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WO2003034066A1 - Procede de diagnostic d'un infarctus cerebral - Google Patents

Procede de diagnostic d'un infarctus cerebral Download PDF

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Publication number
WO2003034066A1
WO2003034066A1 PCT/JP2002/010610 JP0210610W WO03034066A1 WO 2003034066 A1 WO2003034066 A1 WO 2003034066A1 JP 0210610 W JP0210610 W JP 0210610W WO 03034066 A1 WO03034066 A1 WO 03034066A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glycoprotein
nick
concentration
cerebral infarction
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/010610
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takao Koike
Tatsuya Atsumi
Hisao Kato
Hideyuki Tanaka
Original Assignee
Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. filed Critical Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.
Priority to AT02775332T priority Critical patent/ATE499608T1/de
Priority to US10/492,479 priority patent/US20040248200A1/en
Priority to DE60239281T priority patent/DE60239281D1/de
Priority to EP02775332A priority patent/EP1443326B1/en
Publication of WO2003034066A1 publication Critical patent/WO2003034066A1/ja
Priority to US12/197,730 priority patent/US20090004750A1/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing cerebral infarction.
  • the present invention can be used particularly for diagnosis of cerebral infarction patients and observation of pathological conditions after treatment.
  • nick ⁇ 2 glycoprotein I is composed of two polypeptide chains that are cleaved by a protease to a part of the amino acid sequence, but are linked by disulfide bonds. Means jS2 glycoprotein I.
  • ⁇ 2 glycoprotein I that has not been cleaved by a protease is referred to as “nick; 82 glycoprotein IJ” when it is necessary to distinguish it from “nick; 82 glycoprotein IJ”. Therefore, in this specification, when simply referred to as ⁇ ⁇ 2 glycoprotein IJ, unless otherwise specified, it refers to “intact 2 glycoprotein IJ.” In the above, “the total 2 glycoprotein IJ includes both the above-mentioned hick ⁇ 2 glycoprotein IJ and the above“ the intact 2 glycoprotein IJ.
  • ⁇ 2 glycoprotein I is a glycoprotein that exists in the blood of healthy humans at a concentration of about 20 Oj ⁇ gZm, has the property of binding to negatively charged phospholipids, It is known to exhibit anticoagulant activity by inhibiting the contact phase, platelet aggregation by ADP, activated factor 5 and phospholipid-dependent protroponinase activity, and the interaction between protein S and its binding protein.
  • Cerebral infarction is a disease caused by obstruction of the cerebral artery due to thrombus, and is the main cause of stroke, which is the third leading cause of death in Japan, and has a high mortality rate.
  • CT imaging has been used to diagnose cerebral infarction, but in addition to this, if it is possible to measure cerebral infarction-specific molecular markers in the blood, It is considered that it is effectively used for prediction.
  • the inventor of the present invention has conducted intensive studies for the purpose of developing a method capable of diagnosing (that is, detecting) cerebral infarction.
  • Riu ⁇ 2 glycoprotein I is significantly higher in patients with cerebral infarction than in healthy subjects
  • the ratio of the concentration of total yS2 glycoprotein I to the total concentration of glycoprotein I was also effective for diagnosing cerebral infarction.
  • TAT thrombin'anti-tolbin III complex
  • PIC plasmin ⁇ 2 plasmin inhibitor complex
  • DD D-D dimer
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention relates to a method for diagnosing cerebral infarction, comprising the step of measuring the concentration of nick) S2 glycoprotein I in a body fluid sample.
  • the present invention measures the nick) 82 glycoprotein I concentration (N) and the total) S2 glycoprotein I concentration (T) in a body fluid sample to determine the total) 82 glycoprotein I concentration (T).
  • the present invention relates to a method for diagnosing cerebral infarction, which calculates a ratio (N / T) of the concentration (N) of nick yS2 glycoprotein I to T) and uses the ratio as an index.
  • the concentration measurement is performed based on an immunological assay or a biochemical assay.
  • the diagnosis of cerebral infarction mainly means detection or prediction of cerebral infarction, and broadly includes monitoring or screening of a disease state during or after treatment.
  • nick 2 glycoprotein I refers to two polypeptide chains that are cleaved by a protease to a part of the amino acid sequence, but are composed of two disulfide chains. 82 means glycoprotein I linked by a bond.
  • the "nick; 82 glycoprotein IJ has, for example, (1) cleavage into the V domain by plasmin (in human 2 glycoprotein I, the lysine residue at position 31-17 is Nick 2 glycoprotein I that has been cleaved with the threonine residue at position 318, and (2) cleavage to domain V by granulocyte elastase (in human 2 glycoprotein I, Includes nick yS2 glycoprotein I that has been cleaved between the alanine residue at position 3 14 and the residue at position 3 15: L-dialanine residue.
  • FIG. 1 shows the value of the concentration of nick 2 glycoprotein I (nick j8 2 GPI) in the plasma sample measured by the sandwich enzyme immunoassay according to the method of the present invention. And Bar Drafts shown by cerebral infarction patient group.
  • FIG. 2 shows the ratio R calculated from the nick 2 glycoprotein I concentration and the total in the plasma sample measured by the sandwich enzyme immunoassay according to the method of the present invention. It is a bar graph shown separately.
  • Cerebral infarction is a disease caused by obstruction of the cerebral artery by a thrombus. Stenosis or occlusion of the intracranial and extracranial cerebral arteries causes cerebral circulation disorders, resulting in irreversible damage to brain tissue and cerebral infarction. Various neurological symptoms are caused by brain tissue damage. Cerebral infarction is classified as embolic cardiogenic cerebral infarction, thrombotic lacunar infarction, or atherothrombotic cerebral infarction in which hemodynamic factors are added to the above two, depending on the mechanism of occlusion of the resulting blood vessels.
  • Cerebral infarction refers to, for example, a disease state diagnosed by the above-mentioned diagnostic method. It also includes the pathology of experiencing the cerebral infarction and observing the course of treatment thereafter.
  • any body fluid sample of any mammal can be used.
  • the body fluid sample include a blood sample, particularly plasma or serum, and it is particularly preferable to use plasma.
  • the present inventors have found that the concentration of nick 2 glycoprotein I contained in a body fluid sample in cerebral infarction patients is more compared to that in healthy subjects. o Found to be statistically significantly higher.
  • cerebral infarction can be diagnosed by measuring the concentration of nick 2 glycoprotein I contained in a body fluid sample collected from a test subject.
