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WO2003012025A2 - Bioreaktor - Google Patents

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WO2003012025A2
WO2003012025A2 PCT/DE2001/002902 DE0102902W WO03012025A2 WO 2003012025 A2 WO2003012025 A2 WO 2003012025A2 DE 0102902 W DE0102902 W DE 0102902W WO 03012025 A2 WO03012025 A2 WO 03012025A2
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WO
WIPO (PCT)
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gas
liquid
culture vessel
supply
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE2001/002902
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English (en)
French (fr)
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WO2003012025A3 (de
Inventor
Ursula Erhardt
Christoph Erhardt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to JP2003517203A priority Critical patent/JP5149479B2/ja
Priority to US10/485,603 priority patent/US20050118702A1/en
Priority to EP01964868A priority patent/EP1412472A2/de
Priority to PCT/DE2001/002902 priority patent/WO2003012025A2/de
Priority to AU2001285693A priority patent/AU2001285693A1/en
Publication of WO2003012025A2 publication Critical patent/WO2003012025A2/de
Publication of WO2003012025A3 publication Critical patent/WO2003012025A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US11/935,390 priority patent/US20100093073A1/en
Priority to US11/935,387 priority patent/US20100035330A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/26—Conditioning fluids entering or exiting the reaction vessel

Definitions

  • the invention relates to a method and a device which enables a quantitative generation of gas / gas, gas / liquid or liquid / liquid mixtures by a defined supply of the component (s) to be dosed to a carrier medium and thus an exact, quantitative dosing of a single component or a mixture to culture vessels for biological or (bio) chemical reactions.
  • a quantitative gas metering takes place at a constant admission pressure via mechanical flow meters, with needle valves be regulated to the desired gas flow.
  • electronic mass flow controllers that automatically regulate the gas flow via a control unit and electrical control panels.
  • the gas flow regulated in this way can be in the order of magnitude between ml gas / h and m 3 gas / h.
  • a) Pumps Pumps of any type are used as standard for the quantitative dosing of liquids. These take an aliquot from a storage vessel in accordance with the specification of a higher-level controller and pump it through a feed line to the reaction vessel. The transporting force here is the pump power.
  • metering pumps for acid, alkali, antifoam and one or two substrate solutions are common, which simply pump the liquid into the reaction liquid (Braun Biotech International GmbH, bioreactors series BIOSTA A, B, MD, Q, D, U). In no case is the liquid contacted with a gas stream which leads to aerosol formation and thus homogeneous mixing and more effective use of the gas.
  • liquid supply vessels are used which are under overpressure in relation to the culture vessel and which are connected to it by a feed line with an integrated cycle valve. If a liquid is now to be metered, a controller opens the clock valve for a defined time, so that liquid is pressed to the culture vessel by the excess pressure.
  • the parameters can be calibrated quantitatively using the parameters opening time, cross-section of the supply line, excess pressure and viscosity of the liquid (Braun Biotech International GmbH, bioreactors series, customer-specific production systems).
  • Venturi nozzles are known as such from non-bioreactor areas. Due to their fluidic shape, Venturi nozzles create a negative pressure at the side inlet, through which another medium 2 (gas or liquid) can be drawn in towards the flowing medium 1 (gas or liquid). The two media are mixed homogeneously in the outlet area of the nozzle. If the cross sections of the nozzle, the viscosity of the media and the pre-pressure in front of the nozzle are known, one can achieve quantitative mixing. Medium 1 can continue to function as a transport medium after the nozzle due to its upper pressure. Venturi nozzles are used for a variety of applications for degassing (water jet pump), in flow meters (delta pressure) or mixing different media, eg diluting concentrates with a second medium.
  • Venturi nozzles can be used for quantitative sampling of a medium (Fox Valve Development Corporation, Haitton Buisness Park, Dover, New Jersey 07801 USA, lntemetfoxvalve.com). Although a large number of applications for dosing and mixing in daily use are known with the use of venting nozzles (e.g. whirl pool), even though they have no moving wear parts and thus represent an ideal dosing device, the use of these nozzles is biological and (Bio-) chemical culture vessels for dosing gases or liquids by means of a transport medium have not yet been described.
  • no dosing system according to the present invention for biological or (bio-) chemical culture vessels which can combine a transport medium with several dosing media (gas or liquid), enables quantitative dosing, and possibly also has nebulizer nozzles or mixing nozzles at the outlet, to ensure better mixing with the reaction liquid or more effective use of the metered liquid.
