WO2003035128A1

WO2003035128A1 - Substance biologique composite

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Publication number: WO2003035128A1
Application number: PCT/JP2002/010036
Authority: WO
Inventors: Shinichi Sotome; Toshimasa Uemura; Junzo Tanaka; Masanori Kikuchi; Kenichi Shinomiya; Tetsuya Tateishi
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; National Institute for Materials Science; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; National Institute for Materials Science
Priority date: 2001-10-25
Filing date: 2002-09-27
Publication date: 2003-05-01
Anticipated expiration: 2004-04-25
Also published as: US20060172918A1; JPWO2003035128A1; JP3770555B2; US7494664B2; CA2467252A1; CA2467252C

Description

明細書複合生体材料技術分野

本発明は、ハイドロキシアパタイト、コラーゲンおよびアルギン酸を含む複合生体材料およびその製造方法に関する。さらに詳しくは、生体骨類似の機械的特性を有し、生体適合性、骨誘導性に優れた新規複合生体材料とその製造方法に関する。背景技術

現在、再生医療の分野では損傷を受けた組織や器官に代わる種々の人工生体材料が開発されている。特に骨欠損部の治療には、人工骨材や人工骨充填材等のインプラントが用いられるが、こうしたィンプラントには生体骨類似の機械的特性に加えて、生体 31合性や骨誘導性一すなわち、生体適用後徐々に吸収され、骨再生サイクルに取り込まれて自身の骨に置換していく性質一が求められる。

脊椎動物の骨はハイドロキシァパタイトとコラーゲンからなる複合体で、これらは生体骨中でハイドロキシァパタイ卜がその c軸方向にコラーゲン繊維に沿って配向した特有のナノコンポジット構造を形成し、この構造が骨に特有の機械的性質を与えている。こうした生体骨類似の構造組成を有する、ハイドロキシァパタイ卜とコラーゲンからなる複合生体材料については、特開平 7- 101708号公報、特開平 11- 199209号公報等に記載されており、ある程度の骨誘導性も認められている。

一方、アルギン酸は海藻に含まれる多糖類で、従来より止血材ゃ創傷被覆材として使用されてきた。人工骨材としては、 a - TCPとアルギン酸塩を組み合わせた骨補填材開発についての報告（永田、「歯科材料」 vol. 16, No. 6, (1997) P479-491) があるが、最近では、アルギン酸が骨軟骨修復を促すとの報告 (Fragonas et. al. , Biomaterials 21 (2000) ρ795-801 等）もなされている。しかしながら、アルギン酸をハイドロキシアパタイトとコラーゲンからなる複合体に応用しようとの試みは未だなされていなかつた。とりわけ、特有のナノコンポジット構造を生かしつつ、これにアルギン酸を均一に組み込んでいくには、ある程度の困難を伴う。発明の開示

本発明は、生体骨類似の微小多孔質構造を有する八ィドロキシァパタイ卜とコラーゲンからなる複合体にアルギン酸塩を均一に配合し、生体適合性及び骨誘導性に優れた新規複合生体材料とその製造方法を提供することを課題とする。

かかる課題を解決するために本発明者らは鋭意検討した結果、微小多孔質構造を有するハイドロキシァパタイ卜とコラーゲンからなる複合体に、特定の工程でアルギン酸を加えて、硬化させることにより、アルギン酸が均一に配合された複合体を得ることに成功した。そして、この複合体は、優れた生体適合性、骨誘導性を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の（1 ) 〜（1 0 ) を提供するものである。

( 1 ) ハイドロキシアパタイト、コラ一ゲンおよびアルギン酸塩を含み、該ハイドロキシァパタイ卜の c軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した微小多孔質構造を有する複合生体材料。

( 2 ) 前記複合生体材料において、ハイドロキシァパタイトとコラーゲンの総量に対するアルギン酸塩の配合率が 1〜30 質量％であることを特徴とする、上記（1) 記載の複合生体材料。

