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WO2003031984A2 - Verfahren zur sequenzanalyse von polypeptiden - Google Patents

Verfahren zur sequenzanalyse von polypeptiden Download PDF

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WO2003031984A2
WO2003031984A2 PCT/EP2002/011257 EP0211257W WO03031984A2 WO 2003031984 A2 WO2003031984 A2 WO 2003031984A2 EP 0211257 W EP0211257 W EP 0211257W WO 03031984 A2 WO03031984 A2 WO 03031984A2
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WO
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amino acid
halogen
detection
phenyl isothiocyanate
reaction
Prior art date
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PCT/EP2002/011257
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WO2003031984A3 (de
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Christian Wurzel
Ralf KRÜGER
Barbara Zu Lynar
Barbara Popke
Brigitte Wittmann Liebold
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CONSEQUENCE GmbH
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides
    • G01N33/6824—Sequencing of polypeptides involving N-terminal degradation, e.g. Edman degradation

Definitions

  • the conversion rates of the individual sub-steps are of crucial importance for the analysis and identification of the polypeptide.
  • the highest possible turnover rate preferably of over 90% and preferably of over 95%, should be achieved in order to be able to clearly identify a large number of degradation stages.
  • the incomplete degradation means that in the subsequent degradation steps, the amino acid that is now split off is overlaid by the background of the amino acids from the previous steps, the so-called overlap, so that the sequence can no longer be clearly identified.
  • protein sequencers are currently being used, such as, for example, the “Procise cLc” device from Applied Biosystems, Foster City, USA, or the “Knauer 910” device from Knauermaschinemaschinemaschine, Berlin, used. (Technical descriptions of the devices can be found in the respective operating instructions [12, 13]).
  • the present invention has for its object to provide a compound which can be used instead of the phenyl isothiocyanate used in the prior art in the context of Edman degradation and overcomes the disadvantages described in the prior art.
  • Another object on which the present invention is based is that a reagent is provided which replaces the phenyl isothiocyanate used in the prior art in the context of Edman degradation and is intended to further reduce the detection limit for the overall process compared to the prior art.
  • At least one of the radicals R] to R 5 is a halogen and / or contains a halogen
  • the object is achieved in a second aspect by the use of 3,5-bis (trifluoromethyl) phenyl isothiocyanate for the derivatization and / or for the detection of primary and / or secondary amines.
  • the object is achieved according to the invention by using a halogen-substituted phenyl isothiocyanate of the formula
  • the derivatized amine is detected and / or identified as a further step, as is provided in the context of the method according to the invention.
  • Derivatized amine as used herein is the primary or secondary amine which is reacted with the halogen substituted phenyl isothiocyanate as described herein, or the reaction product thereof.
  • anilinothiazolinone amino acid is extracted from the reaction mixture and converted into a phenylhydantoin amino acid.
  • the amino acid derivative is detected by means of an ECD detector, UV detection, retention time, mass information and / or retention time and mass information, or by means of negative chemical ionization.
  • the 3,5-bis (trifluoromethyl) phenyl isothiocyanate according to the invention has a high proportion of fluorine atoms in the molecule and this by suitable coupling to detectors such as ECD (electron capture detection) or by negative chemical ionization (NCI) or chemical ionization (CI) can be specifically detected.
  • detectors such as ECD (electron capture detection) or by negative chemical ionization (NCI) or chemical ionization (CI)
  • HPLC a separation and characterization of the amino acid derivatives obtained by means of gas chromatography with reference to standardized could Retention times take place.
  • the same also applies in principle to those of the phenysothiocyanates disclosed or described herein which have fewer fluorine atoms but still have the above physico-chemical properties.
  • the halogen-substituted phenyl isothiocyanate disclosed herein can react with a primary amine of a peptide, in particular from the terminal amino acid of the peptide and, after cleavage of the said terminal amino acid, can be detected selectively. It is within the scope of the present invention that the reaction with the halogen-substituted phenyl isothiocyanate described herein is not limited to the reaction with peptides. Rather, a reaction generally takes place with primary or secondary amines. In the broadest sense, this reaction is therefore a derivatization reaction of primary and / or secondary amines.
  • the ratio of signal to noise is increased many times over, so that a much more sensitive analysis of the target substances, ie of primary and secondary amines, is made possible.
  • the detection of primary and secondary amines is to be carried out down to the attomole range or in even smaller amounts, and thus ultimately possible to identify the primary or secondary amine containing compound.
  • the halogen-substituted phenyhsothiocyanates described herein primary and secondary amines are now accessible for direct gas chromatographic measurement.
  • the sample to be analyzed can be any sample. Accordingly, the sample can come from the technical or analytical area.
  • the analytical area includes in particular the areas of biology, biochemistry and medicine as well as forensics as well as that of process technology.
  • the samples are preferably of biological origin and in particular blood, urine, stool, lymph fluid or cerebrospinal fluid.
  • the sample can also be an air sample, a soil sample, or a water sample.
  • the sample can also be a solid substance, such as hair or a solid sample in general.
  • the amine contained in the sample in particular primary or secondary amine, or presumably contained therein primary and / or secondary amine, can preferably be such an amine as is used in starting materials for the production of industrial products, such as solvents, for example.
  • amines as they can be detected or detected according to the invention also represent constituents or reactive groups of pharmaceuticals, including drugs.
  • Amines as they can be detected or detected according to the invention also represent, for example, various metabolic products. Of particular interest in In connection with the present invention are primary and secondary amines which are biogenic amines.
  • biogenic amines can be detected particularly preferably or the samples containing them can be analyzed using the method according to the invention.
  • Tyramine, dopamine, noradrenaline and adrenaline which are neurotransmitters, hormones or tissue hormones and which are the decarboxylation product of the amino acid tyrosine.
  • Tryptamine, serotonin and melatonin which are neurotransmitters, hormones and tissue hormones and which are the decarboxylation product of tryptophan.
  • Aminoacteon which arises from L-2-aminoacetoacetic acid and is a precursor for vitamin B12.
  • 5- Amino-4-oxovaleric acid which is formed from succinylglycine and is a precursor for porphyrins.
  • Cadaverine which is made from L-lysine and is a precursor for alkaloids.
  • Dopamine which is derived from L-dopa and is a neurotransmitter, precursor for the catecholamines, L-noradrenaline and L-adrenaline, and is also a proto-alkaloid.
  • Serotonin which arises from 5-hydroxy-L-tryptophan and is a neurotransmitter and precursor of the hormone melatonin. Tryptamine, which arises from L-tryptophan and causes contraction of the smooth muscles and has a growth-promoting effect on plants. Tyramine, which arises from L-tyrosine and causes the contraction of the smooth muscles.
  • Example 1 Determining the clutch speed of FM-PITC:
  • HPLC system was used for detection purposes:

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft. die Verwendung eines Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates der Formel worin R, bis RS jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Wasserstoff, Halogen, Alkyl und Halogenalkyl umfasst, wobei Halogen ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fluor, Chlor, Brom and Jod umfasst, und Alkyl ausgewählt ist aus der Gruppe, die Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl umfasst; unter der Voraussetzung, dass wenigstens einer der Reste R, bis Rs ein Halogen ist. und/oder ein Halogen enthalt, zur Derivatisierung und/oder zum Nachweis von primären und/oder sekundären Aminen in der Sequenzanalyse von Polypeptiden.

Description

Verfahren zur Sequenzanalyse von Polypeptiden
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenzbestimmung von Polypeptiden.
Die Sequenzanalyse von Polypeptiden und Proteinen ist für die moderne Biotechnologie von zentraler Bedeutung. Obgleich mit zunehmender Kenntnis des Genoms von verschiedenen Organismen, einschließlich des Menschen, die Aminosäuresequenzen von Polypeptiden und Proteinen auf der Grundlage der Nukleinsäuresequenz vorhergesagt werden können, kommt der Polypeptidsequenzanalyse immer noch insoweit eine zentrale Bedeutung zu, als dass ausgehend von einer vorliegenden Probe die darin enthaltenen Polypeptide sequenziert oder zumindest ansequenziert werden müssen, um auf der Grundlage des ansequenzierten N-Terminus des Polypeptids eine Sonde zu konzipieren, die dann für das Screenen der Nukleinsäuren unter Rückgriff auf den umfangreichen Nukleinsäuredatenbestand, sei es in vivo, in vitro oder in silico, verwendet wird, um die mutmaßliche Gesamtnukleinsäuresequenz und damit auch die Gesamtsequenz des Proteins zu bestimmen.
Daneben besteht nach wie vor der Bedarf und die Notwendigkeit, Polypeptide oder Proteine zu sequenzieren, insbesondere dann, beispielsweise bei dem Aufsuchen von individuenspezifischen Abweichungen von der erwarteten oder in einer Population besonders verbreiteten Sequenz. Allgemein wird die Proteinanalyse in der jüngeren Zeit in der sogenannten Proteomanalyse verstärkt angewandt [1 Kahn, 1995]. Hierbei werden die Gesamtheit oder Teile, z.B. die Kemfraktion, der exprimierten Proteine eines Organismus oder eines Zelltypes zu einer bestimmten Wachstumsphase, unter dem Einfluss von Medikamenten oder in krankhaft verändertem Zustand untersucht. Die Proteine werden mit bekannten Verfahren, zum Beispiel der zwei dimensionalen Gelelektrophorese [2 Klose 1995], aufgetrennt und die Proteine mit geeigneten Färbemethoden im Gel sichtbar gemacht. Unterschiede im Proteinmuster zeigen sich beispielsweise zwischen den Wachstumsphasen oder bei krankhafter Veränderung. Es gilt hierbei z.B. die Proteine zu identifizieren, die eine unterschiedliche Expressionsrate aufweisen oder durch die krankhaften Veränderungen in der Zelle modifiziert werden [3 Brockstedt 1998].
Ein erstes Verfahren zur Sequenzanalyse von Polypeptiden stellt das Verfahren von Sanger dar, bei dem l-Fluor-2,4-dinitrobenzol zur Markierung N-terminaler Aminosäuren verwendet wurde. Nach vollständiger hydrolytischer Zerlegung des Proteins in einzelne Aminosäuren wurde die markierte (terminale) Aminosäure über chromatographische Techniken identifiziert. Dieses Verfahren war insbesondere bei größeren Peptiden mit Nachteilen verbunden, die daraus resultierten, dass die Polypeptide über partielle Hydrolyse oder enzymatischen Verdau in kleine Fragmente zerlegt und dann jeweils die N- terminale und C-terminale Aminosäure der Fragmente bestimmt und zusätzlich die Aminosäurezusammensetzung mittels Aminosäureanalyse ermittelt werden musste.
Ein gegenüber dem Sanger- Verfahren deutlich mit Vorteilen verbundenes Verfahren stellt der sog. Edman- Abbau dar, bei dem im Rahmen einer zyklischen Reaktion die jeweils N-terminale Aminosäure einer Peptidkette nach der anderen abgespalten wird. [4 Edman 1950]. Im Rahmen des Edman-Abbaus wird unter basischen Bedingungen Phenylisothiocyanat an den Aminoterminus der Polypeptidkette angekuppelt. Es bildet sich ein Phenylthiocarbamyl- Polypeptid (PTC-Polypeptid). Im zweiten Schritt wird die endständige derivatisierte Aminosäure selektiv mit Hilfe von wasserfreier Säure, z.B. Trifluoressigsäure, abgespalten und dabei in das Anilinothiazolinon-Derivat (ATZ-Derivat) der Aminosäure umgewandelt. Im folgenden wird die solchermaßen derivatisierte AS extrahiert und mit Hilfe von wässriger Säure in das stabilere Phenylthiohydantoin-Derivat (PTH-Derivat) der Aminosäure isomerisiert. Das PTH-Derivat der Aminosäure wird in den heutzutage verfügbaren Sequenzierautomaten anschließend automatisch in ein Hochdruckflüssigchromatographie-System injiziert. Hier erfolgt die Auftrennung der Aminosäuren nach ihrer Retentionszeit. Die Detektion erfolgt durch UV-Absorption. Der beschriebene Ablauf wird zyklisch wiederholt, so dass sukzessive die Primärstruktur der Polypeptidkette analysiert werden kann.
