WO2003031627A1

WO2003031627A1 - Polypeptides a origine plaquettaire a activite sphingosine kinase et genes de sphingosine kinase codant pour ces polypeptides

Info

Publication number: WO2003031627A1
Application number: PCT/JP2001/008537
Authority: WO
Inventors: Yasuyuki Igarashi; Akio Kihara
Original assignee: Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd.; Chemical Biology Institute
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2003-04-17

Description

曰月糸田 » 血小板由来のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリベプチドおよびそれをコ一ドするスフィンゴシンキナーゼ遺伝子技術分野

本発明は、血小板由来のスフィンゴシンキナ一ゼ活性を有するポリべプチドおよびそれをコードするスフィンゴシンキナーゼ遺伝子に関し、特に、ヒト血小板由来のスフインゴシンキナーゼ 4 (SPHK4) およびそれをコードするスフィンゴシンキナーゼ遺伝子に関する。匕

スフィンゴシンキナーゼ（SPHK) は、スフィンゴシンをリン酸化し、スフィンゴシン 1-リン酸の生成を触媒する酵素であって、主に血小板に存在している。

スフインゴシンのリン酸化によって生成するスフインゴシン 1-リン酸は、血液中の血小板に蓄積されており、血小板の活性化に伴って放出される。このスフインゴシン 1-リン酸は、血小板凝集の促進、血管壁の傷口治癒、杭がん転移、動脈硬化の防止などの種々の生理的、病理的役割を有することが知られている。

これまで、スフインゴシンキナーゼとしては、スフインゴシンキナーゼ 1 (SPHK1) (Olivera, A., et al., J. Biol. Chem. 273, 12576-125

83. (1998)、 Kohama, T.， et al., J. Biol. Chem. 273, 23722-23728.

( 1998))およびスフィンゴシンキナーゼ 2 (SPHK2) (Hong L.， et al.,

J. Biol. Chem. 275, 19513-19520. (2000) )が知られていた。

SPHK1 は、分子量 43 kDa の蛋白質であり、従来知られている SPHK の中で最も強い SPHK 活性を示す。細胞質中に多く存在し、カルモジュリンとの高い親和性を有する。スプライシング変異体として、 SPHK la

(分子量： 42.3kDa) および SPHK lb (分子量： 43.3kDa) が存在するが、これらはシグナルべプチドおよび膜貫通領域を有していない。また、 mRNA発現は、脾臓と肺で強く発現している。

また SPHK2は、分子量 6 5 k Daの蛋白質で、 SPHK活性は SPHK1の約 5 0 分の 1程度である。界面活性剤、 NaC l、 KC1 濃度依存的に活性の上昇および阻害が観察されており、この点において、 SPHK 1 と性質が逆である。スフインゴシンよりデヒドロスフインゴシンを、むしろ良い基質としている。また、 mRNA発現は、腎臓、肝臓、脳において強く発現している。

SPHK1および SPHK2はいずれも、スフィンゴシンのリン酸化を触媒する酵素であるが、これらはいずれも前記臓器において特異的に発現するものであり、血液中における SPHK を標的とする医薬品開発には適しているものではなかった。

従って、本発明の課題は、 SPHK1および SPHK2 とは異なる血小板におけるスフインゴシン - 1 -リン酸合成を司る主酵素である新規なスフィンゴシンキナーゼを提供することにある。日 Sの^

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、ヒト血小板より、 SPHK1および SPHK2 とは異なる新規なスフィンゴシンキナーゼ 4 ( SPHK4または P- SPHKという）を見出し、本発明を完成するに至った。

SPHK4 は、血小板に特異的に発現が認められる蛋白質であり、スフィンゴシン - 1 -リン酸の血小板における主な合成酵素である。したがつて、 SPHK4は血液中における SPHKを標的とした医薬品開発を可能とするヒト血小板由来の新規スフィンゴシンキナーゼである。

即ち、本発明は、血小板由来のスフインゴシンキナーゼ活性を有するポリベプチドに関する。

また本発明は、以下の（a ) または（b ) のポリべプチド：

( a ) 配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリべプチド

( b ) 配列番号 1に示されるァミノ酸配列において 1もしくは 2以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、スフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリべプチド、

に関する。

さらに本発明は、血小板由来のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリべプチドをコ一ドするスフィンゴシンキナ一ゼ遺伝子に関する。また本発明は、以下の（a ) または（b ) の核酸分子：

( a ) 配列番号 2の塩基配列からなる核酸分子

( b ) 遺伝暗号の縮重により、コドン配列が配列番号 2の塩基配列と異なるが、コードするアミノ酸配列が（a ) と同じである塩基配列からなる核酸分子、

に関する。

さらに本発明は、前記のポリベプチドをコードするスフインゴシンキナ一ゼ遺伝子に関する。

また本発明は、前記の核酸分子を含むスフィンゴシンキナーゼ遺伝子に関する。

さらに本発明は、プロモーターと作動可能に連結した前記の遺伝子を含む発現ベクターに関する。

また本発明は、前記の発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフエクシヨンされた、スフィンゴシンキナーゼを発現する宿主細胞に関する。

