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WO2003012137A2 - Methodes de detection de la maladie de parkinson - Google Patents

Methodes de detection de la maladie de parkinson Download PDF

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WO2003012137A2
WO2003012137A2 PCT/FR2002/002761 FR0202761W WO03012137A2 WO 2003012137 A2 WO2003012137 A2 WO 2003012137A2 FR 0202761 W FR0202761 W FR 0202761W WO 03012137 A2 WO03012137 A2 WO 03012137A2
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WO
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cyp2d6
disease
parkinson
gstm1
cell lines
Prior art date
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PCT/FR2002/002761
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Gérard Lucotte
Patrice Denefle
Marie-Françoise ROSIER
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Aventis Pharma SA
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Publication date
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Definitions

  • the present invention relates to methods for the diagnosis or prognosis of Parkinson's disease in a subject, in which the joint presence of the homozygous mutation CYP2D6-B and the homozygous deletion of GSTM1 indicates that said subject may have the disease. Parkinson's disease or has an increased risk of developing Parkinson's disease.
  • the present invention also relates to diagnostic or prognostic kits for Parkinson's disease, and double transgenic animals into the genome of which is inserted an exogenous genomic DNA sequence carrying the homozygous mutation CYP2D6- B and having the gene invalidation.
  • GSTMl their process for obtaining and their use in order to test the activity of agents or methods intended to prevent and / or treat Parkinson's disease.
  • Parkinson's disease is a neurological disorder that usually appears with age.
  • the neurological changes that cause this disease are variable and still relatively poorly understood.
  • the disorder usually develops asymmetrically, begins with tremors in one hand or leg, and progresses to a symmetrical loss of voluntary movement.
  • the patient is incapacitated due to the severity of symptoms such as tremors, bradykinesia (poor movement) and muscle stiffness.
  • the disease is often accompanied by dementia.
  • GSTs glutathione S-transferases
  • GSTM1 glutathione S-transferases
  • the present invention is based on the discovery that subjects jointly presenting the homozygous mutation CYP2D6-B and whose genome is homozygous for the deletion of GSTM1 have an increased risk of developing Parkinson's disease, this risk being greater than that of subjects not having than the homozygous CYP2D6-B mutation or else being only homozygous for the deletion of GSTM1, as reported in the studies mentioned above.
  • This discovery is particularly interesting because it makes it possible to confirm and / or predict the severity of the disease in patients for whom Parkinson's disease has already been diagnosed as well as the probable effectiveness of the treatments envisaged, or even to predict the risks. onset of the disease in people who do not have symptoms of Parkinson's disease.
  • the present invention thus has for first object a method of diagnosis or prognosis for Parkinson's disease in a subject.
  • Said method comprises the steps of detecting the presence of the homozygous mutation CYP2D6-B on the one hand, and the homozygous deletion of GSTM1 on the other hand.
  • the joint presence of the homozygous CYP2D6-B mutation and the homozygous deletion of GSTM1 indicates that the subject may be suffering from Parkinson's disease or is at increased risk of developing Parkinson's disease.
  • Appropriate subjects can be chosen for example from:
  • the stages of detection, simultaneous or not, of the presence or absence of the homozygous mutation CYP2D6-B and of the homozygous deletion of GSTM1 are carried out directly or indirectly by any appropriate means from biological samples.
  • the present invention therefore also relates to a method of screening biological samples taken from subjects, in particular subjects having no symptoms of Parkinson's disease, in order to detect the presence of samples of subjects highly susceptible to developing Parkinson's disease , said screening comprising the search, simultaneously or not, in said biological samples, for the joint presence of the homozygous mutation CYP2D6-B and the homozygous deletion of GSTM1.
  • Said samples containing the DNAs or proteins to be identified can be of various origins. These can be, for example, samples of blood, semen, hair (with their roots) or any other sample containing nucleated cells.
  • the biological samples analyzed are blood samples.
  • the DNA to be identified is taken from the leukocytes.
  • the term "biological sample” means either samples directly from the subject for whom a diagnosis or prognosis is desired without further transformation, or samples having undergone one or more stages of preparation so as not to keep only a fraction useful for the detection steps, for example a crude cell extract.
  • the detection of mutations in CYP2D6 and GSTM1 can be carried out either by detection of the sole presence or not of the protein CYP2D6-B and of the presence or the absence of GSTM1, either by detection of the presence or absence of the DNA carrying the homozygous mutation CYP2D6-B and of the DNA having the homozygous deletion of GSTM1.
  • the protein CYP2D6-B In the case of the detection of the protein CYP2D6-B, it is intended to detect, within the meaning of the present invention, the protein CYP2D6-B only to the exclusion of any other mutated or wild-type form. This therefore corresponds to an individual with DNA comprising the homozygous mutation CYP2D6-B.
  • the terms "detection of the sole presence or absence of the CYP2D6-B protein" will be used.
  • the steps for detecting the proteins CYP2D6 and GSTM1 or the DNA coding for CYP2D6-B and GSTM1 can be carried out according to direct or indirect methods well known to those skilled in the art.
  • said steps of detecting the presence or absence of the proteins CYP2D6-B and GSTM1 or of the DNA carrying the homozygous mutation CYP2D6-B and having the homozygous deletion of GSTM1 can also be carried out simultaneously or not for each of the two genes.
  • a biological sample contains the mutated CYP2D6-B protein to the exclusion of any other mutated or wild-type form, or contains DNA carrying the homozygous CYP2D6-B mutation
  • this more precisely means that the sample analyzed contains only the mutant protein or that the mutant DNA, that is to say that no trace of the protein or DNA in wild form or in another mutated form has been detected.
  • a sample corresponding to a subject having the homozygous deletion of GSTM1 is, within the meaning of the present invention, a sample in which no trace of the functional protein GSTM1 has been detected.
  • PCR Chain polymerization
  • RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
  • all the techniques for identifying the DNAs coding for CYP2D6-B and GSTM1 which can be used in the context of the present invention include a prior step of collecting the biological sample or samples containing the DNAs to be identified and a step of extracting genomic DNA according to standard techniques well known to those skilled in the art, for example according to the method of Smith et al. (The Lancet, 1992, 339, pp. 1375-7).
  • PCR technique which firstly consists in synthesizing oligonucleotides complementary to the sequence of the regions which delimit the segment of DNA to be amplified (also called “primers”). These oligonucleotides serve as a primer for DNA polymerase. Then, the steps of heat denaturation (92-95 ° C) are undertaken to separate the two strands of DNA, hybridization with the two specific primers by lowering the temperature (50-55 ° C) and extension of primers with DNA polymerase at 70-72 ° C.
  • PCR two successive PCRs using two different pairs of primers
  • a first pair of external primers which allows obtaining a DNA fragment amplified as in conventional PCR
  • a second pair of internal primers to amplify the DNA fragment obtained from the first PCR.
  • the DNA fragments obtained by PCR can also be separated by electrophoresis according to their size and visualized using BET (ethidium bromide) and ultraviolet rays.
  • BET ethidium bromide
  • a particularly advantageous possibility in the present case consists in carrying out a PCR with a first "primer” having at its 3 'end the mutated nucleotide sequence, and a second "primer” having at its 3' end the sequence of wild nucleotides.
  • the amplified DNA fragments are directly identified by a “Dot” technique which consists in depositing a sample of the DNA fragments produced by the PCR on a nylon filter, in carrying out the denaturation of the fragments. DNA, their hybridization with a specific radioactive probe, washing to remove the excess of non-fixed radioactive product and carrying out an autoradiogram.
  • a “Dot” technique which consists in depositing a sample of the DNA fragments produced by the PCR on a nylon filter, in carrying out the denaturation of the fragments. DNA, their hybridization with a specific radioactive probe, washing to remove the excess of non-fixed radioactive product and carrying out an autoradiogram.
  • the revelation can also be done by other means thanks to the use of specific probes comprising a marker other than radioactive, for example a dye or even a fluorescent marker.
  • One such method consists in determining the nucleotide sequence at the level of the polymorphic positions of the CYP2D6 and GSTM1 genes.
  • the sequencing can be carried out by any method known to those skilled in the art, for example by the Sanger method or else by the Maxam and Gilbert method.
  • the detection of the presence or absence of DNA carrying the homozygous mutation CYP2D6-B and having the homozygous deletion of GSTM1 can be carried out using the technique of "Southern Blotting" which consists in performing an electrophoresis of the fragments of DNA obtained after attack by one or more restriction enzymes. The gel is then denatured and a transfer is carried out on a nylon membrane. This membrane is intended to be hybridized with a specific probe. After washing to remove the excess of unbound radioactive product, the film is applied to the membrane. One or more bands can thus be detected corresponding to the DNA fragments recognized by the probe.
  • Southern Blotting which consists in performing an electrophoresis of the fragments of DNA obtained after attack by one or more restriction enzymes.
  • the gel is then denatured and a transfer is carried out on a nylon membrane. This membrane is intended to be hybridized with a specific probe. After washing to remove the excess of unbound radioactive product, the film is applied to the membrane.
  • One or more bands can thus be detected
  • RFLP RFLP technique associated with the Southern Blotting and / or PCR technique
  • the RFLP makes it possible to compare the DNAs of different individuals and to find out whether point mutations causing the appearance or disappearance of restriction sites have occurred. Two DNAs of identical sequence treated with restriction enzymes will give identical fragments, and the Southern Blots obtained with these fragments will therefore be identical. On the contrary, if a restriction site has disappeared or has appeared following a mutation, the fragments will no longer have identical sizes, which will be visible on the autoradiograms. The same applies if a new restriction site has appeared following a mutation.
  • CYP2D6-B it is also possible to use indirect methods to determine the presence or absence of DNA carrying the homozygous mutation CYP2D6-B and having the homozygous deletion of GSTM1. For example, if we detect CYP2D6-A, it is because the subject is not homozygous CYP2D6-B, or, if we detect CYP2D6-A and CYP2D6-C, it is because the subject does not have the mutation CYP2D6-B for neither of the two alleles.
  • the monoclonal antibodies can be obtained according to techniques known to those skilled in the art.
  • the monoclonal antibodies can be obtained according to the techniques of Kohler and Mildstein (Nature 1975, 265, pp. 495-7).
  • the homozygous proteins CYP2D6-B and GSTM1 can be obtained from a subject homozygous for CYP2D6-B and GSTM1. They are then purified according to the technique described by Rail et al. (Methods in EnzymoL, 1986, 128, p. 273) and used as immunogens for the production of monoclonal and polyclonal antibodies.
  • Rail et al. Methods in EnzymoL, 1986, 128, p. 273
  • only a fragment of the CYP2D6-B and GSTM1 proteins can be used as an immunogen.
  • antibody means all types of immunoglobulins, including IgG, IgM, IgA, IgD and IgE.
  • the antibodies used can be monoclonal or polyclonal. They can be of natural origin or else be chimeric antibodies, or they can include antibody fragments such as Fab fragments.
  • the immunological reaction used for the detection of the sole presence or absence of the protein CYP2D6-B and of the presence or absence of the protein GSTM1 generally consists in bringing the specific antibodies and detectable markers into contact with the biological sample.
  • the signal emitted by the marker is modified.
  • Immunological reaction and detection of the signal emitted by the marker can be carried out either homogeneously in the same solution, or heterogeneously.
  • the antibody (ies) are immobilized on a solid support (beads, plate, etc.) and brought into contact with a solution of the biological sample, then the signal emitted either by the solid support or by the solution is examined.
  • the markers emitting a signal can be chosen from the conventional markers well known to those skilled in the art, in particular radioactive markers, fluorescent markers or even enzymatic markers.
  • Another object of the present invention therefore relates to a method of analyzing biological samples taken from a subject which consists in: a) determining the genotype for CYP2D6 and GSTM1 of said subject, and b) converting the data obtained in a) in order to to predict the risk of said subject of developing Parkinson's disease and the effectiveness of possible therapeutic treatments for this disease.
