WO2003035089A1

WO2003035089A1 - Preventives/remedies for foot and mouth disease

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Publication number: WO2003035089A1
Application number: PCT/JP2002/010902
Authority: WO
Inventors: Kazushige Tanaka
Original assignee: TANAKA-AI Co Ltd
Current assignee: TANAKA-AI Co Ltd
Priority date: 2001-10-22
Filing date: 2002-10-21
Publication date: 2003-05-01
Anticipated expiration: 2004-04-22
Also published as: JP2003201245A

Description

明細書口蹄疫の予防治療薬技術分野

本発明は、口蹄疫の予防および/または治療薬（以下、「口蹄疫の予防治療薬という」に関する。背景技術

ロ蹄疫 (Foot and Mouth Di sease)は、家畜に大きな被害を与える国際伝染病で、一部の地域を除いてアジア、アフリカ、南米大陸など世界各地に広く流行している。わが国でも、 2 0 0 1年 3月、 9 2年ぶりに口蹄疫が発生した。幸いにもこの発生は 4戸の農家にとどまり、同年 9月には国際獣疫事務局（〇 1 E ) から日本のロ蹄疫清浄化復帰が認められた。しかし、近年の国際流通の拡大と高速化を鑑みれば、口蹄疫の原因であるロ蹄疫ウィルス（F MDウィルスともいう）のわが国への浸入を完全に防ぐことは困難であると考えられている。そして、一旦ロ蹄疫ウィルスが侵入すると、ロ蹄疫ウィルスの伝染性が極めて強いため、口蹄疫の伝播を防ぐには多大な困難を伴い、国内の畜産業への打撃は大きい。それゆえに、わが国のみならず、世界的にも口蹄疫の予防および治療には多大な努力が払われている。

現在、口蹄疫の予防方法としてはワクチンの接種が挙げられる。しかし、口蹄疫ウイルスはきわめて変異が起こりやすく、それゆえにヮクチンの接種ではウィルスの感染自体を完全に防ぐことができないと考えられている。また、口蹄疫の治療方法としては、有効な方法がないのが現状である。発明の開示本発明は、製造が容易でかつ安全な口蹄疫の予防治療薬を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、パイナップルまたはその処理物並びに二塩基酸および/または三塩基酸がロ蹄疫ウィルスに対する抗ウイルス作用を有するという思いがけない知見を得た。

本発明者らは、さらに検討を重ねて本発明を完成した。

すなわち、本発明は、

( 1 ) パイナツプルまたはその処理物を含有することを特徴とするロ蹄疫の予防および/または治療薬、

( 2 ) パイナップルが、パイナップルの果肉部分であることを特徴とする前記（1 ) に記載の口蹄疫の予防および/または治療薬、

( 3 ) パイナップルの処理物が、パイナップル果汁、パイナップル果汁の絞りかす、パイナツプル由来の S Hプロテアーゼおよびパイナップル果実の表皮の乾燥物からなる群から選ばれる少なくとも 1種の処理物であることを特徴とする前記（1 ) に記載の口蹄疫の予防および/または治療薬、

( 4 ) 口蹄疫の予防およびノまたは治療のためのパイナップルまたはその処理物の使用、

( 5 ) パイナツプルまたはその処理物を使用することを特徴とするロ蹄疫の予防および/または治療方法、

( 6 ) 二塩基酸および Zまたは三塩基酸を含有することを特徴とする口蹄疫の予防および/または治療薬、

( 7 ) 二塩基酸が有機ジカルボン酸で三塩基酸が有機トリカルボン酸であることを特徴とする前記（6 ) に記載の口蹄疫の予防および Zまたは治療薬、

( 8 ) 有機ジカルボン酸がリンゴ酸で有機トリカルボン酸がクェン酸であることを特徴とする前記（6 ) または（7 ) に記載の口蹄疫の予防および Zまたは治療薬、 10902

