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WO2003038097A1 - Ubiquitin-specific protease occurring in the brain and dna encoding the same - Google Patents

Ubiquitin-specific protease occurring in the brain and dna encoding the same Download PDF

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WO2003038097A1
WO2003038097A1 PCT/JP2002/011231 JP0211231W WO03038097A1 WO 2003038097 A1 WO2003038097 A1 WO 2003038097A1 JP 0211231 W JP0211231 W JP 0211231W WO 03038097 A1 WO03038097 A1 WO 03038097A1
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WO
WIPO (PCT)
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protein
dna
seq
nucleotide sequence
ubiquitin
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2002/011231
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tatsuo Suzuki
Qing Bao Tian
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Eisai Co Ltd
Original Assignee
Eisai Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eisai Co Ltd filed Critical Eisai Co Ltd
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a ubiquitin-specific protease present in the brain and DNA encoding the same.
  • An object of the present invention is to provide a protein supposed to be present in PSD and a DNA encoding the protein, which are useful for studying the molecular mechanism of the expression of neural plasticity.
  • the present inventors succeeded in obtaining a full-length cDNA and elucidating the function of an expression product for one of the mRNAs whose functions are unknown as described in Mol. Brain Res., 72: 147-157, 1999. Was completed.
  • the present invention provides the following.
  • a method for producing a ubiquitin-specific protease comprising culturing the transformant according to (8), and collecting from the culture the ubiquitin-specific protease expressed by the transformant.
  • FIG. 1 shows (a) the structure of the expression product and (b) the results of detection of ubiquitin-specific protease activity (electrophoresis photograph).
  • the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a protein specified as a ubiquitin-specific protease present in the brain, as described in Examples described later.
  • the presence of a variant having the same function is predicted for the protein, and a variant having the same function can be obtained by appropriately modifying the amino acid sequence of the protein.
  • a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having ubiquitin-specific protease activity is also included in the present invention. Included in proteins.
  • Modification of the amino acid sequence of a protein can be performed by modifying the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein by well-known means such as site-directed mutagenesis and expressing the DNA with the modified nucleotide sequence. it can.
  • the ubiquitin-specific protease activity is an activity of specifically proteolytically decomposing a ubiquitinated substrate protein, and this activity can be measured by a known method (for example, EMBO J., 16: 1519-15). 30, 1997). Therefore, it is easy for those skilled in the art to determine whether or not they have the same function.
  • the protein of the present invention preferably has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the protein of the present invention may be made into a fusion protein by fusing it with another protein such as glutathione transferase (GST) or His tag.
  • GST glutathione transferase
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the protein of the present invention.
  • Examples of the DNA of the present invention include a DNA having a base sequence of base numbers 178 to 325 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. This DNA is a DNA whose base sequence has been determined in Examples described later. Genes are expected to have alleles that encode the same product but have different nucleotide sequences or alleles that encode variants having the same function.Also, modification of the nucleotide sequence may result in the same product or the same function. Can be obtained.
  • the DNA of the present invention includes a protein having a base sequence similar to the base sequence of base numbers 178 to 325 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having a ubiquitin-specific protease activity. Code D NA is also included.
  • Examples of the DNA having a similar nucleotide sequence include DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of nucleotide numbers 178 to 3285 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: DNA having a base sequence having a homology of 85% or more with the base sequence of base numbers 178 to 3285 in the base sequence shown in 1 is exemplified.
  • Stringent conditions include high pre-digestion at 50 ° C. in 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS, followed by a 0.5 hour wash at 25 ° C. in 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS. Washing is preferably a 0.5 hour wash at 60 ° C. in 1 ⁇ SSC containing 0.1% SDS.
  • DNA having a base sequence similar to the base sequence of base numbers 178 to 3285 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is DNA having the base sequence of base numbers 178 to 3285 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or its DNA Can be obtained by mutagenizing a host that retains the DNA and selecting from the obtained mutant a DNA that hybridizes under the above-mentioned stringent conditions or a DNA that has the above-mentioned homology.
  • the DNA of the present invention can be obtained by a conventional method based on the determined nucleotide sequence. For example, it may be synthesized by a chemical synthesis method, or may be prepared by reverse transcription-PCR from mRNA prepared from cells or tissues expressing the ubiquitin-specific protease of the present invention using appropriately set primers. You may get it.
  • the vector of the present invention is a recombinant vector containing the DNA of the present invention.
  • the vector of the present invention can be obtained by inserting the DNA of the present invention into a vector by a conventional method.
  • the vector into which the DNA of the present invention is inserted is not particularly limited, and includes, for example, those usually used as cloning vectors and those usually used as mammalian cell expression vectors. When a vector is used for producing the protein of the present invention, an expression vector is particularly useful.
  • the transformant of the present invention is obtained by transforming a host with the DNA of the present invention. And it expresses the protein of the present invention.
  • the host is not particularly limited and includes animal cells, bacterial cells, yeast cells, insect cells, and the like. Transformation may be performed by a conventional method, and is preferably performed by introducing the vector of the present invention.
  • the production method of the present invention is a method for producing the protein of the present invention, that is, ubiquitin-specific protease, wherein the transformant of the present invention is cultured, and the ubiquitin-specific protease expressed by the transformant is cultured. Including collecting from objects.
  • the culturing may be performed under conditions in which the transformant expresses the protein of the present invention.
  • the collection of the protein of the present invention from the culture may be performed by various chromatography, electrophoresis, and the like, which are usually used for protein purification. It may be performed by appropriately combining methods such as gel filtration and the like.
  • the protein of the present invention is expressed as a fusion protein with GST or His tag, it can be purified using a glutathione sepharose column or a nickel sepharose column, respectively.
