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WO2003106665A1 - Procede de culture in vitro du virus vhc - Google Patents

Procede de culture in vitro du virus vhc Download PDF

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Publication number
WO2003106665A1
WO2003106665A1 PCT/FR2003/001820 FR0301820W WO03106665A1 WO 2003106665 A1 WO2003106665 A1 WO 2003106665A1 FR 0301820 W FR0301820 W FR 0301820W WO 03106665 A1 WO03106665 A1 WO 03106665A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
lipoproteins
medium
synthesis
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2003/001820
Other languages
English (en)
Inventor
Patrice Andre
Florence Komurian-Pradel
Vincent Lotteau
Glaucia Paranhos-Baccala
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Biomerieux SA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Biomerieux SA
Priority to AU2003260593A priority Critical patent/AU2003260593A1/en
Priority to EP03760045A priority patent/EP1513930A1/fr
Priority to JP2004513478A priority patent/JP2006500918A/ja
Priority to US10/515,381 priority patent/US20050221464A1/en
Publication of WO2003106665A1 publication Critical patent/WO2003106665A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24251—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a new method of in vitro culture of the hepatitis C virus.
  • Hepatitis C is the main cause of transfusion-acquired hepatitis. Hepatitis C can also be transmitted by other percutaneous routes, for example by injecting drugs intravenously. The risk of contamination of health professionals is also not negligible.
  • Hepatitis C is distinguished from other forms of liver disease associated with viruses, such as hepatitis A, B or D.
  • Hepatitis C virus (HCV) infections are often chronic, resulting in diseases of the liver.
  • liver such as hepatitis, cirrhosis and carcinoma in a large number of cases.
  • HCV hepatotropic virus isolated using molecular biology techniques. The viral genome sequences were cloned without the viral particles being viewed.
  • virus in the present application any particle containing RNA of the HCV virus.
  • the two terms will also be used interchangeably.
  • HCV is a positive single-stranded RNA virus, approximately 9.5 kb, which replicates with a copy of complementary RNA and the translation product of which is a single polyprotein of approximately 3,000 amino acids.
  • the 5 'end of the HCV genome corresponds to an untranslated region adjacent to the genes which code for structural proteins, the core protein of the nucleocapsid and the two envelope glycoproteins, E1 and E2.
  • the 5 'untranslated region and the core gene are relatively well conserved in the various genotypes, but the E2 envelope proteins are encoded by a hypervariable region different from one isolate to another isolate.
  • the 3 'end of the HCV genome contains genes that code for non-structural proteins (NS) and for a well-conserved 3' non-coding region.
  • NS non-structural proteins
  • HCV Because of its genomic organization and its supposed mode of replication, HCV has been classified into a new genus in the family of Flaviviridae, hepaci viruses.
  • HCV virus refers to any viral species, including strains pathogenic to humans, attenuated strains and defective strains derived from said strains. Indeed, it is known that RNA viruses have a high rate of spontaneous mutations. There may therefore be multiple strains which may be more or less virulent. It is within the ability of those skilled in the art to identify such strains, for example by homology of nucleic and / or peptide sequences with respect to a reference strain and / or by identifying a strain or an isolate with respect to to morphological and / or immunological criteria.
  • diagnostic immunoassays have been performed to detect antibodies to HCV proteins in patient sera.
  • Synthesis of cDNA by reverse transcription of viral RNA and amplification by PCR. have also been used to detect the HCV genome, as an indirect measure of a potentially infectious virus in the sera of chronically infected humans or those of experimentally infected chimpanzees.
  • hybridization techniques with a DNA probe have also been developed.
  • Patent application WO01 / 09289 describes a method of in vitro culture of viruses, such as HCV, from at least a fraction of LVPs obtained from serum or plasma from an infected patient, using cells which have an endocytosis pathway relayed by at least one lipoprotein receptor and modulated by an activating agent. This process is especially concerned with promoting the entry of fractions into cultured cells.
  • replication of the virus remains limited and must therefore be optimized.
  • Patent application WO02 / 10353 describes complexes consisting of LVPs associated with human immunoglobulins, of density less than or equal to 1.063 g / ml, and containing mainly the RNA of the HCV virus, contrary to known data (Hijikata et al., 1993, J. Viral., 1953-1958). Indeed, Hijikata et al. showed that a high infectivity in the chimpanzee was found in the presence of particles of density less than 1.06 g / ml so that there could not be human immunoglobulins, very dense, in this type of particles low density. These complexes constitute a particular form of the HCV virus which is very infectious.
  • This patent application also describes a method of in vitro culture of the HCV virus from the LVP / immunoglobulin complexes, using cells comprising on their surface at least one type of receptor for the Fc fragment of immunoglobulins or one type of receptor having the capacity to bind immunoglobulins.
  • this process promotes the entry of the complexes into the culture cells but it does not allow an abundant multiplication of the virus.
  • the present inventors have now found a new method for in vitro culture of the HCV virus which makes it possible to solve the above drawback, namely that it uses cells capable of both bringing in the particles containing the HCV RNA and improve ensure replication and production.
  • - are globally spherical unit particles; they are therefore not agglomerates of virions linked to normal lipoproteins, as had been suggested in the prior art, - contain apolipoproteins B and E and triglycerides: they therefore have a lipoprotein structure, and in particular of the VLDL or chylomicron type, and
  • RNA of the virus contain the capsid and the RNA of the virus: they therefore differ from normal lipoproteins found in humans and constitute an unconventional form of the virus.
  • LVPs are hybrid particles, i.e. lipoproteins containing viral components, replication can be unexpectedly improved by using cells capable of synthesizing lipoproteins.
  • the subject of the present invention is a method of in vitro culture of the HCV virus comprising the steps consisting in bringing into contact particles containing the hepatitis C virus RNA with cells having the capacity to synthesize and secrete lipoproteins. , in an appropriate culture medium promoting the synthesis and secretion of lipoproteins, and in harvesting the virus thus obtained.
  • particles containing the HCV RNA is meant viral particles, such as in particular in the form of an LVP / immunoglobulin complex or present in the serum or the plasma of patients detected positive for HCV and containing such particles, and any inoculum containing viral RNA, regardless of the mode of preparation of viral RNA in said inoculum.
  • Apolipoprotein B is a human protein associated with the membrane of the endoplasmic reticulum and which initiates the assembly of VLDLs, the introduction of triglyceride in the presence of the microsomal triglyceride transfer protein, as well as the assembly of VLDL in the lumen of the endoplasmic reticulum.
  • This apolipoprotein is delivered in two forms, apo B 100 and apo B 48, and is synthesized in the liver and the intestine.
  • Apolipoprotein E can be synthesized by numerous cells and in particular by hepatocytes. Furthermore, it can be acquired by VLDLs in the blood stream.