(9) さらに、シユウ酸を含有する前記（6) から（8) のいずれかに記載の口蹄疫の予防および Zまたは治療薬、

(10) ブロメラインを含有することを特徴とする前記（6) から（9) のいずれかに記載の口蹄疫の予防および Zまたは治療薬、

(11) 糖を含有することを特徴とする前記（6) から（10) のいずれかに記載の口蹄疫の予防および Zまたは治療薬、

(12) 糖がブドウ糖、ショ糖、果糖から選ばれるいずれか 1または 2以上である前記（6) から（11) のいずれかに記載の口蹄疫の予防および Zまたは治療薬、 ―

(13) pHが 3. 2〜 3. 5の水性製剤であることを特徴とする前記（6) から（12) のいずれかに記載の口蹄疫の予防および/または治療薬、に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、缶詰加工に際してのパイナップルの切断の具体例を示す図である。図中の符号 1は表皮を、符号 2は周辺果肉を、符号 3は中央部の円柱状果肉を、符号 4は果芯部を、符号 5と 6は天地部を表す。発明を実施するための最良の形態

口蹄疫はロ蹄疫ウィルスの感染による急性熱性伝染病で、牛，水牛，豚，めん羊，山羊などの家畜をはじめ、野生動物を含むほとんどの偶蹄類動物が感染する。口蹄疫に感染した動物では、口の周囲、舌、蹄部及び乳房周辺の皮膚や粘膜に水疱が形成される。致死率は幼畜では 50%をこえる。また、成畜の致死率は数％であるが、採食障害や歩行障害によって著しく生産性が低下する。口蹄疫の原因であるロ蹄疫ウィルスは、感染動物やその汚染物によって直接、間接の接触によって伝播する。さらに地域が濃厚汚染地帯になると空気伝播もおこりえる。潜伏期間は牛、豚、めん羊でそれぞれ 6.2 日、 10.6 日、 9.0 日である。

ロ蹄疫ウィルスは、エンベロープを持たない直径約 21〜25nm程度の球形の 1本鎖 RNAウィルスであり、ピコルナウィルス科 (Family Picornaviridae) のァフトウィルス属（Genus Aphthovirus)に分類される。ロ蹄疫ウィルスには、相互にワクチンが全く効かない 0， A, C, As i a 1, S AT 1, SAT 2 及び SAT 3の 7種類の血清型がある。さらに同一タイプ内にも、部分的にしかワクチン効果が期待できない、従来はサブタイプ（亜型）と呼ばれていた多数の免疫型が存在する。

パイナップルは、学名はアナナス（An an a s) といい、高さが約 60〜 120 cmになるパイナップル科の常緑多年草である。葉は長さ約 lmで細長く、花は果茎上に 100〜150個程度が密に並んで咲き、淡青紫色をしている。茎は肥大部の中心を突き抜けて、その頂部に冠芽をつけている。冠芽は、多数の葉をつけ、子株状になっている芽のことである。茎には、その他に例えば肥大部の直下からの裔芽、肥大部をになう茎の途中からの吸芽、下部の地際からの塊茎芽などの芽がついており、これらの芽から各種の子株が発生する。本発明においては、茎、芽、根や果実などパイナップルのいずれの部位を用いてもよいが、特に、果肉部分、すなわち伸長した茎の周りに排列した小果実の付け根の部分（花托という）が融合肥大した部分を用いるのが特に好ましい。パイナップルは、ハワイ、フィリピン、タイ、台湾、中国の海南島や日本の沖繙県など世界の熱帯 ·亜熱帯の全域で広く栽培されている。本発明において用いるパイナップルの産地は、特に限定されない。

また、パイナップルには多品種が存在し、その品種としては、例えばカイエン群、クイーン群、レッドスパニッシュ群、ブランコ群、ァマレロ群、メイピユア群などに分類される。本発明で用いるパイナップルの品種は特に限定されない。中でも、イェロー 'モーリシヤスやカイエン群のスムースカイエン（葉にトゲのない物）などが、食用またはジュースや缶詰の原料としてよく用いられており、入手が容易であるので好ましい。また、ゴールデン 'パイン、スーパースイート ·パインなどの名で出回る糖度を高めた品種や、手でちぎって食ベるスナック ·パインなどの、品種改良の結果得られた品種を、本発明において用いてもよい。

