar to amino acids or amino acids can be used as long as they can be chemically bonded.
  • the peptide peptide region is preferably composed of puromycin or a derivative thereof, or puromycin or a derivative thereof and one or two residues of deoxyribonucleotides or ribonucleotides.
  • the derivative means an derivative capable of binding to the C-terminus of the peptide in a protein translation system.
  • Puromycin derivatives are not limited to those having a complete puromycin structure, but also include those in which a portion of the puromycin structure is missing. Specific examples of puromycin derivatives include PANS-amino acids, AANS-amino acids, and the like.
  • the peptide acceptor region may be composed of pure mouth mycin alone, but preferably has a nucleotide sequence comprising one or more residues of DNA and / or RNA on the 5 ′ side.
  • the sequence may be dC-puromycin, rC-puromycin, etc., more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puromycin, rCdC-puromycin, dCrC-puromycin, etc. 3.
  • CCA sequences that mimic the ends Philipps, GR (1969) Nature 223, 374-377) are suitable.
  • the type of base is preferably C> U or T>G> A.
  • the spacer molecule preferably contains at least one function-imparting unit between the donor region and the PEG region.
  • the function-imparting unit is preferably one in which at least one residue of deoxyribonucleotide or ribonucleotide base is functionally modified.
  • examples of the function modifying substance include substances for immobilization and fluorescent labeling. As a specific example, it is possible to introduce the fluorescent substance shown in FIG. 20, biotin, or various separation tags such as His-tag.
  • FIG. 20 shows a detailed configuration of an example of a spacer molecule.
  • a spacer molecule is composed of a PEG region composed mainly of polyethylene glycol, a CCA region composed of puromycin or puromycin and at least one residue of DNA and / or RNA, and at least one residue of DNA and / or RNA. Or a donor region containing RNA, and a function-imparting unit (X) in which at least one base of DNA and / or RNA is functionally modified.
  • a fluorescent substance T (F1) and a biotin T (Bio) are used as the function imparting unit (X).
  • the coding molecule is a 5 'untranslated region containing a transcription promoter and a translation enhancer, a 3' side of the 5 'untranslated region, a protein-encoding 0RF region, and a 3' side of the 0RF region.
  • the coding molecule may be DNA or RNA, and in the case of RNA, the terminal may or may not have a Cap structure.
  • the coding molecule can be integrated into any vector or plasmid.
  • the 3 'terminal region contains, for example, an Xhol sequence and a poly A sequence downstream thereof.
  • the poly A sequence in the 3 'terminal region is important, and the poly A sequence has at least 2 dA and / or rA residues.
  • a single poly A continuous chain preferably a poly A continuous chain having 3 or more residues, more preferably 6 or more, and still more preferably 8 or more residues.
  • Factors affecting the translation efficiency of the coding molecule include a combination of a 5 'UTR consisting of a transcription promoter and a translation enhancer and a 3' end region containing a poly A sequence. You. The effect of the poly A sequence in the 3 'terminal region is usually exerted with 10 residues or less.
  • T7 / T3 or SP6 can be used, and there is no particular limitation. SP6 is preferred, and SP6 is particularly preferred when an omega sequence or a sequence containing a part of an omega sequence is used as the enhancer sequence for translation.
  • the translation enhancer is preferably a part of an omega sequence, and the omega sequence may be a TMV omega sequence (Gallie DR, Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., Vol. 20, 4631-4638).
  • the one containing a part of (029) is preferable.
  • the combination of the Xhol sequence and the polyA sequence is important. Also important is the combination of the polyA sequence with the affinity tag attached downstream of the 0RF region, ie, upstream of the Xhol sequence.
  • the affinity sequence is not limited as long as it is a sequence for using any means capable of detecting a protein such as an antigen-antibody reaction. Preferably, it is a Flag-tag sequence which is a tag for affinity separation and analysis by an antigen-antibody reaction.
  • the translation efficiency increases when the Xho I sequence is added to the affinity tag such as Flag-tag and when the poly A sequence is further added thereto.
  • the configuration effective for the translation efficiency described above is also effective for the association efficiency.
  • the 0RF region may be any sequence consisting of DNA and / or RNA. Gene sequences, exon sequences, intron sequences, random sequences, or any natural or artificial sequences are possible, and there are no sequence restrictions.
  • each length is about 60 bp in 5, UTR, 3.
  • Approximately 40 bp in the terminal region enough to be incorporated as an adapter region into PCR primers. For this reason, it is easy to generate a code molecule with 5, UTR and 3, terminal regions from any vector plasmid cDNA library by PCR.
  • translation may be made beyond the 0RF region. That is, a termination codon may not be present at the end of the 0RF region.
  • Figure 21 shows the detailed structure of an example of a coding molecule.
  • the coding molecule consists of a 3 'terminal region, a 5' UTR containing a transcription promoter composed of DNA and / or RNA and a translation enhancer, and sequence information of a decoding region, that is, a 0RF region encoding a phenotypic protein.
  • DNA and / or R It contains an affinity tag sequence consisting of NA, an Xhol sequence, and a poly A sequence, and uses a Flag-tag sequence. 5.
  • a sequence containing SP6 of the transcription promoter and 029 which is a part of the omega sequence of the translation enhancer is used as the UTR.
  • the genotype molecule (translation template) is composed of a 5 'untranslated region containing a transcription promoter and a translation enhancer, a 0RF region encoding a protein bound to the 3' side of the 5 'untranslated region, and a 3' region of the 0RF region.
  • the 3 'end of a coding molecule which is a nucleic acid containing a 3' end region containing a poly A sequence, and which is linked to the 'side, is linked to the donor region of one spacer molecule.
  • the code molecules that make up the genotype molecule are as described for the coding molecule. However, it is preferable to have an expression enhancing sequence if necessary.
  • a genotype molecule can be produced by linking the 3 'end of the above-mentioned coding molecule to the donor region of a spacer molecule by a usual ligase reaction.
  • the reaction conditions are generally 4 to 48 hours at 4 to 25 ° C, and polyethylene glycol having the same molecular weight as the polyethylene glycol in the PEG region of a spacer molecule containing the PEG region is used. When added to the reaction system, it can be reduced to 0.5 to 4 hours at 15 ° C.
  • spacer molecules and coding molecules has a significant effect on ligation efficiency.
  • the 3'-terminal region of the coding region corresponding to the receptor there is at least 2 or more, preferably 3 or more, more preferably 6 to 8 or more DNA and / or RNA poly A sequence.
  • a 5 'UTR translation enhancer a partial sequence of an omega sequence (029; FIG. 21) is preferable, and a donor region of a spacer is at least one residue of dC (doxycytidylic acid) or 2 The residue dCdC (dideoxycytidylic acid) is preferred. This makes it possible to avoid the problems of DNA ligase by using RNA ligase, and to maintain the efficiency at 60 to 80%.
  • genotype molecule is RNA
  • the 3 'end of the coding molecule and (b) the donor region of the spacer molecule, which is composed of RNA, are the same as the polyethylene glycol constituting the PEG region in the spacer molecule. It is preferable to bind with RNA ligase in the presence of free polyethylene glycol having a molecular weight.
  • the ligation efficiency can be 80-90 regardless of the molecular weight of the part of the polyethylene glycol. %, And the separation step after the reaction can be omitted.
  • the assigning molecule is obtained by linking the above-mentioned genotype molecule to a phenotype molecule which is a protein encoded by the 0RF region in the genotype molecule in a transpeptidation reaction.
  • the assigning molecule is a phenotype that is a protein encoded by the 0RF region in the genotype molecule in a transpeptidation reaction by translating the genotype molecule on a ribosome (for example, by a cell-free translation system). By linking to a molecule.
  • the cell-free translation system is preferably of wheat germ or egret reticulocytes.
  • the translation condition may be a condition that is usually adopted. For example, a condition at 25 to 37 ° C. for 15 to 240 minutes can be mentioned.
  • mapping molecules As for the cell-free translation system, the formation of mapping molecules has been examined in E. coli (E. coli), Egret reticulocytes, and wheat germ systems, and the association molecules have been confirmed only in the Eg reticulocyte system.
  • Taga Nemoto, N, Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts, RW, Szostak, JW (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,
  • the mapping molecule can be formed even in a wheat germ system.
  • heron reticulocyte system was not practical because of the lack of stability of the genotype molecule, and has been applied only to short-chain genotype molecules (Roberts, RW, Szostak, JW (1997) Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297; Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E., Yanagawa, H. (1997) FEBS Lett. 414, 405), part of spacer containing PEG region Are more stable in wheat germ systems and are practical for handling long chain lengths. System.
  • the C-terminal labeled protein is a protein having a modified C-terminus, and has a configuration in which a labeling agent is bonded to the C-terminus of the protein, as shown in FIG. 22A. That is, the C-terminal labeled protein is composed of the protein and a labeling agent.
  • Protein that constitutes a C-terminally labeled protein means a protein used as an analysis target for an interaction whose function is known or unknown.
  • the C-terminally labeled protein of the present invention can be used for measuring the presence or absence of an interaction between this protein and a target molecule described below.
  • This protein may be a natural protein or a variant thereof, and an artificial protein or a variant thereof.
  • Natural proteins also include libraries of diverse proteins transcribed and translated from cDNA libraries derived from various organs, tissues or cells of organisms.
  • the artificial protein is a sequence obtained by combining all or a partial sequence of the natural protein, or a sequence containing a random amino acid sequence.
  • the protein constituting the C-terminal labeled protein is preferably a full-length protein.
  • full-length protein refers to a protein in which the C-terminus is completely translated, that is, a protein obtained by translating the codon up to one stop before the stop codon of the nucleotide sequence encoding the protein. means.
  • the N-terminus of the full-length protein may have undergone some processing such as cleavage of a signal peptide.
  • the protein constituting the C-terminal labeled protein may be a protein fused with an affinity tag.
  • affinity tags include polyhistidine peptide peptide peptides, glutathione-S-transferase, protein A, maltose binding protein, calmodulin binding peptide and the like.
  • a C-terminal labeled protein can be produced by expressing a translation template in a translation system in the presence of a labeling agent, performing protein synthesis, and purifying the synthesized protein.
  • a labeling agent examples of the labeling agent, the translation template, and the production will be described, but the present invention is not limited thereto.
  • the labeling agent reacts with the transpeptidase in the protein translation system.
  • a peptide acceptor having a group (including a residue) capable of binding to a protein by a transpeptidation reaction on a ribosome has a structure in which the moiety is linked to a modified portion via a nucleotide linker.
  • the modifying substance included in the modifying portion include fluorescent and non-fluorescent modifying substances.
  • the fluorescent substance include fluorescent dyes such as fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Cy5, eosin series and NBD series, and fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP).
  • the non-fluorescent substance may be any compound such as a coenzyme such as biotin, a protein, a peptide, a saccharide, a lipid, a dye, polyethylene glycol, etc., as long as it can be any marker.
  • the modified moiety has a fluorescent group, a group that binds to a protein (for example, a piotinyl group or an iminobiotinyl group), or both.
  • a piotinyl group or an iminobiotinyl group because the efficiency of modification with the C-terminal labeling agent of the present invention increases.
  • a part of peptide peptide is a protein translation system and has a group capable of binding to a protein by a transpeptidation reaction, and preferably has a residue of pure mouth mycin or a derivative thereof.
  • Puromycin has a similar structure to aminoacyl-tRNA and is known as an antibiotic that inhibits protein synthesis, but is known to bind to the C-terminus of proteins at low concentrations (Miyamoto-Sato, E. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182).
  • the puromycin derivative that can be used in the present invention may be any substance having a structure similar to puromycin and capable of binding to the C-terminus of a protein. Specific examples include 3, -N-aminoacylbiuromycin amino nucleoside, 3, -N-aminoacyl adenosine amino nucleoside, and the like.
  • Nucleotide linkers that connect between the modified moiety and a portion of the peptide acceptor are, specifically, nucleic acids or nucleic acid derivatives in which one or more ribonucleotides or deoxyribonucleotides are linked, and particularly preferred examples.
  • cytosine Examples include compounds in which one or more ribonucleotides containing a base (-rC-) or deoxyribonucleotides (-dC-) are linked.
  • any substance can be used as long as it can increase the yield of the modified protein by being inserted between the modification part and a part of the peptide receptor.
  • the nucleotide linker is 2'-deoxycytidylic acid, 2, -deoxycytidyl- (3,5,)-2, -deoxycytidylic acid, ribocytidylic acid, or ribocytidyl- (3,5,5)-.
  • it is ribocytidylic acid.
  • the labeling agent can be produced by binding the above-mentioned modified moiety and a part of the peptide receptor via a desired nucleotide linker by a chemical bonding method known per se. Specifically, for example, a portion of the above peptide acceptor protected with an appropriate protecting group is bound to a solid support, and a nucleotide phosphoramidite and a nucleotide are converted into a nucleotide linker using a nucleic acid synthesizer or the like.
  • It can be prepared by sequentially binding xynucleotide phosphoramidite and a nucleotide phosphoramidite to which a fluorescent substance, a biotin or the like is bound as a modifying substance, and then performing deprotection. Depending on the type of each part or the type of bonding, they can be combined by a liquid phase synthesis method, or both can be used in combination.
  • a metal ion such as nickel
  • a chelating reagent such as nitrilotriacetic acid or iminodiacetic acid to which the metal ion can coordinate can be bound, and then the metal ion can be coordinated.
  • the translation template is a translation template that can be used when producing the modified protein of the present invention. As shown in FIG. 22C, the 3 ′ end region containing the poly A sequence and the 5 ′ It consists of the untranslated region (5 'UTR) and the encoded 0RF region of the protein.
  • the translation template may be DNA or RNA.
  • the translation template comprises a 0RF region encoding a protein, located on the 5th side of the 0RF region, a 51TR containing a transcription promoter and a translation enhancer, and located on the 3 'side of the 0RF region, It is composed of three terminal regions containing a poly A sequence (polyA).
  • a more preferred translation template is SP6 RNA as a transcription promoter for UTR. Contains the promoter sequence of the polymerase and a part of the omega sequence of tobacco mosaic virus (TMV) (029) as a translation enhancer. Further, it is preferable that the 0RF region contains an affinity tag sequence in a downstream portion thereof.
  • the affinity tag sequence is a sequence encoding the affinity tag described above, and preferably includes a His-tag (polyhistidine tag) sequence.
  • a longer polyhistidine tag is preferable because the recovery rate by the nickel chelate resin is improved.
  • the preferred range of the length of the polyhistidine tag can vary depending on the type of protein to be modified and the type of label, but is usually 8 to 12 residues.
  • upstream and downstream mean in the direction of transcription or translation.
  • the translation template when it is DNA, it may be a DNA vector or a plasmid obtained by introducing the above region into an appropriate DNA vector or brasmid. If the translation template is MA, it may or may not have a Cap structure at the end.
  • Examples of translation systems used for producing C-terminal labeled proteins include cell-free protein synthesis systems and cell expression systems.
  • specific examples of the cell-free protein synthesis system include a wheat germ extract, a heron reticulocyte extract, and an Escherichia coli S30 extract.
  • the translation template described above is added to these cell-free protein synthesis systems, the modifier is added at the same time at 1 to 100 / M, and the mixture is incubated at 25 to 37 ° C for 1 to several hours to synthesize a C-terminal modified protein. You.
  • the synthesized modified protein can be directly used for the next purification process or detection process.
  • cell expression systems include bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, thermophiles, and yeast, cultured cells such as insect cells, mammals, and the like, as well as nematodes, Drosophila, zebrafish, and mice. Any cell can be used as long as gene transfer is possible, up to the cell.
  • the above-mentioned translation template of the present invention is introduced into these cells, and at the same time, 1 to 100 / M of the modifying agent of the present invention is introduced into the cells by electroporation, micro-injection method, or the like.
  • the modified protein is synthesized by incubating at the growth temperature for several hours.
  • the synthesized modified protein is The cells can be recovered by disruption and subjected to subsequent purification or detection processes. It can also be subjected to the detection process in cells as it is. Select a translation template that is appropriate for the translation system used.
  • any method generally used for protein purification such as affinity, chromatography such as gel filtration and ion exchange, electrophoresis, precipitation, and dialysis, can be used.
  • affinity chromatography, gel filtration, ion chromatography, electrophoresis, precipitation, dialysis, and any combination thereof are included.
  • Particularly preferred examples include modified proteins obtained by fusing an affinity tag such as polyhistidine peptide peptide, glutathione-S-transferase, protein A, maltose binding protein, and calmodulin binding peptide to an affinity resin.
  • an affinity tag such as polyhistidine peptide peptide, glutathione-S-transferase, protein A, maltose binding protein, and calmodulin binding peptide to an affinity resin.
  • the gel is applied several times to the gel filtration column.
  • the unmodified protein is completely removed by utilizing the affinity of the piotinyl group or iminopiotinyl group of the modified portion and avidin or streptavidin.
  • the translation template (A in FIG. 1) of the first invention is composed of a coding part derived from the coding molecule (B in FIG. 1) and a PEG spacer derived from one PEG spacer molecule (C in FIG. 1). Department.
  • the stability is improved and the translation efficiency can be improved by connecting (ligating) a part of the PEG spacer to the code part regardless of the arrangement of the code part.
  • the translation efficiency can be further improved depending on the structure of the code part and the type of the PEG spacer. The details are described below.
  • the coding region of the present invention (B in FIG. 1) comprises a 5 ′ terminal region, (ffiF region and 3 ′ terminal region, and may or may not have a Cap structure at the 5 ′ terminal.
  • the 3 'end region of the coding region contains a poly Ax 8 sequence or an X sequence as an A sequence.
  • an Xhol sequence or a sequence with 4 or more bases C or G
  • orchid C or G
  • One orchid
  • a configuration consisting of an A sequence, an X sequence, or a Flag tag sequence as an affinity tag sequence upstream of the XA sequence is considered.
  • the affinity tag sequence is a sequence using any means capable of detecting or purifying a protein, such as one utilizing an antigen-antibody reaction such as HA-tag or IgG protein A (z domain) or His-tag. But it doesn't matter.
  • the combination of XA sequences is important. Among the X sequences, the first four bases are important, and those having an SNNS sequence are preferable.
  • the upper limit of the length of the X sequence is not particularly limited as long as the effect of enhancing translation is obtained, but is usually 15 bases or less, preferably 6 bases or less.
  • the 5'-terminal region consists of a transcription promoter and a translation enhancer.
  • the transcription promoter can be T7 / T3 or SP6, etc., and is not particularly limited. However, in a wheat cell-free translation system, it is used as a translation enhancer sequence. It is preferable to use a sequence containing a part of an omega sequence or an omega sequence, and it is preferable to use SP6 as a promoter.
  • a portion (029) of the omega sequence of the translation enhancer contains a portion of the TMV omega sequence (Gallie DR, Walbot V.
  • the 0RF region of the coding part may be any sequence consisting of DNA and / or RNA. Gene sequences, exon sequences, intron sequences, random sequences, or any natural or artificial sequences are possible and there are no sequence restrictions.
  • a part of the PEG spacer of the present invention (C in FIG. 1) is composed of a CCA area, a PEG area, and a donor area.
  • the minimum required configuration is the donor region.
  • the molecular weight range of the polyethylene glycol in the PEG region is from 400 to 30,000, preferably from 1,000 to 10,000, more preferably from 2,000 to 6,000.
  • the CCA region can be configured with or without puromycin.
  • puromycin for puromycin, puromycin, 3, -N-aminoacylpuromycin aminonucleoside (3'-N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside)
  • PANS-Gly of glycine PANS-Val of palin, PANS-Ala of alanine, and other PANS-all amino acids corresponding to all amino acids can be used.
  • 3'- 3, -N-aminoacyl adenosine aminonucleoside (3 "-Aiinoacyl adenosine aminonucleoside, AANS-amino acid) linked by an amide bond formed as a result of dehydration condensation of the amino group of aminoadenosine and the carboxyl group of amino acid
  • AANS-Gly of glycine, AANS-Val of palin, AANS-Ala of alanine, and other amino acids corresponding to all amino acids can be used for the amino acid portion, and nucleosides or ester bonds of nucleosides and amino acids.
  • any substance that has a chemical bond between a nucleoside or a substance having a chemical structural skeleton similar to a nucleoside and a substance having a chemical structural skeleton similar to an amino acid or an amino acid can be used.
  • the above pure mouth mycin induction Any substance lacking the ability of the amino group to bind to amino acids and the CCA region lacking puromycin may be considered.However, by including puromycin that cannot bind to proteins on the ribosome, translation efficiency can be further improved. For unknown reasons, puromycin, which is unable to bind to proteins, may stimulate ribosomes to promote overnight turnover.
  • a base sequence consisting of one or more residues of DNA and / or RNA
  • the type of base is preferably C> U or T>G> A
  • the sequence is dC-puromycin , RC-puromycin, etc., and more preferably dCdC-puromycin, rCrC-puremycin, rCdC-puremycin, dCrC-puremycin, etc .
  • CCA sequence that mimics an end Philipps GR (1969) Nature 223 , 3 7 4-377) are suitable.
  • these Pew port mycin is impossible coupled with an amino acid in some way .
  • a part of the PEG spacer of the present invention can be configured to have a modifying substance (F1 and / or F2).
  • the translation template can be used as a tag for recovery, reuse by purification, or immobilization.
  • the length is 60 bp, about 40 bp in the 3 'end region, and a length that can be designed as an adapter region in the primer of PCR. This has a new effect Was issued.
  • a translation template with high translation efficiency can be obtained.
  • the method of ligating the PEG sensor part and the code part of the present invention is not particularly limited, and any method may be used, such as a method using a general DNA ligase or a linkage by a light reaction.
  • the A sequence in the terminal region is important as the range that affects ligation efficiency in the coding region, and a mixture of dA and / or rA of at least 2 residues or more And preferably 3 or more residues, more preferably 6 to 8 residues or more.
  • the DNA and / or RNA sequences at the 5 'end of some of the donor regions of the PEG matrix determine the ligation efficiency.
  • the type of base is preferably C> U or T> G> A. Further, it is preferable to add polyethylene glycol having the same molecular weight as that of the PEG region at the time of the Liigession reaction.
  • the second invention is a protein (A in FIG. 2), which is synthesized by translation using the translation template of the first invention in the presence of the modifying agent and is C-terminal modified with the modifying agent. It consists of a template (B in Fig. 2) and a modifier (C in Fig. 2). The feature here is especially the structure of the code part of the translation template. The details are described below.
  • the PEG spacer part of the translation template of the present invention (B in FIG. 2) is similar to the first invention in that puromycin cannot be linked to an amino acid.
  • Approximately 60 bp, approximately 40 bp in the 3'-terminal region, and a length that can be designed as an adapter region for PCR primers This allows any vector And a plasmid containing a 5'-terminal region and a 3'-terminal region of the present invention can be easily prepared by PCR from a cDNA library. By ligating a part of the template, a translation template with high translation efficiency suitable for C-terminal labeling can be obtained.
  • the modifying agent of the present invention (C in FIG. 2) has a group (including a residue) capable of binding to the protein by a transpeptidation reaction in a protein translation system, that is, a peptide transfer reaction on a ribosome.
  • the peptide acceptor has a configuration in which the peptide acceptor is bound to the modifying moiety via a nucleotide linker.
  • the non-radioactive modifying substance as the modifying substance include fluorescent and non-fluorescent modifying substances.
  • the fluorescent substance include fluorescent dyes such as fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Cy5, eosin series, and NBD series, and fluorescent proteins such as green fluorescent protein and (GFP).
  • any compound can be used as a marker, such as a coenzyme such as biotin, a protein, a peptide, a saccharide, a lipid, a pigment, and polyethylene glycol.
  • the modifying portion has a fluorescent group, a group binding to a protein, or both.
  • the peptide acceptor has a group capable of binding to protein by a transpeptidation reaction in a protein translation system, and preferably has a puromycin or a derivative thereof.
  • Puromycin has a structure similar to aminoacyl-tRNA and is known as an antibiotic that inhibits protein synthesis, but is known to bind to the C-terminus of proteins at low concentrations (Miyamoto-Sato, E et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182).
  • the puromycin derivative that can be used in the present invention may be any substance as long as it has a structure similar to puromycin and can bind to the C-terminus of the protein.
  • Nucleotide linkers that connect between the modified moiety and a portion of the amino acid are specifically ribonucleotides or deoxyribonucleic acids.