(3) ハイドロキシァパタイトとコラーゲンの総量に対するアルギン酸塩の配合率が 5〜20質量％であることを特徴とする、請求の範囲第 2項に記載の複合生体材料。

(4) 前記複合生体材料において、ハイドロキシァパタイトとコラーゲンの配合比が 60： 40〜90： 10である、上記（1) 〜（3) のいずれか 1に記載の複合生体材料。

(5) ハイドロキシァパタイ卜とコラーゲンの配合比が 70： 30〜85： 15 である、上記（4) 記載の複合生体材料。

(6) 複合生体材料中にアルギン酸塩が均一に含まれていることを特徴とする、上記（1) 〜（5) のいずれか 1に記載の複合生体材料。

(7) 凍結乾燥後の複合生体材料における空隙率が 80%以上である、上記（6) 記載の複合生体材料。

(8) 以下の工程によって製造されることを特徴とする、上記（7) 記載の複合生体材料。

1) ハイドロキシァパタイ卜とコラーゲンからなる複合体とアルギン酸塩を混合する工程

2) 上記混合物にさらに炭酸カルシウム懸濁液を混合し、ついでダルコン酸粉末を混合して硬化させるとともに二酸化炭素を発泡させ、複合生体材料を得る工程

(9) 以下の工程を含む、複合生体材料の製造方法。

1) ハイドロキシァパタイトとコラーゲンからなる複合体とアルギン酸塩を混合する工程

2) 上記混合物にさらに炭酸カルシウム懸濁液を混合し、ン酸粉末を混合して硬化させるとともに二酸化炭素を発泡させ、複合生体材料を得る工程

( 1 0 ) ハイドロキシァパタイトとコラーゲンからなる複合体が、ハイド口キシァパタイ卜の c軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した微小多孔質構造を有する複合体である、上記（9 ) 記載の方法。以下、本発明の内容について詳述する。

1 . 複合生体材料

1 . 1 複合生体材料の構造

本発明にかかる複合生体材料は、ハイドロキシアパタイト、コラーゲンおよびアルギン酸塩を含み、ハイドロキシァパタイトはその c軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した微小多孔質構造を少なくともその一部に有する。この構造は、生体骨特有の構造であり、本発明の複合生体材料に特有の機械的特性を与えている。

なお、本発明において、「微小多孔質構造」とは、生体骨が有するような、数 /im〜数 10 程度の孔（空隙）が無数に存在する構造を意味する。

本発明の複合生体材料において、ハイドロキシァパタイ卜とコラーゲンの配合比は 60： 40〜90： 10、好ましくは 70： 30〜85： 15である。これは両者の配合比が生体骨の組成（75 : 25) に近いことが必要だからである。本発明の複合生体材料中には、アルギン酸塩が均一に含まれ、該複合生体材料のインプラント等への利用価値をより高いものとしている。

1 . 2 複合生体材料の構成成分

本発明の複合生体材料（凍結乾燥後の状態）において、アルギン酸塩はハイドロキシアパタイトとコラーゲンの総量（合計質量）に対し 1〜30質 W

量％ (以下、単に「質量％」を％と記載する。）、より好ましくは 5〜20% 配合される。アルギン酸の量が少なすぎると複合体の強度が不十分となり、一方、アルギン酸の量が多すぎると細胞の侵入が妨げられるからである。本発明の複合生体材料を、硬化 ·凍結乾燥させることなく骨充填剤として用いる場合、上記複合生体材料は適当量の水分を含有しており、その含水率は用途に応じて適宜調整される。

本発明の複合生体材料を、硬化 ·凍結乾燥させて用いる場合、凍結乾燥後の複合生体材料全体に対して、ハイドロキシァパタイトは 55〜80%、コラーゲンは 10〜35 %、アルギン酸塩が 1〜25 %配合されることが好ましい。 0 本発明の複合生体材料は、凍結乾燥前の水を含んだ状態で、 5〜70%、好ましくは 10〜50%程度の空隙率（発泡による泡の部分）を有する。凍結乾燥後の複合生体材料は、少なくとも 80%以上、好ましくは 95 %以上の空隙率を有する。前項同様、空隙率が低いと、生体適用後の細胞の侵入が不十分となり骨誘導性が悪くなるとともに、インプラント自体の強度が低下す 5 るからである。