  • the present invention also relates to kits for diagnosing or prognosis of Parkinson's disease in a subject.
  • kits can be in the form of a compartmentalized package so as to receive different containers such as, for example, ampoules or tubes.
  • Each of these receptacles comprises the various elements necessary for carrying out the detection of the presence or absence of the DNA carrying the homozygous mutation CYP2D6-B and having the homozygous deletion of GSTM1, or for carrying out the detection of the only presence or not of the CYP2D6-B protein and the presence or absence of the GSTM1 protein, individually or mixed. Said elements making it possible to carry out the detection reaction (s) are chosen from those described above.
  • They can be, for example: primers hybridizing a defined region of CYP2D6-B, primers hybridizing a defined region of GSTM1 and optionally the means necessary for carrying out an amplification reaction, oligonucleotide probes, optionally immobilized on a support and comprising a detectable marker, and optionally the reagents necessary for carrying out a hybridization reaction, or of antibodies capable of binding selectively to GSTM1 optionally immobilized on a support, of antibodies capable of binding selectively link to CYP2D6-B or to other CYP2D6 mutations possibly immobilized on a support, and possibly the reagents necessary for carrying out an immunological reaction.
  • Another object of the present invention is a method of treatment for Parkinson's disease, characterized in that it comprises:
  • the present application also relates to the use of a compound, or of a mixture of compounds known for their activity against the disease of Parkinson for the manufacture of a medicament for the treatment of a subject affected by Parkinson's disease, in which the joint presence of the homozygous mutation CYP2D6-B and the homozygous deletion of GSTM1 has been demonstrated prior to treatment.
  • Parkinson's may be levodopa, or selective inhibitors of the monoamine oxidase MAO-B, a dopamine-degrading enzyme in the brain, such as rasagiline or selegiline. They can also be catechol-O methyl transferase (COMT) inhibitors, possibly in combination with levodopa. They can also be, in addition to levodopa, precursor of dopamine, dopaminergic agonists, such as the following products: bromocriptine, cabergoline, adrogolide, L-dopa, dopadose, ropinirole, pramipexole, rotigotine, spheramine, or uridine.
  • MAO-B monoamine oxidase MAO-B
  • a dopamine-degrading enzyme in the brain such as rasagiline or selegiline.
  • CCT catechol-O methyl transferase
  • Parkinson's may be levodopa,
  • the compounds of the combination can be administered orally, parenterally, transdermally or rectally either simultaneously or separately or over a period of time.
  • the compounds are formulated in the form of pharmaceutical compositions containing the combination of one or more compounds as defined above with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • compositions for oral administration tablets, pills, powders (gelatin capsules, cachets) or granules can be used.
  • the active ingredients are mixed with one or more inert diluents, such as starch, cellulose, sucrose, lactose or silica, under a stream of argon.
  • these compositions can also comprise substances other than diluents, for example one or more lubricants such as magnesium stearate or talc, a dye, a coating (dragees) or a varnish.
  • liquid compositions for oral administration solutions, suspensions, emulsions, syrups and elixirs can be used pharmaceutically acceptable containing inert diluents such as water, ethanol, glycerol, vegetable oils or paraffin oil.
  • inert diluents such as water, ethanol, glycerol, vegetable oils or paraffin oil.
  • These compositions can include substances other than diluents, for example wetting, sweetening, thickening, flavoring or stabilizing products.
  • the sterile compositions for parenteral administration can preferably be aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions.
  • solvent or vehicle water, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, in particular olive oil, injectable organic esters, for example ethyl oleate or other organic solvents can be used. suitable.
  • These compositions can also contain adjuvants, in particular wetting agents, isotonizers, emulsifiers, dispersants and stabilizers. Sterilization can be done in several ways, for example by aseptic filtration, by incorporating sterilizing agents into the composition, by irradiation or by heating. They can also be prepared in the form of sterile solid compositions which can be dissolved at the time of use in sterile water or any other sterile injectable medium.
  • compositions for rectal administration are suppositories or rectal capsules which contain, in addition to the active product, excipients such as cocoa butter, semisynthetic glycerides or polyethylene glycols.
  • excipients such as cocoa butter, semisynthetic glycerides or polyethylene glycols.
  • the pharmaceutical compositions containing the combination as defined above generally contain 0.1 to 500 mg of compound.
  • the doses depend on the desired effect, on the duration of the treatment and on the route of administration used; they are generally from 0.1 to 500 mg per day orally for an adult of the compound.
  • the present invention further relates to a new animal model of Parkinson's disease expressing the protein CYP2D6-B to the exclusion of any other mutated or wild-type form and not expressing the protein GSTM1. More specifically, the present invention relates to a new transgenic animal model into the genome of which is inserted at least one exogenous DNA sequence carrying the homozygous mutation CYP2D6-B so that the function of the CYP2D6 gene is modified, and the GSTMl gene is inactivated. Even more precisely, the present invention relates to a new transgenic animal model which is knock-out (KO) or knock-in (Kl) for CYP2D6 and which is knock-out for GSTM1
  • transgenic animal means any non-human animal exhibiting an artificial modification of its genome.
  • the modification of the genome can result from an alteration or a modification of one or more genes by “knock-in” or by “knock-out” (inactivation / modification of genes by homologous recombination). This modification may be due to the action of conventional altering or mutagenic agents or else effected by stable insertion of an expression cassette allowing the expression of a hybrid gene.
  • the modification of the genome can also result from an insertion of gene (s) or a replacement of gene (s) in its wild or mutated form (s).
  • the modifications are advantageously carried out on reproductive stem cells such that the transgenic animal obtained is KO or K1 for CYP2D6 and KO for GSTM1.
  • ES cells stem cells
  • these technologies can easily be applied by those skilled in the art to these other species to generate KO and / or Kl models.
  • approaches based on the use of oligonucleotides (DNA, RNA or hybrids) alone or linked to enzymes modifying DNA / RNA can be used to introduce a defined mutation modification at a predetermined locus in the genome. Even chemical irradiations or mutagens which induce random changes in the genome can be used if they are combined with an efficient set of biological markers (phenotype) and with a positional high-throughput cloning procedure.
  • transgenes The most direct approach for the modification of the genome of laboratory animals (mice, rats, cows, pigs, sheep ...) is however the random integration of transgenes by microinjection of linearized DNA into one or two pronuclei d oocytes fertilized at the single cell stage (preferably to avoid the generation of chimeric animals although injection at the stage of two or more cells can also be implemented).
  • a transgene is composed of two parts: the regulatory elements which impose spatio-temporal control of the expression of the RNA coded by the cDNA, and said juxtaposed DNA (cDNA or genomic fragment). These two elements (the regulatory element and the DNA coding for the desired protein) can be homologous or heterologous to the target genome.
  • the transgenic animals concerned are generally chosen from non-human mammals. They may, for example, be murine, namely mice, rats and guinea pigs, rabbits, cats, dogs, sheep, or even cattle. Preferably, they are murine, rats or rabbits obtained according to conventional transgenesis techniques.
  • Other objects of the present invention are stem cell lines and differentiated cell lines from these stem cell lines, into the genome of which is inserted at least one exogenous genomic DNA sequence carrying the homozygous mutation CYP2D6-B and whose GSTM1 gene is inactivated.
  • the technologies mentioned above can be applied to generate animal models reproducing the genetic modifications found in human patients or in individuals "at risk" for the development of Parkinson's disease.
  • obtaining transgenic animals, stem cell lines and differentiated cell lines consists of a method implementing the following steps: a) the generation of transgenic animals expressing the human CYP2D6-B protein to the exclusion of any other wild or mutated form by insertion by homologous recombination of a cDNA coding for the protein CYP2D6-B into the corresponding gene of the animal (the insertion of the transgene is targeted immediately after the promoter of the gene of the animal so as to impose the profile of correct expression to the transgene and to prevent the expression of the endogenous gene of the animal: KO) or else by insertion of the specific mutation described in the present invention corresponding to the human isoform gene CYP2D6-B in the endogenous gene of the animal (the modification is made by homologous recombination in the stem cells: K1), b) the generation of transgenic animals having the function of GSTM1 inactivated by cutting the animal gene homologous to the human GST
  • the cut-off cassette is targeted so as to replace the 3 ′ part of the promoter and of the first coding exon in order to prevent any possibility of obtaining truncated versions or isoforms of splicing of the animal gene
  • the double transgenic animals thus obtained reproduce the genotype observed in patients suffering from Parkinson's disease or “at risk”.
  • the genotype control for CYP2D6 and GSTM1 of the newborn animal thus obtained can be carried out using the techniques already described above, in particular using an amplification reaction (PCR) and / or Southern.
  • said transgenic animals can also express another protein (s) little or not active and which has been determined (s) to be involved in Parkinson's disease (by Parkin protein).
  • Such transgenic animals are particularly interesting because they provide an advantageous model for the understanding of Parkinson's disease which very faithfully reproduces the characteristics of Parkinson's disease.
  • this model allows in particular the identification of compounds particularly suitable for the treatment of Parkinson's disease, in particular as described in humans. These compounds can be chemical molecules, peptide or protein molecules, antibodies, chimeric molecules as well as antisense DNAs or ribozymes.
  • the compounds thus demonstrated can be used as a medicament, as such or in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle in order to obtain a pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle in order to obtain a pharmaceutical composition.
  • They can be in particular saline solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition, as appropriate, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the injections can be performed by stereotaxic, topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc.
  • the demonstration of the compounds described above is based on bringing the animal model of the invention into contact, in particular by administration such as for example an injection, with a compound or a mixture of compounds supposed to have an action and then measure the effect (s) of the compounds, in particular at the cerebral level of the model on various biochemical and / or histological changes.
  • transgenic animals In addition to being able to test in vivo therapeutic compounds making it possible to prevent, attenuate or cure Parkinson's disease, these transgenic animals also make it possible to have an animal model of Parkinson's disease useful for screening environmental factors which induce or accelerate pathogenesis, or to study behavior during the development of the disease and to study the various biological mechanisms which are involved, for example for the purpose of studying new drugs or determining the effective amounts of drugs and toxicity.
  • Another object of this The invention relates to the use of a transgenic animal, stem cell lines or differentiated cell lines as defined above for testing the activity of compounds or methods intended to prevent and / or treat Parkinson's disease.
  • Another subject of the invention relates to a cell extracted from transgenic animals as described above as well as its use for the detection of compounds intended for the treatment of Parkinson's disease.
  • the identification of compounds described above is based on bringing cells extracted from the animal model of the invention into contact with a compound or a mixture of compounds supposed to have an action and then measuring the effect (s) of the compounds on level of whole cells, in cell homogenates or on a sub-cellular fraction, on various parameters such as cell death for example.
  • the present invention also includes other characteristics and advantages which will emerge from the examples and figures which follow, and which should be considered as illustrating the invention without limiting its scope.
  • Example 1 Study of the genotype for CYP2D6 and GSTMl in a sample of 103 patients
  • Parkinson's disease had been clinically diagnosed for all these patients according to the accepted criteria, namely the presence of at least 2 of the main characteristics of Parkinson's disease: tremors, bradykinesia
  • Genomic DNA was then isolated from peripheral leukocytes, using a standard proteinase K digestion and phenol-chloroform extraction procedure.
  • D6 * 6 the CYP2D6-T mutation was detected by simple PCR and RFLP of the PCR product with the enzyme Bsrl (Saxena et al., Hum. Mol. Genêt., 1994, 3, pp. 923-926 )
  • the CYP2D6-A (D6 * 3) and CYP2D6-C (D6 * 9) mutations were detected using original primers specific to the sequence SEQ ID No. 1 [5'- GATGAGCTGCTAACTGAGCCC-3 'and SEQ ID N ° 2 5'- GCAAGGTCCTACGCTTCCAA-3 'for CYP2D6-A (D6 * 3) and SEQ ID N ° 3 5'-CCGTTCTGTCCCGAGTAT-3' and SEQ ID N ° 4 5'- GGCTATCACCAGGTGCTG-3 'for CYP2D6-C (D6 * 9)] and by RFLP with the enzyme Mspl.