  • a nucleic acid or nucleic acid derivative in which one or more nucleotides are linked, and particularly preferred is one or more ribonucleotides (-rC-) or deoxyribonucleotides (-dC-) containing cytosine bases.
  • the nucleotide linker is 2′-dexoxytidylic acid, 2, -dexoxytidyyl- (3 ′, 5 ′)-2, -dexoxytidylic acid, ribocytidylic acid, or ribocytidyl- (3 ′, 5 ′). ;)-Lipositidylic acid.
  • the modifying agent of the present invention can be produced by binding the above-mentioned modified moiety and a part of the peptide via a desired nucleotide linkage by a chemical bonding method known per se. Specifically, for example, a part of the above-mentioned amino acid protected with an appropriate protecting group is bound to a solid support, and a nucleotide linker is used as a nucleotide linker using a nucleic acid synthesizer. It can be produced by sequentially binding xynucleotide phosphoramidite, and a phosphoramidite to which a fluorescent substance or biotin is bound as a functional modifier, and then performing deprotection.
  • the third invention relates to a protein synthesized by translation using the translation template of the first invention and modified at the C-terminal with the translation template (A in FIG. 3; assigning molecule) and a translation template (B in FIG. 3). ) Is removed, and the protein has the structure of C-terminally modified protein with PEG (C in Fig. 3). The details are described below.
  • the PEG spacer part of the translation template (B in FIG. 3) is the same as the first invention except that puromycin can be linked to an amino acid.
  • the code part is also the same as that of the first invention, but in particular, it is important that the 3 'terminal region be an A sequence as a configuration suitable for association, It was confirmed that the efficiency of the association was significantly improved and the amount of free protein was drastically reduced.
  • the 5 'end region of the code part is SP6 + 029, and the end region is, for example, Flag + XhoI + A n (n28).
  • each length is about 60 bp at the 5′-end region and about 40 bp at the 3′-end region, and is a length that can be designed as one adapter region for PCR primers.
  • the Yotsute by hail loose vector or plasmid Doya cDNA library one to PCR which easily allows write code section having an end region and a 3 5-terminal region the end of the present invention, to Raigeshiyon the PEG spacer portion As a result, a translation template with high association efficiency can be obtained.
  • the protein modified with C-terminal by PEG of the present invention (FIG. 3C) can be used for detecting protein interaction without using the coding part, for example, for FCCS measurement, fluorescent leader, protein group, etc. In the case of application, it is preferable to intentionally cleave with RNase A or the like. Cleavage can eliminate the difficulty of detecting protein-protein interactions due to interference with the coding region.
  • the mapping molecule uses the Darwinian evolutionary mechanism as an evolutionary molecular engineering to repeat three unit operations of “Mutation”, “Selection” j, and “Amplification”. From a random library, etc., it is possible to apply it engineeringly by creating a material that gradually evolves and acquires the desired function (Fig. 4). Also, as an application to genomic function analysis, it is possible to comprehensively analyze a group of gene sequences interacting with desired substances and proteins from a cDNA library (Fig. 4). Furthermore, as shown in Fig. 5, it is possible to analyze the details of the interaction with substances and proteins using FCCS or microarray, etc., as shown in Fig. 5 as the secondary screening after the primary screening in Fig. 4.
  • the above analysis can also be used in combination with in vitro cotranslation and cotranslation screening methods. Also, when using the assigning molecule in the primary screening, the coding part of the A sequence is used, and in the secondary screening, when using the assigning molecule, the coding part of the A sequence and the C-terminal labeled protein are used. In some cases, the effects can be properly used by changing the code part of the XA sequence by priming.
  • the cell-free protein synthesis system examples include a wheat germ extract, a heron reticulocyte extract, and an Escherichia coli S30 extract.
  • a C-terminal modified protein is synthesized.
  • For mapping add the above translation template and add Simply retaining the temperature at 37 ° C for one to several hours allows the associating molecules to be synthesized. Both synthesized modified proteins can be directly used for the next purification or detection process, or directly into cells.
  • the cell expression system include any cells from bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, thermophiles, and yeast to cultured cells of insect cells, mammals, etc., as well as nematodes, Drosophila, zebrafish, mice, etc. May be.
  • bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, thermophiles, and yeast
  • yeast to cultured cells of insect cells, mammals, etc., as well as nematodes, Drosophila, zebrafish, mice, etc. May be.
  • the above-mentioned C-terminal-labeled or both modified proteins can be directly introduced, or, if the above-mentioned translation template of the present invention is introduced and the C-terminal is labeled,
  • the modified protein of the present invention is introduced into cells by electroporation, microinjection: xillon method, etc.
  • the associating molecule is synthesized by introducing the translation template of the present invention and keeping the cells at the optimal growth temperature for several hours. Both synthesized modified proteins can be recovered by disrupting the cells and subjected to subsequent purification or detection processes. It can also be subjected to the detection process in cells as it is. Select a translation template that is appropriate for the translation system used.
  • the present invention relates to a C-terminal modified protein synthesized from the translation template of the present invention (a protein modified at the C-terminus with a modifying agent (A in FIG. 2), and a protein modified at the C-terminus using the translation template (A in FIG. 3;
  • Fig. 3C protein modified with C-terminal by PEG
  • FIG. 5 a method for analyzing, characterized by using the modified protein of the present invention containing the protein
  • the modified protein of the present invention and the target molecule obtained above are brought into contact with each other by appropriately combining them according to the type of the modifying substance, the type of the reaction system, and the like.
  • the interaction is analyzed by measuring a change in the signal generated based on the interaction between the two molecules in the signal emitted by the target molecule.
  • Interaction analysis can be performed, for example, by fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence imaging analysis, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, surface plasmon resonance, or solid-phase enzyme immunoassay. Test method Done by The details of these methods will be described below.
  • Target molecule means a molecule that interacts with the modified protein of the present invention, and specifically includes proteins, nucleic acids, sugar chains, low molecular weight compounds, and the like.
  • the protein is not particularly limited as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention, and may be a full-length protein or a partial peptide containing a binding active site.
  • the protein may be a protein whose amino acid sequence and function are known or unknown. These can be translated from a synthesized peptide chain, a protein purified from a living body, or a cDNA library using a suitable translation system, and the purified protein can also be used as a target molecule.
  • the synthesized peptide chain may be a sugar protein having a sugar chain bonded thereto.
  • a purified protein having a known amino acid sequence or a protein translated and purified from a cDNA library or the like by an appropriate method can be preferably used.
  • the nucleic acid is not particularly limited as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention, and DNA or RNA can also be used. Further, the nucleic acid may have a known nucleotide sequence or function, or may have an unknown nucleic acid. Preferably, those having a known function as a nucleic acid capable of binding to a protein and a base sequence, or those obtained by cleavage and isolation from a genomic library or the like using a restriction enzyme or the like can be used.
  • the sugar chain is not particularly limited as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention, and may be a sugar chain having a known or unknown sugar sequence or function.
  • a sugar chain which has already been separated and analyzed and whose sugar sequence or function is known is used.
  • the low molecular weight compound is not particularly limited as long as it has an ability to interact with the modified protein of the present invention. Either one whose function is unknown or one whose ability to bind to a protein is already known can be used.
  • the “interactions” that these target molecules make with the modified protein of the present invention are generally defined as the covalent bond, hydrophobic bond, hydrogen bond, van der Waals bond, and electrostatic bond between protein and target molecule.
  • the term refers to the action of forces acting between molecules arising from at least one, but this term should be interpreted in the broadest sense and not in any sense in a limiting sense.
  • Covalent bonds include coordination bonds and dipole bonds.
  • the coupling by electrostatic force includes not only electrostatic coupling but also electric repulsion.
  • the interaction also includes a binding reaction, a synthesis reaction, and a decomposition reaction resulting from the above action.
  • interaction examples include binding and dissociation between an antigen and an antibody, binding and dissociation between a protein receptor and a ligand, binding and dissociation between an adhesion molecule and a partner molecule, and between an enzyme and a substrate. Binding and dissociation between nucleic acids and proteins that bind to it, binding and dissociation between proteins in the signal transduction system, glycosylation and dissociation between proteins and proteins, or glycoproteins and proteins Binding and dissociation between.
  • the target molecule to be used can be used after being modified with a modifying substance according to the embodiment.
  • Modifiers are usually selected from non-radioactive modifiers such as fluorescent materials.
  • Various fluorescent dyes that have free functional groups (for example, carboxyl group, hydroxyl group, amino group, etc.) and can be linked to the above target substances such as proteins and nucleic acids, such as fluorescein series, rhodamine series, Cy3, Cy5 , Eosin series, NBD series, etc.
  • the compound is a modifiable compound such as a dye, the type and size of the compound are not limited.
  • modifying substances those suitable for a method of measuring or analyzing a change in a signal generated based on the interaction between the target molecule and the modified protein of the present invention are appropriately used.
  • the above-mentioned modifying substance can be bound to the target molecule using an appropriate method known per se. Specifically, for example, when the target molecule is a protein, the method described above for modifying the C-terminus can be used. When the target molecule is a nucleic acid, it can be easily modified by a method such as performing PCR using an oligo DNA primer to which a modifying substance is previously bound by a covalent bond or the like.
  • the modified protein of the present invention or the target molecule used in the present invention may be bound to a solid phase depending on the embodiment.
  • the modifier used in the case of binding via the modifier is usually a molecule that specifically binds to a specific polypeptide (hereinafter sometimes referred to as a “ligand”). Is a specific polypeptide that binds to the ligand (hereinafter referred to as "ada Protein protein).
  • the adapter protein also includes a binding protein, a receptor protein constituting a receptor, an antibody, and the like.
  • adapter protein / ligand combinations include, for example, biotin-binding proteins / biotin such as avidin and streptavidin, maltose-binding proteins / maltose, G proteins / guanine nucleotides, and polyhistidine peptides / pike. Or metal ions such as cobalt, glutathione-S-transferase / glutathione, DNA-binding protein / DNA, antibody / antigen molecule (epitope), calmodulin / calmodulin-binding peptide, ATP-binding protein / Examples include ATP or various receptor proteins such as estradiol receptor protein / estradiol / ligand thereof.
  • adapter proteins / ligands include biotin-binding proteins such as avidin and streptavidin, maltose-binding proteins / maltose, and metal ions such as polyhistidine peptide / nickel or cobalt.
  • biotin-binding proteins such as avidin and streptavidin
  • maltose-binding proteins / maltose and metal ions such as polyhistidine peptide / nickel or cobalt.
  • metal ions such as polyhistidine peptide / nickel or cobalt.
  • Daryuthione-S-transferase / glucathione, antibody / antigen molecule (epitope), and the like, and a combination of streptavidin / pyotin is most preferred.
  • binding proteins are known per se, and the DNA encoding the protein has already been cloned.
  • the binding of the adapter protein to the solid surface can be carried out by a method known per se. Specifically, for example, tannic acid, formalin, glutaraldehyde, pyrvic aldehyde, bis-diazo A method using benzodizone halide, toluene-2,4-disocyanate, an amino group, a carboxyl group that can be converted into an active ester, or a hydroxyl group or an amino group that can be converted into a phosphoramidide can be used.
  • Measurement methods used include, for example, fluorescence correlation spectroscopy, fluorescence resonance energy transfer, evanescent field molecular imaging, fluorescence depolarization, fluorescence imaging analysis, surface plasmon resonance, solid-phase enzyme immunoassay, etc. Any system that can detect molecular interactions is available.
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy
  • This value varies with the number of particles present in the volume of space observed at a particular time.
  • the various parameters mentioned above can be calculated from the variation of this signal using an autocorrelation function.
  • Equipment for performing this FCS is also commercially available from Zeiss, etc., and analysis can be performed using these equipment also in this method.
  • the target molecule does not need to be modified.
  • molecules that are much smaller in molecular weight than the C-terminal modified protein whose interaction is to be investigated do not affect the Brownian motion of the C-terminal modified protein.
  • FCCS Fluorescence resonance energy transfer
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the FCCS method when compared to other detection systems such as the fluorescence depolarization method, the FCCS method has the advantages of requiring a smaller amount of sample, shorter detection time, and easier automation for HTS.
  • the FCCS method can provide very basic information such as the size and number of fluorescently labeled molecules, and may be used for general purposes such as surface plasmon resonance. The difference between the two is that the surface plasmon resonance method detects interactions in a protein immobilized state, while the FCCS method allows you to see interactions in a solution that is closer to the natural state. .
  • the FCCS method it is necessary to label the protein with a fluorescent dye instead of immobilizing the protein, but the present invention has made it possible to overcome this problem.
  • any method may be used for bringing the C-terminal modified protein into contact with the target molecule, as long as the two molecules are brought into contact with each other to an extent sufficient to interact with each other.
  • a number of simultaneous analyzes are performed, for example, by injecting a plurality of different C-terminally modified proteins into each of the measurement wells of the above-mentioned FCS measurement apparatus, and then adding a specific target molecule solution thereto.
  • a specific C-terminal modified protein is charged, and a plurality of different target molecule solutions are charged into each well.
  • a modified molecule is brought into contact with a solid-phased molecule, and the interaction between the two molecules causes the fluorescence emitted from the modified molecule remaining on the solid-phased molecule to be converted to a commercially available fluorescence.
  • This is a method of measuring or analyzing using a fluorescence imaging analyzer.
  • the C-terminal modified protein or the target molecule needs to be immobilized by the method described above. Modification when the target molecule is immobilized Both available and not available are available. When used without being immobilized, it is necessary to be modified with the above-mentioned modifying substance.
  • the C-terminal modified protein either a protein immobilized through a modified portion or a protein immobilized in a portion other than the modified portion can be used.
  • a substrate for immobilizing a C-terminal modified protein or a target molecule As a substrate for immobilizing a C-terminal modified protein or a target molecule, a nitrocellulose membrane or a nylon membrane, which is usually used for immobilizing proteins or nucleic acids, or a plastic microplate, etc., is also used. be able to.
  • the method of contacting the modified target molecule or the C-terminal modified protein with the immobilized molecule may be any method as long as the two molecules are brought into contact to an extent sufficient for interaction.
  • a method in which a modified target molecule or a C-terminal modified protein is dissolved at a suitable concentration in a buffer commonly used in biochemistry at an appropriate concentration, and the solution is brought into contact with the surface of a solid phase is preferred.
  • a step of washing the excessively present modified target molecule or C-terminal modified protein with the same buffer or the like is preferably performed, and the target molecule or C-terminal modified protein remaining on the solid phase
  • the fluorescence signal emitted from the modified substance of the above or the mixed signal of the fluorescence emitted from the modified molecule immobilized on the solid phase and the fluorescence emitted from the modified molecule remaining on the solid phase is used. By measuring or analyzing, it is possible to identify a molecule that interacts with the immobilized molecule.
  • a method for performing a large number of analyzes at the same time includes, for example, a method in which a plurality of c-terminal modified proteins or a modified or unmodified target molecule is assigned to the solid phase surface and immobilized, or A method in which a plurality of types of C-terminal modified proteins or modified target molecules which are not immobilized on a type of C-terminal modified protein or a modified or unmodified target molecule are brought into contact is used.
  • the molecules that remain on the solid phase are obtained by dissociation due to differences in buffer concentration, etc., and are obtained by a known method. It can be identified by analyzing with.
  • Fluorescence resonance energy transfer is a method that uses two fluorescent dyes It is well known as an interaction detection method.
  • FRET means that when the fluorescence spectrum of one of the two fluorescent dyes (energy donor) and the absorption spectrum of the other (energy acceptor) overlap, if the distance between the two fluorescent dyes is small enough, A phenomenon in which the probability that the excitation energy excites a receptor increases before light emission from the donor occurs. Therefore, two proteins whose interaction is to be detected are labeled with a fluorescent dye that serves as a donor and an acceptor, respectively.If the donor is excited, the two proteins do not interact with each other.
  • FRET does not occur due to the large distance between the two molecules, and the fluorescence spectrum of the donor is observed.However, when the two proteins interact and the distance between the fluorescent dyes decreases, FRET reduces the fluorescence spectrum of the acceptor. As observed, it is possible to determine the presence or absence of protein-protein interaction based on the difference in the wavelength of the fluorescent spectrum.
  • the fluorescent dye a combination of fluorescein as a donor and rhodamine as an acceptor is often used. Recently, attempts have been made to observe FRET in cells and detect the interaction using a combination of mutants of fluorescent green protein (GFP) with different wavelengths.
  • the disadvantage of this method is that the two fluorescent dyes must be within 40-50 A of each other for FRET to occur, so depending on the size of the protein and the location of the fluorescent dye, they may interact. However, there is a risk that FRET will not be observed.
  • the evanescent field molecular imaging method is a method described in Funatsu, ⁇ ⁇ , et al., Nature, 374, 555-559 (1995), etc., in which molecules immobilized on a transparent body such as glass are used as a solution. This method involves contacting a second molecule, irradiating it with a light source such as a laser beam at an angle at which an evanescent field is generated, and measuring or analyzing the generated evanescent light with a detector. These operations can be performed using an evanescent field fluorescence microscope known per se.
  • either the C-terminal modified protein or the target molecule must be immobilized by the method described above.
  • the target molecule does not need to be modified when immobilized, but when used without being immobilized, it must be modified with the above-mentioned modifying substance.
  • a substrate for immobilizing the C-terminal modified protein or target molecule As a substrate for immobilizing the C-terminal modified protein or target molecule, A substrate made of a material such as a lath is used, and quartz glass is preferably used. Further, it is preferable that the surface is subjected to ultrasonic cleaning in order to prevent scattering of laser light.
  • the method of contacting the C-terminal modified protein or the modified target molecule, which is not immobilized, with the immobilized molecule in this method is not particularly limited as long as the two molecules are in contact with each other to an extent sufficient for interaction.
  • a solution in which the unmodified C-terminal modified protein or modified target molecule is dissolved at an appropriate concentration in a buffer commonly used in biochemistry is prepared, and this is immobilized on the surface of the solid phase.
  • the dropping method is preferred.
  • a method of performing a large number of analyzes at the same time for example, a method of addressing a plurality of C-terminal modified proteins or modified target molecules and immobilizing the same on the substrate is used.
  • the fluorescence polarization method (Perran, J., et al., J. Phys. Rad., 1, 390-401 (1926)) states that a fluorescent molecule excited by fluorescence polarization changes its steady state during the excited state. If it is kept, it emits fluorescence in the same plane of polarization, but if the excited molecule performs rotational Brownian motion etc. during the excited state, the emitted fluorescence will be on a different plane from the excitation light It is a way to use that.
  • the motion of the molecule is affected by its size, and when the fluorescent molecule is a macromolecule, there is little motion of the molecule during the excited state, and the emitted light remains polarized.
  • the emitted light is depolarized because of the high speed of movement. Therefore, the intensity of the fluorescence emitted from the fluorescent molecule excited by the plane-polarized light is measured on the original plane and a plane perpendicular to the original plane, and the motility of this molecule and the state of its existence are determined from the ratio of the fluorescence intensity on both planes. Information can be obtained. According to this method, the behavior of the target molecule that interacts with the fluorescently-modified molecule can be tracked without being affected by contaminants. This is because the change in polarization is measured only when the target molecule interacts with the fluorescently modified molecule.
  • BECON manufactured by Panyera
  • the present method can also be performed by using these devices.
  • any method can be used to bring the target molecule into contact with the C-terminal modified protein, as long as the two molecules come into contact with each other to an extent sufficient to interact with each other.
  • the interaction between the C-terminally modified protein and the target molecule measured in this method may not necessarily be as specific as the antigen-antibody method, so to detect the optimal combination, It is effective to quantify the degree of action.
  • an index indicating the degree of interaction for example, a value of a minimum target substance concentration that gives a maximum fluorescence polarization degree for a certain concentration of a C-terminal modified protein can be used.
  • a large number of analyzes can be performed at the same time, for example, by introducing a plurality of different c-terminal modified proteins to each measurement well of the fluorescence polarization elimination measurement apparatus, and adding a specific target molecule solution Alternatively, a specific C-terminal modified protein is added, and a plurality of different target molecule solutions are added to each well.
  • Surface plasmon resonance is a method in which surface plasmons are excited by molecules interacting at the metal / liquid interface and are measured by changes in the intensity of reflected light (Cullen, DC, et al., Biosensors, 3 (4 ), 211-225 (1987-88)).
  • the C-terminal modified protein When measuring or analyzing the interaction between protein and target molecule using this method, the C-terminal modified protein must be immobilized by the method described above, but the target molecule must be modified. Absent.
  • a substrate for immobilizing the C-terminal modified protein a substrate in which a metal thin film of gold, silver, platinum or the like is formed on a transparent substrate of glass or the like is used.
  • the transparent substrate may be any substrate as long as it is generally used for a surface plasmon resonance device, and is generally made of glass or the like as being made of a material transparent to laser light.
  • the thickness is about 0.1 to 5 mm.
  • the thickness of the metal thin film is suitably about 100 to 200 OA.
  • a commercially available solid substrate for such a surface plasmon resonance device can also be used.
  • the C-terminal modified protein can be immobilized on the substrate by the method described above.
  • the method of bringing the target molecule into contact with the C-terminal modified protein in this method may be any method as long as the two molecules come into contact with each other to an extent sufficient to interact with each other.
  • a method may be used in which the solid-phased C-terminal protein is brought into contact with a solution dissolved at an appropriate concentration in a commonly used buffer solution.
  • a commercially available surface plasmon resonance device for example, BIAcore2000 (Pharmacia Biosensor). After bringing both molecules into contact with each other, the change in relative intensity of the reflected light with time is measured using a surface plasmon resonance device known per se, and the immobilized C-terminal modified protein and target are measured. Analyze molecular interactions.
  • a large number of analyzes can be performed simultaneously, for example, by immobilizing and immobilizing a plurality of C-terminal modified proteins on a substrate used in the surface plasmon resonance apparatus, or by using one type of solid phase.
  • a method of contacting a plurality of types of target molecules with the modified C-terminal modified protein is used.
  • Enzyme Linked Immunosorbent Assay Crowther, JR, Methods in Molecular Biology, 42 (1995)
  • a solution containing an antibody is contacted with an antigen immobilized on a solid phase.
  • the fluorescence emitted from the modified molecule such as IgG
  • the modified molecule that specifically binds the antibody remaining on the immobilized antigen to the antigen
  • ELISA reader a commercially available detector
  • the C-terminal modified protein serving as the antigen be immobilized by the above-described method. Further, the target molecule to be an antibody needs to be modified with the above-mentioned modifying substance.
  • a plastic microplate usually used for ELISA can also be used as a substrate for immobilizing a C-terminal modified protein serving as an antigen.
  • the method for bringing the modified target molecule, which is to be an antibody, into contact with the solid phase molecule in this method may be any method as long as the two molecules come into contact with each other to an extent sufficient for interaction.
  • a preferred method is to prepare a solution in which the molecule is dissolved at an appropriate concentration in a buffer commonly used in biochemistry and inject the solution into a microplate.
  • a step of washing the excessively present modified molecules that are not bound to the immobilized molecules with the same buffer or the like is performed, and the fluorescence emitted from the modified molecules remaining on the solid phase is measured.
  • a molecule that interacts with the immobilized antigen molecule can be identified by measurement or analysis using a commercially available ELISA reader or the like.
  • a target molecule that has been measured by each of the above methods and that has recognized an interaction with a C-terminal modified protein is known per se if the primary structure of the molecule is unknown.
  • the primary structure can be analyzed by an appropriate method. Specifically, when the target molecule for which the interaction is recognized is a protein, the primary structure can be specified by analyzing the amino acid sequence using an amino acid analyzer or the like. Further, when the target molecule is a nucleic acid, the base sequence can be determined by a base sequence determination method using an automatic DNA sequencer or the like.
  • a known suitable device for immobilizing a C-terminal modified protein on a solid phase via a modified portion described above is used.
  • An apparatus can be constructed by combining various means. Each means in the present apparatus is known, and the operations such as holding the substrate, adding the C-terminal modified protein solution, and washing in these means may be performed by methods known per se. By combining these operations, a fully-automatic or semi-automatic device for immobilizing a C-terminal modified protein can be constructed.
  • an apparatus can be constructed by combining known appropriate means for performing the protein-target molecule interaction measurement described above.
  • Each means in the present apparatus is itself known, and operations such as substrate holding, addition of target molecules, washing, and signal detection in these means may be performed by methods known per se. By combining these operations, a fully-automatic or semi-automatic device for measuring protein-target molecule interaction can be constructed.