  • the antibody of the present invention is an antibody against the protein of the present invention, and is preferably a peptide having the amino acid sequence of amino acid numbers 102 to 106 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (hereinafter referred to as C-terminal peptide). ).
  • antibody to means an antibody that reacts immunologically.
  • the antibody of the present invention can be obtained from an animal immunized with the protein of the present invention (preferably a C-terminal peptide).
  • a polyclonal antibody it is prepared from the serum of the immunized animal.
  • antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph nodes of the immunized animal are fused with myeloma cells. Is prepared by selecting a hybridoma that produces an antibody that shows strong specificity for the C-terminal peptide.
  • the immunizing antigen a fragment of the protein of the present invention obtained by the production method of the present invention can be used. Alternatively, those synthesized based on the above amino acid sequence can be used.
  • the antigen may be used as a complex with a carrier protein.
  • Various condensing agents can be used for preparing the complex of the antigen and the carrier protein, and glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, and the like can be used.
  • Carrier protein is commonly used for bovine serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. The method of coupling is usually used at a ratio of 1 to 5 times.
  • Animals to be immunized include mice, rats, egrets, guinea pigs, hamsters, and the like, and inoculation methods include subcutaneous, intramuscular, or intraperitoneal administration. For administration, it may be administered by mixing with complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant, and the administration is usually performed once every 2 to 5 weeks.
  • Antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph node of the immunized animal are fused with myeloma cells and isolated as hybridomas.
  • Myeloma cells are derived from mice, rats, humans, etc., and are preferably derived from the same species as the antibody-producing cells, but may be of different types.
  • the operation of cell fusion can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein (Nature, 256, 495, 1975).
  • the fusion promoter include polyethylene glycol and Sendai virus. Usually, 20 to 40 ° C, preferably 30 to 40% using 20 to 50% concentration of polyethylene glycol (average molecular weight 1000 to 4000).
  • the ratio of the number of antibody-producing cells to the number of myeloma cells is usually about 1: 1 to 10: 1, and the cell fusion can be carried out by reacting for about 1 to 10 minutes.
  • Various immunochemical methods can be used to screen antibody-producing hybridomas.
  • EIA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • electrophoresis of a sample containing the protein of the present invention preferably a C-terminal peptide
  • an immnoplot method using a ditrocell mouth transfer membrane Cloning is further performed from such a file by, for example, cloning by limiting dilution.
  • hybridomas are usually performed in an animal cell culture medium containing 10-20% fetal bovine serum (eg, RPMI1640) with the addition of HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • the clones obtained in this way are transplanted into the abdominal cavity of SCID mice to which pristane has been administered in advance, and after 10 to 14 days, ascites containing a high concentration of monoclonal antibodies can be collected and used as a raw material for antibody purification. it can.
  • the clone can be cultured, and the culture can be used as a raw material for antibody purification.
  • Monoc For purification of the oral antibody, any known method for immunoglobulin purification may be used.
  • ammonium sulfate fractionation PEG fractionation, ethanol fractionation, use of an anion exchanger, and the protein of the present invention ( Preferably, it can be easily achieved by means such as affinity chromatography using a C-terminal peptide). Purification of polyclonal antibodies from serum can be similarly performed.
  • the monoclonal antibody Fc or Fab 'or Fab fraction from which the Fc region has been removed, or a polymer thereof may be used.
  • the chimeric antibody and the humanized antibody may be used.
  • the protein of the present invention in a biological sample can be qualitatively and quantitatively determined by an immunological method using the antibody of the present invention.
  • Immunological methods include, for example, immunohistochemical staining, enzyme immunoassay, agglutination, competition, and sandwich methods for biological samples that have been subjected to appropriate treatment as necessary, such as cell separation and extraction. Known methods can be applied.
  • the immunohistochemical staining method can be performed, for example, by a direct method using a labeled antibody, an indirect method using a labeled antibody to the antibody, or the like.
  • the labeling agent any known labeling substance such as a fluorescent substance, a radioactive substance, an enzyme, a metal, and a dye can be used.
  • Dem 21 double-stranded cDNA (215 bp in length) was obtained as reported in ol. Brain Res., 72: 147-157, 1999.
  • the obtained cDNA was labeled with digoxigenin (DIG) by the PCR labeling method to obtain a DIG-labeled Dem 21 cDNA probe.
  • DIG digoxigenin
  • Oligo (dT) primed cDNA library prepared from hippocampus collected 4 hours after high frequency stimulation in rats pretreated with cyclohexamide (Neuron, 14:43 3-455, 1995) was awarded by Dr. Yamagata of Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience.
  • the library was plated at a density of 5 ⁇ 10 4 plaques per 150 thigh plate, and the duplicated filters (membrane) were screened by hybridization against DIG-labeled Dem 21 cDNA probe. Hybridization was performed at 42 ° C in DIG Easyhyb buffer. The membrane was washed twice with 2 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at room temperature, and then with 1 ⁇ SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C. for 15 minutes.
  • 5 ′ RACE was performed to obtain a full-length cDNA of ⁇ 21 to obtain additional 5 ′ sequence.
  • mMA 0.5 ⁇ g
  • mMA prepared from rat brain treated with kainic acid was reversed using 5, full Race Core Set and Taq MA polymerase (both from Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • Synthesis of single-stranded cDNA by a transcription reaction, cyclization of the synthesized cDNA, and PCR using the cyclized cDNA as type II were performed twice.
  • the first 5, RACE gave a 1.0 kb fragment that overlapped the 5, part of clone 17,1.