凍結乾燥した本発明の複合生体材料には、平均直径 1 ]]！〜 500 2 Π1 程度の空隙（孔）と、無数の 1 m 以下の微小な空隙（孔）が存在し、かかる微小多孔質構造が生体適用後の細胞侵入と骨誘導性の向上に寄与している。 0 2 . 複合生体材料の製造方法

本発明にかかる複合生体材料の製造方法は、以下の 1) および 2) の工程を含む。これにより、ハイドロキシアパタイトとコラーゲンからなる複合体（以下、「HAp/Col複合体」と記載する）中にアルギン酸塩が均一に含まれた微小多孔質構造を有する镌合生体材料を得ることができる。

5 1) HAp/Col複合体にアルギン酸塩を混合する工程； 2) 上記混合物にさらに炭酸カルシウム懸濁液を混合し、ついでダルコン酸粉末を混合して硬化させるとともに二酸化炭素を発泡させ、複合生体材料を得る工程。

2 . 1 工程 1

( 1 ) HAp/Co l複合体

工程 1) において用いられる、 HAp/Col複合体は、ハイドロキシァパタイ卜の c軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した、生体骨類似の微小多孔質構造を有する複合体であることが望ましい。そのような複合体は、例えば菊池らの方法 (Biomater ial s 22, (2000) p l705-1711) にしたがって製造することができる。すなわち、水酸化カルシウム溶液とコラーゲンを含むリン酸塩水溶液を反応容器中に同時滴下し、生じた沈澱物を乾燥することにより得ることができる。ここで、用いられるコラーゲンは、特に限定されないが、分子量が大きいと立体障害のために複合体の強度が不十分となるため、モノメリックなコラーゲンを用いることが好ましい。特に、ぺプシン処理したァテロコラーゲンはモノメリックであることに加えて抗原性が低いため、本発明の複合生体材料に好適である。

前記 HAp/Col複合体は、あらかじめ少量の生理食塩水、脱イオン水、リン酸緩衝液等を加え、ホモジュナイザー等で混合しておくことが好ましい。これは HAp/Col複合体中に遊離のカルシウムイオンが存在する場合、アルギン酸と反応してゲル化を生じることがあるため、生理食塩水等でカルシゥムイオンをハイドロキシァパタイトに吸着させ、アルギン酸と反応しにくくしておくことが必要だからである。

なお、特に生理食塩水ゃリン酸緩衝液を用いるとイオンが複合体内部に入り込み、ハイドロキシァパタイト表面に吸着してその電気的な力を中和するため、混合物がよりなめらかになり好適である。また、加える生理食塩水等の量は HAp/Col複合体の構造組成によっても異なるが、 HAp/Col複合体全量に対して 2倍〜 6倍程度が好ましい。

( 2 ) アルギン酸塩

工程 1) において用いられるアルギン酸塩は、特に限定されず、ナトリゥム塩、カリウム塩等を用いることができる。また、アルギン酸塩は架橋されたアルギン酸を用いてもよい、該架橋アルギン酸の中には生体吸収性の優れたものもあり、このようなものを用いればより好適である。なお、アルギン酸塩はあらかじめ 3〜5 %程度の水溶液にして用いると操作上簡便である。

2 . 2 工程 2

工程 2)では、ダルコン酸と炭酸カルシウムの中和反応により、二酸化炭素が発泡するとともに、アルギン酸がカルシウムイオンで架橋されて硬化し、微小多孔質構造を有する複合生体材料が得られる。