  • the concentration of nick 2 glycoprotein I can be determined based on, for example, an immunological assay or a biochemical assay.
  • NZT concentration ratio
  • the concentration (N) of the nick 2 glycoprotein I and the concentration (T) of! ⁇ 1tal / 82 glycoprotein I contained in the body fluid sample collected from the test subject were measured. Calculate the ratio (NZT) (ie, R value) of the nick to the 82 Glycoprotein I concentration (T); and use the R value as an index. Thus, cerebral infarction can be diagnosed.
  • the concentration of 82 glycoprotein I can be determined, for example, based on the above-described immunoassay or biochemical assay.
  • the concentration of total 2 glycoprotein I can also be determined by immunoassay. It can be performed based on the method or the biochemical measurement method.
  • the above-mentioned nick) Immunological measurement of 52 glycoprotein I can be carried out, for example, by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-28607 ⁇ It does not react with intact ⁇ 2 glycoprotein I, Nick; a monoclonal antibody reactive with glycoprotein I "(hereinafter sometimes referred to as an anti-nick GPI monoclonal antibody) or an antibody fragment thereof.
  • the anti-nick GPI monoclonal antibody preferably comprises (1) Interact; does not react with S2 glycoprotein I, reacts with nick2 glycoprotein I, and further comprises the nick) 82 glycoprotein I Reacts to V domain (especially human nicks) in S2 glycoprotein I (counting from the amino end) Has an epitope in the region consisting of the 242nd amino acid residue to the 326th amino acid residue], more preferably a monoclonal antibody NGP I-59 secreted from Hypridoma NGP I-59, or (2) Not reacting with contact ⁇ 2 glycoprotein I, reacting with nick ⁇ 2 glycoprotein I, and nick; reacting with the region consisting of domain I to domain IV of 82 glycoprotein I [Especially humannic] 82 glycoprotein I has an epitope in a region consisting of the 1st amino acid residue to the 241st amino acid residue (counting from the amino terminal side).
  • Monoclonal antibody more preferably hybridoma Monoclonal antibody NGP I-60 secrete
  • the immunological measurement of the total yS2 glycoprotein I can be performed by, for example, a monoclonal antibody which reacts with intact ⁇ 2 glycoprotein I and also reacts with nick j82 glycoprotein I described in JP-A-2000-28607. (Hereinafter sometimes referred to as an anti-total GPI monoclonal antibody) or an antibody fragment thereof.
  • a monoclonal antibody which reacts with intact ⁇ 2 glycoprotein I and also reacts with nick j82 glycoprotein I described in JP-A-2000-28607. (Hereinafter sometimes referred to as an anti-total GPI monoclonal antibody) or an antibody fragment thereof.
  • anti-total GPI monoclonal antibody examples include intact 2 glycoprotein I (in particular, human intact S2 glycoprotein I), and nick ⁇ 2 glycoprotein I [in particular, human nicks cleaved in the V domain. ⁇ 2 glycoprotein I], preferably a domain consisting of domains I to IV of intact i82 glycoprotein I and nick 2 glycoprotein I
  • a monoclonal antibody having an epitope in the region consisting of amino acid residue 1 to amino acid 241 of amino acid (counted from the amino side) in the immunogenic 2 glycoprotein I More preferred is monoclonal antibody NGPI-123, which is secreted from Hypridoma NGP 1-23.
  • Hydpri Doma NGP I-23 (FERM BP-8202), Hybrid Dorma NGP I-59 (FERM BP-8203), and Hybrid Doma NGP I-60 (FERM BP-8204) were July 998) According to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary [AIST] (formerly, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biotechnology and Industrial Technology Research Institute (address: ⁇ 305—8566, Tsukuba, Ibaraki, Japan) ⁇ Higashi 1-chome 1-1 No. 1 Chuo No. 6)]
  • the international accession numbers (the numbers in parentheses following the international accession numbers are domestic accession numbers) are FERM BP-82 02 [FERP-16891] and FERM BP-8203 [FERM P-1 6892] s FE RM BP-, respectively. 8204 [FERM P-1 6893].
  • the antibody fragment of the anti-nick GPI monoclonal antibody or the anti-Ital GPI monoclonal antibody is a fragment of each of the above-mentioned monoclonal antibodies, and has the same reaction specificity as the original monoclonal antibody. Can be used.
  • Antibody fragments include, for example, Fab, Fab ', F (ab') 2 , or Fv.
  • An immunoassay for glycoprotein I can be performed, for example, by immobilizing the aforementioned anti-nick GPI monoclonal antibody or an antibody fragment thereof on an insoluble carrier as a first antibody, and then immobilizing the immobilized first antibody and a body fluid sample.
  • the fragment is contacted with a labeled second antibody
  • At least one kind of the above-mentioned anti-nick GPI monoclonal antibody or antibody fragment thereof, and another kind of the above-mentioned anti-nick GPI monoclonal antibody or antibody fragment thereof, or the above-mentioned anti-I G1 GP1 monoclonal antibody or antibody thereof When one type of fragment is immobilized on an insoluble carrier, and the immobilized monoclonal antibody or its antibody fragment is brought into contact with a body fluid sample, an agglutination reaction with intact ⁇ 2 glycoprotein I in the body fluid sample occurs.
  • Nick 82 Aggregation reaction can occur only with glycoprotein I. snick in the sample; 82 The amount of glycoprotein I can be measured (aggregation method).
  • the body fluid sample is not pretreated (for example, by chromatographic technique, the intact 2 glycoprotein I and the nick 2 glycoprotein I are previously used). Can be used without any modification to avoid interference with intact; 82 daricopin tin I present in body fluid samples.
  • the anti-nick GPI monoclonal antibody for example, the monoclonal antibody NGP I-59 or the monoclonal antibody NGP I- 60
  • immobilize the antibody fragment on a suitable insoluble carrier first antibody
  • the surface of the insoluble carrier is coated with a suitable blocking agent [eg, serum albumin (BSA) or gelatin, etc.] to avoid non-specific binding between the insoluble carrier and the body fluid sample.
  • a suitable blocking agent eg, serum albumin (BSA) or gelatin, etc.
  • an undiluted body fluid sample is added and contacted for a certain period of time (for example, 5 minutes to 3 hours) and at a certain temperature (for example, 4 ° C to 40 ° C, preferably around room temperature) and reacted (1).