  • Example 1 Preparation of Translation Template and Translation (C-Terminal Labeling)
  • the coding molecule was C-jun or C-fos derived from mouse (Gentz R, Rauscher FJ 3d, Abate C, Curran T (1989) Science 243: 1695).
  • MA templates were transcribed (37 ° C, 2h) using RiboMAX TM Large Scale RNA Production Systems (Promega), the synthesized mHNA was purified using RNeasy Mini Kits (QIAGEN), and the mMA template (coding molecule) was purified. Obtained.
  • FIG. 6 shows that the amount of translation increases when the protein has the SNNS sequence (X sequence) rather than the poly A sequence (A sequence) and further has the SNNS-poly A sequence (XA sequence). From this, it can be said that a translation template having an XA sequence is preferable for general translation and C-terminal labeling. Also, from the translation result when the X sequence is changed, the X sequence must be composed of at least 4 bases in order to exhibit the effect in combination with the A sequence, and the first and fourth bases are C Or G, indicating that an SNNS (S is C or G) configuration is required.
  • a translation template was prepared by ligating one molecule of PEG spacer (see Production Examples 1 to 4 below) to the 3 ′ side of the mRNA template.
  • the amount of translation can be increased by ligating a part of the PEG linker to basically any sequence of the coding section (A in FIG. 7).
  • the translation template (XA) which has a coding part with an XA sequence, has about 3 to 4 times more translation than the code molecule (None), which has neither the XA sequence nor any PEG spacer. was shown.
  • the PEG4000Puro-Boc configuration maximized the translation amount in the code portion having the XA sequence (B in FIG. 7).
  • a translation template having an XA sequence in which a part of the PEG spacer is ligated is suitable for general translation and C-terminal labeling. From Fig. 8, the translation amount of the coding molecule having the XA sequence ( ⁇ ; XA) and the coding molecule having no XA sequence (mouth; None) reached saturation in 3 hours, but the translation template ( ⁇ ; PEG4000Puro-Boc) XA + PEG400Pm? O-Boc) showed an increase in translation even at 6 hours (A in FIG. 8).
  • the translation template ( ⁇ ) having PEG4000Puro-Boc is about twice as large as the code molecule having the XA sequence (A; XA) and the coding molecule having no XA sequence. (Mouth; None) (Fig. 8A).
  • a coding molecule and a translation template with a PEG spacer In comparison, the stability of the coding molecule (K; XA) was reduced by 50% in its mRNA in 1 hour, whereas that of the translation template with a PEG spacer part ( ⁇ ) in 13 hours. The rapid decrease of 50% indicates that the stability of the code molecule ( ⁇ ) having a part of the PEG spacer is very good (B in Fig. 8). From the above, it is considered that the increase in the amount of translation of the translation template ( ⁇ ) is due to the improved stability of the ligated PEG4000Puro-Bo.
  • a PEG spacer molecule (see Production Examples 1 to 4) ligated to a coding molecule (mRNA template) was used as a translation template.
  • mRNA template Jun-XA, Jun-A
  • PEG 2000 Puro a part of PEG spacer
  • the ligated mA template was translated in the same manner as in Example 1 using Wheat Germ Extract (Promega) as a cell-free translation system for wheat germ, and the corresponding molecule was converted to 8 M urea 10% SDS-PAGE. And detected by fluorescence (fluorescein) using a multi-image analyzer, Molecular Imager FX (Bio-Rad).
  • the amount of free protein was determined by labeling the protein using Fluor-dCpPuro as a modifier at the same time as translation (Miyamoto-Sato, R, Nemoto, ⁇ , Kobayashi, ⁇ , and Yanagawa, H. 2000). Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182; Nemoto, N., Miyamoto-Sato, E. and Yanagawa, H. (1999) FEBS Lett., 462: 43-46) and 8 M urea 10% SDS- Electrophoresis by PAGE and 15% SDS-PAGE, and the fluorescence (fluorescein) of the band was measured with a multi-image analyzer, Molecular Imager FX (Bio-Rad). In addition, Western plot using T7-tag antibody The total protein was determined with. Fig. 9 shows a graph summarizing the results.
  • PEG spacer molecule (U) was synthesized by the method shown in FIG. 11 using the reagent shown in FIG.
  • the amidite reagents (1-5) in Figure 10 were purchased from Glen Research (America, Virginia). PEG having an average molecular weight of 1,000, 2000, and 3000 was purchased from NOF Corporation (Shibuya-ku, Tokyo). PEG having an average molecular weight of 4000 was purchased from Hurikisha (Switzerland).
  • the amidite reagent (6) was synthesized from these starting materials using the method reported by Jaschke et al. (Jaschke, A. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34: 301-304). 10 in FIG.
  • DMTr in FIG. 10 represents a 4,4, -dimethoxytrityl group
  • Fmoc in FIG. 11 represents a 9-fluorenemethoxycarbonyl group.
  • the PEG spacer single molecule (14) was synthesized by the method shown in FIGS. 11 and 12 using the reagent shown in FIG.
  • rhodamine green (RhodG) active ester (7) was obtained from Morexura Probes (Oregon, USA), and Cy5 active ester (8) and Cy3 active ester (9) were obtained from Amersham Pharmacia Biotech ( Igi (Squirrel, Buckinghamshire).
  • FIG. 12 was synthesized by applying the method reported by Ikeda et al. (Ikeda, S. et al. (1998) Tetrahedron Lett. 39: 5975-5978).
  • Boc represents a tert-butoxycarbonyl group.
  • Boc-protected PEG spacer part (15) was converted from 12 (400 ig, containing puromycin lO ⁇ mol) using the same method as PEG spacer part (11). Synthesis did. The structure and yield of the obtained Boc-protected PEG spacer single molecule (15) are shown below. p (dCp) 2 T (Fl) pPEG (4000) p (dCp) 2 Puro (Boc) Yield 41% Production Example 4 Synthesis of puromycin-free PEG spacer single molecule (16)
  • Modifiers 1 to 7 were synthesized using the reagents shown in FIGS. 15 and 16 and the method outlined in FIGS. 17 and 18.
  • amidite reagents (15-19) were purchased from Glen Research (American, Virginia), and succinimide reagents (20-22) were purchased from Pierce (Illinois, USA).
  • Modifier 1 yield 44%, UV (50% MeOH -H 2 0) e max 558 nm; MS m / z 2037 (M - H) one modifying agent 2: Yield 32%, UV (H 2 0 ) Belly 558 nm; MS m / z 2035 (MH)
  • Modifier 3 Yield 83 ⁇ 4 ⁇ UV (H 2 0) Aniax 506 nm; MS m / z 2093 (M-H) —
  • the stability of the translation template in the translation system is improved, and the absolute amount of the translation is increased.
  • the ratio of the target assigning molecule to the total protein produced by translation is improved, and the assigning molecule is efficiently obtained. be able to.

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Abstract

　ポストゲノム研究の構造および機能解析研究をハイスループットに行うツールとして、蛋白質の合成を効率的に行える翻訳テンプレートを提供する。翻訳テンプレートは、コード部のみ、またはコード部とPEG部から構成され、そのコード部の3'末端に、アクセプター領域と、アクセプター領域の5'上流の、配列SNNSを含む翻訳増強配列とを持つ場合は、そのPEG部は蛋白質とペプチジル転移反応により結合できないものであることが蛋白質の合成に用いるのに有利であり、そのコード部の3'末端にアクセプター領域を持つ場合は、そのPEG部は蛋白質とペプチジル転移反応により結合できるものであることが対応付けに用いるのに有利である。これらの翻訳テンプレートによって合成された蛋白質、Ｃ末端修飾蛋白質、および対応付け分子も提供し、これらＣ末端修飾蛋白質の修飾剤および対応付け分子のPEG部に機能性修飾を持たせることも可能である。

Description

翻訳テンプレートおよびそのライブラリー、 それらから合成される蛋白質および 蛋白質のライブラリー、 ならびにそれらを構成する要素、 ならびにそれらの製造 法および利用方法 技術分野
現在、 多様な生物のゲノムの塩基配列が解読されようとしている。 ゲノムシー ケンスの研究では、 第 2幕のポストシーケンスの研究として、 解読したゲノム情 報からその意味を解析する研究、 すなわち、 遺伝子や蛋白質の構造や機能解析 ^Saegusa A. Japan boosts proteomics and cell biology... Nature 401, 6751 (1999), Dalton R， Abbott A. Can researchers find recipe for proteins and chips? Nature 402, 6763 (1999)), および蛋白質間、 核酸-蛋白質間相互作用解析などが期待されている（宫 本悦子、 柳川弘志 ( 2000 ) シリーズ ·ポストシークェンスのゲノム科学 3 : プロ テオミクス， pp. 136- 145; 宫本悦子、 柳川弘志 （2001 ) 蛋白質 .核酸 .酵素、 46 (2 )， pp. 138- 147)。 これらの構造および機能解析には、 蛋白質の大量発現が重要 となってくる。 蛋白質の大量発現が可能な無細胞翻訳系とともに、 蛋 質の大量 発現が可能で安定な翻訳テンプレートの開発が所望されている（白水美香子、 木 川隆則、 横山茂之（2000) シリーズ 'ポストシークェンスのゲノム科学 3 : プロテ 才ミクス， pp. 197- 205 )。
ボストゲノム機能解析によって、 重要な生体酵素の発見などによる医薬品の創 製など、 医療、 食料、 エネルギー、 環境など多くの分野の産業の基本ツールとし て積極的に利用可能である。 背景技術
ポストゲノム構造および機能解析研究のヅ一ルとして様々なものが開発されて きている。 どのような解析方法であっても、 蛋白質の解析に共通して欠かせない ものは、 蛋白質の合成工程であり、 さまざまな生物種のゲノムや cDNAから一万種 類以上の蛋白質を発現させねばならない。 そのためには、 ハイスループッ トで強 力な無細胞翻訳系が開発されてきた。 大腸菌内での発現方法と比較した利点は、 ( 1 )発現べクタ一にクローニングすることなく、 直線状 DNA断片や転写した m Aか ら直接目的の蛋白質が発現可能、 （2)短時間の反応で大量発現が可能、 （3)凝集し やすい性質や毒性を持つような発現の難しい蛋白質も生産可能、 などが挙げられ る。
これまで、 無細胞翻訳系として小麦胚芽の系 (Madin K， Sawasaki T， Ogasawara Τ， Endo Υ. A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jan 18;97(2):559-64.)、 および大腸菌の系 (Shimizu Y， Inoue A, Tomari Y， Suzuki T， Yokogawa T， Nishikawa K, Ueda T. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 2001 Aug;19(8):751-5.)におレ、 て、 蛋白質の大量発現が研究されてきている。 それに伴い、 蛋白質の大量発現が 可能な安定した翻訳テンプレートの開発として、 mRNAの安定性向上と翻訳効率向 上のために、 一般的には 3' UTRが使われるが (Sachs A.B., Samow P, and Hentzw M.W. Starting at the Beginning, Middle, and Ena; Translation Initiation in Eukaryotes. (1997) Cell 89， 831-838)^ mRNAの化学構造の置換や修飾などの方法 (Ueda T, Tohda H, Chikazumi N, Eckstein F， Watanabe K.， Cell-free translation system usine phosphorothioate-containing mRNA. Nucleic Acids Symp Ser. 1991;(25):151-2.)を用レヽ ることなどが考案されている。
また、 ポストゲノム機能解析研究のために開発されてきたいろいろな解析ヅ一 ルにも無細胞翻訳系による蛋白質合成が重要な役割を占めている。 その主なもの を以下に挙げる。 いずれも、 蛋白質の大量発現が不可欠である。
分子間相互作用の検出方法として、 これまで表面プラズモン共鳴法、 蛍光共鳴 エネルギー移動法、 蛍光偏光解消法、 エバネツセント場イメージング法、 蛍光相 関分光法、 蛍光イメージング法、 固相酵素免 ¾δ検定法などが知られている。 とり わけ、 蛍光相関分光法 (Fluorescence Correlation Spectroscopy： FCS) は、 測 定に必要な試料量が少なく （およそフェムトリヅトル） 、 測定時間が短く （およ そ 10秒） 、 HTSのための自動化が容易である （実際に EV0TEC社では 1日で 10万検 体以上のスクリーニングを行うウルトラ HT Sを目指した装置の開発を行なってい る） 等の長所があり、 検出系として優れている （金城政孝 （1999) 蛋白質核酸酵 素 44 : 1431-1438) 。 さらに 2種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法 (Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy： FCCS) では、 1種類の蛍光色素を 用いる FCSでは困難であつた同程度の大きさをもつ分子間の相互作用も検出が可 能であり、 タンパク質相互作用の HTSへの応用が期待されている。
一般に、 タンパク質相互作用の検出系では、 固相化のための夕グゃ蛍光色素等 のプローブでタンパク質を修飾する必要がある。 本発明者等は、 ピューロマイシ ン等の核酸誘導体を用いて翻訳系中でタンパク質の C末端を修飾する方法を先に 提案している （特開平 11-322781、 特開 2000-139468) 。 この方法は、 従来の化学 修飾法や蛍光夕ンパク質融合法に比べて、 夕ンパク質の機能を損ないにくい等の 利点がある。
一方、 進化分子工学のツールとして誕生した 「遺伝子（遺伝子型）と蛋白質（表 現型）の対応付け」 を応用して、 ポストゲノム機能解析における蛋白質間相互作 用を網羅的に解析する方法として、 in vitro virus法 （Miyamoto-Sato E, et al. The constraction of the virus type assignment molecule in evolutionary molecular engineering. Viva Origino 25, 35 (1997), Nemoto N， et al. In vitro virus: Bonding of mRNA bearing puromycin at the 3 '-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. FEBS Lett. 414， 405 (1997)， W098/16636)、 STABLE法 (Doi N, Yanagawa H. STABLE: protein-DNA fusion system for screening of combinatorial protein libraries in vitro. FEBS Lett. 457, 227 (1999))、 ファージデイス フ。レ一、法 (Smith G.P. Searching for peptide ligands with an epitope library. Science 228, 1315 (1985))、 リボソーム 'ディスプレイ法 (Mattheakis, L.C. et al. (1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,9022-9026, Mattheakis,L.C. & Dower,WJ. (1995)WO 95/11922) ) 、 mRNA- peptide fusion (mRNA display)法 (Roberts R.W, Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94， 12297)などである。 発明の開示
ポストゲノム構造および機能解析研究のツールとして様々なものが開発されて きている。 どのような解析方法であっても、 蛋白質の解析に共通して欠かせない ものは、 蛋白質の合成工程であり、 さまざまな生物種のゲノムや cDNAから一万種 類以上の蛋白質を発現させねばならない。 その目的で、 ハイスループットで強力 な無細胞翻訳系が開発されてきた。 大腸菌内での発現方法と比較した利点は、 （1 ) 発現べク夕一にクローニングすることなく、 直線状 DNA断片や転写した mRNAから 直接目的の蛋白質が発現可能、 （2)短時間の反応で大量発現が可能、 （3)凝集しや すい性質や毒性を持つような発現の難しい蛋白質も生産可能、 などが挙げられる。 ここで、 mRNAの安定性向上と翻訳効率向上のために一般的に 3' UTRが使われるが Sachs A.B., Sarnow P., and Hentzw M.W. Starting at the Beginning, Middle, and Ena; Translation Initiation in Eukaryotes. (1997) Cell 89, 831-838)、 3， UTRは数百ベースと 長いので、 PCRで簡単にプライミングでつけることは出来ない。 そこで、 せっか く無細胞翻訳系を利用するのに 3' UTRを持つベクターに組み込んで利用すること に る (Madin K， Sawasaki T, Ogasawara Τ， Endo Υ. A highly efficient and robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos: plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jan 18;97(2):559-64.)o しかしながら、 最近の研究で 3， UTRの機能は翻訳量の調節にあ ることがわかってきており (Boucher N. et al. A common mechanism if stage-regulated gene expression in Leishmania mediated by a conserved 3' UTR element. J. Biol. Chem. 2002 Mar 23; [epub ahead of print])、 一概に翻訳を増加させるだけではなく抑制す る場合も考えられるなどの問題点も抱えている。 また、 mRNAの化学構造の置換や 修飾などの方法 (Ueda T， Tohda H, Chikazumi N, Eckstein F, Watanabe K.， Cell-free translation system using phosphorothioate-contaming mRNA. Nucleic Acids Symp Ser. 1991;(25):151-2.)では、 化学構造を置換した材料が高価であったり、 安定性は得ら れるが、 翻訳に支障を来す可能性があるなどの問題点が挙げられる。