さらに本発明は、前記の宿主細胞を培養することを特徴とする、スフィンゴシンキナーゼの製造方法に関する。

また本発明は、前記の核酸分子および/または該核酸分子とストリンジェン卜な条件下でハイブリダイズする核酸分子を用いることを特徴とする、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の検出方法に関する。

さらに本発明は、前記の核酸分子および/または該核酸分子とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする核酸分子を用いることを特徴とする、スフインゴシン関連疾患の診断方法に関する。

また本発明は、前記のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリぺプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬に関する。

さらに本発明は、前記の核酸分子および薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬に関する。

また本発明は、前記の宿主細胞および薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬に関する。

さらに本発明は、前記のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリべプチドのスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用に関する。

また本発明は、前記の核酸分子のスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用に関する。

さらに本発明は、前記の宿主細胞のスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用に関する。

また本発明は、スフィンゴシンキナーゼ関連疾患を治療するための医薬のスクリーニング方法であって、スフィンゴシンキナーゼ 4を発現する宿主細胞の培地に標識化スフィンゴシンおよび医薬の候補となる化合物を添加し、標識化スフインゴシン 1—リン酸を定量し、該化合物のスフィンゴシンキナーゼ活性への影響を評価することを特徴とする、前記方法に関する。

さらに本発明は、前記のスクリーニング方法によって得られたスフィンゴシン関連疾患を治療する医薬。 ] ¾ίのな^日 s

図 1は、 Hi-trap Q 陰イオン交換クロマトグラフィ一溶出パターンを示すグラフである。

図 2は、 Heparin-Sepharose カラムクロマトグラフィー溶出パターンを示すグラフである。

図 3は、ハイド口キシァパタイトカラムクロマトグラフィ一溶出パ夕ーンを示すグラフである。図 4は、ヒト SPHK4のアミノ酸配列を示す図である。

図 5は、血小板における SPHK4の mRNAの発現を示す電気泳動の写真である。

図 6は、大腸菌発現系によって発現した SPHK4のスフィンゴシンキナーゼ活性を示す写真である。昍》串施するめの形

本発明において、スフインゴシンキナーゼ活性とは、スフインゴシンをリン酸化し、スフインゴシン 1 -リン酸の生成を触媒する酵素活性のことをいう。スフインゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチドとして、スフインゴシンキナ一ゼ 1型（SPHK1 ) やスフインゴシンキナーゼ 2型 ( SPHK2 ) などが知られているが、本発明のスフインゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチドとは、典型的には、スフインゴシンキナーゼ 4 ( SPHK4；配列番号 1 ) である。

アミノ酸の欠失とは、任意のアミノ酸配列から、 1 または 2以上のァミノ酸が部分的に欠失することをいう。またアミノ酸の置換とは、任意のアミノ酸配列において、 1または 2以上のアミノ酸が他のアミノ酸と置き換わることをいう。さらにアミノ酸の付加とは、任意のアミノ酸配列に、 1または 2以上のアミノ酸が付加されることをいう。

本発明のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリべプチドには、配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなるポリべプチドにおいて、アミノ酸が欠失、置換または付加したポリペプチドについても、スフインゴシンキナーゼ活性を有する限りにおいて含まれる。

本発明のスフィンゴシンキナーゼ遺伝子とは、スフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であり、典型的には、配列番号 1のァミノ酸配列からなるスフインゴシンキナーゼ 4をコ一ドする遺伝子である。このスフインゴシンキナーゼ 4をコードする遺伝子は、典型的には、配列番号 2の塩基配列からなる核酸分子からなる遺伝子である。また本発明のスフィンゴシンキナーゼ遺伝子には、遺伝暗号の縮重により、コドン配列が配列番号 2の塩基配列と異なるが、コードするアミノ酸配列が配列番号 2の塩基配列からなる核酸分子と同じである核酸分子からなる遺伝子も含まれる。ここでいう遺伝暗号とは、ポリべプチドのアミノ酸配列を規定するための情報をもつ塩基配列のことである。なお本発明の塩基配列は、 DNA、 RN Aおよび c DN A配列を含む。ここで遺伝暗号の縮重について説明する。例えば、ロイシン残基は、コドン CTA、 C T C、 CT G、 CT T、 T TAおよび T T Gによりコ —ドされることが可能であり、これら 6つのコドンの各々は、ロイシン残基をコードするという目的に関して等価である。このようなアミノ酸残基と塩基配列の関係は、当業者にはよく知られている。このようなァミノ酸について複数のコドンが存在する状況では、 1つのアミノ酸配列をコードする遺伝子について、複数の塩基配列からなることができるが、本発明はこれらの遺伝暗号の縮重によって生じる塩基配列からなる核酸分子についても包含する。