  • the cells used in the method of the invention are all cells having the capacity to synthesize and secrete lipoproteins.
  • These cells can be either primary cells or cell lines.
  • cell line refers to established lines, immortalized spontaneously or by manipulation. In practice, to carry out a viral culture of interest, it is necessary to have permissive cells easily maintained in culture.
  • the cell line is therefore preferably an established cell line or which results from immortalization by different methods.
  • a cell line for example an immortalized B cell line, for example with the Epstein-Barr virus
  • cells having the capacity to synthesize and secrete lipoproteins used in the process of the invention is understood to mean cells having spontaneously this capacity and cells having acquired this capacity after induction in a culture medium promoting the differentiation or redifferentiation of cells or after transfection of genes for the synthesis of apolipoprotein apo B and of the microsomal protein for the transfer of triglycerides MTP.
  • Examples of cells having the ability to synthesize and secrete lipoproteins suitable for the purposes of the invention include enterocyte-type intestinal epithelium cells, brain cells and liver cells. According to one embodiment, the cells used are cells which have acquired the capacity to synthesize and secrete lipoproteins after induction in a medium promoting the differentiation or redifferentiation of cells.
  • liver cells have lost their ability to produce lipoproteins or other cells, such as the cells of the intestinal epithelium, have an ability that can be improved.
  • the cells suitable for the purposes of the invention are the cells of the intestinal epithelium, and in particular the cells
  • Caco-2 (Van Greevenbroeck, M.M.J., et al., 2000, Atherosclerosis, 25-31).
  • the cells of the intestinal epithelium can be previously cultured for 3 weeks with DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum, in boxes covered with collagen or under semi-permeable membranes.
  • liver cells examples include hepatocytes (Moshage, H., et al., 1992, Journal of Hepatology, 15, 404-413) and hepatocarcinomas such as Hep G2 cells (Gherardi, E ., et al., 1992, Journal of Cell Science, 103, 531-539).
  • the cells used in the method of the invention are hepatocarcinoma cells.
  • these cells are Hep G2 cells.
  • lipids such as fatty acids, preferably C 18 or C 20 , for example oleate (Luchoomun, J., et al., 1999, The Journal of Biological Chemistry, Vol
  • oleate in the medium for redifferentiation of hepatocarcinomas constitutes a particular embodiment of the invention.
  • the modified DMEM medium consists, in addition to DMEM (Gibco BRL) and an agent inducing lipoprotein synthesis, 1% HEPES (Gibco), 1% glutamine (Gibco ), gentamycin
  • Another type of cell which can be used in the process of the invention consists of cells obtained after transfection of genes for the synthesis of apolipoproteins apo B and optionally apo E and of the microsomal protein for the transfer of triglycerides.
  • transfected insect cell lines as described by Gretch, D.G., et al. in The Journal of Biological
  • the particles containing the HCV RNA when they are brought into contact with cells having the capacity to synthesize and secrete lipoproteins, enter these cells either via the lipoprotein receptors of said cells, of the LDL receptor type, as in the case of LVP for example, or by internalization by transfection according to techniques known to those skilled in the art, as in the case of preparations of viral RNA for example.
  • the culture medium used in the process of the invention is such that it promotes the synthesis and the secretion of lipoproteins, preferably of VLDL or chylomicron type.
  • a suitable medium retained is a modified DMEM medium supplemented with agents promoting the metabolism of the cell in culture, as well as with at least one agent inducing the synthesis of lipoproteins.
  • dexamethasone and insulin agents promoting the metabolism of the cell.
  • a preferred modified DMEM medium is as defined above and supplemented with dexamethasone and insulin.
  • agents inducing the synthesis of lipoproteins mention may be made of different lipids such as fatty acids, preferably C 18 or C 0 , for example Poleate, phospholipids such as lysophosphatidylcholine, as well as 22 or 25 OH -cholesterol.
  • the use of the oleate as an agent inducing the synthesis of lipoproteins, optionally in combination with 22 or 25 OH-cholesterol, constitutes another particular embodiment of the invention.
  • the virus thus cultivated by the method of the invention can be harvested by various methods such as centrifugation, for example on a density gradient, and immunoprecipitation using anti-apo B and / or anti-apo E antibodies.
  • the invention also relates to a diagnostic composition
  • a diagnostic composition comprising at least the viral particles obtained according to the method of the invention or one of its components as a source of antigen.
  • the invention also relates to a method for screening and / or selecting at least one antiviral molecule, comprising the step of bringing said antiviral molecule into contact in the culture medium during the culture method of the invention.
  • the selection of the antiviral molecules is carried out by techniques well known to those skilled in the art such as the reduction in the number of intracellular viral RNA and / or of infectious viral particles secreted in the supernatant in the presence of variable concentrations of the various inhibitors.
  • inhibitors can be nucleotide or nucleoside analogs, inhibitors of viral proteases or other molecules interfering with the functions of other viral proteins.
  • the invention also opens up other therapeutic perspectives in that it makes it possible to develop a therapeutic composition capable of influencing in a qualitative and / or quantitative manner the propagation and the in vivo replication of HCV, which is characterized in that it comprises inter alia an agent capable of modulating, repressing or inhibiting the synthesis of lipoproteins, such as for example an inhibitor of the microsomal protein for the transfer of triglycerides.
  • agent capable of modulating, repressing or inhibiting the synthesis of lipoproteins means any molecule making it possible, respectively, to control, reduce or suppress the propagation and replication in vivo of HCV.
  • agents can be selected by screening from a pool of molecules having recognized pharmacological activity on lipid metabolisms.
  • FIG. 1 represents a graph showing the influence of culture conditions (modified DMEM medium plus oleate compared to the standard medium) of Hep G2 cells on the secretion of the HCV viral particles, secretion evaluated by the quantification of the viral RNA in the culture supernatant as a function of time,
  • FIG. 2 represents a graph showing the influence of the addition of oleate in the modified DMEM culture medium on the secretion of the viral particles evaluated by the quantification of HCV RNA in the culture supernatant as a function of time
  • FIG. 3 shows a graph showing the production of the HCV virus by Caco-2 cells, after differentiation for 3 weeks of culture, said production being demonstrated by the number of viral RNA in the culture supernatant as a function of time .
  • the low density fraction (LDL) freed of the purified LVPs was diluted, as well as the purified LVPs in PBS and were visualized using an electron microscope (JEOL device, Laennec Joint Imaging Center, Lyon, France) after floating drops of the sample on 200 mesh copper grids coated with a Formvar support film (Electron Microscopy Science, PA) for 3 min at room temperature, colored for 3 min by flotation on a medium of photungstic acid at 4% (mass / vol), buffered to pH 7.2 with NaOH, then dried.