  • a certain period of time for example, 5 minutes to 3 hours
  • a certain temperature for example, 4 ° C to 40 ° C, preferably around room temperature
  • the above-mentioned anti-nick GPI monoclonal antibody of a different kind from the monoclonal antibody used as the above-mentioned primary antibody, a second antibody labeled with its antibody fragment, or the above-mentioned anti-total GPI monoclonal antibody An antibody (for example, monoclonal antibody NGP1-23) or a fragment of the antibody is added to the labeled second antibody, and a fixed time (for example, 5 minutes to 3 hours) and a constant temperature (for example, 4 ° C to 40 ° C) are added. (° C, preferably around room temperature) and react (secondary reaction).
  • the amount of the labeled antibody present on the insoluble carrier is quantified. From that value, the amount of nick ⁇ 2 glycoprotein I in the body fluid sample can be calculated. It is also possible to carry out the primary reaction and the secondary reaction simultaneously.
  • the immunoassay for total 2 glycoprotein I is, for example, an anti-nick 2GP I monoclonal antibody or an antibody fragment thereof instead of the anti-nick 2GP I monoclonal antibody in the above-mentioned assay method for nick ⁇ 2 glycoprotein I. Alternatively, it can be measured by a similar method using an antibody fragment thereof (sandwich method). 02 10610 y
  • the insoluble carrier that can be used in the above-described immunological analysis method by the sandwich method is not particularly limited.
  • a polymer for example, polyethylene, polystyrene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyester, Polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, or polysaccharide), nitrocellulose, paper, or agarose, or a combination thereof.
  • an enzyme for example, alkaline phosphatase, peroxidase, and / S-D-galactosidase.
  • the fluorescent substance include fluorescein isothiosinate, and examples of the luminescent substance include acrylonitrile ester. Alternatively, luciferin or the like can be used.
  • any insoluble carrier generally used in an immunological analysis method using an agglutination reaction of an antigen-antibody reaction can be used.
  • latex particles Particularly, polystyrene latex particles
  • a known method for example, a chemical bonding method (for example, using carbodiimide or dartalaldehyde as a cross-linking agent) or a physical adsorption method can be used.
  • the concentrations of the nick 2 glycoprotein I and I ⁇ tal 82-glycoprotein I can be measured, for example, biochemically.
  • a nick ⁇ 2 glycoprotein I and an intact) ⁇ 2 glycoprotein I can be biochemically assayed by using a perchlorate-treated human plasma on a heparin column [eg, Hi Trap—Heparinco Iumn ( [Pharmacia)]] [Okura et al., Blood, Vol. 91, pp. 411-73 to pp. 419-79. , (1998)].
  • nick 2 glycoprotein I and intact 2 glycoprotein I can be separated by the difference in their elution positions (ie, by the difference in affinity for heparin).
  • the respective amounts of nick ⁇ 2 glycoprotein I and intact S2 glycoprotein I can be measured.
  • the concentration of nick; 52 glycoprotein I in a cerebral infarction patient group and a healthy group was measured.
  • the cerebral infarction patient group is a patient who has undergone cerebral infarction and is regularly followed up.
  • Tris buffer A (5 Ommo I ZL Tris-HCI, 0.15 mol ZL Na CI () containing fragment F (ab ') 2 of monoclonal antibody NGP I-60 at a concentration of 10 gZmL pH 7.5)] Put 100 pieces into each of the microtiter plates (Immu Ion-II; Nippon Dynatech Co., Ltd.) Left for 8 hours. The plate was washed three times with a washing solution W (0.05% Tween-20, -0.5 mol / LNaCI).
  • Tris buffer B [2 Ommo I ZL Tris-HCI, 0.5 mol ZL Na CI, 0.05% Tween—20 (pH 7) containing fragment F (ab ') 2 in an amount of 2 gZmL .6)] 100 jUL was added, and reacted at 25 ° C. for 1 hour.
  • the total (82) glycoprotein I in the cerebral infarction patient group and the healthy person group was measured, and the R value was calculated.
  • the L was placed in each well of a microtiter plate for ISA (Immu Ion-ll; Nippon Dynatech Co., Ltd.) and left at 4 ° C for 18 hours. The plate was washed three times with the washing solution W (0.05% Tween-20, 0.5moI / L NaCI).
  • the TAT (thrombin-antithrombin III complex) value, PIC (plasmin-2 plasmin inhibitor complex) value, and DD (D-D dimer) value were determined for the cerebral infarction patient group by the conventional method.
  • PIC plasmin-2 plasmin inhibitor complex
  • DD D-D dimer
  • the same plasma sample used in Examples 1 and 2 was used.
  • the agglutination method Jatron was used for all of TAT, PIC, and DD.
  • Example 4 Normal reference values for TAT, PIC, and DD measurements in cerebral infarction patients Comparison with
  • cerebral infarction can be diagnosed with high sensitivity.
  • the present invention has been described according to the specific embodiments. However, modifications and improvements obvious to those skilled in the art are included in the scope of the present invention.