Für die Analyse und die Identifikation des Polypeptids sind die Umsatzraten der einzelnen Teilschritte, z.B. Kupplung, Abspaltung oder Extraktion des sog. Edman-Abbaus, von entscheidender Bedeutung. Für den Gesamtprozess sollte dabei eine möglichst hohe Umsatzrate, bevorzugterweise von über 90% und bevorzugtererweise von über 95% erreicht werden, um eine Vielzahl von Abbaustufen eindeutig identifizieren zu können. Bei geringeren Umsatzraten führt der unvollständige Abbau dazu, dass in den darauf folgenden Abbauschritten die nun abgespaltene Aminosäure durch den Hintergrund der Aminosäuren aus dem vorhergehenden Schritten überlagert wird, dem sogenannten Overlap, so dass die Sequenz nicht mehr eindeutig identifizierbar ist. Ein Überblick über die Proteinsequenzierung findet sich in [5,6]. Das Verfahren wurde bis zur Einfuhrung von Sequenzierautomaten durch Edman und Begg im Jahre 1967 [7 Edman 1967] manuell durchgeführt. Im Laufe der Jahre wurden mannigfaltige technische Verbesserungen an den Automaten vorgenommen. Hervorzuheben sind die Einführung von totvolumenfreien Ventilsystemen [8 Wittmann-Liebold 1973], mit denen die einzelnen Reagenzien und Lösemitteln im Automaten unter Luftabschluss und ohne dass Flüssigkeitsreste in den Leitungen verbleiben, dosiert werden. Mit der On-line-Konvertierung [9 Wittmann-Liebold 1976] und der On-line Injektion [9 Wittmann-Liebold 1985] konnte der gesamte chemische Prozess und nicht nur ein Teil davon vollständig automatisiert werden. Hierdurch konnten Verluste durch manuelle Handhabung minimiert und auch die sauerstoffempfindliche Konvertierung vollständig unter Luftabschluss durchgeführt werden, was zu insgesamt höheren Umsatzraten führte. Mit der Entwicklung der Reaktorcartridge und der damit verbundenen Einführung der Gasphasen-Sequenzierung, bei der einige Reagenzien gasförmig dosiert werden [11 Hewick 1981], gelang es die Nebenprodukte der Reaktion zu verringern und damit die Analyse empfindlicher durchzuführen. Alle technischen Verbesserungen hatten letztlich das Ziel, die Empfindlichkeit der Analyse zu erhöhen. So waren anfänglich Mikromolmengen eines gereinigten Proteins für eine erfolgreiche Analyse erforderlich. Inzwischen werden routinemäßig Analysen im Bereich von wenigen Picomol durchgeführt. Der eigentliche chemische Prozess blieb über die Jahre jedoch nahezu unverändert.
Für die Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen und Peptiden mittels Edman-Abbau werden derzeit Proteinsequenzierautomaten, wie beispielsweise das Gerät „Procise cLc" der Firma Applied Biosystems, Foster City, USA, oder das Gerät „Knauer 910" der Firma Knauer Wissenschaftlicher Gerätebau, Berlin, verwendet. (Technische Beschreibung der Geräte befinden sich in den jeweiligen Bedienungsanleitungen [12, 13]).
Die Geräte unterscheiden sich in der technischen Ausführung geringfügig. Gemein ist beiden Geräten, dass die Reagenzien und Lösemittel in einer Flaschenbatterie enthalten sind. Über ein Ventilsystem werden diese unter Luftabschluss in die Reaktorkammer und die Konverterkammer dosiert. Beide Geräte identifizieren die abgespaltene Aminosäure mit einem Flüssigchromatographen mit UV-Detektion. Die Geräte unterscheiden sich auch geringfügig in der Verwendung einzelner Reagenzien oder Lösemittel. Die Anwendung der Methode „Edman- Sequenzierung" oder Edman-Abbau mit dem „Edman-Reagenz" Phenylisothiocyanat als Standardmethode ist nicht nur diesen Vorrichtungen, sondern praktisch allen derzeit auf dem Markt befindlichen Geräten gemein. Es existiert jedoch eine Vielzahl von kleinen Verfahrensvarianten. Die Geräte sind weiterhin so ausgelegt, das der Benutzer Änderungen im Prozess nach eigenen Vorstellungen vornehmen, wie beispielsweise andere Lösemittel verwenden kann. Die Bezeichnungen Feuchtphasen-Sequenzierung (Knauer) oder Gasphase- und Pulsed-Liquid-Sequencing (Applied Biosystems) bedeuten, dass einzelne Reagenzien als Flüssigkeitstropfen, als feiner Sprühnebel oder gasförmig dosiert werden. Hierbei können für die verschiedenen Reagenzien im Prozeß auch unterschiedliche Dosierungsarten kombiniert werden. Gemein ist den Verfahren, dass das Protein in einer Reaktorkammer auf geeigneten Membranen nonkovalent, z.B. über hydrophobe Wechselwirkungen, immobilisiert wird und die Reagenzien in den Reaktor dosiert werden. Die Bindung des Proteins an die Membran wird durch einige Reagenzien gelöst bzw. gelockert, so dass eine ungünstige Prozessführung zu einem Auswaschen des Proteines führt und damit die Empfindlichkeit herabgesetzt wird bzw. die Weiterführung der Analyse unmöglich wird. Die Hersteller haben mit den einzelnen Dosierungsarten die chemische Reaktion auf hohe Umsatzraten und geringes Auswaschen optimiert. Prinzipiell können alle Sequenzierungsverfahren mit kleinen Änderungen an den Geräten durchgeführt werden. Es kann auch die Flüssigphasensequenzierung oder die Festphasensequenzierung, bei der das Protein kovalent an Trägermaterial gebunden wird, wenngleich mit Einschränkungen, durchgeführt werden.
Der Ablauf einer Proteinsequenzierung in einem Automaten verläuft im allgemeinen folgendermaßen. Das Protein wird in einem geeigneten Lösemittel aufgenommen und auf einen Filter aufgebracht. Dieser Filter besteht beispielsweise aus PVDF (Polyvinylidenfluorid) (Sequelon-Membran, Millipore, USA) oder aus vorbehandelter Glasfaser (Applied Biosystems, USA). Das Protein bindet nicht kovalent, z.B. über hydrophobe Wechselwirkungen, so dass es auf dem Filter bzw. der Membran immobilisiert ist. Das Filter bzw. die Membran mit dem Protein wird in eine Reaktorkammer eingebracht. Im Anschluss werden die Reagenzien und Lösemittel dosiert. Prinzipiell wird dabei erst eine Base (z.B. 6% Trimethylamin in Ethanol Wasser (1 :1)) dosiert. Anschließend wird 5% Phenylisothiocyanat in Heptan und wieder Trimethylamin dosiert. In der Reaktorkammer findet die Kupplungsreaktion statt (ca. 20 min bei 45°C). Die überschüssigen Reagenzien werden mit einem organischen Lösemittel (beispielsweise Ethylacetat, Heptan, Butylchlorid) ausgewaschen. In die Reaktorkammer wird wasserfreie Säure (z.B. 100% Trifluoressigsäure) dosiert und es erfolgt die Abspaltung der endständigen Aminosäure. Die Extraktion der abgespaltenen derivatisierten Aminosäure wird mit einem organischen Lösemittel (z.B. Butylchlorid, Ethylacetat) durchgeführt. Hierbei wird das Lösemittel durch den Reaktor gespült und in dem Konverter in einem kleinen Behältnis wie einem Fläschchen aufgefangen. Im Reaktor steht das um eine Aminosäure verkürzte Protein für den nächsten Abbauschritt zur Verfügung. In den Konverter wird eine wässrige Säure (z.B. 25 % Trifluoressigsäure in Wasser) dosiert. Die Isomerisierungsreaktion findet bei ca. 55°C für 30 min statt. Anschließend wird das Reagenz getrocknet und in einem geeigneten Lösemittel (z.B. 20% Acetonitril in Wasser) wiederaufgenommen und über ein Injektionsventil mit sechs Anschlüssen in das HPLC System injiziert. Der Konverter ist damit bereit für die Aufnahme der zwischenzeitlich abgespaltenen Aminosäure und der Prozess wird zyklisch wiederholt. In dem gesamten Prozess sind eine Vielzahl weiterer Trocknungs-, Misch- oder Reinigungsschritten für die Analyse vonnöten. Eine vollständige Beschreibung findet sich in den jeweiligen Gerätedokumentationen [12, 13].
Wie in der ursprünglichen Publikation von Edman [4] beschrieben, wird auch heute noch Phenylisothiocyanat als Kupplungsreagenz verwendet. Allerdings gab es in der Vergangenheit mannigfaltige Versuche diese Reagenz zu ersetzen, um eine höhere Empfindlichkeit der Analyse zu erreichen. Zu nennen sind hierbei zum Beispiel der Einsatz von 4-N,N- dimethylaminoazobenzene 4'-isothiocyanat [14 Chang, 1978], einem fluoreszierenden Isothiocyanat, oder der Einsatz von 311-PITC, das von Aebersold und Mitarbeitern für die empfindliche massenspektrometrische Detektion entwickelt wurde [15 Hess 1995].
Ein Nachteil der bisher vorgestellten Reagenzien zur Substitution von Phenylisothiocyanat ist zum Beispiel, dass sie meist eine im Vergleich zu PITC geringe Reaktionsgeschwindigkeit mit dem Aminoterminus aufweisen, so dass es nicht zu einer vollständigen Umsetzung kommt. Die geringe Kupplungsgeschwindigkeit liegt in der sterischen Hinderung der Reaktion durch die größeren Isothiocyanatmoleküle oder in den veränderten elektronischen Eigenschaften des Phenylringes bzw. des verwendeten Isothiocyanates begründet.
Ein weiterer Nachteil von einigen der vorgestellten Verbindungen besteht darin, das sie zwar eine vergleichbar hohe Kupplungsrate aufweisen, die Abspaltungsreaktion jedoch wesentlich langsamer verläuft, so dass sich aus diesem Grund die geforderten hohen Umsatzraten des Gesamtprozesses nicht realisieren lassen. Einige Verbindungen wie zum Beispiel 4-(N-l- Dimethylaminonaphthalen-5-Sulfonylamino)Phenylisothiocyanate [16 Jin, 1986] weisen eine hohe Kupplungsrate und eine hohe Abspaltungsrate auf, sie weisen allerdings für den Gesamtprozess ungünstige physiko- chemische Eigenschaften auf; so liegen die fluoreszierenden Isothiocyanate bei Raumtemperatur und Normaldruck als Feststoff vor und müssen für die Reaktion in einem geeigneten Lösemittel in Lösung gehalten werden. In der früher üblichen Flüssigphasensequenzierung, die in den sogenannten Spinning Cup Reaktionskompartimenten oder in manuellen Verfahren durchgeführt wurde, spielte dieser Effekt auf die Reaktionsgeschwindigkeit nur eine untergeordnete Rolle. Allerdings führten die technischen Gegebenheiten dieser Analysegeräte bzw. der darin durchgeführten Verfahren, beispielsweise der vergleichsweise hohe Sauerstoffeintrag während des Prozesses, zu einer Beschränkung ihrer Sensitivität.
Werden fluoreszierende Isothiocyanate in den heutzutage verwendeten Gas- oder Feuchtphasen- Sequenziergeräten eingesetzt, tritt während der Kupplungsreaktion folgender Effekt auf: Das Kupplungsreagenz, gelöst in geeigneten organischem Lösemittel (z.B. Heptan) wird in den Reaktor dosiert. Im darauf folgenden Trocknungsschritt verdampft das Lösemittel teilweise. In anschließenden Schritt wird die Base, beispielsweise 6% Trimethylamin in 50% Ethanol und 50%) Wasser, dosiert. Das Isothiocyanat präzipiert weitgehend auf dem Filter mit der Folge, dass die Reaktionsgeschwindigkeit mit dem Protein erheblich eingeschränkt ist. Nachteilig hier ist weiterhin, dass durch diese physiko-chemischen Eigenschaften auch die Entfernung des der Reaktion im Überschuss zugesetzten Reagenz erheblich erschwert wird (z.B. infolge stationärer Ladung des verwendeten Kupplungsreagenz). In dem Prozessschritt der Extraktion der abgespaltenen endständigen Aminosäure zeigen viele der vorgeschlagenen Substitute des PITC ungünstige Eigenschaften. So erfolgt die Extraktion durch die Löslichkeitseigenschaften der verwendeten Isothiocyanate nur unvollständig und es kann ein nur geringer Anteil der derivatisierten Aminosäure detektiert werden, weshalb die Detektionsgrenze bezogen auf die eingesetzte Proteinmenge insgesamt herabgesetzt ist.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Verbindung bereitzustellen, die anstelle des im Stand der Technik verwendeten Phenylisothiocyanates im Rahmen des Edman- Abbaus verwendet werden kann und die im Stand der Technik beschriebenen Nachteile überwindet. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine derartige Verbindung bereitzustellen, die zumindest mehrere der für eine zuverlässige Anwendung des Edman-Abbaus, insbesondere in seiner automatisierten Form, erforderlichen Eigenschaften aufweist, nämlich eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit mit primären Aminen, eine hohe Abspaltungsrate, einen geringen Schmelzpunkt, Löslichkeit in organischen und anorganischen Lösemitteln sowie eine niedrige Detektionsgrenze für mit diesem Reagenz derivatisierte Aminosäuren mit einem geeigneten Detektionsverfahren. Eine weitere der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, dass ein Reagenz bereitgestellt wird, welches das im Stand der Technik im Rahmen des Edman-Abbaus verwendete Phenylisothiocyanat ersetzt und die Nachweisgrenze für den Gesamtprozeß gegenüber dem Stand der Technik weiter verringern soll.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt gelöst durch die Verwendung eines Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates der Formel
Figure imgf000008_0001
(I)
worin Rj bis R5 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Wasserstoff, Halogen, Alkyl und Halogenalkyl umfasst,
wobei Halogen ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fluor, Chlor, Brom und Jod umfasst,
und Alkyl ausgewählt ist aus der Gruppe, die Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl umfasst;
unter der Voraussetzung, dass wenigstens einer der Reste R] bis R5 ein Halogen ist und/oder ein Halogen enthält,
zur Derivatisierung und/oder zum Nachweis von primären und/oder sekundären Aminen. In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Halogenalkylrest mit mindestens einem Halogen substituiert ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehendass das Halogen-substituierte Phenylisothiocyanat ausgewählt ist aus der Gruppe, die 2,4-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat, 2,5-Bis(Trifluormethyl)-Phenylisothiocyanat und 3,5-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat umfasst.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem zweiten Aspekt gelöst durch die Verwendung von 3,5-Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat zur Derivatisierung und/oder zum Nachweis von primären und/oder sekundären Aminen.
In einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Adukt aus 3,5 - Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat und einer Aminosäure.
In Ausführungsformen gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das primäre Amin eine Aminosäure, bevorzugterweise eine α-Aminosäure ist. Alternativ ist das primäre und/oder sekundäre Amin ein biogenes Amin oder eine chemische Verbindung, die als funktionelle Gruppe eine Aminogruppe enthält. Dabei ist es grundsätzlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Aminosäure ebenso wie das primäre bzw. sekundäre Amin in der L- oder D-Form vorliegen kann.
In einer Ausführungsform der ersten und des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Aminosäure eine N-terminale Aminosäure eines Polypeptids ist
In einem dritten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch Verwendung eines Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates der Formel
Figure imgf000009_0001
(I)
worin Ri bis R5 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Wasserstoff, Halogen, Alkyl und Halogenalkyl umfasst,
wobei Halogen ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fluor, Chlor, Brom und Jod umfasst, und
Alkyl ausgewählt ist aus der Gruppe, die Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl umfasst;
unter der Voraussetzung, dass wenigstens einer der Reste R] bis R ein Halogen ist und/oder ein Halogen enthält,
zur Analyse von Polypeptiden.
Diese Halogen-substutierten Phenyhsothiocyanate werden hierin auch als „Halogen-substituierte Phenyhsothiocyanate, wie hierin beschrieben", bezeichnet und auf diese unter Verwendung dieses Begriffes Bezug genommen.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Halogenalkylrest mit mindestens einem Halogen substituiert ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Halogen-substituierte Phenylisothiocyanat ausgewählt ist aus der Gruppe, die 2,4-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat, 2,5-Bis(Trifluormethyl)-Phenylisothiocyanat und 3,5-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat umfasst.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass 3,5-Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat zur Analyse von Polypeptiden verwendet wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Analyse die Sequenzanalyse des Polypeptids ist. In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Analyse mittels Edman- Abbaus erfolgt.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass als weiterer Schritt, wie er im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen ist, das derivatisierte Amin nachgewiesen und/oder identifiziert wird. Derivatisiertes Amin, wie hierin verwendet, ist das primäre oder sekundäre Amin, welches mit dem Halogen-substituierten Phenylisothiocyanat, wie hierin beschrieben, umgesetzt wird bzw. das Reaktionsprodukt hiervon.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Nachweisen und/oder Identifizieren mittels eines Verfahrens erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Umkehrphasen-HPLC, Gaschromatographie und Massenspektrometrie umfasst. Dabei ist besonders bevorzugt die Mikrobore-Umkehrphasen-HPLC .
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Nachweis des derivatisierten Amins mittels OCD-Detektion und/oder UV-Detektion und Retentionszeit erfolgt. Weiter ist vorgesehen, dass der Nachweis mittels Masseninformation und/oder Retentionszeit erfolgt. Schließlich ist auch vorgesehen, dass der Nachweis mittels Masseninformation und/oder Retentionszeit und Masseninformation erfolgt, wobei die Masseninformation erhalten wird durch Ionisation der Moleküle mittels negativer chemischer Ionisation.
In' Λveiteren Ausführungsformen ist vorgesehen, dass der Nachweis mittels ECD-Detektion und/oder UV-Detektion und Retentionszeit erfolgt. Alternativ kann vorgesehen sein, dass der Nachweis mittels Massenspektrometrie alleine, oder mittels Auftrennung und Massenspektrometrie erfolgt. Für den Fall, dass Massenspektrometrie verwendet wird, erfolgt die dabei erforderliche Ionisation bevorzugterweise durch negative chemische Ionisation.
In einem vierten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Reaktionsprodukt aus einem Halogen-substituierten Phenylisothiocyanat, insbesondere einem Halogensubsituierten Phenylisothiocyanat, wie hierin beschrieben, und einem primären und/oder sekundären Amin, bevorzugterweise einer Aminosäure und bevorzugtererweise einer α-Aminosäure.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Aminosäure an mindestens eine weitere Aminosäure gebunden ist, bevorzugterweise an ein Polypeptid. In einem fünften Aspekt wird die Aufgabe schließlich gelöst durch ein Verfahren zur Sequenzbestimmung von Polypeptiden umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen des Polypeptids und
Umsetzen des Polypeptids mit einem Halogen-substituierten Phenylisothiocyanat, wie hierin beschrieben.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erfindungsgemäße, zumindest einen der folgenden Schritte weiter umfasst:
Abspalten der endständigen derivatisierten Aminosäure und Detektierten der abgespaltenen endständigen derivatisierten Aminosäure.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Schritte des Umsetzens, des Abspaltens und der Detektion zumindest einmal wiederholt werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Umsetzen bei einer Temperatur von etwa 20 - 95°C, bevorzugterweise 20 - 85°C und bevorzugtererweise 40 - 45°C erfolgt.
In «iner Ausführungsform ist des weiteren vorgesehen, dass das Umsetzen unter basischen Bedingungen erfolgt, bevorzugterweise unter Verwendung einer Stickstoffbase.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Umsetzen bei einem pH von 7 bis 14, bevorzugterweise bei einem pH von 8 bis 10 erfolgt.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das nach Umsetzen des Polypeptids mit Phenylisothiocyanat erhaltene Phenylthiocarbamoyl-Polypeptid, bevorzugterweise nach Trocknen des Phenylthiocarbamoyl-Polypeptids mit wasserfreier Säure umgesetzt und dabei die N-terminale Aminosäure des Polypeptids als heterozyklisches Derivat in Form einer Anilinothiazolinon-Aminosäure abgespalten wird. In einer noch weiteren Ausführungsform ist, dass die Anilinothiazolinon-Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und direkt in ein Detektionssystem überführt und identifiziert wird.
Schließlich ist in einer Ausführungsform vorgesehen, dass die Anilinothiazolinon-Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und in eine Phenylthiocarbamoyl-Aminosäure überführt wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Anilinothiazolinon-Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und in eine Phenylhydantoin-Aminosäure überfuhrt wird.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass als weiterer Schritt Nachweisen und/oder Identifizieren des Aminosäure-Derivates erfolgt.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Nachweisen und/oder Identifizieren mittels eines Verfahrens erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Umkehrphasen-HPLC, insbesondere Mikrobore-Umkehrphasen-HPLC, Gaschromatographie und Massenspektrometrie umfasst.
In einer Ausführungsform ist, dass der Nachweis des Aminosäure-Derivates mittels ECD- Detektor, UV-Detektion, Retentionszeit, Masseninformation und/oder Retentionszeit und Masseninformation, oder mittels negativer chemischer Ionisation erfolgt.
In einer weiteren Ausführungsform ist, dass das Polypeptid mit einer um die eine N-terminale Aminosäure verringerten Sequenz mit 3,5-Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat umgesetzt wird.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass mindestens einer der in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehenen Schritte wiederholt werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass mit den hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenylisothiocyanaten Reagenzien ermittelt und bereitgestellt werden konnten, welche den spezifischen Anforderungen eines Phenylisothiocyanatderivates als Kupplungsreagenz für den Edman-Abbau genügen und welche eine Verbesserung des Edman-Abbaus erlauben und insbesondere die Nachweisgrenze für einzelne Aminosäuren deutlich verringern.
Die hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate weisen die folgende Formel
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(I)
auf, worin R] bis R5 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Wasserstoff, Halogen, Alkyl und Halogenalkyl umfasst.
In bevorzugten Ausführungsformen ist Halogen unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, die Fluor, Chlor, Brom und Jod umfasst, Alkyl unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, die Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl umfasst, jeweils unter der Voraussetzung, dass wenigstens einer der Reste RI bis R5 ein Halogen ist und/oder ein Halogen enthält. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist dabei in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dass das Halogen als solches bzw. das Halogen in dem Halogenalkyl aus der vorstehend genannten Gruppe der Halogene ausgewählt ist. Besonders bevorzugt sind dabei Fluor und Chlor.
Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Alkylrest, sei es der Alkylrest als solches oder der Alkylrest des Halogenalkyls, aus der Gruppe ausgewählt ist, die Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl umfasst.
Dabei ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Halogen direkt an das Phenylisothiocyanat, insbesondere den Phenyl-Ring, gebunden ist. Das Halogenalkyl umfasst bevorzugterweise solche Alkylreste, die zumindest einfach, bevorzugterweise jedoch zwei- bzw. dreifach substituiert sind. Dabei ist bevorzugt, dass die zwei- oder dreifache Substitution jeweils das gleiche Halogen verwendet. Es ist weiter bevorzugt, dass die zwei- oder dreifache Substitution am gleichen Kohlenstoffatom erfolgt.
Besonders bevorzugt ist dabei die Verwendung von 3,5-Bis(Trifluormethyl)-Isothiocyanat. Die im folgenden gemachten Ausführungen beziehen sich lediglich auf das besagte 3,5- Bis(Trifluormethyl)-Isothiocyanat. Es ist jedoch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die im Zusammenhang mit dieser Verbindung speziell gemachten Ausführungen und beschriebenen Vorteile, Ausführungsformen, Anwendungen und Vorteile allgemein für die Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate, wie sie hierin offenbart sind, gelten.
Die hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate vereinigen überraschenderweise eine Vielzahl jener Eigenschaften, die man von einem „optimalen" Edman- Reagenz erwartet. Insoweit ist die Verwendung der hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate gegenüber den im Stand der Technik beschriebenen Edman-Reagenzien überraschenderweise mit deutlichen Vorteilen verbunden. Die hierin beschriebenen Halogen- substituierten Phenyhsothiocyanate sind beispielsweise beschrieben in der deutschen Offenlegungsschrift 26 08 488. Die erfindungsgemäße Verwendung der hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate erlaubt die Durchführung des Edman-Abbaus an Polypeptiden oder Proteinen, die in sehr geringen Konzentrationen vorliegen. Dadurch wird eine direkte Analyse von beispielsweise in biologischen Systemen nur schwach exprimierten Polypeptiden und Proteinen erstmals möglich. Gerade die Analyse von schwach exprimierten Polypeptiden und Proteinen ist in der modernen Biotechnologie von besonderem Interesse, stellt jedoch auch insoweit ein Problem dar, als dass durch die geringen Konzentrationen bei Aufreinigungsschritten eine selektive Aufreinigung der interessierenden Polypeptide schwer möglich ist und die spezifischen Verluste hier besonders schwer wiegen. Darüber hinaus wird es durch die verringerte Nachweisgrenze im Rahmen von Polypeptidsequenzierungen auch möglich, vereinfachte Polypeptid-Reinigungsverfahren anzuwenden. Damit ergeben sich wiederum weitere Anwendungen der Polypeptidanalytik unter Anwendung des Edman-Abbaus, insbesondere im Bereich der Diagnostik und hier wiederum bei Systemen mit einem hohen Durchsatz, d. h. sogenannten High-Throughput-Systemen.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass im wesentlichen der Edman-Abbau, wie er in der Literatur beschrieben und den Fachleuten bekannt ist, ohne weitere Änderungen des Versuchsprotokolls mit Ausnahme der hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate anstelle der ansonsten im Stand der Technik verwendeten Phenyhsothiocyanatderivate durchgeführt werden kann. Dies gilt sowohl hinsichtlich der Aufbereitung des Polypeptids, insbesondere dessen Vorlage in der Reaktorkammer, den verwendeten Lösungsmitteln und Hilfsstoffen, des pH- Wert-Bereiches, des Temperaturbereiches sowie der Durchführung der nach der Derivatisierung der Aminosäure, insbesondere der N- terminalen Aminosäure eines Polypeptids mit den hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenylisothiocyanaten bei den nachfolgenden Reaktionsschritten.
Grundsätzlich umfasst der Edman-Abbau die folgenden Schritte:
1. Bereitstellen eines zu sequenzierenden Polypeptids oder Proteins,
2. Umsetzen mit Kupplungsreagens, d. h. im vorliegenden Falle erfindungsgemäß unter Verwendung eines Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates, wie hierin beschrieben,
3. Abspalten der endständig durch das Halogen-substituierte Phenylisothiocyanat derivatisierten Aminosäure,
4. Detektion der abgespaltenen endständigen derivatisierten Aminosäure, und
5. optional zyklisches Wiederholen der Schritte 2, 3 und 4.
Typischerweise erfolgt nach der Abspaltung eine Extraktion oder Trennung der derivatisierten Aminosäure und im Anschluss daran eine Messung derselben. Die besagte Messung kann entweder eine direkte Messung sein, oder durch eine Konversion, beispielsweise durch Isomerisierung in PTH und anschließender Detektion erfolgen, oder durch Konversion, beispielsweise durch Isomerisierung in PTH und zusätzlicher Derivatisierung und Detektion erfolgen, oder durch Konversion, beispielsweise durch Hydrolyse, in PTC und anschließender Detektion erfolgen, oder durch Konversion, beispielsweise Hydrolyse, in PTC und zusätzlicher Derivatisierung und Detektion erfolgen.