本発明に用いることができるプロモーターは、作動可能に連結する核酸分子を転写することができるものであれば特に限定されない。具体的なプロモ一夕一としては、 CMV、 SV40、 PGK、 EF321、 MC1、 TK、 Plac、 Pt acなどが挙げられる。特に、大腸菌（E. coli) などの細菌で発現させるためには Ptac、 Placが好ましい。また、発現量の観点からは、 CMV、 EF321が好ましい。

本明細書において、「作動可能に連結する」とは、プロモーターなどの調節配列と SPHK4遺伝子などのコード配列が直接または間接的に連結され、コード配列の遺伝子の発現，転写などが、調節配列の影響下または制御下にあるように機能的に連結していることをいう。

コード配列がポリベプチドに翻訳されることが望ましい場合、例えば、プロモーターの誘導によって、コード配列の転写をもたらす。そして双方の D N A配列間の連結が、（ 1 ) フレームシフト突然変異の導入を生じない、（ 2 ) コード配列の転写を指図するプロモー夕一領域の能力を妨げず、あるいは（ 3 ) タンパク質に翻訳される対応する R N A転写物の能力を妨害しないならば、 2つの D N A配列は作動可能に連結されているといえる。

本明細書において、「ベクタ一」とは、異なる遺伝子環境間での運搬のために、または宿主細胞中での発現のために、制限酵素処理およびラィゲーシヨンなどにより所望の配列が挿入され得るものである。ベクタ —は、典型的には D N Aで構成されるが、しかし、 R N Aベクターも利用可能である。ぺク夕一としては、プラスミド、ファージミドおよびゥィルスゲノムなどが挙げられるが、これらに限定されない。クロ一ニングベクターは、宿主細胞内において、自律的に、あるいは宿主細胞中のゲノムに組込み後に、複製し得るものである。発現べクタ一は、コード配列が調節配列に作動可能に連結されており、コード配列の遺伝子が R N A転写物として発現され得るものである。

ベクタ一には、細胞が該ぺク夕一で形質転換またはトランスフエクトされているか否かを同定するのに用いるのに適した 1つまたはそれ以上のマ一力一配列を含含むことができる。マ一力一としては、例えば、抗体またはその他の化合物に対する耐性または感受性を増大または低減するタンパク質をコードする遺伝子（例えば、カナマイシン抵抗性遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子など）、活性が標準的な方法により検出可能な酵素（例えば、 ?一ガラクトシダ一ゼ、アルカリ性ホスファタ —ゼ、ルシフェラ一ゼなど）をコードする遺伝子、および形質転換細胞またはトランスフエクシヨンされた細胞、宿主、コロニーまたはブラークの表現型（例えば、緑色蛍光タンパク質（G F P ) など）を視覚的に検出できる遺伝子などが挙げられる。

このようなベクタ一の例としては、クロ一ニングベクターとして、 pB lueScriptl l SK( + )、 pBlueScript l l SK( - )、 pcDNA3-FLAGl、 pcDM3-HAl、 pEGFP-N pEGFP-C pcDNA などが挙げられる。また、発現べクタ一として、 pGEX-2T、 pMAL- C2が挙げられる。これらのうち、発現効率、発現後の回収率、検出効率、発現蛋白質の可溶化などの観点から、それそれ pcDNA3-FLAG pMAい C2が好ましい。

また、マーカ一としては、抗- FLAG M2抗体、抗 -FLAG M5抗体、 GFPなどが好ましい。

「ストリンジェントな条件」とは、通常知られた核酸ハイプリダイゼーシヨンが行われ得る条件のことをいい、たとえば、 Molecular Clonin g: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al. , eds.， Second Eaiti on, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ne York, 1989または Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al . , eds. , John Wiley & Sons, Inc. , New York などに記載されている。

特に本明細書におけるストリンジントな条件とは、例えば、ハィブリダィゼーシヨン溶液（ 5 X S S C、 1 O xデンハルト（Denhart' s) 溶液、 1 OmM N a H ₂ P 0₄ (pH 6.5), 0. 5 %S D S、 50%ホルムアミド）中での 6 8 °Cでのハイブリダイゼ一ションを指す。

本発明のスフインゴシンキナーゼ遺伝子の検出方法は、例えば、配列番号 2で示される塩基配列より、適当なマーカーで標識化したプローブを作製し、該プローブを試料から得られた核酸とハイプリダイズすることによって行なうことができる。このようなハイプリダイズはスフィンゴシン関連疾患の診断方法においても利用可能である。