本発明の実施態様には、上述のパイナップルまたはその処理物を含有する口蹄疫の予防治療剤が含まれる。かかるパイナップルまたはその処理物の状態は特に限定されず、固形状でも、液状でも、固形状物と液状物の混合状態でもよレ^例えば、本発明にかかる口蹄疫の予防治療剤には、上述のパイナップルが、切断物の形状で含まれていてよい。切断物の大きさは、本発明にかかるロ蹄疫の予防治療剤を投与することができれば特に限定されない。

パイナップルの処理物としては、特に限定されず、パイナップルに何らかの加工処理を加えたものは全て含まれる。例えば、パイナップルの処理物としては、パイナップルから得られる果汁もしくはパイナップルの抽出液、またはそれらの濃縮物、精製物または乾燥物などが挙げられる。また、パイナップルの処理物としては、パイナップルの乾燥物、もしくはパイナップルの切断物の乾燥物、パイナップル果実の表皮もしくはその乾燥物、またはそれらの粉砕物などが挙げられる。さらに、パイナップルの処理物としては、果汁を搾り取った後の残部、すなわち絞りかす、またはその乾燥物、さらにその切断物なども挙げられる。

さらに、パイナップルの処理物としては、パイナップル由来の S Hプロテアーゼであってもよい。 S Hプロテアーゼとは、活性中心に S H基を有するプロテア一ゼである。より具体的には、パイナップル由来の S Hプロテアーゼとしては、ブロメラインなどが挙げられる。ブロメラインは、パイナップルの茎由来の酵素の混合物であり、公知の方法により容易に得ることができる。また、本発明においては市販品を用いてよい。本発明で用いる上記パイナップルの処理物は、公知の方法により容易に得ることができる。例えば、パイナップル果汁は、パイナップルまたはパイナップルの一部、好ましくは果肉部分を粉碎機などによる粉砕後、得られた粉砕物から搾汁機などを用いて搾汁して得ることができる。得られた果汁に対し、さらに遠心分離やろ過などの精製手段を施してもよい。また、さらに、果汁に含まれる水分を蒸留などの方法により取り除き、濃縮してもよい。得られた果汁または濃縮物を噴霧乾燥し、粒状物や粉状物としてもよい。

また、例えば、パイナップルの抽出液は、水もしくはエタノール等のアルコール類のような親水性溶媒、またはこれらの組み合わせよりなる溶媒を用いて、常圧また加圧下、常温または加熱下で抽出することができる。また、水またはエタノール等のアルコール類のような親水性溶媒の蒸気（気体）を用いて抽出することもできる。さらに、上記と同様に、得られた抽出液に対し、さらに精製や濃縮、噴霧乾燥などを施してもよい。

また、パイナップルまたはパイナップルの切断物の乾燥物は、自然乾燥することにより得ることができるし、加圧もしくは常圧下で加熱することにより乾燥させて得ることもできる。乾燥に用いる媒体は、空気であってもよいし、例えば窒素などの不活性ガスであってもよく、特に限定されない。また乾燥温度は一概には言えないが、例えば、約 1 0 0 °C以下、より好ましくは約 7 0 °C程度以下であることが好適である。さらに、凍結乾燥によっても、上記乾燥物を得ることができる。また、パイナップルまたはその切断物、好ましくはスライス状の切断物を糖溶液へ浸漬することによつても、上記乾燥物を得ることができる。このようにして得られる乾燥物を、ハンマーミル、パワーミルまたはポ —ルミルなどの公知の粉砕機を用いて粉砕してもよい。

本発明においては、パイナップルの缶詰やジュースを製造する際に出る廃棄物を用いることが好ましい。例えば、パイナップルの缶詰は、下記のようなェ程で製造される。第 1図に、缶詰加工に際してのパイナップルの切断の具体例を示した。まず、洗浄工程において土等の付着物が除去されたパイナップルは