( 1 ) 中和反応（発泡、架橋）

工程 2) において用いられる炭酸カルシウムは特に限定されず、懸濁液であっても粉末であってもよい。また、工程 2) で用いられるダルコン酸も特に限定されない。

炭酸カルシウムとダルコン酸の比率は、モル比で 1 : 3〜2： 3、好ましくは 1： 2程度であるとよい。本発明の複合生体材料は、炭酸カルシウムとグルコン酸の量を適宜変えることにより、発泡量を制御し、孔のサイズや空隙率を所望のものにすることができる。ただし、加える炭酸カルシウムやダルコン酸の量が少なすぎると、ゲル化が不十分となり、多すぎると発泡が過剰となり、いずれも複合生体材料の強度を低下させる。したがって、炭酸カルシウムは HAp/Col複合体全量に対して 10〜100%程度混合されることが好ましい。なお、ダルコン酸のみを多めに加えると、発泡量は変化せず、ハイドロキシアパタイトが一部溶解し、遊離したカルシウムイオンにより架橋密度が上がるため、ィンプラントの強度が高くなることが確認されている。

特に本発明の複合生体材料の強度を高めたい場合は、工程 2) で得られるゲル化混合物を、さらに塩酸カルシウム溶液等に浸漬させてアルギン酸を架橋させるとよい。ただし、アルギン酸の架橋が密になりすぎると、生体適用後の細胞侵入が悪くなるため注意が必要である。

( 2 ) 硬化 ·成形

工程 2) で得られたゲル化混合物は、数分から数 10分程度で硬化がはじまり、本発明の複合生体材料が得られる。

なお、複合生体材料は硬化前に直接骨欠損部に注入すれば、そのまま骨充填材として使用できる。

また、特定形状のインプラントを製造したい場合は、ダルコン酸混合後すみやかに所望の型に注入し成形する。さらに、硬化度を高めたい場合には凍結乾燥を行うが、該凍結乾燥の条件（たとえば温度、凍結時間、水中での凍結乾燥等）を選ぶことにより、複合生体材料の構造、すなわち比表面積、空隙率、孔（空隙）の大きさ等は、適宜調整することができる。

( 3 ) その他

本発明の複合生体材料には、必須の成分であるハイドロキシァパタイト、コラーゲンおよびアルギン酸塩に加えて、本発明の目的 ·効果を損なわない範囲で、さらに他の成分を含有させることもできる。かかる成分としては、例えば BMP2、 BMP6及び BMP7等の骨形成タンパク、 bFGF、 aFGF、 VEGF 及び TGF /3等の増殖因子等が挙げられる。 3 . 複合生体材料の利用方法 ( 1 ) 生体骨置換型骨再建材 (インプラン卜)

前述のように、本発明の該複合生体材料は、硬化前に直接骨欠損部に注入することにより、そのまま骨充填材として使用できる。また、ダルコン酸混合後すみやかに所望の型に注入し成形することにより、所望の形状のインプラントを製造することができる。

本発明により得られる複合生体材料は、水を吸うとスポンジのような弾性を有し、優れた生体親和性、骨誘導能ないしは骨伝導能を有する。すなわち、骨組織に埋入した場合は速やかに骨組織と結合し、ドナー側の硬組織と本発明により得られる複合材料との界面は完全に一体化しうる。

( 2 ) 培養基板

また、本発明の複合生体材料は細胞 ·組織培養基板としても利用できる。例えば、本発明の複合生体材料に生理活性の高いサイトカインを含有させ、これを基板として力学 ·電気などを加えた生体類似環境下で組織培養を行うことにより、骨髄、肝臓などの組織再建の効果が期待できる。この培養基板は、直接生体内に適用すれば、損傷部の効果的な組織再建を可能にする。

( 3 ) 薬剤徐放性基材

さらに、本発明の複合生体材料は他の生理活性物質、薬剤等の徐放材として用いることもできる、たとえば、骨肉腫などの切除骨の再建に、本発明により得られる複合材料に抗癌剤を含浸させたものを用いることで、癌再発の防止とともに生体硬組織の誘導を行うことができる。すなわち、本発明によって得られる複合生体材料は、骨誘導および骨伝導能を有する车体骨置換型骨再建材、アミノ酸、糖質、サイト力インを含有する組織工学に用いられる生体活性基材ゃ培養基板、および生体融和型薬剤徐放性基材として利用できる。具体的には、人工骨、人工関節、腱と骨との接合材、歯科用インプラント材、カテーテル用経皮端子、薬剤徐放性基材、骨髄誘導チャンバ一、組織再建用チャンバ一 ·基材等を挙げることができる。図面の簡単な説明