本発明に用いられる宿主細胞は、スフィンゴシンキナーゼ 4が発現可能であれば、原核細胞および真核細胞のいずれでもよく、特に限定されない。また動物細胞、植物細胞、糸状菌、細菌などのいずれの細胞であつてもよい。さらに具体的には、 C0S7、 HEK293, He 、 CH0、 H.end FB、 Jurkat MEG-O CMK などが挙げられる。特に好ましい細胞は、トランスフエクションした場合に発現量が多いという観点から、 C0S7である。宿主細胞の培養は、通常知られている方法を用いればよく、特に限定されない。 C0S7、 HeLaを宿主細胞として用いる場合は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM) (組成： 2mM グル夕ミン、 100 zg/ml ストレプトマイシン、 100U/ml ペニシリン、 10%ゥシ胎仔血清）を用いて、 37°C、 5 % C 0 ₂条件下で培養する。

本明細書において、スフインゴシン関連疾患とは、スフインゴシンのリン酸化が過剰、不足または欠損していることによって起きる疾患 ·障害のことをいう。また、スフインゴシンのリン酸化が過剰、不足または欠損以外の原因によって起きる疾患であって、スフインゴシンのリン酸化を調節することによって治癒可能な疾患 ·障害も含まれる。

このようなスフインゴシン関連疾患は、具体的には、動脈硬化、癌、アレルギー、心筋梗塞が挙げられる。

したがって、本発明の医薬は、スフインゴシン関連疾患治療薬として用いることができる。さらに、血管新生促進剤、抗癌転移剤、動脈硬化防止剤などとして用いることができる。本発明の医薬の有効成分として、 SPHK4 などの血小板由来のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリべプチド、それをコードする核酸分子、または分泌型スフインゴシンキナ —ゼを発現する宿主細胞などが用いることができる。

本明細書の薬学的に許容し得る担体とは、本発明のポリペプチド、核酸分子および宿主細胞が安定に保たれ、薬学的に有効な投与を可能にし、実質的に非毒性である担体を意味する。具体的な担体としては、水、ヮセリン、鉱油、植物油、動物油、有機または無機ヮックス、キサンタン、ゼラチン、セルロースまたはアラビアゴムのような天然ポリマ一、合成ポリマー、アルコールなどである。

本発明の医薬は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与等の投与形態によって投与することができ、剤形は投与形態に適した剤形を適宜選択することができる。例えば、散剤、顆粒、ペレット若しくは錠剤、コーティング剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤等の経口投与に適した剤型、または注射剤、点滴剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、噴霧剤などの非経口投与に適した剤型にすることができる。これらの製剤は、医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて造ることができる。補助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等が挙げられる。これら医薬製剤の投与量は、症状、年齢、体重、投与方法及び剤形等によって異なるが、通常は成人に対して 1 日あたり、上限が 10m g〜2 0m g、下限が l m g〜2 m gであり、好適な投与量は 5m gである。本発明のスフィンゴシンキナーゼ関連疾患を治療するための医薬のスクリーニング方法は、例えば、配列番号 1で示されるポリペプチドのァミノ酸配列から SPHKに対する特異的な抗体を作製し、試料に対して、該抗体を用い、ウエスタンブロッテイング、免疫沈降法などをおこなうことにより可能である。

また配列番号 2で示される塩基配列から、 SPHKに対する特異的な標識化プローブを作製し、試料に対してノーザンプロットなどを行なうことにより可能である。

これらの方法により得られた医薬を、インビトロの系において、所望の特性（例えば、 SPHK活性を阻害する性質）を指標にさらに選抜し、その後に動物実験を通して各種疾患への検討を経ることによって、所望の特性を有する医薬をスクリーニングすることができる。

スクリーニング方法には、次に示す方法が例示される。

スフィンゴシンキナーゼ活性阻害剤のスクリーニングにおいては、 SP HK4発現細胞の培地プレー卜に³ H -スフィンゴシンを添加し、培地中に生成する³ H -スフィンゴシン 1―リン酸を TLCまたは HPLCで定量する。この系において、培地に阻害剤の候補となる化合物を加え、前記活性の強弱を指標に抑制効果のある化合物をスクリーニングすることができる。スフインゴシンの標識化は³ Hによるものに限らず、標識となるものであれば、適宜選択でき、抗体を用いる場合には、ィムノアツセィを利用して活性を定量化することも可能である。このようなスクリ一ニングによって得られた阻害剤は、血中の過剰なスフィンゴシン 1-リン酸の生成を制御することが可能であり、例えば、血小板輸血毒性抑制剤、血小板安定化剤などに用いることができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 (実施例 1 ) サイトゾルおよび膜の分画ならびに血液血小板からの 1M NaCl抽出画分の調整

