WO2003018784A1

WO2003018784A1 - Process for producing antigen-specific human t cells and drugs

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Publication number: WO2003018784A1
Application number: PCT/JP2002/008499
Authority: WO
Inventors: Takashi Nishimura
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2001-08-24
Filing date: 2002-08-23
Publication date: 2003-03-06
Anticipated expiration: 2004-02-24

Description

抗原特異的ヒト T細胞の製造方法及び医薬

技術分野

本発明は、ヒ卜 Th1細胞の製造方法、該製造方法によリ製造された細胞及びその医薬用途に関する。本発明のヒ卜 Thl細胞は、特に癌や宿主対移植片反応等の免疫療法に有用である。

背景技術

癌の治療は医療上の最重要課題のひとつである。現在までに、さまざまな外科療法、化学療法、放射線療法が試みられており、治療成績は向上してきているものの、未だ満足できるレベルにはない。 1980年代からは免疫療法も試みられ、改良が加えられながら進展してきており、新しい癌の治療法として期待されている。本来、癌細胞は宿主の免疫機能により排除され得るものと考えられるが、癌細胞が体内に多量に存在していて免疫抑制状態にある患者においては、患者自身の免疫系だけではもはや十分に癌細胞を排除できない状態にある。このため、体外から各種のサイ卜力インや免疫賦活化物質を投与したり、さらには活性化リンパ球の注入などで体内の能動免疫を高め、癌を治療しょうとするのが免疫療法である。現在までに様々な手法が試みられているが、効果はまだ限定的であり、さらなる改良が求められている（Fuj imoto T. et a l ： J. I國 uno l 158： 5619, 19 9フ、特許番号第 2530966号および「細胞免疫療法の現状」、医学のあゆみ、 vo l . 195, No. 1 , 2000) 。

最近、免疫応答の根本的な反応である抗原提示に関して、樹状細胞が極めて重要な役割を果たしていることが明らかになつてきた（I naba. K. et a l : Proc. N at I . Acad. Sc i . USA 80： 6041 , 1983, Banchereau J. et a I ： Nature 392： 2 45, 1998) 。癌の免疫療法でもこの樹状細胞を用いた癌のワクチン療法は現在注目を浴びており、その有望性についてはいくつか報告されている（Sato Μ· et a I： I nt. Immuno l . 12： 335, 2000、「細胞免疫療法の現状」、医学のあゆみ、 vo 1. 195, No. 1 , 2000) 。具体的には、癌ペプチド抗原と樹状細胞を数時間培養して抗原提示能を高めた後、樹状細胞を患者に輸注したり、さらにその樹状細胞を刺激細胞として患者末梢血リンパ球から細胞傷害性 T細胞（GTL) を誘導して癌患者に輸注するという方法であり、すでに悪性黒色腫、前立腺癌、乳癌等に対して臨床試験が進められている。

このような免疫療法では、樹状細胞を始めとする抗原提示細胞に癌抗原ゃ癌抗原由来ペプチドをイン ' ビトロで感作させる場合に、いかに特異的に抗原提示細胞を感作し得るか、次にいかに効率よく必要量の GTLを誘導し得るか、さらに癌患者体内でいかに効率よく GTLを病巣に到達させ得るかということが、治療効果を上げるための重要事項である。樹状細胞の感作に用いる抗原は、患者の癌細胞抗原が最も合理的であるが、癌べプチド抗原が患者の主要組織適合遺伝子複合体

(MHG) 分子に提示され得るものであることが必須であり（MHG拘束性）、その際に用いる具体的な抗原としては MHGクラス I結合べプチド（すべての有核細胞と血小板に発現し、細胞質タンパク質に由来するべプチドを細胞傷害性 GD8陽性キラ一 Τ細胞に提示する）を用いることが一般的である。し力、し、抗原に特異的な GTLをクラス I結合性ペプチドのみで誘導することは困難であり、種々のアジュバン卜を用いて免疫増強を図ることによりこの問題を克服する試みが続けられているが、まだ実用レベルの手法は確立されていない。たとえば、インタ一ロイキン 2 ( I L-2) 、 IL - 12等を用いた試み (R ibas A et a l ： Cancer Res 57： 2865,

1997) では、わずかな癌の縮小と延命という治療成績しか得られていない。免疫療法では 2種類ある MHG分子のうち、 MHGクラス Iだけでなく、 MHGクラス I I (主に抗原提示細胞に発現し、形質膜および細胞外タンパク質に由来するぺプチドを GD4陽性ヘルパー T細胞に提示する）を介した免疫応答も誘導することが重要であるが、この誘導技術は未だ確立されていない。