  • the object of the present invention is therefore to provide an effective, economical fluid metering method suitable for miniaturization, and an apparatus therefor.
  • the problem is solved by a method and a device for producing a carrier fluid which can simultaneously be used for the gassing of the culture vessel.
  • the carrier fluid can be mixed quantitatively and defined the fluids to be metered. Without the use of pumps and other complex mechanical parts, defined and controlled conditions can thus be created in the culture vessel in the reaction fluid and in the atmosphere of the vessel, the properties of the metered fluids being used optimally at the same time.
  • the invention is particularly suitable for the parallel operation of several culture vessels.
  • the present invention can be used in all areas in which biological or biochemical reactions are carried out in culture vessels, especially in the field of biotechnology, food technology and environmental protection.
  • the object is achieved with respect to the method in that the fluid or fluids to be dosed are admixed to one or more carrier and transport fluids (carrier fluids) in a defined concentration and this carrier fluid or these carrier fluids to the culture vessel in a defined amount and / or time units stolen are fed into the reaction medium or into the headspace.
  • carrier and transport fluids carrier fluids
  • the object is achieved by devices for admixing one or more fluids to be metered into one or more carrier fluids and feeding them into one or more culture vessels, as described in the following examples and the patent claims.
  • the gas supply module of the device consists of the following essential components (drawing 1):
  • the compressed gas inlet with an inlet overpressure in relation to the culture vessel of 0.1 to 10 bar, preferably 0.2 to 1 bar, in particular 0.5 bar, is via a pressure-resistant hose, inside diameter 0.5 to 8 mm, preferably 0.5 to 2 mm , in particular 1 mm, connected to the three-way valve DV1 (see drawing 1).
  • the valve DV1 is switched so that the gas container B1 is filled with compressed air or another gas with a container volume of 1% to 40%, preferably 1 to 10%, in particular 5%, of the liquid volume in the culture vessel).
  • the full volume of the gas container can be varied from 0% to 1 00% of the container volume using a built-in stamp.
  • valve DV1 is switched to the other position, gas container - culture vessel.
  • the pressure equalization to the culture vessel creates a gas flow which, after an optional gas filter, can be passed through the modules described below and ultimately flows out in the headspace or the reaction fluid of the culture vessel.
  • the pressure compensation capillary branching off after the three-way valve DV1 ensures a balanced one Pressure between the gas supply and the liquid supply modules.
  • a filter for filtering the transport medium can be attached to the output of the gas supply module.
  • the culture vessel is supplied with defined and thus quantifiable "gas portions" in the simplest way by this device according to the invention. The smaller the container volume and the higher the valve's clock rate, the closer this discontinuous gas flow approaches a continuous gas flow.
  • the container volume is 5% of the liquid volume of the reaction liquid (example 25 ml container volume, 500 ml reaction liquid volume) and the gassing rate VF is the quotient from gas volume / h to the volume of reaction liquid.
  • the VF values are usually between 5 and 60 (1 / h). This can be achieved in a very simple manner in an almost “continuous” gas flow using the module according to the invention, with complicated, mechanical or electronic flow measurements and controllers can be dispensed with.
  • Essential for an optimal and continuous gas supply of cultures of microorganisms with optimal use of the gas is the so-called "gas hold up", ie the time of the gas bubbles in the reaction solution, during which gas exchange can take place at the interface between gas bubble and liquid by diffusion.
  • An optimum use of the gas with an optimal gassing rate is achieved when the "gas hold up" is equal to the clock rate of the valve DVl. Gas is always dosed when the gas bubbles disappear from the liquid. The amount of gas passed through can be varied via the variable volume of the gas container.
  • the construction of the module according to the invention reduces the tendency to
  • liquid can be used as the transport medium.
  • the gas supply module is replaced by a regulated liquid pump, which is either connected to the reaction liquid in the culture vessel via a suction line and circulates it, or is sucked in from its own storage vessel (drawing 2).
  • the drive pump module consists of the following essential components:
  • liquid as a transport medium is particularly useful if the reaction liquid is to be enriched with gases effectively, but avoiding gas bubbles in the culture, e.g. CO 2 dosing in cell culture media or minimal amounts of substance are to be added.
  • gas bubbles e.g. CO 2 dosing in cell culture media or minimal amounts of substance are to be added.
  • the dosage of catalysts or the dosage of biological active substances should be mentioned. Active ingredients are usually extremely expensive and only long-term stable in a concentrated form. According to the invention, they are dosed with liquid modules (see below) in the smallest quantities and in any combination.