北海道赤十字センター（北海道、日本）より分譲されたァゥトディトの濃厚血小板溶液を 2000 xgで 15分間遠心分離した。ペレツト状の血小板を Hepes / Tyrodeバッファ一（129 m NaCl、 8.9 mM NaHC0₃、 0.8 mM KH₂P0₄、 0.8mM MgCl₂、 lOm Hepes, pH 7.4、 2 mM EGTA)で 3回洗浄した。洗浄した血小板をバッファー A (20 mM Tris-HCK pH 7.5、 0.25 m M EDTA、 1 mM ジチオスレィトール）に再懸濁し、超音波処理し、 4 °C、 100， 000 xgで 30分間遠心分離した。

膜画分は、 1M NaClを含むバッファー Aに再懸濁し、氷上で 1時間撹拌した後に、 100，000xgで 30分間遠心分離した。得られた上清を透析し、 Centriprep- 10 Consentratorで濃縮し、 10%スクロースを含むバヅファー Aで希釈し、最終塩濃度が 100mM以下になるまで再濃縮した。サィトゾル画分および 1M NaCl抽出画分は、使用まで— 80°Cで保存した。

(実施例 2 ) 免疫沈降および SPHK分析

血小板画分を 1 mM フエニルメチルフルオリド、 1 mM EDTA を含む溶解バッファ一（20 mM Tris-HCK pH 7.5、 1 % (w/v) Triton X- 100 (sig ma)、 l¾(w/v) Tween-40, 0.85 % NaCl)に懸濁した。溶解物を超音波処理し、 100,000xgで 30分間遠心分離し、得られた上清（300 zgの蛋白質）および MBP- SPHK1 (対照の蛋白質）を l gの抗- SPHKla抗体および 50 1のプロティン Aセファロース CL- 4B 1:1懸濁液（Amersham Pharma cia Biotech)とともに、 4°Cで 12 時間インキュベートした。抗- SPHKla 抗体は、坂野博士（岐阜大学、岐阜、日本）より分譲していただいた。免疫複合ビーズを 3,000xgで 5分間遠心分離することにより回収し、溶解バッファ一で 3回洗浄した。上清およびペレツ卜について SPHK 活性をアツセィした。

(実施例 3) スフインゴシンキナーゼ活性のアツセィ試料および 10 1の 1 mMスフインゴシン（5% Triton X-100に溶解）をバッファ一 B( 20 mM Tris-HCK pH7.5、 10% グリセロール、 1 mM ジチォスレイトール、 0.25 mM EDTA、 1 mM オルトバナジウム酸ナトリゥム、 20 mM ? -グリセ口ホスフェート、 5mM NaF、 1 mM フエニルメチルフルォリドおよび 1 mM 4-デォキシピリドキシン）と全量が 190 1 となるように混合し、 MgCl₂ (200 mM)を含む [³²P] ATP (10 Ci， 20 mM)を IOJLI加えることで反応を開始し、 37°Cで 15分間ィンキュベ一トした。そののち、 20 〃1の 1 M HC1を加え反応を止め、次いで 0.8 mlのクロ口ホルム/メタノール/ HC1 (100:200:1、 v/v)を加えた。激しく撹拌した後、クロ口ホルム 240 /1および 1 M KC1 240 〃1 を加え、懸濁液を 2， 000 X gで 1分間の遠心分離によって分離した。有機層の脂質を分離、濃縮し、 1-ブ夕ノール/エタノール/酢酸/水（80:20:10:20、 v/v)でシリ力ゲル 60HPTLCプレートに再溶解し、ォ一トラジォグラフィ一によつて視覚化した。スフィンゴシン 1 -リン酸に対応する放射性のスポットを P hospho Imager BAS-2000 (富士フィルム、日本）で定量化した。スフインゴシンキナーゼ特異的な活性は、 mg蛋白質あたり毎分形成されるスフィンゴシン 1 -リン酸の pmol として表される。

(実施例 4 ) 血液血小板からの NaCl抽出可能な SPHK活性の部分精製 Hitrap-Q陰イオン拇クロマトグラフィーによる部分焙製

上記の 1M NaCl抽出物を FPLC equipment (Amersham Pharmacia Biot ech)に連結し、あらかじめ流率 0.5 ml/min でバッファー Bによって平衡ィ匕された Hitrap-Q sepharose Fast Frow column Amersham Pharmac ia Biotech)にアプライした。溶出物の 280 nmでの吸光度が 0.05未満になるまでバッファー Bで洗浄した。結合した蛋白質は、 0〜0.5M NaCl の 10 mlのリニアグラジェントによって、流率 0.5 ml/minで溶出した。 l mlの画分を収集し、各画分の SPHK活性を分析した。