、次のサイジング工程において、中央部の円柱状果肉 3と、周辺果肉 2および表皮 1からなる部分とに分離される。次に、円柱状果肉 3の上下の天地部 5、 6が切断され、次いで果芯除去工程で果芯部 4が芯抜きされる。ついで、表面に残存している褐色の目部を取り除き、輪切り工程において所定の厚さに輪切りされる。最後にこれを缶に詰め、密封した状態で殺菌および冷却する。ここから明らかなように、パイナップルの缶詰の製造工程においては、周辺果肉 2 と表皮 1からなる部分、天地部 5、 6および果芯部 4が、廃棄物となる。本発明においては、かかる廃棄物に上記のような加工処理を施した処理物を用いるのが好ましい。このように、廃棄物を有効に利用することにより、本発明の治療予防薬の原料を容易かつ安価に入手できることができるという利点がある。また、廃棄物の処分に必要なエネルギーや資源が節約され、環境への負担を軽減できるという利点もある。

また、二塩基酸および/または三塩基酸を含有する口蹄疫の予防治療剤も本発明の実施態様である。本発明においては、二塩基酸としては有機ジカルボン酸が、三塩基酸としては有機トリカルボン酸が好ましい。有機ジカルボン酸としては、シユウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、ダルタル酸、アジピン酸などの飽和ジカルボン酸、マレイン酸、フマル酸などの不飽和ジカルボン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸などの芳香族ジカルボン酸が、また有機トリカルボン酸としてはクェン酸、イソクェン酸、 c i S —アコニット酸などが挙げられ、これらを一種または二種以上を組み合わせて用いることができる。好ましくは、有機ジカルボン酸としてリンゴ酸、有機トリカルボン酸としてクェン酸を単独で、または混合して用いる。最も好ましくは、有機ジカルボン酸としてクェン酸を用いる。さらに、シユウ酸を添加することもできる。なお、全有機酸全量（例えば、ジカルボン酸とトリカルボン酸とシユウ酸との総和量）に対してクェン酸が約 5 0〜7 0重量％、リンゴ酸が約 2 0〜4 0重量％、シユウ酸が約 1重量％含まれているのが好ましい。有機ジカルボン酸と有機トリカルボン酸およびシユウ等の全有機酸の製剤全体に対する使用割合は通常 1〜 5 0重量％、好ましくは 5〜4 0重量％である。また、有機ジカルボン酸およびノまたは有機トリカルボン酸の群から選ばれる一種または二種以上とパイナップルまたはパイナップル処理物を組み合わせて用いてもよい。したがって上述のように、本発明の製剤にはブロメラインが入っていてもよい。有機酸とブロメラインとの重量割合は約 1 : 0 . 0 1〜1、より好ましくは約 1 ： 0 . 0 5〜0 . 5とするのがよい。本発明においてブロメラインは、市販品を用いることができる。例えば、ブロメライン 2 0 0 G D U (日本パイォコン（株）製）、キモタブ S 4万単位（持田製薬（株）製）などが挙げられる。

また、必要に応じて、二塩基酸および/または三塩基酸に糖を含有させることもできる。糖としては、ブドウ糖、果糖、マンノース、ガラクトース、キシロース、ァラビノース、リブロースなどの単糖類、ショ糖、トレハロース、ィソトレハロース、イソサッカロ一スなどの二糖類、オリゴ糖などが挙げられ、これらを一種または二種以上組み合わせて用いることができる。好ましくは、ブドウ糖、ショ糖、果糖を一種または二種以上組み合わせて用いる。なお、パィナツプルにはブドウ糖、ショ糖、果糖が含まれているためパイナップルまたはその処理物を使用する際には、特に添加する必要はない。また、ブドウ糖、ショ糖、果糖の一種または二種以上と他の糖を組み合わせて用いてもよい。さらに、所望により、本発明にかかる口蹄疫の予防治療薬とともに、ヮクチンの接種、特開平 7— 6 9 8 9 9のような他の抗ウィルス剤などを併用してもよい。