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Description

明 細 書 脳梗塞の診断方法 技術分里 f
本発明は、 脳梗塞の診断方法に関する。 本発明は、 特に、 脳梗塞患者の診断及 び治療後の病態観察に利用することができる。
本明細書において、 「ニック ^ 2グリコプロテイン I」 とは、 プロテア一ゼに よリアミノ酸配列の一部に開裂を受けて 2本のポリべプチド鎖からなるものの、 それらがジスルフィ ド結合により結合している jS 2グリコプロテイン Iを意味す る。
また、 本明細書において、 プロテアーゼによる開裂を受けていない^ 2グリコ プロテイン Iを、 前記の 「ニック ;8 2グリコプロテイン I J と区別する必要があ る場合には、 「インタクト；8 2グリコプロテイン I J と称することがある。 従つ て、 本明細書において、 単に Γ 2グリコプロテイン I J と称する場合には、 特 に断わらない限り、 「インタクト 2グリコプロテイン I J を指すものとする。 更に、 本明細書において、 「トータル 2グリコプロテイン I J とは、 前記 ヒック β 2グリコプロテイン I J と前記 「インタクト 2グリコプロテイン I J との両方を含む。 背景技術
β 2グリコプロテイン Iは、 健常人の血液中に約 2 0 O j« g Zmしの濃度で存 在する糖タンパク質であり、 陰性荷電リン脂質と結合する性質を有し、 内因系凝 固の接触相、 A D Pによる血小板凝集、 活性化第 5因子やリン脂質依存性プロト ロンピナーゼ活性、 プロテイン Sとその結合タンパクとの相互反応などを抑制し て抗凝固活性を示すことが知られている。
また、 2グリコプロテイン Iの一部がプロテアーゼにより開裂を受けたニッ ク 8 2グリコプロテイン Iでは、 陰性荷電リン脂質との親和性が、 インタクト^ 2グリコプロテイン Iの親和性から約 1 1 0 0以下に低下することが報告され ている [J. E. Hu n tら， P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 第 90巻， 第 21 41頁〜第 21 45頁 （1 993年） ] 。 様々な病態において、 血管内凝固系が活性化されると、 これに引き続いて線溶系酵素であるプラスミン が活性化されるので、 このプラスミンによって^ 2グリコプロテイン Iが開裂を 受け [大蔵ら， B l o o d, 第 91巻， 第 41 73頁〜第 41 79頁 （1 998 年） ] 、 陰性荷電リン脂質との親和性が低下し、 ニック S 2グリコプロテイン I が血液中に遊離してくるものと考えられる。
脳梗塞は血栓による脳動脈の閉塞により生じる疾患であり、 日本における死因 の第 3位になっている脳卒中の主病型で死亡率の高い疾患である。
従来から、 脳梗塞の診断には CT検査などによる画像診断がなされているが、 これに加えて、 血中の脳梗塞特異的な分子マーカーを測定することが可能となれ ば、 脳梗塞の診断や予知に有効に活用されるものと考えられる。
発明の開示
本発明者は、 脳梗塞を診断 （すなわち、 検出） 可能な方法を開発する目的で銳 意研究したところ、 二、リウ β 2グリコプロテイン Iは健常人に比べ脳梗塞患者で 有意に高値となること、 更に、 トータル 2グリコプロテイン I濃度に対する二 ック yS 2グリコプロテイン I濃度の比率も、 脳梗塞の診断に有効であることを見 出した。
また、 従来の凝固線溶系マーカー、 例えば、 TAT (トロンビン 'アンチ卜口 ンビン III複合体） 値、 P I C (プラスミン■ ひ 2プラスミンインヒビター複合 体） 値、 及び DD (D— Dダイマー） 値では、 健常人における正常基準値と脳梗 塞患者 （あるいは脳梗塞経験患者） の測定値との間に統計学的な有意差が認めら れない。 これに対し、 ニック 2グリコプロテイン I (例えば、 プラスミンによ リ開裂を受けたニック jS 2グリコプロテイン I ) は、 健常人に比べ脳梗塞患者で 統計学的に有意に高値となり、 更に、 トータル; 82グリコプロテイン I濃度に対 するニック j82グリコプロテイン I濃度の比率も、 健常人に比べ脳梗塞患者で統 計学的に有意に高値となるので、 ニック) 82グリコプロテイン I 又はトータル β 2グリコプロテイン I濃度に対するニック) S 2グリコプロテイン I濃度の比率 は、 脳梗塞の診断に有効な高感度のマーカーとなる。
本発明は、 こうした知見に基づくものである。
本発明は、 体液試料中のニック )S 2グリコプロテイン Iの濃度を測定する工程 を含む、 脳梗塞を診断する方法に関する。
また、 本発明は、 体液試料中のニック )8 2グリコプロテイン Iの濃度 （N ) 及 ぴトータル )S 2グリコプロテイン Iの濃度 （T ) を測定し、 トータル) 8 2グリコ プロテイン Iの濃度 （T ) に対するニック yS 2グリコプロテイン Iの濃度 （N ) の比率 （N / T ) を算出し、 その比率を指標とする、 脳梗塞を診断する方法に関 する。
更に、 本発明の好ましい態様においては、 前記の濃度測定を免疫学的測定法又 は生化学的測定法に基づいて行う。
本明細書において、 脳梗塞の診断とは、 主として脳梗塞の検出や予知を意味し、 広義には治療中又は治療後の病態のモニタリング又はスクリーニングも含むもの とする。
本明細書において、 「ニック 2グリコプロテイン I」 とは、 前記のとおり、 プロテア一ゼによリアミノ酸配列の一部に開裂を受けて 2本のポリべプチド鎖か らなるものの、 それらがジスルフィ ド結合により結合している 8 2グリコプロテ イン Iを意味する。 具体的には、 前記 「ニック ;8 2グリコプロテイン I J には、 例えば、 （1 ) プラスミンにより第 Vドメインに開裂 （ヒ卜 2グリコプロティ ン Iにおいては、 第 3 1 7番目のリジン残基と第 3 1 8番目のトレォニン残基と の間で開裂） を受けたニック 2グリコプロテイン I、 及び （2 ) 顆粒球エラス タ一ゼにより第 Vドメインに開裂 （ヒト 2グリコプロテイン Iにおいては、 第 3 1 4番目のァラニン残基と第 3 1 5番目のフ: L二ルァラニン残基との間で開 裂） を受けたニック yS 2グリコプロテイン Iが含まれる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明方法によるサンドィツチ酵素免疫測定法によリ測定した血漿検 体中のニック 2グリコプロテイン I (ニック j8 2 G P I ) 濃度の値を、 健常人 及び脳梗塞患者群別に示した棒ダラフである。