結果を図 1に示す。 SPHK活性は、 0.3M NaCl付近に活性が溶出した。 Heparin-Sepharoseカラムクロマトグラフィーによる蟮製

活性のある画分をフ。一ゾレし、 Centriprep-10 Consentrator (Amicon) を用いて濃縮し、バッファ一 C(MES-NaOH、 pH 6.0、 5 % グリセロール、 0.25 mM EDTA、 5mM NaF、 1 mM ジチオスレィトール、 1 mM オルトバナジゥム酸ナトリウム、 20 mM ?-グリセ口ホスフェート、 1 mM フエニルメチルフルオリド、 1 mM 4-デォキシピリドキシン）によってあらかじめ平衡ィ匕された Hitrap - Heparin sepharose Fast Frow column (Amersham Pharmacia Biotech)に流率 0.3 ml/minでロードした。溶出物の 280 n mでの吸光度が 0.05未満になるまでバッファー Cで洗浄した。結合した蛋白質は、 0〜1M NaClの 10 mlのリニアグラジェントによって、流率 0. 3 ml/minで溶出した。 0.5 mlの画分を収集し、各画分の SPHK活性を分祈した。

結果を図 2に示す。 SPHK4 はへパリンに対する強いァフィ二ティが認められ、 0.5〜0.6M NaCl付近に強い SPHK活性が濃縮されて溶出されている。この結果よりも本蛋白質がへパリンとの相互作用を持つ可能性が示され、へパリン結合モチーフの存在が予想される。ハイドロキシァパタイトカラムクロマトグラフィ一による部分饍製

活性のある画分をプールし、バッファー D (リン酸カリウム、 pH 6.8、 5¾ グリセロール、 5mM NaFs 1 m ジチオスレィトール、 1 mM オルトノナジゥム酸ナトリウム、 20 mM ?-グリセ口ホスフエ一ト、 1 mM フエ二ルメチルフルオリド、 1 mM 4-デォキシピリドキシン）であらかじめ平衡化したハイドロキシァパタイトカラム（Bio-Rad)に流率 0.5 ml/minで口一ドした。 0.5 mlの画分を収集し、各画分の SPHK活性を分析した。結果を図 3に示す。ハイドロキシァパタイトカラムにより、きわめてシャープに本酵素の活性が分離されている。溶出はリン酸カリウムによる濃度勾配法により行った。この段階で溶出された活性フラクションをアミノ酸配列分析に利用した。 (実施例 5 ) SPHK4のアミノ酸配列の決定

活性のある画分をプールし、バッファー Bであらかじめ平衡化した R esource-Q Column (Amersham Pharmac ia Biotech )に流率 0.5 ml/min でロードした。 0.25 mlの画分を収集し、各画分の SPHK活性を分析した。

SPHK活性のピークを含む画分を SDSを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS- PEGE) に供試した。 SDS-PAGEによって分離した蛋白質をポリビニリデンジフルオリド膜（I匪 obi lon P, Mi l l ipore AB )に転写し、クマシ一ブル一（Coomassie Blue) で染色した。バンドを切り出し、メ夕ノ——ノレ ίこ浸し、 Proc ise 492 protein sequencing system ( PE Appl ie d B iosystems )でのアミノ酸配列分析に供試した。アミノ酸配列の決定は、製造者の方法に準じて行なった。

結果を図 4および配列番号 1に示す。なお、図中網掛けの部分は、既知のスフインゴシンキナーゼとの N末端アミノ酸配列一致部分を示している。

SPHK4 (配列番号 1 ) は 416アミノ酸より構成され、等電点が 8.6 (理論値）である塩基性蛋白質である。また、リン酸化部位として、 PKC リン酸化部位、カゼィンキナ一ゼリン酸化部位、 cAMP、 cGMPプロティンキナ一ゼリン酸化部位を有している。さらにカルモジュリン結合ドメイン、へパリン結合モチーフ、 ATP結合ドメインも有している。

特にへパリン結合モチーフは、既知の SPHKは有しておらず、 SPHK4の特性の大きな特徴である。 SPHK4のへパリン結合性は、前記の SPHK4の部分精製においてへパリンァフイエティーカラムを用いることができたことからも推測されたが、本発明者らの研究により、特に FGFタイプのへパリン結合モチーフの存在がつきとめられた。

SPHK が血小板から放出された場合、このへパリン結合性を反映して、細胞外マトリックスや細胞表面のへパリンやへパラン硫酸が、そのリザ一バーとして働くことが示唆されていることから、血小板由来の種々の医薬を考える上で重要な特性といえる。 (実施例 6 ) ヒト SPHK4 cDNAのクロ一ニング