本発明の目的は、 以上の問題を解決するために、 作成方法が簡単で安定でかつ 高効率に蛋白合成を行える翻訳テンプレートを提供することである。 この翻訳テ ンプレートによって、 ポストゲノム構造および機能解析をハイスループットに行 うことが出来る。 また、 この翻訳テンプレートの利用により、 C末端ラベル化蛋 白質（Labeled protein and its oroducing methoa, labeling compound to be used in the method for analyzing function of genes, 2001, U.S.Patent 6,228,994, H. Yanagawa, N. Nemoto, E. Miyamoto)による蛋白質の相互作用解析、 および対応付け分子 (Molecule that homologizes genotype and phenotype ana utilization thereof, 1998， PCT/JP97/03766 (W098/16636) H. Yanagawa, N. Nemoto, E. Miyamoto, Y. Fusimi)に よるゲノム機能解析、 進化分子工学への応用などの解析能力を従来よりもいっそ う向上させることが出来る。
本発明の第一の発明は、 蛋白質に翻訳される情報を含むコード部の 3'末端に PE Gスぺーサ一部をライゲーシヨンした翻訳効率の高い翻訳テンプレートとその合 成方法であり、 その PEGスぺーサ一部に機能性修飾物質を持たせることが可能な 構成を特徴とし、 およびそのテンプレートによって合成された蛋白質やそのライ ブラリーを提供するものである。 また、 第二の発明は、 第一の発明の翻訳テンプ レートを用いて合成された C末端ラベル化蛋白質とその合成方法であり、 特に、 翻訳テンプレートのコード部の 3'末端に特別な配列（ XA配列）を用いることが特徴 であり、 また、 その C末端修飾剤に機能性修飾物質を持たせることが可能な構成 を特徴とし、 およびそのテンプレートによって合成された C末端修飾された蛋白 質とそのライプラリーを提供するものである。 第三の発明は、 第一の発明の翻訳 テンプレートを用いて合成された翻訳テンプレート C末端修飾された蛋白質（対 応付け分子）または PEGスぺーサ一部で C末端修飾された蛋白質、 とそれらの合成 方法であり、 特に、 翻訳テンプレートのコード部の 3'末端に特別な配列（A配列） を用いることが特徴であり、 また、 その PEGスぺーサ一部に機能性修飾物質を持 たせることが可能な構成を特徴とし、 およびそのテンプレートによって合成され た C末端修飾された蛋白質とそのライブラリーを提供するものである。
本発明の第一の発明は、 蛋白質に翻訳される情報を持つコ一ド部と PEGスぺー サ一部からなることを特徴とする翻訳テンプレートに関するものである。 コード 部は、 蛋白質に翻訳される情報であり、 どのような配列でも良いが、 好ましくは、 コード部の 3'末端領域にァクセプター領域 (A配列）を持つ、 または、 コード部の 3 '末端領域にァクセプター領域 (A配列）を持ち、 かつ A配列の 5'上流に翻訳増強配 列 （X配列） を持つことを特徴とする。 コード部の A配列と'して、 短いポリ A配列 を含む。 X配列として、 C (または G)丽 C (または G)配列を有する配列、 たとえば、 X hoi配列を有することを特徴とする。 PEGスぺーサ一部は、 ポリエチレングリコー ルを主成分とした PEG領域、 コード部と連結するためのドナー領域、 および 3'末 端に CCA領域を持つ。 PEGスぺーサ一部は、 ドナー領域のみ、 CCA領域のみでもか まわないが、 好ましくは、 ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域を含 む構成をとる。 CCA領域は、 該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、 ぺプチド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とし得る。 PEG領 域のポリエチレングリコールの分子量は、 400以上であることを特徴とし得る。 また、 ドナ一領域および/または CCA領域において、 少なくとも 1つの機能付与ュ ニヅト（F)を含むことを特徴とし得る。 機能付与ユニット（F 1および/または F 2 ) が、 該翻訳テンプレートおよび/または該翻訳デンプレートから翻訳された蛋白 質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とし得る。 固定化物質としてピオ チンなどが考えられ、 蛍光性物質として、 フルォレセィン， Cy5， またはローダ ミングリーン（RhG)などが考えられる。 これらのコード分子や翻訳テンプレート、 およびそのライブラリー、 さらに、 リボソーム上で翻訳された蛋白質やそのライ ブラリーに関するものである。 翻訳テンプレートはコード部のみからなるもの (コード分子） であってもよい。
本発明の第二の発明は、 第一の発明の翻訳テンプレートにより翻訳され、 修飾 剤によって C末端ラベル化された蛋白質に関するものである。 翻訳テンプレート は、 蛋白質に翻訳される情報を持つコード部とポリエチレングリコールを主成分 とした PEGスぺーサ一部からなる。 コード部は、 A配列と X配列を有し、 A配列とし て、 短いポリ A配列を含む。 X配列として、 C (または G)匪 C (または G)配列を有する 配列、 たとえば、 Xhol配列を有することを特徴とする。 PEGスぺーサ一部は、 ポ リエチレングリコールを主成分とした PEG領域において、 ポリエチレングリコ一 ルの分子量が 400以上であることを特徴とする、 また、 ドナー領域および/または CCA領域において、 少なくとも 1つの機能付与ュニヅト（F )を含むことを特徴とし 得る。 CCA領域は、 該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、 ペプチド 転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とし得る。 機能性修飾物質 ( F 1および/または F 2 )が、 該翻訳テンプレートおよび/または該翻訳テンプレー トから翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とし得る。 固定化物質としてピオチンなどが考えられ、 蛍光性物質として、 フルォレセイン， Cy5， またはローダミングリーン（RhG)などが考えられる。 また、 修飾剤は、 蛋 白質の C末端を標識する修飾部とピュー口マイシンを含むぺプチドアクセプ夕一 部、 およびそれらを連結するヌクレオチドのリンカ一、 からなる。 また、 修飾剤 は、 修飾部に、 機能性修飾物質 (F3)を含むことを特徴とし得る。 該 F3が、 該翻訳 テンプレートにより翻訳された蛋白質を固定化または蛍光ラベル化することを特 徴とする。 固定化物質としてピオチンなどが考えられ、 蛍光性物質として、 フル ォレセイン， Cy5， またはローダミングリーン（RhG)などが考えられる。 これら、 コード部および翻訳テンプレート、 およびそのライブラリーが、 修飾剤の存在下 で、 リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質お よび蛋白質のライブラリーに関するものである。
本発明の第三の発明は、 翻訳テンプレートによって C末端修飾された蛋白質 (二 対応付け分子）に関するものである。 翻訳テンプレートは、 蛋白質に翻訳される 情報を持つコード部と PEGスぺ一サ一部からなる。 コード部の 3'末端に A配列を有 し、 A配列は、 短いポリ A配列を含む。 PEGスぺーサ一部は、 ポリエチレングリコ ールを主成分とした PEG領域において、 ポリエチレングリコールの分子量が 400以 上であることを特徴とする、 また、 ドナー領域および/または CCA領域において、 少なくとも 1つの修飾物質（F 1および/または F 2 )を含むことを特徴とし得る。 ま た、 CCA領域は、 該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、 ペプチド転 移反応によって結合する機能を有することを特徴とし、 代表的には CCA領域にピ ユーロマイシンを有する。 また、 修飾物質（F 1および/または F 2 )が、 該翻訳テ ンプレートおよび/または該翻訳テンプレートから翻訳された蛋白質を固定化ま たは蛍光ラベル化することを特徴とし得る。 固定化物質としてピオチンなどが考 えられ、 蛍光性物質として、 フルォレセィン， Cy5， またはローダミングリーン (RhG)などが考えられる。 これら、 コード部および翻訳テンプレート、 およびそ のライブラリーが、 リボソーム上で翻訳されることにより合成される蛋白質 (二対 応付け分子）および蛋白質 (二対応付け分子）のライブラリーに関するものである。 これら 3つの発明を応用した発明として、 コード分子および翻訳テンプレート、 およびそのライブラリーを用いて、 無細胞翻訳系、 および細胞での蛋白質の大量 合成が可能であり、 蛋白質の構造と機能解析が実現できる。 また、 リボソーム上 で翻訳されることにより合成される蛋白質 (=蛋白質、 C末端ラベル化蛋白質、 対 応付け分子）およびそのライブラリーのいろいろな組み合わせを用いて、 in vitr oまたは in vivoで蛋白質と物質の相互作用解析が可能である。 たとえば、 対応付 け分子は、 分子進化工学的な機能物質の創製やゲノム機能解析に利用できる （図 4 )。 蛋白質と物質の相互作用解析において、 翻訳テンプレートとそのライブラ リーおよび/または蛋白質とそのライブラリーを蛍光ラベル化および/または固定 化することを特徴とする蛋白質と物質の相互作用解析も可能である（図 5 )。 たと えば、 各種のァフィ二ティー .スクリ一ニング、 マイクロアレイやプロテインチ ヅプは、 固定化の例であり、 FCCS解析などは、 蛍光ラベル化の例である（図 5 )。 以上の解析は、 in vitroにおける共翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせ て利用することもできる。
本発明は、 より詳細には、 以下のものを提供する。
1 . 蛋白質に翻訳される情報を持つ 0RF領域およびその 3'末端領域を有し、 3 ，末端領域は、 ァクセプター領域と、 ァクセプター領域の 5'上流に、 配列 S匪 Sを 含む翻訳増強配列とを含むことを特徴とするコード分子。
2 . ァクセプ夕一領域が、 長さ 2〜 1 0塩基のポリ. A配列を含むことを特徴 とする 1記載のコード分子。
3 . X配列が S肩 S配列であることを特徴とする 1または 2記載のコード分子。 4 . X配列が Xhol配列であることを特徴とする 1または 2記載のコード分子。
5 . 1〜 4 'のいずれか 1項に記載されたコード分子のライブラリー。
6 . 蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結す るためのドナー領域を持つ PEGスぺーサ一部を含み、 コード部が 1〜4のいずれ か 1項に記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。
7 . スぺーサ一部が、 コード部と連結するためのドナー領域、 およびポリエ チレングリコールを主成分とした PEG領域、 および 3'末端に CCA領域を持つことを 特徴とする PEGスぺ一サー分子に由来する 6記載の翻訳テンプレート。
8 . ポリエチレングリコールの分子量が 400以上であることを特徴とする 7 記載の翻訳テンプレート。
9 . CCA領域が、 該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、 ぺプチ ド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする 7記載の翻訳テン プレート。
1 0 . CCA領域にピュー口マイシンを有することを特徴とする 9記載の翻訳 テンフ 'レート。
1 1 . ドナー領域に機能付与ュニット F1および/または CCA領域に機能付与 ュニヅト F2を含むことを特徴とする？〜 1 0のいずれか 1項に記載の翻訳テンプ レート。
1 2 . 機能付与ユニット F1および/または F2が、 該翻訳テンプレートを固定 化および/または蛍光ラベル化するものであることを特徴とする 1 1に記載の翻 訳テンプレート。
1 3 · 機能付与ュニヅト F1および/または F2がピオチンであることを特徴と する 1 2記載の翻訳テンプレート。
1 4 . 機能付与ユニット F1および/または F2が、 フルォレセィン、 Cy5、 ま たはローダミングリーンであることを特徴とする 1 2記載の翻訳テンプレート。
1 5 . 6〜 1 4のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートのライブラリ
1 6 . 6〜 1 4のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートがリボソーム 上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
1 7 . 1 5に記載された翻訳テンプレートのライブラリ一がリボソーム上で 翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。
1 8 . 6〜1 4のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートが、 修飾部と、 ピュー口マイシンを含むぺプチドアクセプ夕一部と、 それらを連結するヌクレオ チドのリンカ一とを含む、 蛋白質の C末端を標識する修飾剤の存在下で、 リボソ —ム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
1 9 . 修飾部において、 少なくとも 1つの機能付与ユニット F3を含むことを 特徴とする 1 8に記載の蛋白質。
2 0 . 機能付与ユニット F3が、 該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質 を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする 1 9記載の蛋白質。
2 1 . 機能付与ュニヅト F3がピオチンであることを特徴とする 2 0記載の蛋 白質。
2 2 . 機能付与ユニット F3が、 フルォレセイン， Cy5， またはローダミング リーンであることを特徴とする 2 0記載の蛋白質。
2 3 . 1 5に記載された翻訳テンプレートのライプラリーが、 修飾部と、 ピ ユーロマイシンを含むぺプチドアクセプ夕一部と、 それらを連結するヌクレオチ ドのリンカ一とを含む、 蛋白質の C末端を標識する修飾剤の存在下で、 リボソ一 ム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。
2 4 . 修飾部において、 少なくとも 1つの機能付与ユニット F3を含むことを 特徴とする 2 3に記載の蛋白質のライブラリ一。
2 5 . 機能付与ユニット F3が、 該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質 を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする 2 4記載の蛋白質のライブラ リー。
2 6 . 機能付与ュニヅト F3がピオチンであることを特徴とする 2 5記載の蛋 白質のライブラリー。
2 7 . 機能付与ュニット F3が、 フルォレセィン, Cy5, またはローダミング リーンであることを特徴とする 2 5記載の蛋白質のライブラリ一。
2 8 . 蛋白質に翻訳される情報を持つ 0RF領域およびその 3'末端領域を有し、 3'末端領域は、 長さ 2〜 1 0塩基のポリ A配列を含むァクセプター領域を含むこ とを特徴とするコード分子。
2 9 . 2 8に記載されたコード分子のライブラリ一。
3 0 . 蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結 するためのドナ一領域を持つ PEGスぺーサ一部を含み、 コード部が 2 8に記載さ れたコード分子に由来する翻訳テンプレート。
3 1 . スぺ一サ一部が、 コード部と連結するためのドナ一領域、 およびポリ エチレングリコールを主成分とした PEG領域、 および 3，末端に CCA領域を持つこと を特徴とする PEGスぺーサ一分子に由来する 3 0記載の翻訳テンプレート。
3 2 . CCA領域が、 該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、 ぺプ チド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とする 3 1記載の翻訳テ ンプレート。 3 3 . CCA領域にピュー口マイシンを有することを特徴とする 3 2記載の翻 訳テンプレート。
3 4 . 3 0〜3 3のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートのライブラ リー。
3 5 . 3 0〜3 3のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートが、 リボソ —ム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
3 6 . 3 4に記載された翻訳テンプレートのライブラリーが、 リボソーム上 で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリー。
3 7 . コード部を持たないことを特徴とする 3 5記載の蛋白質。
3 8 . 蛋白質がコード部を持たないことを特徴とする 3 6記載の蛋白質のラ ィブラリー。
3 9 . 3 7に記載された蛋白質または 3 8記載のライブラリ一におけるコー ド部を、 RNaseによって切断することを特徴とする蛋白質またはそのライブラリ 一の製造法。
4 0 . 1 6、 1 8〜2 3、 3 5および 3 7のいずれか 1項に記載の蛋白質、 または、 1 7、 2 3〜2 7、 3 6および 3 8のいずれか 1項に記載の蛋白質のラ ィブラリーと物質を相互作用させて相互作用を解析することを含む、 蛋白質と物 質の相互作用解析方法。
4 1 . 相互作用の解析が、 蛍光相関分光法、 蛍光イメージングアナライズ法、 蛍光共鳴エネルギー移動法、 エバネッセント場分子イメージング法、 蛍光偏光解 消法、 表面プラズモン共鳴法、 または、 固相酵素免疫検定法により行われる、 4 0記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。
4 2 . 3 5に記載の蛋白質、 または、 3 6記載の蛋白質のライブラリ一にお いて、 該蛋白質の C末端に結合したコード部の塩基配列の増幅により蛋白質と物 質の相互作用を検出する方法。
4 3 . 無細胞共翻訳法または無細胞共翻訳スクリーニング法を用いることを 特徴とする 4 2記載の蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
4 4 . 相互作用の解析において、 翻訳テンプレートとそのライブラリーを蛍 光ラベル化および/または固定化することを特徴とする、 4 1記載の蛋白質と物 質の相互作用解析方法。
4 5 . 相互作用の解析において、 蛋白質とそのライブラリーを蛍光ラベル化 および/または固定化することを特徴とする、 4 0記載の蛋白質と物質の相互作 用解析方法。
4 6 . 相互作用の解析において、 in vitroで蛋白質と物質の相互作用を解析 する 4 0載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。
4 7 . 相互作用の解析において、 in vitroで共翻訳法を利用することを特徴 とする 4 6記載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。
4 8 . 1〜4および 2 8のいずれか 1項に記載されたコード分子もしくは 6 〜 1 4ぉょび3 0〜3 3のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートまたはそ のライブラリーをリボソーム上で翻訳することを含む蛋白質またはそのライブラ リーの製造方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の翻訳テンプレート （A ) ならびにその構成要素であるコード 分子 （B ) およびスぺ一サ一分子 （C ) の構成を示す。 翻訳テンプレートは、 コ 一ド分子由来のコード部とスぺ一サ一分子由来のスぺーサ一部からなる。 F1およ び F2は蛍光色素を す。
図 2は、 C末端修飾された蛋白質（C末端ラベル化蛋白質） （A ) 、 本発明の翻 訳テンプレート （B ) 、 および、 修飾剤 （C ) の構成を示す。
図 3は、 C末端修飾された蛋白質（対応付け分子） （A ) 、 本発明の翻訳テンプ レート （B ) 、 および、 修飾剤 （C ) の構成を示す。
図 4は、 本発明の対応付け分子による物質や蛋白質の相互作用解析の一次スク リーニングの説明図を示す。 対応付け分子は、 進化分子工学として、 ランダムラ イブラリーなどから、 漸進的に進化させ、 所望の機能を獲得した物質を創製する ことに応用できる。 また、 ゲノム機能解析への応用として、 cDNAライブラリ一か ら所望の物質ゃ蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析できる。 ここでは、 無細胞共翻訳スクリーニング法を利用することもできる。
図 5は、 本発明の対応づけ分子や C末端ラベル化法による物質や蛋白質の相互 作用解析の一次スクリーニングと二次スクリーニングの説明図を示す。 本発明翻 訳テンプレートから合成された C末端修飾タンパク質 (修飾剤で C末端修飾され た蛋白質、 翻訳テンプレートで C末端修飾された蛋白質 (対応付け分子）、 PEGに よって C末端修飾された蛋白質を利用したタンパク質を、 標的分子との間の相互 作用の解析に利用可能である。 図 4のスクリーニングを一次スクリーニングとし て物質ゃ蛋白質と相互作用の詳細を FCCSやマイクロアレイなどによりさらに解析 することが可能である。
図 6は、 コード分子の 3'末端配列の違いによる翻訳量の比較を示す。 C- junの 遺伝子配列を有する、 異なる 1 2種類の 3'末端配列を持つコード分子 (A8=A配列） の翻訳量の比較。 X配列のバリエーションと必要な条件を示した。 詳細は、 実施 例 1参照。
図 Ίは、 翻訳テンプレートが PEGスぺーサ一部を持たない場合および異なる PEG スぺーサ一部を持つ場合の翻訳量の比較を示す。
A: c-fosの遺伝子配列を有する A配列も X配列も持たないコード分子（1^½(11111 ）) と， A配列を持つコード分子（A(mRNA) )、 および dCdCT(Flu)PEG4000dCdCPuro- Boc をライゲ一シヨンした翻訳テンプレート（+PEG4000dCdCPuro- Boc，）の翻訳量の比 較。 詳細は、 実施例 1参照。
B： C- junの遺伝子配列を有する A配列も X配列も持たないコード分子（None ( mRNA ) )， XA配列を持つコード分子 (XA(mRNA) )、 およびコード分子（XA(mRNA) )に（dC ) 2T(Fl u)T (XA+(dC ) 2T2 )， dCdCT(Flu)TPEG4000 (XA+PEG4000 ) , dCdCT(Flu)PEG4000dCdC Puro-Boc (XA+PEG4000dCdCPuro- Boc )をライゲ一シヨンした翻訳テンプレートの 翻訳量の比較 （電気泳動の結果 （写真） も示す） 。 詳細は、 実施例 1参照。
図 8は、 翻訳テンプレートの翻訳量と安定性を示す。
A : c - junの遺伝子配列を有する XA配列を持つコード分子（暴; XA配列）、 A配列も X 配列も持たないコード分子（口； None配列）、 およびコード分子（XA配列）と dCdCT (Flu)PEG4000dCdCPuro-Bocをライゲーシヨンした翻訳テンプレート（〇）の翻訳量 のタイムコース。 詳細は、 実施例 1参照。
B : C- junの遺伝子配列を有するコード分子（暴； XA配列）と、 およびコード分子（X A配列）と dCdCT(Flu)PEG4000dCdCPuro- Bocをライゲーシヨンした翻訳テンプレー ト（〇）の安定性のタイムコース。 詳細は、 実施例 1参照。
図 9は、 本発明の翻訳テンプレートが異なる PEGスぺ一サ一部を持つ場合の翻 訳量の比較 （電気泳動の結果 （写真） も示す） を示す。
A: C- junの遺伝子配列を有するコード分子（XA配列， A配列）と dCdCT(Flu)PEG4000 dCdCPuro- Bocをラィゲ一シヨンした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによ る対応付け分子の形成効率。 対応付け分子、 Ligated mRNA; コード部に PEG スぺーサ一部がライゲーシヨンされた翻訳テンプレート。 レーン 1〜 6 ； RNA添 加量が 10， 25, 50， 100， 200， 400 nM. 詳細は、 実施例 2参照。
B : c-junの遺伝子配列を有するコード分子（XA配列， A配列）と dCdCT(Flu)PEG4000 dCdCPuro-Bocをライゲーシヨンした場合の翻訳テンプレートの添加量の違いによ るフリー蛋白質（Free protein)の合成率 （対応付け分子の形成量 +フリー蛋白質 の合成量 =100%)。 レーン 1〜6 ； RNA添加量が 10， 25， 50， 100, 200， 400 nM. 詳細は、 実施例 2参照。
図 1 0〜 1 4は、 本発明に使用される PEGスぺーサ一分子とその合成スキーム を示す。
図 1 5〜1 8は、 本発明に使用される修飾剤とその合成スキームを示す。
図 1 9は、 対応付け分子、 スぺーサ一分子およびコード分子の構造の概略を示 す。
図 2 0は、 スぺ一サー分子の一例の詳細な構成を示す。 D : ドナ一領域、 X2お よび XI：機能付与ュニヅト、 PEG： PEG領域、 A：ぺプチドアクセプ夕一領域。 Bio ： ピオチン、 F1：蛍光色素。
図 2 1は、 コード分子の一例の詳細な構成を示す。
図 2 2は、 C末端修飾蛋白質 (A)、 修飾剤（B )、 および、 翻訳テンプレート（C ) の構成を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の翻訳テンプレートがリボソーム上で翻訳されることにより合成される 蛋白質のうち、 翻訳テンプレートと結合している蛋白質 （対応付け分子） 、 さら に修飾剤の存在下で同様に合成される蛋白質 （C末端ラベル化蛋白質） に関して、 まず、 本発明を説明する。 なお、 本明細書において塩基を表す記号は、 特記しな い限り、 WIPO Standard ST.25の定義によるものである。
< 1 >対応付け分子
本明細書において、 対応付け分子とは、 表現型と遺伝子型と対応付ける分子を 意味する。 対応付け分子は、 遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸を含む遺 伝子型分子と、 表現型の発現に関与するタンパク質を含む表現型分子とが結合し てなる。 遺伝子型分子は、 遺伝子型を反映する塩基配列を、 その塩基配列が翻訳 され得るような形態で有するコード分子と、 スぺーサ一部とが結合してなる。 対応付け分子における、 表現型分子に由来する部分、 スぺ一サー分子に由来す る部分、 および、 コード分子に由来する部分をそれぞれ、 デコード部、 スぺ一サ 一部およびコード部と呼ぶ。 また、 遺伝子型分子における、 スぺーサ一分子に由 来する部分、 および、 コード分子に由来する部分をそれぞれ、 スぺ一サ一部およ びコード部と呼ぶ。
