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WO2003030888A1 - Antiradicals and fat compositions, foods, drinks, drugs or feeds containing the antiradicals - Google Patents

Antiradicals and fat compositions, foods, drinks, drugs or feeds containing the antiradicals Download PDF

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WO2003030888A1
WO2003030888A1 PCT/JP2002/010471 JP0210471W WO03030888A1 WO 2003030888 A1 WO2003030888 A1 WO 2003030888A1 JP 0210471 W JP0210471 W JP 0210471W WO 03030888 A1 WO03030888 A1 WO 03030888A1
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vinyl
oil
extract
radical
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PCT/JP2002/010471
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French (fr)
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Shigeru Morimura
Kenji Kida
Hiroshi Maeda
Fumi Yasuda
Daisuke Wakamatsu
Jun Tsunehiro
Chiaki Nakai
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JAPANESE RESEARCH AND DEVELOPMENT ASSOCIATION FOR NEW FUNCTIONAL FOODS
Original Assignee
JAPANESE RESEARCH AND DEVELOPMENT ASSOCIATION FOR NEW FUNCTIONAL FOODS
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • Anti-radical agent fat / oil composition containing the agent, food and drink, pharmaceutical, or feed
  • the present invention relates to an anti-radical agent, an oil / fat composition containing the agent, a food / drink, a drug, or a feed.
  • Lipid peroxides alkyl hydroperoxides
  • lipid radicals are generated inside, it is considered that intestinal epithelial cells are easily brought into contact with and damaged by intestinal epithelial cells, and into chylomicron and taken up by the lymphatic system to reach the blood.
  • LDL low-density lipoprotein
  • HDL high-density lipoprotein
  • a free radical scavenger obtained by extracting sesame seeds or degreased germ products of the sesame seeds with water and / or a hydrophilic organic solvent JP-A 2000-236847.
  • fat-soluble anti-radical agents are important, considering their use in fats and oils products and their effectiveness in vivo.
  • fat-soluble antiradical agents include BHA (butylhydroxylanisol) and BHT (butylhydroxytoluene), which are chemically synthesized and tend to be avoided.
  • BHA butylhydroxylanisol
  • BHT butylhydroxytoluene
  • tocopherol As a fat-soluble antioxidant derived from natural products, tocopherol is known, but tocopherol has a certain effect in suppressing the oxidation of ordinary foods. Effect is not enough.
  • An object of the present invention is to obtain a highly active fat-soluble antiradical agent derived from a natural product, which can enhance the stability of a food (oil / fat composition) and at the same time prevent oxidative damage in a living body.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and have found that alcohol extracts of rapeseed crude have high anti-radical activity. As a result of further studies, the present invention has been completed.
  • the present invention has the following configuration.
  • An anti-radical agent containing 4-vinyl-1,2,6-dimethoxyphenol as an active ingredient.
  • An anti-radical agent consisting of an extract of rapeseed crude oil containing 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol.
  • the rapeseed oil is treated with alcohol or hydrous alcohol.
  • An oil or fat composition comprising the anti-radical agent according to the above 1, 2, 3, 4 or 5.
  • the antiradical agent of the present invention is characterized by using 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol as an active ingredient.
  • the alcohol extract of rapeseed oil was found to have high anti-radical activity, and when the active ingredient was searched for, it was found that it was 4-vinyl-1,2,6-dimethoxyphenol. It has been reached.
  • 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol which is an active ingredient of the antiradical agent of the present invention, is excellent in that it is easily soluble in fats and oils and has high antiradical activity.
  • Antioxidants extracted from conventional rapeseed defatted lees are hardly fat-soluble, but the active ingredient of the anti-radical agent of the present invention is extracted from rapeseed crude oil and is easily soluble in fats and oils. It is easy to use as an antioxidant for fat and oil compositions.
  • this anti-radical agent When this anti-radical agent is ingested, it is fat-soluble and has a high affinity for cell membranes in vivo, and works effectively in lipid-rich cell membranes and organs where water-soluble anti-radical agents are unlikely to act. .
  • the active ingredient of the present anti-radical agent is obtained from an extract of rapeseed crude oil. This is advantageous in terms of raw materials and safety.
  • the oil / fat composition to which the present anti-radical agent is added improves not only the anti-radical property but also the stability.
  • 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol which is an active ingredient of the anti-radical agent of the present invention, is readily soluble in fats and oils and has high anti-radical activity. This indicates that the selection of the component has a special significance.
  • Figure 1 shows the measured NMR of isolated and purified 4-vinyl-1,2,6-dimethoxyphenol.
  • Figure 2 shows the measurement of HPLC of 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol.
  • Rapeseed oil is oil and fat obtained from seeds of rapeseed belonging to Brassica family (Cruciferae), and rapeseed crude oil used for extraction can be selected from compressed oil, extracted oil, degummed oil, etc. .
  • Examples of the alcohol used for the extraction include methanol, ethanol, propanol, butanol, and hydrates thereof.
  • the preferred water content for extraction depends on the alcohol, but is 0 to 10% by volume for methanol and 5 to 20% for ethanol.
  • the extraction conditions are not particularly limited.
  • the temperature is 10 to 85 ° C, and extraction can be suitably performed at room temperature.
  • Extraction efficiency can be increased by shaking extraction or extraction with an extractor equipped with a stirrer or the like.
  • the extraction time is several minutes to several hours. The longer the extraction time, the more the extraction is completed, but the concentration of 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol in the extract may be low.
  • the raw material is extracted with 0.1 to 20 times the amount of alcohol, and the same extraction operation is preferably repeated two to three times.
  • This extraction is a liquid-liquid extraction of oil and fat, and the alcohol fraction is separated and concentrated to obtain an extract containing 4-vinyl-1,2,6-dimethoxyphenol.
  • ethanol has relatively high compatibility with fats and oils.
  • 4-Vinyl-2,6-dimethoxyphenol which is an active ingredient of the anti-radical agent of the present invention, can also be concentrated by distilling rapeseed crude oil.