  • the deletion of the GSTM1 gene was determined by PCR of the genomic DNA using the method described by Brokmoller et al. (Cancer Res., 1994, 54, pp. 4103-4111).
  • Table 1 summarizes the genotype for CYP2D6 and GSTMl in the 103 patients studied.
  • Wt means "wild type allele” and the numbers 3, 4, 5, 6 and 9 correspond respectively to the mutations CYP2D6-A, CYP2D6-B, CYP2D6-D, CYP2D6-T and CYP2D6-C.
  • the symbol "(-)” means that the GSTM1 gene has a homozygous deletion, and the symbol “(+)” means that the GSTM1 gene does not have a homozygous deletion.
  • Table 1 Genotypes for CYP2D6 and GSTMl in patients with Parkinson's disease
  • the most frequent allele in the series is CYP2D6-B (D6 * 4) in 21.8% of cases, the other mutations representing only less than 5% of cases.
  • allelic frequency p is therefore 70%, and the frequency of the expected heterozygotes is 42%.
  • Subjects with a metabolic deficiency of CYP2D6 are defined as being subjects having the two mutated alleles (that is to say both homozygous mutants and also heterozygous mutants composites).
  • PM subjects with a metabolic deficiency of CYP2D6
  • 9 patients are PM (7 homozygotes 4/4, one heterozygote composite 4/5 and one 4/9).
  • CYP2D6 and GSTMl are not genetically linked, due to their location on different chromosomes (chromosome 22 and chromosome 1 respectively). It is only possible to study their statistical interaction by studying the cases in relation to chance, since this interaction in controls has not been studied.
  • Table 2 summarizes the risk ratio (RR) between patients with a homozygous deletion of GSTM1 and who are PM for CYP2D6:
  • Table 2 Combined polymorphic effects of the GSTM1 and CYP2D6 genotypes in patients with Parkinson's disease and their risk ratio
  • This value is greater than 1, which indicates that there is a synergistic effect between the homozygous deletion of GSTM1 and subjects metabolically deficient for CYP2D6 (Fisher's exact test gives p ⁇ 0.016), and the interaction is statistically significant at 5% threshold.
  • Mutagenesis of human CYP2D6-B is done via the use of an in vitro mutagenesis system such as Sculptor TM (Amersham, France).
  • the coding region of CYP2D6-B including a Kozak consensus motif, is subcloned into a cloning vector of the Bluescript type (Stratagene) and the mutations are introduced according to the protocol supplied by the manufacturer via the use of oligonucleotides containing the desired mutation.
  • the mutated sequences are to be verified by sequence analysis.
  • the cDNA coding for the mutated human CYP2D6-B is subcloned into the polylinker of a ubiquitous transgenic expression vector such as HMG (Czech et al., 1997) or specific for certain tissues / cell types such as THYI (L ⁇ thi et al, J. Neuroscience, 17, pp. 4688-99), NSE, PDGF, or even prion.
  • a plasmid preparation kit (Qiagen) is used to prepare supercoiled DNA.
  • the vector sequences are to be eliminated by digestion with a defined restriction enzyme, leaving intact all of the transgene and separating it from unnecessary sequences of the cloning vector. Then, the fragment containing the expression cassette is purified by electrophoresis on an agarose gel.
  • the aliquots intended for microinjection are dialyzed against a TE buffer (10 mM Tris pH 7.4; 0.1 mM EDTA) on a floating filter (Millipore; type of membrane: VS; 0.025 ⁇ m) and then filtered (Spin-X; Costar; polyacetate membrane; 0.22 ⁇ m).
  • the DNA is diluted to the final concentration of 1-2 ng / ⁇ l for microinjection.
  • the purified fragment is injected into one of the two pronuclei of the fertilized oocytes of mice.
  • the surviving embryos are immediately transplanted into the oviduct of adoptive mothers ("pseudopregnant").
  • the presence of the transgene in newborns is determined either by PCR or by an analysis in Southern, using specific probes / sequences. By all of these analyzes, any major rearrangement or deletions of the transgene in the founders and their descendants can be excluded.
  • mice Homologous recombination technology
  • the primers and samples described in the present invention can be easily used to screen isogenic genomic libraries of mice (lambda libraries, BAC, YAC, etc.) in order to isolate and clone the corresponding gene of the mouse.
  • Said mouse gene is characterized for its genomic organization and its sequence using the standard techniques known to those skilled in the art (restriction site mapping, sequencing, bioanalytical tools) in order to define the exact place where the cDNA human must be inserted to obtain the expression profile of the desired human cDNA while permanently interrupting the expression of the murine gene.
  • a standard targeting vector for the stem cells is constructed (that is to say a vector having markers for the selection of the desired events, said markers being all well known to those skilled in the art. art specialist in the field).
  • a selection cassette antibiotic resistance gene
  • a selection cassette is placed at the limit of the 3 'and 5' ends of the genomic DNA fragments of the mouse (2-6 kb) identical to the 3 'and 5' extensions of the murine CYP2D6-B gene sequence located immediately after the selected insertion site.
  • a positive control vector for the screening of recombinant stem cells is generated (the vector reproduces the locus of the murine gene once integration is successful) in order to optimize and validate the procedure. high throughput screening.
  • DNA is purified for targeting assays.
  • the targeting vector is introduced into the stem cells using standardized electroporation techniques, after which the stem cell clones are subjected to a sequential screening procedure (antibiotics) so as to favor the stem cell clones carrying the desired recombination. In general, screening takes about 2 weeks.
  • the resistant stem cell clones are screened by PCR and / or Southern.
  • Clones of stem cells having the desired recombination without other detectable modification in their genome are developed so as to obtain sufficient cells. Then, said cells are injected into 3 1 ⁇ 2 day embryos obtained from a female who has ovulated naturally. The surviving blastocytes (comprising the stem cells) are implanted in a recipient female which will allow the development of the blastocytes at their term and will give birth to newborn mice composed of cells originating from the host blastocytes and stem cell clones. This type of animal is called a "chimera animal".
  • chimeras preferably males since most of the stem cell lines are obtained from male mice
  • the breeding of heterozygous animals between them makes it possible to generate homozygous animals.
  • the murine gene is isolated and characterized.
  • it is essential to compare the human gene and the murine gene so as to identify the exact position where the mutation point found in humans must be introduced into the murine gene. Bioanalysis is essential at this stage.
  • the targeting vector is developed and assembled in the same way as described above. After successful homologous recombination, nothing but the desired mutation point has changed in the coding sequence for the murine gene. Some selection markers may remain in an intron, but they generally have no influence on gene expression. If necessary, they can be eliminated using a second generation of targeting vectors including recombinase recognition elements. Once the construction is assembled, the steps are identical to those of the procedure described above.
  • the procedures described for the CYP2D6- B gene are carried out in a similar manner. Primers and specific samples are used to isolate and clone the mouse GSTM1 homolog. When the structure and the relevant sequence of the mouse GSTM1 gene are established, the most appropriate localization in the gene to allow the gene to be inactivated definitively is identified. The targeting vector is then assembled and introduced into the stem cells. The cells are screened and the transgenic animals obtained as above.
  • Transgenic animals are obtained and identified according to standard procedures already described (e.g. "Manipulating the Mouse Embryo”; Hogan et al CSH Press; Cold Spring Harbor. N.Y.).
  • the brain tissue of transgenic mice and non-transgenic control mice is homogenized on ice in a 0.32 M sucrose solution containing protease inhibitors (Complete TM, Boehrmger-Mannheim, Germany). Cellular debris is removed by centrifugation at 4 ° C for 5 minutes at 1500g. The protein concentration in the supernatant is measured using the BCA protein test (Pierce, USA). For the detection of CYP2D6-B or GSTMl, 25 ⁇ g of protein extract are incubated at 56 ° C. for 20 minutes in Lae mli deposition buffer containing 8 mM urea and 50 mM dithiothreitol.
  • CYP2D6-B and GSTMl For the detection of CYP2D6-B and GSTMl, 25 ⁇ g of protein extract are denatured at 95 ° C for 10 minutes in 30 ⁇ l of the standard deposition buffer Laemmli. The proteins are fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • the filter After transferring the proteins onto a nitrocellose filter (Amersham, France), the filter is heated in PBS for 5 minutes in order to increase the sensitivity, and immediately saturated with 5% (weight / volume) of skimmed milk powder in TBST at 850 mM (Tris-HCl pH 8.1, 150 mM NaCl, 0.05% (vol / vol) Tween 20) for 1 hour and incubated overnight at 4 ° C with the primary antibody in TBST buffer alone.
  • the binding of the antibody is detected with an anti-IgG antibody conjugated to horseradish peroxidase (Amersham, France) followed by a chemiluminescence detection system (Amersham, France) according to the manufacturer's instructions.
  • the monoclonal or polyclonal antibodies are to be used under conditions easy to establish by a person skilled in the art.
  • mice must be deeply anesthetized (Pentobarbital: 60 mg / ml / kg ip, Ketamine: 40 mg / ml / kg ip) and then perfused in transcardiac with physiological saline then paraformaldehyde (4% in PBS).
  • the brains are then removed and postfixed in the same fixing solution for 24 hours at 4 ° C. After fixation, the brains are separated into right and left hemicerveaux and then subjected to the conventional paraffin coating protocol.
  • the left hemicerveaux coated in the paraffin of transgenic and non-transgenic mice, and also blocks of postmortem human brain tissue (frontal cortex) of subjects suffering from Parkinson's disease and of a control subject are cut to 6 ⁇ m thick. (serial sections), via the use of a microtome (LEICA RM 2155, France).
  • the tissue blocks corresponding to the right hemicerveaux of transgenic and non-transgenic mice are cut to a thickness of 25 ⁇ m.
  • the brain sections For each immunohistochemistry experiment, the brain sections must first be dewaxed with xylene and dehydrated in 100% ethanol. The sections are then incubated in hydrogen peroxide (1% in methanol) in order to block endogenous peroxidasic activities, rinsed in ethanol and citrate buffer (10 mM sodium citrate, pH 6) and finally placed in a microwave (650W, Whirlpool) for 2 times 5 minutes in the citrate solution.
  • the sections For the immunostaining experiments of the proteins CYP2D6-B and GSTM1, the sections are subjected to an additional stage of incubation for 3 minutes in 80% formic acid.
  • the dewaxed brain sections are incubated in the Ac solution primary (overnight at 4 ° C). After rinsing, the sections are placed in the presence of the secondary biotinylated Ac (for 2 hours at ambient temperature) then in the presence of the avidin-biotin peroxidase complex according to the manufacturer's instructions (Kit ABC Vectastin, Vector Laboratories, Burlingame, CA). 3-3'-diaminobenzydine is used as a chromogen for the enzyme peroxidase.
  • the anti-Bax Ab (PI 9 antibody, Santa Cruz) is incubated with the synthetic peptide Bax (PI 9 peptide control, Santa Cruz; concentrations of the peptide tested: 0.002 and 0.02 and 0.2 mg / ml) for at least 12 hours before being used according to the immunohistochemistry protocol described previously.
  • the anti-cytochrome C Ab (7H8.2C12, Pharmingen) is incubated according to the same protocol with exogenous purified cytochrome C from horse or rat heart (Sigma) (concentrations of the purified proteins tested: 0.01 and 0.1 mg / ml).

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Abstract

Méthodes de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet. Ladite méthode comprend les étapes de détection de la présence ou de l'absence de la mutation homozygote CYP2D6-B d'une part, et de la délétion homozygote de GSTM1 d'autre part. La présence conjointe de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTM1 indique que le sujet peut être atteint de la maladie de Parkinson ou bien présente un risque accru de développer la maladie de Parkinson.