図 1 9に、 対応付け分子、 スぺーサ一分子およびコード分子の一例の大まかな 構成を示す。 この対応付け分子は、 ピュ一ロマイシンを含むスぺ一サ一（スぺ一 サ一部と呼ぶ）と表現型のコードを反映する塩基配列（コード部と呼ぶ）からなる。 この対応付け分子は、 コード分子に何らかの方法によってピュー口マイシンを含 むスぺ一サ一部を結合して遺伝子型分子とし、 無細胞翻訳系において、 リポソ一 ム上で表現型分子と連結した構成をもつ。 スぺーサ一分子は、 ポリエチレングリ コールを主成分とした PEG領域、 少なくともピューロマイシンまたはピューロマ イシンと 1残基以上の DNAおよび/または RNAからなる CCA領域、 少なくとも 1残基以 上の MAおよび/または Aを含むドナ一領域、 さらに、 少なくとも 1残基の DNAお よび/または RNAの塩基に機能修飾を施した機能付与ュニツ ト（X)からなる。 コ一 ド分子は、 デコード部の一部の配列からなる DNAおよび/または RNAのポリ A配列を 含む 3，末端領域、 および、 DNAおよび/または RNAからなる転写プロモーターおよ び翻訳ェンハンサ一を含んだ 5' UTR、 さらに、 主として表現型分子の配列からな る 0RF領域から構成される。 以下、 この例を参照して説明するが、 本発明はこれ に限定されるものではない。 < 1 - 1 >スぺーサ一分子
スぺ—サ—分子は、 核酸の 3'末端に結合できるドナ一領域と、 ドナー領域に結 合した、 ポリエチレングリコールを主成分とした PEG領域と、 PEG領域に結合した、 ペプチド転移反応によってペプチドと結合し得る基を含むペプチドァクセプ夕ー 領域とを含む。
核酸の 3，末端に結合できるドナー領域は、 通常、 1以上のヌクレオチドからな る。 ヌクレオチドの数は、 通常には 1〜1 5、 好ましくは 1〜2である。 ヌクレ ドナー領域の 5，末端の配列は、 ライゲーシヨン効率を左右する。 コード部とス ぺーサ一部をライゲ一シヨンさせるためには、 少なくとも 1残基以上を含むこと が必要であり、 ポリ A配列をもつァクセプ夕一に対しては、 少なくとも 1残基の d C (デォキシシチジル酸）または 2残基の dC dC (ジデォキシシチジル酸）が好ましい。 塩基の種類としては、 C>Uまたは T>G>Aの順で好ましい。
PEG領域はポリエチレングリコールを主成分とするものである。 ここで、 主成 分とするとは、 PEG領域に含まれるヌクレオチドの数の合計が 20 bp以下、 または、 ボリエチレングリコールの平均分子量が 400以上であることを意味する。 好まし くは、 ヌクレオチドの合計の数が 10 bp以下、 または、 ポリエチレングリコール の平均分子量が 1000以上であることを意味する。
PEG領域のポリエチレングリコールの平均分子量は、 通常には、 400〜30，000、 好ましくは1，000〜10, 000、 より好ましくは 2，000〜8，000である。 ここで、 ポリ エチレングリコールの分子量が約 400より低いと、 このスぺーサ一分子に由来す るスぺ一サ一部を含む遺伝子型分子を対応付け翻訳したときに、 対応付け翻訳の 後処理が必要となることがあるが (Liu, R, Barrick, E" Szostak, J置， Roberts, R.W. (2000) Methods in Enzymology, vol. 318， 268-293) 、 分子量 1000以上、 より好まし くは 2000以上の PEGを用いると、 対応付け翻訳のみで高効率の対応付けができる ため、 翻訳の後処理が必要なくなる。 また、 ポリエチレングリコールの分子量が 増えると、 遺伝子型分子の安定性が増す傾向があり、 特に分子量 1000以上で良好 であり、 分子量 400以下では DNAスぺーサ一と性質がそれほどかわらず不安定とな ることがある。 ペプチドァクセプ夕一領域は、 ぺプチドの C末端に結合できるものであれば特 に限定されないが、 例えば、 ピューロマイシン、 3，- N-アミノアシルピューロマ イシンアミノヌクレオシド (3， -N-Aminoacy lpurorayc in aiinonucleoside, PANS- アミノ酸） 、 例えばアミノ酸部がグリシンの PANS- Gly、 パリンの PANS-Val、 ァラ ニンの PANS-Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。 また、 化学結合として 3，-アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシ ル基が脱水縮合した結果形成されたアミ ド結合でつながつた 3' -N-アミノアシル アデノシンアミノヌクレオシド (3， -Aminoacyladenosine aminonucleosiae, AAN S -アミノ酸） 、 例えばアミノ酸部がグリシンの AANS-Gly、 パリンの AANS- Val、 ァ ラニンの AANS-Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する AANS-全アミノ酸が利用でき る。 また、 ヌクレオシドまたはヌクレオシドとァミノ酸のエステル結合したもの なども利用できる。 その他、 ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構 造骨格を有する物質と、 アミノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有す る物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用することができる。 ペプチドァクセプ夕一領域は、 好ましくは、 ピューロマイシンもしくはその誘 導体、 または、 ピューロマイシンもしくはその誘導体と 1残基もしくは 2残基の デォキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドからなることが好ましい。 ここで、 誘導体とはタンパク質翻訳系においてぺプチドの C末端に結合できる誘 導体を意味する。 ピューロマイシン誘導体は、 ピューロマイシン構造を完全に有 しているものに限られず、 ピュー口マイシン構造の一部が欠落しているものも包 含する。 ピューロマイシン誘導体の具体例としては、 PANS-アミノ酸、 AANS-アミ ノ酸などが挙げられる。
ぺプチドアクセプ夕一領域は、 ピュー口マイシンのみの構成でもかまわないが、 5'側に 1残基以上の DNAおよび/または RNAからなる塩基配列を持つことが好ましい。 配列としては、 dC-ピュ一ロマイシン， rC -ピューロマイシンなど、 より好ましく は dCdC -ピューロマイシン， rCrC-ピューロマイシン， rCdC-ピューロマイシン， d CrC-ピュー口マイシンなどの配列で、.アミノアシル- tRNAの 3，末端を模倣した CCA 配列 (Philipps, G.R. (1969) Nature 223, 374-377) が適当である。 塩基の種類とし ては、 C>Uまたは T>G>Aの順で好ましい。 スぺーサ一分子は、 ドナー領域と PEG領域との間に、 少なくとも 1つの機能付 与ユニットを含むことが好ましい。 機能付与ユニットは、 好ましくは、 少なくと も 1残基のデォキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基に機能修飾 を施したものである。 例えば、 機能修飾物質として、 固定化や蛍光ラベル化のた めの物質が挙げられる。 具体例としては、 図 2 0に示した蛍光物質、 ピオチン、 または His-tagなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。
図 2 0に、 スぺーサ一分子の一例の詳細な構成を示す。 スぺーサ一分子は、 ポ リエチレングリコールを主成分とした PEG領域、 ピュー口マイシンまたはピュー ロマイシンと少なくとも 1残基の DNAおよび/または RNAからなる CCA領域、 少なく とも 1残基以上の DNAおよび/または RNAを含むドナー領域、 さらに、 少なくとも 1 残基の DNAおよび/または RNAの塩基に機能修飾を施した機能付与ュニット（X)から なる。 ここでは、 機能付与ユニット（X)として蛍光物質 T(F1 )とピオチン T(Bio)が 用いられている。
く 1一 2 >コード分子
コード分子は、 転写プロモータ一および翻訳ェンハンサーを含む 5'非翻訳領域 と、 5'非翻訳領域の 3'側に結合した、 タンパク質をコードする 0RF領域と、 0RF領 域の 3，側に結合した、 ァクセプタ一領域 （通常にはポリ A配列） および、 必要に よりその 5'側に翻訳増強配列 （例えば制限酵素 Xholが認識する配列） を含む 3'末 端領域を含む核酸である。
コード分子は、 DNAでも RNAでもよく、 RNAの場合、 5，末端に Cap構造があっても なくても良い。 また、 コード分子は任意のベクターやプラスミ ドに組み込まれた
3'末端領域は、 例えば、 Xhol配列とその下流にポリ A配列を含む。 スぺ一サ一 分子とコード分子とのライゲーシヨン効率に影響を与える要素としては 3'末端領 域のポリ A配列が重要であり、 ポリ A配列は、 少なくとも 2残基以上の dAおよび/ または rAの混合または単一のポリ A連続鎖であり、 好ましくは、 3残基以上、 より 好ましくは 6以上、 さらに好ましくは 8残基以上のポリ A連続鎖である。
コード分子の翻訳効率に影響する要素としては、 転写プロモーターと翻訳ェン ハンサ一からなる 5' UTR、 および、 ポリ A配列を含む 3'末端領域の組み合わせがあ る。 3'末端領域のポリ A配列の効果は通常には 10残基以下で発揮される。 5' UTRの 転写プロモーターは T7/T3または SP6などが利用でき、 特に制限はない。 好ましく は SP6であり、 特に、 翻訳のェンハンサー配列としてオメガ配列やオメガ配列の 一部を含む配列を利用する場合は SP6を用いることが特に好ましい。 翻訳ェンハ ンサ一は好ましくはオメガ配列の一部であり、 オメガ配列の一部としては、 TMV のオメガ配列 (Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20， 4631-4638) の一部（029)を含んだものが好ましい。
また、 翻訳効率に関し、 3'末端領域においては、 Xhol配列とポリ A配列の組み 合わせが重要となる。 また、 0RF領域の下流部分、 すなわち Xhol配列の上流に親 和性タグがついたものとポリ A配列の組み合わせも重要となる。 親和性夕グ配列 としては、 抗原抗体反応など、 タンパク質を検出できるいかなる手段を用いるた めの配列であればよく、 制限はない。 好ましくは、 抗原抗体反応によるァフィ二 ティー分離分析用タグである Flag- tag配列である。 ポリ A配列効果としては、 Fla g - tag等の親和性夕グに Xho I配列がついたものとそこへさらにポリ A配列がついた ものの翻訳効率が上昇する。
上記の翻訳効率に関し効果のある構成は、 対応付け効率にも有効である。
0RF領域については、 DNAおよび/または RNAからなるいかなる配列でもよい。 遺 伝子配列、 ェキソン配列、 イントロン配列、 ランダム配列、 または、 いかなる自 然界の配列、 人為的配列が可能であり、 配列の制限はない。 また、 コード分子の 5' UTRを SP6+029とし、 3'末端領域を、 たとえば、 Flag+XhoI+An(n=8)とすること で、 各長さは、 5，UTRで約 60bp、 3，末端領域で約 40bpであり、 PCRのプライマーに アダプター領域として組み込める長さである。 このため、 あらゆるベクターゃプ ラスミ ドゃ cDNAライブラリ一から PCRによって、 5，UTRと 3，末端領域をもったコー ド分子を簡単に作成できる。 コード分子において、 翻訳は 0RF領域を超えてされ てもよい。 すなわち、 0RF領域の末端に終止コドンがなくてもよい。
図 2 1に、 コード分子の一例の詳細な構成を示す。 コード分子は、 3'末端領域 と、 DNAおよび/または RNAからなる転写プロモ一ターおよび翻訳ェンハンサーを 含む 5' UTRと、 デコード部の配列情報からなる、 すなわち表現型タンパク質をコ —ドする 0RF領域とからなる。 ここでは、 3'末端領域として、 DNAおよび/または R NAからなる親和性タグ配列、 Xhol配列、 ポリ A配列を含み、 Flag- tag配列を用い ている。 5，UTRとして、 転写プロモータ一の SP6、 翻訳ェンハンサ一のオメガ配列 の一部である 029を含む配列を用いている。
< 1一 3 >遺伝子型分子およびその製造方法
遺伝子型分子 （翻訳テンプレート） は、 転写プロモーターおよび翻訳ェンハン サーを含む 5'非翻訳領域と、 5'非翻訳領域の 3'側に結合した、 タンパク質をコー ドする 0RF領域と、 0RF領域の 3'側に結合した、 ポリ A配列を含む 3'末端領域を含 む核酸であるコード分子の 3'末端と、 スぺーサ一分子のドナ一領域とが結合して なる。
遺伝子型分子を構成するコ一ド分子は、 コード分子について説明したとおりで ある。 しかしながら、 必要により発現増強配列を有することが好ましい。
遺伝子型分子は、 上記コード分子の 3'末端と、 スぺーサ一分子のドナー領域を、 通常のリガーゼ反応により結合させることにより製造できる。 反応条件としては、 通常、 4〜 2 5 °Cで 4〜4 8時間の条件が挙げられ、 PEG領域を含むスぺーサ一 分子の PEG領域内のポリエチレングリコールと同じ分子量のポリエチレングリコ ールを反応系に添加する場合には、 15°Cで 0.5〜 4時間に短縮することも可能で ある。
スぺ—サ—分子とコード分子の組み合わせはライゲーシヨン効率に重要な効果 をもたらす。 ァクセプターにあたるコード部の 3'末端領域において、 少なくとも 2残基以上、 好ましくは 3残基以上、 さらに好ましくは 6〜 8残基以上の DNAお よび/または RNAのポリ A配列があること、 さらに、 5' UTRの翻訳ェンハンサ一とし ては、 オメガ配列の部分配列（029 ; 図 2 1 )が好ましく、 スぺーサ一部のドナ一 領域としては、 少なくとも 1残基の dC (デォキシシチジル酸）または 2残基の dCdC (ジデォキシシチジル酸）が好ましい。 このことによって、 RNAリガーゼを用いる ことで DNAリガ一ゼのもつ問題点を回避し、 かつ効率を 60〜 80%に保つことができ る。
遺伝子型分子が RNAである場合には、 （ a)転写プロモー夕一および翻訳ェンハン サーを含む 5'非翻訳領域と、 5'非翻訳領域の 3'側に結合した、 タンパク質をコー ドする 0RF領域と、 0RF領域の 3'側に結合した、 ポリ A配列を含む 3'末端領域を含 むコード分子の 3'末端と、 （b)上記のスぺ一サー分子のドナー領域であって RNAか らなるものとを、 スぺーサ一分子内の PEG領域を構成するポリエチレングリコー ルと同じ分子量をもつ遊離のポリエチレングリコールの存在下で、 RNAリガーゼ により結合させることが好ましい。
ライゲーシヨン反応時に、 PEG領域を含むスぺーサ一部の PEG領域と同じ分子量 のポリエチレングリコールを添加することによって、 スぺ一サ一部のポリェチレ ングリコ一ルの分子量によらずライゲーション効率が 80〜90%以上に向上し、 反 応後の分離工程も省略することができる。
< 1 - 4 >対応付け分子およびその製造方法
対応付け分子は、 上記の遺伝子型分子を、 ペプチド転移反応で、 遺伝子型分子 内の 0RF領域によりコードされたタンパク質である表現型分子と連結してなるも のである。
対応付け分子は、 遺伝子型分子を、 リボゾーム上で翻訳 （例えば無細胞翻訳系 で翻訳） することにより、 ペプチド転移反応で、 遺伝子型分子内の 0RF領域によ りコードされたタンパク質である表現型分子と連結することにより。
無細胞翻訳系は、 好ましくは、 小麦胚芽またはゥサギ網状赤血球のものである。 翻訳の条件は通常に採用される条件でよい。 例えば、 2 5〜3 7 °Cで 1 5〜240 分の条件が挙げられる。
無細胞翻訳系については、 これまで大腸菌（E . col i )、 ゥサギ網状赤血球、 小 麦胚芽の系で対応付け分子の形成が検討され、 ゥサギ網状赤血球の系でのみ対応 付け分子が確認されていたが （Nemoto, N,， Miyamoto-Sato, E.， Yanagawa, H. (1997) FEBS Lett. 414, 405; Roberts, R.W, Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94， 12297) 、 この態様によれば、 PEG領域を含むスぺーサ一部をもつ対応付け分子と して、 小麦胚芽の系でも対応付け分子の形成を行うことができる。 また、 これま でゥサギ網状赤血球の系では遺伝子型分子の安定性を欠くために実用性に乏しく、 短い鎖長の遺伝子型分子にのみ適用されてきたが （Roberts, R.W, Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94， 12297; Nemoto, N.， Miyamoto-Sato, E.， Yanagawa, H. (1997) FEBS Lett. 414， 405)、 PEG領域を含むスぺーサ一部をもつ対 応付け分子は、 小麦胚芽の系ではより安定であり長い鎖長を取り扱える実用的な 系である。
< 2 > C末端ラベル化蛋白質
C末端ラベル化蛋白質は、 C末端が修飾された蛋白質であり、 図 2 2の Aに示 すように、 ラベル化剤が蛋白質の C末端に結合した構成をもっている。 すなわち、 C末端ラベル化蛋白質は、 蛋白質とラベル化剤とにより構成される。
C末端ラベル化蛋白質を構成する 「蛋白質」 とは、 その機能が既知または未知 である相互作用の解析対象として用いる蛋白質を意味する。 本発明の C末端ラベ ル化蛋白質は、 この蛋白質と後述する標的分子との相互作用の有無の測定に使用 できる。
この蛋白質は、 天然蛋白質またはその変異体、 および人工蛋白質またはその変 異体の何れでもよい。 天然蛋白質は、 種々の生物の器官、 組織または細胞に由来 する c D N Aライブラリーから転写および翻訳される、 多様性を有する蛋白質の ライブラリーをも含むものである。 人工蛋白質は、 天然蛋白質の全てもしくは部 分配列を組み合わせた配列、 またはランダムなァミノ酸配列を含むものである。
C末端ラベル化蛋白質を構成する蛋白質は、 全長蛋白質であることが好ましい。 本明細書において 「全長蛋白質」 とは、 C末端が完全に翻訳されている蛋白質、 すなわち、 その蛋白質をコードする塩基配列の終止コドンの一つ前までのコドン が翻訳されて得られた蛋白質を意味する。 全長蛋白質の N末端は、 シグナルぺプ チドの切断等何らかのプロセシングを受けていてもよい。
また、 C末端ラベル化蛋白質を構成する蛋白質は親和性タグと融合した蛋白質 であってもよい。 親和性タグの例としては、 ポリヒスチジンペプチドゃェピトー プペプチド、 グル夕チオン- S-トランスフェラーゼ、 プロテイン A、 マルトース結 合蛋白質、 カルモジュリン結合べプチド等が挙げられる。
C末端ラベル化蛋白質は、 ラベル化剤存在下で、 翻訳テンプレートを翻訳系で 発現させて蛋白質合成を行わせ、 合成された蛋白質を精製することにより製造す ることができる。 以下、 ラベル化剤、 翻訳テンプレートおよび製造の例について 説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。
< 2 - 1 >ラベル化剤
ラベル化剤は、 図 2 2の Bに示すように、 蛋白質の翻訳系でのペプチド転移反 応、 すなわち、 リボソーム上でのペプチド転移反応によって蛋白質と結合し得る 基 (残基を含む) をもつぺプチドアクセプ夕一部が、 ヌクレオチドリンカーを介 して修飾部と結合した構成をもつ。 このラベル化剤の存在下で蛋白質合成を行い、 得られる C末端ラベル化蛋白質を精製し、 分子間相互作用の検出系を用いること によって、 蛋白質相互作用の検出が可能となる。
修飾部に含まれる修飾物質の具体例としては、 蛍光性、 非蛍光性修飾物質等が 挙げられる。 蛍光性物質としては、 フルォレセィン系列、 ローダミン系列、 Cy3、 Cy5、 ェォシン系列、 NBD 系列等の蛍光色素や、 緑色蛍光蛋白質 （GFP) 等の蛍光 性蛋白質がある。 また、 非蛍光性物質としては、 ピオチンのような補酵素、 蛋白 質、 ペプチド、 糖類、 脂質類、 色素、 ポリエチレングリコール等、 何らかの目印 となり得る化合物であればいかなるものでもよい。
C末端ラベル化剤においては、 修飾部が蛍光基、 蛋白質と結合する基 （例えば ピオチニル基やイミノビォチニル基） 、 または、 その両方をもつことが好ましい。 特に、 ピオチニル基やイミノビォチニル基を有することは、 本発明 C末端ラベル 化剤による修飾の効率が上昇するため、 好ましい。
ペプチドァクセプ夕一部は、 蛋白質の翻訳系で、 ペプチド転移反応によって蛋 白質と結合し得る基をもち、 好ましくはピュー口マイシンまたはその誘導体の残 基をもつ。
ピューロマイシンはアミノアシル tRNAと類似した構造をもち、 蛋白質合成を阻 害する抗生物質として知られているが、 低濃度では蛋白質の C末端に結合するこ とが知られて I、る (Miyamoto-Sato, E. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182)。 本発明で用いることができるピューロマイシン誘導体は、 ピューロマイシンと類 似した構造を有し、 蛋白質の C末端に結合することができる物質であればいかな るものでもよい。 具体例としては、 3，- N-アミノアシルビユ一ロマイシンァミノ ヌクレオシド、 3，- N-アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド等が挙げられ る。
修飾部とぺプチドアクセプ夕一部との間をつなぐヌクレオチドリンカーとは、 具体的には、 リボヌクレオチドまたはデォキシリボヌクレオチドが 1個ないし複 数個つながった核酸または核酸誘導体であり、 特に好ましい例として、 シトシン 塩基を含むリボヌクレオチド (- rC- ) またはデォキシリボヌクレオチド (- dC -) が 1個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。 その他、 修飾部とペプチド ァクセプ夕一部との間に挿入することによつて修飾蛋白質の収量を上げることが できる物質であればいかなるものでもよい。
ラベル化剤においては、 ヌクレオチドリンカーが 2' -デォキシシチジル酸、 2， -デォキシシチジル-（3，，5，）- 2，-デォキシシチジル酸、 リボシチジル酸、 また は、 リボシチジル-（3，， 5， )-リボシチジル酸であることが好ましい。
ラベル化剤は、 上記修飾部とペプチドァクセプ夕一部とを所望のヌクレオチド リンカーを介して、 それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより 製造することができる。 具体的には、 例えば、 適当な保護基で保護された上記べ プチドアクセプ夕一部を固相担体上に結合させ、 核酸合成機等を用いてヌクレオ チドリンカ一としてヌクレオチドホスホアミダイ ト、 およびデォキシヌクレオチ ドホスホアミダイ ト、 修飾物質として蛍光物質やピオチンなどを結合したヌクレ ォチドホスホアミダイ トを順次結合させた後、 脱保護を行うことによって作製す ることができる。 上記各部の種類、 または結合の種類によっては液相合成法で結 合させるかまたは両者を併用することもできる。 また、 修飾物質としてニッケル 等の金属イオンを用いる場合には、 金属イオンが配位しうる二トリロトリ酢酸や ィミノジ酢酸等のキレート性の試薬を結合させ、 次いで金属イオンを配位させる ことができる。
< 2 - 2 >翻訳テンプレート
翻訳テンプレートは、 本発明修飾蛋白質を製造する際に利用できる翻訳テンプ レートであり、 図 2 2の Cに示すように、 ポリ A配列を含む 3'末端領域、 転写プ 口モーターを含んだ 5'非翻訳領域（5' UTR)、 および、 蛋白質のコードされた 0RF領 域から構成される。 翻訳テンプレートは DNAでも RNAでもよい。
さらに詳細には、 翻訳テンプレートは、 蛋白質をコードする 0RF領域と、 0RF領 域の 5， 側に位置する、 転写プロモーターおよび翻訳ェンハンサーを含んだ 51T Rと、 0RF領域の 3'側に位置する、 ポリ A配列 (polyA)を含んだ 3，末端領域から構成 される。
さらに好ましい翻訳テンプレートは、 5，UTRの転写プロモー夕一として SP6 RNA ポリメラーゼのプロモ一夕一配列を含み、 翻訳ェンハンサ一としてタバコモザィ クウィルス（TMV)のオメガ配列の一部（029)を含む。 また、 0RF領域がその下流部 分に親和性タグ配列を含むことが好ましい。 親和性タグ配列は、 上述の親和性夕 グをコードする配列であり、 好ましくは His- tag (ポリヒスチジンタグ） 配列を 含む。 本発明翻訳テンプレートを用いて製造された本発明修飾蛋白質をポリヒス チジンタグを用いて製造する場合には、 ポリヒスチジンタグは長い方が、 ニッケ ルキレート樹脂による回収率が向上するため、 好ましい。 ポリヒスチジンタグの 好ましい長さの範囲は、 修飾される蛋白質の種類や標識の種類により変化し得る が、 通常には、 8〜 1 2残基である。
なお、 本明細書において 「上流」 および 「下流」 とは、 転写または翻訳の方向 におけるものを意味する。
翻訳テンプレートは、 DNAである場合、 上記の領域を適当な DNAベクターまたは ブラスミ ドに導入することにより得られた DNAべク夕一またはプラスミ ドであつ てもよい。 また、 翻訳テンプレートは、 MAである場合、 5，末端に Cap構造があつ てもなくてもよい
< 2 - 3 > C末端ラベル化蛋白質の製造
C末端ラベル化蛋白質の製造に用いられる翻訳系としては、 無細胞蛋白質合成 系や細胞発現系が挙げられる。 無細胞蛋白質合成系の具体例としては、 小麦胚芽 抽出液、 ゥサギ網状赤血球抽出液、 大腸菌 S30抽出液等が挙げられる。 これらの 無細胞蛋白質合成系の中に、 上記翻訳テンプレートを加え、 同時に 1〜100 /Mの 修飾剤を加え、 25〜37°Cで 1〜数時間保温することによって C末端修飾蛋白質が 合成される。 合成された修飾蛋白質は、 そのまま次の精製プロセスまたは検出プ 口セスに供することができる。 一方、 細胞発現系の具体例としては、 大腸菌、 枯 草菌、 好熱菌、 酵母等の細菌から、 昆虫細胞、 哺乳類等の培養細胞、 さらに線虫、 ショウジヨウバエ、 ゼブラフィ ッシュ、 マウス等の細胞に至るまで、 遺伝子導入 が可能な細胞であればいかなるものでもよい。 これらの細胞の中に、 上記本発明 翻訳テンプレートを導入し、 同時に 1〜100 /Mの本発明修飾剤を電気穿孔法、 マ イク口インジヱクシヨン法等により細胞の中に導入し、 細胞の至適生育温度で数 時間保温することによつて修飾蛋白質が合成される。 合成された修飾蛋白質は、 細胞を破砕することによって回収し次の精製プロセスまたは検出プロセスに供す ることができる。 また、 そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能で ある。 翻訳テンプレートは、 用いる翻訳系に合わせて適切なものを選択する。
C末端ラベル化蛋白質を精製する方法としては、 ァフィ二ティ一、 ゲルろ過、 イオン交換等のクロマトグラフィーや、 電気泳動、 沈澱、 透析等、 一般に蛋白質 の精製に用いられるあらゆる方法が利用可能である。 好ましくは、 ァフィ二ティ —クロマトグラフィー、 ゲルろ過、 イオンクロマトグラフィー、 電気泳動、 沈殿、 透析、 および、 それらの任意の組合せが挙げられる。 特に好ましい例として、 ポ リヒスチジンぺプチドゃェピトープぺプチド、 グル夕チオン- S-トランスフェラ —ゼ、 プロテイン A、 マルトース結合蛋白質、 カルモジュリン結合ペプチド等の 親和性タグを融合した修飾蛋白質を親和性樹脂で精製し、 さらに未反応の修飾剤 を完全に除去するためにゲルろ過カラムに数回かける方法がある。