  • Distillation may be performed using any apparatus, for example, a thin-film or centrifugal distillation apparatus can be used.
  • a high vacuum distillation apparatus molecular distillation apparatus
  • the distillation conditions are not particularly limited.
  • the temperature is 70 to 300 ° C.
  • the pressure is 0.1 to 10 ° C.
  • the time is preferably several minutes to several hours.
  • Distillation is sufficient to perform distillation at high temperature and high vacuum for a long time, but other components in rapeseed crude oil are also distilled, lowering the concentration of 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol in the distillate.
  • distillation is performed at 130 to 180 ° C., 10 minutes to 2 hours, and 1.0 to 3.0 Torr. By blowing steam, the distillation efficiency can be further increased.
  • 4-vinyl-1,2,6-dimethoxyphenol can be used, if necessary, for two-layer separation, column chromatography, thin-layer chromatography (TLC), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Etc., can be purified, separated and concentrated.
  • the amount of 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol in the antiradical agent should be 0.2% by weight or more.
  • the methanol, ethanol extract, distillate, etc. will be directly resistant. It can be used as a radical agent.
  • This anti-radical agent may be ingested as it is, but it is blended with a general fat-and-oil composition such as refined edible oil to obtain an anti-radical oil-and-fat composition.
  • An anti-radical food or drink can also be obtained.
  • Products to which the present anti-radical agent is added have improved stability as well as anti-radical properties.
  • Foods and drinks include, for example, confectionery (gum, candy, caramel, chocolate, cookie, snack, jelly, gummy, confectionery, etc.), dairy (soba, udon, ramen, etc.), dairy products (milk, Ice cream, yogurt, etc.) and beverages (use, coffee, tea, tea, carbonated drinks, sports drinks, etc.).
  • Additives such as a deterioration inhibitor, a sweetener, a flavor, a coloring agent, an emulsifier, an antioxidant, and a bulking agent can be appropriately added to the food or drink.
  • the antiradical agent / antiradical oil / fat composition can be added to pharmaceuticals, cosmetics, feeds, and the like to obtain antiradical drugs, cosmetics, feeds, and the like.
  • the composition becomes an anti-radical fat / oil composition, and its effect can be fully exerted.
  • the collected eluted fractions were collected in an eggplant flask, and the solvent was distilled off in an evaporator. The solvent was distilled off to obtain 144 mg of a black-mouthed form fraction, 205 mg of an acetone fraction, and 42 mg of a methanol fraction.
  • the solvent was distilled off to obtain 144 mg of a black-mouthed form fraction, 205 mg of an acetone fraction, and 42 mg of a methanol fraction.
  • this porcine form fraction was used in the next step.
  • the yellow band on the plate was confirmed, and the desired substance was scraped off with a spatula together with the silica gel.
  • the mixture was shaken well, and the silica gel was filtered off through a glass filter.
  • the solvent was evaporated in the evaporator to obtain 13 mg of a concentrate. The obtained concentrate was used for the next step.
  • HP LC elution was performed using 2 mg of the concentrate obtained in step 4 under the following conditions. 100% of eluent A flows from 0 to 20 minutes, and eluent A 100% from 20 to 25 minutes A linear gradient was applied from 100% to B 100%, and eluent B was flowed 100% after 25 minutes. 4. The single peak observed around 5 minutes was collected. The yield was 1 mg.
  • UV detector 300nm, 450mn
  • the sample was dissolved in methanol, and measured by AP C I (+) using LC / MS (J EOL, JMS-LC matte).
  • the m / z of the low-resolution MS of the main component was 18 1.
  • the molecular weight of the m / z 181 component is 180 in APC I (+) because it is easily ionized by M + H.
  • the molecular formula of the above mZz 18 1 component is C,. Since the H 13 0 3, calculated molecular weight of 18 1.0865. Since the error is little computation value and the measured value of the molecular weight, molecular formula of the main component was determined to be C .o H, 20 3.
  • this purified product was identified as 4-vinyl-12,6-dimethoxyphenol.
  • the HPLC method of (1) -1.5 was repeated several times to obtain standard 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol for quantification.
  • FIG. 2 shows the results of this analysis.
  • PMC was detected around 6 minutes (peak 3) and 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol was detected around 18 minutes (peak 7).
  • the anti-radical activity was measured by the following method.
  • Chemiluminescence is measured by a chemiluminescence method using a measurement system that uses evening butyl hydroperoxide (t-BuOOH) as a model compound for lipid peroxides (alkyl peroxide: ROOH). Determine the concentration of the test compound to be suppressed.
  • t-BuOOH evening butyl hydroperoxide
  • ROOH alkyl peroxide
  • a test sample at a predetermined concentration of 100/1 or a 6 / hydroxy-6, hydroxy-1,2,5,7,8-tetramethylchroman solution was added to a 200-fold diluted human serum solution (101).
  • 1 2 Add 10 ⁇ 1 of carboxylic acid (Trolox) solution. Next, add 180 mg / l of 3.73 mg / 1 phycoerythrin (? -PE) and preheat at 37 ° C for 1 minute. Next, add 10 ⁇ 1 of 80 mM 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) and start the reaction at 37 ° C.
  • Trolox carboxylic acid
  • ? -PE 3.73 mg / 1 phycoerythrin
  • AAPH 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride
  • a phosphate buffer 75 mM, ⁇ 7. ⁇
  • the fluorescence intensity (Ex: 540 nm, Em: 565 nm) of the reaction solution is measured every 2 minutes from the start of the reaction, and a curve graph of the fluorescence intensity (y-axis) and one hour (X-axis) is drawn.
  • the curve obtained for the test sample, Trolox and control is interposed between the X-axis and the y-axis.
  • S interview
  • Trolox specific activity (test sample S-control S) / (Trolox S-control S) X (Trolox concentration / test sample concentration)
  • AAPH generates a peroxyl radical, which oxidizes the substrate? -PE, resulting in a reaction in which the fluorescence of? -PE disappears.