  • JEOL device Laennec Joint Imaging Center, Lyon, France
  • the LDL fraction consisted of particles of homogeneous spherical structure, with an average diameter of 25 nm, in agreement with normal LDL. In contrast, the purified LVPs were unusually large spherical structures, with an average diameter of 100 nm.
  • the total cholesterol, phospholipid and triglyceride concentrations were determined using the Cholesterol RTU, Phospholipids Enzymatic PAP 150 and Triglyceride Enzymatic PAP 150 kits (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) according to the manufacturer's recommendations, and in establishing standard curves. b) Determination of the apo B concentration of the LVPs
  • the apolipoprotein apoB concentration in the purified LVPs was determined using an ELISA assay. To do this, 96-well flat bottom ELISA plates (Maxisorb; Nunc) were coated with 100 ⁇ l of human anti-apo B monoclonal antibody.
  • the LVPs which are found in the two fractions of different density, namely low and very low density, contain more triglyceride per apo B molecule than normal lipoproteins of the same fractions.
  • the LVPs contain many lipids, - the lipid concentration of the LVP is different from that of normal lipoproteins; this therefore excludes any contamination, and
  • - LVP contains apo B.
  • PLC / PFR / 5 (ATCC CRL 8024) (Alexander Cells) (Human Hepatoma) in 96-well plates (Maxisorb, Nunc?)
  • DMEM culture medium Gibco, BRL
  • 10% "of fetal calf serum Biowhittaker, Emerainville, France
  • 2mM HEPES Gibco / BRL
  • 1% non-essential amino acids Gibco / BRL
  • 50 IU of penicillin / streptamycin (Gibco / BRL) / ml at 37 ° C.
  • the apo B receptor binding sites have been blocked with monoclonal antibodies directed against the apo B receptor binding site (4G3 and 5 B 11; Ottawa Heart Institute Research Corporation, Ottawa, Ontario Canada ) and on the other hand the binding sites to the apo E receptors with monoclonal antibodies 1D7 (Ottawa Heart Institute Research Corporation).
  • the PLC cells were washed three times with PBS and incubated for 3 h with purified LVP. The cells were washed, then they were harvested in 350 ⁇ l of lysis buffer from the Rneasy kit (Qiagen) and the RNA was extracted as indicated above.
  • Blocking the recognition of LVP by blocking the recognition sites of apo B and E indicates that they contain apolipoproteins and highlights the lipoprotein structure of LVP.
  • the presence of the capsid was demonstrated by delipidating the purified LVPs as follows: the LVPs were incubated for 30 min while stirring gently, in a solution of 85%> ether-15% butanol. The presence of the capsid was visualized using an electron microscope (JEOL device, Center Commun d'Imagerie de Laennec, Lyon, France) as indicated in point 1.1 above.
  • the presence of the core protein of the HCV virus was confirmed by Western blot by contacting the delipidated LVPs as described above, with anti-HCV core protein monoclonal antibodies (19D9D6; Jolivet-Reynaud, CP, et al. , 1998, J. Med. Virol., 56, 300-309) and secondary antibodies labeled with 10 nm gold and visualization using the grids indicated above by immunodetection after negative staining by flotation on l uranyl acetate 3%.
  • Hep G2 cells were cultured either in a medium consisting of DMEM and 10% fetal calf serum (standard medium), as in patent application WO01 / 09289, or in a modified DMEM medium, c ie containing DMEM supplemented with PHEPES 1%, glutamine 1%, gentamycin 0.25 mg / ml, PUloser-G 1.5%, Forskoline 5.10 "6 M, PMA 1.6.10 "7 M, retinol acetate 5.6 IU / ml, sodium butyrate 0.5.10 " M, niacidamide 10 " M, polybrene 2.10 " 6 g / ml, sodium selenite 2.9.10 “8 M and triiodo-L-thyronine sodium l.lO " 9 M.
  • the medium was aspirated and the cells were incubated in the presence of the virus, at the rate of 500,000 HCV RNA per well, for 6 h using DMEM supplemented with 0.2% BSA.
  • the cells were then washed with PBS and cultured either in standard medium or in modified medium, as indicated above, but also supplemented with hexamethasone and insulin and a mixture of oleate and BSA 0.15 mM oleate.
  • Hep G2 cells were first cultivated for 24 h in a modified medium as described in Example 2 above, and they were added to the wells of the Falcon 24 well culture plates at a rate of 150 000 cells per well.
  • the cells were then incubated in the presence of the virus, at a rate of 400,000 HCV RNA per well, for 6 h in DMEM medium supplemented with 0.2% BSA alone or with 0.1 ⁇ M of 25 OH cholesterol. The cells were then washed as indicated in Example 2 above and cultured in a modified medium.
  • Caco-2 cells are differentiated on semi-permeable membranes (Transwell, Costar) contained in 24-well plates, for 3 weeks in standard medium (DMEM supplemented with 10% fetal calf serum).
  • the cells thus prepared were incubated with the viral particles at the rate of 200,000 HCV RNA / well for 6 h.
  • the cells were washed and cultured in DMEM medium supplemented with 10% o fetal calf serum and 0.15 mM oleate-taurocholate.
  • FIG. 3 highlights the culture of the HCV virus by cells of the intestinal epithelium in a medium which promotes the synthesis and secretion of lipoproteins.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de culture in vitro du virus VHC comprenant les étapes consistant à mettre en contact des particules contenant l'ARN du virus de l'hépatite C avec des cellules ayant la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines, dans un milieu de culture approprié favorisant la synthèse et la sécrétion des lipoprotéines, et à récolter le virus ainsi obtenu. Applications : diagnostic et thérapeutique.

Description

Procédé de culture in vitro du virus VHC
La présente invention concerne un nouveau procédé de culture in vitro du virus de l'hépatite C.
L'hépatite C est la cause principale des hépatites acquises par transfusion. L'hépatite C peut également être transmise par d'autres voies percutanées, par exemple par injection de drogues par voie intraveineuse. Le risque de contamination des professionnels de la santé n'est par ailleurs pas négligeable.
L'hépatite C se distingue des autres formes de maladies du foie associées à des virus, telles que les hépatites A, B ou D. Les infections par le virus de l'hépatite C (VHC) sont souvent chroniques avec pour résultante des maladies du foie, telles que hépatite, cirrhose et carcinome dans un grand nombre de cas.
Bien que le risque de transmission du virus par transfusion ait diminué du fait de la sélection des donneurs de sang, la fréquence des hépatites C reste élevée. Actuellement, environ 170 millions de personnes à travers le monde sont infectées de manière chronique par VHC. Les populations à risque élevé se trouvent principalement chez les transfusés et les utilisateurs de drogues intraveineuses, mais il existe des donneurs de sang asymptomatiques qui n'appartiennent pas à ces groupes à risque élevé et chez lesquels des anticorps anti-VHC circulants ont été retrouvés. Pour ces derniers, la voie de l'infection n'a encore pas été identifiée. VHC a été le premier virus hépatotrope isolé au moyen des techniques de biologie moléculaire. Les séquences du génome viral ont été clonées sans que les particules virales n'aient été visualisées.