本発明にかかる二塩基酸および/または三塩基酸を含有することを特徴とする口蹄疫の予防治療薬の p Hは、約 3 . 2〜3 . 5の範囲がより好ましい。約 3 . 2以下では動物に対し注射時疼痛の副作用が発現する場合があり、約 3 . 5以上では口蹄疫の予防治療薬としての効果が弱まる場合がある。ル果汁の p Hも、約 3 . 2〜3 . 5であるためパイナップル果汁を口蹄疫の予防治療薬として使用することは好ましい。

本発明に係る口蹄疫の予防治療剤は、経口投与または非経口投与が都合よく行われるものであればどのような剤形のものであってもよい。本発明に係る医薬品の剤形としては、 ( 1 )パイナップルまたはその処理物、および Zまたは（ 2 ) 二塩基酸およぴンまたは三塩基酸を含む限りどのようなものでもよく、例えば散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射液、輸液等が挙げられる。また、本発明においては、症状に応じて、上記剤形の本発明に係る予防治療剤をそれぞれ単独で、または組合わせて使用することができる。

本発明に係る口蹄疫の予防治療剤には、所望により賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、安定化剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の添加剤を添加することができる。

より具体的には、本発明に係る予防治療剤がカプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などの固形製剤の場合には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソ一ダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシゥム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などの添加剤を製剤中に含有させることができる。また、本発明にかかる予防治療剤が液体製剤の場合には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコ一ル、プロピレングリコールなどのグリコ一ル類；ごま油、ォリーブ油、大豆油などの油類； P—ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの添加剤を製剤中に含有させることができる。また、液体製剤の場合、本発明に係る予防治療剤は有効成分を用時溶解させる形態の製剤であってもよい。

なお、製剤中の例えば、二塩基酸、三塩基酸、シユウ酸などの有機酸の量は、約 0 . 0 0 1〜2 0重量％、好ましくは約 0 . 5〜1 5重量％、さらに好ましくは約 1〜1 0 %とするのがよい。

上述したような本発明に係る予防治療剤は、それ自体製剤学の分野で周知または慣用の方法に従って容易に製造することができる。

本発明に係る口蹄疫の予防治療剤は、ヒトを含むいずれの動物に対しても適用可能であるが、特に牛、水牛、豚、めん羊、山羊などの家畜をはじめ、野生動物を含む偶蹄類動物に対して適用するのが好ましい。

本発明に係る口蹄疫の予防治療剤の投与経路は、特に限定されず、経口投与または非経口投与のいずれでもよい。中でも、本発明に係る口蹄疫の予防治療剤は経口投与することが、服用の容易性などの観点から好ましい。

また、本発明に係る口蹄疫の予防治療剤の投与量は、投与経路、剤形、投与する動物の種類、症状の重篤度、年齢もしくは体重などによって異なるので、一概には言えない。具体的には、一日あたり約 0. 0 1〜1 0 gZ k g程度、好ましくは約 0. l〜5 gZ k g程度、より好ましくは約 1〜5 g/k g程度である。

本発明に係る予防治療剤に含まれるパイナップルは、長年多くの国々で食用されてきており、毒性はなく、動物に対して投与しても安全である。

このように、パイナップルまたはその処理物を使用することにより、ロ蹄疫を予防し、または治療することができる。

また、二塩基酸および/または三塩基酸がどのようにしてロ蹄疫ウィルスを不活性化するかについての詳細は不明である。可能なメカニズムの一つとして、当該二塩基酸および Zまたは三塩基酸からロ蹄疫ウィルス構造内の多様なタンパク質の一つまたは全てのアミド窒素への陽子の供与が考えられる。この陽子付加は、タンパク質構造内の正味の陽性荷電をもたらすと考えられ、これによつて、高分子タンパク質分子の陽子付加アミド部分間に反発力が生ずると考えられる。これは、ロ蹄疫ウィルス内のタンパク質構造のいくつかまたは全ての 10902