まだ十分な免疫制御法は確立されていない癌、アレルギー、自己免疫病の治療に有用な細胞免疫制御法を確立するためには、 MHGクラス I結合性抗原べプチドによる GTLの活性化とともに、 MHGクラス I I結合性抗原ペプチドによる Th1細胞の活性化を行うことが必要である。それは、この細胞集団は免疫療法に非常に有用で、細胞傷害性とサイトカイン産生能が高く、 MHGクラス I I拘束性であるため、ターゲットとなる癌細胞や病因に関連する細胞に対して強い細胞傷害性 G D4陽性 GTしを得ることができるからである。すなわち、免疫療法において高い治療効果を得るためには、抗原特異的な Th1細胞の活性化と、それに引き続く M HGクラス I I拘束性の抗原特異的なキラー T細胞（GD4陽性 GT1J あるいは GD4陽性ヘルパーノキラー細胞の誘導という、 Th1主導型の全身性細胞性免疫が賦活された環境を作り出すこと力極めて重要である。

一方、 T細胞の関する最近の免疫研究の進展から、ヘルパー T細胞が TM と Th 2という 2つのサブタイプに分かれ、多くの免疫反応がコントロールされていることがマウスの系で明らかにされた（Mosmann, T. R.： Ann. NY Acd. Sc i . 664： 89, 1992) 。同様のヘルパー T細胞サブセットがヒトでも存在することも明らかとなり、 Th1 と Th2のバランスが癌を含む数々の病気の発症に重要な働きを持つことが推測されている (Sa l game, P. et a l . Sc i ence, 254： 279, 1991 , Abbas. A. K. et a l . Nature 383： 787, 1996) 。それらによれば、 Th1 と Th2は相互に機能的バランスをとつておリ、このバランスが保たれている場合には健康な状態であるが、 Th1が過剰になると、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、多発性硬化症等が、 Th2が過剰になると癌、免疫不全、アレルギー疾患等が発症するとされている。この TM ZTh2バランスに基づく免疫制御法も癌の有効な治療に結びつくと期待されているが、 Thl細胞および Th2細胞の効率的な誘導法は確立されておらず、具体的な臨床応用もまだ行われていない。実際のヒ卜への臨床応用に当たっては、 Th1 /Th2バランスの概念は当初マウスの実験で提唱されたものであることから、少なくとも、実際に対応するヒ卜型の Th1および Th2のヘルパー T 細胞を誘導して、それらが免疫療法に適用得る機能を持つ癌細胞傷害性や免疫バランスを制御するサイトカインの産生能を有するかどうかの検証が必要とされる。この検証は、まだ十分とは言えない。

上述したような癌の免疫療法に加えて、骨髄移植や造血幹細胞移植も、 Th1細胞を用いた免疫療法のひとつとして捉えることができる。骨髄移植は、白血病や再生不良性貧血の治療のために行われ、造血幹細胞移植は、固形癌で大量の化学療法や強い放射線療法後（骨髄破壊的造血幹細胞移植）や固形癌の患者にごく少量の化学療法剤や放射線治療を施した後（骨髄非破壊的造血幹細胞移植）、さら 02 08499

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に血液細胞に依存する先天性代謝異常症にも試みられている。骨髄移植や造血幹細胞移植の場合、宿主対移植片反応（HVGD) が生じ、移植片対宿主反応（GVHD) が弱いと、移植片生着の不良や原疾患の再発などにつながることが知られている力 GVHDが起こるか否かは偶然に頼っており、骨髄移植や造血幹細胞移植の成功の鍵となる GVHDを制御することは、医療上の大きな課題になっている（Yabe . et aに： Bone Marrow Transp l antat i on. 24： 29， 1999) ₀

免疫療法を実際に行う場合には、抗原提示細胞の分離と抗原感作処理、それに引き続く培養、また、それとは別に T細胞の分離と培養等が必要とされ、多大の手間と高度のノウハウが求められる。加えて、癌細胞や癌ペプチド等の抗原の入手の困難さやそれらを扱う手技の煩雑さ、十分な設備的な対応などの課題も残つている。さらに患者の細胞を用いる場合には、患者への侵襲や負担、また化学療法や放射線療法のために極度の貧血に陥っている患者からの採血は事実上困難であるという医療上の問題がある。したがって、患者由来の血球を用いる場合には、微量な試料から、簡便に効率よく、目的とする細胞が誘導することが、実用化のためには極めて重要な要件となる。