図 1は、試験例 1で作製したインプラントの走査顕微鏡写真である。図 2は、試験例 2における本発明のインプラント移植 2, 4、 8週間後の HE染色した組織像を示す写真である。

図 3は、試験例における市販の多孔質 HAp移植 2, 4、 8週間後の HE 染色した組織像を示す写真である。

図 4は、試験例における HAp/Co l複合体移植 2, 4、 8週間後の HE染色した組織像を示す写真である。

図 5は、試験例 2におけるアルギン酸ナトリウム移植 2， 4、 8週間後の HE染色した組織像を示す写真である。本明細書は、本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 1 - 3 2 8 1 6 7号の明細書に記載された内容を包含する。発明を実施するための最良の形態

以下、試験例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

〔試験例 1〕ハイドロキシァパタイ卜/コラーゲン/アルギン酸複合生体材料の製造 1. 試験方法

まず、 HAp/Col複合体粉末 500mgに生理食塩水 3ml を加え、ホモジュナィザ一で均一になるまで混合し、ついで 3%アルギン酸ナトリウム水溶液を 1.5m加え、さらに均一になるまで混合した。なお、ハイドロキシァパ夕イトとコラーゲンからなる複合体（HAp/Col 複合体）としては、前述の菊池らの方法（Biomaterials 22， (2000) ρΠ05- 1711)により合成した HAp/Col 複合体粉末 500mgを用いた。

つぎに、 5Mの炭酸カルシウム懸濁液 80 1を加えて混合し、さらにダルコン酸粉末 lOOmgを加えて混合した。

混合物はすみやかに型に入れ、 45分かけて硬化させた。この硬化物を- 20 で 12時間凍結した後、凍結乾燥させ、本発明の複合生体材料（インプラント）を得た。

2. 結果（複合生体材料の特性）

インプラント断面を走査電顕で観察すると、直径数 m〜数 100 mからなる多孔質体で、生体骨類似の微小多孔質構造を有することが確認された (図 1)。

〔試験例 2〕ラッ卜大腿骨への移植実験

1. 試験方法

試験例 1で作製したインプラント 2x2x5mmを 10週齢の Wistar系ラッ卜大腿骨果部に骨孔をあけて移植し、、 4、 6、 8週後に採取し HE染色、トルイジンブルー染色を行った。比較として、以下の 3種の物質をそれぞれ試験例 2と同様にラット大腿骨果部に移植し、評価した。図 2〜5に各試料の移植後 2、 4、 8週における HE染色結果を示す。 ①市販の焼結体多孔質ハイドロキシアパタイト（三菱マテリアル社「ボンフィル」： 2 X 2 X 5M1)

②試験例 1で用いた HAp/Col複合体の圧縮成形体（2 X 2 X 5mm)

③アルギン酸ナトリゥム粉末（和光製「アルギン酸ナトリウム CP500- 600」）の 3 %溶液（生理食塩水）

2. 結果

1) 本発明のインプラン卜

図 2から明らかなように、本発明のインプラント周囲では、 2週目で既にインプラントに接した骨形成が旺盛で、 4週、 8週と経過するに従い、細胞の進入も増加している。拡大図では、 4週、 8週と経過するに従い、細胞の進入が増加するだけでなく、インプラント内部でも骨形成が増加しているのがわかる。このように、本発明のインプラントを移植した標本では、インプラント内への細胞進入が比較的良好で、貪食細胞と思われる多核巨細胞のインプラント内への進入も認められた。また、骨新生は直接インプラントに接して起こっており、インプラントと新生骨の境界は不明瞭であつた。さらに、卜ルイジンブル一染色では、炎症反応は認められなかった。