図 2は、 本発明方法によるサンドィツチ酵素免疫測定法にて測定した血漿検体 中のニック 2グリコプロテイン I濃度及びトータル) 82グリコプロテイン I濃 度から算出した比率 Rを、 健常人及び脳梗塞患者群別に示した棒グラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明方法によれば、 脳梗塞を高感度に診断することができる。 脳梗塞は、 血 栓による脳動脈の閉塞により生じる疾患である。 頭蓋内外の脳動脈に、 狭窄ない し閉塞により、 脳循環障害が起こり、 その結果、 脳組織に非可逆的に損傷が起こ ることにより脳梗塞となる。 脳組織の損傷により、 種々の神経症状を呈する。 脳 梗塞は、 生じる血管の閉塞機序により、 塞栓性の心原性脳梗塞、 血栓性のラクナ 梗塞、 あるいは前記 2者に血行力学性因子が加わるァテローム血栓性脳梗塞に分 類される。 その診断は、 従来から、 例えば、 画像診断 （Comp u t e d To mo g r a p y, Ma n e t ι c Re s o n a n c e A n g i o g r a P h y) 所見及び臨床所見 （神経徴候、 等） により行われている [東ら， Me d i c a I T e c h n o l o g y, 第 29卷 2号， 第 138項〜 1 46項 （20 01年） ] 。 また、 脳梗塞 （ラクナ梗塞） の診断への補助的アプローチとして、 凝血学的検査として T AT (トロンビン 'アンチトロンビン III複合体） 値、 P I C (プラスミン■ 2プラスミンインヒビター複合体） 値、 DD (D— Dダイ マ一） 値の測定が行われている [山口ら， 今日の診断指針， 第 3版， 医学書院， 第 499項〜 500項 （ 1 992年） ] 。
本明細書において 「脳梗塞」 とは、 例えば、 上記の診断方法により診断された 疾患病態をいう。 また、 前記の脳梗塞を経験し、 その後の治療経過を観察中の病 態も含まれる。
本発明方法においては、 任意の哺乳動物 （特にはヒト） の任意の体液試料を用 いることができる。 体液試料としては、 例えば、 血液試料、 特には血漿又は血清 を挙げることができ、 特に血漿を用いるのが好ましい。
本発明者は、 後述する実施例に示すとおり、 脳梗塞患者においては、 健常人と 比較して、 体液試料中に含まれているニック 2グリコプロテイン Iの濃度が統 o 計学的に有意に高くなることを見出した。
従って、 本発明方法においては、 検査対象者から採取した体液試料中に含まれ ているニック 2グリコプロテイン Iの濃度を測定することによって、 脳梗塞を 診断することができる。
ニック 2グリコプロテイン Iの濃度は、 例えば、 免疫学的測定法又は生化学 的測定法に基づいて行うことができる。
また、 本発明者は、 後述する実施例に示すとおり、 脳梗塞患者では、 健常人と 比較して、 体液試料中においてトータル^ 2グリコプロテイン Iの濃度 （T ) に 対するニック 2グリコプロテイン Iの濃度 （N ) の比率 （N Z T ) (すなわち、 R値） 力《統計学的に有意に高くなることを見出した。
従って、 本発明方法においては、 検査対象者から採取した体液試料中に含まれ ているニック 2グリコプロテイン Iの濃度 （N ) 及び! ^一タル /8 2グリコプロ ティン Iの濃度 （T ) を測定し、 トータル) 8 2グリコプロテイン Iの濃度 （T ) に対するニック； 8 2グリコプロテイン Iの濃度 （N ) の比率 （N Z T ) (すなわ ち、 R値） を算出し、 そしてその R値を指標とすることによって、 脳梗塞を診断 することができる。
ニック ;8 2グリコプロテイン Iの濃度は、 例えば、 前記の免疫学的測定法又は 生化学的測定法に基づいて行うことができ、 トータル 2グリコプロテイン Iの 濃度も、 同様に、 免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行うことができ る。
前記のニック )5 2グリコプロテイン Iの免疫学的測定は、 例えば、 特開 2 0 0 0 - 2 8 6 0 7号公報に記載の 「インタク ト β 2グリコプロテイン Iと反応しな いが、 ニック； 8 2グリコプロテイン I とは反応するモノクローナル抗体」 （以下、 抗ニック G P Iモノクローナル抗体と称することがある) 又はその抗体フラグメ ントを用いて実施することができる。
前記の抗ニック G P Iモノクローナル抗体としては、 好ましくは、 （1 ) イン タクト； S 2グリコプロテイン Iとは反応せず、 ニック 2グリコプロテイン Iと 反応し、 しかも、 ニック) 8 2グリコプロテイン Iの第 Vドメインに反応する [特 に、 ヒトニック) S 2グリコプロテイン Iにおける （ァミノ末端側から数えて） 第 242番目のアミノ酸残基〜第 326番目のアミノ酸残基からなる領域にェピト ープを有する] モノクローナル抗体、 より好ましくは、 ハイプリ ドーマ NGP I 一 59から分泌されるモノクローナル抗体 NGP I—59、 あるいは、 （2) ィ ンタク ト^ 2グリコプロテイン Iとは反応せず、 ニック^ 2グリコプロテイン I と反応し、 しかも、 ニック; 82グリコプロテイン Iの第 I ドメイン〜第 IVドメイ ンからなる領域に反応する [特に、 ヒトニック) 82グリコプロテイン Iにおける (ァミノ末端側から数えて） 第 1番目のアミノ酸残基〜第 241番目のアミノ酸 残基からなる領域にェピトープを有する] モノクローナル抗体、 より好ましくは、 ハイブリ ドーマ NGP I一 60から分泌されるモノクローナル抗体 NGP I -6 0を挙げることができる。
前記のトータル yS 2グリコプロテイン Iの免疫学的測定は、 例えば、 特開 20 00-28607号公報に記載の 「インタクト β 2グリコプロテイン Iと反応し、 しかもニック j82グリコプロテイン Iとも反応するモノクローナル抗体」 （以下、 抗トータル GP Iモノクローナル抗体と称することがある） 又はその抗体フラグ メントを用いて実施することができる。
前記の抗トータル GP Iモノクローナル抗体としては、 インタク卜 2グリコ プロテイン I (特には、 ヒトインタク卜 S 2グリコプロテイン I ) 、 及びニック β 2グリコプロテイン I [特には、 第 Vドメインに開裂を受けたヒトニック β 2 グリコプロテイン I ] と反応し、 好ましくはインタクト i82グリコプロテイン I 及びニック 2グリコプロテイン Iの第 I ドメイン〜第 IVドメインからなる領域
[例えば、 ヒ卜ニック 2グリコプロテイン Iにおける （ァミノ末端側から数え て） 第 1番目のアミノ酸残基〜第 241番目のアミノ酸残基からなる領域] にェ ピ! ^一プを有するモノクローナル抗体が好ましく、 ハイプリ ドーマ NGP 1—2 3から分泌されるモノクローナル抗体 NG P I一 23がより好ましい。