  • Trolox is a derivative of water-soluble vitamin E and is used as a reference substance for antioxidant activity in this test system.
  • These reaction substrates and reference substances are used in the ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) method.
  • the ORAC method is a widely used method that can easily and accurately determine the antioxidant and antiradical activities of biological samples and natural products by comparison with reference substances.
  • the thermal stability test was performed by the following method.
  • test oil into a pot (23 cm in diameter) and heat to 180 ° C with an electric heater. Immediately after reaching the specified temperature, fry a potato paddle (4 cm in diameter, 0.6 cm in thickness) for 3 minutes. With the temperature maintained at 180 ° C, fry the hanger every hour, for up to 5 hours. The amount of foam was observed 20 seconds after the introduction, and the amount of foam was evaluated on a 5-point scale based on the total surface area of the pot (A: 0 to 20%, B: 21 to 40%) , C: 41-60%, D: 61-80%, E: 81-; 100%).
  • Table 2 shows the antiradical activity and the content of 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol of the extract, distillate and 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol of the above example.
  • Vitamin E was used in rapeseed salad oil using Hi Toc 68.1%, / 3- -oc 0.4%, ⁇ - ⁇ oc 0.1%. The activity was measured.
  • Example 2 The oil extract obtained in Example 2 was added to refined rapeseed oil at 2% to obtain an anti-radical purified rapeseed oil.
  • Example 4 0.7% of the methanol extract obtained in Example 4 was added to rapeseed purified oil to obtain an anti-radical rapeseed purified oil.
  • Example 5 The acetonitrile fraction obtained in Example 5 was added to refined rapeseed oil at 0.15% to obtain a purified anti-radical rapeseed oil.
  • Example 6 0.2% of the distillate obtained in Example 6 was added to refined rapeseed oil to obtain a purified rapeseed oil having antiradical activity.
  • Table 3 shows the anti-radical activity and stability of the refined anti-radical rapeseed oils of Examples 8 to 11. [Table 3]
  • the antiradical agent of the present invention contains 4-vinyl-2,6-dimethoxyphenol as an active ingredient and is excellent in that it has high antiradical activity.
  • Antioxidants extracted from conventional rapeseed defatted lees are hardly fat-soluble, but the active ingredient of the anti-radical agent of the present invention is extracted from rapeseed crude oil and is easily soluble in oils and fats. It is easy to use as an antioxidant for edible oils and other oil and fat compositions.
  • this anti-radical agent When this anti-radical agent is ingested, it is fat-soluble and therefore has high affinity for cell membranes in vivo and is effective in lipid-rich cell membranes and organs where water-soluble anti-radical agents are unlikely to act.