2) 市販の焼結体多孔質ハイドロキシアパタイト

図 3から明らかなように、市販の多孔質 HApのィンプラント周囲では、 2 週目でインプラントに接した骨形成が起こっているものの、 4週、 8週と経過しても、細胞の進入はあまり増加しなかった。拡大図では、 4週、 8週と経過するに従いィンプラント内部で骨形成が増加していることが認められるが、多孔質であるにもかかわらず細胞の進入していない孔が多いことがわかる。なお、特に強い炎症所見は認められなかった。

3) HAp/Col複合体の圧縮成形体図 4から明らかなように、 HAp/Co 1複合体では、 2週目ではインプラント内部への細胞の進入はほとんど認めらなかった。 4週、 8週と経過すると、ィンプラントの吸収は進行するものの、吸収されていない部分への細胞の進入は依然としてあまり増加しなかった。拡大図では、時間が経過するにしたがいインプラントの吸収が進行し、その部分では細胞の進入が起こつているのがわかる。骨形成はインプラント吸収の前線を追うように繊維組織を挟んで進行していた。

4) アルギン酸ナトリウム 3%溶液

図 5から明らかなように、アルギン酸ナトリウムでは、部分的にインプラントに接した骨形成が起こっているが、 8 週経過しても、細胞の進入は少なかった。なお、強い炎症所見は特に認められなかった。拡大図の所見も同様である。糸口' B冊

以上のとおり、本発明のインプラント（複合生体材料）は、他の多孔質インプラントに比較して、優れた生体親和性、細胞進入および骨形成能を有することが確認された。また、移植後の炎症反応も認められず、本発明の複合生体材料は安全性の面でも優れていることが確認された。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考 ■ として本明細書中にとり入れるものとする。産業上の利用の可能性

本発明によれば、生体適合性、骨誘導性に優れた新規複合生体材料を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . ハイドロキシァパタイト、コラーゲンおよびアルギン酸塩を含み、該ハイドロキシァパタイ卜の c軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した微小多孔質構造を有する複合生体材料。 ·

2 . 前記複合生体材料において、ハイドロキシァパタイトとコラーゲンの総量に対するアルギン酸塩の配合率が 1〜30 質量％であることを特徴とする、請求の範囲第 1項に記載の複合生体材料。

3 . ハイドロキシァパタイトとコラーゲンの総量に対するアルギン酸塩の配合率が 5〜20質量％であることを特徴とする、請求の範囲第 2項に記載の複合生体材料。

4 . 前記複合生体材料において、ハイドロキシアパタイトとコラーゲンの配合比が 60： 40〜90： 10である、請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか 1項に記載の複合生体材料。

5 . ハイドロキシアパタイトとコラーゲンの配合比が 70： 30〜85： 15である、請求の範囲第 4項に記載の複合生体材料。

6 . 複合生体材料中にアルギン酸塩が均一に含まれていることを特徴とする、請求の範囲第 1項〜第 5項のいずれか 1項に記載の複合生体材料。

7 . 凍結乾燥後の複合生体材料における空隙率が 80 %以上である、請求の範囲第 6項に記載の複合生体材料。

8 . 以下の工程によって製造されることを特徴とする、請求の範囲第 7項に記載の複合生体材料。

1) ハイドロキシァパタイ卜とコラーゲンからなる複合体とアルギン酸塩を混合する工程 2) 上記混合物にさらに炭酸カルシウム懸濁液を混合し、ついでダルコン酸粉末を混合して硬化させるとともに二酸化炭素を発泡させ、複合生体材料を得る工程

9 . 以下の工程を含む、複合生体材料の製造方法。

1) ハイドロキシアパタイトとコラーゲンからなる複合体とアルギン酸塩を混合する工程

2) 上記混合物にさらに炭酸カルシウム懸濁液を混合し、ついでグルコン酸粉末を混合して硬化させるとともに二酸化炭素を発泡させ、複合生体材料を得る工程

1 0 . ハイドロキシアパタイトとコラーゲンからなる複合体が、ハイド口キシァパタイトの c軸がコラーゲン繊維に沿うように配向した、微小多孔質構造を有する複合体である、請求の範囲第 9項に記載の方法。