Actuellement, les seules particules virales naturelles caractérisées dans le sang de patients infectés sont des capsides non enveloppées, même si l'on sait que d'autres formes de particules contenant de l' ARN viral existent.
Par commodité, on appellera « virus » dans la présente demande toute particule contenant de l'ARN du virus VHC. On utilisera également les deux termes indifféremment.
VHC est un virus à ARN simple brin positif, d'environ 9,5 kb, qui se réplique par une copie d'ARN complémentaire et dont le produit de la traduction est une polyprotéine unique d'environ 3 000 acides aminés. L'extrémité 5' du génome de VHC correspond à une région non traduite adjacente aux gènes qui codent pour les protéines structurales, la protéine core de la nucléocapside et les deux glycoprotéines d'enveloppe, El et E2. La région non traduite 5' et le gène core sont relativement bien conservés dans les différents génotypes, mais les protéines d'enveloppe E2 sont codées par une région hypervariable différente d'un isolât à un autre isolât. L'extrémité 3' du génome de VHC contient les gènes qui codent pour les protéines non structurales (NS) et pour une région 3' non codante bien conservée.
Du fait de son organisation génomique et de son mode présumé de réplication, VHC a été classifié dans un nouveau genre de la famille des Flaviviridae, les hépaci virus.
Le terme virus VHC fait référence à toute espèce virale, parmi lesquelles les souches pathogènes pour l'homme, les souches atténuées et les souches défectives dérivées desdites souches. En effet, il est connu que les virus à ARN présentent un taux de mutations spontanées élevé. Il peut donc exister des souches multiples qui peuvent être plus ou moins virulentes. Il est à la portée de l'homme de l'art d'identifier de telles souches, par exemple par homologie de séquences nucléiques et/ou peptidiques par rapport à une souche de référence et/ou en identifiant une souche ou un isolât par rapport à des critères morphologiques et/ou immunologiques.
De nombreuses techniques ont été développées pour diagnostiquer une infection par VHC. Par exemple, des essais immunologiques de diagnostic ont été réalisés pour détecter des anticorps dirigés contre des protéines de VHC dans les sérums de patients. La synthèse d'ADNc par transcription inverse de l'ARN viral et l'amplification par PCR. ont également été utilisées pour détecter le génome de VHC, comme la mesure indirecte d'un virus potentiellement infectieux dans les sérums d'humains infectés de manière chronique ou ceux de chimpanzés infectés expérimentalement. Par ailleurs, sur la base du clonage de gènes, des techniques d'hybridation avec une sonde ADN ont également été développées.
Cependant, il est reconnu que les techniques de diagnostic existantes manquent de sensibilité et/ou de spécificité et/ou souffrent de difficultés de mise en oeuvre. A titre d'exemple, avec la méthode d'hybridation de sondes il est impossible de faire la distinction entre un virus à faible pouvoir infectieux et un virus à pouvoir infectieux élevé. Il est donc nécessaire, mais difficile à mettre en oeuvre, d'inoculer le virus devant être testé à un chimpanzé et de tester l'infection résultante sur l'animal.
Il est donc de toute première importance, d'un point de vue de santé publique, de pouvoir développer des méthodes spécifiques, sensibles et pratiques pour identifier et cribler les porteurs de VHC. Une des solutions pourrait être de réaliser un système efficace de culture in vitro de VHC qui permettrait d'obtenir une propagation du virus, en particulier pour étudier ses mécanismes de réplication, pour tester des anticorps neutralisants ou des antiviraux, de même que pour développer des matériaux biologiques, des essais de diagnostic et des préparations vaccinales. En effet, bien que la séquence complète de VHC soit disponible depuis 1989 (Q. L Choo et al., Science 244, 359 (1989)), la compréhension du cycle de vie et du mode de réplication de VHC a été entravée par manque d'un système de culture in vitro approprié. Ito et al. (J. Gen. Virol. 77 : 1043-1054 (1996)) ont bien confirmé le maintien de la réplication de VHC dans des cultures primaires d'hépatocytes humains, obtenus à partir de patients porteurs de VHC et pour lesquels la maladie était établie de manière chronique, et suggéré un passage d'infection, mais des problèmes relatifs à la propagation du virus subsistent (impossibilité de culture au long cours) et le système développé est limité par la nécessité d'approvisionnement en foie humain et la lourdeur de la technique. Par ailleurs, à ce jour, il n'y a pas de consensus général sur le tropisme de VHC et tous les récepteurs cellulaires pour le virus n'ont pas encore été identifiés.
Dans le plasma de patients infectés par VHC sont retrouvées des particules contenant de l' ARN viral très hétérogènes en densité. Cette hétérogénéité de densité des particules contenant de l'ARN viral est attribuée à leur association en proportion variable avec des lipoprotéines (Thomsen et al., 1993, Med. Microbiol. Immunol. 182 : 639). Dans la description de la présente demande de brevet, les inventeurs ont dénommé ces particules hybrides LVPs (lipo-viro-particules). La répartition de chacune de ces formes le long d'un gradient de densité varie d'un patient à l'autre. Les analyses existantes des particules de faible densité montrent des densités recouvrant celles des LDLs (Low Density Lipoproteins) et des VLDLs (Very Low Density Lipoproteins). La nature des LVPs contenant de l'ARN viral n'est à ce jour pas précisément connue. La demande de brevet WO01/09289 décrit un procédé de culture in vitro de virus, tels que le VHC, à partir d'au moins une fraction de LVPs obtenue à partir de sérum ou plasma d'un patient infecté, en utilisant des cellules qui possèdent une voie d'endocytose relayée par au moins un récepteur des lipoprotéines et modulée par un agent activateur. Ce procédé s'attache surtout à favoriser l'entrée des fractions dans les cellules en culture. Toutefois, la réplication du virus reste limitée et doit donc être optimisée.
La demande de brevet WO02/10353 décrit des complexes constitués de LVPs associées à des immunoglobulines humaines, de densité inférieure ou égale à 1,063 g/ml, et contenant majoritairement l'ARN du virus HCV, contrairement aux données connues (Hijikata et al., 1993, J. Viral., 1953-1958). En effet, Hijikata et al. ont montré qu'une forte infectivité chez le chimpanzé était retrouvée en présence de particules de densité inférieure à 1,06 g/ml de sorte qu'il ne pouvait pas y avoir d'immunoglobulines humaines, très denses, dans ce type de particules de faible densité. Ces complexes constituent une forme particulière du virus VHC qui est très infectieuse.