なお、 ハイプリ ドーマ NGP I— 23 (FERM BP— 8202) 、 ハイブ リ ドーマ NGP I— 59 (FERM BP— 8203) 、 及びハイブリ ドーマ N GP I— 60 (FERM BP— 8204) は、 平成 10年 （1 998年） 7月 9曰に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター [ (旧） 工業技術 院生命工学工業技術研究所 （あて名 ： 〒 305— 8566 日本国茨城県つくば 巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) ] に国内寄託されたものであり、 平成 1 4年
(2002年） 1 0月 1 1日から国際寄託に移管されている。 国際受託番号 （国 際受託番号に続く [] 内は国内受託番号） は、 それぞれ、 FERM BP— 82 02 [F E R P— 1 6891] 、 FERM BP— 8203 [FERM P -1 6892] s F E RM BP— 8204 [FERM P— 1 6893] であ る。
抗ニック G P Iモノクローナル抗体又は抗 I タル G P Iモノクローナル抗体 の抗体フラグメントとしては、 前記の各モノク口一ナル抗体のフラグメントであ つて、 しかも、 もとの各モノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体フラ グメントを用いることができる。 抗体フラグメントには、 例えば、 Fa b、 F a b'、 F (a b' ) 2、 又は Fv等が含まれる。
ニック； 82グリコプロテイン Iの免疫学的測定法は、 例えば、 前記の抗ニック G P Iモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第 1抗体として不溶性担 体に固定化し、 この固定化された第 1抗体と体液試料とを接触させ、 続いて、 第 1抗体とは別種の前記の抗ニック G P Iモノクローナル抗体若しくはその抗体フ ラグメントに標識を付した第 2抗体、 又は前記の抗トータル GP Iモノクローナ ル抗体若しくはその抗体フラグメン卜に標識を付した第 2抗体と接触させると、 前記の固定化第 1抗体一ニック 2グリコプロテイン I複合体と結合した前記第 2抗体又は前記の固定化第 1抗体一ニック 2グリコプロテイン I複合体と結合 しなかつた前記第 2抗体の前記標識からの信号を検出することができるので、 体 液試料中のニック) 82グリコプロテイン Iの量を測定することができる （サンド イッチ法） 。
また、 前記の抗ニック G P Iモノクローナル抗体又はその抗体フラグメント少 なくとも 1種類と、 別種の前記の抗ニック G P Iモノクローナル抗体若しくはそ の抗体フラグメント又は前記の抗 I ^一タル GP 1モノクローナル抗体若しくはそ の抗体フラグメント 1種類とを不溶性担体に固定化し、 これらの固定化したモノ ク口ーナル抗体又はその抗体フラグメン卜と体液試料とを接触させると、 体液試 料中のインタクト β 2グリコプロテイン Iとは凝集反応を起こさず、 ニック) 82 グリコプロテイン Iとの間でのみ凝集反応を起こさせることができるので、 体液 s 試料中のニック; 82グリコプロテイン Iの量を測定することができる （凝集法） 。 従って、 前記のニック) 82グリコプロテイン Iの免疫学的分析方法においては、 体液試料を前処理せずに （例えば、 クロマトグラフィーの手法で、 予めインタク 卜 2グリコプロテイン Iとニック 2グリコプロテイン Iとを分離操作するこ となく） 、 そのまま使用しても、 体液試料中に存在するインタクト ;82ダリコプ 口ティン Iの妨害を避けることができる。
サンドイッチ法を利用するニック； S 2グリコプロテイン Iの免疫学的分析方法 では、 具体的には、 前記の抗ニック GP Iモノクローナル抗体 （例えば、 前記の モノクローナル抗体 NGP I -59又はモノクローナル抗体 NGP I— 60) 又 はその抗体フラグメントを適当な不溶性担体に固定化する （第 1抗体） 。 次に、 不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、 適当なブロッキング剤 [例えば、 ゥシ血清アルブミン （BSA) やゼラチン等] で不溶性担体の表面を 被覆する。 続いて、 未希釈の体液試料を加えて一定時間 （例えば、 5分〜 3時 間） 及び一定温度 （例えば、 4°C〜40°C、 好ましくは室温付近） で接触させ反 応させる （1次反応） 。 続いて、 前記第 1次抗体として用いたモノクローナル抗 体とは別種の前記の抗ニック GP Iモノクローナル抗体若しくはその抗体フラグ メントに標識を付した第 2抗体、 又は前記の抗トータル GP Iモノクロ一ナル抗 体 (例えば、 モノクローナル抗体 NGP 1 -23) 若しくはその抗体フラグメン 卜に標識を付した第 2抗体を加えて一定時間 （例えば、 5分〜 3時間） 及び一定 温度 （例えば、 4°C〜40°C、 好ましくは室温付近） で接触させ反応させる （2 次反応） 。 これを適当な洗浄液 （例えば、 界面活性剤を含む生理食塩水） で洗浄 してから、 不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。 その値から、 体液 試料中のニック ^ 2グリコプロテイン Iの量を算出することができる。 また、 1 次反応と 2次反応とを同時に行うことも可能である。
トータル 2グリコプロテイン Iの免疫学的測定法は、 例えば、 前記のニック β 2グリコプロテイン Iの測定法において、 抗ニック 2GP Iモノクローナル 抗体又はその抗体フラグメントの代わりに抗! ^一タル 2GP Iモノクローナル 抗体又はその抗体フラグメントを用いて同様の方法により測定することが可能で ある （サンドイッチ法） 。 02 10610 y 前記のサンドイッチ法による免疫学的分析方法に使用することのできる不溶性 担体は特に限定されるものでなく、 例えば、 高分子 （例えば、 ポリエチレン、 ポ リスチレン、 ポリプロピレン、 ポリ塩化ビニル、 ポリエステル、 ポリアクリロニ トリル、 フッ素樹脂、 架橋デキストラン、 又はポリサッカライド等） 、 ニトロセ ルロース、 紙、 若しくはァガロース、 又はこれらの組み合わせ等を例示すること ができる。 標識物質としては、 酵素、 蛍光物質、 又は発光物質を使用するのが有 利である。 酵素としては、 例えば、 アルカリホスファターゼ、 ペルォキシダーゼ、 又は /S— D—ガラクトシダーゼ等、 また、 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレ セインイソチオシァネー卜等、 また、 発光物質としては、 例えば、 ァクリジニゥ 厶エステル又はルシフヱリン等を使用することができる。