  • this anti-radical agent When this anti-radical agent is ingested, it is fat-soluble and therefore has high affinity for cell membranes in vivo and is effective in lipid-rich cell membranes and organs where water-soluble anti-radical agents are unlikely to act.
  • the active ingredient of the anti-radical agent is obtained from the extract of rapeseed crude oil, it is advantageous in terms of raw materials and safety.
  • the product (oil composition, etc.) to which the anti-radical agent is added not only has an anti-radical property but also has improved stability.

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Description

明細書 抗ラジカル剤、 該剤を含有してなる油脂組成物、 飲食品、 医薬品又は飼料 技術分野
抗ラジカル剤、 該剤を含有してなる油脂組成物、 飲食品、 医薬品又は飼料に関 する。
背景技術
活性酸素等のラジカル物質は、 生体内において、 様々な疾病や老化の原因とな る酸化的障害をもたらすことが知られている。 脂質が酸素障害を受けて生じる脂 質過酸化物 （アルキルヒ ドロパーォキサイ ド） は、 寿命が長い上に、 脂質で出来 ているため、 脂質が豊富な細胞膜や臓器に蓄積することが考えられるし、 腸管内 で脂質ラジカルが生ずることを考えると、 腸管上皮細胞に容易に接触して障害を 与え、 またカイロミクロンとなってリンパ系に取り込まれて血中へ到達すること が考えられる。
血液中にはこのカイロ ミクロンの他、 LDL (低比重リポ蛋白質）、 HDL (高比 重リポ蛋白質） などの、 脂質と蛋白質の複合体が多く存在する。 LDL 中の脂質 は金属イオンや上記脂質ラジカル等により、 連鎖的脂質過酸化反応を受け、 容易 に酸化 LDL となる。 酸化 LDLは、 動脈硬化症の重要な危険因子の 1つであると 考えられている。
従って、 脂質過酸化物に起因するラジカルを捕捉することは、 生体の酸化的障 害を抑制する上で重要であり、 抗酸化作用については、 各種の研究がなされてい る。 例えば、 以下のものが挙げられる。
1 ) 菜種種子の脱脂粕から抽出した水溶性成分には抗酸化作用がある （H . Nowak et . al . , Fat Sci. Technol. , 94, 149一 152 ( 1992) ； U. Wanasundara. et al. , J. Agric. Food Chem. , 42， 1285 - 1290 ( 1994) ) 。
2 ) 野菜等の植物の水抽出物にはラジカル捕捉 · 除去作用がある （前田浩、 Environ. Mutagen Res. , 18， 53— 61 ( 1996) )。
3 ) フ トモモ科植物の溶媒抽出物を含有する過酸化脂質抑制剤 （特開平 1 0— 3 6 2 7 8 )o
4 ) えごま種子又はえごま種子の発芽物の脱脂物を水及び/又は親水性有機溶剤 で抽出してなるフリ一ラジカル消去剤 （特開 2 000— 2 3 6 847 )。
5 ) ォリーブ植物から得られる抽出物を有効成分とする抗酸化剤 （特開 2 00 1 - 1 8 1 6 3 2 )
以上のものは、 何れも水溶性成分を有効成分とするものであり、 水溶性抗ラジ カル剤である。
これに対して、 油脂製品への利用、 または生体内での有効性を考えると、 脂溶 性抗ラジカル剤の存在は重要である。 脂溶性抗ラジカル剤としては、 B HA (ブ チルヒ ドロキシァニソール）や B H T (プチルヒ ドロキシ トルエン）等があるが、 これらは化学合成によるものであるから、 その使用が避けられる傾向がある。 天然物由来の脂溶性抗ラジカル剤としては、 菜種由来の脱ガム油等が知られて いるが （特開平 9— 1 5 76 8 7 )、 その活性は十分ではない。
また、 天然物由来の脂溶性抗酸化剤としては、 トコフエロールが知られている が、 トコフヱロールは、 通常の食品の酸化を抑制する効果においてはそれなりの 効果を有しているが、 脂質ラジカル捕捉能の効果は十分でない。
以上のことから、 天然物由来の高活性の脂溶性抗ラジカル剤の開発が待たれて いる。
発明の開示
本発明の目的は、 食品 （油脂組成物） の安定性を増し、 同時に生体での酸化的 障害を予防できる、天然物由来の高活性の脂溶性抗ラジカル剤を得ることにある。 本発明者らは、 上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、 菜種原油 のアルコール抽出物に高い抗ラジカル活性があることを知り、 更に研究を重ねた 結果、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 以下の構成からなるものである。
1. 4—ビニル一 2 , 6—ジメ トキシフエノールを有効成分とする抗ラジカル剤。 2. 4—ビニル— 2 , 6—ジメ トキシフエノールを含有する菜種原油の抽出物か らなる抗ラジカル剤。
3. 菜種原油をアルコール又は含水アルコールで処理することを特徴とする 4一 ビニル— 2 , 6 —ジメ トキシフヱノールが濃縮された菜種原油の抽出物。
4 . 菜種原油を蒸留することを特徴とする 4 一ビニル一 2， 6—ジメ トキシフエ ノールが濃縮された菜種原油の抽出物。
5 . 上記 3又は 4記載の菜種原油の抽出物を含有する抗ラジカル剤。
6 . 上記 1、 2、 3、 4又は 5記載の抗ラジカル剤を含有してなる油脂組成物。