これらの問題点は、癌治療や骨髄移植のみならず、今後免疫療法の対象となる難治性疾患に共通の課題となっている。

以上のように、免疫療法には、コンセプトの検証のみならず、対応する医療技術の整備など、多くの課題が山積しており、これらを含めた簡便で有用な治療法はまだ確立されていないのが現状である。

上述のように、癌治療や骨髄移植という免疫療法において、 MHGクラス I I拘束性の GTLや Th1細胞を誘導する安全で簡便な手法の開発とそれらの治療への応用は、医療上の大きな課題となっている。

発明の開示

本発明の目的は、これらの課題を解決し、癌や免疫疾患に対して新たな治療法を可能にするヒト Th1細胞の製造方法、該製造方法により製造された細胞からなる医薬、さらに該製造方法により製造された細胞で治療しえる疾患への用途を提供することにある。本発明者らは、鋭意研究の結果、患者の末梢血や骨髄細胞より、外来的なサイトカインを用いて細胞傷害活性を有する MHGクラス I I拘束性の抗原特異的なヒ卜 Th1細胞を簡便に得ることができることを見出し、このヒト Th1細胞を用いて癌の治療や骨髄移植等を行うことができることに想到し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、患者から採取した末梢血又は骨髄を材料とし、疾患由来抗原を外部から加えずに、また外来的なサイトカインを用いて体外培養することにより、樹状細胞を誘導し、培養物中に含まれる CD4陽性 T細胞を前記樹状細胞との共存下で培養し、細胞傷害活性を有するヒト Th1細胞に誘導することを含む、主要組織適合遺伝子複合体クラス 1 1拘束性の抗原特異的なヒト Th1細胞の製造方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法により製造されたヒト Th1 細胞を提供し、該ヒト Th1細胞を含む医薬あるいは医薬組成物を提供する。例えば、癌治療薬、血液あるいは造血系の悪性疾患治療薬、宿主対移植片反応制御薬を提供する。血液あるいは造血系の悪性疾患治療薬としては、具体的には、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群あるいは再生不良性貧血の各治療薬を挙げることができる。さらに、本発明は、上記本発明の細胞の癌治療薬、血液あるいは造血系の悪性疾患治療薬、宿主対移植片反応制御薬の製造のための用途を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の細胞の有効量を癌、免疫疾患、血液あるいは造血系の悪性疾患の各患者に投与することを含む癌、血液あるいは造血系の悪性疾患の治療方法を提供する。また本発明は、上記本発明の細胞の有効量を、宿主対移植片反応を制御することが望まれる患者に投与することを含む、宿主対移植片反応の制御方法を提供する。

本発明の方法により得られる抗原特異的 Th1細胞は、サイトカイン産生も行い、かつ標的細胞に対して特異的で標的細胞に対する的確な細胞傷害性活性を発揮し得ることから、患者に治療的効果を有する Th1主導型の全身性細胞性免疫状態を誘導することができる。しかも、得られる Th1細胞は患者の Tリンパ球に由来するものであることから、これを該患者の体内に戻しても有害な拒絶反応等の問題は起きない。したがって、白血病を始めとする各種癌に有効な免疫療法を実施することができる。また、宿主対移植片反応の制御方法としても有用である。図面の簡単な説明

図 1は、白血病細胞を例とした活性化 T細胞の誘導法を示す図である。一般的に用いられている従来法（A) と本発明の方法（B) を示す。

図 2は、実施例 1における培養前後のリンパ球表面抗原の同定の結果を示す図である。培養後には純粋な CD4陽性細胞が得られる。培養前 (before cu l ture) 0. 92%しか存在しなかった GD4陽性 ZGD8陰性のヘルパー T細胞が、培養後（after cu I ture) には 94. 66%の存在比にまで誘導され、ほぼ純粋な CD4陽性ヘルパーノキラー細胞集団になっていることがわかる。

図 3は、実施例 1 ~3において、本発明の方法（Th1条件）又は比較例の方法（T hO条件及び Th2条件）によリ得られた Tリンパ球の自己癌に対する細胞傷害性を示す図である。 ThO； ThO型ヘルパー T細胞誘導条件の場合、 Th0/1 ； ThOおよび Thl型ヘルパー T細胞誘導条件の場合、 Th1 ； Th1型ヘルパー T細胞誘導条件の場合、 Th2 ； Th2型ヘルパー T細胞誘導条件の場合、であり、 Th1型に誘導された場合が最も細胞傷害性が高いことがわかる。