  • the second 5 ′ RACE resulted in an 800 bp fragment overlapping the first 5 ′ RACE fragment.
  • 17 ′ 1 cDNA sequence and 5 ′ RACE By combination, a 5738 bp cDNA was obtained.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1. This 5738 bp sequence contained 3111 bp of 0RF.
  • the poly (A) + tail is the consensus AAATTAAA polyadenylation signal.
  • the 5 'portion of the 178 bases from the 5' end of the translation initiation codon is rich in GC and corresponds to the 5 'untranslated region.
  • the flanking base sequence around this putative start codon corresponds to the Kozak consensus sequence (J. Biol. Chem., 266: 19867-19870, 1991) with a G of -3 and +4.
  • the CT-rich sequence and the presence of an inframe stop codon upstream of the putative start site further support that this ATG is a true start codon.
  • the obtained cDNA of 5738 bp contains the full-length cDNA of Dem 21, and is obtained from Mol. Brain Res. 72:
  • the 215 bp fragment reported in 147-157, 1999 was found to be the 3 'end of the full length cDNA with poly (A) +.
  • Dem 21 is considered to be a novel member of the USP family enzyme, and thus Dem 21 was named synaptic USP (synUSP).
  • synUSP is the USP7 by the nomenclature proposed for human USP by the Human Genome Organization (HUGO) Nomenclature Committee (http: ⁇ ww.gene.ucl.ac.uk / nomenclature). It is most similar to HAUSP, a herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease. Between these two proteins, there was 28% identity and 40% similarity over 413 amino acid residues.
  • synUSP encodes a protein of 1036 amino acids, has a predicted molecular weight of 118.78 kDa and a pi of 5.83.
  • a leucine zipper domain was detected in the carboxyl terminal region in a database search. Because the leucine dipa domain is thought to be involved in protein-protein interactions, the lipoxyl terminus of synUSP may be involved in certain protein-protein interactions.
  • synUSP also contains two amino acids of six amino acids ((L / I) LCPHG (SEQ ID NO: 3)). It has a peat at the carboxyl terminal portion. Database searches did not provide information on the function of this sequence.
  • USP activity was basically performed using T7-driven IPTG-inducible synUSP expression plasmid according to the method of Everett et al. (EMBO J 16: 1519-1530, 1997).
  • the pT7-syn USP plasmid was created by inserting the complete coding region of synUSP into the Ncol site of the T7 expression plasmid pET3d (pBR322 Amp r replicon).
  • the T7- the SynUSP expression cassette is a plasmid comprising in p pACYC184 Cm r replicon pACT7- synUSP, was constructed by ⁇ the EcoRV fragment of pT7- synUSP the EcoRV site of pACYC184.
  • E. coli BL21 (DE3) cell line harboring pGEX-Ub52 was further transformed with either pACT7-synUSP or PACYC-UBP2, and both ampicillin and chloramphenicol were used.
  • Protein expression was induced by IPTG, the cells were incubated for an additional 3 hours, and the substrate was cleaved by USP The cells were sonicated to extract water-soluble protein extracts.
  • the GST fusion proteins and their proteolysis products were purified by glutathione-agarose beads and subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • synUSP in which Cys98 was replaced with Ala and synUSP in which the C-terminal was deleted from either the His box, LLCPH G repeat sequence or leucine zipper (Fig. 1). The same operation was performed for a).
  • C-15 Ab specifically reacted with the expressed 125 kDa synUSP, and its interaction was blocked by adding an excess of C-15 peptide.
  • synUSP The subcellular distribution of synUSP was examined using C-15 Ab.
  • the subcellular fraction was obtained as follows. Synaptic plasma membrane (SPM) and PSD fractions were obtained from the forebrain of Wistar rats (male, 6 weeks) as described in Mol. Brain Res., 78, 80-90 (2000). Was. Also, P1 (fraction containing nuclei and cell debris), P2 (crude mitochondrial fraction) and syn (synaptosome fraction) were obtained during the isolation of PSD. In addition, the soluble fraction and the dendritic lipid raft fraction were combined with Mol. Brain Res., 78, 80-90 (2000) and Mol. Brain Res., 89, 20-28, respectively. 2001).
  • a stamprot was performed on proteins prepared from the heart, brain, spleen, lung, liver, skeletal muscle, kidney, testis, thymus, stomach and small intestine in the same manner as described above. As a result, a 125 kDa band was detected in the brain and thymus, but the expression level in the thymus was lower than that in the brain. In addition, a band of the same size was detected in the testis, but its expression level was extremely low. In the brain, immunoreactive bands shorter than the full length were detected, but disappeared with the addition of the C-15 peptide, and the amount varied from experiment to experiment, so it was estimated to be a degradation product of synUSP. Also in the liver, two bands immunoreactive with low molecular weight regions were detected. These disappeared with the addition of the C-15 peptide. No immunoreactive bands were detected in other tissues. Industrial applicability
  • a ubiquitin-specific protease present in the brain and a DNA encoding the same are provided. These are useful in studies on neuroplasticity and the pathology of neurodegenerative diseases.