また、 上記の親和性タグを融合した修飾蛋白質を親和性樹脂で予め精製した後、 修飾部のピオチニル基またはィミノピオチニル基とアビジンまたはストレプトァ ビジンの親和性を利用して、 未修飾蛋白質を完全に除き、 100%修飾された蛋白質 を得る方法もある。
く 3 >本発明のより具体的な態様の説明
第一の発明の翻訳テンプレート（図 1の A )は、 コード分子（図 1の B )に由来す るコード部と PEGスぺーサ一分子（図 1の C )に由来する PEGスぺーサ一部からなる。 本発明は、 基本的にはコード部の配列によらず、 コード部に PEGスぺ一サ一部を 連結（ライゲーシヨン）することでその安定性が向上して翻訳効率を向上出来る。 しかしながら、 さらにコード部の構成や PEGスぺーサ一部の種類によって、 その 翻訳効率をより向上させることが可能である。 以下にその詳細を記載する。
本発明コード部（図 1の B )は、 5'末端領域、 （ffiF領域、 3'末端領域からなり、 5 ，末端に Cap構造があってもなくてもよい。 また、 コード部の配列には特に制限は なく、 あらゆるベクタ一やプラスミ ドに組み込まれた遺伝子やランダム配列など の利用が考えられる。 また、 コード部の 3'末端領域には、 A配列としてポリ Ax 8 配列、 または X配列として Xhol配列や 4塩基以上で（Cまたは G)蘭 (Cまたは G)の配 列を持つもの （すなわち、 Xhol配列およびその他の 4塩基以上で SNNSの配列を持 つもの） 、 および A配列と X配列の組み合わせとしての XA配列がある。 A配列、 X配 列、 または XA配列の上流に親和性タグ配列として Flag- tag配列、 からなる構成が 考えられる。 ここで、 親和性タグ配列としては HA- tagや IgGの protein A( zドメイ ン）などの抗原抗体反応を利用したものや His- tagなど、 蛋白質を検出または精製 できるいかなる手段を用いるための配列でもかまわない。 ここで、 翻訳効率に影 響する範囲としては、 XA配列の組み合わせが重要であり、 X配列のなかで、 最初 の 4塩基が重要であり、 SNNSの配列を持つものが好ましい。 X配列の長さの上限 は、 翻訳増強の効果が得られる限り特に限定されないが、 通常には、 1 5塩基以 下、 好ましくは 6塩基以下である。 また、 5'末端領域は、 転写プロモーターと翻 訳ェンハンサーからなり、 転写プロモータ一は T7/T3または SP6などが利用でき、 特に制限はないが、 小麦の無細胞翻訳系では、 翻訳のェンハンサー配列としてォ メガ配列やオメガ配列の一部を含む配列を利用することが好ましく、 プロモー夕 —としては、 SP6を用いることが好ましい。 翻訳ェンハンサ一のオメガ配列の一 部（029)は、 TMVのオメガ配列 (Gallie D.R., Walbot V. (1992) Nucleic Acids Res., vol. 20, 4631-4638)の一部を含んだものである。 コード部の 0RF領域については、 DNA および/または RNAからなるいかなる配列でもよい。 遺伝子配列、 ェキソン配列、 イントロン配列、 ランダム配列、 または、 いかなる自然界の配列、 人為的配列が 可能であり、 配列の制限はない。
本発明 PEGスぺーサ一部（図 1の C )は、 CCA領域、 PEG領域、 ドナ一領域からな る。 最低限必要な構成は、 ドナー領域である。 翻訳効率に影響する範囲としては、 ドナ一領域のみならず PEGスぺーサ一部を持つものが好ましく、 さらにアミノ酸 との結合能力のないピュー口マイシンを持つことが好ましい。 PEG領域のポリエ チレングリコールの分子量の範囲は、 400〜30，000で、 好ましくは 1 , 000〜10，000、 より好ましくは 2，000〜6，000である。 また、 CCA領域にはピューロマイシンを含 む構成と含まない構成が可能であり、 ピューロマイシンについては、 ピューロマ イシン (Puromycin) 、 3， -N-アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド (3' -N-Aminoacylpuromycin aminonucleoside, PANS -アミノ酸) 、 例えばアミノ 酸部がグリシンの PANS- Gly、 パリンの PANS- Val、 ァラニンの PANS- Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する PANS-全アミノ酸が利用できる。 また、 化学結合として 3' - アミノアデノシンのァミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合した結果形 成されたアミ ド結合でつながった 3，- N-ァミノアシルアデノシンアミノヌクレオ シド (3" -Aiinoacyl adenosine aminonucleoside, AANS -アミノ酸) 、 例えばアミ ノ酸部がグリシンの AANS- Gly、 パリンの AANS- Val、 ァラニンの AANS- Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する AANS-全アミノ酸が利用できる。 また、 ヌクレオシドまた はヌクレオシドとアミノ酸のエステル結合したものなども利用できる。 その他、 ヌクレオシドまたはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質と、 アミ ノ酸またはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な 結合様式のものなら全て利用することができる。 本翻訳テンプレートでは、 以上 のピュー口マイシン誘導体のァミノ基がアミノ酸と結合する能力を欠いたあらゆ る物質、 およびピューロマイシンを欠いた CCA領域も考えられるが、 リボソーム 上で蛋白質と結合不能なピューロマイシンを含むことで、 より翻訳効率を高めら れる。 その理由は定かではないが、 蛋白質と結合不能なピューロマイシンがリボ ソームを刺激することで夕一ンオーバーが促進される可能性がある。 CCA領域（ CC A)の 5'側に 1残基以上の DNAおよび/または RNAからなる塩基配列を持つことが好 ましい。 塩基の種類としては、 C>Uまたは T>G>Aの順で好ましい。 配列としては、 dC-ピューロマイシン， rC -ピューロマイシンなど、 より好ましくは dCdC-ピュー ロマイシン， rCrC-ピュー口マイシン, rCdC-ピュー口マイシン， dCrC-ピュー口 マイシンなどの配列で、 ァミノアシル -tRNAの 3'末端を模倣した CCA配列 (Philipps G.R. (1969) Nature 223, 374-377)が適当である。 第一の発明では、 これらのピュー 口マイシンが何らかの方法でアミノ酸と結合不可能となっている。
本発明 PEGスぺ一サ一部は修飾物質 (F 1および/または F 2 )を有する構成が可能 である。 このことによって、 翻訳テンプレートを回収、 精製による再利用、 また は固定化などのためのタグとして利用することが出来る。 少なくとも 1残基の DNA および/または RNAの塩基に修飾物質として、 蛍光物質、 ピオチン、 または His - ta gなど各種分離タグなどを導入したものが可能である。 また、 コード部の 5'末端 領域を SP6+029とし、 3，末端領域を、 たとえば、 Flag+XhoI+An(n=8)とすることで、 各長さは、 5'末端領域で約 60bp、 3'末端領域で約 40bpであり、 PCRのプライマ一 にアダプター領域として設計可能な長さである。 これによつて新たな効果が生み 出された。 すなわち、 あらゆるベクターやプラスミドや cDNAライブラリーから PC Rによって、 本発明の 5'末端領域と 3' ,末端領域をもったコード部を簡単に作成可 能となり、 このコード部に、 3， UTRの代わりとして PEGスぺ一サ一部をライゲー シヨンすることで、 翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。
本発明 PEGスぺ一サ一部とコード部のライゲーシヨンは、 その方法については、 一般的な DNAリガ一ゼを用いるものや光反応による連結など何でもよく、 特に限 定されるものではない。 RNAリガーゼを用いるライゲ一シヨンでは、 コード部で ライゲーシヨン効率に影響を与える範囲としては 3，末端領域の A配列が重要であ り、 少なくとも 2残基以上の dAおよび/または rAの混合または単一のポリ A連続鎖 であり、 好ましくは、 3残基以上、 より好ましくは 6から 8残基以上のポリ A連続 鎖である。 PEGスぺ一サ一部のドナー領域の 5，末端の DNAおよび/または RNA配列は、 ライゲーシヨン効率を左右する。 コード部と PEGスぺ一サ一部を、 RNAリガーゼで ライゲーシヨンするためには、 少なくとも 1残基以上を含むことが必要であり、 ポリ A配列をもつァクセプ夕一に対しては、 少なくとも 1残基の dC (デォキシシチ ジル酸）または 2残基の dCdC (ジデォキシシチジル酸）が好ましい。 塩基の種類と しては、 C>Uまたは T>G>Aの順で好ましい。 さらに、 ライゲ一シヨン反応時に、 PE G領域と同じ分子量のポリエチレングリコールを添加することが好ましい。
第二の発明は、 修飾剤の存在下で、 第一の発明の翻訳テンプレートを用いた翻 訳によって合成された、 修飾剤で C末端修飾された蛋白質（図 2の A )であり、 翻 訳テンプレート（図 2の B )と、 修飾剤（図 2の C )からなる。 ここでの特徴は、 特 に翻訳テンプレートのコード部の構成にある。 以下詳細に記述する。
本発明翻訳テンプレート（図 2の B )の PEGスぺ一サ一部は、 ピューロマイシン がアミノ酸と連結出来ないことを特徴とし、 第一の発明と同様である。 また、 コ 一ド部も第一の発明と同様であるが、 特に、 C末端ラベル化に適した構成として は、 3'末端領域が、 XA配列であることが重要であり、 X配列のなかで、 最初の 4 塩基が重要で、 S匪 Sの配列を持つものが好ましい。 ここでも、 コード部の 5，末端 領域を SP6+029とし、 3，末端領域を、 たとえば、 Flag+XhoI+An(n=8)とすることで、 各長さは、 5，末端領域で約 60bp、 3'末端領域で約 40bpであり、 PCRのプライマー にアダプター領域として設計できる長さである。 これによつて、 あらゆるベクタ —やプラスミ ドゃ cDNAライブラリーから PCRによって、 本発明の 5'末端領域と 3， 末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、 このコード部に 3' UTRの代 わりとして PEGスぺーサ一部をライゲーシヨンすることで、 C末端ラベル化に適 した翻訳効率の高い翻訳テンプレートを得られる。
本発明修飾剤（図 2の C )は、 タンパク質の翻訳系でのペプチド転移反応、 すな わち、 リボソーム上でのぺプチド転移反応によってタンパク質と結合し得る基 (残基を含む) をもつぺプチドアクセプター部が、 ヌクレオチドリンカ一を介し て修飾部と結合した構成をもつ。 この修飾剤の存在下でタンパク質合成を行い、 得られる C末端修飾タンパク質を精製し、 分子間相互作用の検出系を用いること によって、 タンパク質相互作用の検出が可能となる。 修飾部には、 第一の発明の PEGスぺーサ一部と同様に修飾物質（F3 )が含まれる。 修飾物質として、 非放射性 修飾物質の具体例としては、 蛍光性、 非蛍光性修飾物質等が挙げられる。 蛍光性 物質としては、 フルォレセィン系列、 ローダミン系列、 Cy3、 Cy5、 ェォシン系列、 NBD 系列等の蛍光色素や、 緑色蛍光タンパク質，（GFP) 等の蛍光性タンパク質が ある。 また、 非蛍光性物質としては、 ピオチンのような補酵素、 タンパク質、 ぺ プチド、 糖類、 脂質類、 色素、 ポリエチレングリコール等、 何らかの目印となり 得る化合物であればいかなるものでもよい。 本発明修飾剤においては、 修飾部が 蛍光基、 タンパク質と結合する基、 または、 その両方をもつことが好ましい。 ぺ プチドアクセプ夕一部は、 タンパク質の翻訳系で、 ペプチド転移反応によって夕 ンパク質と結合し得る基をもち、 好ましくはピューロマイシンまたはその誘導体 の残基をもつ。 ピューロマイシンはアミノアシル tRNAと類似した構造をもち、 夕 ンパク質合成を阻害する抗生物質として知られているが、 低濃度ではタンパク質 の C末端に結合することが知られている (Miyamoto-Sato, E. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182) 。 本発明で用いることができるピューロマイシン誘導 体は、 ピューロマイシンと類似した構造を有し、 タンパク質の C末端に結合する ことができる物質であればいかなるものでもよい。 具体例としては、 3' - N-アミ ノアシルピュー口マイシンアミノヌクレオシド、 3， - N-ァミノアシルアデノシン アミノヌクレオシド等が挙げられる。 修飾部とァクセプ夕一部との間をつなぐヌ クレオチドリンカーとは、 具体的には、 リボヌクレオチドまたはデォキシリボヌ クレオチドが 1個ないし複数個つながった核酸または核酸誘導体であり、 特に好 ましい例として、 シトシン塩基を含むリボヌクレオチド （- rC- ) またはデォキシ リボヌクレオチド （- dC- ) が 1個ないし複数個つながった化合物が挙げられる。 その他、 修飾部とァクセプ夕一部との間に挿入することによつて修飾タンパク質 の収量を上げることができる物質であればいかなるものでもよい。 本発明修飾剤 においては、 ヌクレオチドリンカ一が 2' -デォキシシチジル酸、 2， -デォキシシチ ジル-（3' , 5' )-2， -デォキシチジル酸、 リボシチジル酸、 または、 リボシチジル- ( 3' , 5'；)-リポシチジル酸であることが好ましい。
本発明の修飾剤は、 上記修飾部とァクセプ夕一部とを所望のヌクレオチドリン 力一を介して、 それ自体既知の化学結合方法によって結合させることにより製造 することができる。 具体的には、 例えば、 適当な保護基で保護された上記ァクセ プ夕一部を固相担体上に結合させ、 核酸合成機を用いてヌクレオチドリンカーと してヌクレオチドホスホアミダイ ト、 およびデォキシヌクレオチドホスホアミダ ィ ト、 機能性修飾物質として蛍光物質やピオチンなどを結合したホスホアミダイ トを順次結合させた後、 脱保護を行うことによって作製することができる。 上記 各部の種類、 または結合の種類によっては液相合成法で結合させるかまたは両者 を併用することもできる。 また、 機能性修飾物質としてニッケル等の金属イオン を用いる場合には、 金属イオンが配位しうるニトリロトリ酢酸やィミノジ酢酸等 のキレート性の試薬を結合させ、 次いで金属イオンを配位させることができる。 第三の発明は、 第一の発明の翻訳テンプレートを用いた翻訳によって合成され た、 翻訳テンプレートで C末端修飾された蛋白質（図 3の A；対応付け分子）と翻 訳テンプレート（図 3の B )を除去した、 PEGによって C末端修飾された蛋白質（図 3の C )の構成を持つ。 以下詳細に記述する。
翻訳テンプレート（図 3の B )の PEGスぺーサ一部は、 ピューロマイシンがアミ ノ酸と連結できることを特徴とする以外は第一の発明と同様である。 また、 コ一 ド部も第一の発明と同様であるが、 特に、 対応付けに適した構成としては、 3'末 端領域を A配列にすることが重要であり、 ト一夕ル蛋白の対応付けの効率が著し く向上してフリー蛋白質の量が激減することが確認された。 ここでも、 コード部 の 5'末端領域を SP6+029とし、 3，末端領域を、 たとえば、 Flag+XhoI+An(n二 8)とす ることで、 各長さは、 5'末端領域で約 60bp、 3'末端領域で約 40bpであり、 PCRの プライマーにアダプタ一領域として設計できる長さである。 これによつて、 あら ゆるベクターやプラスミ ドゃ cDNAライブラリ一から PCRによって、 本発明の 末 端領域と 35末端領域をもったコード部を簡単に作成可能となり、 PEGスぺーサー 部をライゲーシヨンすることで、 対応付け効率の高い翻訳テンプレートが得られ る。 また、 本発明の PEGによって C末端修飾された蛋白質（図 3 C )は、 蛋白質の 相互作用検出などにおいて、 コード部を利用しない場合、 たとえば、 FCCS測定、 蛍光リ一ダー、 プロテインチヅプなどに応用する場合は、 RNase Aなどで意図的 に切断することが好ましい。 切断することによって、 コード部の妨害による蛋白 質間相互作用の検出の困難性が解消出来る。
対応付け分子は、 進化分子工学として、 ダーウィン進化機構を利用して、 「変 異（Mutation)」 、 「選択（Selection)j 、 「増幅（Ampl if ication)」 の 3つの単位 操作を繰り返すことで、 ランダムライブラリ一などから、 漸進的に進化させ、 所 望の機能を獲得した物質を創製することで工学的に応用することが可能である (図 4 )。 また、 ゲノム機能解析への応用として、 cDNAライブラリーから所望の物 質や蛋白質と相互作用を持つ一群の遺伝子配列を網羅的に解析可能である（図 4 )。 さらに、 図 4のスクリーニングを一次スクリーニング後に、 二次スクリーニング として、 図 5に示したように物質や蛋白質と相互作用の詳細を FCCSやマイクロア レイなどにより解析することが可能である。 以上の解析は、 in vitroにおける共 翻訳や共翻訳スクリーニング法と組み合わせて利用することもできる。 また、 一 次スクリーニングで対応付け分子を利用するときは A配列のコード部を利用し、 二次スクリーニングでは、 対応付け分子を利用するときは A配列のコード部、 C 末端ラベル化蛋白質を利用するときは XA配列のコード部をプライミングによって 変更して使用することで、 それぞれの効果を使い分けることが出来る。
無細胞タンパク質合成系の具体例としては、 小麦胚芽抽出液、 ゥサギ網状赤血 球抽出液、 大腸菌 S30抽出液等が挙げられる。 これらの無細胞タンパク質合成系 の中に、 上記翻訳テンプレートを加え、 C末端ラベル化の場合は、 同時に 1〜100 〃Mの修飾剤を加え、 25〜37°Cで 1〜数時間保温することによって C末端修飾夕ン パク質が合成される。 対応付けの場合は、 上記翻訳テンプレートを加えて、 25〜 37°Cで 1〜数時間保温するだけで対応付け分子が合成される。 合成された両修飾 タンパク質は、 そのまま次の精製プロセスまたは検出プロセス、 または直接細胞 への導入に供することができる。 細胞発現系の具体例としては、 大腸菌、 枯草菌、 好熱菌、 酵母等の細菌から、 昆虫細胞、 哺乳類等の培養細胞、 さらに線虫、 ショ ウジヨウバエ、 ゼブラフィッシュ、 マウス等に至るまでいかなる細胞でもよい。 これらの細胞の中に、 上記 C末端ラベル化または対応付けされた両修飾夕ンパク 質を直接導入することもできるし、 または、 上記本発明翻訳テンプレートを導入 し、 C末端ラベル化の場合は、 同時に 1〜100 Μの本発明修飾剤を電気穿孔法、 マイクロインジ: クシヨン法等により細胞の中に導入し、 細胞の至適生育温度で 数時間保温することによって修飾夕ンパク質が合成される。 対応付けの場合は、 上記本発明翻訳テンプレートを導入し、 細胞の至適生育温度で数時間保温するこ とによって対応付け分子が合成される。 合成された両修飾タンパク質は、 細胞を 破砕することによって回収し次の精製プロセスまたは検出プロセスに供すること ができる。 また、 そのまま細胞の中で検出プロセスに供することも可能である。 翻訳テンプレートは、 用いる翻訳系に合わせて適切なものを選択する。
本発明は、 本発明翻訳テンプレートから合成された C末端修飾タンパク質（修 飾剤で C末端修飾された蛋白質（図 2の A )、 翻訳テンプレートで C末端修飾され た蛋白質（図 3の A；対応付け分子）、 PEGによって C末端修飾された蛋白質（図 3 C ) )を利用した夕ンパク質と標的分子との間の相互作用の解析方法、 すなわち、 タンパク質と標的分子との間の相互作用を解析する方法であって、 該タンパク質 を含む本発明修飾タンパク質を用いることを特徴とする方法を提供する（図 5 )。 < 4 >解析方法
本発明の解析方法においては、 通常には、 上記で得られた本発明修飾タンパク 質と標的分子を、 修飾物質の種類や反応系の種類などにより適宜組み合わせて接 触せしめ、 該本発明修飾タンパク質または該標的分子が発する信号において両分 子間の相互作用に基づいて発生される上記信号の変化を測定することにより相互 作用を解析する。 相互作用の解析は、 例えば、 蛍光相関分光法、 蛍光イメージン グアナライズ法、 蛍光共鳴エネルギー移動法、 エバネッセント場分子イメージン グ法、 蛍光偏光解消法、 表面プラズモン共鳴法、 または、 固相酵素免疫検定法に より行われる。 以下これらの方法の詳細については記述する。
「標的分子」 とは、 本発明修飾タンパク質と相互作用する分子を意味し、 具体 的にはタンパク質、 核酸、 糖鎖、 低分子化合物などが挙げられる。 タンパク質と しては、 本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り特に制限はなく、 タンパク質の全長であっても結合活性部位を含む部分ペプチドでもよい。 またァ ミノ酸配列、 およびその機能が既知のタンパク質でも、 未知のタンパク質でもよ い。 これらは、 合成されたペプチド鎖、 生体より精製されたタンパク質、 または c D N Aライブラリー等から適当な翻訳系を用いて翻訳し、 精製したタンパク質 等でも標的分子として用いることができる。 合成されたぺプチド鎖はこれに糖鎖 が結合した糖夕ンパク質であってもよい。 これらのうち好ましくはアミノ酸配列 が既知の精製されたタンパク質か、 または c D N Aライブラリー等から適当な方 法を用いて翻訳および精製されたタンパク質を用いることができる。
核酸としては、 本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、 特に 制限はなく、 D N Aまたは R N Aも用いることができる。 また、 塩基配列または 機能が既知の核酸でも、 未知の核酸でもよい。 好ましくは、 タンパク質に結合能 力を有する核酸としての機能、 および塩基配列が既知のものか、 またはゲノムラ ィブラリー等から制限酵素等を用いて切断単離してきたものを用いることができ る。 糖鎖としては、 本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、 特 に制限はなく、 その糖配列または機能が、 既知の糖鎖でも未知の糖鎖でもよい。 好ましくは、 既に分離解析され、 糖配列または機能が既知の糖鎖が用いられる。 低分子化合物としては、 本発明修飾タンパク質と相互作用する能力を有する限り、 特に制限はない。 機能が未知のものでも、 またはタンパク質に結合する能力が既 に知られているものでも用いることができる。
これら標的分子が本発明修飾タンパク質と行う 「相互作用」 とは、 通常は、 夕 ンパク質と標的分子間の共有結合、 疎水結合、 水素結合、 ファンデルワールス結 合、 および静電力による結合のうち少なくとも 1つから生じる分子間に働く力に よる作用を示すが、 この用語は最も広義に解釈すべきであり、 いかなる意味にお いても限定的に解釈してはならない。 共有結合としては、 配位結合、 双極子結合 を含有する。 また静電力による結合とは、 静電結合の他、 電気的反発も含有する。 また、 上記作用の結果生じる結合反応、 合成反応、 分解反応も相互作用に含有さ れる。
相互作用の具体例としては、 抗原と抗体間の結合および解離、 タンパク質レセ プ夕一とリガンドの間の結合および解離、 接着分子と相手方分子の間の結合およ び解離、 酵素と基質の間の結合および解離、 核酸とそれに結合するタンパク質の 間の結合および解離、 情報伝達系におけるタンパク質同士の間の結合と解離、 糖 タンパク質とタンパク質との間の結合および解離、 または糖鎖とタンパク質との 間の結合および解離が挙げられる。
用いられる標的分子は、 態様に応じて修飾物質により修飾して用いることがで きる。 修飾物質は、 通常、 蛍光性物質などの非放射性修飾物質から選択される。 蛍光物質としては、 フリーの官能基 （例えばカルボキシル基、 水酸基、 アミノ基 など） を持ち、 タンパク質、 核酸等の上記標的物質と連結可能な種々の蛍光色素、 例えばフルォレセイン系列、 ローダミン系列、 Cy3、 Cy5、 ェォシン系列、 N B D 系列などのいかなるものであってもよい。 その他、 色素など修飾可能な化合物で あれば、 その化合物の種類、 大きさは問わない。
これらの修飾物質は、 標的分子と本発明修飾タンパク質との間の相互作用に基 づいて発生される信号の変化の測定または解析方法に適したものが適宜用いられ る。
上記修飾物質の標的分子への結合は、 それ自体既知の適当な方法を用いて行う ことができる。 具体的には、 例えば、 標的分子がタンパク質の場合、 上記に記載 した C末端を修飾する方法等を用いることができる。 また標的分子が核酸の場合 は、 予め修飾物質を共有結合などで結合させたオリゴ D N Aプライマーを用いた P C Rを行う方法などによつて簡便に修飾することができる。
また、 本発明修飾タンパク質または本発明に用いられる標的分子は態様に応じ て、 固相に結合させる場合があるが、 固相に結合させる方法としては、 修飾物質 を介して結合させるものと、 それ以外の部分により結合させるものが挙げられる。 修飾物質を介して結合させる場合に用いられる修飾物質は、 通常には、 特定の ポリペプチドに特異的に結合する分子 （以下、 「リガンド」 と称することがある。 ） であり、 固相表面には該リガンドと結合する特定のポリペプチド （以下、 「ァダ プタータンパク質」 と称することがある） を結合させる。 アダプタ一タンパク質 には、 結合タンパク質、 受容体を構成する受容体タンパク質、 抗体なども含まれ る。
アダプタータンパク質/リガンドの組み合わせとしては、 例えば、 アビジンお よびストレブトアビジン等のピオチン結合タンパク質/ピオチン、 マルト一ス結 合夕ンパク質/マルトース、 Gタンパク質/グァニンヌクレオチド、 ポリヒスチ ジンぺプチド /二ヅケルまたはコバルト等の金属イオン、 グルタチオン一 S—ト ランスフェラ一ゼ /グル夕チオン、 D N A結合夕ンパク質/ D N A、 抗体/抗原 分子 （ェピトープ） 、 カルモジュリン/カルモジュリン結合ペプチド、 A T P結 合夕ンパク質/ A T P、 またはエストラジオール受容体夕ンパク質/エストラジ オールなどの各種受容体タンパク質/そのリガンドなどが挙げられる。
これらの中で、 アダプタ一夕ンパク質/リガンドの組み合わせとしては、 アビ ジンおよびストレプトアビジンなどのピオチン結合タンパク質、 マルト一ス結合 夕ンパク質/マルトース、 ポリヒスチジンぺプチド /ニッケルまたはコバルト等 の金属イオン、 ダル夕チオン一 S—トランスフェラーゼ /グル夕チオン、 抗体/ 抗原分子 （ェピトープ） 、 などが好ましく、 特にストレプトアビジン/ピオチン の組み合わせが最も好ましい。 これらの結合タンパク質は、 それ自体既知のもの であり、 該夕ンパク質をコードする D N Aは既にクロ一ニングされている。
アダプタ一夕ンパク質の固相表面への結合は、 それ自体既知の方法を用いるこ とができるが、 具体的には、 例えば、 タンニン酸、 ホルマリン、 グルタルアルデ ヒド、 ピルビックアルデヒド、 ビス一ジァゾ化べンジゾン、 トルエン- 2， 4-ジィ ソシァネート、 アミノ基、 活性エステルに変換可能なカルボキシル基、 またはホ スホアミダイ ドに変換可能な水酸基またはアミノ基などを利用する方法を用いる ことができる。