図 4は、実施例 1〜3において、本発明の方法（Th1条件）又は比較例の方法（T hO条件及び Th2条件）により得られた IFN- r産生量を示す図である。 ThO； ThO型ヘルパー T細胞誘導条件の場合、 Thl ； Th1型ヘルパー T細胞誘導条件の場合、 Th2 ； Th2型ヘルパー T細胞誘導条件の場合、であり、 Th1型に誘導された場合が最も I

FN - r産生が高いことがわかる。

図 5は、実施例 3の MHGクラス I I抗原拘束性を示す図である。 IM患者から誘導された Th1細胞が示す自己癌細胞刺激による I FN- r産生および自己癌細胞に対する細胞傷害性の MHGクラス 1 1抗原に対する抗体での抑制。 MHGクラス 1 1抗体によリ、 I FN- 産生と細胞傷害活性が阻害され、明確に MHGクラス 1 1拘束性を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明は、好ましくは、患者の骨髄または末梢血から、外来的に抗原物質を加えることなく、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-GSF) と I L- 3によリ樹状細胞を誘導し、その培養系に I L - 2を加えることにより、わずかに存在する GD4陽性 T細胞を樹状細胞と相互作用させて増殖させ、さらに、この増殖した CD4陽性 T細胞を I L-12やインタ一フエロン τ ( I FN- r ) などの Th1誘導性サイトカインで培養することにより得られる、自己癌細胞に対する細胞傷害活性や I FN - χの産生を示す Th1細胞型 GD4陽性ヘルパーキラー細胞と、その誘導法である。この Th 1型の GD4 陽性ヘルパーキラー細胞は強い細胞傷害活性を有し、さらに IFN- T産生能が高いため、患者体内で免疫応答を惹起して Th1主導型の全身性細胞性免疫状態に誘導する能力が期待できる。このように免疫治療活性が極めて高いことから、これを用いて癌の治療や宿主対移植片反応の制御を行うことが可能となる。また、患者本来の自家細胞を使うために、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。

図 1には、白血病を例として、従来より一般的に用いられている癌抗原の感作法とそれに続く活性化 T細胞の誘導法（図 1A) と、効率よく Th1型 CD4陽性へルパー Zキラー細胞が用いられる本発明（図 1B) を示したものである。本発明においては、従来必要とされてきた、外来性の癌抗原を必要とせず、また新たに別の細胞と混合することなく実施する単一の培養系において、経時的にサイトカインを添加することにより、非常に簡便に、かつ効率よく MHGクラス I I拘束性の Th1型 CD4陽性ヘルパーキラー細胞を得ることができる。

ここで用いる細胞は、各種の癌患者の末梢血または骨髄であれば特に限定されないが、好ましくは白血病、悪性リンパ腫等の血液癌の患者から得ることができる。また、末梢血または骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。本発明に必要とされる検体量は数 mL程度の極めて少量の骨髄または末梢血でもよいことから、検査用の少量サンプルや残検体で済むほか、凍結保存したサンプルでもよい。このため、極度の貧血に陥った癌患者や正常血液細胞の少ない白血病患者に対しても適用でき、患者にほとんど負担をかけずに多くの対象疾患に適用可能である利点がある。たとえば、 1〜2mLの白血病患者の血液から通常の養子免疫療法に必要とされる 10⁷〜10⁸個の誘導も可能である。

末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞ゃ GD4陽性細胞、さらには標的細胞である血液癌細胞のような癌細胞等も含まれている。しかし、末梢血や骨髄の状態のままでは十分に治療的な効果が得られる Th1主導型の全身性細胞性免疫を形成する状態にはなっておらず、本発明によつて十分な治療効果が得られる。

一般に白血病やリンパ腫では、図 2に示したように、患者から得られる培養前の状態の骨髄細胞や末梢血には正常な CD4陽性 T細胞は数％と極めて少ないため (実施例 1参照）、従来法ではここから GD4陽性 T細胞を十分に分離することはできず、その後のヘルパー T細胞の誘導は実質的に不可能である。本発明によれば、従来には調製が実施できなかったり、極めて困難とされていた極少量からの血液から Th1細胞の調製が可能である。さらに、凍結されたリンパ球からも誘導が可能であることから、患者に対する負担が非常に軽減される。たとえば、従来の方法で一度の採血にはおおむね 20mL以上で、 2週間に一度の採血というレジメンで治療が実施される場合に比較して、本法では一度に 5mLの採血でリンパ球を凍結保存し、 1 mL毎に 5回分の材料とすることができる。白血病や固形癌患者では貧血状態になっている場合も多く、頻回の採血は患者に大きな負担となるが、本法によればその負担が大きく軽減される。