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Description

明細書 脳に存在するュビキチン特異的プロテアーゼ及びそれをコードする DNA 技術分野
本発明は、 脳に存在するュビキチン特異的プロテアーゼ及びそれをコードする DNAに関する。 背景技術
樹状突起に分布する mRNAからの局所的蛋白質合成は、 発現したシナプス可塑性 を維持する上で重要な役割を果たしていると考えられている。 シナプス後領域に おけるものは特に重要と考えられ、 シナプス後肥厚部（PSD)に関連する mRNAの検 索が行われている （Mol. Brain Res., 72: 147-157, 1999) 。 しかしながら、 そ の多くは機能が不明である。 発明の開示
本発明は、 神経可塑性発現の分子機構の研究などに有用な、 PSDに存在すると 思われる蛋白質及びそれをコードする DN Aを提供することを課題とする。 本発明者らは、 Mol. Brain Res., 72: 147-157, 1999に記載された機能が不明 な mRNAの一つについて、 全長 cDNAの取得及び発現産物の機能の解明に成功し、 本 発明を完成するに到った。
すなわち本発明は、 以下のものを提供する。
( 1) 下記 （a) または （b) の蛋白質。
(a) 配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。 .
(b) 配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつュビキチン特異的プロテ ァーゼ活性を有する蛋白質。
(2) 配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する （1) 記載の蛋白質。
(3) ( 1) または （2) 記載の蛋白質をコードする DNA。 ( 4 ) 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜 3285の塩基配列を有 する （3) 記載の DNA。 ：
(5) 下記 （a) または （b) の DNA。
(a) 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜- 3285の塩基配列を有 する DNA。
( b ) 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜 3285の塩基配列に相 補的な塩基配列を有する DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダィズし、 かつュビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
(6) 下記 （a) または （b) の DNA。
(a) 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜3285の塩基配列を有 する DNA。
( b ) 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜 3285の塩基配列と相 同性が 85%以上の塩基配列を有し、 かつュビキチン特異的プロテア一ゼ活性を 有する蛋白質をコードする DNA。
(7) (3) 〜 （6) のいずれかに記載の DN Aを含む組換えベクター。
(8) (3) 〜 （6) のいずれかに記載の DNAにより宿主を形質転換して得 られる形質転換体。
(9) (8) 記載の形質転換体を培養し、 該形質転換体が発現したュビキチン 特異的プロテアーゼを培養物から採取することを含む、 ュビキチン特異的プロテ ァーゼの製造法。
(10) (1) または （2) 記載の蛋白質に対する抗体。
( 1 1) 配列番号 2に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 1022〜1036 のアミノ酸配列を有するぺプチドに対する抗体。 図面の簡単な説明
図 1は、 （a) 発現産物の構造、 及び、 （b) ュビキチン特異的プロテアーゼ 活性の検出結果 （電気泳動写真） を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の蛋白質のうち、 配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する蛋白質は、 後 述の実施例に記載したように、 脳に存在するュビキチン特異的プロテアーゼとし て特定された蛋白質である。 蛋白質には、 同一の機能を有する変異体の存在が予 測され、 また、 蛋白質のアミノ酸配列を適宜改変することによって、 同一の機能 を有する変異体を得ることができる。 従って、 配列番号 2.に示すアミノ酸配列に おいて 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列 を有し、 かつュビキチン特異的プロテア一ゼ活性を有する蛋白質も本発明の蛋白 質に包含される。
蛋白質のアミノ酸配列の改変は、 部位特異的変異誘発法などの周知の手段によ り蛋白質をコードする D N Aの塩基配列を改変し、 塩基配列が改変された' D N A を発現させることによって行うことができる。 また、 ュビキチン特異的プロテア ーゼ活性とは、 ュビキチン化された基質蛋白質を特異的に蛋白質分解する活性で あり、 この活性は公知の方法により測定できる （例えば、 EMBO J.， 16 : 1519-15 30, 1997参照） 。 従って、 同一の機能を有するか否かを決定することは当業者で あれば容易である。
本発明の蛋白質は、 好ましくは、 配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する。 本発明の蛋白質は、 グル夕チオントランスフェラ一ゼ（GST)や Hisタグなどの他 の蛋白質と融合させることにより融合蛋白質とされていてもよい。