SPHK4の N末端配列は、 GenBankでのヒト K IAA c lonel646 (c lone : BA B33316 )の推定アミノ酸配列に対応する。このクローンは、かずさ DNA 研究所（千葉、日本）によって寄託されており、 Sal I-Not I サイトに 4171 塩基対の断片が挿入されている pBluescript I I SK+を長瀬博士より分譲いただいた。 5，順方向プライマ一（5， p-SPHKプライマー： 5， -GAATCCATGCTGGAGAAGCTG-3 ' ；配列番号 3 ) は N 末端アミノ酸配列ぺプチド（MLEKL；配列番号 5 ) の配列に基づいており、 3 ' 逆方向プライマ — ( 3， p-SPHKプライマ一： 5， -GAATCCTCAGCTGTGTGAGTC-3 ' ；配列番号 4 ) は KIAA 1646 cloneの終止コドンの配列に基づいている。 Taq DNA ポリメラ一ゼ、 5， p- SPHKプライマーおよび 3， P- SPHKプライマ一を用いて cDNA を増幅した。 94 °C、 45秒間の変性、 60 °C、 1 分間のァニーリングおよび 72 °C、 45秒間の伸張を 1サイクノレとし、 30サイクルの PCR反応を行なった。結果、 1251塩基対の PCR産物が得られた。増幅した PCR産物は、 Mag Extractor (東洋紡）を用いてァガロースゲルから精製し、 pGEM-T easy vector (Promega)にライゲ一シヨンし、さらに大腸菌 XLl-Blue系統を形質転換するのに用いた。ポジティブクローンを 50 g/ml アンピシリン、 40 g/ml X - gal ( 5 - bromo - 4 - chloro - 3 - indolyl ? -D-galactpranoside ), 100〃M イソプロピル- /? -D-チォガラクトシド (これらの薬品は Sigma より入手）を含む LB寒天培地（Difco )上で選抜した。プラスミド DNAをポジティブクローンから精製し、 EcoR I ( Sigma) で制限酵素による消化をすることによって、クローニングされた PCR産物の存在を確認した。クローニングした DNAは AB I 377 DNAシークェンサーを用いて配列を決定した。

結果を配列番号 2に示す。

(実施例 7 ) ヒト SPHK4 cDNAの発現

発現べクタ一 pMAL- c2 (New England Biolabs )を用いたが、これは N- 末端に MBP (マルトース結合蛋白質）タグ（tag) を含む蛋白質を発現するように設計されている。この発現べクタ一を 37°C、 1時間で、制限酵素 BamHIによる消化を行ない直線状にして、アル力リホスファターゼ処理した。その後、ァガロースゲルから精製した。調製した pMAい c2への SPHK4 cDNAのライゲ一ションに続いて、ベクタ一を大腸菌 XL1- Blue系統の形質転換に用いた。ポジティブクローンを AB I 377 DNAシークェンサ一を用いて確認したところ、該クローンは、 SPHK4 cDNAの正常なフレ —ムと配位を有することが確認された。

ポジティブクローンを 50〃g /ml アンピシリンを含む LB broth培地に植菌した。培養物を吸光度 A_6()Qが 0.5〜0.7に達するまで 37°Cでィンキュベ一トし、その後、終濃度を 0.5 mMとなるようにィソプロピル- -D-チォガラクトシド（Sigma)を加え、同条件でさらに 3時間インキュべ一卜した。大腸菌の沈殿を集め、超音波処理によって破砕し、細胞残渣を遠心分離により除去した。上清をアミロース樹脂（New England Biola bs )にロードし、 MBP融合蛋白質を捕捉した。吸光度 A_28fl が 0.005になるまで、ノッファー Bで洗浄した後、平衡化された 10mM マルトースを用いて、組換え SPHK4の溶出を行なった。

なお、発現の誘導は、常法に従い、 IPTGにより行ない（37°C、 4時間、終濃度 0. 5mM)、誘導した SPHK4の SPHK活性を実施例 3と同様にアツセィした。その結果を図 6に示す。 IPTGによる SPHK4遺伝子の発現誘導をしていないものにはほとんど見られないスフインゴシン一 1一リン酸のスポット（図中矢印の位置）が、 IPTGによる誘導をしたものには明確に現れており、挿入した SPHK4遺伝子のコ一ドするポリべプチドが SPH K活性を有することを確認した。

(実施例 7 ) RT-PCR分析

mRMの単離のために、 Sepacel l PLX-5A-ILS (旭メディカル株式会社）を用いて血小板を前記と同様に、ただし白血球が混入しないようにして調製した。貫流した試料を 2，000 X g、 10 分間、 22 °Cで遠心分離し、上清を血小板のペレツトから注意深く除いた。 mRNAを QuickPrep Micro mRNA purification kit (Amersham Pharmacia Biotech)を用いて、ヒト血小板から単離した。使用まで mMA調製物を分けて、 — 80°Cで凍結した。

デ—夕ペース中のヒト _SPHKファミリ— （SPHK1および SPHK2) および血小板因子 4 (PF-4) のヌクレオチド配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマ一を調製した。 Π- PCRは、テンペレート mRNA (50ng) に S uper Script One-Step RT-PCR system (Life Tecnnologies, In )を用いて、サーマルサイクラ一（GeneAmp PCR system 9700、 PE Applied Biosystems)にて、以下の条件で行なった。