また、骨髄移植や血液幹細胞移植では、本方法でドナ一から提供された細胞を同様に培養し、宿主対移植片反応を適度に制御できることにより、移植片の生着向上や原疾患の治療等につなげることができる。

本発明の製造方法は、上記した各種サイ卜力インを培地に添加して 1工程で行うこともできるし、樹状細胞を誘導する第 1工程と、培養物中に含まれる GD4 陽性 T細胞を前記樹状細胞との共存下で培養し、細胞傷害活性を有するヒト Th1 細胞に誘導する第 2工程とに分けて行うこともできる。

1工程で行う場合、本発明で細胞の刺激に用いられるサイト力インは、好ましくは、少なくとも GM-GSF、 I L- 3、 I L-2及び I FN- であり、これ以外に例えば I L - 12のような、他種のサイトカインも必要により用いられる。また、培養期間は、必要数の樹状細胞や Th1型の CD4陽性ヘルパー/キラ一 T細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常 3曰〜 8週間の間で行われる。

2工程で行う場合、第 1工程は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及び又はインターロイキン 3の存在下で行い、第 2工程は、第 1工程で得られた培養物にィンターロイキン 2を添加して培養を続けて CD4陽性 T細胞を前記樹状細胞と相互作用させながら増殖させる工程と、さらにインターフヱロン r及び又はインターロイキン 1 2を添加して細胞傷害活性を有するヒ卜 Th1細胞に誘導する工程とからなる。第 2工程の CD4陽性 T細胞を増殖させる工程では、好ましくは第 1工程で得られた培養物にインタ一ロイキン 2に顆粒球マクロファージコ口ニー刺激因子あるいはインターロイキン 3を、さらに好ましくは第 1工程で得られた培養物にィンターロイキン 2に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及びインターロイキン 3をさらに添加して培養を続けてもよい。第 2工程とは一段階で行うことも、 2段階に分けて行うこともできるが、 2段階に分けて行う場合には、 GD4陽性 T細胞を増殖させる工程及び細胞傷害活性を有するヒト Th1細胞に誘導する工程のいずれにおいても用いたサイトカインを添加する。培養期間は、必要数の樹状細胞や Th1型の GD4陽性ヘルパーキラー T細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常、上記第 1工程が 1 〜7日、好ましくは 2曰、上記第 2工程前段が 2〜 6週間、好ましくは 2〜 3週間、上記第 2工程後段が 2 〜7日、好ましくは 2日である。

上記したいずれの方法及びいずれの工程においても、用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、上記したいずれの方法及びいずれの工程においても、樹状細胞や TM 型の GD4陽性ヘルパーキラー T細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で 10〜1000ng/mL程度が好ましく、さらに好ましくは 20〜500ng/mL程度である。また、複数のサイト力インが用いられる場合、各サイトカインの濃度は、通常、 1 ng/nl以上であることが好ましい。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒ卜の体温である 37°C 程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、 5%G0₂を通気することが好ましい。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができる力医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナ一式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。

具体的な治療形態としては次の手順が考えられる。すなわち、対象疾患の患者から採血し、リンパ球および白血球成分を分離して、培養を始め、 2〜4週間後に誘導された Th 1型の GD4陽性ヘルパーキラー T細胞を、患者自身に輸注する。患者にかかる負担は基本的に採血と輸注のみであり、癌細胞は誘導された Th1型の GD4陽性ヘルパーキラー T細胞により抑制され、結果として治療される。また、骨髄移植や血液幹細胞移植では、ドナーから提供された細胞を同様に培養し、宿主対移植片反応が制御して、移植片の生着向上や原疾患の治療等につなげることができる。

本発明により得られる T h 1 細胞を治療に用いる場合、 Thl 細胞を静脈内注射、点滴等により末梢血に投与することが好ましい。また、固形癌の場合には、末梢血に投与してもよいし、癌組織中に直接投与してもよい。投与する細胞の数は、患者の症状等により適宜設定できるが、末梢血に投与する場合、通常、成人患者 1回の治療当たり 10⁷〜10¹¹個程度であり、好ましくは 10⁸〜10⁹個程度である。実施例