本発明の D N Aは、 本発明の蛋白質をコードする D N Aである。 本発明の D N Aとしては、 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 1 7 8〜 3 2 8 5の塩基配列 を有する D N Aが挙げられる。 この D N Aは、 後述の実施例において、 塩基配列 が決定された D N Aである。 遺伝子には、 同一の産物をコードするが塩基配列の 異なる遺伝子や同一の機能を有する変異体をコードする対立遺伝子の存在が予測 され、 また、 塩基配列の改変により、 同一の産物や同一の機能を有する変異体を コードする遺伝子を得ることができる。 従って、 本発明の D N Aには、 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 1 7 8〜3 2 8 5の塩基配列に類似する塩基配列を 有し、 かつ、 ュビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードする D NAも包含される。 類似の塩基配列を有する DNAとしては、 配列番号 1に示す 塩基配列の塩基番号 178〜3285の塩基配列に相補的な塩基配列を有する D NAとストリンジェントな条件でハイブリダィズする DNA、 または、 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜 3285の塩基配列と相同性が 85 %以上 の塩基配列を有する D N Aが挙げられる。
ストリンジェントな条件としては、 0.1% SDSを含む 2 XSSC中 5 0°Cでのハイ プリダイゼーシヨン、 次いで 0.1% SDSを含む 2 XSSC中 2 5 °Cでの 0.5時間の洗浄 が挙げられる。 洗浄は、 好ましくは、 0.1% SDSを含む 1 XSSC中 6 0°Cでの 0.5時 間の洗浄である。
相同性は、 Genetryx (ソフトウェア開発株式会社） により算出される値である。 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜 3285の塩基配列に類似する 塩基配列を有する DN Aは、 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜32 85の塩基配列を有する DNAまたはその DNAを保持する宿主を突然変異誘発 処理し、 得られた変異体から、 上述のストリンジェントな条件でハイブリダィズ する DNA、 または、 上述の相同性を有する DNAを選択することにより得るこ とができる。 上述のようにュビキチン特異的プロテアーゼ活性の測定法は公知で あり、 従って、 このような DN Aから、 ュビキチン特異的プロテアーゼ活性を有 する蛋白質をコードする DN Aを選択することは当業者にとって容易である。 本発明の D N Aは、 明らかにされた塩基配列に基づき常法により得ることがで きる。 例えば、 化学合成法により合成してもよいし、 適宜設定されたプライマー を用いて、 本発明のュビキチン特異的プロテアーゼを発現している細胞や組織か ら調製された mRNAから逆転写- PCR法により得てもよい。
本発明のベクターは、 本発明の DN Aを含む組換えベクターである。 本発明の ベクターは、 常法により本発明の DN Aをべクタ一に挿入することにより得るこ とができる。 本発明の DNAが挿入されるベクターとしては特に制限はなく、 例 えば、 クローニング用ベクタ一として通常に使用されるもの、 哺乳動物細胞発現 用べクタ一として通常に使用されるものが挙げられる。 本発明の蛋白質を生産す る目的でベクターを使用する場合には、 特に発現ベクターが有用である。
本発明の形質転換体は、 本発明の DN Aにより宿主を形質転換して得られる形 質転換体であり、 本発明の蛋白質を発現する。
宿主としては、 特に制限はなく、 動物細胞、 細菌細胞、 酵母細胞、 昆虫細胞な どが挙げられる。 形質転換は、 常法により行えばよく、 本発明のベクタ一を導入 することによって行うことが好ましい。
本発明の製造法は、 本発明の蛋白質すなわちュビキチン特異的プロテア一ゼの 製造法であり、 本発明の形質転換体を培養し、 該形質転換体が発現したュビキチ ン特異的プロテア一ゼを培養物から採取することを含む。
培養は、 形質転換体が本発明の蛋白質を発現する条件で行えばよく、 培養物か らの本発明の蛋白質の採取は、 蛋白質の精製に通常に用いられる、 種々のクロマ トグラフィー、 電気泳動、 ゲル濾過などの方法を適宜組み合わせて行えばよい。 本発明の蛋白質を、 GSTや Hisタグとの融合蛋白質として発現させる場合には、 そ れぞれグル夕チオンセファロースカラムやニッケルセファロースカラムを用いて 精製することが可能である。
本発明の抗体は、 本発明の蛋白質に対する抗体であり、 好ましくは、 配列番号 2に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 1 0 2 2〜 1 0 3 6のアミノ酸配列を有す るペプチド （以下 C末端ペプチドともいう） に対する抗体である。 本明細書にお いて 「対する抗体」 とは、 免疫学的に反応する抗体を意味する。
本発明の抗体は、 本発明の蛋白質 （好ましくは C末端ペプチド） を免疫した動 物から得ることができる。 ポリクロ一ナル抗体であれば上記免疫動物の血清より 調製され、 モノクローナル抗体であれば上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節か ら得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、 本発明蛋白質 （好ましくは C末 端ペプチド） に強い特異性を示す抗体を産生するハイプリ ドーマを選択すること により調製される。
免疫抗原としては、 本発明の製造法により得られる本発明の蛋白質のフラグメ ントを用いることができる。 あるいは、 上記アミノ酸配列に基づき合成したもの を用いることができる。 抗原はキヤリア蛋白質との複合体として用いてもよい。 抗原とキヤリア蛋白質の複合体の調製には種々の縮合剤を用いることができるが、 グルタルアルデヒド、 カルボジィミ ド、 マレイミ ド活性エステル等が使用できる。 キャリア蛋白質は牛血清アルブミン、 サイログロブリン、 へモシァニン等の常用 されているものでよく、 通常 1〜5倍量の割合でカツプリングさせる方法が用い られる。
免疫される動物としてはマウス、 ラヅト、 ゥサギ、 モルモヅト、 ハムスターな どがあげられ、 接種方法は皮下、 筋肉あるいは腹腔内の投与があげられる。 投与 に際しては完全フロイントアジュバンドゃ不完全フロイントアジュバンドと混和 して投与してもよく、 投与は通常 2〜5週毎に 1回ずつ行われる。 免疫された動 物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合さ せられハイプリ ドーマとして単離される。 骨髄腫細胞としてはマウス、 ラヅト、 ヒト等由来のものが使用され、 抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ま しいが、 異種間においても可能な場合もある。