反応条件：（1) 50 °C、 30分間、（2) 94 °C、 2分間、（3) 94 °C、 15秒間、（4) 58 °C、 30秒間、（5) 72 °C、 30秒間、（6)(3)から（5)を 40サィクル繰り返し、そして（7) 72 °C、 1 分間。

RT-PCR産物は、 1%ァガロースゲル電気泳動において視覚化し、そのヌクレオチド配列を ABI 377 DNAシークェンサ一で確認した。

SPHK4の m Aが血小板において発現しているか否かについて明確にするため、血小板からの全 RNAを抽出し、前記プライマ一（配列番号 3および 4 ) を用いて RT- PCR を行った。結果を図 5に示す。なお、対照として、 PF- 4についても同様に PCR反応を行い、また逆転写酵素を加えないもの（図中 RT (-) と表す）についても検討した。図 5に示すように、血小板において SPHK4の mMAが発現していることが確認された（図中矢印の位置）。誘卜の禾 II の T 小牛

本発明によれば、ヒト血小板より、 SPHK1および SPHK2 とは異なる新規なスフインゴシンキナーゼ 4 (SPHK4) が得られた。この SPHK4 は、スフィンゴシンキナーゼ活性があり、スフィンゴシン関連疾患の治療のための医薬として用いることができる。

特に、既知の SPHK1および SPHK2と比べて、血小板に特異的に発現する点で優れており、血中での直接的な医薬品の作用に役立つ。具体的には、血小板輸血毒性抑制剤、血小板安定化剤などに用いるのに適していまた、本発明の SPHK4および SPHK4遺伝子を用いて、スフインゴシン関連疾患の診断等にも応用することができる。

Claims

言青求の範囲

I . 血小板由来のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリべプチド

2 . 以下の（ a ) または（b ) のポリぺプチド：

( a ) 配列番号 1に示されるァミノ酸配列からなるポリベプチド

( b ) 配列番号 1に示されるァミノ酸配列において 1もしくは 2以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、スフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリべプチド。

3 . 血小板由来のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリぺプチドをコードするスフィンゴシンキナゼ遺伝子。

4 . 以下の（ a ) または（b ) の核酸分子：

( a ) 配列番号 2の塩基配列からなる核酸分子

( b ) 遺伝暗号の縮重により、コドン配列が配列番号 2の塩基配列と異なるが、コードするアミノ酸配列が（a ) と同じである塩基配列からなる核酸分子。

5 . 請求項 2に記載のポリべプチドをコードするスフインゴシンキナ —セ遺伝子。

6 . 請求項 4に記載の核酸分子を含むスフィンゴシンキナーゼ遺伝子。

7 . プロモーターと作動可能に連結した請求項 3または 4に記載の遺伝子を含む発現ベクター。

8 . 請求項 7に記載の発現べクタ一を用いて形質転換またはトランスフエクシヨンされた、スフィンゴシンキナーゼを発現する宿主細胞。

9 . 請求項 8に記載の宿主細胞を培養することを特徴とする、スフィンゴシンキナーゼの製造方法。

1 0 . 請求項 4に記載の核酸分子および/または該核酸分子とストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする核酸分子を用いることを特徴とする、スフインゴシンキナーゼ遺伝子の検出方法。

I I . 請求項 4に記載の核酸分子および Zまたは該核酸分子とストリンジヱン卜な条件下でハイブリダィズする核酸分子を用いることを特徴とする、スフインゴシン関連疾患の診断方法。

1 2 . 請求項 1または 2に記載のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリべプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬。

1 3 . 請求項 3または 4に記載の核酸分子および薬学的に許容し得る担体を含む、スフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬。

1 4 . 請求項 8に記載の宿主細胞および薬学的に許容し得る担体を含む、スフインゴシン関連疾患を治療するための医薬。

1 5 . 請求項 1または 2に記載のスフィンゴシンキナーゼ活性を有するポリぺプチドのスフインゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用。

1 6 . 請求項 3または 4に記載の核酸分子のスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用。

1 7 . 請求項 8に記載の宿主細胞のスフィンゴシン関連疾患を治療するための医薬への使用。

1 8 . スフィンゴシンキナーゼ関連疾患を治療するための医薬のスクリーニング方法であって、スフィンゴシンキナーゼ 4を発現する宿主細胞の培地に標識化スフィンゴシンおよび医薬の候補となる化合物を添加し、標識化スフインゴシン 1 _リン酸を定量し、該化合物のスフインゴシンキナーゼ活性への影響を評価することを特徴とする、前記方法。

1 9 . 請求項 1 8に記載のスクリーニング方法によって得られたスフィンゴシン関連疾患を治療する医薬。