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。

実施例 1 Th1細胞の製造（その 1 )

ヒト急性リンパ球性白血病（ALL) 患者の骨髄細胞あるいは末梢血より単核球を分離し、 2 χ 10⁶個ノ mLの濃度で 10%ヒト血清を含んだ AIM-V培地（G I BG0 - B RL社製) に顕濁し、 12穴プレートに播種し GM-GSF (30ng/mL) と I L-3 (30ng/mL ) を添加し、 2日間培養して樹状細胞を誘導した。その後培養液に IL-2 (100U/m L(10ng/mD) を添加し、 14〜21 日間培養し GD4陽性 T細胞を大量に得た。なお、 CD4陽性か否かは、 Phycoerythrin標識抗ヒト GD4抗体および Fluorescein isot hiocyanate標識抗ヒト GD8抗体にて細胞を染色し、フローサイトメ一ターにて確認した（図 2参照）（免疫実験操作法 l， lし 1995年、（株）南江堂）。この GD4陽性 T細胞を - 12 (40U/mL(4ng/mL)) 、 !FN-r (30ng/mL) を含んだ培養液にて、さらに 2日間培養を続けた。なお培養期間中細胞濃度が 5 x10⁶個 mL を越えた場合には、細胞をガラスピペットで撹拌しながら回収し、およそ 1 x10 ⁶個 mL程度に上記のサイトカインを添加した培養液で再顕濁し、すべて新たなプレー卜に播種した。得られた CD4陽性 T細胞をガラスピペットを用い、撹拌しながら遠心管に集め、遠心分離することにより回収した。

また比較のため、 Th2条件として、培養の最初より IL - 4 (30ng/mL) の濃度で添加しておき、最後の段階の IL- 12および IFN-rを加えないもの、または ThO 条件（ThO細胞あるいは Th1/2前駆細胞）として最後の段階の - 12および IFN- rを加えないものも培養し、上記と同様に回収した。

実施例 2 Th1細胞の製造（その 2)

ヒト慢性骨髄性白血病（CIVIL) 患者の骨髄細胞あるいは末梢血より単核球を分離し、 2χ10⁶個ノ mLの濃度で 10%ヒト血清を含んだ AIM-V培地（GIBC0-BRL社製）に顕濁し、 12穴プレートに播種し GM - GSF (30ng/mL) と IL-3 (30ng/mL) を添加し、 2日間培養して樹状細胞を誘導した。その後培養液に IL - 2 (100U/mL(10 ng/mD) を添加し、 14〜21 日間培養し CD4陽性 T細胞を大量に得た。この GD4 陽性 T細胞を - 12 (40U/mL(4ng/mD) 、 IFN-r (30ng/mL) を含んだ培養液にて、さらに 2日間培養を続け、実施例 1と同様に CD4陽性 T細胞を回収した。また比較のため、実施例 1と同様に Th2条件下および ThO条件下においても培養し、上記と同様に回収した。

実施例 3 Th1細胞の製造（その 3)

ヒト急性単球性白血病（AMoL (M4)) 患者の骨髄細胞あるいは末梢血より単核球を分離し、 2x10⁶個 mLの濃度で 10%ヒト血清を含んだ AIM-V培地（GIBG 0-BRL社製) に顕濁し、 12穴プレートに播種し GM-GSF (30ng/mL) と I L-3 (30ng Ml) を添加し、 2日間培養して樹状細胞を誘導した。その後培養液に - 2 (100 U/mL (10ng/mD ) を添加し、 14〜21 日間培養し GD4陽性 T細胞を大量に得た。この GD4陽性 T細胞を I L- 12 (40U/mL (4ng/mL) ) 、 I FN- r (30ng/mL) を含んだ培養液にて、さらに 2日間培養を続け、実施例 1と同様に GD4陽性 T細胞を回収した。また比較のため、実施例 1 と同様に Th2条件下および ThO条件下においても培養し、上記と同様に回収した。さらには ThO/1条件として培養の最初より I L- 12 (40U/mL (4ng/mD ) 、 I FN- r (30ng/mL) を加え続ける条件にて培養し、 CD4 陽性 T細胞を上記と同様にして回収した。ただしこの ThO/1条件の培養は、細胞増殖率が他の条件よリ悪かった。

実施例 4 細胞の性質（その 1 )