  • the Liquid Vodage module consists of the following essential components (drawing 1):
  • the liquid reservoir is filled with a liquid to be metered into the reaction liquid in the culture vessel, with a residual volume of gas of at least 2% of the volume of the reservoir for pressure equalization being present. If the transport medium is a liquid, the remaining volume of the gas in the receiver and the pressure equalization via capillaries are eliminated (drawing 2).
  • the template can be ventilated with atmospheric outside pressure to avoid negative pressure.
  • the liquid supply can be any, hanging, standing, lying to the device be attached, whereby the pressure compensation line should open into the existing gas volume.
  • the liquid reservoir has a volume of 0.5% to 50%, preferably 5%, compared to the liquid volume of the reaction liquid. It is connected via a supply line to the clock valve VI, which is connected to the Venturi nozzle VD1.
  • the gas supply or drive pump module supplies a flow of transport medium via the Venturi nozzle, a vacuum is created at the side inlet of the nozzle compared to the otherwise pressure-balanced system.
  • the timing valve VI With the simultaneous opening of the timing valve VI, liquid is sucked in from the liquid vodage to the gas flow in the nozzle.
  • the amount of liquid drawn in correlates with the following parameters
  • feed batch methods are particularly common.
  • One or more substrates for example a carbon or nitrogen source, are metered into the culture in a controlled manner.
  • the present device allows the composition of the liquid dosage to be varied in the simplest way.
  • substrate gradients can only be created by varying the cycle time or additional nutrients can be added, for example growth factors, minerals or vitamins from other fluid modules.
  • the dosing template for gases module (drawing 3 and 4) consists of the following essential components
  • the three-way valve is switched from the gas inlet to the gas container B2.
  • the container fills with gas, whereby the filling volume can be varied via the built-in stamp, but is therefore known quantitatively. If gas is now to be metered, the three-way valve is switched over to the Venturi nozzle for a defined cycle time, it should be ensured that a negative pressure is generated at the nozzle which is generated by the transport medium. is applied. With known admission pressure at the gas inlet, filling volume of the gas container and the cycle time of the three-way valve, a quantitative gas dosage can be achieved.
  • Several gas metering modules preferably 2 modules, can be interposed between the gas supply module or drive module (drawings 1 and 2) and the culture vessel module.
  • the circuit can be connected in parallel (preferred) or in series. In this way, it is possible to quantitatively meter no or several different gases into the transport medium at the same time, to combine them in any quantity and to mix them homogeneously before they enter the culture vessel.
  • the gas modules can be used in place or in any combination with the liquid modules.
  • C02 is often used to regulate the pH value, which can be dosed simply and quantitatively with this module while avoiding gas bubbles in the reaction liquid.
  • the gas dosage can create and regulate an artificial atmosphere in the culture vessel, which is advantageous for biological cultures. Examples include the culture of plant cells that prefer a higher CO 2 concentration (as a substrate) or the cultivation of anaerobic organisms under a nitrogen or sulfur atmosphere.
  • the culture vessel module essentially consists of the following components: - Culture vessel KG1, filled with the reaction liquid and the gas space (headspace) above it and closure of the vessel - Supply line for the transport medium - Inlet valve EVl with supply line in the headspace of the culture vessel
  • the inlet valves attached to the closure of the culture vessel make it possible to choose whether the transport medium is to be metered into the air space of the culture vessel (headspace) or into the reaction liquid.
  • the inlet valve EV1 to the headspace leads to a nebulizer nozzle AD1 which is located in the air space and which again atomizes the transport medium.
  • the entire, nebulized transport medium and the dosages sink uniformly onto the surface of the reaction liquid. This fine distribution results in a quick mixing of the transport medium and the dosages with the reaction liquid and can lead to a more effective use of the metered liquid.
  • the effectiveness of antifoam agents, which are dosed in this way can hereby be increased up to tenfold, consequently the consumption can be minimized accordingly.
  • the inlet valve EV2 leads to a Venturi nozzle BDI attached in the reaction liquid.
  • the transport medium (and the doses) flows through the BDI aerator into the reaction liquid.
  • reaction liquid is sucked in at the lateral inlet of the nozzle due to the resulting negative pressure and is effectively mixed in the outlet area of the nozzle.
  • the microorganisms eg tissue cells
  • the side inlet opening can be closed with a filter membrane.