Bei den vorstehend geschilderten Reaktionen wird das Polypeptid typischerweise auf einem geeigneten Trägermaterial kovalent oder nicht kovalent gebunden. Geeignete Trägermaterialien sind dabei Glas, Glasfasern, mikroporöse Glaskugeln, Kunststoffmembranen (wie PVDF, Polyethylen, Teflon und dergleichen). Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate, wie sie hierin beschrieben sind, resultieren wesentliche Vorteile auch aus dem niedrigen Siedepunkt dieser Verbindungen. So ist es möglich, dass das bei der Kupplung im Überschuss, bezogen auf die Proteinmenge, zugegebene Reagenz, nachdem die Reaktion stattgefunden hat, auch durch eine Temperaturerhöhung und eine damit verbundene Verdampfung des Reagens entfernt werden kann. Ein weiterer Vorteil aus dem geringeren Siedepunkt der Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate, wie sie hierin beschrieben sind, besteht darin, dass die Prozessführung insoweit abgeändert werden kann, als dass nach der Reaktion des Isothiocyanates mit der Polypeptidkette die Temperatur in der Reaktorkammer erhöht werden kann. Das leicht flüchtige Isothiocyanat verdampft, zumindest teilweise, wodurch die anschließenden Waschschritte, bei denen das Reagens zusätzlich extrahiert wird, effektiver verlaufen. Durch diese Form der Verfahrensführung weist die erfindungsgemäße Edman-Sequenzierung durch eine geringere Menge an störenden Nebenprodukten ein verbessertes Analysenergebnis auf.
Die vorzugsweise unter basischen Bedingungen durchgeführte Umsetzung der Aminosäure mit einem der Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate, wie sie hierin beschrieben sind, erfolgt vorzugsweise unter Zugabe von Wasser und/oder einem organischen Lösungsmittel. Ein Beispiel für ein derartiges organisches Lösungsmittel ist Ethanol. Die unter Zusatz einer Base durchgeführte Reaktion kann dabei eine flüssige oder gasförmig zugeführte Base umfassen. Geeignete Basen sind beispielsweise solche, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die als Stickstoffbasen bezeichnet werden, also beispielsweise die tertiären Amine, beispielsweise Trimethylamin oder Triethylamin, Basen aus der Gruppe der Morpholine, beispielsweise 4- Methylmorpholin, Basen aus der Gruppe, die Pyrrolidone, Pyridine und Pyrimidine umfasst. Es können für die Reaktion auch Basen verwendet werden, die kein Stickstoff enthalten. Auch ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, eine Mischung zweier oder mehrerer Basen zu verwenden.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird typischerweise das Halogen-substituierte Phenylisothiocyanat im Überschuss zugegeben. Eine Entfernung des Reagens folgt vorzugsweise durch Extraktion und/oder Evaporation, wobei grundsätzlich auch andere Verfahren als Evaporation angewandt werden können, jedoch ist infolge des niedrigen Siedepunktes der Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate die Entfernung mittels Temperaturerhöhung besonders effizient auszugestalten. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, eine Kombination aus Extraktion und Verdampfung durchzuführen.
Wird der Reaktionsansatz getrocknet, erfolgt dies typischerweise dadurch, dass ein Inertgas (Stickstoff oder Argon) durch das Reaktionsgefäß geleitet wird. Alternativ kann auch Trocknung durch Anlegen eines Vakuums erfolgen. Der anschließende Waschschritt erfolgt bevorzugterweise mit organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Ethylacetat oder Heptan. Allgemein sind Lösungsmittel bevorzugt, die das Polypeptid nicht anlösen bzw. auswaschen. Anschließend erfolgt ein weiterer Trocknungsschritt unter Ver- oder Anwendung der vorstehend beschriebenen Maßnahmen.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Anilinothiazolinon-Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und direkt in ein geeignetes Detektionssystem überführt und identifiziert wird. Die Extraktion erfolgt dadurch, dass ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacetat und/oder Butylchlorid, durch die Reaktorkammer geleitet wird. Die abgespaltene Aminosäure löst sich, wobei sich das um eine Aminosäure verkürzte Polypeptid jedoch nicht löst und in dem Reaktionsgefäß verbleibt. Das Extraktionsmittel mit der Aminosäure wird in das Detektionssystem überführt und die Aminosäure entsprechend identifiziert.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Anilinothiazolinon-Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und in eine Phenylthiohydantoin-Aminosäure überführt wird. Dabei erfolgt die Extraktion, indem ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethylacetat und/oder Butylchlorid, durch die Reaktorkammer geleitet wird. Die abgespaltene Aminosäure löst sich, wohingegen sich das um eine Aminosäure verkürzte Polypeptid nicht löst und in der Reaktorkammer verbleibt. Das Extraktionsmittel mit der derivatisierten Aminosäure wird in eine weitere Reaktionskammer, den sogenannten „Konverter" überführt. Hier wird eine wässrige Säure zudosiert, wie beispielsweise 25 % Trifluoressigsäure, und die Isomerisierungsreaktion findet statt.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Anilinothiazolinon-Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und in eine Phenylthiocarbamoyl-Aminosäure (PTC-AS) überführt wird. Die Extraktion erfolgt, indem ein organisches Lösungsmittel, wie Ethylacetat und/oder Butylchlorid durch das Reaktionsgefäß geleitet wird. Die abgespaltene Aminosäure löst sich, wohingegen sich das um eine Aminosäure verkürzte Polypeptid nicht löst und in der Reaktorkammer verbleibt. Das Extraktionsmittel mit der Aminosäure wird in die besagte weitere Reaktionskammer („Konverter") überführt. Hier wird beispielsweise Wasser oder eine wässrige Base dosiert und die Hydrolysereaktion findet statt. Die PTC-Aminosäure kann anschließend direkt identifiziert werden oder sie wird in einem weiteren Schritt derivatisiert und darauffolgend analysiert.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Anilinothiazolinon- Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und in eine Phenylthiohydantoin-Aminosäure überführt wird. Die Extraktion erfolgt, indem ein organisches Lösungsmittel, wie Ethylacetat und/oder Butylchlorid, durch das Reaktionsgefäß geleitet wird. Die abgespaltene Aminosäure löst sich im Gegensatz zu dem um eine Aminosäure verkürzten Polypeptid, welches in der Reaktorkammer verbleibt. Das Extraktionsmittel mit der Aminosäure wird in eine weitere Reaktorkammer, den „Konverter", überführt. Hier wird eine wässrige Säure, wie beispielsweise 25 % Trifluoressigsäure, hinzugegeben und die Isomerisierungsreaktion findet statt. Anschließend wird die Phenylthiohydantoin-Aminosäure in einem weiteren Schritt derivatisiert. Die Derivatisierung erfolgt, wie auch im Falle des PTC-Derivates der Aminosäure, mit z. B. in der Gaschromatographie üblichen Reagenzien, so dass die zweifach derivatisierte Aminosäure einem hochempfindlichen Analyseverfahren zugänglich ist. Dabei kann eine leicht ionisierbare Verbindung angekuppelt werden oder entstehen, eine fluoreszierende Gruppe angekuppelt werden, oder der Siedepunkt der Verbindung durch die Derivatisierung herabgesetzt werden.
Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung von 3,5 - Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat im Rahmen des Edman-Abbaus ist in dem Nachweis- bzw. Identifizierungsschritt der mit 3,5 - Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat derivatisierten Aminosäure zu sehen. Obgleich die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, wie beispielsweise UV-Detektion, [10, Wittmann- Liebold 1985] grundsätzlich angewandt werden können, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere empfindlichere Nachweis- oder Detektionsverfahren möglich. Dies liegt darin begründet, dass das erfindungsgemäße 3,5-Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat einen hohen Anteil an Fluoratomen im Molekül aufweist und diese durch geeignete Kopplung an Detektoren, wie beispielsweise ECD (Electron Capture Detection) oder durch negative chemische Ionisation (NCI) oder chemische Ionisation (CI) spezifisch nachgewiesen werden können. Anstelle von HPLC könnte auch eine Auftrennung und Charakterisierung der erhaltenen Aminosäure-Derivate mittels Gaschromatographie unter Bezug auf standardisierte Retentionszeiten erfolgen. Gleiches gilt grundsätzlich auch für solche der hierin offenbarten bzw. beschriebenen Phenyhsothiocyanate, die weniger Fluoratome, aber immer noch die vorstehenden physiko-chemischen Eigenschaften aufweisen.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die verschiedenen Aminosäurederivate unter Anwendung verschiedener Trennprinzipien aufgelöst werden und anschließend, ebenfalls unter Anwendung verschiedener, unter anderem physiko-chemischer Parameter aufgetrennt werden. Insoweit sind grundsätzlich alle möglichen Kombinationen aus Trennverfahren und Nachweis- Verfahren möglich, beispielsweise die Verwendung von Detektoren, wie ECD oder NCI bei Trennung mittels Gaschromatographie, Gas-Flüssig-Chromatographie und
Flüssigchromatographie (Umkehrphasen-Chromatographie oder Ionenaustausch-
Chromatographie). Im Falle der UV-Detektion oder ECD-Detektion kommt die wesentliche Information hinsichtlich der Identität des Aminosäure-Derivates aus der Retentionszeit.
Insbesondere bei der Verwendung gaschromatographischer Systeme ist es erforderlich, die derivatisierten Aminosäuren aus dem Edman-Abbau (FM-TH-AS) zu derivatisieren, um sie der Detektion erst zugänglich zu machen. Allgemein ist es bei dem erfindungsgemäßen Edman- Abbau möglich, die entstandenen derivatisierten Aminosäuren (in der Konfiguration Anilinothiazolinon oder Thiocarbamyl oder Thiohydantoin) in einem weiteren Schritt derart zu derivatisieren, dass sie für die gaschromatographische Analyse optimale Eigenschaften aufweisen.
Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Edman-Abbau als automatisiertes Verfahren, wie hierin im Einleitungsteil beschrieben, der hierin durch Bezugnahme an dieser Stelle als nochmals aufgenommen und wiederholt gelten soll, unter Verwendung der hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenylisothiocyanaten, wie beispielsweise 3,5 - Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat, als „wet phase"- Verfahren, als „pulsed liquid"- Verfahren oder als Gasphasen- Verfahren durchgeführt wird.
Bei dem „wet phase"-Verfahren, dem „pulsed liquid"-Verfahren oder dem Gasphasen- Verfahren, wie sie hierin bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden können, werden eine oder mehrere Reagenzien in Form eines kleinen (vorzugsweise kleiner lOμl, bevorzugtererweise kleiner 2μl) in Form eines Flüssigkeitstropfens („wet phase"), in Form eines Sprühnebels („pulsed liquid") oder gasförmig mit einem Trägergas (bevorzuigterweise Stichstoff oder Argon) in die Reaktorkammer dosiert, in der sich das Polypeptid kovalent oder nicht kovalent gebunden auf einem Trägermaterial (vorzugsweise einem Glasfaserfilter, einer Membran die vorzugsweise hydrophoben Eigenschaften aufweist, beispielsweise aus PVDF, oder porösen Glaskugeln) befindet. Die Reagenzien sind hierbei eines der hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate, (vorzugsweise gelöst in organischem Lösemittel), die Base, vorzugsweise eine Stickstoffbase, vorzugsweise ein tertiäres Amin, wie beispielsweise Trimethylamin oder Triethylamin oder eine Ringverbindung mit einem Stickstoffatom, die in einem organischen Lösemittel oder in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und organischen Lösemittel gelöst sein kann, und die wasserfreie Säure, vorzugsweise Trifluoressigsäure. Hierbei kann eine beliebige Kombination der verschiedenen Dosierungstechniken für die Dosierung der Reagenzien verwendet werden.
Wie aus der vorstehenden Darstellung ersichtlich, kann das hierin offenbarte Halogen- substituierte Phenylisothiocyanat mit einem primären Amin eines Peptides, insbesondere von der terminalen Aminosäure des Peptids reagieren und, nach Abspaltung der besagten terminalen Aminosäure, selektive detektiert werden. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Reaktion mit dem hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenylisothiocyanat nicht auf die Reaktion mit Peptiden beschränkt ist. Vielmehr erfolgt eine Reaktion allgemein mit primären oder sekundären Aminen. Bei dieser Reaktion handelt es sich somit im weitesten Sinne um eine Derivatisierungsreaktion von primären und/oder sekundären Aminen. Mit der erfindungsgemäßen Derivatisierung von primären und sekundären Aminen ist es möglich, die besagten primären und sekundären Amine gezielt aus oder in einem Stoffgemisch, insbesondere in einem Gemisch dieser Stoffklassen, zu analysieren. Mit der Derivatisierung wird die Polarität der die primäre oder sekundäre Amingruppe enthaltenden.Substanz verringert, so dass sie besser einer gaschromatographischen Analyse zugänglich ist bzw. wird. Durch die elektronegativen Eigenschaften des Derivatisierungsreagenz, d. h. des hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenylisothiocyanat, bedingt durch die Halogenatome, ist das Reagenz besonders geeignet für eine Detektion mit Elektronen-Einfang-Detektoren oder für eine Detektion mittels negativer chemischer Ionisation undjnassenspektrometrischer Detektion. Mit dieser selektiven Detektion wird das Verhältnis von Signal zu Rauschen um ein Vielfaches erhöht, so dass damit eine wesentlich empfindlichere Analyse der Zielsubstanzen, d. h. von primären und sekundären Aminen, ermöglicht wird. Unter Anwendung des hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates ist der Nachweis von primären und sekundären Aminen bis in den Attomolbereich oder in noch geringeren Stoffmengen zu fuhren und es damit letzten Endes möglich, die ein primäres oder sekundäres Amin enthaltende Verbindung zu identifizieren. Mit der erfindungsgemäßen Verwendung der hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate werden primäre und sekundäre Amine einer direkten gaschromatographischen Messung nun zugänglich.