実施例 1〜 3で得られた CD4陽性 T細胞の、該患者の白血病細胞に対する細胞傷害活性を調べた。細胞傷害活性を調べた具体的な方法は、該患者の凍結保存してある白血病細胞を凍結融解後培養し、実験時に定法に従い ⁵¹Cr で放射標識し、該患者の誘導し得られた GD4陽性 T細胞と放射標識白血病細胞を各エフェクター細胞対標的細胞比にて混合培養し、 4時間後に培養上清に放出される放射能活性を測定し、細胞傷害活性を求めた（免疫実験操作法し Iし 1 995年、（株）南江堂）。

結果を図 3に示す。図 3に示されるように、本発明の方法（Th1条件あるいは ThO/1条件）により各患者から得られた GD4陽性 T細胞は、各患者の白血病細胞に対して高し、細胞傷害活性を示した。

実施例 5 細胞の性質（その 2 )

また、実施例 1〜 3で得られた GD4陽性 T細胞の I FN- r産生能を調べた。これは具体的には次のようにして行った。患者より得られた白血病細胞をマイトマイシン C (50 g/mL) ( (株）協和発酵）にて処理し、このマイ卜マイシン C処理白血病細胞（5 χ 10⁴個）と該患者より得られた CD4陽性 Τ細胞（2 χ 10⁵個）を混合培養し、その 4 8時間後に培養上清に産生された IFN - rを、 IFM- r ELISA k i t (R&D社製) にて測定した。結果を図 4に示す。図 4に示されるように、本発明の方法（Th1条件）により得られた GD4陽性 T細胞は、 IFN-r産生能を示したことから Th1型の細胞であること力わかった。

これらのことから、癌の免疫療法および GVHDの制御に有望と考えられる GD4 陽性ヘルパーキラー細胞が効率的に誘導できた。

実施例 6 細胞の性質（その 3)

実験例 3で得られた本発明の Th1細胞が示す自己癌細胞刺激により IFN- τ産生及び自己癌細胞に対する細胞傷害活性の MHGクラス IIに対する抗体での抑制を調べた。これは具体的に次のようにして行った。実施例 4および実施例 5で行つた試験系と同様におこない、その混合培養系に MHGクラス I に対する抗血清あるいはクラス I Iに対する抗血清を 100倍希釈になるように加え、試験を行つた。

結果を図 5に示す。図 5より自己癌細胞刺激による IFM- τの産生は MHCクラス IIに対する抗血清を加えることにより完全に抑制され（a) 、自己癌細胞に対する細胞傷害活性も MHGクラス I Iに対する抗血清を加えることにより、約 40 %抑制された（b) 。このことより、誘導された GD4陽性 T細胞が、 MHCクラス IIに拘束されていることがわかる。

参考例 1

マウスのォブアルブミン (OVA) 抗原特異的リンパ球を、抗原提示細胞（マウス脾細胞）とともに、 OVAペプチド (10〃 g/mL) 、 IL-12 (20U/mL) , IFN-r (1 ng/mL) , IL-2 (20U/mL)、抗 IL-4抗体 (50 g/mL) 、牛胎児血清 (10%) を添加した RPM卜 1640培地で培養し、 OVA抗原特異的 Th1細胞を誘導した。マウス 6匹に OVA抗原を遺伝子導入によリ発現させた癌細胞（A20- 0VA)をマウスの皮内に 2 χ10⁶個移植し、 0VA抗原発現の癌腫が 6〜8mmに増殖した時点で、誘導した 0V A抗原特異的 Th1細胞 2χ10⁷個をその担癌マウスに移入した。その結果、全例で癌の消失が認められ、抗原特異的 Thl細胞に注入による著明な抗腫瘍効果を認めた。

参考例 1 マウス骨髄移植モデルで Th1細胞の制御による移植細胞の生着に対する効果を調ベた。すなわち、 BDF1マウスに G57BL/6マウスのリンパ球を 5 X 1 0⁷個を静脈内注射にて移植し、誘導される IFN-rを測定した。その結果、移植後、 5〜7 日後に血清中に IFN - rが 50 Opg/mLから 200 Opg/mL検出され、 1 0〜"！ 4 日後には、移植を受けたマウスのリンパ球は、すべて移植したマウスの細胞に置き換わっていた。一方、 IFN- rが 1 Opg/nt以下の場合には移植リンパ球は生着しなかった。以上の結果より、 Th1反応が誘導されることが移植する細胞の定着に重要なことが判明した。このことは白血病患者などの造血器腫瘍患者に対する同種造血細胞移植時の移植片対宿主病（graft-versus- host disease ： GVHD) および移植片対白血病リンパ腫 (graft- versus- leukemia/ lymphoma ： GVL) の制御に重要な知見と考えられる。