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変性をもたらすものと考えられる。このタンパク質構造の変性または展開によつてロ蹄疫ウィルスは不活性化されるものと考えられる。また、二塩基酸および/または三塩基酸によるまた別の可能な不活性化メカニズムは、ロ蹄疫ウイルス構造内のタンパク質および他の分子の加水分解を介するものである。この酸触媒加水分解は、おそらく複雑なロ蹄疫ウィルス構造を作り上げているタンパク質のアミド官能性の切断を介して生じるものと考えられる。ロ蹄疫ウィルス構造内のタンパク質のこの加水分解およびその結合破壊は、ロ蹄疫ウィルスを不活性化し、ロ蹄疫ウィルスが体内の健常な細胞に結合することができなくなると考えられる。

このように、二塩基酸および Zまたは三塩基酸を使用することにより、口蹄疫を予防し、または治療することができると考えられる。実施例

パイナップルの乾燥物（以下、パイナップルスラグという）及びパイナップル果汁の実験動物に対する安全性及び抗ロ蹄疫ウィルス作用について検討した。以下に、試験例 1〜4で用いた試験材料を示す。

1. 検体：田中藍株式会社（香港）より入手したパイナップルスラグ及びパイナツプル果汁（計 2種）

2. 実験動物：健常マウス（日齢 4〜6日及び熟齢）、ラットおよびゥサギ（いずれも中国農業科学院蘭州獣医研究所の実験動物室より入手）

3. 飼育豚：健常雑種白豚（体重 20〜30 kg、市販品）

4. 子牛血清：除菌済み健常牛血清（成都華西生物技術会社より購入、ロ蹄疫検査を実施し、陰性であったもの）

5. O型ロ蹄疫ウィルス： OPNF₁₁LD₅₀>8. 0

6. 間接凝血抗原：中国農業科学院蘭州獣医研究所で製造された製品（ロット番号： 2001826)、力価 1 : 2048 7. 希釈溶液： 0. lmlZL PBS (pH7. 6)、高圧滅菌済み、室温保存

8. 脱イオン水：中国農業科学院蘭州獣医研究所の実験動物室より供給、高圧滅菌、室温保存

〔試験例 1〕実験動物を用いた安全性試験

滅菌済みの脱イオン水を用いて、パイナップルスラグ及びパイナップル果汁をそれぞれ 2、 3、 4及び 5容量倍に希釈し、下記表に記載の用量及び方法で動物に接種し、死亡の有無、接種部位における炎症および壊死の有無、健康状態及び摂餌状態等を 7日間観察した。摂取動物を観察し、安全が保証できる試料の最低希釈率を繰り返し検討し、測定した。

ゥサギは滅菌済み脱イオン水を用い、対照群及び健常動物の対照群として設定した。第 1表

果汁の実験動物に対する安全性の判定基準は、以下の通りであった 02

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1. 各種実験動物に強制経口投与または貼り付けにより接種した場合、該動物が死亡せず、かつ異常な症状が認められずに健常である場合は、パイナップルスラグ及びパイナップル果汁が安全であると判定する。

2. 接種部位における炎症の発生や組織の壊死または動物の死亡を認めた場合、パイナップルスラグ及びパイナップル果汁は安全でないと判定する。

5回繰り返し試験を行つた結果、パイナップルスラグ及びパイナップル果汁の 2容量倍希釈液はラット等の実験動物に対して毒性や刺激性はなく、接種部位における異常な症状もなく、全ての動物が健常であった。従って、田中藍株式会社（香港）より入手したパイナップルスラグ及びパイナップル果汁試料の 2容量倍希釈液は、動物に対する刺激性はなく、安全であった。

〔試験例 2〕

ラット及びマウスを用いた抗ウィルス作用の有効濃度の検討を以下に示す手順に従って行った。

1. ロ蹄疫ウィルス液の調製と希釈

O型ロ蹄疫ウィルス（中国農業科学院蘭州獣医研究所保存品、 OPNFuL D₅₀>8. 0) を秤量し、 1 : 10 (重量比）の懸濁液を調製した。ベニシリン— Gを加え 4 °Cで 24時間放置した後、 4000 r pmZ分で 15分間遠心分離した。上清を取り、リン酸塩緩衝液で 500倍希釈した。