Die Durchführung der Derivatisierung bzw. des Verfahrens zum Nachweis von primären und/oder sekundären Aminen erfolgt dabei gemäß den folgenden Schritten:
a) Bereitstellen einer Probe,
b) optional Durchführen eines Aufreinigungsschrittes mit dem Ziel, bestimmte Komponenten der Probe zu entfernen oder den Anteil der zu derivatisierenden bzw. nachzuweisenden primären und/oder sekundären Amine zu erhöhen,
c) Bereitstellen eines geeigneten Lösemittels,
d) optional Hinzugeben einer Stickstoff ase,
e) Hinzugeben des Isothiocyanates zu dem Reaktionsansatz und Abreagierenlassen der Probe bzw. des Reaktionsansatzes,
f) optional Abtrennen des überschüssigen Reagens und/oder der Hilfsstoffe, und
g) Analyse des solchermaßen erhaltenen Reaktionsansatzes.
Die zu analysierende Probe kann im Prinzip eine jegliche Probe sein. Die Probe kann entsprechend aus dem technischen oder dem analytischen Bereich stammen. Der analytische Bereich umfasst dabei insbesondere die Bereiche Biologie, Biochemie und Medizin sowie Forensik ebenso wie den der Prozesstechnik. Bevorzugterweise sind die Proben biologischen Ursprungs und hierbei insbesondere Blut, Urin, Stuhl, Lymphflüssigkeit oder Liquor. Die Probe kann jedoch auch eine Luftprobe, eine Bodenprobe, oder eine Wasserprobe sein. Schließlich kann die Probe auch eine feste Substanz sein, wie beispielsweise Haare oder allgemein eine Feststoffprobe. Bei dem in der Probe enthaltenen Amin, insbesondere primären oder sekundären Amin, bzw. mutmaßlich darin enthaltenem primären und/oder sekundären Amin kann es sich bevorzugterweise um ein solches Amin handeln, wie es in Ausgangsmaterialien für die Herstellung von industriellen Produkten, wie beispielsweise Lösungsmitteln, Textil- und Flotationshilfsmittel, Invertseifen, Tensiden, Bakteriziden, Korrosionsinhibitoren, Antischaummitteln und Additiven enthalten ist. Amine, wie sie erfindungsgemäß nachgewiesen oder detektiert werden können, stellen jedoch auch Bestandteile bzw. reaktive Gruppen von Pharmazeutika, einschließlich Drogen, dar. Amine, wie sie erfindungsgemäß nachgewiesen oder detektiert werden können, stellen des Weiteren beispielsweise verschiedene Stoffwechselprodukten dar. Von besonderem Interesse im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind dabei solche primären und sekundären Amine, die biogene Amine sind.
Biogene Amine sind primäre Mono- und Diamine und im weiteren Sinne gewisse Derivate hiervon. Typischerweise entstehen derartige biogene Amine im Organismus durch Decarboxylierung von Aminosäuren gebildet. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können unter Anwendung der hierin beschriebenen Halogen-substituierten Phenyhsothiocyanate biogene Amine nachgewiesen werden und erlauben somit einen Rückschluss auf den Zustand eines Organismus, insbesondere auf das Vorhandensein von erwünschten oder unerwünschten biogenen Aminen, die wiederum Rückschluss auf Krankheiten oder Krankheitszustände erlauben. Weiterhin ist damit ein Überwachen des Therapieerfolges bzw. eine Bestimmung der Pharmakokinetik von primären bzw. sekundären Aminen enthaltenden Wirkstoffen möglich. Unter Verwendung der hierin offenbarten Halogen-substituierten Phenylisothiocyanaten und den entsprechenden Verfahren zum Derivatisieren bzw. Nachweisen von primären und/oder sekundären Aminen können die folgenden biogenen Amine besonders bevorzugt nachgewiesen werden bzw. sind die diese enthaltenden Proben unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu analysieren. Tyramin, Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin, die Neurotransmitter, Hormone, bzw. Gewebehormone darstellen und das Decarboxylierungsprodukt der Aminosäure Tyrosin darstellen. Tryptamin, Serotonin und Melatonin, die Neurotransmitter, Hormone und Gewebehormone darstellen und das Decarboxylierungsprodukt von Tryptophan darstellen. Histamin, das ein Gewebehormon ist und bei einer Vielzahl von Reaktionen, einschließlich allergischer Reaktionen, beteiligt und das Decarboxylierungsprodukt der Aminosäure Histidin ist. Cysteamin, welches ein wesentlicher Bestandteil des Co-Enzyms A und das Decarboxylierungsprodukt von Cystein ist. Betaalanin, das ebenfalls Baustein des Co-Enzyms A und das Decarboxylierungsprodukt der Aminosäure Asparagin ist. Gammaaminobuttersäure, die ein wichtiger Neurotransmitter und das Decarboxylierungsprodukt von Glutaminsäure ist. Propanolamin, welches eine wesentliche Funktion als Cobalamin aufweist und das Decarboxylierungsprodukt von Threonin ist. Ethanolamin, welches ein wesentlicher Bestandteil der Phosphatide, die ihrerseits am Aufbau der Zytoplasmamembran beteiligt sind, und das Decarboxylierungsprodukt von Serin ist. Cadaverin, welches ein bakterielles Abbauprodukt von Lysin ist. Spermidin, Spermin und Putrescin, welche bei der Regulation der DNA- und RNA-Synthese sowie Zeilproliferation beteiligt sind und das Decarboxylierungsprodukt der Aminosäure Omithin sind. Agmatin, das ein bakterielles Abbauprodukt und das Decarboxylierungsprodukt von Arginin ist. ß-Alanin, welches aus L- Asparaginsäure entsteht und als Vorstufe für Pantothensäure von Bedeutung ist. Aminoacteon, welches aus L-2-Aminoacetessigsäure entsteht und eine Vorstufe für Vitamin B12 darstellt. 5- Amino-4-oxovaleriansäure, welches aus Succinylglycin entsteht und eine Vorstufe für Porphyrine darstellt. Cadaverin, welches aus L-Lysin hergestellt wird und eine Vorstufe für Alkaloide darstellt. Dopamin, welches von L-Dopa herrührt und ein Neurotransmitter, Vorstufe für die Katecholamine, L-Noradrenalin und L-Adrenalin und darüber hinaus ein Protoalkaloid ist. Serotonin, welches aus 5-Hydroxy-L-Tryptophan entsteht und ein Neurotransmitter sowie Vorstufe des Hormons Melatonin ist. Tryptamin, welches aus L-Tryptophan entsteht und die Kontraktion der glatten Muskulatur bewirkt und bei Pflanzen wachstumsfordernd wirkt. Tyramin, welches aus L-Tyrosin entsteht und die Kontraktion der glatten Muskulatur bedingt.
Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von weiteren biogenen Aminen, für die die erfindungsgemäße Verwendung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist. Sofern ein kausaler Zusammenhang zwischen dem erfindungsgemäß nachzuweisenden primären bzw. sekundären Amin und einer Krankheit besteht, kann das entsprechende Verfahren als diagnostisches Verfahren für die jeweilige Krankheit verwendet werden.
Die gemäß Schritt b) optional durchgeführten Aufreinigungsschritte haben zum Ziel, gegebenenfalls die Reaktion störende Inhaltsstoffe der Probe zu entfernen bzw. in einem Vorschritt bereits die Konzentration der nachzuweisenden bzw. zu derivatisierenden primären und/oder sekundären Amine zu erhöhen. Beispielsweise kann eine Phasentrennung erfolgen für den Fall, dass die Probe eine Dispersion darstellt oder größere Feststoffe enthält. Die Aufreinigung erfolgt dabei nach Prinzipien, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, wobei beispielsweise auch eine Extraktion erfolgen kann mit dem Ziel, die primären und sekundären Amine in eine entsprechende Lösemittelphase aufzunehmen. Die Probe wird in Schritt c) dann in ein geeignetes Lösungsmittel aufgenommen, in welchem letzten Endes die Reaktion mit dem erfindungsgemäßen Halogen-substituierten Phenylisothiocyanat erfolgen soll. Grundsätzlich sind eine Vielzahl von Lösungsmitteln geeignet, wobei die Eignung des jeweiligen Lösungsmittels im Wesentlichen von dem konkret nachzuweisenden Amin bestimmt wird. Beispielhaft sei hier auf die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Sequenzierung von Proteinen bzw. Peptiden angeführten Lösungsmittel verwiesen, die grundsätzlich auch für diese Anwendung geeignet sind. Ein geeignetes Lösungsmittel kann beispielsweise eine Mischung aus 50 % Pyridin, 6 % Trimethylamin und 44 % Wasser darstellen. Bevorzugterweise liegt das Isothiocyanat im Überschuss vor.
Bei der optionalen Zugabe einer Stickstoffbase gemäß Schritt d) sind wiederum jene Basen grundsätzlich anwendbar, wie dies auch im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für die Sequenzanalyse von Polypeptiden verwendet werden. Insbesondere bevorzugt sind dabei Stickstoffbasen, wie Trimethylamin, Triethylamin oder Pyridin.
Mit der Zugabe des Isothiocyanats zu der gegebenenfalls aufbereiteten Probe erfolgt die eigentliche Reaktion, die unter üblichen Bedingungen durchgeführt wird. Übliche Bedingungen bezeichnet dabei z. B. 50° C bis 55° C für 30 bis 40 min, bevorzugt 50° C für 40 min.
Nach Schritt e), insbesondere dem Umsetzen des Reaktionsansatzes kann optional vorgesehen sein, dass eine Isomerisierungsreaktion des verwendeten Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates erfolgt. Mit dieser Reaktion wird im Allgemeinen die Nachweisempfindlichkeit weiter erhöht. Reaktionsbedingungen, die zu einer Isomerisierung des mit dem Amin umgesetzten Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates führen, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise auch im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Sequenzanalyse von Polypeptiden beschrieben. Beispielsweise kann die Isomerisierung, bevorzugtererweise nach Trocknung des Reaktionsansatzes, mit 25 % Trifluoressigsäure durchgeführt werden.
Die Analyse gemäß Schritt g) wird dabei insbesondere unter Verwendung des derivatisierten Amins erfolgen, wobei das jeweilige Amin vor Aufnahme in ein für das jeweils ausgewählte Analyseverfahren geeignetes Lösemittel getrocknet wird. Bei Verwendung eines Gaschromatographiesystems ist beispielsweise eine Rücklösung des getrockneten Amins in 70 % Aceton oder in reinem Aceton bevorzugt. In dem gaschromatographischen System kann das jeweilige Amin als Derivat durch Vergleich der Retentionszeiten oder über die massenspektrometrische Bestimmung identifiziert werden. Die eigentliche Detektion kann sowohl im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Sequenzbestimmung von Polypeptiden wie auch beim erfindungsgemäßen Derivatisieren und/oder Nachweis von primären und/oder sekundären Aminen auch mittels UV- oder Fluoreszenzdetektion erfolgen. Durch die Derivatisierung wird sichergestellt, dass bei Verwendung eines Elektronen-Einfang- Detektors (ECD-Detektors) mindestens eine funktioneile Gruppe im Molekül enthalten ist, die stark elektronegative Eigenschaften aufweist. Der Elektronen-Einfang-Detektor ist ein spezifischer Detektor der mit elektronegativen Elementen oder elektronegativen funktionellen Gruppen wie zum Beispiel Fluor (-F), Chlor (-C1) oder Brom (-Br) Substituten oder Nitrogruppen (-NO2) mit einer hohen Response, also einer hohen Signalantwort reagiert, so dass diese Moleküle selektiv detektiert werden.
Die Detektion kann auch in einem Massenspektrometer, bevorzugterweise in einem Massenspektrometer, welches mit einer Ionenquelle für die sogenannte negative chemische Ionisation ausgestattet ist, erfolgen. In diesem in der Literatur ausführlich beschriebenen Verfahren werden bevorzugt Moleküle, die elektronegative funktionelle Gruppen wie zum Beispiel Fluor (-F), Chlor (-C1) oder Brom (-Br) Substitute oder Nitrogruppen (-NO2) enthalten, ionisiert. Damit können die derivatisierten Substanzen selektiv mit einer außergewöhnlich hohen Empfindlichkeit detektiert werden
Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff primäres und/oder sekundäres Amin eine jegliche chemische Verbindung, welche als eine funktionelle Gruppe mindestens ein primäres und/oder sekundäres Amin oder Aminogruppe enthält. Dabei ist es im Rahmen der Definition, dass die Verbindung auch eine oder mehrere weitergehende, andere funktionelle Gruppen aufweisen kann.