Claims

求の範囲

1 . 患者から採取した末梢血又は骨髄を材料とし、疾患由来抗原を外部から加えずに、また外来的なサイト力インを用いて体外培養することにより、樹状細胞を誘導し、培養物中に含まれる CD4陽性 T細胞を前記樹状細胞との共存下で培養し、細胞傷害活性を有するヒト Th1細胞に誘導することを含む、主要組織適合遺伝子複合体クラス 1 1拘束性の抗原特異的なヒト Th1細胞の製造方法。

2 . 患者の疾患が癌である請求項 1記載の方法。

3 . 患者の疾患が血液あるいは造血器系の悪性疾患である請求項 1記載の方法 _c

4 . 患者の疾患が白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群あるいは再生不良性貧血である請求項 2記載の方法。

5 . 外来的なサイトカインが、少なくとも顆粒球マクロファージコロニ一刺激因子、インターロイキン 3及びインタ一ロイキン 2にインタ一フエロン及び又はィンタ一ロイキン 12を加えた群である請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の方法。

6 . 前記樹状細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及びインター口ィキン 3から成る群より選ばれる少なくとも 1種のサイトカイン存在下で前記骨髄細胞又は白血球成分を培養することにより誘導される請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の方法。

7 . 培養物中に含まれる GD4陽性 T細胞を前記樹状細胞との共存下で培養し、細胞傷害活性を有するヒト Th1細胞に誘導することには、前記 GD4陽性 T細胞を、インターロイキン 2存在下で前記樹状細胞と相互作用させながら増殖させ、ついで、インターフェロン r及びノ又はインターロイキン 12を加える培養条件下でヒト Th1細胞に誘導させることを含む請求項 1ないし 6のいずれか 1項に記載の方法。

9 . 樹状細胞を誘導する第 1工程と、培養物中に含まれる CD4陽性 T細胞を前記樹状細胞との共存下で培養し、細胞傷害活性を有するヒト Th1細胞に誘導する第 2工程とを含む請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の方法。

1 0 . 前記第 1工程は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子及び又はィンターロイキン 3の存在下で行い、前記第 2工程は、前記第 1工程で得られた培養物にィンタ一ロイキン 2を添加して培養を続けて GD4陽性 T細胞を増殖させる工程と、さらにインターフ: cロン r及ぴ又はインターロイキン 1 2を添加して細胞傷害活性を有するヒ卜 Th1細胞に誘導する工程とを含む請求項 9記載の方法。 1 1 . 請求項 1 ないし 10のいずれか 1 項に記載の方法により製造された細胞。

1 2 . 請求項 1 1記載の細胞を含む医薬。

1 3 . 請求項 1 1記載の細胞を含む医薬組成物。

1 4 . 請求項 1 1記載の細胞を含む癌治療薬。

1 5 . 請求項 1 1記載の細胞を含む血液あるいは造血器系の悪性疾患治療薬。

1 6 . 前記血液あるいは造血器系の悪性疾患が白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群あるいは再生不良性貧血治療薬である請求項 1 5記載の血液あるいは造血器系の悪性疾患治療薬。

1 7 . 請求項 1 1記載の細胞を含む宿主対移植片反応制御薬。

1 8 . 請求項 1 1記載の細胞の癌治療薬製造のための用途。

1 9 . 請求項 1 1記載の細胞の血液あるいは造血器系の悪性疾患癌治療薬製造のための用途。

2 0 . 前記血液あるいは造血器系の悪性疾患が白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫骨髄異形成症候群あるいは再生不良性貧血である請求項 1 9記載の用途。 2 1 . 請求項 1 1.記載の細胞の宿主対移植片反応制御薬製造のための用途。

2 2 . 請求項 1 1記載の細胞の有効量を癌又は免疫疾患患者に投与することを含む癌の治療方法。

2 3 . 請求項 1 1記載の細胞の有効量を血液あるいは造血器系の悪性疾患患者の治療方法。

2 4 . 前記血液あるいは造血器系の悪性疾患が白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫骨髄異形成症候群あるいは再生不良性貧血患者である請求項 2 3記載の治療方法。

2 5 . 請求項 1 1記載の細胞の有効量を、宿主対移植片反応を制御することが望まれる患者に投与することを含む、宿主対移植片反応の制御方法。