2. ラット及びマウスを用いた抗ウィルス作用の有効濃度の検討

試験例 1の安全性試験において、当該 2種の試料の実験動物に対する安全濃度を確認した後、滅菌済み脱イオン水を用いて、パイナップルスラグ及びパイナツプル果汁をそれぞれ 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 13、 16、 19及び 21容量倍に希釈し、等量の上記ロ蹄疫ウィルス 500倍希釈液と混合した。別に各濃度レベルに 10 %の子牛血清を含有する群を設けた。パイナップルスラグまたはパイナップル果汁と等量の上記ロ蹄疫ウイルス 5 0 0倍希釈液とを充分に混合し、 2 4 °Cの室温下で 3 0分間反応させた。これらをそれぞれ日齢 4〜6日のマウス及びラットに注射した。また、ウィルス対照群及び試料ブランク群を設ける。これらの動物を 7日間観察した後、判定を仃つた。

抗ウィルス作用の有効濃度の判定基準は、以下に示す通りである。

1 .ウィルス陽性対照群は、接種後 2 4時間から 7 2時間以内に発病して死亡、またはロ蹄疫ウィルスの特徴的な症状を示す。

2 . 実験群（即ち、試料とロ蹄疫ウィルスとの混合液を投与した群）は、健常群と同様に、観察期間中に異常な症状を示さない。

3 . 1 0 0 %の抗ロ蹄疫ウィルス作用を示す最大希釈倍数の試料の濃度を当該試料の有効濃度とする。

5回繰り返し試験を行つた結果、パイナップルスラグ及びパイナップル果汁のいずれも、その 4容量倍希釈液が 1 0 0 %の抗ロ蹄疫ウィルス作用を有することが証明された。

〔試験例 3〕

雑種白豚（体重 2 0〜3 0 k g ) における抗ウィルス作用の有効濃度の検討を以下に示す手順に従って行つた。

試験例 2よりマウス及びラットを用いた抗ロ蹄疫ゥィルス作用の有効濃度を確認した後、雑種白豚（体重 2 0〜3 0 k g ) についても抗ウィルス作用を確認し、当該作用の再現性と確実性を確認した。

滅菌済みの脱イオン水を用いて、パイナツプルスラグ及びパイナツプル果汁をそれぞれ 2、 3、 4、 5容量倍希釈し、それぞれ等量の上記ロ蹄疫ウィルスの 5 0 0倍希釈液と混合し、 2 4 °Cの室温下で 3 0分間反応させた後、直ちに体重 2 0〜3 0 k gの白豚に耳の付け根筋肉から 3 mLを注射し接種した。同時にウィルス陽性対照群 3頭を設け、耳の付け根筋肉から 1 0 0 0倍希釈の口蹄疫ウィルス液 3 mLを注射した。試験群及び対照群を別々に飼育し、 1 5日間観察した後、判定を行った。

体重 2 0〜3 0 k gの雑種飼育白豚を用いて、パイナップルスラグ及びパイナップル果汁の抗ロ蹄疫ウイルス作用の有効濃度を検討した。 4容量倍希釈した試料で処理したロ蹄疫ウィルス液を接種した豚は、いずれも 1 5日間観察した結果、口または足に水泡発生の異常は認められなかった。一方、ウィルス陽性対照群の動物はすべて 4 8時間以内に発病した。患部組織を採取し、抗原を作製し、間接凝血法により検査した結果、病原ウィルスは本試験に用いたウイルスと同型であったことを判明した。従って、パイナップルスラグ及びパイナップル果汁の 4容量倍希釈液は 1 0 0 %の抗ロ蹄疫ウィルス作用を有することが証明された。

〔試験例 4〕

パイナップルスラグの抗口蹄疫ゥィルス作用に関する試験を以下に示す手順に従って行った。

パイナップルスラグ 5 0 gを枰量し、 5 0 mL の P B Sで希釈し、ぺニシリン一 Gを加え、室温に 1 0分間放置した後、 4 0 0 0 r pmZで 1 5分間遠心分離した。上清を取り、直ちに 2〜4日齢の口蹄疫に感染したマウス数匹に注射し、 7 2時間観察した。その後、マウスを解剖し、ホモジネートをべニシリンー Gで 6倍希釈し、 4°Cで 2 4時間放置した後、遠心分離、上清をマウスに接種した。このような操作を 3回繰り返し行った。