Die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Sequenzbestimmung von Polypeptiden beschriebenen Reaktionsbedingungen gelten grundsätzlich auch für die Verwendung des Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates, wie hierin beschrieben, zur Derivatisierung und/oder zum Nachweis von primären und/oder sekundären Aminen. Im folgenden wird die Erfindung anhand der Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei zeigt
Fig. 1 die Strukturformel von 3,5-Bis (Trifluormethyl) Phenylisothiocyanat,
Fig. 2 A die Umsetzung von Ala mit FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 2 B die Umsetzung von Ala mit PITC und FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 3 A die Umsetzung von Arg mit FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 3 B die Umsetzung von Arg mit PITC und FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 4 A die Umsetzung von Asp mit FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 4 B die Umsetzung von Asp mit PITC und FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 5 A die Umsetzung von Val mit FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 5 B die Umsetzung von Val mit PITC und FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 6 A die Umsetzung von Ile mit FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 6 B die Umsetzung von Ile mit PITC und FM-PITC als Chromatogramm,
Fig. 7 ein Chromatogramm von mit 3,5-Bis(Trifluormethyl)Phenylisothiocyanat derivatisiertem Arg, Asp, Ala, Val und Phe, Fig. 8 ein Chromatogramm von mit 3,5-Bis(Trifluormethyl)Phenylisothiocyanat derivatisiertem Ile, Pro, Met, Ser und Lys, Fig. 9 A ein Chromatogramm verschiedener Alanin-Derivate, wie in Beispiel lc) hergestellt, Fig. 9 B ein Chromatogramm verschiedener Ala-Derivate, wie hergestellt in Beispiel lb),
Fig. 10 A ein Chromatogramm verschiedener Ala-Derivate, wie hergestellt in Beispiel ld) nach fünf Minuten, Fig. 10 B ein Chromatogramm verschiedener Ala-Derivate, wie hergestellt in Beispiel ld) nach zehn Minuten, Fig. 10 C ein Chromatogramm verschiedener Ala-Derivate, wie hergestellt in Beispiel ld) nach zwanzig Minuten, und Fig. 11 A die Umsetzung von Lys mit FM-PITC als Chromatogramm, Fig. 11 B die Umsetzung von Lys mit PITC und FM-PITC als Chromatogramm, Fig. 12 a/b die Detektion von FM-Thiohydantoin-Valin mittels Elektronenstoßionisation im
Selected Ion Modus, Fig. 13 a/b Nachweis von FM-Thiohydantoin-Valin mittels negativer chemischer Ionisation im Selected Ion Modus, Fig. 14 Detektion von FM-Thiohydantoin-Valin mittels Elektroneneinfangdetektion,
Fig. 15 a/b Detektion von FM-Thiohydantoin-Isoleucin mittels negativer chemischer
Ionisation im Scan Modus Fig. 16 a/b Detektion von FM-Thiohydantoin-Glutamin mittels negativer chemischer
Ionisation im Scan Modus, Fig. 17 a/b Schritt 1 der Sequenzanalyse von ß-Lactoglobulin und Nachweis von FM-
Thiohydantoin-Leucin mittels negativer chemischer Ionisation, Fig. 18 a/b Schritt 2 der Sequenzanalyse von ß-Lactoglobulin, insbesondere Detektion von
FM-Thiohydantoin-Isoleucin mittels negativer chemischer Ionisation, Fig. 19 a/b Schritt 3 Sequenzanalyse von ß-Lactoglobulin, insbesondere Detektion von FM- Thiohydantoin-Valin mittels negativer chemischer Ionisation, Fig. 20 a/b Nachweis und Identifizierung des Reaktionsproduktes eines Amins und FM-PITC mittels negativer chemischer Ionisation, und Fig. 21 das Ergebnis der Sequenzierung eines synthetischen Peptids mit der Sequenz F-A-
E-A-A-K-Y-A-S, wobei die ersten drei Abbauschritte dargestellt sind.
In den nachfolgend beschriebenen Beispielen wurden verschiedene Reagenzien und Lösungen verwendet, die im folgenden genauer bezeichnet und in ihrer Zusammensetzung gekennzeichnet sind. Dabei ist die Durchführung nicht auf die verwendeten Lösemittel oder Hilfsstoffe beschränkt, sondern kann mit üblichen Substituten durchgeführt werden.
- Lösung 1 : Aminosäure-Lösung (c = 0,01 μmol/μl): freie Aminosäure gelöst in Pyridin/Wasser (1 :
- Lösung 2: PITC-Lösung: 5 Vol.-% Phenylisothiocyanat in reinem Acetonitril (ACN)
- Lösung 3: 3,5 - Bis (Trifluormehtyl) - Phenylisothiocyanat (FM-PITC)-Lösung: 5Vol.-% FM-PITC in reinem Acetonitril
- Lösung 4: TMA-Lösung: 6 Vol.-% Trimethylamin in Ethanol
- Lösung 5: TFA-Lösung: 40 Vol.-% Trifluoressigsäure
Beispiel 1 : Ermittlung der Kupplungsgeschwindigkeit von FM-PITC:
Versuchsansätze a) Umsetzung der freien Aminosäure Alanin mit PITC:
Für die Umsetzung der freien Aminosäure Alanin mit PITC wurde wie folgt vorgegangen:
Vereinigen von 40 μl Lösung 1, 40 μl Lösung 2 und 30μl Lösung 4; mixen; spülen mit N2; Reaktion bei 55 °C für 2h; in Vakuumkonzentrator (Speed-Vac, Fa. Savant) trocknen. Zur Konvertierung in 50μl ACN aufnehmen und Hinzugeben von 50μl Lösung 5; Reaktion bei 55 °C für 30 min halten; in Vakuumkonzentrator trocknen; in lOOOμl ACN/H2O (1 :1) aufnehmen; Anschließend werden geeignete Verdünnungen hergestellt. Die qualitative und quantitative Bestimmung erfolgt mittels HPLC. Die Bedingungen für die HPLC Messungen waren bei allen hierin beschriebenen Versuchen identisch. Für die Messungen wurde ein ABI 130a Gradientensystem (Applied Biosystems, USA) als Pumpe, und ein UV Detektor Typ SPD 10A (Shimadzu, Japan) bei 269nm Wellenlänge verwendet. Die Datenaufhahme im PC erfolgte mit einem Auswertesystem der Fa. Knauer, Berlin. Für die chromatographische Auftrennung wurde eine Säule Typ YMC ODS AQ 150*2mm, 3μ 120A (YMC, Japan) verwendet. Die Säule wurde auf 45°C temperiert. Verwendet wurde Puffer A 0,1%>TFA in Wasser, Puffer B 0,08% TFA in Acetonitril, Gradient %B 20% 0-8min, Injektion bei 8min, 5B 20-60% 8-32,5min, %B 60-80% 32,5-34 min
b) Umsetzung der freien Aminosäure Alanin mit FM-PITC:
Für die Umsetzung der freien Aminosäure Alanin mit FM-PITC wurde wie folgt vorgegangen:
Vereinigen von 40 μl Lösung 1, 40 μl Lösung 3 und 30 μl Lösung 4; mixen; spülen mit N2; Reaktion bei 55°C für 2h; in Vakuumkonzentrator trocknen.
Zur Konvertierung: in 50μl ACN aufnehmen + 50μl Lösung 5; Reaktion Bei 55 °C 30min; in Vakuumkonzentrator trocknen; in lOOOμl ACN/H2O (1 :1) aufnehmen; Anschließend werden geeignete Verdünnungen hergestellt. Die qualitative Bestimmung erfolgt mittels HPLC wie unter a) beschrieben.
Eine Blindprobe diente der Verifizierung gebildeter Nebenprodukte; hierzu wird unter gleichen Bedingungen eine Reaktion mit FM-PITC ohne eine Aminosäure durchgeführt. c) Kinetische Analyse der Umsetzung der freien Aminosäure Alanin mit PITC:
Um die Kinetik der Reaktion der freien Aminosäure Alanin mit PITC zu untersuchen, wurde die Reaktion mit einer zeitversetzten Zugabe von FM-PITC analysiert. Die zeitversetzte Zugabe von FM-PITC erfolgte nach 5, 10, 20, 30 und 60 Minuten gemäß dem nachfolgenden Reaktionsschema:
In 5 Reaktionsgefaßen werden jeweils 40 μl Lösung 1 + 40 μl Lösung 2 + 30 μl Lösung 4 vorgelegt; Der Reaktionsansatz wurde gemischt, mit Stickstoff gespült und die Reaktion bei 55°C durchgeführt. Nach jeweils 5, 10, 20, 30 und 60 min werden in die verschiedenen Reaktionsgefäße 40 μl Lösung 3 pipettiert. Die Reaktionsmischungen werden insgesamt 2 h bei 55 °C gehalten. Es wird weiter verfahren wie unter a) und b) beschrieben.
d) Kinetische Analyse der Umsetzung einer freien Aminosäure mit FM-PITC:
Um die Kinetik der Reaktion der freien Aminosäure Alanin mit FM-PITC zu untersuchen, wurde die Reaktion mit einer zeitversetzten Zugabe von PITC zu dem in b) beschriebenen Reaktionsansatz analysiert. Die zeitversetzte Zugabe von PITC erfolgte nach 5, 10, 20, 30 und 60 Minuten gemäß dem nachfolgenden Reaktionsschema:
In 5 Reaktionsgefäßen werden jeweils 40 μl Lösung 1 + 40 μl Lösung 3 + 30 μl Lösung 4 vorgelegt; Der Reaktionsansatz wurde gemischt, mit Stickstoff gespült und die Reaktion bei 55°C durchgeführt. Nach jeweils 5, 10, 20, 30 und 60 min werden in die verschiedenen Reaktionsgefäße 40 μl Lösung 2 pipettiert. Die Reaktionsmischungen werden insgesamt 2 h bei 55 °C gehalten. Es wird weiter verfahren wie unter a) und b) beschrieben. e) Umsetzung einer freien Aminosäure bei gleichzeitiger Zugabe von FM-PITC-Lösung und PITC-Lösung:
Für diese Untersuchungen wurden Lösungen analog Lösung 1 der folgenden Aminosäuren hergestellt: Isoleucin, Alanin, Valin, Asparaginsäure, Lysin, Arginin. Es wurde bei diesem Reaktionsansatz wie folgt vorgegangen:
Es wurden in 6 Reaktionsgefäßen parallel 6 Ansätze durchgeführt. In jedem Reaktionsgefäß wurde nur eine Aminosäure der Aminosäuren Isoleucin, Alanin, Valin, Asparaginsäure, Argenin und Lysin verwendet. Es wurden jeweils 40 μl der Aminosäurelösung enthaltend vereinigt mit 40 μl Lösung 3, 40 μl Lösung 2 und 30 μl Lösung 4. Der jeweilige Reaktionsansatz wurde gemischt, mit Stickstoff gespült und die Reaktion anschließend bei 55°C für zwei Stunden inkubiert. Danach wurde in einer Vakuumkonzentrator (Speed- Vac) getrocknet. Auch hier wird weiter verfahren wie unter a) und b) beschrieben. Die in den Figuren 2B bis 6B und 11B dargestellten Chromatogramme 849, 852, 854, 856, 858, 860 zeigen den Ansatz bei gleichzeitiger Zugabe der Reagenzien. Im Vergleich zeigen die in den Figuren 2A bis 6A und 11 A dargestellten Chromatogramme 850, 851, 853, 855, 857, 859 die Aminosäuren nur mit FM-PITC umgesetzt, wie in b) beschrieben)
Ergebnisse:
Aufgrund der vorstehend beschriebenen Versuchsansätze kann folgendes festgehalten werden:
a) Anhand der in a) beschriebenen Umsetzung einer freien Aminosäure, die als PTH- Aminosäure unter definierten Reaktionsbedingungen umgesetzt wurde, lassen sich die hierin verwendeten Reaktionsbedingungen überprüfen. Der gebildeten PTH-Aminosäure sowie Nebenprodukten lassen sich charakteristische Retentionszeiten zuordnen, beispielsweise durch Vergleich mit einem PTH-Aminosäure-Standard. Die Versuchsergebnisse bestätigen, dass die Reaktion sowohl qualitativ wie auch quantitativ möglich ist.
b) Durch die in b) beschriebene Umsetzung einer freien Aminosäure mit dem erfindungsgemäßen 3,5 - Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat (FM-PITC) unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie bei Umsetzung der Aminosäure mit PITC konnte ebenfalls eine positive Reaktion in dem Sinne festgestellt werden, dass ein entsprechendes FM-PTH-Amionsäurederivat gebildet wurde und damit ein Nachweis bzw. eine Identifizierung einer Aminosäure unter Verwendung von 3,5-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat. Der entsprechende Nachweis erfolgt mittels Chromatographie. Die chromatographische Messung der Blindprobe, die die entstandenen Nebenprodukte zeigt, bestätigen das vorstehende Ergebnis.
c) Die in c) beschriebene kinetische Analyse der Umsetzung einer freien Aminosäure mit PITC und zeitlich verzögerter Zugabe von FM-PITC zeigt, dass überwiegend das PTH- Aminosäure-Derivat gebildet wird. Es werden bei der zeitlich verzögerten Zugabe von FM- PITC selbst nach 60 Minuten noch geringe Mengen von FM-PTH-Aminosäure 3,5- Bis(Trifluormethyl)-Phenylthiohydantoin-Aminosäure gebildet und sind detektierbar. (Chromatogramm 838)
d) Darüber hinaus zeigt die anfängliche Umsetzung der freien Aminosäure mit FM-PITC, wie in d) beschrieben, dass schon nach wenigen Minuten der überwiegende Anteil an Aminosäure umgesetzt ist. Eine verzögerte Zugabe von PITC lässt erkennen, dass bereits nach fünf Minuten keine PTH-Aminosäure mehr detektierbar ist. (Chromatogramm 807)
e) Die gleichzeitige Umsetzung der freien Aminosäuren mit FM-PITC und PITC, wie in -Versuchsansatz e) beschrieben, zeigt, dass die Reaktion von FM-PITC mit einer freien
Aminosäure schneller verläuft als mit PITC. Wie mittels chromatographischer Analyse des Reaktionsgeschehens gezeigt werden konnte, wurde im Vergleich zur PTH-Aminosäure eine deutlich größere Menge des FM-PTH-Aminosäure-Derivates detektiert. Hier bei konnte eine 3 bis 6 fach höhere Konzentration festgestellt werden.