7 . 上記 1、 2、 3、 4又は 5記載の抗ラジカル剤又は上記 6記載の油脂組成物 を添加した飲食品、 医薬品又は飼料。
なお、 4 —ビニル一 2 , 6—ジメ トキシフエノールの構造式は、 以下のとおり である。
Figure imgf000005_0001
本発明の抗ラジカル剤は、 4 —ビニル— 2， 6 —ジメ トキシフエノールを有効 成分とすることを特徴とするものである。
本発明では、 菜種原油のアルコール抽出物に高い抗ラジカル活性があることを 知り、 該活性成分を探求したところ、 4—ビニル一 2， 6—ジメ トキシフエノ一 ルであることをつきとめ、 本発明に到達したものである。
本発明の抗ラジカル剤の有効成分の 4 一ビニル— 2， 6—ジメ トキシフエノ一 ルは、 油脂に易溶性であり、 高い抗ラジカル活性を有する点で優れている。
従来の菜種脱脂粕より抽出した抗酸化剤は難脂溶性であるが、 本発明の抗ラジ カル剤の有効成分は、 菜種原油から抽出したものであり、 油脂に溶け易いため、 食用油やその他油脂組成物の抗酸化剤として利用し易い。
また、 本抗ラジカル剤を摂取した場合、 脂溶性であるため生体内で細胞膜への 親和性が高く、 水溶性抗ラジカル剤が作用し難い脂質の豊富な細胞膜や臓器中で 有効に作用.する。
更に、 本抗ラジカル剤の有効成分は、 菜種原油の抽出物から得られるものであ るので、 原料面や安全面で有利である。
本抗ラジカル剤を添加した油脂組成物は、 抗ラジカル性だけでなく、 安定性も 向上する。
何れにしても、 本発明の抗ラジカル剤の有効成分である、 4ービニルー 2， 6 ージメ トキシフエノ一ルは、 油脂に易溶性であり、 高い抗ラジカル活性を有する ことは、 本発明で初めて知り得たことからみて、 該成分の選択には格別の意義が あることが分かる。
図面の簡単な説明
図 1は、 単離 '精製した 4一ビニル一 2， 6—ジメ トキシフエノールの N M R の測定図である。
図 2は、 4一ビニル— 2， 6—ジメ トキシフエノールの H P L Cの測定図であ る。
発明を実施するための形態
以下、 更に本発明について詳述する。
( 1 ) 抽出
本発明の抗ラジカル剤の有効成分である、 4—ビニル— 2 , 6—ジメ トキシフ ェノールは、菜種原油をアルコールで抽出することにより濃縮することができる。 菜種油は、 アブラナ科 （Cruciferae) アブラナ属 （ Brassica) に属するナタネの種 子から得られる油脂であるが、 抽出に用いられる菜種原油は、 圧搾油、 抽出油、 脱ガム油等から選ぶことができる。
抽出に用いるアルコールとしては、 メタノール、 エタノール、 プロパノール、 ブ夕ノール、 又はそれらの含水物等が挙げられる。
抽出に好適な含水量は、 アルコールにより異なるが、 メタノールの場合は容積 比で 0〜 1 0 %、 エタノールでは 5〜 2 0 %である。
抽出条件は特に限定されない。 例えば、 温度は 1 0〜 8 5 °Cで、 常温でも好適 に抽出できる。 振とう抽出や攪拌機等のついた抽出機で抽出することによって抽 出効率を上げることもできる。 抽出時間は数分〜数時間であり、 長時間なほど十 分に抽出されるが、 抽出物中の 4 —ビニルー 2 , 6—ジメ トキシフエノール濃度 が低くなる可能性がある。 原料に対して、 0. 1〜 2 0倍量のアルコールで抽出し、 好ましくは同様の抽 出操作を 2 ~ 3回繰り返すのがよい。
本抽出は、 油脂とアルコールとの液々抽出であり、 アルコール画分を分離して 濃縮し、 4—ビニル一 2， 6—ジメ トキシフエノール含有抽出物を得る。
抽出方法には種々の方法が選択されるが、 アルコールと油脂の溶解性に注意す る必要がある。 特にエタノールは、 油脂との相溶性が比較的高いため、 抽出物中 の 4—ビニルー 2， 6—ジメ 卜キシフエノール濃度を上げ、 卜 リグリセリ ド濃度 を抑えるためには、 原料に対して 0. 1〜 1倍量のエタノールで抽出するのが好 ましい。
本発明の抗ラジカル剤の有効成分である、 4 -ビニル— 2 ,6—ジメ トキシフエ ノールは、 菜種原油を蒸留することでも濃縮することが出来る。
蒸留はどのような装置を用いて行ってもよく、 例えば、 薄膜式または遠心式蒸 留装置を使用することができる。 また低真空度の蒸留装置に加え、 高真空度の蒸 留装置 （分子蒸留装置） も使用することができる。
蒸留条件は特に限定されない。 例えば、 温度は 70〜 3 00 °Cで、 圧力は 0. 1〜 1 0 ΤΟΓΤ、 時間は数分から数時間で好適に蒸留される。 高温かつ高真空度で 長時間蒸留するほど十分に蒸留されるが、 菜種原油中の他の成分も蒸留されて、 蒸留物中の 4 一ビニル— 2，6—ジメ トキシフエノ一ル濃度が低下したり、 臭い や味質の面で好ましくない成分も混入する可能性がある。 好ましくは、 1 30〜 1 80°C、 1 0分〜 2時間、 1. 0〜3. 0 Torrで蒸留を行うのがよい。 また、 水蒸気を吹き込むことにより、 更に蒸留効率を高めることができる。
また、 4 _ビニル一 2 , 6—ジメ トキシフエノールは、 必要に応じて、 2層分 配法、 カラムクロマ トグラフィー法、 薄層クロマトグラフィー法 （T L C法）、 高速液体クロマトグラフィ一法 （H P L C法） 等を適用し、 精製 '分離して、 濃 縮することができる。
抗ラジカル剤中の 4—ビニル— 2， 6—ジメ トキシフエノール量は、 0. 2重 量％以上で十分である。
従って、 4—ビニル— 2， 6—ジメ トキシフエノールを 0. 2重量％以上含有 するものであるならば、 メタノールやエタノール抽出物、 蒸留物等はそのまま抗 ラジカル剤として使用可能である。
( 2 ) 適用
本抗ラジカル剤は、 そのまま摂取してもよいが、 一般の食用精製油等の油脂組 成物に配合して、抗ラジカル性油脂組成物を得、 この組成物を飲食品に添加して、 抗ラジカル性の飲食品を得ることもできる。
また、 本抗ラジカル剤を添加した製品 （油脂組成物等） は、 抗ラジカル性だけ でなく、 安定性も向上する。