Cette demande de brevet décrit également un procédé de culture in vitro du virus VHC à partir des complexes LVP/immunoglobuline, en utilisant des cellules comportant à leur surface au moins un type de récepteur du fragment Fc des immunoglobulines ou un type de récepteur ayant la capacité de lier les immunoglobulines. Là-encore, ce procédé favorise l'entrée des complexes dans les cellules de culture mais il ne permet pas une multiplication abondante du virus.
Les présents inventeurs ont maintenant trouvé un nouveau procédé de culture in vitro du virus VHC permettant de résoudre l'inconvénient ci-dessus, à savoir qu'il utilise des cellules capables à la fois de faire entrer les particules contenant l'ARN du VHC et d'améliorer assurer la réplication et la production.
En effet, les présents inventeurs ont mis en évidence, de manière surprenante, que les particules d'ARN du VHC appelées LVP :
- sont des particules unitaires globalement sphériques ; ce ne sont donc pas des agglomérats de virions liés à des lipoprotéines normales, comme cela avait été suggéré dans l'art antérieur, - contiennent des apolipoprotéines B et E et des triglycérides : elles possèdent donc une structure de lipoprotéine, et en particulier de type VLDL ou chylomicron, et
- contiennent la capside et l'ARN du virus : elles se différencient donc des lipoprotéines normales que l'on trouve chez l'homme et constituent une forme non conventionnelle du virus.
Puisque les LVP sont des particules hybrides, à savoir des lipoprotéines contenant des composants viraux, la réplication peut être améliorée de façon inattendue en utilisant des cellules capables de synthétiser les lipoprotéines.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de culture in vitro du virus VHC comprenant les étapes consistant à mettre en contact des particules contenant l'ARN du virus de l'hépatite C avec des cellules ayant la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines, dans un milieu de culture approprié favorisant la synthèse et la sécrétion des lipoprotéines, et à récolter le virus ainsi obtenu.
Par particules contenant l'ARN du VHC, on entend des particules virales, telles que notamment sous forme de complexe LVP/immunoglobuline ou présentes dans le sérum ou le plasma de patients détectés positifs au VHC et contenant de telles particules, et tout inoculum contenant de l'ARN viral, quel que soit le mode de préparation de l'ARN viral dans ledit inoculum.
Les complexes LVP/immunoglobuline et leur procédé de purification à partir d'un échantillon de plasma ou de sérum d'un patient infecté par VHC, ont déjà été décrits dans la demande de brevet WO02/10353.
Toutefois, ce document ne décrit, ni ne suggère la nature particulière de ces LVP de type lipoprotéine, à savoir qu'ils possèdent des triglycérides, de Papolipoprotéine B et éventuellement des apolipoprotéines E. L'apolipoprotéine B est une protéine humaine associée à la membrane du réticulum endoplasmique et qui initie l'assemblage des VLDLs, l'introduction de triglycéride en présence de la protéine de transfert des triglycérides microsomale, ainsi que l'assemblage des VLDL dans la lumière du réticulum endoplasmique. Cette apolipoprotéine est délivrée sous deux formes, apo B 100 et apo B 48, et est synthétisée dans le foie et l'intestin. L'apolipoprotéine E peut être synthétisée par de nombreuses cellules et notamment par les hépatocytes. Par ailleurs, elle peut être acquise par les VLDLs dans le flux sanguin.
Les cellules utilisées dans le procédé de l'invention sont toutes cellules ayant la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines.
Ces cellules peuvent être soit des cellules primaires, soit des lignées cellulaires.
Le terme lignée cellulaire fait référence aux lignées établies, immortalisées spontanément ou par manipulation. En pratique, pour effectuer une culture virale d'intérêt, il est nécessaire d'avoir des cellules permissives facilement maintenues en culture. La lignée cellulaire est donc de préférence une lignée cellulaire établie ou qui résulte d'une immortalisation par différents procédés. Ceci peut être effectué (i) par l'établissement d'une lignée stable, établie, continue, par mise en co-culture de cellules permissives avec des cellules permissives de même nature tumorisées, capables de se multiplier indéfiniment et d'assurer la propagation du virus au sein de la culture, l'inoculation virale ayant lieu au sein de la culture, (ii) en utilisant des cellules primaires infectées par le virus qui sont ensuite co-cultivées avec des cellules tumorisées permissives qui assurent la propagation du virus au sein de la culture de la lignée cellulaire ainsi établie (iii) par infection virale d'une lignée cellulaire, par exemple une lignée de lymphocytes B immortalisée, par exemple par le virus d'Epstein- Barr ou encore (iv) par modification de l'activité télomérase.
On entend notamment par cellules ayant la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines utilisées dans le procédé de l'invention les cellules ayant spontanément cette capacité et les cellules ayant acquis cette capacité après induction dans un milieu de culture favorisant la différenciation ou redifférenciation des cellules ou après transfection de gènes de synthèse de l'apolipoprotéine apo B et de la protéine microsomale de transfert des triglycérides MTP.
Des exemples de cellules ayant la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines appropriées aux fins de l'invention comprennent les cellules de l'épithélium de l'intestin du type entérocyte, les cellules du cerveau etles cellules du foie. Selon un mode de réalisation, les cellules utilisées sont des cellules ayant acquis la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines après induction dans un milieu favorisant la différenciation ou redifférenciation des cellules.
En effet, certaines cellules, comme les cellules du foie, ont perdu leur capacité à produire des lipoprotéines ou bien d'autres cellules, comme les cellules de l'épithélium de l'intestin, ont une capacité qui peut être améliorée. Pour pallier cet inconvénient, il est possible d'induire une différenciation ou redifférenciation de ces cellules par mise en contact avec un milieu approprié favorisant cette différenciation ou redifférenciation.
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules appropriées aux fins de l'invention sont les cellules de l'épithélium de l'intestin, et en particulier les cellules
Caco-2 (Van Greevenbroeck, M.M.J., et al., 2000, Atherosclerosis, 25-31).
Pour favoriser leur capacité à synthétiser et sécréter des lipoprotéines, les cellules de l'épithélium de l'intestin, telles que Caco-2, peuvent être préalablement cultivées pendant 3 semaines avec un milieu DMEM complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal, dans des boîtes recouvertes de collagène ou sous des membranes semi- perméables.
A titre d'exemples de cellules du foie, on peut citer les hépatocytes (Moshage, H., et al., 1992, Journal of Hepatology, 15, 404-413) et les hépatocarcinomes tels que les cellules Hep G2 (Gherardi, E., et al., 1992, Journal of Cell Science, 103, 531-539). Selon un autre mode de réalisation particulier, les cellules utilisées dans le procédé de l'invention sont des cellules d'hépatocarcinome.