Das vorstehend geschilderte Ergebnis, dass die Reaktion von FM-PITC mit der freien Aminosäure deutlich schneller abläuft als mit PITC, ist auch insoweit von Bedeutung, als dass damit ein weiterer Schritt bei der Automatisierung des Edman-Abbaus, insbesondere in der Ausprägung als High-Throughput-System, unter Verwendung von 3,5- Bis(Trifluormethyl)-Phenylisothiocyanat möglich wird. Beispiel 2: Reaktionen von FM-PITC mit verschiedenen Aminosäuren:
Um nachzuweisen, dass die erfindungsgemäße Verwendung von 3,5-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat auch mit anderen als der in Beispiel 1 beschriebenen Aminosäuren erfolgt, wurden weitere Aminosäuren mit FM-PITC gemäß dem folgenden Schema umgesetzt: Hierbei wurden die Aminosäuren Isoleucin, Alanin, Valin, Asparaginsäure, Argenin Serin. Methionin Prolin, Phenylalanin und Lysin verwendet.
Jeweils 40 μl der verschiedenen Aminosäure-Lösungen (c = 0,01μmol/μl werden in Reaktionsgefäße pipettiert und 40 μl von Lösung 3 und 30μl von Lösung 4 hinzugegeben. Dieser Ansatz wird dann gemischt, mit Stickstoff gespült und die Reaktion bei 55 °C für eine Stunde inkubiert. Der Ansatz wird anschließend getrocknet und zur Konvertierung in 50μl Acetonitril aufgenommen. Zu diesem Ansatz werden anschließend 50μl von Lösung 5 hinzugesetzt und die Reaktion bei 55 °C für 30 Minuten stehen gelassen. Anschließend erfolgt eine erneute Trocknung. Das getrocknete Produkt wird in 1000 μl Acetonitril/H2O (1:1) mit 0,1 % TFA aufgenommen. Nach Herstellung geeigneter Verdünnungen wurden die FM-PTH-Aminosäure-Derivate mittels HPLC unter den oben genannten Bedingungen qualitativ bestimmt. Figs. 7 und 8 zeigen Chromatogramme FM-AS Standard 1 und FM-AS Standard 2 mit je 5 Aminosäuren aus einzelnen Versuchen in einem Bild übereinandergelegt.
Ergebnisse:
Die hergestellten FM-PTH-Aminosäuren-Derivate können reproduzierbar eindeutig von einander unterschieden werden. Die Chromatogramme zeigen, dass jedem FM-PTH- Aminosäuren-Derivat ein charakteristischer Peak mit einer definierten Retentionszeit zugeordnet werden kann.
Beispiel 3: Manuelle Edman-Sequenzierung mit FM-PITC am Beispiel verschiedener, synthetischer Peptide
Die Durchführung der manuellen Sequenzierung wurde in Anlehnung an [5] durchgeführt. Für die Untersuchung wurde in drei Ansätzen drei synthetische Peptide verwendet. Peptid 1 hat die Sequenz F-A-E-A-A-K-Y-A-S, Peptid 2 hat die Sequenz I-L-R-G-S-V-A-H-K, Peptid 3 hat die Sequenz Y-T-D-P-N-T-F-S-S. Die Peptide wurde auf einer Waage ausgewogen und durch zugäbe der entsprechenden Menge 50% Acetonitril/ Wasser, 0,1 % Trifluoressigsäure auf eine Konzentration von 50 pmol/μl verdünnt. 40μl der jeweiligen Lösung (n = 2 nmol) werden in Reaktionsgefäße pipettiert und vakuumgetrocknet.
Kupplungsreaktion gemäß Edman-Abbau:
Zu dem getrockneten Ansatz werden 20 μl Pyridin/Wasser (1 :1) sowie 20 μl 5 Vol.-%ige FM-PITC-Lösung (in reinem Acetonitril) gegeben; die Reaktion erfolgt bei 55 °C für 40 min.
Es wird zweimal mit jeweils 80 μl einer Mischung aus Heptan/Essigester (2:1) extrahiert, um überschüssige Reagenz abzutrennen. Der Überstand wird verworfen; der Rückstand gefriergetrocknet
Abspaltung gemäß Edman-Abbau:
Zu dem getrockneten Rückstand werden 5 μl 100%ige Trifluoressigsäure pipettiert; die Reaktion erfolgt bei 55°C für 10 min.; anschließend wird der Reaktionsansatz gefriergetrocknet.
-Der Rückstand wird in 30 μl Wasser aufgenommen, und zweimal mit jeweils 40 μl Butylester extrahiert. Der Extrakt mit dem abgespaltenen Aminosäure-Derivat wird in einem Reaktionsgefäß gesammelt und in der Speed-Vac getrocknet; das im Wasser zurückgebliebene Peptid wird ebenfalls gefriergetrocknet und für ' die nächste Kupplungsreaktion eingesetzt.
Konvertierung gemäß Edman-Abbau:
Das getrocknete Aminosäure-Derivat wird mit 10 μl 40%iger Trifluoressigsäure versetzt; die Reaktion erfolgt bei 55°C für 30 min.; der Reaktionsansatz wird anschließend mittels Speed- Vac getrocknet. Der getrocknete Rückstand wird in 20 μl 100 % Acetonitril + 0,1 % TFA gelöst und mit weiteren 20 μl Wasser versetzt, 2μl der Lösung werden in die HPLC injiziert. Die Bestimmung erfolgt mittels HPLC unter den oben genannten Laufbedingungen.
Ergebnis:
Es wurden mit den Peptiden je drei Abbauschritte durchgeführt. Die (bekannte) Sequenz der Peptide der» synthetischen Peptide lässt sich durch Vergleich mit den in Beispiel 2 hergestellten FM-PTH- Aminosäuren-Derivaten eindeutig verifizieren. In den in Fig. 21 dargestellten Chromatogrammen sind die drei Abbaustufen übereinander gelegt und die Aminosäuren gekennzeichnet. Die Ausbeute der FM-PTH-Derivate zeigt, daß die Umsetzung sowie die Abspaltung nahezu vollständig verlaufen. Auch lässt sich in den Abbauschritten n+1 quasi kein Aminosäure-Derivat aus dem vorläufigen Abbauschritt, d. h. Abbauschritt n, detektieren. Ein sog. Overlap, der auf unvollständige Kupplung oder unvollständige Abspaltung hinweisen würde, tritt hier nicht auf und bestätigt somit die der Erfindung zugrundeliegende Erkenntnis, dass die erfindungsgemäße Verwendung von 3,5- Bis(Trifluormethyl)-Phenylisothiocyanat eine Optimierung des Edman-Abbaus zulässt.
Beispiel 4: Edman-Sequenzierung mit FM-PITC im Knauer Sequencer Typ 910, (Fa Knauer Wissenschaftlicher Gerätebau, Berlin) von synthetischen Peptiden
Durchführung:
Von der oben genannten Lösung des Peptides 2 mit der Sequenz I-L-R-G-S-V-A-H-K (c=50pmol/μl) werden auf ein mit Biobren vorbehandelten PVDF Filter pipettiert. (Biobrene Plus, Applied Biosystems, USA, c=10μg/μl in 50% Acetonitril Wasser, 3μl auf Filter pipettieren und trocknen lassen. Bei dem Knauer Sequenzer Typ 910 wurde bis auf die beschriebenen Modifikationen die Standardkonfiguration verwand [13]. Damit wurde der Sequenzer im sog. Wet-Phase Modus betrieben (Dosierung von Kupplungsreagenz ca. 8μl, Base ca. 4μlund Säure ca. 3μl als Flüssigkeitstropfen in den Reaktor) Als Kupplungsreagenz RI wird statt 5% PITC in Heptan eine Lösung von 5% FM-PITC in Heptan verwendet, als Lösemittel S3, mit dem die konvertierte Aminosäure Rückgelöst und in die HPLC injiziert wird, wird 50% Acetonitril/Wasser verwendet. Alle weiteren Reagenzien und Lösemittel werden wie in der Standardkonfiguration verwendet. Für den Abbau wird das aktuelle Standard-Abbauprogramm verwendet, dass als Anlage zu [13] beschrieben ist. Im Programmablauf wird an der Stelle, an der ansonsten die automatische Injektion der PTH-Aminosäure in ein Detektionssystem erfolgt, die derivatisierte Aminosäure aufgefangen und manuell in eine HPLC injiziert. Die Auswertung erfolgt analog zu dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren.
Für Detektionszwecke wurde das folgende HPLC-System verwendet:
Pumpe ABI 130a Gradientensystem, Detektor Shimadzu SPD 10A 269nm, Auswertesystem Knauer HPLC-Box, Eurochromsoftware, Säule YMC ODS AQ 150*2mm, 3μ 120A, Ofen 45°C, Puffer A 0,1%TFA in Wasser, Puffer B 0,08% TFA in Acetonitril, Gradient %B 0-8min 20%, 8- 32,5min 20-60%, 32,5-34 min 60-80%
Die Sequenz des Peptides konnte in 6 Abbaustufen eindeutig identifiziert werden, was durch den Vergleich der in Beispiel 3) ermittelten Sequenz und dem Vergleich mit den in Beispiel 2) synthetisierten Derivate hervorgeht. Es zeigt sich also, das die Reagenz 3,5 Bis(Trifluormethyl)Phenylisothiocyanat für die automatische Durchführung in einem Sequenzautomaten hervorragend geeignet ist.
Beispiel 5: Reaktionsbedingungen zum Nachweis von primären und/oder sekundären Aminen
In - Ergänzung zu den vorstehenden Reaktionsbedingungen können auch die folgenden Reaktionsbedingungen zum Nachweis bzw. zur Derivatisierung von primären und/oder sekundären Aminen gemäß der hierin gegebenen Offenbarung nachgewiesen werden.
Das nachzuweisende primäre und/oder sekundäre Amin oder die dieses mutmaßlich enthaltende Probe wird typischerweise in einem Lösungsmittel gelöst, welches aus 50 % Pyridin, 6 % Trimethylamin und 44 % Wasser besteht. Der Probe wird das Derivatisierungsreagenz, beispielsweise 3,5-Bis (Trifluormethyl)-Phenylisothiocyanat, als 5% Lösung in Acetonitril zugegeben. Die Reaktionsbedingungen sind 50 bis 55° C und die Zeiten 30 bis 40 min. Bevorzugt sind dabei 50° C für 40 min. Die Isomerisierungsreaktion wird mit 25 % Trifluoressigsäure durchgeführt, das danach erhaltene Reaktionsprodukt getrocknet und in 70 % Aceton aufgelöst. Beispiel 6: Nachweis der Umsetzung der freien Aminosäure mit FM-PITC mittels Gaschromatographie:
In diesem Beispiel wird unter anderem die erfindungsgemäße Verwendung der beschriebenen Reagens zum Nachweis von Aminen gezeigt, da die Stoffklasse der Aminosäuren eine Unterklasse aus der Stoffgruppe der Amine darstellt.
Versuchsansätze
Umsetzung der freien Aminosäuren mit FM-PITC:
Für die Umsetzung der freien Aminosäuren Valin, Isoleucin und Glutamin mit FM-PITC wurde analog zu Beispiel 1 wie folgt vorgegangen:
Vereinigen von 40 μl Lösung 1, 40 μl Lösung 3 und 30 μl Lösung 4; mixen; spülen mit N2; Reaktion bei 55°C für 2h; in Vakuumkonzentrator trocknen.