飲食品としては、 例えば、 菓子類 （ガム、 キャンディ一、 キャラメル、 チョコ レート、 クッキ一、 スナック、 ゼリー、 グミ、 定菓等）、 麵類 （そば、 うどん、 ラーメンなど）、 乳製品 （ミルク、 アイスク リーム、 ヨーグル ト等）、 飲料 （ジ ユース、 コーヒー、 紅茶、 茶、 炭酸飲料、 スポーツ飲料等） 等が挙げられる。 飲食品には、 劣化防止剤、 甘味料、 香料、 着色料、 乳化剤、 酸化防止剤、 増量 剤等の添加剤を適宜配合することができる。
また、 同様にして、 本抗ラジカル剤ゃ抗ラジカル性油脂組成物を、 医薬品、 化 粧品、 飼料等に添加して、 抗ラジカル性の医薬品、 化粧品、 飼料等を得ることが できる。
油脂組成物中には、 4—ビニル— 2， 6—ジメ トキシフエノールを 10〜50 O O ppm添加すれば、 抗ラジカル性油脂組成物となり、 その効果を十分発揮す ることができる。
以下、 実施例を挙げて本発明を更に説明するが、 本発明はこれらの実施例に限 定されるものではない。 なお、 特に断らない限り、 「％」 は 「重量％」 を意味す る。
( 1 ) 4—ビニルー 2， 6—ジメ トキシフエノールの単離 '精製
以下の 5工程により、 菜種原油から 4 -ビニル一 2， 6—ジメ トキシフエノー ルを単離 ·精製した。
1. メタノール抽出
菜種原油 45 O gにメ夕ノ一ル 9 Omlを加え、 シェーカーを用いて 10分間 激しく振とうさせた。 振とう後、 5000 rpmで 30分間遠心分離を行った。 上層のメタノール層を、 ナス型フラスコに回収した。 下層の菜種原油に再びメタ ノール 9 0 m lを加え、 シ χ—カーで振とう した。 これらの操作を合計 3回繰り 返して、 回収したメタノール層からメタノールを蒸発させ、 抽出物 2. 9 gを得 た。
2. 2層分配
工程 1で得たメタノール抽出物 2. 9 gを、 実施例 5と同様の方法で 2層分配 を行い、 へキサン画分 1. 5 g、 ァセ トニ ト リル画分 0. 8 6 gを得た。
ァセ トニ ト リル画分に高い抗ラジカル活性が認められたので、 ァセ トニ ト リル 画分を次の精製工程に使用した。
3. シリカゲルカラムクロマ トグラフィーによる分画
シリカゲル （関東化学製カラムクロマト用く 1 5 0〃m) 1 5 gを、 3 00 m m x 2 0 mm øのガラスカラムに充填した。 工程 2で得たァセ 卜ニト リル画分 5 O O mgを、 5 m 1のクロ口ホルムに溶解し、 カラムに注入した。 これに、 分離 溶媒 （へキサン/ジェチルエーテル （ 9 0/ 1 0) 1 7 5 m l, クロ口ホルム 2 2 5 m 1 s アセ トン 40 0m l、 メタノール 2 00 m 1の順） を約 2 m l/ min の流速で供給し溶出した。 集めた各溶出画分はナスフラスコに回収し、 エバポレ —夕一で溶媒を留去し、 クロ口ホルム画分 1 44mg、ァセ トン画分 20 5 m g、 メ夕ノール画分 42 mgを得た。
ク口口ホルム画分に最も高い活性が認められたので、 このクロ口ホルム画分を 次の工程に使用した。
4. 薄層クロマトグラフィー （T L C) による分取
工程 3のクロ口ホルム画分 1 0 0 m gを、 展開プレ一ト （シリ力ゲル ： Merk ieselgel 6 0 ) /展開溶媒 （へキサン/ジェチルエーテル = 8 0/ 3 0 ) を用 いて展開した。 プレー卜上の黄色バンドを確認し、 スパチュラでシリカゲルごと 目的の物質をかき取った。 クロ口ホルム 2 0〜 30 m lを加え、 よく振り混ぜた 後、 ガラスフィル夕一でシリカゲルを濾別した。 エバポレー夕一で溶媒をとばし て、 濃縮物 1 3 mgを得た。 得られた濃縮物を次の工程に使用した。
5. 高速液体クロマトグラフィー （HP L C) による分取
工程 4で得た濃縮物 2 mgを用いて、 下記の条件で、 HP L C溶出を行った。 0〜 2 0分は溶離液 Aを 1 00 %流し、 2 0〜 2 5分にかけて溶離液 A 1 00 % から B 1 00%へリニアグラジェン 卜をかけ、 25分以降は溶離液 Bを 100% 流した。 4. 5分付近に見られたシングルピークを分取した。 収量は 1 mgであ つた。
(HP L Cの溶出条件）
カラム ： Keystone Scientific, Inc. AQUASIL C18 ( 4.6 I.D.X 250mm )
サンプル量 ： 100〃 1 (5mg/ml)
溶離液 A ： CH3CN/H2O (90/10)
溶離液 B ： CH3CN
カラム温度 ： 室温
流量 ： l.Oml/min
検出器 ： UV検出器 （300nm，450mn)
( 2 ) 4一ビニル一2， 6—ジメ トキシフエノールの同定
本同定は、 以下の分析法で行った。
1 ) L C/M S
(分析法）
サンプルをメタノールに溶解させ、 L C/MS (J EOL、 JMS-LCma t e ) を用い、 AP C I ( + ) で測定した。
(分析結果）
主成分の低分解能 M Sの m/zは 18 1であった。
上記の低分解能 MSの分子量の測定結果によると、 APC I ( + ) では、 M + Hでイオン化し易いため、 m/z 18 1成分の分子量は 180となる。
そこで、 m/z 18 1成分について、 高分解能 （ミ リマス） MSによる分析を 行い、 正確な分子量を測定したところ、 1 8 1. 08 13であった。
CHN分析、 S分析の結果より、 N、 Sが存在しないことが確認できた。
この結果を参酌すると、 上記 mZz 18 1成分の分子式は C ,。 H 1303 となる から、 分子量の計算値は 18 1. 0865となる。 この分子量の計算値と上記の 実測値の誤差は殆どないので、 主成分の分子式は C .o H ,203であると判断した。
2 ) NMR
(分析方法） サンプルを窒素気流下で乾燥させた後、 重クロ口ホルム （CD C 1 に溶解 させ、 専用のガラス管に入れ、 NMR (J EOL、 400 MH z) を測定した。 (分析結果）
NMRの測定結果は、 図 1に示す。
この NMRの結果から、 以下のことがいえる。
3. 90 ppm : - O C H 3 X 2 (線対称） の H 6個
5. 17 ppm： C = Cの t r a n s位の H
5. 5 1 ppm： フエノ一ルの H
5. 6 2 01 : 〇= 0の0 1 3位の H
6. 6 1 ppm： C = Cの g e m位の Hとベンゼン環の H 2個
また、 1〜3 ppm にはビークが見られないため、 アルキル基 （ C— C) は存 在しない。