上記のように 3回連続接種し試験を行つた結果、試料からロ蹄疫ウィルスは検出されなかった。

また、二塩基酸および Zまたは三塩基酸の実験動物に対する安全性及び抗口蹄疫ウィルス作用について検討した。上述した試験例 1〜4のパイナップルスラグ及びパイナップル果汁を下記の製剤例 1及び 2に置き換えて試験例 1〜 4 について検討した。

〔製剤例 1〕クェン酸 7. 0 g、リンゴ酸 3. 0 g、シユウ酸 0. l gを滅菌済みの脱イオン水 1リットルを用いて溶解し、 pHを 3. 2に調整し、水性製剤とした。

〔製剤例 2〕クェン酸 7. 0 g、リンゴ酸 3. 0 g、シユウ酸 0. l g、ブロメライン（キモタブ S 4万単位） 1. 0 gを滅菌済みの脱イオン水 1リットルを用いて溶解し、 pHを 3. 2に調整し、水性製剤とした。その結果、得られる製剤例 1及び 2の水性製剤は、パイナップルスラグ及びパイナップル果汁と同様に、試験例 1において動物に対する刺激性はなく安全であり、試験例 2及び 3において抗ロ蹄疫ウィルス作用を有し、試験例 4においてロ蹄疫ウィルスは検出されない。産業上の利用可能性

本発明は、今まで有効な治療および予防手段がなかったロ蹄疫に対する画期的な予防治療薬を提供する。本発明にかかる予防治療薬は、パイナップルまたはその処理物並びに二塩基酸およびノまたは三塩基酸を有効成分とすることから、毒性がなく安全である。しかも、天然物の原料が利用できるため原料の入手が容易であり、また、予防治療薬の剤形が特に限定されないため、本発明にかかる予防治療薬は容易かつ安価に製造することができる。

Claims

請求の範囲

1 . パイナップルまたはその処理物を含有することを特徴とする口蹄疫の予防および/または治療薬。

2 . パイナップルが、パイナップルの果肉部分であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の口蹄疫の予防および/または治療薬。

3 . パイナップルの処理物が、パイナップル果汁、パイナップル果汁の絞りかす、パイナップル由来の S Hプロテア一ゼおよびパイナップル果実の表皮の乾燥物からなる群から選ばれる少なくとも 1種の処理物であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の口蹄疫の予防および zまたは治療薬。

4 . 口蹄疫の予防および Zまたは治療のためのパイナツプルまたはその処理物の使用。

5 . パイナップルまたはその処理物を使用することを特徴とする口蹄疫の予防および/または治療方法。

6 . 二塩基酸および/または三塩基酸を含有することを特徴とする口蹄疫の予防および Zまたは治療薬。

7 . 二塩基酸が有機ジカルボン酸で三塩基酸が有機トリカルボン酸であることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載の口蹄疫の予防および/または治療薬。

8 . 有機ジカルボン酸がリンゴ酸で有機トリカルボン酸がクェン酸であることを特徴とする請求の範囲第 6項または第 7項に記載の口蹄疫の予防および/ または治療薬。

9. さらに、シユウ酸を含有することを特徴とする請求の範囲第 6項から第 8項のいずれかに記載の口蹄疫の予防および/または治療薬。

10. ブロメラインを含有することを特徴とする請求の範囲第 6項から第 9 項のいずれかに記載の口蹄疫の予防および Zまたは治療薬。

1 1. 糖を含有することを特徴とする請求の範囲第 6項から第 10項のいずれかに記載の口蹄疫の予防および Zまたは治療薬。

12. 糖がブドウ糖、ショ糖、果糖から選ばれるいずれか 1または 2以上である請求の範囲第 6項から第 11項のいずれかに記載の口蹄疫の予防および Z または治療薬。

13. pHが 3. 2〜3. 5の水性製剤であることを特徴とする請求の範囲第 6項から第 12項のいずれかに記載の口蹄疫の予防および Zまたは治療薬。