Description

METHODES DE DETECTION DE LA MALADIE DE PARKINSON
La présente invention se rapporte à des méthodes de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet, dans lesquelles la présence conjointe de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTMl indique que ledit sujet peut être atteint de la maladie de Parkinson ou bien présente un risque accru de développer la maladie de Parkinson. La présente invention concerne également les kits de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson, et les animaux double transgéniques dans le génome desquels est insérée une séquence d'ADN exogène génomique portant la mutation homozygote CYP2D6- B et présentant l'invalidation du gène GSTMl, leur procédé d'obtention et leur utilisation afin de tester l'activité d'agents ou de méthodes destinés à prévenir et/ou traiter la maladie de Parkinson.
La maladie de Parkinson est un trouble neurologique qui apparaît généralement avec l'âge. Les changements neurologiques à l'origine de cette maladie sont variables et encore relativement incompris. Le trouble se développe généralement de façon asymétrique, débute par des tremblements dans une main ou une jambe, et progresse en une perte symétrique des mouvements volontaires. Eventuellement, le patient est frappé d'incapacité du fait de la sévérité des symptômes tels que les tremblements, la bradykinésie (pauvreté des mouvements) et la rigidité musculaire. Dans les états les plus avancés, la maladie est souvent accompagnée de démence.
Jusqu'à présent, le diagnostic des cas aussi bien familiaux que sporadiques de la maladie de Parkinson n'est généralement fait qu'après apparition des symptômes. Des composés anticholinergiques, le propranolol, la primidone et la L-dopa sont alors fréquemment administrés afin de modifier les transmissions neuronales et ainsi supprimer les symptômes de la maladie. Cependant, il n'existe à ce jour aucune thérapie permettant de stopper ou de ralentir la progression sous-jacente de la maladie. Or, une telle maladie progresse souvent rapidement et perturbe de nombreuses fonctions vitales majeures. Le temps constitue donc un facteur crucial dans le choix et l'administration de différentes options de traitements. La difficulté à trouver une thérapie s'explique notamment par le fait que Pétiologie de la maladie de Parkinson reste largement inconnue. Il y a plusieurs dizaines d'années, des facteurs environnementaux ont été tenus pour responsables de la pathogenèse de la maladie. Cependant, l'identification ces dernières années de mutations dans trois gènes différents, Pα-synucléine, la parkine et Phydroxylase ubiquitin carboxy-terminale, a permis de souligner l'importance des facteurs génétiques, du moins pour certains cas de parkinsonisme. Aujourd'hui, on pense que la maladie de Parkinson est certainement causée par des neurotoxines environnementales vis-à-vis desquelles certaines personnes ont une susceptibilité d'origine génétique.
Une partie de cette susceptibilité semble notamment conférée par l'existence de polymorphismes dans le gène CYP2D6 codant pour le cytochrome P450 2D6, responsable de la métabolisation de différents produits et agents environnementaux, parmi lesquels probablement des neurotoxines tel que le MPTP, produit chimique dont l'implication dans la maladie de Parkinson est déjà connue. De nombreuses études ont ainsi rapporté l'existence d'une association entre certaines mutations alléliques dans CYP2D6, en particulier avec l'allèle CYP2D6-B (ou D6*4) qui présente une transition G -> A à la jonction intron 3/exon 4 qui entraîne une déficience métabolique, et la maladie de Parkinson (Armstrong et al., The Lancet, 1992, 339, pp.1017-8 ; Smith et al., The Lancet, 1992, 339, pp. 1375-7 ; Kurth et al., Am. J. o/Med. Genêt, 1993, 48, pp. 166-8 ; Lucotte et al, Am. J. ofMed. Genêt., 1996, 67, pp. 361-5 ; McCann et al., J. ofNeurol ScL, 1997, 153, pp. 50-3). On estime aujourd'hui qu'environ 2 à 3 % des personnes de la population générale portent la mutation homozygote CYP2D6-B. Par ailleurs, les glutathion S-transférases (GSTs), parmi lesquelles GSTMl, sont une famille d'enzymes dimères également impliquées dans des processus de détoxification : elles catalysent la conjugaison entre le glutathion et des produits toxiques tels que les carcinogènes, les polluants et un large spectre de xénobiotiques. Il a également été montré que les personnes atteintes de la maladie de Parkinson avaient plus fréquemment un génotype présentant la délétion homozygote de GSTMl que les personnes non-malades (Stroombergen et al, Hum. & Exper. Toxicoh, 1999, 18, pp. 141-145). Par « délétion homozygote »de GSTMl, on entend au sens de la présente invention que le gène GSTMl possède ses deux allèles mutés de telle sorte qu'elles sont toutes les deux non-fonctionnelles, ce qui résulte en l'absence d'une protéine GSTMl fonctionnelle. L'absence de cette protéine également impliquée dans des processus de détoxification constituerait également un facteur de susceptibilité à la maladie de Parkinson. On estime aujourd'hui qu'environ 50 % des personnes de la population générale présentent la délétion homozygote de GSTMl .
La présente invention repose sur la découverte que les sujets présentant conjointement la mutation homozygote CYP2D6-B et dont le génome est homozygote pour la délétion de GSTMl ont un risque accru de développer la maladie de Parkinson, ce risque étant supérieur à celui de sujets ne présentant que la mutation homozygote CYP2D6-B ou bien n'étant que homozygote pour la délétion de GSTMl, comme rapporté dans les études mentionnées ci-avant. Cette découverte est particulièrement intéressante car elle permet de confirmer et/ou de pronostiquer la sévérité de l'atteinte chez les patients pour lesquels la maladie de parkinson a déjà été diagnostiquée ainsi que l'efficacité probable des traitements envisagés, ou encore de pronostiquer les risques d'apparition de la maladie chez des sujets ne présentant pas de symptômes de la maladie de Parkinson.
La présente invention a ainsi pour premier objet une méthode de diagnostic ou de pronostic la maladie de Parkinson chez un sujet. Ladite méthode comprend les étapes de détection de la présence de la mutation homozygote CYP2D6-B d'une part, et de la délétion homozygote de GSTMl d'autre part. La présence conjointe de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTMl indique que le sujet peut être atteint par la maladie de Parkinson ou bien présente un risque accru de développer la maladie de Parkinson. Des sujets appropriés peuvent être choisis par exemple parmi :
- les personnes qui ne présentent pas les symptômes de la maladie de Parkinson, - les personnes chez lesquelles le risque de développer la maladie de Parkinson a déjà été détecté, mais qui ne présentent pas encore les symptômes de la maladie, et
- les personnes qui ont préalablement été diagnostiqués comme étant atteintes de la maladie de Parkinson pour lesquelles une confirmation du diagnostic est souhaitée.
Les étapes de détection, simultanée ou non, de la présence ou de l'absence de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTMl sont effectuées directement ou indirectement par tout moyen approprié à partir d'échantillons biologiques.
La présente invention concerne donc également une méthode de criblage d'échantillons biologiques prélevés sur des sujets, notamment des sujets ne présentant pas de symptômes de la maladie de Parkinson, pour détecter la présence d'échantillons de sujets fortement susceptibles de développer la maladie de Parkinson, ledit criblage comprenant la recherche, de manière simultanée ou non, dans lesdits échantillons biologiques, de la présence conjointe de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTMl.
Lesdits échantillons contenant les ADN ou les protéines à identifier peuvent être de diverses origines. Il peut s'agir par exemple d'échantillons de sang, de sperme, de cheveux (avec leurs racines) ou de tout autre échantillon contenant des cellules nucléées. De préférence, les échantillons biologiques analysés sont des échantillons de sang. Dans ce cas, l'ADN à identifier est prélevé des leucocytes. Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon biologique » soit des échantillons directement issus du sujet pour lequel on souhaite un diagnostic ou un pronostic sans autre transformation, soit des échantillons ayant subit une ou plusieurs étapes de préparation de façon à n'en conserver qu'une fraction utile pour les étapes de détection, par exemple un extrait cellulaire brut.
La détection des mutations dans CYP2D6 et GSTMl peut être effectuée soit par détection de la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B et de la présence ou de l'absence de GSTMl, soit par détection de la présence ou de l'absence de l'ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B et de l'ADN présentant la délétion homozygote de GSTMl .
Dans le cas de la détection de la protéine CYP2D6-B, on entend détecter au sens de la présente invention la protéine CYP2D6-B seulement à l'exclusion de toute autre forme mutée ou sauvage. Cela correspond donc à un individu possédant une ADN comprenant la mutation homozygote CYP2D6-B. Dans toute la suite, on utilisera les termes de « détection de la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B ».
Les étapes de détection des protéines CYP2D6 et de GSTMl ou des ADN codant pour CYP2D6-B et GSTMl peuvent être effectuées selon des méthodes directes ou indirectes bien connues de l'homme de l'art. En outre, lesdites étapes de détection de la présence ou de l'absence des protéines CYP2D6-B et GSTMl ou des ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B et présentant la délétion homozygote de GSTMl, peuvent également être effectuées simultanément ou non pour chacun des deux gènes.
Si un échantillon biologique présente la protéine mutée CYP2D6-B à l'exclusion de toute autre forme mutée ou sauvage, ou bien contient de l'ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B, cela signifie plus précisément que l'échantillon analysé ne contient que la protéine mutante ou que l'ADN mutant, c'est-à-dire qu'aucune trace de la protéine ou de l'ADN sous forme sauvage ou sous une autre forme mutée n'a été détectée. De même, un échantillon correspondant à un sujet possédant la délétion homozygote de GSTMl est, au sens de la présente invention, un échantillon dans lequel aucune trace de la protéine fonctionnelle GSTMl n'a été détectée.
En ce qui concerne les techniques permettant de détecter ou d'identifier la présence ou l'absence des ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B et présentant la délétion homozygote de GSTMl, il peut s'agir par exemple de combinaisons des techniques de Réaction de Polymérisation en Chaîne (« PCR »), de « Southern Blotting », de Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction (« RFLP »), et/ou de séquençage direct des produits de la PCR. Toutes ces techniques sont maintenant bien connues de l'homme de l'art. D'une manière générale, toutes les techniques d'identification des ADN codant pour CYP2D6-B et GSTMl qui peuvent être employées dans le cadre de la présente invention comprennent une étape préalable de collecte du ou des échantillons biologiques contenant les ADN à identifier et une étape d'extraction de l'ADN génomique selon les techniques standard bien connues de l'homme de l'art, par exemple selon la méthode de Smith et al. (The Lancet, 1992, 339, pp. 1375-7).
Succinctement, Il est possible d'utiliser la technique de PCR qui consiste tout d'abord à synthétiser des oligonucléotides complémentaires de la séquence des régions qui délimitent le segment d'ADN à amplifier (encore appelés « amorces »). Ces oligonucléotides servent d'amorce à la DNA polymérase. Puis, on entreprend les étapes de dénaturation par la chaleur (92-95°C) pour séparer les deux brins d'ADN, d'hybridation avec les deux amorces spécifiques grâce à un abaissement de la température (50-55°C) et d'extension des amorces avec une DNA polymérase à 70- 72°C.
Pour obtenir à la fois une plus grande sensibilité et une meilleure spécificité, il est également possible d'effectuer deux PCR successives en utilisant deux couples d'amorces différents (« nasted PCR ») : un premier couple d'amorces externes qui permet d'obtenir un fragment d'ADN amplifié comme en PCR classique et un second couple d'amorces internes pour amplifier le fragment d'ADN obtenu de la première PCR.
Afin de déterminer l'empreinte génétique de la région souhaitée, les fragments d'ADN obtenus par PCR peuvent également être séparés par électrophorèse selon leur taille et visualisés grâce au BET (bromure d'éthidium) et aux rayons ultraviolets.
Une possibilité particulièrement intéressante dans le cas présent consiste à effectuer une PCR avec un premier « primer » ayant à son extrémité 3' la séquence de nucléotides mutée, et un second « primer » ayant à son extrémité 3' la séquence de nucléotides sauvage. La différence de température de dénaturation dans ces deux cas, et en conséquence d'efficacité d'amplification, permet de distinguer l'ADN mutant de l'ADN sauvage.