上記のことから、 ベンゼン環に、 一 O H、 - 0 C H X 2 (線対称）、 C = C に Hが付いており、 アルキル基 （C— C) はないことが分かる。
以上の分析結果を合わせ考え、 ケミカルシフ トの計算値を参考にして、 本精製 物は、 4一ビニル一 2 , 6—ジメ トキシフエノールであると同定した。
(3) 4-ビエル— 2， 6—ジメ トキシフエノ一ルの定量
前記（ 1 ) 一 5. の H P L C法を数回繰り返し、 定量用の標準 4—ビニルー 2， 6—ジメ トキシフエノールを得た。
本標品を用い、 以下に示す HP L C分析により、 検量線を作成し、 各サンプル の 4—ビニル— 2， 6—ジメ トキシフエノール濃度を求めた。
(HP L C分析条件）
カラム ： LiChroCART 250 - 4 LiChrospher 100 NH ( 4.0ID X 244mm , 5 u ) 溶離液 ： 1.2%ィソプロピルアルコール/へキサン（v/v)
流量 ： 1.2ml/min
カラム温度 ： 室温 （25°C以下）
検出器： 蛍光検出器 （Ex298mn ,Em325nm)
試料量 ： 50 JL 1
内部標準試薬 ： ペン夕メチルクロマノ一ル （PMC) 測定時間 ： 30分
本分析の結果を図 2に示す。 PMC は 6分前後 （ピーク 3 )、 4一ビニル— 2， 6—ジメ トキシフエノールは 1 8分前後 （ピーク 7 ) に検出された。
( 4) 抗ラジカル活性
抗ラジカル活性は、 以下の方法で測定した。
1 ) IPOX 50値
脂質過酸化物 （アルキルパーォキサイ ド ： ROOH) のモデル化合物として夕一シ ャルブチルハイ ドロパ一ォキサイ ド （t-BuOOH) を用いる測定系で、 化学発光法 により測定して、 化学発光を 5 0 %抑制する被験物の濃度を求める。
0. 0 1 M リン酸緩衝生理食塩水 2 5 0〃 1に'、 1 0 mMジエチレン ト リァ ミン 5酢酸 ( Sigma Chemical Co. 製） 5 0〃 l、 3 0 0 mM t-BuOOH ( Sigma Chemical Co. 製） 5 0 / 1、 l O O mMルミノール （和光純薬 （株） 製） 5 0 1、 被 験物のエタノール溶液 5 0 j lを加えて十分に攪拌した後、 1 mgZlへモグロ ビン（ブ夕由来 ： Sigma Chemical Ca 製） 5 を加え、 素早く極微弱発光測定 装置 （BertholdLB9505) にセッ 卜 して、 発光量を測定する。
被験液を入れない場合に対して、 発光量を 5 0 %に抑制する被験物濃度を求め て 5 0 %抑制濃度 （IPOX5。） とする。 この値が小さいほどラジカル捕捉能が強い ことを示す。
2 ) ORAC法における Trolox比活性
ヒ ト血清の 2 0 0倍希釈溶液 1 0 1に、 1 0 / 1の所定濃度の被験試料、 又 は、 6 0 /Mの 6—ヒ ドロキシ一 2，5，7，8—テトラメチルクロマン一 2 —カル ボン酸 （Trolox) 溶液を 1 0〃 1加える。 次に、 3. 7 3 mg / 1の —フィコェ リ ト リン （ ?一 PE) を 1 8 0〃 1加え、 3 7 °Cで 1分間、 予備加温する。 次い で、 8 0 mM の 2 , 2 ' —ァゾビス （ 2—アミジノプロパン） 一ジヒ ドロクロリ ド （AAPH) を 1 0〃 1加え、 3 7 °Cで反応を開始する。 血清や添加試薬の希釈 には、 リン酸緩衝液 （ 7 5 mM、 ρΗ7. θ) を用いる。 また、 対照は被験試料の代 わりに、 上述したリン酸緩衝液を用いる。 反応液の蛍光強度 （Ex : 540nm、 Em : 565nm) を反応開始後より 2分毎に測定し、 蛍光強度 （ y軸） 一時間 （X軸） の 曲線グラフを描く。 被験試料、 Trolox, 対照の得られた曲線と X軸、 y軸で挟ま れた領域の面接 （ S ) を算出する。 被験物質の血清中での抗ラジカル活性は、 以 下の式で Trolox比活性として算出する。
Trolox比活性 = (被験試料の S—対照の S) / (Troloxの S—対照の S) X (Trolox の濃度 /被験試料の濃度）
この試験系では、 AAPH がペルォキシラジカルを発生させ、 それが基質である ?— P Eを酸化し、 その結果、 ?— P Eの蛍光が消失する反応が起こる。 Trolox は、 水溶性ビタミン Eの誘導体であり、 この試験系において抗酸化作用の基準物 質として用いられる。 これらの反応基質や基準物質は OR AC ( Oxygen Radical Absorbance Capacity) 法に用いられるものである。 ORAC法は、 生体試料や天然 物の抗酸化、 抗ラジカル活性を簡便かつ正確に基準物質との比較値で求めること ができ、 広く用いられている方法である。
( 5 ) ランシマッ ト試験
本試験は、 油脂の酸化安定性を測定するものである。
本試験は、 試料を反応容器で 1 2 0°Cに加熱しながら、 清浄空気を送り込み、 酸化により生成した揮発性分解物を水中に捕集し、 水の導電率が急激に変化する 折曲点までの時間 （ランシマツ ト時間） を測定することにより行われる。
( 6 ) 熱安定性試験
熱安定性試験は、 以下の方法で行った。
試験油 5 00 gを鍋 （直径 2 3 c m) にはかりとり、 電熱器により 1 80 °Cに 加熱する。 規定温度到達後、 直ちにジャガイモ天ぶら （直径 4 cm、 厚さ 0. 6 cm) を 3分間揚げる。 温度を 1 8 0°Cに維持したまま 1時間ごとに、 5時間ま で天ぶらを揚げる。 投入 2 0秒後の力二泡の量を観察し、 泡の量を鍋の表面積全 体に対しての比率で 5段階評価した （A : 0〜2 0 %、 B : 2 1〜40 %、 C ： 4 1〜 6 0 %、 D : 6 1〜8 0 %、 E : 8 1〜； 1 0 0 %)。
実施例 1、 比較例 1
4一ビニル一 2 , 6—ジメ トキシフエノール 6 0 M、 及びひ一 トコフエ口 ールは 30 0〃 Mを試験に供し、 表 1に示す Trolox 比活性を算出した。 [表 1 ]
Figure imgf000014_0001