修飾物質以外の部分により固相に結合させる場合は、 通常タンパク質、 核酸、 糖鎖、 低分子化合物を固相に結合させるのに用いられる既知の方法、 具体的には 例えば、 タンニン酸、 ホルマリン、 グルタルアルデヒド、 ピルビヅクアルデヒド、 ビス一ジァゾ化べンジゾン、 トルエン- 2，4-ジイソシァネート、 アミノ基、 活性 エステルに変換可能なカルボキシル基、 またはホスホアミダイ ドに変換可能な水 酸基またはアミノ基などを利用する方法を用いることができる。
' 「測定」 とは解析のために用いられる信号の変化を収集するための手段であり、 いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。 用いられる測定法として は、 例えば、 蛍光相関分光法、 蛍光共鳴エネルギー移動法、 エバネッセント場分 子イメージング法、 蛍光偏光解消法、 蛍光イメージングアナライズ法、 表面ブラ ズモン共鳴法、 固相酵素免疫検定法など、 分子間相互作用を検出できるあらゆる 系が利用可能である。
虫光木日 ¾分光 (Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) ： Eigen, Μ·， et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5740-5747(1994)) は、 共焦点レーザ一顕微鏡等の下 で、 粒子の流動速度、 または拡散率、 容積収縮等を測定する方法であり、 本発明 においては、 本発明修飾タンパク質 （C末端修飾タンパク質） と標的分子間の相 互作用により元の修飾分子 1分子の並進ブラゥン運動の変化を測定することによ り、 相互作用する分子を測定することができる。 具体的には試料粒子が励起光に より励起されて、 試料液容積の一部において蛍光を放射し、 この放射光を測定し 光子割合を得る。 この値は、 特定の時間に観測されている空間容積中に存在する 粒子の数と共に変化する。 上述した種々のパラメ一夕は自己相関関数を使用して この信号の変動から算出され得る。 この FCSを行う為の装置も力一ルヅアイス （Z eiss) 社等から市販されており、 本方法においてもこれらの装置を用いて解析を 行うことができる。 この方法を用いてタンパク質一標的分子間相互作用の測定ま たは解析を行う場合、 C末端修飾タンパク質または標的分子のいずれも溶液とし て供することが必要である （液相法） 。 標的分子は修飾の必要はない。 また相互 作用を調べようとする C末端修飾タンパク質より非常に分子量の小さい分子は、 C末端修飾タンパク質のブラウン運動に影響を及ぼさないため本方法においては しかし、 2種類の蛍光色素を用いる蛍光相互相関分光法 （FCCS) は、 1種類の 蛍光色素を用いる FCSでは困難であった同じくらいの分子量をもつタンパク質間 の相互作用も検出できる。 2種類の蛍光色素を用いる他の方法としては蛍光共鳴 エネルギー移動 （FRET) 法が知られているが、 FRETが生じるためには 2つの蛍光 色素が 40〜50A以内に近接する必要があり、 タンパク質の大きさや蛍光色素の付 いている位置によっては、 相互作用していても FRETが観測されない危険性がある。 FCCS法では相互相関の検出は蛍光色素間の距離に依存しないので、 そのような問 題がない。 一方、 他の検出系である蛍光偏向解消法と比較すると、 FCCS法は必要 なサンプル量が少なく、 検出時間が短く、 HTSのための自動化が容易等の長所が ある。 さらに FCCS法では蛍光標識された分子の大きさや数というきわめて基本的 な情報が得られるので、 表面プラズモン共鳴法のように汎用的な用途に利用でき る可能性がある。 両者の違いは、 表面プラズモン共鳴法ではタンパク質が固定化 された状態で相互作用を検出するのに対して、 FCCS法ではより天然の状態に近い 溶液中の相互作用を見ることができる点にある。 FCCS法では、 タンパク質の固定 化が必要ないかわりに、 タンパク質を蛍光色素で標識する必要があるが、 本発明 により、 この課題を克服することが可能となった。
本方法において C末端修飾タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであつ てもよいが、 好ましくは市販の F C S用装置の測定用ゥエルに通常生化学的に用 いられる緩衝液等に適当な濃度で C末端修飾タンパク質溶解した溶液を投入し、 さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によって 行われる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記 F C S 用測定装置の各測定用ゥエルにそれぞれ異なる複数の C末端修飾夕ンパク質を投 入し、 これに特定の標的分子溶液を投入するか、 または特定の C末端修飾タンパ ク質を投入し、 各ゥエルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する方法が 用いられる。
蛍光イメージングアナライズ法は、 固相化された分子に、 修飾分子を接触せし め、 両分子の相互作用により、 固相化された分子上にとどまった修飾分子から発 せられる蛍光を、 市販の蛍光イメージングアナライザーを用いて測定または解析 する方法である。
この方法を用いてタンパク質一標的分子間相互作用の測定または解析を行う場 合、 C末端修飾タンパク質または標的分子のいずれか一方は上記した方法により 固相化されていることが必要である。 標的分子は固相化して用いる場合には修飾 されているものと、 されていないもののどちらも利用可能である。 また、 固相化 しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されていることが必要であ る。 C末端修飾タンパク質は、 修飾部を介して固定化されているものも、 修飾部 以外の部分で固定化されているものも用いることができる。
C末端修飾タンパク質、 または標的分子を固相化するための基板としては、 通 常タンパク質や核酸等を固定化するのに用いられる二トロセルロースメンブレン やナイロンメンブレン、 またはプラスチック製のマイクロプレート等も用いるこ とができる。
本方法において修飾標的分子または C末端修飾タンパク質を固相化分子へ接触 せしめる方法としては、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であ ればいかなるものであってもよいが、 好ましくは修飾標的分子または C末端修飾 タンパク質を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃度で溶解した溶液を作 成し、 これを固相表面に接触させる方法が好ましい。
両分子を接触せしめた後、 好ましくは過剰に存在する修飾標的分子または C末 端修飾タンパク質を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、 固相上にとどまった 標的分子または C末端修飾夕ンパク質の修飾物質から発せられる蛍光信号、 また は固相化されている修飾分子から発せられる蛍光と固相上にとどまつた修飾分子 から発せられる蛍光が混ざり合った信号を、 市販のイメージングアナライザーを 用いて測定または解析することにより、 固相化された分子と相互作用する分子を 同定することができる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記固相表 面に、 複数の c末端修飾夕ンパク質または修飾もしくは非修飾標的分子を番地付 けして固相化する方法、 または 1種類の C末端修飾タンパク質または修飾もしく は非修飾標的分子に固相化されていない複数種の c末端修飾夕ンパク質または修 飾標的分子を接触させる方法等が用いられる。 複数種の C末端修飾夕ンパク質ま たは修飾標的分子を接触させる場合には、 固相にとどまった該分子を緩衝液の濃 度の差等により解離させて取得し、 これを既知の方法により分析することにより 同定できる。
蛍光共鳴エネルギー移動 （FRET) 法は、 2種類の蛍光色素を用いる他の分子間 相互作用検出法としてよく知られている。 FRET とは、 2種類の蛍光色素の一方 (エネルギー供与体） の蛍光スペクトルと、 もう一方 （エネルギー受容体） の吸 収スペクトルに重なりがあるとき、 2つの蛍光色素間の距離が十分小さいと、 供 与体からの発光が起こらないうちに、 その励起エネルギーが受容体を励起してし まう確率が高くなる現象をいう。 したがって、 相互作用を検出したい 2つのタン パク質を、 それぞれ供与体および受容体となる蛍光色素で標識しておき、 供与体 を励起すれば、 2つのタンパク質が相互作用しない場合は、 蛍光色素間の距離が 大きいため FRETは起こらず、 供与体の蛍光スペクトルが観察されるが、 2つの 夕ンパク質が相互作用して蛍光色素間の距離が小さくなると、 FRETにより受容体 の蛍光スぺクトルが観察されるので、 蛍光スぺクトルの波長の違いからタンパク 質間相互作用の有無を判別することができる。 蛍光色素としては、 供与体がフル ォレセイン、 受容体がローダミンという組み合わせがよく用いられている。 また 最近では、 蛍光緑色タンパク質 （GFP) の波長の異なる変異体の組み合わせによ り、 細胞の中で FRETを観察し相互作用を検出する試みがなされている。 この方 法の欠点としては、 FRETが生じるために 2つの蛍光色素が 40〜50A以内に近接 する必要があるため、 夕ンパク質の大きさや蛍光色素の付いている位置によって は、 相互作用していても FRETが観測されない危険性があるという点が挙げられる。 エバネヅセント場分子イメージング法とは、 Funatsu， Τ·, et al., Nature, 374, 555-559 (1995)等に記載されている方法で、 ガラス等の透明体に固相化した分子 に溶液として第 2の分子を接触せしめ、 これにエバネヅセント場が発生する角度 でレーザー光等の光源を照射し、 発生したエバネッセント光を検出器によって測 定または解析する方法である。 これらの操作は、 それ自体既知のエバネッセント 場蛍光顕微鏡装置を用いて行うことができる。
この方法を用いてタンパク質一標的分子間相互作用の測定または解析を行う場 合、 C末端修飾夕ンパク質または標的分子のいずれか一方は上記した方法により 固相化されていることが必要である。 標的分子は固相化する場合は修飾の必要は ないが、 固相化しないで用いる場合には上記した修飾物質により修飾されている ことが必要である。
C末端修飾タンパク質、 または標的分子を固相化するための基板としては、 ガ ラス等の材質の基板が用いられ、 好ましくは石英ガラスが用いられる。 また、 レ 一ザ一光の散乱等を防ぐために表面を超音波洗浄したものが好ましい。
本方法において固相化していない C末端修飾タンパク質または修飾標的分子を 固相化分子へ接触せしめる方法としては、 両分子が相互作用するに十分な程度に 接触する方法であればいかなるものであってもよいが、 好ましくは固相化して.い ない C末端修飾タンパク質または修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝 液に適当な濃度で溶解した溶液を作成し、 これを固相表面に滴下する方法が好ま しい。
両分子を接触せしめた後、 エバネッセント場照明により励起された蛍光を C C Dカメラ等の検出器を用いて測定することにより、 固相化された分子と相互作用 する分子を同定することができる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記基板に、 複数の C末端修飾タンパク質または修飾標的分子を番地付けして固相化する方法 等が用いられる。
蛍光偏光法 (Perran, J., et al.， J. Phys. Rad., 1, 390-401(1926)) は、 蛍光偏光で励 起された蛍光分子が、 励起状態の間、 定常状態を保っている場合には同一の偏光 平面で蛍光を放射するが、 励起された分子が励起状態中に回転ブラウン運動等を 行った場合に、 放射された蛍光は励起光とは異なった平面になることを利用する 方法である。 分子の運動はその大きさに影響を受け、 蛍光分子が高分子である場 合には、 励起状態の間の分子の運動はほとんどなく、 放射光は偏光を保ったまま になっているのに対して、 低分子の蛍光分子の場合は、 運動速度が速いために放 射光の偏光が解消される。 そこで、 平面偏光で励起された蛍光分子から放射され る蛍光の強度を、 元の平面とそれに垂直な平面とで測定し、 両平面の蛍光強度の 割合からこの分子の運動性およびその存在状態に関する情報が得られるものであ る。 この方法によれば、 夾雑物があってもこれに影響されることなく、 蛍光修飾 された分子と相互作用する標的分子の挙動を追跡できる。 これは蛍光修飾された 分子と標的分子が相互作用するときにのみ、 偏光度の変化として測定されるから である。
この方法を行うための装置としては例えば BECON (Panyera社製） 等が市販され ており、 本方法もこれらの装置を用いることにより行うことができる。
この方法を用いてタンパク質一標的分子間相互作用の測定または解析を行う場 合、 C末端修飾タンパク質または標的分子のいずれも溶液として供する必要であ る。 標的分子は修飾の必要はない。 また相互作用を調べようとする C末端修飾夕 ンパク質より非常に分子量の小さい分子は、 C末端修飾タンパク質のブラウン運 動に影響を及ぼさないため本方法においてはふさわしくない。
本方法において C末端修飾タンパク質に標的分子を接触せしめる方法としては、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であれば如何なるものであつ てもよいが、 好ましくは市販の蛍光偏光解消装置の測定用ゥエルに通常生化学的 に用いられる緩衝液等に適当な濃度で c末端修飾タンパク質溶解した溶液を投入 し、 さらに同緩衝液に適当な濃度で標的分子を溶解した溶液を投入する方法によ つて行われる。
本方法において測定する C末端修飾夕ンパク質および標的分子との間の相互作 用は、 必ずしも抗原抗体方法ほど特異性は高くないことが考えられるため、 最適 の組み合わせを検出するためには、 相互作用の程度を数値化することが有効であ る。 相互作用の程度を示す指標としては、 例えば一定濃度の C末端修飾タンパク 質に対して、 極大蛍光偏光度を与える最小標的物濃度の値等を用いることができ る。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記蛍光偏 光解消法測定装置の各測定用ゥエルにそれぞれ異なる複数の c末端修飾夕ンパク 質を投入し、 これに特定の標的分子溶液を投入するか、 または特定の C末端修飾 夕ンパク質を投入し、 各ゥエルに互いに異なる複数種の標的分子溶液を投入する 方法が用いられる。
表面プラズモン共鳴法とは、 金属/液体界面で相互作用する分子によって表面 プラズモンが励起され、 これを反射光の強度変化で測定する方法である （Cullen, D.C., et al.， Biosensors, 3(4)， 211-225(1987-88)) 。 この方法を用いてタンパク質一 標的分子間相互作用の測定または解析を行う場合、 C末端修飾夕ンパク質は上記 した方法により固相化されていることが必要であるが、 標的分子の修飾は必要な い。 C末端修飾タンパク質を固相化するための基板としては、 ガラスの等の透明基 板上に金、 銀、 白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。 透明基板とし ては、 通常表面プラズモン共鳴装置用に用いられるものであればいかなるもので あってもよく、 レーザー光に対して透明な材料からなるものとして一般的にはガ ラス等からなるものであり、 その厚さは 0 . l〜5 mm程度のものが用いられる。 また金属薄膜の膜厚は 1 0 0〜2 0 0 O A程度が適当である。 このような表面プ ラズモン共鳴装置用固基板として市販されているものも用いることができる。 C 末端修飾夕ンパク質の上記基板への固相化は前述した方法により行うことができ る。
本方法において標的分子を C末端修飾タンパク質へ接触せしめる方法としては、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるものであつ てもよいが、 好ましくは標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に適当な濃 度で溶解した溶液に固相化された C末端タンパク質を接触させる方法を用いるこ とができる。
これらの行程は市販の表面プラズモン共鳴装置、 例えば B IAcore2000 (Pharmacia Biosensor社製）によってもよい。 両分子を接触せしめた後、 それ自体既 知の表面プラズモン共鳴装置を用いて、 それぞれの反射光の相対強度の時間的変 化を測定することにより、 固相化された C末端修飾タンパク質と標的分子の相互 作用が解析できる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記表面プ ラズモン共鳴装置に用いられる基板に、 複数の C末端修飾タンパク質を番地付け して固相化するか、 または 1種類の固相化された C末端修飾夕ンパク質に複数種 の標的分子を接触させる方法等が用いられる。
固相酵素免疫検定法 ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay ( EL I SA) : Crowther, J.R., Methods in Molecular Biology, 42 (1995)) は、 固相上に固定化した 抗原に対し、 抗体を含む溶液を接触せしめ、 両分子の相互作用 （抗原抗体反応） により、 固相化された抗原上にとどまった抗体をこれと特異的に結合する修飾分 子 （I g G等） から発せられる蛍光、 または修飾分子を基質とする色素から発せ られる信号を、 市販の検出器 （E L I S Aリーダー） を用いて測定または解析す る方法である。
この方法を用いてタンパク質一標的分子間相互作用の測定または解析を行う場 合、 抗原となる C末端修飾タンパク質を上記した方法により固相化されているこ とが必要である。 また抗体となる標的分子は上記した修飾物質により修飾されて いることが必要である。
抗原となる C末端修飾タンパク質を固相化するための基板としては、 通常 E L I S Aに用いられるプラスチック製のマイクロプレート等も用いることができる。 本方法において抗体となる修飾標的分子を固相分子へ接触せしめる方法として は、 両分子が相互作用するに十分な程度に接触する方法であればいかなるもので あってもよいが、 好ましくは修飾標的分子を生化学的に通常使用される緩衝液に 適当な濃度で溶解した溶液を作成し、 これをマイクロプレートに注入する方法が 好ましい。
両分子を接触せしめた後、 好ましくは過剰に存在する固相化分子に結合してい ない修飾分子を同緩衝液等により洗浄する工程を行い、 固相上にとどまった修飾 分子から発せられる蛍光を、 市販の E L I S Aリーダ一等を用いて測定または解 析することにより、 固相化された抗原分子と相互作用する分子を同定することが できる。
この方法において、 同時に多数の解析を行う方法としては、 例えば上記マイク 口プレートの各穴にそれぞれ異なる複数の修飾標的分子を固相化する方法が用い られる。
相互作用する分子の同定方法としては、 上記のそれぞれの方法により測定され C末端修飾タンパク質との間に相互作用が認められた標的分子は、 該分子の一次 構造が未知の場合、 それ自体既知の適当な方法により、 その一次構造を解析する ことができる。 具体的には、 相互作用を認められた標的分子がタンパク質の場合、 ァミノ酸分析装置等によりァミノ酸配列を解析し、 一次構造を特定することがで きる。 また、 標的分子が核酸の場合には、 塩基配列決定方法により、 オート D N Aシーケンサ一などを用いれば塩基配列を決定することができる。
C末端修飾タンパク質の固相化のための装置としては、 上記に記載した C末端 修飾夕ンパク質の修飾部を介した固相への固定化方法を行うために、 既知の適切 な手段を組み合わせて装置を構築することもできる。 本装置における各手段自体 はそれぞれ既知のものであり、 これらの手段における、 基板の保持、 C末端修飾 タンパク質溶液の添加、 洗浄等の各操作は、 それ自体既知の方法により行えばよ い。 これらの操作を組み合わせ、 全自動または半自動の、 C末端修飾タンパク質 の固相化のための装置を構築することができる。
タンパク質一標的分子間相互作用測定のための装置としては、 上記に記載した タンパク質一標的分子間相互作用測定を行うために、 既知の適切な手段を組み合 わせて装置を構築することもできる。 本装置における各手段自体はそれそれ既知 のものであり、 これらの手段における、 基板の保持、 標的分子の添加、 洗浄、 信 号検出等の各操作は、 それ自体既知の方法により行えばよい。 これらの操作を組 み合わせ、 全自動または半自動の、 タンパク質—標的分子間相互作用測定のため の装置を構築することができる。 実施例
以下、 具体的に本発明の翻訳テンプレート、 C末端修飾蛋白質、 翻訳テンプレ ートによる C末端ラベル化法および対応付け方法についての実施例を記述するが、 下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、 本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。 実施例 1 翻訳テンプレートの作成とその翻訳 （C末端ラベル化） コード分子は、 マウス由来の C- junまたは C- fos(Gentz R， Rauscher FJ 3d, Abate C， Curran T (1989) Science 243:1695-9; Neuberg M, Schuermann M, Hunter JB, Muller R (1989) Nature 338:589-90)の組み込まれているプラスミ ド（C- junは、 pEU-T7JunF lag (配列番号 1 ) ; c - fosは、 pCMVFosCBPzz (配列番号 2 ) )から PCRで作成した。 PC Rのプライマーとしては、 C- junでは 5， UTR領域について 1種類（プライマー； 5' SP6 - 029(配列番号 3 ) )と 3，末端領域については 13種類（プライマー； 3，A8=A (配列 番号 6 )、 3，X(CTCGAG) (配列番号 7 )、 3， X(CTCGAG)A8=XA (配列番号 8 )、 3' X(CTCG CC )A8(配列番号 9 )、 3' X(CTCG)A8(配列番号 1 0 )、 3' X(CTC)A8(配列番号 1 1 )、 35 X(CTCT)A8(配列番号 1 2 )、 3， X(TTCG)A8(配列番号 1 3 )、 3， X(GTCC)A8(配列番 号 1 4 )、 3' X(CATG)A8(配列番号 1 5 )、 3' X(CTCC)A8(配列番号 1 6 )、 3' X(GTCG) A8(配列番号 1 7 )、 3' none (配列番号 5 ) )、 c - fosでは 5' UTR領域について 1種類 (プライマー； 5，T7(0， )- bait (配列番号 4 ) )と 3'末端領域については 2種類（ブラ イマ一； 3' baitFosD (配列番号 1 8 )， 3' baitFosDA (配列番号 1 9 ) )を用い、 計 1 5種類の DNAテンプレートを調製し、 QIAquick PCR Purification Kits(QIAGEN)で 精製した。 これらの MAテンプレートを、 RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems (Promega)をもちいて転写（37°C , 2h)し、 合成した mHNAを RNeasy Mini Kits (QIAGEN)で精製し、 mMAテンプレート （コード分子） を得た。
まず、 得られた mRNAテンプレートを翻訳テンプレートとして用いて、 翻訳を行 つた。 翻訳テンプレート 2 pmolを用いて、 Wheat Germ Extract (Promega)の 10〃 1 の系で翻訳（26°C， 60 min)を行い、 翻訳と同時に、 修飾剤として 240 pmolの Fluo r-dCpPuroを用いて、 蛋白質のラベル化 (Miyamoto-Sato, E.， Nemoto, N.， Kobayashi, K.， and Yanagawa, H. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182; Nemoto, N.， Miyamoto-Sato, E. and Yanagawa, H. (1999) FEBS Lett., 462: 43-46)を行い、 15%SDS- PAGEで電気泳動し、 バンドの蛍光（フルォレセィン）をマルチ画像解析装置、 Molecular Imager FX (Bio-Rad)で測定した。 その結果をまとめたグラフを図 6に示 す。
図 6から、 ポリ A配列 （A配列） より SNNS配列 （X配列） を有する場合に、 さら に SNNS-ポリ A配列 （XA配列） を有する場合に、 翻訳量が増加することが示された。 このことから、 XA配列を持つ翻訳テンプレートは、 一般的な翻訳や C末端ラベル 化により好ましいといえる。 また、 X配列を変えたときの翻訳結果から、 X配列が A配列と組み合わさって効果を現すには、 最低 4塩基からなることが必要であり、 第一番目と第四番目の塩基は Cか Gであることが要求され、 SNNS (Sは Cまたは G) の構成が必要であることが示された。
さらに、 mRNAテンプレートの 3'側に PEGスぺーサ一分子（下記製造例 1〜 4参照） をライゲーシヨンした翻訳テンプレートを作成した。 ここでは、 T4 RNAリガーゼ (宝酒造）をもちいて、 PEGスぺーサ一部（（dC) 2 (T) 2， PEG棚， PEG4000Puro-Boc) と、 コード分子（Jun- X(CTCGAG)A8=Jun- XA (プライマー 3，X(CTCGAG)A8二 XAを用いて 得られたもの））またはコード分子（Fos- D(-A)または 3， baitFos-DA(+A) (プライマ -35 baitFosDまたは 3， baitFosDAを用いて得られたもの））とのライゲ一シヨン（ 15 °C， 20 h)を行い、 RNeasy Mini Kits (QIAGEN)で精製し、 8 M尿素 4%PAGEで電気泳 動し、 エチレンブロマイ ド（EtBr )で染色し、 バンドの蛍光（EtBrとフルォレセィ ン）をマルチ画像解析装置、 Molecular Imager FX (Bio-Rad)で検出した。 ライゲ一 シヨンした 2 pmolの翻訳テンプレートを用いて、 Wheat Germ Extract (Promega)ま たは、 PR0TEI0S ( Toyobo )を用いて、 10 / 1の系で翻訳（26°C； 1 , 3， 6， 20 hr )を 行い、 翻訳と同時に、 修飾剤として 240 pmolの Fluor- dCpPuroを用いて、 蛋白質 のラベルイ匕 fiVIiyamoto-Sato， E., Nemoto, N" Kobayashi, K., and Yanagawa, H. (200O) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182; Nemoto, N.， Miyamoto-Sato, E. and Yanagawa, H. (1999) FEBS Lett., 462: 43-46)を行い、 15%SDS- PAGEで電気泳動し、 バンドの蛍光 (Fluorescein)をマルチ画像解析装置、 Molecular Imager FX (Bio- Rad)で測定し た。 RNAの安定性実験は、 PEGスぺ一サ一部の蛍光を用いて、 RNAの残量をマルチ 画像解析装置、 Molecular Imager FX (Bio- Had)で測定した。 対照としてライゲ —シヨンしていない翻訳テンプレートを用いて同様の手順を行った。 それらの結 果をまとめたグラフを図 7および図 8に示す。