凝集反応を利用する免疫学的分析方法において、 不溶性担体としては、 一般に 抗原抗体反応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任意の 不溶性担体を用いることができ、 例えば、 ラテックス粒子 （特には、 ポリスチレ ンラテックス粒子） を挙げることができる。 モノクローナル抗体を不溶性担体に 固定化させるには、 公知の方法、 例えば、 化学結合法 （架橋剤として、 例えば、 カルポジイミド又はダルタルアルデヒド等を用いる） 又は物理吸着法を用いるこ とができる。
前記のニック 2グリコプロテイン I及び I ^一タル 8 2グリコプロテイン Iの 濃度は、 例えば、 生化学的に測定することもできる。 例えば、 ニック β 2グリコ プロテイン I及びインタクト) δ 2グリコプロテイン Iの生化学的測定法は、 過塩 素酸処理したヒ卜血漿を、 へパリンカラム 〔例えば、 H i T r a p— H e p a r i n c o I u m n (フアルマシア社） 〕 を用いたァフィ二ティークロマトグラ フィ一により分画することで実施することができる [大蔵ら， B l o o d , 第 9 1巻， 第 4 1 7 3頁〜第 4 1 7 9頁， （1 9 9 8年） ] 。 この際、 ニック 2グ リコプロテイン I及びインタク卜 2グリコプロテイン Iは、 それらの溶出位置 の違いにより （すなわち、 へパリンに対するァフィ二ティーの違いにより） 、 分 離が可能となる。 溶出フラクションのタンパク定量を行うことにより、 ニック β 2グリコプロテイン I及びインタクト S 2グリコプロテイン Iのそれぞれの量を 測定することができる。 前記のニック^ 2グリコプロテイン I及びインタクト^ TJP02/10610
IU
2グリコプロテイン Iのそれぞれの量からトータル 2グリコプロテイン Iの濃 度を算出し、 これらの値からトータル) 82グリコプロテイン I濃度 （T) に対す るニック) 82グリコプロテイン I濃度 （N) の比率 （NZT = R) を求めること ができる。 実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。
実施例 1 ： ニック) S 2グリコプロテイン Iの測定
本実施例では、 脳梗塞患者群及び健常人群におけるニック ;52グリコプロティ ン Iの濃度を測定した。 ここで、 脳梗塞患者群は、 脳梗塞経験者で定期的に経過 観察をしている患者である。
前記の脳梗塞患者よリ採取された血漿検体及び健常人よリ採取された血漿検体 を試料とし、 以下の方法にてニック) S 2グリコプロテイン Iの測定を行った。 モノクローナル抗体 NGP I— 60の断片 F (a b' ) 2を 10 gZmLの 濃度で含有する卜リス緩衝液 A 〔5 Omm o I ZL T r i s-HC I , 0. 1 5mo l ZL N a C I (p H 7. 5) 〕 1 00〃しを96ゥェル巳 1_ 13 用 マイクロタイタープレート （ I mmu I o n— II ； 日本ダイナテック株式会社） の各ゥ; cルに入れて、 4°Cで 1 8時間放置した。 そのプレートを洗浄液 W (0. 05%Twe e n-20, -0. 5mo l /L N a C I ) で 3回洗浄した。 こ のようにして抗体を感作したプレートのゥエルに、 ニック^ 2グリコプロテイン Iを 200 n gZmし、 1 00 n gZmL、 50 n gZmし、 25 n g/m L 1 2. 5 n gZmL及び 6. 25 n gZm Lの濃度になるように卜リス緩衝液 B 〔20mmo l ZL T r i s— HC I , 0. 5mo l /L N a C I , 0. 0 5 %T we e n— 20 (p H 7. 6) 〕 にそれぞれ添加して調製したスタンダー ド試料 1 00 L、 あるいは、 検体血漿を同様のトリス緩衝液 Bにて 5倍に希釈 した検体試料 1 00 Lを加え、 25 °Cで 2時間反応させた。
次に、 前記洗浄液 W (0. 05%Twe e n-20, 0. 5mo I /L N a C I ) で 3回洗浄した後に、 ビォチン標識モノクローナル抗体 N G P I— 23の 断片 F (a b' ) 2を 2 gZmLの量で含有するトリス緩衝液 B [2 Ommo I ZL T r i s -H C I , 0. 5mo l ZL N a C I , 0. 05%T w e e n— 20 (p H 7. 6) 〕 1 00jU Lを加え、 25 °Cで 1時間反応させた。 続い て、 前記洗浄液 W (0. 05%Twe e n-20, 0. 5mo \ XL N a C I ) で 3回洗浄した後、 トリス緩衝液 Bにて 2000倍に希釈したペルォキシダ ーゼ標識アビジン （ダコ社） 1 00 1_を加え、 25°Cで 1時間反応させた。 前 記洗浄液 Wで 3回洗浄した後、 酵素基質液 [1 0mmo l ZLフ: ノ—ル Z 0. 5mmo l ZL 4—ァミノアンチピリン ZO . 005 %過酸化水素を含む 50 mmo l ZL T r i s - H C I , 0. 1 5 m o I L N a C I (p H 7. 5) ] を各ゥエルに 200 Lずつ加え、 各ゥエルの 492 nmにおける吸光度 をマイクロプレートリーダー （MPR A 4 i型；東ソ一） で測定した。 各濃度 のスタンダード試料の吸光度をもとに検量線を作製し、 この検量線よリ検体血漿 中のニック) δ 2グリコプロテイン Iの濃度を求めた。
結果を表 1及び図 1に示す。 各群のニック )S 2グリコプロテイン I濃度の平均 値土 S Dは、 健常人群 （44例） が 58. 60±38. 98 n gZmL、 脳梗塞 患者群 （63例） が 1 96. 69±1 45. 75 n g Zm Lであった。 健常人に 対して脳梗塞患者群は P<0. 001であり、 統計学的に有意な差が認められた。 健常人 脳梗塞患者
濃度（n /oiL) 58.60+38.98 196.69±145.75 統計学的有意差
健常人 V s 脳梗塞 p<0. 00 実施例 2 ： I ^一タル; g 2グリコプロテイン I及び R値の測定
本実施例では、 脳梗塞患者群及び健常人群におけるトータル) 82グリコプロテ イン Iを測定し、 R値を算出した。