Toutefois, dans ce cas, leur capacité à synthétiser et sécréter des lipoprotéines peut être favorisée par mise en contact de ces cellules avec un milieu DMEM modifié, à savoir contenant au moins un agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines. De préférence, ces cellules sont les cellules Hep G2.
A titre d'agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines, on peut citer différents lipides tels que les acides gras, de préférence en C18 ou C20, par exemple l'oléate (Luchoomun, J., et al., 1999, The Journal of Biological Chemistry, Vol
274(28), 19565-19572), et les phospholipides tels que la lysophosphatidylcholine (Zhou, Z., 1998, Biochimica et Biophysica Acta, 1391, 13-24). L'utilisation de l'oléate dans le milieu de redifférenciation des hépatocarcinomes constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le milieu DMEM modifié est constitué, outre par du DMEM (Gibco BRL) et un agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines, d'HEPES 1% (Gibco), de glutamine 1% (Gibco), de gentamycine
0,25 mg/ml (Gibco), d'Ultroser-G 1,5% (Gibco), de Forskoline 5.10'6 M (ICN), de
PMA 1,6.10"7 M (4-α-phorboll2-myristatel3-acétate) (Sigma), d'acétate de rétinol
5,6 Ul/ml (Sigma), de butyrate de sodium 0,5.10 M (Sigma), de niacidamide 10" M
(ICN), de polybrène 2.10"6 g/ml (Sigma), de sélénite de sodium 2,9.10"8 M (ICN) et de triiodo-L-thyronine sodée 1.10"9 M (ICN).
Un autre type de cellules utilisable dans le procédé de l'invention consistent en les cellules obtenues après transfection de gènes de synthèse des apolipoprotéines apo B et éventuellement apo E et de la protéine microsomale de transfert des triglycérides. A titre d'exemple de telles cellules, on peut citer des lignées cellulaires d'insecte transfectées telles que décrites par Gretch, D.G., et al. dans The Journal of Biological
Biochemistry, 1998, Vol 271(15), 8682-8691.
Les particules contenant l'ARN du VHC, lorsqu'elles sont mises en contact avec les cellules ayant la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines, rentrent dans ces cellules soit par l'intermédiaire des récepteurs des lipoprotéines desdites cellules, du type LDL récepteur, comme dans le cas des LVP par exemple, soit par internalisation par transfection selon les techniques connues de l'homme du métier, comme dans le cas des préparations d'ARN viral par exemple.
Le milieu de culture utilisé dans le procédé de l'invention est tel qu'il favorise la synthèse et la sécrétion des lipoprotéines, de préférence de type VLDL ou chylomicron. Un milieu approprié retenu est un milieu DMEM modifié complémenté avec des agents favorisant le métabolisme de la cellule en culture, ainsi qu'avec au moins un agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines.
A titre d'agents favorisant le métabolisme de la cellule, on peut citer le dexaméthasone et l'insuline. Un milieu DMEM modifié préféré est tel que défini ci-dessus et complémenté avec du dexaméthasone et de l'insuline. A titre d'agents inducteurs de la synthèse des lipoprotéines, on peut citer différents lipides tels que les acides gras, de préférence en C18 ou C 0, par exemple Poléate, les phospholipides tels que la lysophosphatidylcholine, ainsi que le 22 ou 25 OH-cholestérol. L'utilisation de l'oléate à titre d'agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines, éventuellement en association avec du 22 ou 25 OH-cholestérol, constitue un autre mode de réalisation particulier de l'invention.
Le virus ainsi cultivé par le procédé de l'invention peut être récolté par différents procédés tels que la centrifugation, par exemple sur gradient de densité, et Pimmunoprécipitation à l'aide d'anticorps anti-apo B et/ou anti-apo E.
L'invention concerne également une composition diagnostique comprenant au moins les particules virales obtenues selon le procédé de l'invention ou un de ses composants comme source d'antigène.
L'homme du métier déterminera facilement la quantité de particules virales à utiliser en fonction de la technique diagnostique utilisée.
L'invention concerne encore un procédé pour cribler et/ou sélectionner au moins une molécule antivirale, comprenant l'étape de mise en contact de ladite molécule antivirale dans le milieu de culture pendant le procédé de culture de l'invention.
La sélection des molécules antivirales est effectuée par des techniques bien connues de l'homme du métier telles que la réduction du nombre d'ARN viral intracellulaire et/ou de particules virales infectieuses sécrétées dans le surnageant en présence de concentrations variables des différents inhibiteurs.
Ces inhibiteurs peuvent être des analogues nucléotidiques ou nucléosidiques, des inhibiteurs de protéases virales ou d'autres molécules interférant avec les fonctions des autres protéines virales.
Mais l'invention ouvre également d'autres perspectives thérapeutiques en ce qu'elle permet de développer une composition thérapeutique susceptible d'influencer de manière qualitative et/ou quantitative la propagation et la réplication in vivo du VHC, laquelle est caractérisée en ce qu'elle comprend entre autre un agent susceptible de moduler, de réprimer ou d'inhiber la synthèse des lipoprotéines, comme par exemple un inhibiteur de la protéine microsomale de transfert des triglycérides. On entend par agent susceptible de moduler, de réprimer ou d'inhiber la synthèse des lipoprotéines toute molécule permettant, respectivement, de contrôler, de diminuer ou de supprimer la propagation et la réplication in vivo du VHC.
Ces agents peuvent être sélectionnés par criblage à partir d'un pool de molécules ayant une activité pharmacologique reconnue sur les métabolismes des lipides.
On peut citer, à titre d'exemple d'agent susceptible d'inhiber la synthèse des lipoprotéines, l'inhibiteur de la protéine microsomale de transfert des triglycérides.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 à 3 annexées, sur lesquelles : - la figure 1 représente un graphe montrant l'influence des conditions de culture (milieu DMEM modifié plus oléate par rapport au milieu standard) des cellules Hep G2 sur la sécrétion des particules virales VHC, sécrétion évaluée par la quantification de l'ARN viral dans le surnageant de culture en fonction du temps,
- la figure 2 représente un graphe montrant l'influence de l'ajout d'oléate dans le milieu de culture DMEM modifié sur la sécrétion des particules virales évaluée par la quantification d'ARN de VHC dans le surnageant de culture en fonction du temps, et
- la figure 3 représente un graphe montrant la production du virus VHC par les cellules Caco-2, après différenciation pendant 3 semaines de culture, ladite production étant mise en évidence par le nombre d'ARN viral dans le surnageant de culture en fonction du temps.
Exemple 1 : Caractérisation des LVP
1.1 Mise en évidence de la forme globalement sphérique des LVP On a purifié les LVP de sérums de patients détectés positifs pour le virus de l'hépatite C, comme décrit dans la demande de brevet WO02/10353.