図 7から、 コード部の配列は基本的にはどのような配列でも PEGスぺ一サ一部 をライゲーシヨンすることで翻訳量が増加することが示された（図 7の A )。 また、 XA配列を持つコード部をもつ翻訳テンプレート（XA)では、 XA配列も PEGスぺ一サ 一部も持たないコ一ド分子（None)に比べて、 翻訳量が約 3〜 4倍増加しているこ とが示された。 また、 XA配列を持つコード部では、 PEG4000Puro- Bocの構成が最 も翻訳量が増加することが示された（図 7の B )。 よって、 一般的な翻訳や C末端 ラベル化には PEGスぺーサ一部がライゲーシヨンされた XA配列を持つ翻訳テンプ レートを用いることが適しているといえる。 図 8から、 XA配列を持つコード分子 ( · ; XA)、 XA配列を持たないコード分子（口； None )は 3時間で翻訳量は飽和に達 したが、 PEG4000Puro- Bocをもつ翻訳テンプレート（〇； XA+PEG400Pm?o-Boc )は、 6時間でも翻訳の増加が見られた（図 8の A )。 また、 その翻訳量は、 6時間で比 較すると、 PEG4000Puro-Bocをもつ翻訳テンプレート（〇）は、 XA配列を持つコー ド分子（會； XA)の約 2倍、 XA配列を持たないコード分子（口； None ) の約 4倍で あった（図 8の A )。 コード分子と、 PEGスぺーサ一部をもつ翻訳テンプレートと の安定性を比較すると、 コード分子（き； XA)は、 その mRNAが 1時間で 50%減るの に対して、 PEGスぺーサ一部をもつ翻訳テンプレート（〇）は、 1 3時間でようや く 50%減ることから、 PEGスぺーサ一部をもつコ一ド分子（〇）の安定性が非常によ いことがわかる（図 8の B )。 以上から、 翻訳テンプレート（〇）の翻訳量が増加し たのは、 ライゲーシヨンされた PEG4000Puro- Bo よる安定性向上が原因と考え られる。 実施例 2 翻訳テンプレートを用いた対応付け
コード分子（mRNAテンプレート）に PEGスぺーサ一分子（下記製造例 1〜 4参照） をライゲーシヨンしたものを翻訳テンプレートとして用いた。 ここでは、 実施例 1で得たコ一ド分子の mRNAテンプレート（Jun-XA， Jun- A)と PEGスぺーサ一部（PEG 2000Puro )を実施例 1と同様の方法でライゲーシヨンした。 ライゲ一シヨンした m Aテンプレートを小麦胚芽の無細胞翻訳系として Wheat Germ Extract (Promega) をもちいて、 実施例 1と同様の方法で翻訳し、 対応付け分子を 8 M尿素 10%SDS - PA GEで電気泳動し、 蛍光（フルォレセイン）によってマルチ画像解析装置、 Molecular Imager FX (Bio- Rad)で検出した。 また、 フリー蛋白質の量は、 翻訳と同時に、 修 飾剤として Fluor- dCpPuroを用いて、 蛋白質のラベル化 （Miyamoto-Sato, R, Nemoto, Ν·, Kobayashi, Κ·， and Yanagawa, H. 2000) Nucleic Acids Res. 28: 1176-1182; Nemoto, N.， Miyamoto-Sato, E. and Yanagawa, H. (1999) FEBS Lett., 462: 43-46) を行い、 8 M尿素 10%SDS- PAGEおよび 1 5 %SDS- PAGEで電気泳動し、 バンド の蛍光（フルォレセィン）をマルチ画像解析装置、 Molecular Imager FX (Bio-Rad)で 測定し、 あわせて、 T7- tagによる抗体を用いたウェスタンプロットで総蛋白量を 決定した。 それらの結果をまとめたグラフを図 9に示す。
図 9から、 対応付け分子は、 XA配列を持つコード部と A配列を持つコード部に ついて比較すると、 添加する RNA量を変化させたときの対応付け効率は両方とも 7 0%でほとんど変わらないことが示された（図 9の A；)。 しかしながら、 添加した RN
Aテンプレートから合成された蛋白質総量（フリー蛋白質 +対応付け分子 =100%)に 対する対応付け効率については、 添加する MA量を変化させたとき、 A配列を持つ コード部の場合は 90% (フリー蛋白質 10%)を超える高い効率を示すことが示された (図 9の B )。 一方、 XA配列を持つコード部の場合は、 フリー蛋白質の生成割合が 高い（図 9の. B )。 よって、 対応付け分子には XA配列よりも A配列を持つコード部 が適しているといえる。 製造例 1 PEGスぺーサ一分子 （11) の合成
PEGスぺーサ一分子 （U ) は、 図 1 0に示す試薬を用い、 図 1 1に示す方法で 合成した。 図 1 0中アミダイ ト試薬 （1〜5 ) はグレンリサーチ社 （ァメリカ合衆 国、 バージニア州） より購入した。 平均分子量 1000、 2000、 3000の PEGは日本油 脂 （東京都渋谷区） より購入した。 平均分子量 4000の PEGはフル力社 （スイス）. より購入した。 それらを原料にしてアミダイ ト試薬 （6 )を、 Jaschkeらが報告し た方法 (Jaschke, A. et al . ( 1993 ) Tetrahedron Lett. 34 : 301-304) を用い 合成した。 図 1 1中 10は Ikedaらが報告した方法 ( Ikeda, S. et al . ( 1998) Tet rahedron Lett. 39 : 5975-5978) で合成した。 なお、 図 1 0中 DMTrは 4，4， -ジメ トキシトリチル基を、 図 1 1中 Fmocは 9-フルオレンメ トキシカルボ二ル基を示す。
10 (400 mg, ピューロマイシン lO^mol含有） に対し、 以下の A〜Dの処理を 所定の配列に従い、 所定数のヌクレオチドおよび PEGが導入されるまで繰り返し 仃なった。
A . 3%トリクロ口酢酸一塩化メチレン溶液を 1 inL加え室温で 3分間放置後、 塩化 メチレン 5 mLで 3回洗浄する。 再度同じ操作を繰り返した後、 無水ァセトニトリ ル 5 mLで 5回洗浄する。
B . ヌクレオチドアミダイ ト 30 zmol、 0.457 Mテトラゾールー無水ァセトニトリ ル溶液 100/zL、 および無水ァセトニトリル 1 mLを加え、 室温で 15分間振盪する。 ァセトニトリル 5 mLで 5回洗浄する。
C . 50 mMョゥ素溶液 （テトラヒドロフラン一ピリジン一水 = 7 5 ： 2 0 ： 5 ) 1 mLを加え室温で 3分間放置後、 ピリジン 5 mLで 3回洗浄する。 再度同じ操作を繰 り返した後、 無水ピリジン 5 mLで 5回洗浄する。
D . 10%無水酢酸—ピリジン溶液 1 mLおよび触媒量の 4， 4-ジメチルァミノピリジン を加え室温で 20分間放置後、 ピリジン 5 mLで 5回、 塩化メチレン 5 mLで 5回洗浄す る。 上記の処理をし所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された 10に濃ァ ンモニァ水 1.5 mLおよびエタノール 0.5 mLを加え、 室温で 14時間震盪した。 ろ過 により固相担体 （CPG) を取り除き、 ろ液を凍結乾燥した。 残査を HPLC [カラ ム ： YMC社 (京都府) 製 YMC pack ODS-A SH-343-5, 溶離液 10- 60%ァセトニトリ ルー 0.1 M酢酸トリエチルアンモニゥム水溶液 （pH 7.0) の 30分間の直線濃度勾 配、 流速： 10 mL/分] で精製後、 PEGスぺーサ一分子 （11) を得た。 得られた PEG スぺーサ一分子 （U) の構造および収率を以下に示す。
p(dCp)2PEG(1000)p(dCp)2Puro 収率 8.7%
p(dCp)2T(Fl)pPEG(1000)pdCpPuro 収率 62%
p(dCp)2T(Fl)pPEG(1000)p(dCp)2Puro 収率 14%
p(dCp)2PEG(2000)p(dCp)2Puro 収率 7%
p ( dCp ) 2T(F 1 )pPEG( 2000 )pdCpPuro 収率 30%
p(dCp)2T(Fl)pPEG(2000)p(dCp)2Puro 収率 27%
p(dCp)2T(Bio)pPEG(2000)pdCpPuro 収率 9%
p(dCp)2T(Bio)pPEG(2000)p(dCp)2Puro 収率 8%
p(dCp)2T(Bio)pT(ri)pPEG(2000)pdCpPuro 収率 ¾
p(dCp)2T(Bio)pT(Fl)pPEG(2000)p(dCp)2Puro 収率 8%
p(dCp)2PEG(3000)pdCpPuro 収率 2%
p(dCp)2PEG(3000)p(dCp)2Puro 収率 22%
p(dCp)2T(Fl )PPEG(3000 )pdCpPuro 収率 29%
p(dCp)2T(Fl)PPEG(3000)p(dCp)2Puro 収率 23%
p(dCp)2T(Fl)pPEG(4000)pdCpPuro 収率 16%
p(dCp)2T(Fl)pPEG(4000)p(dCp)2Puro 収率 17% 製造例 2 PEGスぺ一サ一分子 （14) の合成
PEGスぺーサ一分子 （14) は、 図 1 0に示す試薬を用い、 図 1 1および 1 2に 示す方法で合成した。 図 1 0中、 ローダミングリーン（RhodG) 活性エステル（7) はモレキユラプローブ社 （アメリカ合衆国、 オレゴン州） より、 Cy5活性エステ ル（8)および Cy3活性エステル（9)はアマシャムフアルマシアバイオテク社 （ィギ リス、 バヅキンガムシヤー） より、 購入した。 図 1 2中、 12は Ikedaらが報告し た方法 (Ikeda, S. et al. (1998) Tetrahedron Lett. 39: 5975-5978) を応用 し合成した。 なお、 図 1 0中、 Bocは tert-ブトキシカルボ二ル基を示す。
12 (400 mg3 ピューロマイシン ΙΟ ΒΙΟΙ含有） に対し、 PEGスぺーサ一分子 （1 1) の合成の場合と同様の A〜Dの処理を所定の配列に従い、 所定数のヌクレオ チドおよび PEGが導入されるまで繰り返し行なった。
上記の処理を行ない、 所定の配列および所定数のヌクレオチドが導入された 12 に濃アンモニア水 1.5 mLおよびエタノール 0.5 mLを加え、 室温で 14時間震盪した。 ろ過により固相担体 （CPG) を取り除き、 ろ液を凍結乾燥した。 残査を HPLC
[カラム ： YMC社 （京都府） 製 YMC pack 0DS-A SH-343-5, 溶離液： 10-60% ァセ トニトリル— 0.1 M酢酸トリェチルアンモニゥム水溶液 （pH 7.0) の 30分間の直 線濃度勾配、 流速： 10 mL/分] で精製後、 13を得た。 13を 30%ァセトニトリル— 水 0.1 mLに溶かし、 7，8または 9を 10 11101、 および 1M 炭酸水素ナトリウム水溶液
(pH 8.3)を 10 zL加え室温で 2時間放置した。 反応液を同上の条件の HPLCで精製 後、 産物を含む画分を濃縮した。 残查を 60%トリフルォロ酢酸一水 1 mLにて室温 で 30分処理後、 濃縮乾固した。 残査を濃アンモニア水 1 mLにて室温で 15分処理後、 濃縮乾固した。 残査を同上の条件の HPLCで精製後、 産物を含む画分を濃縮し、 PE Gスぺーサ一分子 （14) を得た。 なお、 図 1 3中、 RhodGは図 1 0中 7の、 Cy5は図 10中 8の、 Cy3は図 1 0中 9の、 蛍光色素残基部をそれぞれ示す。 得られた PEGス ぺーサ一分子 （14) の構造および収率を以下に示す。
p(dCp)2T(Bio)pT(RhodG)pPEG(2000)p(dCp)2Puro 収率 11%
p(dCp)2T(Bio)pT(Cy5)pPEG(2000)p(dCp)2Puro 収率 8%
p(dCp)2T(Bio)pT(RhodG)pPEG(4000)p(dCp)2Puro 収率 12%
p(dCp)2T(Bio)pT(Cy5)pPEG(4000)p(dCp)2Puro 収率 10%
p(dCp)2T(Cy3)pPEG(4000)p(dCp)2Puro 収率 9% 製造例 3 Boc保護 PEGスぺーサ一分子 （15) の合成
図 14に示したように、 12 (400 ig, ピューロマイシン lO^mol含有） より、 P EGスぺーサ一部 （11) と同じ方法を用いて Boc保護 PEGスぺーサ一部 （15) を合成 した。 得られた Boc保護 PEGスぺーサ一分子 （15) の構造と収率を以下に示す。 p(dCp) 2T(Fl )pPEG(4000 )p(dCp) 2Puro(Boc ) 収率 41% 製造例 4 ピューロマイシン非含有 PEGスぺーサ一分子 （16) の合成
Jaschkeらが報告した方法 （Jaschke, A. et al. (1993) Tetrahedron Lett. 34: 301-304) に従い合成した。 得られたピューロマイシン非含有 PEGスぺーサ一分子 （16) の 構造と収率を以下に示す。
p(dCp) 2T(Fl )pTpPEG(4000) 収率 55% 製造例 5 修飾剤 1〜 7の合成
修飾剤 1〜 7は、 図 1 5および図 1 6に示した試薬を用い、 図 1 7および 1 8 にその概略を示す方法を用いて合成した。 図 1 5中、 アミダイ ト試薬 （15〜19) はグレンリサーチ社 (ァメリ力合衆国、 バージニア州） より、 スクシンイミ ド試 薬 （20〜22) はピアス社 （アメリカ合衆国、 イリノイ州） より購入した。
10または 12 (400 mg, ピューロマイシン 10〃mol含有） に対し、 PEGスぺ一サ —分子 （11 ) の合成に関して示した A〜Dの処理を所定数のアミダイ ト試薬が導 入されるまで繰り返し行なった。 その後、 50 mM炭酸ナトリウム-水を 2 mLまたは 濃アンモニア水 1 .5 mLおよびエタノールを 0.5 mL加え、 室温で 14時間震盪した。 ろ過により固相担体 （C P G ) を取り除き、 ろ液を減圧濃縮した。 残査を HPLC
[カラム ： YMC社 （京都府） 製 YMC pack ODS-A SH-343-5, 溶離液： 10- 60%ァセ トニトリル— 0. 1 M 酢酸トリェチルアンモニゥム水溶液 （pH 7.0) の 30分間の直 線濃度勾配、 流速： 10 mL/分] で精製後、 凍結乾燥した。 その後、 修飾剤によつ ては、 残査を 30%ァセトニトリル一水 1 mLに溶解させ、 1 M炭酸水素ナトリウム- 水 （pH 8.3) を 0. 1 mL、 およびスクシンイミ ド試薬 （7，8または 20 ) 0. 1 腿 olを N， Ν' -ジメチルホルムアミ ド 0.5 mLに溶解させた液を加え、 室温で 2時間放置した。 その後、 減圧濃縮し、 残査を HPLC [カラム ： YMC社 （京都府） 製 YMC pack 0DS-A
SH-343-5, 溶離液： 10- 60%ァセトニトリル— 0. 1 M酢酸トリエチルアンモニゥ ム水溶液 （pH 7.0) の 30分間の直線濃度勾配、 流速： 10 mL/分] で精製後、 凍結 乾燥した。 その後、 修飾剤によっては、 残查を 80%酢酸一水 2 mLに溶解させ、 室 温で 4時間放置後、 減圧濃縮した。 残査を 30%ァセトニトリル一水 1 mLに溶解させ、 1 M炭酸水素ナトリウム—水 （pH 8.3) を 0.1 mL、 およびスクシンィミ ド試薬 （2 1または 22 )0. 1 ipiolを Ν, Ν' -ジメチルホルムアミ ド 0.5 mLに溶解させた液を加え、 室温で 2時間放置した。 その後、 Poly- Pakl l (グレンリサーチ社) で脱塩し減圧 濃縮した。 その後、 上記の残査に 60%トリフルォロ酢酸—水 2 mLを加え、 室温で 3 0分間放置後、 減圧濃縮した。 残查を HPLC [カラム ： YMC社 （京都府） 製 YMC pack ODS-A SH-343-5, 溶離液： 10- 60%ァセトニトリル一 0. 1 M酢酸トリェチルアンモ ニゥム水溶液 （pH 7.0) の 30分間の直線濃度勾配、 流速： 10 mL/分] で精製後、 凍結乾燥した。 得られた修飾剤 1 〜 7の物性デ一夕を以下に示す。
修飾剤 1 ：収率 44%、 UV (50% MeOH-H20) え max 558 nm; MS m/z 2037 (M - H)一 修飾剤 2 ：収率 32%、 UV (H20) え腹 558 nm; MS m/z 2035 (M-H)一
修飾剤 3 ：収率 8¾ヽ UV (H20) Aniax 506 nm; MS m/z 2093 (M- H)—
修飾剤 4 ：収率 8%、 UV (H20) max 506 nm; MS m/z 1979 (M - H)—
修飾剤 5 ：収率 13%、 UV (H2O ) え腿 649 nm; MS m/z 2375 (M- H)一
修飾剤 6 ：収率 131 UV (H2O ) Amax 649 nm; MS m/z 2261 (M - H)一
修飾剤 7 ：収率 22%、 UV (H2O) Amax 646 nm; MS m/z 1977 (M-H)" 産業上の利用の可能性
本発明の一態様によれば、 翻訳系における翻訳テンプレートの安定性が向上し、 輝訳の絶対量が増加する。
また、 本発明の別の態様によれば、 翻訳系を用いる対応付け分子の製造におい て、 翻訳により生じる総蛋白質に対する目的の対応付け分子の割合が向上し、 効 率的に対応付け分子を得ることができる。

Claims

請求の範囲
1 . 蛋白質に翻訳される情報を持つ 0RF領域およびその 3'末端領域を有し、 3 ，末端領域は、 ァクセプ夕ー領域と、 ァクセプター領域の 5'上流に、 配列 S匪 Sを 含む翻訳増強配列とを含むことを特徴とするコード分子。
2 . ァクセプター領域が、 長さ 2〜 1 0塩基のポリ A配列を含むことを特徴 とする請求項 1記載のコード分子。
3 . X配列が SNNS配列であることを特徴とする請求項 1または 2記載のコ一 h分十。
4 . X配列が Xhol配列であることを特徴とする請求項 1または 2記載のコ一 ド分子。
5 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載されたコード分子のライブラリー。
6 . 蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結す るためのドナー領域を持つ PEGスぺ一サ一部を含み、 コード部が請求項 1〜4の いずれか 1項に記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。
7 . スぺーサ一部が、 コード部と連結するためのドナ一領域、 およびポリエ チレングリコールを主成分とした PEG領域、 および 3'末端に CCA領域を持つことを 特徴とする PEGスぺーサ一分子に由来する請求項 6記載の翻訳テンプレート。
8 . ポリエチレングリコールの分子量が 400以上であることを特徴とする請 求項 7記載の翻訳テンプレート。
9 . CCA領域が、 該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、 ぺプチ ド転移反応によって結合する機能を有しないことを特徴とする請求項 7記載の翻 訳テンプレート。
1 0 . CCA領域にピューロマイシンを有することを特徴とする請求項 9記載 の翻訳テンプレート。
1 1 . ドナー領域に機能付与ュニッ ト F1および/または CCA領域に機能付与 ュニット F2を含むことを特徴とする請求項 7〜 1 0のいずれか 1項に記載の翻訳 テンプレート。
1 2 . 機能付与ュニヅト F1および/または F2が、 該翻訳テンプレートを固定 化および/または蛍光ラベル化するものであることを特徴とする請求項 1 1に記 載の翻訳テンプレート。
1 3 . 機能付与ュニット F1および/または F2がピオチンであることを特徴と する請求項 1 2記載の翻訳テンプレート。
1 4 . 機能付与ユニット F1および/または F2が、 フルォレセイン、 Cy5、 ま たはローダミングリニンであることを特徴とする請求項 1 2記載の翻訳テンプレ —ト。
1 5 . 請求項 6〜 1 4のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートのライ ブラリー。
1 6 . 請求項 6〜1 4のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートがリボ ゾーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
1 7 . 請求項 1 5に記載された翻訳テンプレートのライブラリ一がリポソ一 ム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリ一。
1 8 . 請求項 6〜 1 4のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートが、 修 飾部と、 ピューロマイシンを含むペプチドァクセプ夕一部と、 それらを連結する ヌクレオチドのリンカーとを含む、 蛋白質の C末端を標識する修飾剤の存在下で、 リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
1 9 . 修飾部において、 少なくとも 1つの機能付与ユニット F3を含むことを 特徴とする請求項 1 8に記載の蛋白質。
2 0 . 機能付与ュニット F3が、 .該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質 を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする請求項 1 9記載の蛋白質。
2 1 . 機能付与ュニット F3がピオチンであることを特徴とする請求項 2 0記 載の蛋白質。
2 2 · 機能付与ユニット F3が、 フルォレセィン, Cy5, またはローダミング リーンであることを特徴とする請求項 2 0記載の蛋白質。
2 3 . 請求項 1 5に記載された翻訳テンプレートのライブラリーが、 修飾部 と、 ピューロマイシンを含むペプチドァクセプ夕一部と、 それらを連結するヌク レオチドのリンカ一とを含む、 蛋白質の C末端を標識する修飾剤の存在下で、 リ ポソ一ム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブ ラリー。
2 4 . 修飾部において、 少なくとも 1つの機能付与ユニット F3を含むことを 特徴とする請求項 2 3に記載の蛋白質のライブラリー。
2 5 . 機能付与ユニット F3が、 該翻訳テンプレートにより翻訳された蛋白質 を固定化または蛍光ラベル化することを特徴とする請求項 2 4記載の蛋白質のラ ィブラリー。
2 6 . 機能付与ュニット F3がピオチンであることを特徴とする請求項 2 5記 載の蛋白質のライブラリ一。
2 7 . 機能付与ユニット F3が、 フルォレセイン， Cy5, またはローダミング リーンであることを特徴とする請求項 2 5記載の蛋白質のライブラリー。
2 8 . 蛋白質に翻訳される情報を持つ 0RF領域およびその 3'末端領域を有し、 3'末端領域は、 長さ 2〜1 0塩基のポリ A配列を含むァクセプ夕一領域を含むこ とを特徴とするコード分子。
2 9 . 請求項 2 8に記載されたコード分子のライブラリ一。
3 0 . 蛋白質に翻訳される情報を持つコード部と少なくともコード部と連結 するためのドナ一領域を持つ PEGスぺーサ一部を含み、 コード部が請求項 2 8に 記載されたコード分子に由来する翻訳テンプレート。
3 1 . スぺーサ一部が、 コード部と連結するためのドナー領域、 およびポリ エチレングリコールを主成分とした PEG領域、 および 3，末端に CCA領域を持つこと を特徴とする PEGスぺ一サ一分子に由来する請求項 3 0記載の翻訳テンプレート。
3 2 . CCA領域が、 該翻訳テンプレートによって翻訳された蛋白質と、 ぺプ チド転移反応によって結合する機能を有することを特徴とする請求項 3 1記載の 翻訳テンプレート。
3 3 . CCA領域にピューロマイシンを有することを特徴とする請求項 3 2記 載の翻訳テンプレート。
3 4 . 請求項 3 0〜3 3のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートのラ ィブラリ一。
3 5 . 請求項 3 0〜3 3のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレートが、 リボソーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質。
3 6 . 請求項 3 4に記載された翻訳テンプレートのライブラリーが、 リボソ ーム上で翻訳されることにより合成されることを特徴とする蛋白質のライブラリ
3 7 . コード部を持たないことを特徴とする請求項 3 5記載の蛋白質。
3 8 . 蛋白質がコード部を持たないことを特徴とする請求項 3 6記載の蛋白 質のライブラリー。
3 9 . 請求項 3 7に記載された蛋白質または請求項 3 8記載のライブラリー におけるコード部を、 RNaseによって切断することを特徴とする蛋白質またはそ のライブ.ラリーの製造法。
4 0 . 請求項 1 6、 1 8〜2 3、 3 5および 3 7のいずれか 1項に記載の蛋 白質、 または、 請求項 1 7、 2 3〜2 7、 3 6および 3 8のいずれか 1項に記載 の蛋白質のライブラリーと物質を相互作用させて相互作用を解析することを含む、 蛋白質と物質の相互作用解析方法。
4 1 . 相互作用の解析が、 蛍光相関分光法、 蛍光イメージングアナライズ法、 蛍光共鳴エネルギー移動法、 エバネッセント場分子イメージング法、 蛍光偏光解 消法、 表面プラズモン共鳴法、 または、 固相酵素免疫検定法により行われる、 請 求項 4 0記載の蛋白質と物質の相互作用解析方法。
4 2 . 請求項 3 5に記載の蛋白質、 または、 請求項 3 6記載の蛋白質のライ ブラリーにおいて、 該蛋白質の C末端に結合したコード部の塩基配列の増幅によ り蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
4 3 . 無細胞共翻訳法または無細胞共翻訳スクリーニング法を用いることを 特徴とする請求項 4 2記載の蛋白質と物質の相互作用を検出する方法。
4 4 . 相互作用の解析において、 翻訳テンプレートとそのライブラリ一を蛍 光ラベル化および/または固定化することを特徴とする、 請求項 4 1記載の蛋白 質と物質の相互作用解析方法。
4 5 . 相互作用の解析において、 蛋白質とそのライブラリ一を蛍光ラベル化 および/または固定化することを特徴とする、 請求項 4 0記載の蛋白質と物質の 相互作用解析方法。
4 6 . 相互作用の解析において、 in vitroで蛋白質と物質の相互作用を解析 する請求項 4 0載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。
4 7 . 相互作用の解析において、 in vitroで共翻訳法を利用することを特徴 とする請求項 4 6記載の蛋白質と物質の相互作用を解析する方法。
4 8 . 請求項 1〜 4および 2 8のいずれか 1項に記載されたコード分子もし くは請求項 6〜 1 4および 3 0〜3 3のいずれか 1項に記載された翻訳テンプレ —トまたはそのライブラリーをリボソーム上で翻訳することを含む蛋白質または そのライブラリーの製造方法。
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