細胞融合の操作は既知の方法、 たとえばケーラ一とミルスタインの方法 （Natu re, 256， 495， 1975) に従い実施できる。 融合促進剤としてはポリエチレングリ コールやセンダイウィルスなどが挙げられ、 通常には、 20〜50%程度の濃度のポ リエチレングリコール （平均分子量 1000〜4000) を用いて 20〜40°C、 好ましくは 30〜37°Cの温度下、 抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常 1 ： 1〜10： 1程 度、 約 1〜 10分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる。 抗体産生ハイプリ ドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用で きる。 たとえば、 本発明の蛋白質 （好ましくは C末端ペプチド） をコートしたマ ィクロプレ一卜を用レ、る EUSA (Enzyme- l inked immunosorbent assay ) 法、 f几 免疫グロブリン抗体をコートしたマイクロプレートを用いる EIA (Enzyme immuno assay) 法、 本発明の蛋白質 （好ましくは C末端ペプチド） を含むサンプルを電 気泳動後二トロセル口ース転写膜を用いるィムノプロット法などがあげられる。 このようなゥヱルから更に例えば限界希釈法によってクローニングを行いクロ ーンを得る。 ハイプリ ドーマの選別、 育種は、 通常、 HAT (ヒポキサンチン、 ァ ミノプテリン、 チミジン） を添加して、 10〜20%牛胎児血清を含む動物細胞用培 地 （例、 RPMI1640) で行われる。 このようにして得られたクローンはあらかじめ プリスタンを投与した SCIDマウスの腹腔内へ移植し、 10〜14日後にモノクローナ ル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、 抗体精製の原料とすることができる。 また、 該クローンを培養し、 その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。 モノク 口ーナル抗体の精製は免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用いればよく、 たとえば、 硫安分画法、 PEG分画法、 エタノール分画法、 陰イオン交換体の利用、 さらに本発明の蛋白質 （好ましくは C末端ペプチド） を用いるァフィ二テイク口 マトグラフィーなどの手段により容易に達成することができる。 血清からのポリ クローナル抗体の精製も同様に行うことができる。
モノクロ一ナル抗体は Fc，あるいは Fc領域を除去した Fab'あるいは Fab画分、 あ るいはその重合体を用いてもよい。 またそのキメラ抗体、 ヒト化抗体であっても よい。
本発明の抗体を用いる免疫学的方法により生体試料中の本発明の蛋白質の定性、 定量を行うことができる。 免疫学的方法としては、 生体試料を必要に応じて適切 な処理、 たとえば細胞の分離、 抽出操作などをした試料について、 免疫組織染色 法、 酵素免疫測定法、 凝集法、 競合法、 サンドイッチ法など既知の方法を適用す ることができる。 免疫組織染色法は、 例えば標識化抗体を用いる直接法、 該抗体 に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行い得る。 標識化剤 としては螢光物質、 放射性物質、 酵素、 金属、 色素など公知の標識物質がいずれ も使用できる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 ' 実施例 1 全長 Dem 21 cDNAのクロ一ニング
Dem 21二本鎖 cDNA (長さ 215 bp) を、 ol . Brain Res. , 72 : 147-157, 1999に 報告されたようにして取得した。 得られた cDNAを PCRラベル化法によりジゴキシ ゲニン（DIG)で標識し、 DIG標識 Dem 21 cDNAプロ一ブを得た。
このプローブを用いた、 非刺激ラヅト脳から調製されたライブラリーのスクリ —ニングでは、 陽性クローンは得られなかった。 そこで、 高頻度刺激から 4時間 後に採取された海馬から調製されたオリゴ（dT)プライムド cDNAライブラリーをス クリーニングした。
シクロへキサミ ドで前処置したラットでの高頻度刺激から 4時間後に採取され た海馬から調製されたオリゴ（dT)プライムド cDNAライブラリ一 （Neuron, 14: 43 3-455, 1995) は、 東京都神経科学総合研究所の山形博士より恵与された。 この ライブラリ一を、 150 腿プレート当たり 5 x 1 0 4プラークの密度でプレートし、 プレートをデュプリケートしたフィルター （メンブラン） を、 DIG標識 Dem 21 cD NAプロ一ブに対するハイプリダイゼ一シヨンによりスクリーニングした。 ハイブ リダィゼ一シヨンは、 DIG Easyhybバッファ一中で 42°Cにおいてー晚行った。 メ ンブランを、 0. 1% SDSを含む 2 X SSCで室温において 2回洗浄し、 次いで 0. 1% SDS を含む 1 X SSCで 65°Cにおいて 15分間洗浄した。 発色は、 DIG化学発色キット （曰 本ロシュ社） の指示書に従って行った。 候補プラークを選択し、 同様に再スクリ 一二ングを行った。 陽性 cDNAクローンのインサートを切り出し、 DNA配列決定に より確認した。 この結果、 共にプローブ配列を含む、 二つの部分的に重複する、 異なる長さの二つの陽性クローン （18，2および 17' 1 ) が得られた。 クローン 18' 2 は、 ポリ（A)+配列およびそのポリ (A)+の 30 bp上流に AAATTAAAポリアデ二ル化シ グナルを有する 2163 bpのインサートを含んでいた。 クローン 17' 1は、 18' 2と同 じ 3'配列を有する 4369 bpのインサートを含んでいた。
長い方のクローンは、 部分的なオープンリーディングフレーム（0RF )を含んで いたので、 ·ϋθπι21の全長 cDNAを得るため、 5' RACEを行い、 更なる 5'配列を得た。 具体的には、 カイニン酸で処置したラヅ トの脳から調製された mMA (0.5〃g) に ついて、 5， ful l Race Core Set及び Taq MAポリメラーゼ（共に宝酒造株式会社） を用いて、 逆転写反応による 1本鎖 cDNAの合成、 合成された cDNAの環化及び環化 した cDNAを錡型とする PCRを 2回行った。 1回目の 5' RACEでは、 17 の cDNA配列 に基づいて調製された、 逆転写反応用の遺伝子特異的プライマー （配列番号 4 ) ならびに PCR用のアンチセンスプライマ一及びセンスプライマ一 （配列番号 5及 び 6 ) を用いた。 2回目の 5' MCEでは、 1回目の 5' RACEで得られた塩基配列に基 づいて調製された、 逆転写反応用の遺伝子特異的プライマー （配列番号 7 ) なら びに PCR用のアンチセンスプラィマー及びセンスプライマー （配列番号 8及び 9 ) を用いた。