Selon une autre alternative, les fragments d'ADN amplifiés sont directement identifiés par une technique de « Dot » qui consiste à déposer un échantillon des fragments d'ADN produits de la PCR sur un filtre de nylon, à effectuer la dénaturation des fragments d'ADN, leur hybridation avec une sonde spécifique radioactive, un lavage pour éliminer l'excès de produit radioactif non-fixé et la réalisation d'un autoradiogramme. La révélation peut également être faite par d'autres moyens grâce à l'emploi de sondes spécifiques comportant un marqueur autre que radioactif, par exemple un colorant ou encore un marqueur fluorescent.
Selon une autre alternative, il est également possible de détecter la présence ou l'absence de mutations des ADN codant pour CYP2D6 et GSTMl par séquençage direct de tout ou partie des fragments d'ADN amplifiés. Un tel procédé consiste à déterminer la séquence nucléotidique au niveau des positions polymorphes des gènes CYP2D6 et GSTMl. Le séquençage peut être effectué par toute méthode connue de l'homme de l'art, par exemple par la méthode de Sanger ou bien par la méthode de Maxam et Gilbert.
Selon une autre alternative, la détection de la présence ou l'absence des ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B et présentant la délétion homozygote de GSTMl peut être effectuée en utilisant la technique de « Southern Blotting » qui consiste à effectuer une électrophorèse des fragments d'ADN obtenus après une attaque par une ou plusieurs enzymes de restriction. Le gel est ensuite dénaturé et un transfert est opéré sur une membrane de nylon. Cette membrane est destinée à être hybridée avec une sonde spécifique. Après lavage pour éliminer l'excès de produit radioactif non fixé, le film est appliqué sur la membrane. Il peut ainsi être décelé une ou plusieurs bandes correspondant aux fragments d'ADN reconnus par la sonde.
Il est également possible d'utiliser la technique de la RFLP associée à la technique de Southern Blotting et/ou de PCR pour détecter la présence ou l'absence des mutations d'intérêt dans CYP2D6 et GSTMl. La RFLP permet de comparer les ADN de différents individus et de rechercher si des mutations ponctuelles faisant apparaître ou disparaître des sites de restriction se sont produites. Deux ADN de séquence identique traitées par des enzymes de restriction donneront des fragments identiques, et les Southern Blot obtenus avec ces fragments seront donc identiques. Au contraire, si un site de restriction a disparu ou bien est apparu à la suite d'une mutation, les fragments n'auront plus des tailles identiques ce qui sera visible sur les autoradiogrammes. Il en est de même si un nouveau site de restriction est apparu à la suite d'une mutation.
Selon la présente invention, il est également possible d'utiliser des méthodes indirectes pour déterminer la présence ou l'absence des ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B et présentant la délétion homozygote de GSTMl. Par exemple, si on détecte CYP2D6-A, c'est que le sujet n'est pas homozygote CYP2D6- B, ou encore, si on détecte CYP2D6-A et CYP2D6-C, c'est que le sujet ne comporte pas la mutation CYP2D6-B pour aucun des deux allèles.
Toutes les techniques décrites ci-avant sont bien connues de l'homme de l'art. Naturellement, toute autre technique connue et également appropriée pour la détection de la présence ou de l'absence de mutations de l'ADN codant pour CYP2D6 et GSTMl peut être employée. On peut à ce titre par exemple citer les techniques de « Ligase Chain Reaction », « Strand Displacement Amplification », « Transcription-based Amplification » etc... De façon avantageuse, lesdites étapes de détection sont effectuée par PCR, RFLP, Southern Blotting et/ou une combinaison de ces techniques, conformément aux méthodes décrites dans la littérature (voir par exemple : Gough et al., Nature, 1990, 347, p.773 ; Kagimoto et al., J. Biol Chem., 1990, 265, p. 17209 ; Wolf et al., The Lancet, 1990, 336, p. 1452 ; Hayashi et al, NucleicAcids Res., 1991, 19, p. 4797 ; Daly et al., Pharmacogenetics, 1991, 1, p. 33 ; Spurr et al., Methods Enzymol, 1991, 206, p. 149 ; Armstrong et al, The Lancet, 1992, 339, p. 1017 ; Kurth et al, Am. J. ofMed. Genêt., 1993, 48, p. 166; Lucotte et al., Am. J. ofMed. Genêt., 1996, 67, p. 361 ; McCann et al., J. Neurol Sel, 1997, 153, p. 50 ; Stroombergen et al., Hum. & Exper. ToxicoL, 1999, 18, p. 141). Selon une variante de l'invention, il est possible de détecter la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B et la présence ou l'absence de la protéine GSTMl dans les échantillons biologiques collectés. Dans ce cas, il est possible d'utiliser d'une part des anticorps qui se lient sélectivement à CYP2D6-B et qui ne présentent essentiellement aucune liaison aux autres protéines isoformes de CYP2D6 dans les mêmes conditions, et d'autre part des anticorps qui se lient sélectivement à GSTMl. Afin de détecter si un sujet est homozygote ou hétérozygote pour CYP2D6-B, il est également possible d'employer plusieurs anticorps spécifiques des différentes mutations de CYP2D6.
De tels anticorps peuvent être obtenus selon les techniques connues de l'homme de l'art. Par exemple, les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon les techniques de Kohler et Mildstein (Nature 1975, 265, pp. 495-7). Pour ce faire, les protéines homozygotes CYP2D6-B et GSTMl peuvent être obtenues à partir d'un sujet homozygote pour CYP2D6-B et GSTMl. Elles sont ensuite purifiées selon la technique décrite par Rail et al. (Methods in EnzymoL, 1986, 128, p. 273) et utilisées comme immunogènes pour la production d'anticorps monoclonaux et polyclonaux. Selon une variante, un fragment seulement des protéines CYP2D6-B et GSTMl peut être utilisé comme immunogène.
Au sens de la présente invention, on entend par « anticorps » tous les types d'immunoglobulines, y compris les IgG, IgM, IgA, IgD et IgE. Les anticorps utilisés peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. Ils peuvent être d'origine naturelle ou bien être des anticorps chimères, ou encore ils peuvent inclure des fragments d'anticorps tels que des fragments Fab.
La réaction immunologique mise en jeu pour la détection de la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B et de la présence ou de l'absence de la protéine GSTMl consiste de manière générale à mettre en contact les anticorps spécifiques et des marqueurs détectables avec l'échantillon biologique. Lorsque le/les anticorps(s) se lie(nt) aux protéines présentes dans l'échantillon, le signal émis par le marqueur est modifié. La réaction immunologique et la détection du signal émis par le marqueur peuvent être effectuées soit de façon homogène dans une même solution, soit de façon hétérogène. Dans ce dernier cas, le/les anticorps sont immobilisés sur un support solide (billes, plateau...) et mis en contact avec une solution de l'échantillon biologique, puis le signal émis soit par le support solide soit par la solution est examiné. Selon la présente invention, les marqueurs émettant un signal peuvent être choisis parmi les marqueurs classiques bien connus de l'homme de l'art, notamment des marqueurs radioactifs, des marqueurs fluorescents ou encore des marqueurs enzymatiques.
Là encore, il est également possible d'utiliser des méthodes indirectes pour déterminer la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B et la présence ou l'absence de la protéine GSTMl. De même, la détection de la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B et la présence ou l'absence de la protéine GSTMl peuvent être effectuées simultanément ou non. Naturellement, toute autre technique connue et également appropriée peut être employée. Il existe notamment de nombreuses variantes des tests immunologiques décrits ci-avant qui peuvent être avantageusement employées.
Toutes ces méthodes de détection sont particulièrement utiles car elles constituent la base permettant de déterminer si un sujet peut être atteint par la maladie de Parkinson ou bien présente un risque accru de développer la maladie de Parkinson. Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne une méthode d'analyse d'échantillons biologiques prélevés sur un sujet qui consiste à : a) déterminer le génotype pour CYP2D6 et GSTMl dudit sujet, et b) convertir les données obtenues en a) afin de pronostiquer le risque dudit sujet de développer la maladie de Parkinson et l'efficacité de traitements thérapeutiques envisageables pour cette maladie.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également les kits de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet.
De tels kits peuvent se présenter sous forme d'un emballage compartimenté de façon à recevoir différents récipients tels que par exemple des ampoules ou des tubes. Chacun de ces récipients comprend les différents éléments nécessaires pour effectuer la détection de la présence ou de l'absence de l'ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B et présentant la délétion homozygote de GSTMl, ou pour effectuer la détection de la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B et la présence ou l'absence de la protéine GSTMl, individuellement ou mélangés. Lesdits éléments permettant d'effectuer la ou les réactions de détection sont choisis parmi ceux décrits ci-avant. Il peut s'agir par exemple : d'amorces hybridant une région définie de CYP2D6-B, d'amorces hybridant une région définie de GSTMl et éventuellement les moyens nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification, de sondes oligonucléotidiques, éventuellement immobilisées sur un support et comprenant un marqueur détectable, et éventuellement les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation, ou encore d'anticorps capables de se lier sélectivement à GSTMl éventuellement immobilisés sur un support, d'anticorps capables de se lier sélectivement à CYP2D6-B ou à d'autres mutations de CYP2D6 éventuellement immobilisés sur un support, et éventuellement les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction immunologique.
Un autre objet de la présente invention est une méthode de traitement de la maladie de Parkinson caractérisée en ce qu'elle comprend :
-une ou plusieurs étapes, simultanées ou non, de détection de la présence conjointe de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTMl chez un sujet, et -l'administration d'un composé, ou d'un mélange de composés connus pour leur activité à l' encontre de la maladie de Parkinson chez un sujet présentant conjointement la mutation homozygote CYP2D6-B et la délétion homozygote de
GSTMl.
La présente demande est en outre relative à l'utilisation d'un composé, ou d'un mélange de composés connus pour leur activité à l'encontre de la maladie de Parkinson pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un sujet atteint par la maladie de Parkinson, chez lequel la présence conjointe de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTMl a été mise en évidence préalablement au traitement.
Lesdits composés connus pour leur activité à l' encontre de la maladie de
Parkinson peuvent être la lévodopa, ou encore des des inhibiteurs sélectifs de la monoamine oxydase MAO-B, enzyme de dégradation de la dopamine dans le cerveau, tels que rasagiline ou selegiline. Ils peuvent aussi être des inhibiteurs de la catéchol-O méthyl-transférase (COMT), éventuellement en association avec la lévodopa. Ils peuvent encore être, outre la lévodopa, précurseur de la dopamine, des agonistes dopaminergiques, tels que les produits suivants : bromocriptine , cabergoline, adrogolide, L-dopa, dopadose, ropinirole, pramipexole, rotigotine, spheramine, ou uridine.
Les composés de l'association peuvent être administrés par voie orale, parentérale, transdermale ou rectale soit simultanément soit séparément soit de façon étalée dans le temps.
Les composés sont formulés sous forme de compositions pharmaceutiques contenant l'association de un ou plusieurs composés tels que définis précédemment avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Comme compositions solides pour administration orale, peuvent être utilisés des comprimés, des pilules, des poudres (capsules de gélatine, cachets) ou des granulés. Dans ces compositions, les principes actifs sont mélangés à un ou plusieurs diluants inertes, tels que amidon, cellulose, saccharose, lactose ou silice, sous courant d'argon. Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les diluants, par exemple un ou plusieurs lubrifiants tels que le stéarate de magnésium ou le talc, un colorant, un enrobage (dragées) ou un vernis.
Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des solutions, des suspensions, des émulsions, des sirops et des élixirs pharmaceutiquement acceptables contenant des diluants inertes tels que l'eau, l'éthanol, le glycérol, les huiles végétales ou l'huile de paraffine. Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des produits mouillants, édulcorants, épaississants, aromatisants ou stabilisants.
Les compositions stériles pour administration parentérale, peuvent être de préférence des solutions aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylèneglycol, un polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, des esters organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle ou d'autres solvants organiques convenables. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en particulier des agents mouillants, isotonisants, émulsifiants, dispersants et stabilisants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple par filtration aseptisante, en incorporant à la composition des agents stérilisants, par irradiation ou par chauffage. Elles peuvent également être préparées sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable.