  • the present invention is characterized in that it brings function modules together in a suitable manner for a completely new field of application and thus combines a previously complex and complex technology in a simple, compact device.
  • the device can be used for biotechnological processes under sterile conditions. In this way, areas of control technology are accessible that previously could not be served with the prior art.
  • An example here is the recently carried out parallel fermentation of culture vessels, usually up to 16 vessels (Das GIP GmbH, www.dasgip.de), which serves the media and process optimization of biological processes.
  • the effects of various parameters on the result of the culture are to be investigated under conditions that are as close as possible to production, and the conditions of the production system would be desirable as far as measurement and control technology are concerned, ie effective gassing and metering of different liquids.
  • the entire device including the liquid and gas templates and the valve control can be attached to the neck of the culture vessel.
  • the data exchange with the tax EDP takes place via infrared interface. Only one supply line, consisting of gas supply and voltage supply, is therefore required for the culture vessel.
  • a further miniaturization of the device can take place in that the functional parts and supply lines are etched, cut or injected into corresponding materials, such as steel or plastics, and the valve function can be implemented by inserted seals which are operated by means of a tappet or any other mini valves.
  • the device according to the invention can be combined with internals in the culture vessel, for example patent application entitled “Device as an insert for culture vessels for optimized gassing and metering of shaken or stirred three-phase systems" (file number will be submitted later).
  • the combination creates a powerful culture vessel that can easily reproduce and simulate the complete measurement and control technology and process engineering parameters of a high-performance fermenter on almost any scale.
  • Yeast extract for microbiology 20 g / 1
  • Glucose for microbiology 1 g / 1
  • Three-way valve DVl The Lee Company, type LHDA12311115H
  • Cycle valve VI, V2 The Lee Company, type LFVA 123021 OH
  • Inlet valve EV1, EV2 The Lee Company, type LFVA 123021 OH
  • Venturi nozzle VD1 VD2 Spraying Systems, Typ
  • Aerator nozzle BDI Spaying Systems, type Air nozzle AD1: Spaying Systems, type
  • Air tank Bl Braun Melsungen, disposable syringe 50 ml with
  • Air filter FI Sartorius, single-use sterile filter, 0.2 ⁇ m
  • Liquid supply disposable ampoules, 25 ml with crimp cap and rubber seal
  • Hoses Teflon hose, 1 mm inner diameter
  • Foam detection isolated needle with short to ground
  • Reaction fluid valve control Braun Melsungen DCU 3 system
  • the media components are available from the relevant specialist dealers in the same quality.
  • the ingredients of glucose and magnesium chloride were sterilized separately as suitable aliquots and then added under steal conditions.
  • the culture vessel was filled with 500 ml of medium and sterilized in an autoclave.
  • the supply lines to the headspace and to the reaction liquid with the nozzles were passed through a hole in the lid, closed and also sterilized with the vessel.
  • the device according to the invention was separated at the outlet of the inlet valves.
  • 24 ml of glucose solution (100 g / 1) and 24 ml of anti-foaming agent (Dow silicone oil, 10% suspension) which were each sterilized separately, served as liquid templates.
  • the device according to the invention was connected according to drawing 1 with Luer lock connections and Teflon tubes and fastened to a worktop.
  • the inoculation was carried out with a pure culture of the microorganism, each with one milliliter, under sterile conditions.
  • the pure culture was prepared from a tube with E.
  • the device was coupled to the inlet valves with the culture vessel and with the gas supply module.
  • the glucose solution was connected to the liquid template 1, the antifoam agent to the second Liquid templates were used upright.
  • a short single-use injection needle was used as the connection for the pressure overlay, and a long one for the liquid withdrawal, which was passed sterile through the rubber seal. Compressed air with an overpressure of 0.5 bar was connected to the compressed air inlet.
  • the volume of the gas container was adjusted to 25 ml.
  • the entire device and the culture vessel were heated to 37 ° C. in an incubator.
  • the culture vessel was not shaken because the gas flow alone provided the culture with sufficient gas.
  • the valves of the device according to the invention were connected to the control unit DCU3 and regulated as shown in Table 3:
  • Clock rate 15 fillings and gas flows per minute corresponds to a VF of 45 or 22.5 1 air / h, inlet valve EVl closed, EV 2 open, i.e. Gas flow into the reaction liquid
  • Cycle valve VI opened four times per minute for 0.2 seconds, simultaneously with the switching of a gas flow to the culture vessel, DVI open to the culture vessel, EV2 open, corresponds to a glucose dosage of 1 mi per hour
  • Liquid template 2, anti-foaming agent cycle valve V2 normally closed.