1回目の 5，RACEで、 クローン 17，1の 5，部分と重複する 1.0 kbフラグメントが得 られた。 さらに、 2回目の 5' RACEにより、 第 1の 5' RACEフラグメントと重複する 800 bpのフラグメントが得られた。 17' 1の cDNA配列及び 5' RACEで得られた配列を 組み合わせることにより、 5738 bpの cDNAが得られた。 塩基配列を配列番号 1に 示す。 この 5738 bp配列は、 3111 bpの 0RFを含んでいた。 上述のように、 ポリ（A) +テールの前には、 コンセンサス AAATTAAAポリアデニル化シグナルがある。 推測 翻訳開始コドンの 5'端から 178塩基の 5'部分は GCに富み、 5'非翻訳領域に一致す る。 この推測開始コドンの周囲の隣接塩基配列は、 -3および +4の Gで Kozakコンセ ンサス配列 （J. Biol . Chem. , 266 : 19867-19870, 1991 ) に一致する。 CTに富む 配列および推定開始部位の上流にィンフレームの終止コドンが存在することは、 この ATGが真の開始コドンであることをさらに裏付けている。 以上から、 得られ 'た 5738 bpの cDNAは、 Dem 21の全長 cDNAを含むものであり、 Mol . Brain Res. 72 :
147-157, 1999に報告されていた 215 bpの断片は、 ポリ（A)+を有する全長 cDNAの 3'末端であることが判明した。
完全 Dem 21 cDNAクローンの推定アミノ酸配列 （配列番号 2 ) の、 DDBJ nrデー タベースを用いたホモロジ一検索では、 同一の蛋白質または高い相同性を有する 単一の蛋白質種は見い出されなかった。 しかし、 推定蛋白質は、 ュビキチン特異 的プロテアーゼ （USP) に見られる Cysボックス、 Hisボックス、 Aspボックス及び KRFボックスなどの保存されたドメインを多数含んでいた。 この特徴によれば、 D em 21は USPフアミリー酵素の新規なメンバーであると考えられ、 従って、 Dem 21 をシナプス性 USP (synUSP) と名付けた。 既知の USPの中で、 synUSPは、 ヒュ一マ ン ゲノム オーガニゼーション (HUGO) ノーメンクレチヤ一 コミツティー（http ：〃 ww. gene . ucl . ac . uk/nomenclature)によりヒト USPについて提案している命名 法で USP7と名付けられている HAUSP (ヘルぺスウィルス関連ュビキチン特異的プ 口テア一ゼ） に最も類似している。 これらの二つの蛋白質の間では、 413ァミノ 酸残基に渡り 28%のアイデンティティ一及び 40%のシミラリティ一があつた。
synUSPは、 1036アミノ酸からなる蛋白質をコードし、 118.78 kDaの推測分子量 及び 5.83の piを有する。 USP活性部位ドメインの他に、 データベース検索で、 力 ルボキシル末端領域にロイシンジッパードメインが検出された。 ロイシンジヅパ 一ドメインは、 蛋白質一蛋白質相互作用に関与すると考えられているので、 synU SPの力ルポキシル末端は、 ある種の蛋白質一蛋白質相互作用に関与している可能 性がある。 synUSPは、 また、 6アミノ酸 ( (L/I )LCPHG (配列番号 3 )) の二つのリ ピートをカルボキシル末端部分に有する。 データベース検索では、 この配列の機 能についての情報は得られなかった。 実施例 2 発現産物の USP活性の確認
synUSPの、 モデルュビキチン化蛋白質を切断する活性を、 E . col iの共発現系 を用いて調べた。
USP活性は、 基本的に、 Everettら (EMBO J 16 : 1519-1530, 1997) の方法に 従って、 T7 -ドリブン IPTG誘導性 synUSP発現プラスミ ドを用いて行った。 pT7- syn USPプラスミ ドを、 synUSPの完全なコード領域を T7発現プラスミ ド pET3d (pBR322 Ampr レブリコン） の Ncol部位に挿入して作製した。 T7- synUSP発現カセットを p ACYC184 Cmrレプリコン中に含むプラスミ ドである pACT7- synUSPを、 pT7- synUSP の EcoRVフラグメントを PACYC184の EcoRV部位に揷入することにより構築した。 酵 母 UBP2をコードするプラスミ ド pACYC- UBP (pACYC184 Cm1"レブリコン） 及び GST- U b52融合蛋白質をコードするプラスミド pGEX-Ub52 (pBR322 Ampr レブリコン） を、 USP及び USP基質のポジティブコントロールとして用いた。 GST- Ub52基質の切断に ついては、 pGEX- Ub52を保持する E. col i BL21 (DE3 )株細胞をさらに pACT7- synUSP または PACYC-UBP2のいずれかにより形質転換し、 アンピシリン及びクロラムフエ 二コールの両方に対して耐性のコロニーを生育させた。 蛋白質発現を IPTGにより 誘導し、 細胞をさらに 3時間インキュベートし、 USPに基質を切断させた。 細胞 を超音波処理して、 水溶性蛋白質の抽出物を調製した。 GST融合蛋白質及びそれ らの蛋白質分解生成物をグル夕チオンーァガロースビーズにより精製し、 SDSポ リアクリルアミ ドゲル電気泳動に付し、 クマシ一ブリリアントブルー染色により 検出した。 また、 Cys98を Alaに置換した synUSP、 ならびに、 Hisボックス、 LLCPH Gリピート配列もしくはロイシンジッパーのいずれかから C末端側を欠失させた s ynUSP (図 1の a ) についても同様の操作を行った。
結果を図 1の bに示す。 GST- Ub52基質蛋白質の発現は IPTGにより誘導された (レーン 1 ) GST-Ub52蛋白質は、 酵母 USP2の共発現により、 30 kDaのバンドに 分解された。 分解産物のサイズは、 計算により求めたものとよく一致した。 従つ て、 上記 USP活性アツセィ系の有効性が確認された。 野性型（WT)synUSPを共発現 させると、 45 kDaの GST- Ub52蛋白質の量は減少し、 それに付随して 30 kDaの蛋白 質分解産物が顕著に増加した （レーン 3 ) 。 従って、 synUSPは USP活性を有して いることが確認された。 synUSPの活性は、 Cys98を Alaに置換すること、 または、 Hisボックス、 LLCPHGリピート配列もしくはロイシンジッパーのいずれかから C 末端側を欠失させることにより消失した （レーン 4〜7 ) 。 実施例 3 抗体の調製ならびに synUSPの細胞下分布および組織分布