Les compositions pour administration rectale sont les suppositoires ou les capsules rectales qui contiennent, outre le produit actif, des excipients tels que le beurre de cacao, des glycérides semisynthétiques ou des polyéthylèneglycols. Les compositions pharmaceutiques renfermant l'association telle que définie précédemment contiennent généralement 0.1 à 500 mg de composé.
Les doses dépendent de l'effet recherché, de la durée du traitement et de la voie d'administration utilisée; elles sont généralement de 0,1 à 500 mg par jour par voie orale pour un adulte de copmposé.
D'une façon générale, le médecin déterminera la posologie appropriée en fonction de l'âge, du poids et de tous les autres facteurs propres au sujet à traiter. La présente invention concerne en outre un nouveau modèle animal de la maladie de Parkinson exprimant la protéine CYP2D6-B à l'exclusion de toute autre forme mutée ou sauvage et n'exprimant pas la protéine GSTMl. Plus précisément, la présente invention concerne un nouveau modèle d'animal transgénique dans le génome duquel est inséré au moins une séquence d'ADN exogène portant la mutation homozygote CYP2D6-B de telle sorte que la fonction du gène CYP2D6 est modifiée, et dont le gène GSTMl est inactivé. Encore plus précisément, la présente invention concerne un nouveau modèle d'animal transgénique qui est knock-out (KO) ou knock- in (Kl) pour CYP2D6 et qui est knock-out pour GSTMl
On entend par animal transgénique tout animal non-humain présentant une modification artificielle de son génome. La modification du génome peut résulter d'une altération ou d'une modification de un ou plusieurs gènes par « knock-in » ou par « knock-out » (inactivation/modification de gènes par recombinaison homologue). Cette modification peut être due à l'action d'agents altérants ou mutagènes classiques ou bien effectuée par insertion stable d'une cassette d'expression permettant l'expression d'un gène hybride. En particulier, on peut par exemple opérer selon des méthodes identiques ou analogues à celles décrites dans les demandes WO 01/02552 ou encore WO 01/13176.
La modification du génome peut également résulter d'une insertion de gène(s) ou d'un remplacement de gène(s) dans sa (leur) forme sauvage ou mutée.
Les modifications sont avantageusement effectuées sur des cellules souches reproductrices de telle sorte que l'animal transgénique obtenu est KO ou Kl pour CYP2D6 et KO pour GSTMl.
A l'heure actuelle, la modification du génome en utilisant la technologie « knock-in » et « knock-out » est limitée à la souris comme modèle du fait que seules les cellules souches (dites cellules « ES ») ayant la capacité de coloniser la lignée germinale issue de l'embryon de souris sont disponibles. Lorsque les lignées cellulaires ES seront établies pour d'autres espèces, ces technologies pourront facilement être appliquées par l'homme de l'art à ces autres espèces pour générer des modèles KO et/ou Kl. De plus, les approches basées sur l'utilisation d' oligonucléotides (ADN, ARN ou hybrides) seuls ou liés à des enzymes modifiant l' ADN/ARN, peuvent être utilisées pour introduire une modification mutation définie à un locus prédéterminé dans le génome. Même des irradiations ou des mutagènes chimiques qui induisent des modifications aléatoires dans le génome peuvent être employées s'ils sont combinés avec un jeu efficace de marqueurs biologiques (phénotype) et avec une procédure de clonage positionnel à haut débit.
L'approche la plus directe pour la modification du génome d'animaux de laboratoire (souris, rats, vaches, cochons, moutons...) est cependant l'intégration aléatoire de transgènes par microinjection d'ADN linéarisé dans un ou deux pronucléi d'ovocytes fertilisés à l'étape de cellule unique (de préférence pour éviter la génération d'animaux chimériques bien que l'injection au stade deux cellules ou plus puisse également être mise en œuvre). En règle générale, un transgène est composé de deux parties : les éléments de régulation qui imposent le contrôle spatio-temporel de l'expression de l'ARN codé par l'ADNc, et ledit ADN juxtaposé (ADNc ou fragment genomique). Ces deux éléments (l'élément de régulation et l'ADN codant pour la protéine désirée) peuvent être homologues ou bien hétérologues du génome cible. Les animaux transgéniques concernés sont d'une manière générale choisis parmi les mammifères non-humains. Il peut s'agir par exemple de murins, à savoir les souris, les rats et les cobayes, de lapins, de chats, de chiens, d'ovins, ou encore de bovins. De préférence, il s'agit de murins, de rats ou de lapins obtenus selon les techniques classiques de transgenèse. D'autres objets de la présente invention sont des lignées de cellules souches et lignées de cellules différenciées à partir de ces lignées de cellules souches, dans le génome desquels est insérée au moins une séquence d'ADN exogène genomique portant la mutation homozygote CYP2D6-B et dont le gène GSTMl est inactivé. Les technologies mentionnées ci-avant peuvent être appliquées pour générer des modèles animaux reproduisant les modifications génétiques trouvées chez les patients humains ou chez les individus « à risque » pour le développement de la maladie de Parkinson. Succinctement, l'obtention des animaux transgéniques, des lignées de cellules souches et lignées de cellules différenciées selon l'invention consiste en un procédé mettant en œuvre les étapes suivantes : a) la génération d'animaux transgéniques exprimant la protéine CYP2D6-B humaine à l'exclusion de toute autre forme sauvage ou mutée par insertion par recombinaison homologue d'un ADNc codant pour la protéine CYP2D6-B dans le gène correspondant de l'animal (l'insertion du transgène est ciblée immédiatement après le promoteur du gène de l'animal de façon à imposer le profil d'expression correct au transgène et à empêcher l'expression du gène endogène de l'animal : KO) ou bien par insertion de la mutation spécifique décrite dans la présente invention correspondant au gène isoforme CYP2D6-B humain dans le gène endogène de l'animal (la modification est faite par recombinaison homologue dans les cellules souches : Kl), b) la génération d'animaux transgéniques ayant la fonction de GSTMl inactivée par coupure du gène animal homologue du gène GSTMl humain par recombinaison homologue dans les cellules souches selon la technologie KO
(idéalement, la cassette de coupure est ciblée de façon à remplacer la partie 3' du promoteur et du premier exon codant afin d'empêcher toute possibilité d'obtenir des versions tronquées ou des isoformes d'épissage du gène animal), c) la génération d'animaux double transgéniques en introduisant les modifications décrites ci-avant en a) et en b) dans leur génome.
Les animaux doubles transgéniques ainsi obtenus reproduisent le génotype observé chez les patients atteints par la maladie de Parkinson ou « à risque ». Le contrôle du génotype pour CYP2D6 et GSTMl de l'animal nouveau-né ainsi obtenu peut être effectué en utilisant les techniques déjà décrites ci-avant, notamment en utilisant une réaction d'amplification (PCR) et/ou de Southern.
Selon une variante de la présente invention, lesdits animaux transgéniques peuvent en outre exprimer une autre ou des autres protéine(s) peu ou pas actives et qui a ont été déterminée(s) comme étant impliquée(s) dans la maladie de Parkinson (par exemple la protéine Parkine). De tels animaux transgéniques sont particulièrement intéressants car ils fournissent un modèle avantageux pour la compréhension de la maladie de Parkinson qui reproduit très fidèlement les caractéristiques de la maladie de Parkinson. En comparaison des modèles connus, ce modèle permet notamment la mise en évidence de composés particulièrement adaptés au traitement de la maladie de Parkinson, notamment telle que décrite chez l'homme. Ces composés peuvent être des molécules chimiques, des molécules peptidiques ou protéiques, des anticorps, des molécules chimériques ainsi que des ADNs antisens ou des ribozymes.
Les composés ainsi mis en évidence peuvent être utilisés comme médicament, tels quels ou en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable afin d'obtenir une composition pharmaceutique. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les injections pouvant être réalisées par voie stéréotaxique, topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
La mise en évidence des composés décrits précédemment repose sur la mise en contact, notamment par une administration telle que par exemple une injection, du modèle animal de l'invention avec un composé ou un mélange de composés supposé(s) avoir une action et de mesurer ensuite le ou les effet(s) des composés notamment au niveau cérébral du modèle sur différents changements biochimiques et/ou histologiques.
Outre le fait de pouvoir tester in vivo des composés thérapeutiques permettant de prévenir, d'atténuer ou de guérir la maladie de Parkinson, ces animaux transgéniques permettent également de disposer d'un modèle animal de la maladie de Parkinson utile pour cribler des facteurs environnementaux qui induisent ou accélèrent la pathogenèse, ou encore pour étudier le comportement lors du développement de la maladie et étudier les divers mécanismes biologiques qui sont impliqués, par exemple dans le but de l'étude de nouveaux médicaments ou la détermination des quantités efficaces de médicaments et de la toxicité. Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un animal transgénique, de lignées de cellules souches ou de lignées de cellules différenciées tels que définis ci-avant pour tester l'activité de composés ou de méthodes destinées à prévenir et/ou traiter la maladie de Parkinson. Un autre objet de l'invention concerne une cellule extraite des animaux transgéniques tels que décrits précédemment ainsi que son utilisation pour la mise en évidence de composés destinés au traitement de la maladie de Parkinson.
La mise en évidence de composés décrits précédemment repose sur la mise en contact de cellules extraites du modèle animal de l'invention avec un composé ou un mélange de composés supposé(s) avoir une action et de mesurer ensuite le ou les effets des composés au niveau des cellules entières, dans des homogénats de cellules ou sur une fraction sub-cellulaire, sur différents paramètres tels que la mort cellulaire par exemple.
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES
Exemple 1 : Etude du génotype pour CYP2D6 et GSTMl dans un échantillon de 103 patients
103 patients (54 hommes et 49 femmes) sans liens de parentés entre eux et tous atteints de la maladie de Parkinson ont été recrutés dans des hôpitaux et cliniques de la région Champagne- Ardenne en France.
La maladie de Parkinson avait été cliniquement diagnostiquée pour tous ces patients selon les critères acceptés en la matière, à savoir la présence d'au moins 2 des caractéristiques principales de la maladie de Parkinson : tremblements, bradykinésie
(pauvreté des mouvements), rigidité musculaire et détérioration des réflexes. Tous les patients réagissaient positivement à la L-dopa. La moyenne d'âge des patients au début de la maladie était de 65,7 ans (écart : 25-88 ans).
10 ml de sang ont été obtenus de chaque patient, après consentement éclairé.
L'ADN genomique a alors été isolé des leucocytes périphériques, en utilisant une procédure standard de digestion à la protéinase K et d'extraction phénol-chloroforme.
1. Méthode moléculaire
Une combinaison de Southern Blotting, de PCR et de RFLP des produits de la PCR a été employée pour l'analyse du génotype de CYP2D6 qui compte 5 mutations alléliques différentes entraînant une déficience métabolique :
- la mutation CYP2D6-D (D6*5) a été détectée après restriction par l'enzyme Xbal par hybridation Southern Blotting avec une sonde d'ADNc humain CYP2D6 (Gaedigk et al, Am. J. Hum. Genêt., 1991, 48, pp. 943-950),
la mutation CYP2D6-B (D6*4) a été détectée par simple PCR et RFLP du produit de la PCR avec l'enzyme v l (Gough et al., Nature, 1990, 347, pp. 773-776),
la mutation CYP2D6-T (D6*6) a été détectée par simple PCR et RFLP du produit de la PCR avec l'enzyme Bsrl (Saxena et al., Hum. Mol. Genêt., 1994, 3, pp. 923-926),
- Les mutations CYP2D6-A (D6*3) et CYP2D6-C (D6*9) ont été détectées à l'aide de primers originaux spécifiques de séquence SEQ ID N°l [5'- GATGAGCTGCTAACTGAGCCC-3' et SEQ ID N°2 5'- GCAAGGTCCTACGCTTCCAA-3' pour CYP2D6-A (D6*3) et SEQ ID N°3 5'-CCGTTCTGTCCCGAGTAT-3' et SEQ ID N°4 5'- GGCTATCACCAGGTGCTG-3' pour CYP2D6-C (D6*9)] et par RFLP avec l'enzyme Mspl. La délétion du gène GSTMl a été déterminée par PCR de l'ADN genomique en utilisant la méthode décrite par Brokmôller et al. (Cancer Res., 1994, 54, pp. 4103- 4111).