  • Inlet valve EV2 is closed, inlet valve EV1 is opened, ie headspace gassing start one Timer. If the foam signal of the stylus is negative after 8 seconds, the valve EV1 is closed and the valve EV2 is opened, return to normal operation. If the foam signal is still present, the cycle valve V2 is opened for 1 second at the same time with each cycle of the gas supply and antifoam (18.7 ml / h) is mixed into the air flow of the gas supply. If the foam signal is still present after a further 16 seconds, the EV2 valve is also opened to supply the culture with gas again. This state is maintained until the sensor needle signal is negative. Then return to normal operation.
  • the cultivation of the microorganisms was stopped and the optical density (OD) at 546 nm was determined in a photometer.
  • the OD of approx. 90 corresponds to the expected value in a high-performance fermenter and convinced of the performance of the device.
  • the substrate vodage was completely used up. An amount of about 2 ml of antifoam was measured, significantly less than the amount that a conventional fermenter would have needed for this batch (about 12 ml, depending on the control algorithm).

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Abstract

Bioreaktor zur Kultivierung von Zellen, mit einem Kulturgefäß, mit einer oder mehreren Gasversorgungen und/oder einer oder mehreren Flüssigkeitsvorlagen sowie Zuführungseinrichtungen für Gase und/oder Flüssigkeiten, mittels welcher Gase und/oder Flüssigkeiten dem Kulturgefäß zuführbar sind, wobei zwischen der Zuführungseinrichtung und der Gasversorgung bzw. Flüssigkeitsvorlage eine Mischvorrichtung, insbesondere eine Venturidüse, zur Mischung von Gas und/oder Flüssigkeit aus der Gasversorgung bzw. Flüssigkeitsvorlage geschaltet ist.

Description

Bioreaktor
Gebiet der Erfindung.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren und eine Vorrichtung, die eine quantitative Erzeugung von Gas/Gas-, Gas/Flüssigkeit- oder Flüssigkeit/Flüssigkeitsgemischen durch definierte Zuführung der zu dosierenden Komponente (n) zu einem Carriermedium ermöglicht und so eine exakte, quantitative Dosierung einer einzigen Komponente oder eines Gemisches zu Kulturgefäßen für biologische oder (bio) chemische Reaktionen ermöglicht.
Stand der Technik.
Kulturgefäße für biologische oder (bio) chemische Reaktionen, soweit es sich nicht um Fermenationsanlagen im Maß- stab größer 1000 ml handelt, werden derzeit üblicherweise weder begast noch verfügen Sie über geeignete Dosiereinrichtungen. Dies liegt daran, daß der technische und wirtschaftliche Aufwand für diese Regelsysteme nach dem Stand der Technik sehr hoch ist und mit fortschreitender Minia- turisierung der Kulturgefäße technisch nicht machbar ist. Der aus der Praxis bekannte Stand der Technik zur vorliegenden Erfindung soll an Hand verschiedener quantitativer Dosiermodule dargestellt werden:
Gasdosierung:
Eine quantitative Gasdosierung erfolgt bei konstantem Vordruck über mechanische Flowmeter, die mit Nadelventilen auf den gewünschten Gasfluß geregelt werden. Weiterhin existieren elektronische Massflowcontroler, die über eine Regeleinheit und elektrische Stellblenden den Gasfluß automatisch regeln. Der so geregelte Gasfluß kann in Größen- Ordnungen zwischen ml Gas/h und m3 Gas /h liegen.
Biologische oder (bio) chemische Kulturgefäße werden in jeder ihrer Anwendungen über eine eigene Gasdosierstrecke versorgt. An der Auslaßöffnung zum Kulturgefäß hin können sich Perlausströmer befinden. (Braun Biotech International GmbH, Bioreaktoren Serie BIOSTA A, B,MD, Q, D, U) . In keinem Fall wird der Gasstrom als Trägermedium für Flüssigkeiten oder andere Gase genutzt. Desweiteren werden keine Ventu- ridüsen an der Auslaßöffnung verwendet, um die Durchmischung mit der Reaktionsflüssigkeit und damit die Effek- tivität der Begasung zu steigern.