Zur Durchführung der Isomerisierungsreaktion auch Konvertierung genannt wird wie folgt vorgegangen: Die Probe in 50μl ACN aufnehmen und 50μl Lösung 5 hinzufügen;_Reaktion bei 55 °C 30min; in Vakuumkonzentrator trocknen; in lOOOμl Aceton aufnehmen; anschließend werden geeignete Verdünnungen hergestellt. Die qualitative und quantitative Bestimmung erfolgt mittels Gaschromatograhie. Hierzu wurde ein Gaschromatograph Agilent 6890N ausgerüstet mit einem Elektronen-Einfang-Detektor, ein Gaschromatograph Agilent 6890N ausgestattet mit einem massenselektiven Detektor Agilent 5973 MSD in der Konfiguration mit Elektronenstoßionisation (EI) und in der Konfiguration mit negativer chemischer Ionisation (NCI) verwendet. Als Trägergas wurde Helium, als Reagentgas wurde Methan verwendet. Die Gaschromatographen waren mit einem temperaturprogrammierbaren Einlasssystem ausgestattet. Das Temperaturprogramm lautete wie folgt: Initial 50° C für 0,02 min, heizen mit 720°C/min auf 270°C, halten der Temperatur für 1 min. Der Einlass wurde im Splitmodus betrieben. Das Splitverhältnis wurde je nach der vorliegenden Konzentration variiert. Übliche Splitverhältnisse lagen zwischen 1 zu 1 und 1 zu 200. Üblicherweise wurde lμl injiziert. Als Säule wurde eine HP 5 MS verwendet. Der Temperaturgradient wurde von 50°C bis 280°C programmiert. Ergebnisse:
Fig. 12a zeigt einen Ausschnitt des Totalionenstrom einer Messung im EI im Selected Ion Monitoring Modus (deutsch: Auswahlionenüberwachungsmodus). Selected Ion Monitoring Modus bedeutet, dass der Quadrupol-Massenfilter auf Ionen eines bestimmten Verhältnis von Masse zu Ladung voreingestellt ist, Diese vorgewählten Ionen können passieren und werden detektiert. Ionen mit einem anderen Verhältnis von Masse zu Ladung können den Massenfilter nicht passieren und detektiert werden. Deutlich ist ein Peak bei 18.85 min zu identifizieren. Das dazugehörige gemittelte Spektrum Fig. 12b identifiziert das FM- Thiohydantoin-Valin derivat mit der Masse 370 und dem spezifischen Fragment 328 (Abspaltung der Propylseitengruppe). Fig. 13a zeigt die gleiche Probe gemessen mit negativer chemischer Ionisation als Totalionenstrom. Fig. 13a zeigt das dazugehörige Massenspektrum. Der chromatographische Peak weist die gleiche Retentionszeit auf und die Massen 370 und 328 identifizieren die Substanz eindeutig. Fig. 14 zeigt die gleiche Probe im •Elektronen Einfang-Detektor. Die Aminosäure wurde auch hier eindeutig identifiziert.
Fig. 15a zeigt die Analyse von FM-Thiohydantoin-Isoleucin im einer NCI Messung im Scan Modus (deutsch: Abtastmodus). Scan Modus bedeutet, dass der Quadrupol Massenfilter in einem voreingestellten Bereich nacheinander die einzelnen Massen analysiert, d.h. während eines kurzen Zeitraumes ein komplettes Massenspektrum des vorgewählten Bereiches aufnimmt. Die derivatisierte Aminosäure kann eindeutig als chromatographischer Peak in -diesem Beispiel bei 11.00 min identifiziert werden. Fig. 15b zeigt das dazugehörige Massenspektrum. Die derivatisierte Aminosäure ist über ihre Masse 384 und das Fragment 356 (Abspaltung von Kohlenmonoxyd) eindeutig identifiziert. r
Fig. 16a zeigt die Analyse von FM-Thiohydantoin-Glutamin. Die Aminosäure eluiert in dieser chromatographischen Trennung bei 10,80 min und wird über ihre Masse 399 und das Fragment 371 identifiziert (Fig. 16b). Beispiel 7: Durchführung einer automatischen Proteinsequenzierung von ß- Lactoglobulin im Knauer Sequenzer mit FM-PITC als Kupplungsreagenz und Nachweis der abgespaltenen, derivatisierten Aminosäuren nach gaschromatographischer Trennung und massenspektrometrischer Detektion mit negativer chemischer Ionisation:
Versuchsansatz
Die automatische Proteinsequenzierung wurde analog durchgeführt, wie in Beispiel 4 beschrieben. Als Proteinprobe wurde ß-Lactoglobulin verwendet.
Die abgespaltenen und konvertierten Aminosäuren wurden in Aceton rückgelöst, in geeignete Gefäße transferiert und in das Gaschoromatographiesystem injiziert. Die Figs. 17a, 17b, 18a, 18b, 19a und 19b zeigen beispielhaft jeweils den Totalionenstrom im Scan Modus der ersten drei Abbauschritte der Sequenz. Es wurden die Aminosäuren Leucin (Fig. 17a, b), Isoleucin (Fig. 18a, b) und Valin (Fig. 19a, b) identifiziert. Das entspricht der in der Literatur beschriebenen aminoterminalen Sequenz von ß-Lactoglobulin. Die jeweiligen Aminosäuren wurden über den Vergleich der Retentionszeiten mit den analog zu Beispiel 3 und 6 hergestellten Derivaten und die jeweiligen spezifischen Massen und Fragmentmassen identifiziert.
Beispiel 8: Nachweis und Identifizierung von Aminen durch Derivatisierung mit 3,5-Bis (Trifluormethyl)-Phenylisothiocyanat mit gaschromatographischer
Trennung und massenspektrometrischer Detektion mit negativer chemischer Ionisation:
Versuchsansatz
Einer Probe, die in einer Lösung von 50% Ethanol 50 % Wasser vorliegt und die neben Dimethylamin weitere Substanzen enthält, wurde eine Lösung mit 5% FM-PITC 5% Trimethylamin in Acetonitril zugegeben. Die Reaktion wurde für 40 min bei 55°C durchgeführt und die Probe anschließend getrocknet, in 70% Aceton rückgelöst und in das Gaschromatographiesystem injiziert. Fig. 20a zeigt den Totalionenstrom der Reaktion von Dimethylamin mit 3,5-Bis (Trifluormethyl)-Phenylisothiocyanat. Das Reaktionsprodukt hat eine Retentionszeit von 9,08 min und wird über die Masse 317 eindeutig identifiziert, wie in Fig. 20b dargestellt.
Die hierin in eckigen Klammem hierin angegebenen Literaturstellen werden aus Gründen der Übersicht zusammenfassend im folgenden angegeben.
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Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung eines Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates der Formel
Figure imgf000042_0001
(I)
worin Ri bis R5 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Wasserstoff, Halogen, Alkyl und Halogenalkyl umfasst,
wobei Halogen ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fluor, Chlor, Brom und Jod umfasst, und
Alkyl ausgewählt ist aus der Gruppe, die Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl umfasst;
unter der Voraussetzung, dass wenigstens einer der Reste Ri bis R5 ein Halogen ist und/oder ein Halogen enthält,
zur Derivatisierung und/oder zum Nachweis von primären und/oder sekundären Aminen.
2. Verwendung nach Anspmch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Halogenalkylrest mit mindestens einem Halogen substituiert ist.
3. Verwendung nach Anspmch 1 oder 2, dadurch gekennzeiclinet, dass das Halogen-substituierte Phenylisothiocyanat ausgewählt ist aus der Gruppe, die 2,4-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat, 2,5-Bis(Trifluormethyl)-Phenylisothiocyanat und 3,5-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat umfasst.
4. Verwendung von 3,5-Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat zur Derivatisiemng und/oder zum Nachweis von primären und/oder sekundären Aminen.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das primäre Amin eine Aminosäure, bevorzugterweise eine α-Aminosäure ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das primäre und/oder sekundäre Amin ein biogenes Amin ist.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure eine N-terminale Aminosäure eines Polypeptids ist.
8. Verwendung eines Halogen-substituierten Phenylisothiocyanates der Formel
Figure imgf000043_0001
(I)
worin Ri bis R5 jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die Wasserstoff, Halogen, Alkyl und Halogenalkyl umfasst,
wobei Halogen ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fluor, Chlor, Brom und Jod umfasst, und
Alkyl ausgewählt ist aus der Gruppe, die Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl umfasst; unter der Voraussetzung, dass wenigstens einer der Reste Ri bis R5 ein Halogen ist und/oder ein Halogen enthält,
zur Analyse von Polypeptiden.
9. Verwendung nach Anspmch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Halogenalkylrest mit mindestens einem Halogen substituiert ist.
10. Verwendung nach Anspmch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Halogen- substituierte Phenylisothiocyanat ausgewählt ist aus der Gmppe, die 2,4-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat, 2,5-Bis(Trifluormethyl)-Phenylisothiocyanat und 3,5-Bis(Trifluormethyl)- Phenylisothiocyanat umfasst.
11. Verwendung von 3,5-Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat zur Analyse von Polypeptiden.
12. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse die Sequenzanalyse des Polypeptids ist.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse mittels Edman-Abbaus erfolgt.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass als weiterer Schritt Nachweisen und/oder Identifizieren des derivatisierten Amines erfolgt.
15. Verwendung nach Anspmch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisen und/oder Identifizieren mittels eines Verfahrens erfolgt, das ausgewählt ist aus der G ppe, die Umkehrphasen-HPLC, insbesondere Mikrobore-Umkehrphasen-HPLC, Gaschromatographie und Massenspektrometrie umfasst.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des derivatisierten Amines mittels ECD-Detektion und/oder UV-Detektion und Retentionszeit, und/oder Masseninformation und/oder Retentionszeit und Masseninformation, und/oder Masseninformation und/oder Retentionszeit und Masseninformation, wobei die Ionisation der Moleküle mittels negativer chemischer Ionisation erfolgt, erfolgt.
17. Reaktionsprodukt aus einem Halogen-substituierten Phenylisothiocyanat, insbesondere einem Phenylisothiocyanat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, und einem primären und/oder sekundären Amin, bevorzugterweise einer Aminosäure und bevorzugterweise einer α- Aminosäure.
18. Reaktionsprodukt nach Anspmch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure an mindestens eine weitere Aminosäure gebunden ist, bevorzugterweise an ein Polypeptid.
19. Verfahren zur Sequenzbestimmung von Polypeptiden umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen des Polypeptids und
Umsetzen des Polypeptids mit einem Halogen-substituierten Phenylisothiocyanat nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
20. Verfahren nach Anspmch 19, weiter umfassend zumindest einen der folgenden Schritte:
Abspalten der endständigen derivatisierten Aminosäure und Detektierten der abgespaltenen endständigen derivatisierten Aminosäure.
21. Verfahren nach Anspmch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte des Umsetzens, des Abspaltens und der Detektion zumindest einmal wiederholt werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Umsetzen bei einer Temperatur von etwa 20 - 95°C, bevorzugterweise 20 - 85°C und bevorzugtererweise 40 - 45°C erfolgt.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Umsetzen unter basischen Bedingungen erfolgt, bevorzugterweise unter Verwendung einer Stickstoffbase.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Umsetzen bei einem pH von 7 bis 14, bevorzugterweise bei einem pH von 8 bis 10 erfolgt.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das nach Umsetzen des Polypeptids mit Phenylisothiocyanat erhaltene Phenylthiocarbamoyl-Polypeptid, bevorzugterweise nach Trocknen des Phenylthiocarbamoyl-Polypeptids, mit wasserfreier Säure umgesetzt und dabei die N-terminale Aminosäure des Polypeptids als heterozyklisches Derivat in Form einer Anilinothiazolinon-Aminosäure abgespalten wird.
26. Verfahren nach Anspmch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Anilinothiazolinon- Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und direkt in ein Detektionssystem überführt und identifiziert wird.
27. Verfahren nach Anspmch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Anilinothiazolinon- Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und in eine Phenylthiocarbamoyl-Aminosäure überführt wird.
28. Verfahren nach Anspmch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Anilinothiazolinon- Aminosäure aus dem Reaktionsansatz extrahiert und in eine Phenylhydantoin-Aminosäure überführt wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass als weiterer Schritt Nachweisen und/oder Identifizieren des Aminosäure-Derivates erfolgt.
30. Verfahren nach Anspmch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweisen und/oder Identifizieren mittels eines Verfahrens erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gmppe, die Umkehrphasen-HPLC, insbesondere Mikrobore-Umkehrphasen-HPLC, Gaschromatographie und Massenspektrometrie umfasst.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Aminosäure-Derivates mittels ECD-Detektion und/oder UV-Detektion und Retentionszeit, und/oder Masseninformation und/oder Retentionszeit und Masseninformation, und/oder Masseninformation und/oder Retentionszeit und Masseninformation, wobei die Ionisation der Moleküle mittels negativer chemischer Ionisation erfolgt, erfolgt.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid mit einer um die eine N-terminale Aminosäure verringerten Sequenz mit 3,5-Bis (Trifluormethyl) - Phenylisothiocyanat umgesetzt wird.
33. Verfahren nach Anspmch 32, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der in den Ansprüchen 19 bis 32 vorgesehenen Schritte wiederholt werden.
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