2. Génotype pour GSTMl et CYP2D6
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 1 ci-dessous. Ce tableau résume le génotype pour CYP2D6 et GSTMl chez les 103 patients étudiés. « wt » signifie « wild type allele » (allèle sauvage) et les chiffres 3, 4, 5, 6 et 9 correspondent respectivement aux mutations CYP2D6-A, CYP2D6-B, CYP2D6-D, CYP2D6-T et CYP2D6-C. En outre le symbole « (-) » signifie que le gène GSTMl présente une délétion homozygote, et le symbole « (+) » signifie que le gène GSTMl ne présente pas une délétion homozygote.
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Tableau 1 : Génotypes pour CYP2D6 et GSTMl chez les patients atteints de la maladie de Parkinson
53 des patients atteints de la maladie de Parkinson de la série présentent au moins une mutation allélique de CYP2D6 (soit 51,5 %), les autres patients ayant un génotype sauvage (« wt/wt »). Le génotype mutant le plus fréquent est wt/4 (CYP2D6-B) dans 28,2 % des cas, 7 patients étant homozygotes 4/4. Les mutants hétérozygotes autres que wt/4 (c'est-à-dire wt/3 ou 9 ou 5 ou 6) concernent un total de 14,6 % des patients de la série, les patients hétérozygotes ayant les 2 allèles du gène CYP2D6 mutées (c'est-à-dire 4/9 et 4/5) représentant 2 % des cas.
L'allèle le plus fréquent de la série est CYP2D6-B (D6*4) dans 21,8 % des cas, les autres mutations ne représentant que moins de 5 % des cas.
Si on désigne parp la fréquence de l'allèle sauvage (« wt ») et par q celle de l'ensemble des allèles mutants (homozygotes 4/4, hétérozygotes 4/9 et 4/5), les fréquences génotypiques au polymorphisme CYP2D6 sont en équilibre de Hardy- Weinberg complet (X2 = 0) dans la série. L'équilibre de Hardy- Weinberg est également respecté pour l'allèle CYP2D6-B seul dans la série (X2 = 0,98) ainsi que pour tous les autres allèles mutants de CYP2D6 considérés séparément. Il n'y a donc pas de biais sélectif ou d'échantillonnage dans cette série de patients.
51 patients (49,5 %) des patients présentent une délétion homozygote du gène GSTMl. La technique de PCR utilisée dans la présente étude ne permet pas de différencier les patients ne présentant pas de délétion de GSTMl des patients présentant seulement une délétion hétérozygote de GSTMl.
Si on désigne par/» la fréquence allélique (-) dans la série de patients étudiée et par q la fréquence d'allèles non-délétés, l'application de l'équilibre de Hardy- Weinberg donne j?2 = 0,495 (p = 0,704), q (= \-p) = 0,296, 2pq = 0,417 et q2 = 0,088.
La fréquence allélique p est donc de 70%, et la fréquence des hétérozygotes attendus est de 42%.
3. Interaction entre les allèles GSTMl et CYP2D6
Les sujets présentant une déficience métabolique de CYP2D6 (appelés sujets « PM » pour « Poor Metabolizer ») sont définis comme étant les sujets ayant les deux allèles mutés (c'est-à-dire à la fois les mutants homozygotes et également les mutants hétérozygotes composites). Dans la série des 103 patients atteints de la maladie de Parkinson, 9 patients sont PM (7 homozygotes 4/4, un hétérozygote composite 4/5 et un 4/9).
CYP2D6 et GSTMl ne sont pas génétiquement liés, du fait de leur localisation sur des chromosomes différents (le chromosome 22 et le chromosome 1 respectivement). Il n'est possible d'étudier leur interaction statistique que par une étude des cas par rapport au hasard, puisque cette interaction chez les témoins n'a pas été étudiée. Le tableau 2 résume le rapport de risque (RR) entre les patients présentant une délétion homozygote de GSTMl et qui sont PM pour CYP2D6 :
Figure imgf000024_0001
Tableau 2 : Effets polymorphiques combinés des génotypes GSTMl et CYP2D6 chez les patients atteints de la maladie de Parkinson et leur rapport de risque
Les résultats obtenus sont les suivants :
Le rapport de risque des patients d'être 0/1 [PM/(-)] est : RR0\ = 8/51, le rapport de risque des patients d'être 0/0 [non-PM (-)] est : RRoo = 43/51 et le rapport de risque des patients d'être 1/1 [PM/(+)] est : RRn = 1/51,
L'écart par rapport à la simple interaction multiplicative entre les deux gènes a été calculé de la façon suivante : RRU/(RRQI*RRIO) = 9,50 dans le cas présent.
Cette valeur est supérieure à 1, ce qui indique qu'il existe un effet synergique entre la délétion homozygote de GSTMl et les sujets déficients métaboliquement pour CYP2D6 (le test exact de Fisher donne p ≈ 0,016), et l'interaction est statistiquement significative au seuil de 5%.
Le même calcul a été réalisé pour étudier l'éventuelle interaction entre la délétion homozygote de GSTMl et le seul allèle D6*4(B) (allèle mutant de CYP2D6 le plus fréquent). Le rapport RR entre les patients présentant la délétion homozygote de GSTMl et présentant au moins un allèle D6*4 donne : RR = 2,18 et le test de Fisher donne p = 0,069 (à la limite du significatif au seuil de 5%). Exemple 2 : procédé d'obtention d'une souris transgénique
1. Génération d'une souris transgénique exprimant la protéine humaine CYP2D6-B
La mutagenèse de CYP2D6-B humaine est faite via l'utilisation d'un système de mutagenèse in vitro comme le Sculptor™ (Amersham, France). La région codante de CYP2D6-B, incluant un motif consensus Kozak, est sous-clonée dans un vecteur de clonage du type Bluescript (Stratagène) et les mutations sont introduites selon le protocole fourni par le fabricant via l'utilisation d' oligonucléotides contenant la mutation désirée. Les séquences mutées sont à vérifier par analyse de séquence.
2. Génération et identification des souris transgéniques CYP2D6-B
Pour la construction du transgène, l'ADNc codant pour la CYP2D6-B mutée humaine est sous-clonée dans le polylinker d'un vecteur d'expression transgénique ubiquitaire comme le HMG (Czech et al., 1997) ou spécifique de certains tissus/types cellulaires comme le THYI (Lϋthi et al, J. Neuroscience, 17, pp. 4688-99), NSE, PDGF, ou encore prion. Un kit de préparation de plasmide (Qiagen) est utilisé pour préparer de l'ADN superenroulé. Pour la microinjection, les séquences du vecteur sont à éliminer par digestion avec une enzyme de restriction définie, laissant intacte la totalité du transgène et le séparant des séquences inutiles du vecteur de clonage. Ensuite, le fragment contenant la cassette d'expression est purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose.
Les aliquotes destinés à la microinjection sont dialyses contre un tampon TE (10 mM Tris pH 7,4 ; 0,1 mM EDTA) sur un filtre flottant (Millipore ; type de membrane : VS ; 0,025 μm) puis filtrés (Spin-X ; Costar ; membrane polyacétate ; 0,22 μm). L'ADN est dilué à la concentration finale de 1-2 ng/μl pour la microinjection. Le fragment purifié est injecté dans un des deux pronucléi des ovocytes fertilisés de souris. Les embryons survivants sont immédiatement transplantés dans l'oviducte de mères adoptives (« pseudopregnant »). La présence du transgène chez les nouveau-nés est déterminée soit par PCR soit par une analyse en Southern, en utilisant des sondes/séquences spécifiques. Par l'ensemble de ces analyses, tout réarrangement majeur ou délétions du transgène dans les fondateurs et leur descendance peuvent être exclus.
3. Génération d'animaux transgéniques comportant la protéine humaine CYP2D6-B dans leur génome
On utilise la technologie de recombinaison homologue dans les cellules souches pour introduire le gène CYP2D6-B à la position prédéfinie désirée dans le gène de la souris. Les amorces et échantillons décrits dans la présente invention peuvent être facilement utilisés pour cribler des librairies génomiques isogéniques de souris (librairies lambda, BAC, YAC ...) afin d'isoler et de cloner le gène correspondant de la souris. Ledit gène de la souris est caractérisé pour son organisation genomique et sa séquence en utilisant les techniques standard connues de l'homme de l'art (cartographie des sites de restriction, séquençage, outils bioanalytiques) afin de définir la place exacte où l'ADNc humain doit être inséré pour obtenir le profil d'expression de l'ADNc humain désiré tout en interrompant définitivement l'expression du gène murin. Une fois la position exacte identifiée, on construit un vecteur de ciblage standard pour les cellules souches (c'est-à-dire un vecteur ayant des marqueurs pour la sélection des événements désirés, lesdits marqueurs étant tous bien connus de l'homme de l'art spécialiste du domaine). Rapidement, une cassette de sélection (gène de résistance à un antibiotique) est mise en limite des extrémités 3' et 5' des fragments d'ADN genomique de la souris (2- 6 kb) identiques aux extensions 3' et 5' de la séquence du gène murin CYP2D6-B situé immédiatement après le site d'insertion sélectionné.
Sur la base de la connaissance du gène de la souris, un vecteur de contrôle positif pour le criblage des cellules souches recombinantes est généré (le vecteur reproduit le locus du gène murin une fois l'intégration réussie) afin d'optimiser et valider la procédure de criblage à haut débit.
Conformément aux procédures standards, l'ADN est purifié pour les essais de ciblage. Le vecteur de ciblage est introduit dans les cellules souches en utilisant des techniques d'électroporation standardisées, après quoi les clones de cellules souches sont soumis à une procédure de criblage séquentiel (antibiotiques) de façon à favoriser les clones de cellules souches portant la recombinaison désirée. En général, le criblage prend environ 2 semaines. Les clones des cellules souches résistants sont criblés par PCR et/ou Southern.
Les clones des cellules souches ayant la recombinaison désirée sans autre modification détectable dans leur génome sont développés de façon à obtenir suffisamment de cellules. Puis, lesdites cellules sont injectées dans des embryons de 3 jours et demi obtenus d'une femelle ayant ovulé naturellement. Les blastocytes survivants (comportant les cellules souches) sont implantés dans une femelle receveuse qui permettra le développement des blastocytes à leur terme et donnera naissance à des souriceaux nouveau-nés composés de cellules provenant des blastocytes hôtes et des clones de cellules souches. Ce type d'animal est appelé « animal chimère ».
Ces chimères (de préférence des mâles puisque la plupart des lignées de cellules souches sont obtenues de souris mâles) sont « mariées » avec des souris de type sauvage de façon à obtenir des animaux hétérozygotes pour la modification. L'élevage d'animaux hétérozygotes entre eux permet de générer des animaux homozygotes.
4. Génération d'animaux transgéniques comportant la mutation de la protéine humaine CYP2P6-B dans leur gène correspondant
De la même façon que décrit précédemment, le gène murin est isolé et caractérisé. Pour ce type de modification , il est essentiel de comparer le gène humain et le gène murin de façon à identifier la position exacte où le point de mutation trouvé chez l'homme doit être introduit dans le gène murin. Une bioanalyse est essentielle à cette étape. A la fin, le vecteur de ciblage est élaboré et assemblé de la même façon que décrit ci-avant. Après recombinaison homologue réussie, rien d'autre que le point de mutation désiré n'a changé dans la séquence codante du gène murin. Certains marqueurs de sélection peuvent rester dans un intron, mais ils n'ont en général aucune influence sur l'expression du gène. Si nécessaire, ils peuvent être éliminés en utilisant une seconde génération de vecteurs de ciblage incluant des éléments de reconnaissance recombinase. Une fois la construction assemblée, les étapes sont identiques à celles de la procédure décrite précédemment.