On a dilué la fraction de faible densité (LDL) débarrassée des LVP purifiées, ainsi que les LVP purifiées dans du PBS et on les a visualisées à l'aide d'un microscope électronique (appareil JEOL, Centre Commun d'Imagerie de Laennec, Lyon, France) après avoir fait flotter des gouttes de l'échantillon sur des grilles de cuivre de 200 mesh revêtues d'un film support Formvar (Electron Microscopy Science, PA) pendant 3 min à température ambiante, coloré pendant 3 min par flottaison sur un milieu d'acide photungstique à 4% (masse/vol), tamponné à pH 7,2 avec du NaOH, puis séché.
La fraction LDL était constituée de particules de structure sphérique homogène, d'un diamètre moyen de 25 nm, en accord avec les LDL normales. En revanche, les LVP purifiées étaient des structures sphériques inhabituellement larges, avec un diamètre moyen de 100 nm. 1.2 Dosage des constituants des LVP a) Détermination de la concentration en lipides des LVP
On a déterminé les concentrations en cholestérol total, en phospholipide et en triglycéride à l'aide des kits Cholestérol RTU, Phospholipides Enzymatique PAP 150 et Triglycéride Enzymatic PAP 150 (bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) selon les recommandations du fabricant, et en établissant des courbes standards. b) Détermination de la concentration en apo B des LVP
On a déterminé la concentration en apolipoprotéine apoB dans les LVP purifiées à l'aide d'un dosage ELISA. Pour ce faire, on a revêtu des plaques ELISA à fond plat, de 96 puits (Maxisorb ; Nunc), avec 100 μl d'anticorps monoclonal anti-apo B humaine
(5 μg/ml ; clone 1609 ; Biodesign, Saco, Maine) dans du PBS (solution saline tamponnée au phosphate). On a laissé au repos toute la nuit à 4°C, puis on a bloqué la réaction avec 2% de BSA (sérumalbumine bovine). On a tout d'abord incubé les échantillons pendant 30 min à la température ambiante dans un mélange PBS- 0,2% de BSA complémenté avec 10 μg d'IgG humaine/ml, puis on les a distribuées sur les plaques à raison de 100 μl/puits.
Après 2 h d'incubation à 37°C et lavage avec un milieu PBS-0,05% de Tween
20, on a ajouté à raison de 100 μl/puits des anticorps de chèvre anti-apo B humaine conjugués à la peroxydase (1,6 μg/ml ; Biodesign) dans un mélange PBS-0,2% de BSA, et on a laissé incubé pendant 90 min à 37°C.
On a lavé les plaques et on a ajouté le substrat o-phénylènediamine (Sigma) à raison de 150 μl/puits. On a laissé le développement de la réaction pendant 10 min et on a lu les plaques à 490 nm. c) Résultats Les résultats, en terme de rapport triglycéride/cholestérol (TG/Chol) et triglycéride/apo B (TG/apo B) sont indiqués dans le tableau ci-dessous. A titre de comparaison, ce tableau contient également ces mêmes rapports pour les lipoprotéines normales du patient, c'est-à-dire les lipoprotéines obtenues après extraction des LVP.
Tableau
Figure imgf000014_0001
: p<0,04 : p<0,01
Les LVP, que l'on retrouve dans les deux fractions de densité différente, à savoir faible et très faible densités, contiennent plus de triglycéride par molécule d'apo B que les lipoprotéines normales des mêmes fractions. Ces données confirment que :
- les LVP contiennent bien des lipides, - la concentration en lipides des LVP est différentes de celles des lipoprotéines normales ; cela exclut donc toute contamination, et
- les LVP contiennent de l'apo B.
1.3 Présence d'apoliprotéines B et E
On a mis en évidence la présence d'apo B et d'apo E en empêchant l'entrée des LVP dans des cellules PLC après blocage des sites de liaison aux récepteurs de apoB et apoE desdites cellules comme suit :
On a cultivé 5 x 105 cellules de lignées cellulaires d'hépatome humaines
PLC/PFR/5 (ATCC CRL 8024) (Alexander Cells) (Hepatoma humain) dans des plaques de 96 puits (Maxisorb, Nunc ?) pendant 24 h avec un milieu de culture DMEM (Gibco,BRL) complémenté avec 10%» de sérum de veau fœtal (Biowhittaker, Emerainville, France), 2mM d'HEPES (Gibco/BRL), 1% d'acides aminés non essentiels (Gibco/BRL) et 50 UI de pénicilline/streptamycine (Gibco/BRL)/ml à 37°C.
On a bloqué d'une part les sites de liaison au récepteur de l'apo B avec des anticorps monoclonaux dirigés contre le site de liaison au récepteur de apo B (4G3 et 5B11 ; Ottawa Heart Institute Research Corporation, Ottawa, Ontario Canada) et d'autres part les sites de liaison aux récepteurs de l'apo E avec des anticorps monoclonaux 1D7 (Ottawa Heart Institute Research Corporation). On a lavé à trois reprises les cellules de PLC avec du PBS et on les a incubées pendant 3 h avec des LVP purifiées. On a lavé les cellules, puis on les a récoltées dans 350 μl de tampon de lyse du kit Rneasy (Qiagen) et on a extrait l'ARN comme indiqué ci-dessus.
Le blocage de la reconnaissance des LVP en bloquant les sites de reconnaissance des apo B et E indique qu'elles contiennent des apolipoprotéines et met en évidence la structure lipoprotéique des LVP.
1.4 Présence de la capside constituée de la protéine core et de l'ARN du virus dans les LVP
On a mis en évidence la présence de la capside en délipidant les LVP purifiées de la façon suivante : on a incubé les LVP 30 min tout en agitant doucement, dans une solution de 85%> d'éther-15% de butanol. On a visualisé la présence de la capside à l'aide d'un microscope électronique (appareil JEOL, Centre Commun d'Imagerie de Laennec, Lyon, France) comme indiqué dans le point 1.1 ci-dessus.
On a confirmé la présence de la protéine core du virus VHC par Western blot par mise en contact des LVP délipidées comme décrit ci-dessus, avec des anticorps monoclonaux anti-protéine core de VHC (19D9D6 ; Jolivet-Reynaud, C. P., et al., 1998, J. Med. Virol., 56, 300-309) et d'anticorps secondaires marqués à l'or 10 nm et visualisation à l'aide des grilles indiquées ci-dessus par immunodétection après coloration négative par flottaison sur de l'acétate d'uranyle à 3%.