実施例 1と同じ血漿検体を試料として使用し、 以下の方法にてトータル^ 2グ リコプロテイン 1の測定を行った。 IZ モノクローナル抗体 NGP I— 23を 5 jU gZmLの濃度で含有する卜リス緩 衝液 A 〔5 Ommo I ZL T r i s - H C I , 0. 1 5mo l Zし N aC I (p H 7. 5) ] 50 Lを 96ゥエル Eし I S A用マイクロタイタープレート ( I mmu I o n-ll ； 日本ダイナテック株式会社） の各ゥヱルに入れて、 4°C で 1 8時間放置した。 そのプレートを前記洗浄液 W (0. 05%Twe e n-2 0， 0. 5mo I /L Na C I ) で 3回洗浄した。 このようにして抗体を感作 したプレートのゥエルに、 インタク ト S 2グリコプロテイン Iを 200 n g/m し、 1 00 n gZmし、 50 n /mLN 25 n g/mし、 1 2. 5 n / m L 及び 6. 25 n gZmLの濃度になるようにトリス緩衝液 B 〔20mmo I ZL T r i s— H C I , 0. 5mo I XL N a C I , 0. 05%Twe e n-2 0 (p Hフ. 6) 〕 にそれぞれ添加して調製したスタンダード試料 50〃 L、 あ るいは、 検体血漿を同様の卜リス緩衝液 Bにて 8000倍に希釈した検体試料 5 0 Lを加え、 25 °Cで 2時間反応させた。
次に、 前記洗浄液 W (0. 05%Twe e n-20, 0. 5mo l ZL N a C I ) で 3回洗浄した後に、 ビォチン標識抗ヒト )S 2グリコプロテイン Iゥサギ ポリクローナル抗体 （セダレーン社） を 2. 5 i gZmLの量で含有するトリス 緩衝液 B 〔2 Ommo I ZL T r i s -H C I , 0. 5mo l ZL Na C I , 0. 05%Twe e n-20 (p H 7. 6) 〕 50〃 Lを加え、 25°0で1時間 反応させた。 続いて、 前記洗浄液 W (0. 05 %T we e n— 20， 0. 5mo I ZL N a C I ) で 3回洗浄した後、 卜リス緩衝液 Bにて 2000倍に希釈し たペルォキシダーゼ標識アビジン （ダコ社） 1 00 Lを加え、 25°Cで 1時間 反応させた。 前記洗浄液 Wで 3回洗浄した後、 酵素基質液 [1 Ommo I ZLフ ェノール ZO. 5mmo I XL 4—ァミノアンチピリン 0. 005 %過酸化 水素を含むトリス緩衝液 A 〔5 Ommo I ZL T r i s-HC I , 0. 1 5 m o l ZL N a C I (p H 7. 5) 〕 ] を各ゥヱルに 200 jt Lずつ加え、 各ゥ エルの 492 nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダー （MPR A4 i 型；東ソ一） で測定した。 各濃度のスタンダード試料の吸光度をもとに検量線を 作製し、 この検量線より検体血漿中のトータル) 82グリコプロテイン I濃度を求 めた。 前記実施例 1で測定したニック )32グリコプロテイン I濃度 （N) を用いて、 本実施例で測定したトータル ;82グリコプロテイン I濃度 （T) に対するニック 2グリコプロ亍イン I濃度 （N) の比率 （NZT = R) を個々の検体について 算出した。 その結果を表 2及び図 2に示す。 健常人に対して脳梗塞患者群では p <0. 001 となり、 統計学的に有意な差が認められた。
表 2
健常人 脳梗塞患者
0.44±0.22 1.30±1.15 統計学的有意差
健常人 V s 脳梗塞： p <0. 001 実施例 3 ： TAT、 P I C、 及び DD測定値とニック 82グリコプロテイン I値 の相関性の検定
本実施例においては、 脳梗塞患者群に関して、 従来法によって TAT (卜ロン ビン■アンチトロンビン III複合体） 値、 P I C (プラスミン■ 2プラスミン インヒビター複合体） 値、 及び DD (D— Dダイマー） 値を測定し、 ニック^ 2 グリコプロテイン I値との相関性の検討を行った。
本実施例でも、 実施例 1及び 2で用いた同じ血漿検体を使用した。 前記凝固線 溶系マーカーの測定は、 TAT、 P I C、 及び DDのいずれに関しても凝集法 (ャトロン） を使用した。
その結果、 ニック 2グリコプロテイン Iとの相関は、 それぞれ以下の通りで あった。
T AT値： r =0. 01 7、
P I C値： r =-0. 028、
DD値： r =-0. 01 8。
すなわち、 いずれの測定値ともニック 2グリコプロテイン Iとの相関性は認 められなかった。
実施例 4 ：脳梗塞患者群の TAT、 P I C、 及び DD測定値における正常基準値 との比較
実施例 3で測定した T AT、 P I C及び DD測定値を用いて、 これらの値と正 常基準値 （各試薬の添付文書に記載された参考基準値による） との比較を行った。 結果を表 3に示す。
表 3
脳梗塞患者
< 3 ng/mL 1 · 87+3.59 ng/mL
D D く 1 g/mL 0.84±1.34 g/mL
P P I く 0.8jU /!nL 1.36±1.02"g/mL その結果、 脳梗塞患者群における T A T、 P I C及び DDの値はいずれも正常 基準値とほとんど統計学的有意差が認められなかった。 産業上の利用可能性
本発明方法によれば、 脳梗塞を高感度で診断することができる。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

10 請 求 の 範 囲
1. 体液試料中のニック β 2グリコプロテイン Iの濃度を測定する工程を含む、 脳梗塞を診断する方法。
2. 体液試料中のニック S 2グリコプロテイン Iの濃度 （Ν) 及びトータル )82 グリコプロテイン Iの濃度 （Τ) を測定し、 トータル )S 2グリコプロテイン Iの 濃度 （T) に対するニック 2グリコプロテイン Iの濃度 （N) の比率 （NZ T) を算出し、 その比率を指標とする、 脳梗塞を診断する方法。
3. 濃度測定を免疫学的測定法又は生化学的測定法に基づいて行う、 請求項 1又 は 2に記載の方法。
4. 免疫学的測定法において、 インタクト^ 2グリコプロテイン Iと反応しない が、 ニック; S 2グリコプロテイン Iとは反応するモノクローナル抗体又はその抗 体フラグメントを少なくとも用いる、 請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の方法 c
5. モノクローナル抗体として、 （1 ) インタク卜 S 2グリコプロテイン Iとは 反応せず、 ニック 2グリコプロテイン Iと反応し、 しかも、 ニック jS 2グリコ プロテイン Iの第 Vドメインに反応するモノクローナル抗体、 あるいは、 （2) インタク ト 82グリコプロテイン Iとは反応せず、 ニック β 2グリコプロテイン
Iと反応し、 しかも、 ニック 2グリコプロテイン Iの第 I ドメイン〜第 IVドメ インからなる領域に反応するモノクローナル抗体を少なくとも用いる、 請求項 4 に記載の方法。
6. 生化学的測定法において、 へパリンカラムを用いる、 請求項 1 ~3のいずれ か一項に記載の方法。
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