5. Génération d'animaux transgéniques dont le gène GSTMl est inactivé
On procède de façon analogue aux procédures décrite pour le gène CYP2D6- B. Des amorces et échantillons spécifiques sot utilisés pour isoler et cloner l'homologue GSTMl de la souris. Lorsque la structure et la séquence pertinente du gène GSTMl de la souris sont établies, la localisation la plus appropriée dans le gène pour permettre d' inactiver définitivement le gène est identifiée. Le vecteur de ciblage est alors assemblé et introduit dans les cellules souches. Les cellules sont criblées et les animaux transgéniques obtenus comme précédemment.
6. Génération des animaux double transgéniques
Les animaux transgéniques sont obtenus et identifiés selon des procédures standard déjà décrites (e.g. « Manipulating the Mouse Embryo » ; Hogan et al CSH Press ; Cold Spring Harbor. N.Y.).
7. Analyse par Western blot
Le tissu cérébral de souris transgéniques et de souris contrôles non transgéniques (littermate) est homogénisé sur de la glace dans une solution de sucrose 0,32 M contenant des inhibiteurs de protease (Complète™, Boehrmger-Mannheim, Allemagne). Les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 4°C pendant 5 minutes à 1500g. La concentration en protéines dans le surnageant est mesurée à l'aide du test de protéine BCA (Pierce, USA). Pour la détection de CYP2D6-B ou GSTMl, 25 μg d'extrait protéique sont incubés à 56°C pendant 20 minutes dans du tampon de dépôt Lae mli contenant de l'urée à 8 mM et du dithiothreitol à 50 mM. Pour la détection de CYP2D6-B et de GSTMl, 25 μg d'extrait protéique sont dénaturés à 95°C pendant 10 minutes dans 30 μl du tampon standard de dépôt Laemmli. Les protéines sont fractionnées par électrophorèse sur gel polyacrylamide (SDS-PAGE). Après transfert des protéines sur filtre de nitrocellose (Amersham, France), le filtre est chauffé dans du PBS pendant 5 minutes afin d'augmenter la sensibilité, et immédiatement saturé avec 5 % (poids/volume) de lait écrémé en poudre dans du TBST à 850 mM (Tris-HCl pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,05 % (vol/vol) Tween 20) pendant 1 heure et incubé la nuit à 4°C avec l'anticorps primaire en tampon TBST seul. La liaison de l'anticorps est détectée avec un anticorps anti-IgG conjugué à la peroxidase de Raifort (Amersham, France) suivi d'un système de détection par chemiluminescence (Amersham, France) selon les instructions du fabricant. Pour la détection de CYP2D6-B ou GSTMl, les anticorps monoclonaux ou polyclonaux sont à utiliser dans des conditions faciles à établir par l'homme de l'art.
8. Manipulation des animaux
Les animaux doivent être hébergés dans des conditions de température et d'humidité contrôlées et soumis à un cycle de 12 heures de jour/ 12 heures de nuit (lumière 7 :00 EST). Les animaux ont libre accès à l'alimentation et à l'eau. Les expériences menées sur ces animaux sont à réaliser avec l'accord du Comité d'Ethique d'Aventis Pharma sur le soin et l'utilisation des animaux, en conformité avec les standards du « Guide for the care and use of laboratory animais » (National Research Council ILAR) et dans le respect des règlements français et de la directive CEE.
9. Neurohistopathologie
9.1. Préparation du tissu cérébral
Les souris doivent être profondément anesthésiées (Pentobarbital: 60 mg/ml/kg i.p., Kétamine: 40 mg/ml/kg i.p.) puis perfusées en transcardiaque avec du sérum physiologique puis du paraformaldéhyde (4% dans du PBS). Les cerveaux sont ensuite prélevés puis postfixés dans la même solution de fixation 24 heures à 4°C. Après la fixation, les cerveaux sont séparés en hémicerveaux droit et gauche puis soumis au protocole classique d'enrobage dans la paraffine. Les hémicerveaux gauches enrobés dans la paraffine des souris transgéniques et non transgéniques, et également des blocs de tissu de cerveau humain postmortem (cortex frontal) de sujets atteints par la maladie de Parkinson et d'un sujet contrôle sont coupés à 6 μm d'épaisseur (coupes sériées), via l'utilisation d'un microtome (LEICA RM 2155, France). Les blocs de tissu correspondants aux hémicerveaux droits des souris transgéniques et non transgéniques sont coupés à une épaisseur de 25 μm.
Pour chaque expérience d'immunohistochimie, les coupes de cerveaux doivent d'abord être déparaffinées avec du xylène et déshydratées dans de l'éthanol 100 %. Les coupes sont ensuite incubées dans de l'eau oxygénée (1% dans du méthanol) afin de bloquer les activités peroxidasiques endogènes, rincées dans de l'éthanol et du tampon citrate (citrate de sodium à 10 mM, pH 6) et finalement placées dans un micro-ondes (650W, Whirlpool) pendant 2 fois 5 minutes dans la solution de citrate. Pour les expériences d'immunomarquage des protéines CYP2D6-B et GSTMl, les coupes sont soumises à une étape supplémentaire d'incubation de 3 minutes dans l'acide formique à 80%.
9.2. Marquage immuno-enzymatique
Après une incubation de 30 minutes dans du tampon de blocage (sérum normal de chèvre (Chemicon) à 10% dans du PBS contenant 0,1% de triton (Sigma)), les coupes de cerveaux déparaffmées sont incubées dans la solution d'Ac primaire (toute la nuit à 4°C). Après rinçages, les coupes sont mises en présence de l'Ac secondaire biotinylé (pendant 2 heures à température ambiante) puis en présence du complexe avidin-biotin peroxidase selon les instructions du fabricant (Kit ABC Vectastin, Laboratoires Vector, Burlingame, CA). La 3-3'-diaminobenzydine est utilisée comme chromogène pour l'enzyme peroxidase.
Pour les expériences de préabsorption, l'Ac anti-Bax (anticorps PI 9, Santa Cruz) est incubé avec le peptide synthétique Bax (Contrôle peptide PI 9, Santa Cruz ; concentrations du peptide testées: 0,002 et 0,02 et 0,2 mg/ml) pendant au moins 12 heures avant d'être utilisé selon le protocole d'immunohistochimie décrit précédemment. L'Ac anti-cytochrome C (7H8.2C12, Pharmingen) est incubé selon le même protocole avec du cytochrome C purifié exogène de coeur de cheval ou de rat (Sigma) (concentrations des protéines purifiées testées: 0,01 et 0,1 mg/ml).

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet caractérisée en ce qu'elle comprend une ou plusieurs étapes, simultanées ou non, de détection de la présence conjointe de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTMl .
2. Méthode de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdites étapes de détection sont effectuées directement ou indirectement à partir d'échantillons biologiques, et simultanément ou non pour chacun des deux gènes CYP2D6-B et GSTMl.
3. Méthode de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet selon la revendication 2, caractérisée en ce que lesdits échantillons biologiques sont des échantillons contenant des cellules nucléées.
4. Méthode de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet selon les revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que lesdits échantillons biologiques sont des échantillons de sang, de sperme ou de cheveux.
5. Méthode de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les étapes de détection sont des étapes de détection de la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B à l'exclusion de toute autre forme mutée ou sauvage, et de la présence ou de l'absence de la protéine GSTMl, ou bien des étapes de détection de la présence ou de l'absence de l'ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B et de l'ADN présentant la délétion homozygote de GSTMl.
6. Méthode de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites étapes de détection de la présence ou de l'absence des ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B et présentant la délétion homozygote de GSTMl sont effectuées par combinaison des techniques de Réaction de Polymérisation en Chaîne (« PCR »), de Southern Blotting, de Polymorphisme de Longueur des Fragments de Restriction (« RFLP »), et/ou de séquençage direct.
7. Méthode de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson chez un sujet selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites étapes de détection de la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B à l'exclusion de toute autre forme mutée ou sauvage, et de la présence ou de l'absence de la protéine GSTMl sont effectuées par des réactions immunologiques mettant en œuvre des anticorps spécifiques.
8. Méthode d'analyse d'échantillons biologiques prélevés sur un sujet caractérisée en ce que : a) on détermine le génotype pour CYP2D6 et GSTMl, b) on convertit les données obtenues en a) afin de pronostiquer le risque dudit sujet de développer la maladie de Parkinson et l'efficacité de traitements thérapeutiques envisageables pour cette maladie.
9. Kit de diagnostic ou de pronostic de la maladie de Parkinson caractérisé en ce qu'il comprend les différents éléments nécessaires pour effectuer la détection de la présence ou de l'absence des ADN portant la mutation homozygote CYP2D6-B et présentant la délétion homozygote de GSTMl, ou pour effectuer la détection de la seule présence ou non de la protéine CYP2D6-B à l'exclusion de toute autre forme mutée ou sauvage, et de la présence ou de l'absence de la protéine GSTMl, individuellement ou mélangés.
10. Animaux transgéniques, lignées de cellules souches et lignées de cellules différenciées à partir de ces lignées de cellules souches, dans le génome desquels est insérée au moins une séquence d'ADN exogène genomique portant la mutation homozygote CYP2D6-B et dont le gène GSTMl est inactivé.
11. Animaux transgéniques, lignées de cellules souches et lignées de cellules différenciées à partir de ces lignées de cellules souches, selon la revendication 10 qui sont knock-out ou knock-in pour le gène CYP2D6 et knock-out pour le gène GSTMl .
12. Animaux transgéniques selon l'une des revendications précédentes caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les mammifères non-humains.
13. Procédé d'obtention d'animaux transgéniques, de lignées de cellules souches et de lignées de cellules différenciées à partir de ces lignées de cellules souches, selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend a) la génération d'animaux transgéniques, de lignées de cellules souches et de lignées de cellules différenciées à partir de ces lignées de cellules souches, exprimant la protéine CYP2D6-B humaine à l'exclusion de toute autre forme sauvage ou mutée, b) la génération d'animaux transgéniques, de lignées de cellules souches et lignées de cellules différenciées à partir de ces lignées de cellules souches, ayant la fonction GSTMl inactivée, c) la génération d'animaux double transgéniques, de lignées de cellules souches et de lignées de cellules différenciées à partir de ces lignées de cellules souches, comportant dans leur génome les deux modifications décrites en a) et en b).
14. Utilisation d'animaux transgéniques, de lignées de cellules souches et de lignées de cellules différenciées à partir de ces lignées de cellules souches, selon l'une des revendications 10 à 12 pour tester l'activité d'agents ou de méthodes destinés à prévenir et/ou traiter la maladie de Parkinson.
15. Cellule extraite d'animaux transgéniques tel que décrit dans l'une des revendications 10 à 12.
16. Utilisation d'une cellule telle que décrite dans la revendication 15 pour la mise en évidence de composés destinés au traitement de la maladie de Parkinson.
17. Méthode de traitement de la maladie de Parkinson caractérisée en ce qu'elle comprend : -une ou plusieurs étapes, simultanées ou non, de détection de la présence conjointe de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTMl chez un sujet, et -l'administration d'un composé, ou d'un mélange de composés connus pour leur activité à l'encontre de la maladie de Parkinson chez un sujet présentant conjointement la mutation homozygote CYP2D6-B et la délétion homozygote de GSTMl.
18. Utilisation d'un composé, ou d'un mélange de composés connus pour leur activité à l'encontre de la maladie de Parkinson pour la fabrication d'un médicament pour le traitement d'un sujet atteint par la maladie de Parkinson, chez lequel la présence conjointe de la mutation homozygote CYP2D6-B et de la délétion homozygote de GSTMl a été mise en évidence préalablement au traitement.
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