Enfin, on a mis en évidence la présence de l'ARN du virus par extraction des LVP purifiées et délipidées en utilisant un kit QIAamp (Qiagen S.A., Courtaboeuf, France). Exemple 2 : Influence des conditions de culture sur la production du virus VHC par des cellules Hep G2
On a tout d'abord cultivé des cellules Hep G2 soit dans un milieu constitué de DMEM et de 10% de sérum de veau fœtal (milieu standard), comme dans la demande de brevet WO01/09289, soit dans un milieu DMEM modifié, c'est-à-dire contenant du DMEM complémenté avec de PHEPES 1%, de la glutamine 1%, de la gentamycine 0,25 mg/ml, de PUltroser-G 1,5%, de la Forskoline 5.10"6 M, du PMA 1,6.10"7 M, de l'acétate de rétinol 5,6 Ul/ml, du butyrate de sodium 0,5.10" M, du niacidamide 10" M, du polybrène 2.10"6 g/ml, du sélénite de sodium 2,9.10"8 M et de la triiodo-L-thyronine sodée l.lO"9 M.
On a ensuite ensemencé des plaques de culture de 24 puits Falcon à raison de 150 000 cellules par puits avec du milieu standard ou du milieu DMEM modifié et on a laissé en culture pendant 24 h.
On a aspiré le milieu et on a incubé les cellules en présence du virus, à raison de 500 000 ARN VHC par puits, pendant 6h en utilisant du DMEM complémenté avec 0,2% de BSA.
On a ensuite lavé les cellules avec du PBS et on les a cultivées soit en milieu standard, soit en milieu modifié, comme indiqué ci-dessus, mais également complémenté avec de Phexaméthasone et de l'insuline et un mélange d'oléate et de BSA à raison de 0, 15 mM d'oléate.
Toutes les cultures se sont déroulées en atmosphère à 5% de CO2 et à 37°C. On a ensuite prélevé le surnageant des puits (en triplicate) et on a quantifié l'ARN VHC par RT-PCR selon le protocole décrit par Komurian-Pradel, F. dans J. Virol. Methods, 2001, 95, 111-119. Les résultats, copies d'ARN/ml de surnageant en fonction du temps, sont reportés sur la figure 1 sur laquelle les losanges représentent l'utilisation du milieu standard et les carrés l'utilisation du milieu favorisant la synthèse et la sécrétion des lipoprotéines.
Cette figure met en évidence que la réplication du virus et sa sécrétion est améliorée en utilisant des cellules ayant la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines et en les mettant dans des conditions favorables. Exemple 3 : Importance de l'ajout de lipides dans le milieu favorisant la synthèse et la sécrétion des lipoprotéines
On a tout d'abord cultivé pendant 24 h des cellules Hep G2 dans un milieu modifié tel que décrit dans l'exemple 2 ci-dessus, et on les a ajoutées dans les puits des plaques de culture de 24 puits Falcon à raison de 150 000 cellules par puits.
On a ensuite incubé les cellules en présence du virus, à raison de 400 000 ARN VHC par puits, pendant 6 h dans un milieu DMEM complémenté avec 0,2% de BSA seul ou avec 0,1 μM de 25 OH cholestérol. On a ensuite lavé les cellules comme indiqué dans l'exemple 2 ci-dessus et on les a cultivées en milieu modifié.
On a ajouté 3 jours après l'inoculation des cellules un mélange oléate-BSA avec 0,15 mM d'oléate.
On a collecté le surnageant et on a quantifié l'ARN VHC par RT-PCR. Les résultats, mettant en évidence l'importance de l'utilisation d'oléate, sont reportés sur la figure 2 sur laquelle les losanges représentent l'utilisation du milieu modifié seul et les carrés l'utilisation du milieu modifié complémenté avec de P oléate et du 25 OH cholestérol.
Exemple 4 : Culture du virus à l'aide des cellules Caco-2
Des cellules Caco-2 sont mises à différencier sur des membranes semi- perméables (Transwell, Costar) contenues dans des plaques de 24 puits, pendant 3 semaines en milieu standard (DMEM complémenté avec 10% de sérum de veau fœtal).
On a incubé les cellules ainsi préparées avec les particules virales à raison de 200 000 ARN de VHC/puits pendant 6 h.
On a lavé les cellules et on les a cultivées dans du milieu DMEM complémenté avec 10%o de sérum de veau fœtal ainsi que de l'oléate-taurocholate à 0,15 mM d'oléate.
On a prélevé le surnageant au dessus de Pinsert et on a quantifié l'ARN viral par RT-PCR. Les résultats sont reportés sur la figure 3 qui met en évidence la culture du virus VHC par des cellules de l'épithélium de l'intestin dans un milieu favorisant la synthèse et la sécrétion des lipoprotéines.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de culture in vitro du virus de l'hépatite C, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à mettre en contact des particules contenant l'ARN du virus de l'hépatite C avec des cellules ayant la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines, dans un milieu de culture approprié favorisant la synthèse et la sécrétion des lipoprotéines, et à récolter le virus ainsi obtenu.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisée en ce que les particules contenant l'ARN du virus de l'hépatite C sont les lipo-viro-particules LVP.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules ayant la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines sont choisies parmi les cellules ayant spontanément cette capacité et les cellules ayant acquis cette capacité après induction dans un milieu de culture favorisant la différenciation ou redifférenciation des cellules ou après transfection de gènes de synthèse de l'apolipoprotéine B et de la protéine microsomale de transfert des triglycérides.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les cellules utilisées sont des cellules ayant acquis la capacité de synthétiser et sécréter des lipoprotéines après induction dans un milieu favorisant la différentiation ou redifférenciation des cellules.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules de l'épithélium de l'intestin.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites cellules sont les cellules Caco-2.
7. Procédé selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que les cellules sont préalablement traitées pendant 3 semaines avec un milieu DMEM complémenté avec 10%o de sérum de veau fœtal.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules d'hépatocarcinome.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les cellules d'hépatocarcinome sont les cellules Hep G2.
10. Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce que lesdites cellules sont préalablement mises en contact avec un milieu DMEM modifié contenant un agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines est P oléate.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu favorisant la synthèse et la sécrétion des lipoprotéines est un milieu dérivé du milieu DMEM modifié, complémenté avec des agents favorisant le métabolisme de la cellule de culture, ainsi qu'avec au moins un agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit milieu comprend l'oléate comme agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit milieu contient également du 22 ou 25 OH-cholestérol comme autre agent inducteur de la synthèse des lipoprotéines.
15. Procédé pour cribler et/ou sélectionner au moins une molécule antivirale, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape de mise en contact de ladite molécule antivirale dans le milieu de culture pendant le procédé de culture selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
16. Composition thérapeutique susceptible d'influencer de manière qualitative et/ou quantitative la propagation et la réplication in vivo du VHC, caractérisée en ce qu'elle comprend entre autre un agent susceptible de moduler, de réprimer ou d'inhiber la synthèse des lipoprotéines.
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