表 1の結果によると、 血清中における 4 一ビニル一 2 ， 6—ジメ トキシフエノ —ルの Trolox比活性は、 ひ— トコフエロールの約 7倍を示した。 このことから 4 —ビニル一 2 , 6—ジメ トキシフエノールは、 血清中でひ 一 トコフエロールより 極めて強い抗ラジカル活性を発現することが分かる。
実施例 2 (エタノール抽出物）
菜種原油 1 k gに 2 0 0 m 1の 9 9 . 5 %エタノールを加え、 1 0分間激しく 振とうした。 遠心分離を行い、 エタノール層を分取した。 この操作を 3回繰り返 し、回収したエタノール層を濃縮してエタノールを除去し、抽出物 2 1 gを得た。
実施例 3 (含水エタノール抽出物）
菜種原油 1 k gに 2 0 0 m lの 9 0 %含水エタノールを加え、 1 0分間激しく 振とう した。 遠心分離を行い、 エタノール層を分取した。 この操作を 3回繰り返 し、 回収したエタノール層を濃縮してエタノールおよび水を除去し、 抽出物 8 g を得た。
実施例 4 (メタノール抽出物）
菜種原油 1 k gに 2 0 0 m lの 9 9 . 5 %メタノールを加え、 1 0分間激しく 振とうした。 遠心分離を行い、 メタノール層を分取した。 この操作を 3回繰り返 し、 回収したメタノール層を濃縮してメタノールを除去し、 抽出物 7 gを得た。
実施例 5 ( 2層分配ァセ トニト リル抽出物）
実施例 4で得られたメタノ一ル抽出物 7 gをへキサン 4 5 m lに溶かして、 分 液漏斗①に入れた。これに 9 9 . 5 %ァセ トニト リノレ 1 5 m 1を加え振とう した。 振とう後、 下層 （ァセ トニト リル層） を新たなへキサン 4 5 m 1の入っている分 液漏斗②に移し、 分液漏斗①には新たなァセ トニト リル 1 5 m 1を入れた。 分液 漏斗①及び②を振とうして、 分液漏斗②の下層をナス型フラスコに分取し、 分液 漏斗①の下層は分液漏斗②に移した。 分液漏斗①には新たなァセ トニト リル 1 5 m lを入れ、 同様の操作を合計 2回繰り返した。 分取した各下層を合わせ濃縮し てァセ トニト リルを除去し、 抽出物 1. 5 gを得た。
実施例 6 (蒸留物）
菜種原油 1 0 0 0 gをクライゼンフラスコに張込み、 1 5 0°C、 3 0分間、 1. 5 Torr, 水蒸気吹込み量対油 1. 5 %で分子蒸留を行った。 トラップから回収し た回収物から水分を蒸発させ、 蒸留物 3 gを得た。
実施例 7 ( 4—ビニル一 2 , 6—ジメ トキシフエノール）
前記 （ 3 ) の、 菜種原油から単離 '精製した 4—ビニル一 2 , 6—ジメ トキシ フエノ一ルを用いた。
上記の実施例の抽出物、 蒸留物及び 4ービニル— 2， 6—ジメ トキシフエノー ルの抗ラジカル活性及び 4 -ビニルー 2， 6—ジメ トキシフエノ一ルの含量を、 表 2に示す。
比較のために、 菜種原油 （比較例 2 )、 1 0 0 %ビタミ ン E (比較例 3 )、 5 %ビタミン E (比較例 4 )、 1 %ビタミン E (比較例 5 ) の抗ラジカル活性を同 様に測定し、 表 2に示す。
なお、 比較例 3〜 5では、 ビタミン Eは、 ひ一 T o c 6 8. 1 %、 /3 - Ύ o c 0. 4 %、 δ - Ύ o c 0. 1 %のものを用い、 菜種サラダ油に溶かして活性を測 定した。
ほ 2 ]
Figure imgf000016_0001
表 2の結果から、 4一ビニル— 2 , 6—ジメ トキシフエノール又はその含有物 は、 従来のものに比し、 優れた抗ラジカル活性を有することが分かる。
実施例 8
実施例 2で得られたェ夕ノ一ル抽出物を、 菜種精製油に 2 %添加して抗ラジ力 ル性菜種精製油を得た。
実施例 9
実施例 4で得られたメタノール抽出物を、 菜種精製油に 0. 7 %添加して抗ラ ジカル性菜種精製油を得た。
実施例 1 0
実施例 5で得られたァセ トニト リル画分を、 菜種精製油に 0. 1 5 %添加して 抗ラジカル性菜種精製油を得た。
実施例 1 1
実施例 6で得られた蒸留物を精製菜種油に 0. 2 %添加して、 抗ラジカル活性 菜種精製油を得た。
実施例 8〜 1 1の抗ラジカル性菜種精製油の抗ラジカル活性と安定性を、 表 3 に示す。 [表 3 ]
Figure imgf000017_0001
表 3の結果から、 本抗ラジカル剤を添加した油脂組成物は、 抗ラジカル活性や 熱安定性等が向上することが分かる。
産業上の利用の可能性
( 1 ) 本発明の抗ラジカル剤は、 4 —ビニルー 2 , 6—ジメ トキシフ エノールを 有効成分とするものであって、 高い抗ラジカル活性を有する点で優れている。
( 2 ) 従来の菜種脱脂粕より抽出した抗酸化剤は難脂溶性であるが、 本発明の抗 ラジカル剤の有効成分は、 菜種原油から抽出したものであり、 油脂に易溶性のた め、 食用油やその他油脂組成物の抗酸化剤として利用し易い。
( 3 ) 本抗ラジカル剤を摂取した場合、 脂溶性であるため生体内で細胞膜への親 和性が高く、 水溶性抗ラジカル剤が作用し難い脂質の豊富な細胞膜や臓器中で有 効に作用する。
( 4 ) 本抗ラジカル剤の有効成分は、 菜種原油の抽出物から得られるものである ので、 原料面や安全面で有利である。
( 5 ) 本抗ラジカル剤を添加した製品 （油脂組成物等） は、 抗ラジカル性が付与 されるだけでなく、 安定性も向上する。

Claims

請求の範囲
1 . 4ービニルー 2， 6—ジメ トキシフエノールを有効成分とする抗ラジカル 剤。
2 . 4ービニルー 2， 6—ジメ トキシフエノ一ルを含有する菜種原油の抽出物 からなる抗ラジカル剤。
3 . 菜種原油をアルコール又は含水アルコールで処理することを特徴とする 4 —ビニルー 2， 6ージメ トキシフ工ノールが濃縮された菜種原油の抽出物。
4 . 菜種原油を蒸留することを特徴とする 4—ビニルー 2， 6—ジメ トキシフ ェノールが濃縮された菜種原油の抽出物。
5 . 請求項 3又は 4記載の菜種原油の抽出物を含有する抗ラジカル剤。
6 . 請求項 1、 2、 3、 4又は 5記載の抗ラジカル剤を含有してなる油脂組成 物。
7 . 請求項 1、 2、 3、 4又は 5記載の抗ラジカル剤又は請求項 6記載の油脂 組成物を添加した飲食品、 医薬品又は飼料。
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