Flüssigkeitsdosierung:
a) Pumpen Standardmäßig werden zur quantitativen Dosierung von Flüssigkeiten Pumpen beliebiger Bauart eingesetzt. Diese entnehmen aus einem Vorratsgefäß entsprechend der Vorgabe eines übergeordneten Reglers ein Aliquot und pumpen dieses über eine Zuleitung zum Reaktionsgefäß. Die transportie- rende Kraft ist hier die Pumpleistung. Bei biologischen oder (bio) chemischen Kulturgefäßen sind Dosagepumpen für Säure, Lauge, Antischaummittei und ein bis zwei Substratlösungen üblich, die die Flüssigkeit einfach in die Reaktionsflüssigkeit pumpen (Braun Biotech International GmbH, Bioreaktoren Serie BIOSTA A, B,MD, Q, D, U) . In keinem Fall wird die Flüssigkeit mit einem Gasstrom, der zur Aerosolbildung und damit zur homogenen Durchmischung und effektiveren Nutzung des Gases führt, kontaktiert. b) Druckvorlagen
Bei größeren Kulturgefäßen (etwa ab 50 Liter) werden Flüs- sigkeitsvorlagegefässe verwendet, die gegenüber dem Kulturgefäß unter einem Überdruck stehen und mit diesem durch eine Zuleitung mit integrierten Taktventil verbunden sind. Soll nun eine Flüssigkeitsdosierung erfolgen, öffnet ein Regler für eine definierte Zeit das Taktventil, so daß durch den Überdruck Flüssigkeit zum Kulturgefäß gedrückt wird. Durch die Parameter Öffnungszeit, Querschnitt der Zuleitung, Überdruck und Viskosität der Flüssigkeit kann die Dosierung quantitativ geeicht werden (Braun Biotech International GmbH, Bioreaktoren Serie kundenspezifische Produktionsanlagen). Bei biologischen oder (bio) chemischen sind Vorlagegefäße für Säure, Lauge, Antischaummittel und ein bis zwei Substratlösungen üblich, die die Flüssigkeit einfach in die Reaktionsflüssigkeit "drücken". In keinem Fall wird die Flüssigkeit mit einem Gasstrom, der zur Ae- rosolbildung und damit zur homogenen Durchmischung und effektiveren Nutzung des Gases führt, kontaktiert.
c) Mischstationen mit Venturidüsen
Venturidüsen sind als solche aus Bioreaktor-fremden Bereichen bekannt. Venturidüsen erzeugen auf Grund ihrer strömungstechnischen Form am Seiteneinlass einen Unterdruck, durch den zum strömenden Medium 1 hin (Gas oder Flüssigkeit) ein weiteres Medium 2 (Gas oder Flüssigkeit) ange- saugt werden kann. Im Auslaßbereich der Düse erfolgt eine homogene Durchmischung der beiden Medien. Wenn die Querschnitte der Düse, die Viskosität der Medien und der Vordruck vor der Düse bekannt sind, läßt sich eine quantitative Mischung erzielen. Medium 1 kann nach der Düse auf Grund seines Oberdrucks weiterhin als Transportmedium fungieren. Eingesetzt werden Venturi Düsen für vielfältige Applikationen zum Entgasen (Wasserstrahlpum- pe) , in Durchflußmessern (delta Druck) oder Mischen verschiedener Medien, z.B. Verdünnen von Konzentraten mit einem zweiten Medium. Im Mikromaßstab lassen sich Venturidüsen für eine quantitative Probenahme eines Mediums einsetzen (Fox Valve Devetopment Corp, Ha itton Buisness Park, Dover, New Jersey 07801 USA, lntemetfoxvalve.com). Obwohl mit dem Einsatz von Ventuddüsen eine Vielzahl von Anwendungen für Dosieren und Mischen im täglichen Gebrauch bekannt ist (z.B. Whirl pool) , obwohl sie keinerlei bewegte Verschleißteile aufweisen und somit eine ideale Dosier- Vorrichtung darstellen, ist der Einsatz von diesen Düsen im Bereich biologische und (bio-) chemische Kulturgefäße zur Dosierung von Gasen oder Flüssigkeiten mittels eines Transportmediums bisher nicht beschrieben. Weiterhin ist kein Dosiersystem gemäß der vorliegenden Erfindung für biologische oder (bio-) chemische Kulturgefäße beschrieben, das ein Transportmedium mit mehreren Dosagemedien (Gas oder Flüssigkeit) vereinen kann, dabei eine quantitative Dosierung ermöglicht, und ggf. am Auslaß noch Verneblerdüsen oder Mischdüsen besitzt, um eine bessere Durchmischung mit der Reaktionsflüssigkeit oder effektivere Ausnutzung der dosierten Flüssigkeit zu gewährleisten.