synUSPの C末端の 1 5アミノ酸 （配列番号 2に示すアミノ酸配列のアミノ酸番 号 1022〜1036) からなるペプチド （C- 15ペプチド） をキーホールリンペットへモ シァニンに結合させ、 これを用いてゥサギを免疫した。 追加免疫を繰り返した後、 血清を採取し、 C- ペプチドを固定化した Affi- Gel 10を用いて抗 synUSP抗体 (C - 15 Ab)をァフィ二ティークロマトグラフィーで精製した。
精製した C-15 Abの特異性を、 J. Biol . Ghem. , 276, 21417-21424 (2001 )に記 載された方法に従って、 Cos7細胞で発現した全長 synUSPに対するゥヱスタンプ口 ットを行うことにより試験した。 この結果、 C- 15 Abは、 発現した 125 kDaの synU SPと特異的に反応し、 その相互作用は、 過剰の C- 15ペプチドを加えることにより プロックされた。
C - 15 Abを用いて、 synUSPの細胞下分布を調べた。 細胞下画分は以下のように して得た。 Mol . Brain Res. , 78， 80-90 (2000)に記載されたようにして、 ウイ スターラヅ ト （ 6週齢、 雄） の前脳からシナプス原形質膜（SPM)および PSDの画分 を得た。 また、 PSDの単離中に、 P1 (核および細胞片を含む画分）、 P2(粗ミ トコン ドリア画分）および syn (シナブトゾーム画分）を得た。 さらに、 可溶性画分および デンドリティ ヅクリピヅドラフト (dendritic l ipid raft) 画分を、 それぞれ、 Mol . Brain Res. , 78， 80-90 (2000)および Mol . Brain Res. , 89， 20-28 (2001 ) に記載されたようにして得た。
各画分を、 C-15 Abを用いるウエスタンプロットにより分析した。 この結果、 C os7細胞で発現した全長 synUSPと同じ分子量のバンドが、 全ホモジヱネート画分、 可溶性画分、 デンドリティヅクリピヅドラフト画分および PSD画分で検出された。 なお、 PSD画分では、 異なる大きさの免疫反応するバンドが検出されたが、 これ らは C-15ペプチドの添加で消失し、 また、 実験毎に量が変動したので、 synUSPの 分解物と推定された。
心臓、 脳、 脾臓、 肺、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 精巣、 胸腺、 胃および小腸から調 製された蛋白質について上記と同様にゥヱスタンプロヅトを行った。 この結果、 脳および胸腺で 125 kDaのバンドが検出されたが、 胸腺における発現レベルは、 脳におけるものより低かった。 また、 同サイズのバンドが精巣でも検出されたが、 その発現レベルは極めて低かった。 脳においては、 全長よりも短い免疫反応する バンドが検出されたが、 これらは C- 15ペプチドの添加で消失し、 また、 実験毎に 量が変動したので、 synUSPの分解物と推定された。 また、 肝臓においても、 低分 子量の領域に免疫反応する 2つのバンドが検出された。 これらは、 C- 15ペプチド の添加で消失した。 他の組織では、 免疫反応するバンドは検出されなかった。 産業上の利用の可能性
本発明により、 脳に存在するュビキチン特異的プロテアーゼ及びそれをコード する D N Aが提供される。 これらは、 神経可塑性や、 神経変性疾患の病態に関す る研究において有用である。

Claims

請求の範囲
1. 下記 （a) または （b) の蛋白質。
(a) 配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。
( b ) 配列番号 2に示すァミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠 失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつュビキチン特異的プロテ ァーゼ活性を有する蛋白質。
2. 配列番号 2に示すァミノ酸配列を有する請求項 1記載の蛋白質。
3. 請求項 1または 2記載の蛋白質をコードする DNA。
4. 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜 3285の塩基配列を有 する請求項 3記載の DNA。
5. 下記 （a) または （b) の DNA。
(a) 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜3285の塩基配列を有 する DNA。
( b ) 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜 3285の塩基配列に相 補的な塩基配列を有する DNAとストリンジヱントな条件でハイブリダィズし、 かつュビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する蛋白質をコードする DNA。
6. 下記 （a) または （b) の DNA。
(a) 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜 3285の塩基配列を有 する DNA。
( b ) 配列番号 1に示す塩基配列の塩基番号 178〜 3285の塩基配列と相 同性が 85 %以上の塩基配列を有し、 かつュビキチン特異的プロテアーゼ活性を 有する蛋白質をコードする DNA。 '
7. 請求項 3〜6のいずれか 1項に記載の DNAを含む組換えベクター。
8. 請求項 3〜 6のいずれか 1項に記載の D N Aにより宿主を形質転換して 得られる形質転換体。
9. 請求項 8記載の形質転換体を培養し、 該形質転換体が発現したュビキチ ン特異的プロテアーゼを培養物から採取することを含む、 ュビキチン特異的プロ テアーゼの製造法。
10. 請求項 1または 2記載の蛋白質に対する抗体。
1 1. 配列番号 2に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 1022〜 1036のァ ミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体。
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