Zusammengefasst sind die Nachteile des Stands der Technik für Kulturgefäße für biologische und (bio) chemische Reaktionen:
- für eine Miniaturisierung unter 1000ml Kulturgefäßvolumen nicht geeignet - bei Parallelansatzen aufwendig, störanfällig, unwirtschaftlich und nur bedingt einsetzbar
- kostenintensiv.
Die Dosierung von Flüssigkeiten, Gasen oder Gemischen daraus in Kulturgefaße für biologische oder (bio) chemische Reaktionen erfordert einen erheblichen wirtschaftlichen und mechanischen Aufwand und ist bei größerer Anzahl parallel betriebener Kulturgefaße nicht mehr realisierbar.
Technisches Problem der Erfindung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein effektives, wirtschaftliches und für Miniaturisierung geeignetes Fluiddosierverfahren, sowie eine Vorrichtung dafür zur Verfugung zu stellen.
Grundzuge der Erfindung.
Das Problem wird gelost durch ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erzeugung eines Carrierfluids, das gleichzeitig zur Begasung des Kulturgefaßes verwendet werden kann.
Dem Carrierfluid können quantitativ und definiert die zu dosierenden Fluide beigemischt werden. Ohne Verwendung von Pumpen und anderen aufwendigen mechanischen Teilen können so im Kulturgefaß in der Reaktionsflussigkeit und in der Atmosphäre des Gefäßes definierte und geregelte Bedingungen geschaffen werden, wobei gleichzeitig die Eigenschaften der dosierten Fluide optimal genutzt werden. Besonders geeignet ist die Erfindung für den parallelen Betrieb mehrerer Kulturgefäße. Die vorliegende Erfindung ist angewendbar in allen Bereichen, in denen in Kulturgefäßen biologische oder biochemische Reaktionen durchgeführt werden, speziell im Bereich Biotechnologie, Lebensmitteltechnik und Umweltschutz.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung.
Die Aufgabe wird bezüglich des Verfahrens dadurch gelöst, daß das zu dosierende Fluid oder die zu dosierenden Fluide einem oder mehreren Träger- und Transportfluiden (Carrier- fluiden) in definierter Konzentration beigemischt werden und dieses Carrierfluid, bzw. diese Carrierfluide dem Kulturgefäß in definierter Menge und/oder Zeiteinheiten entwender ins Reaktionsmedium oder in den Headspace zugeführt werden.
Die Aufgabe wird bezüglich der Vorrichtung gelöst durch Vorrichtungen zur Beimischung von einem oder mehreren zu dosierenden Fluiden zu einem oder mehreren Carrierfluiden und die Zuführung in ein oder mehrere Kulturgefäße, wie Sie in den folgenden Beispielen und den Patentansprüchen beschrieben werden.
Folgend erfolgt die Beschreibung der Erfindung beispielhaft mit der Beschreibung der einzelnen Moduie und erfin- dungsgemäßen Eigenschaften an einem 1000 ml Kulturgefäß mit 500 ml Flüssigkeitsvolumen. Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, daß die Zahlen (vor allem die relativen Angaben) an Kulturgefäße mit Volumen von 1 ml bis 50 m3 angepasst werden können, wobei die Querschnitte der Düsen und Dosierstrecken jeweils anzupassen sind.
a) Gas als Transportmedium der Vorrichtung
Das Modul Gasversorgung der Vorrichtung besteht aus folgenden, wesentlichen Bauteilen (Zeichnung 1):
- Druckgaseinlaß
- Dreiwegeventil DV1 oder Einlaß- und Auslaßventil - Gasbehälter Bl
- Gasfilter F 1
- Druckausgleichskanal DGl
Der Druckgaseinlaß mit einem Eingangsuberdruck gegenüber dem Kulturgefaß von 0,1 bis 10 bar, bevorzugt 0,2 bis 1 bar, insbesondere 0,5 bar, ist über einen druckbestandigen Schlauch, Innendurchmesser 0,5 bis 8 mm, bevorzugt 0,5 bis 2mm, insbesondere 1 mm, mit dem Dreiwegeventil DV1 (s. Zeichnung 1) verbunden. Das Ventil DV1 ist so geschaltet, daß der Gasbehälter Bl mit einem Behaltervolumen von 1% bis 40%, bevorzugt 1 bis 10%, insbesondere 5%, des Flus- sigvolumens im Kulturgefaß, mit Druckluft oder einem anderen Gas gefüllt wird) . Das Fullvolumen des Gasbehälters kann über einen eingebauten Stempel von 0% bis 1 00% des Behaltervolumens variiert werden. Nach Erreichung des Druckausgleiches wird das Ventil DV1 in die andere Stellung, Gasbehälter - Kulturgefaß, geschaltet. Es entsteht durch den Druckausgleich zum Kulturgefäß hin ein Gasstrom, der nach einem optionalen Gasfilter durch nachstehend be- schriebene Module geleitet werden kann und letztlich im Headspace oder der Reaktionsflussigkeit des Kulturgefaßes ausströmt. Die nach dem Dreiwegeventil DV1 abzweigende Druckausgleichskapillare sorgt für einen ausgeglichenen Druck zwischen der Gaszuführung und den Modulen Flüssigkeitsvorlage. Am Ausgang des Moduls Gasversorgung kann ein Filter zur Filtration des Transportmediums angebracht sein. Das Kulturgefäß wird durch diese erfindungsgemäße Vorrichtung diskontiunierlich auf einfachste Weise mit definierten und damit quantifizierbaren "Gasportionen" versorgt. Je kleiner das Behältervolumen und je höher die Taktrate des Ventils ist, desto mehr nähert sich dieser diskontinuierliche Gasstrom einem kontinuierlichen Gass- trom an. In folgender Tabelle ist das Behältervolumen 5% des Flüssigvolumens der Reaktionsflüssigkeit (Beispiel 25 ml Behältervolumen, 500 ml Reaktionsflüssigkeitsvolumen) und die Begasungsrate VF der Quotient aus Gasvolumen/h zu Volumen Reaktionsflüssigkeit.
Tabelle 1
Taktrate Gasst :rom/min VF
Ventil/min in % Flüssigvolumen (1 /h)
0 0 0
1 5% 3
2 10% 6
5 25% 15
10 50% 30
15 75% 45
20 100% 60
25 125% 75
50 250% 150
Für aerobe, biologische oder (bio) chemische Reaktionen liegen die VF Werte üblicherweise zwischen 5 und 60 (1/h) Dies lässt sich mit vorliegenden, erfindungsgemäßen Modul auf einfachste Weise in einem nahezu "kontinuierlichen" Gasstrom erreichen, wobei auf komplizierte, mechanische oder elektronische Durchflußmessungen und -Regler verzichtet werden kann. Wesentlich für eine optimale und kontinuierliche Gasversorgung von Kulturen von Mikroorganismen bei optimaler Ausnutzung des Gases ist der sogenannte "gas hold up", also die Aufenthaltszeit der Gasblasen in der Reaktionslösung, während der an der Grenzfläche zwischen Gasblase und Flüssigkeit durch Diffusion der Gasaustausch erfolgen kann. Ein Optimum der Nutzung des Gases bei gleichzeitig optimaler Begasungsrate erreicht man, wenn der "gas hold up" gleich der Taktrate des Ventils DVl ist. Es erfolgt immer eine Dosierung von Gas, wenn die Gasblasen aus der Flüssigkeit verschwinden. Eine Variation der Menge des durchgesetzten Gases kann über das variable Volumen des Gasbehälters erfolgen. Weiterhin reduziert der erfindungsgemäße Aufbau des Moduls die Tendenz zur
Schaumbildung, da immer nur soviel Gas dosiert wird, wie für eine optimale Versorgung der Kultur nötig ist.
b) Flüssigkeit als Transportmedium
An Stelle des Moduls Gasversorgung kann Flüssigkeit als Transportmedium eingesetzt werden. In diesem Fall wird das Modul Gasversorgung durch eine geregelte Flüssigkeitspumpe ersetzt, die entweder mit einer Saugleitung mit der Reak- tionsflüssigkeit im Kulturgefäß verbunden ist und diese umwälzt oder aus einem eigenen Vorratsgefäß ansaugt (Zeichnung 2) . Das Modul Antriebspumpe besteht aus folgenden wesentliche Bauteilen:
- Flüssigkeitspumpe - Saugleitung
- Druckleitung zum Kulturgefäß hin
- Filter (optional) Der Einsatz von Flüssigkeit als Transportmedium bietet sich besonders dann an, wenn die Raktionsflüssigkeit effektiv, aber unter Vermeidung von Gasblasen in der Kultur, mit Gasen angereichert werden soll, z.B. C02 Dosierung in Zellkulturmedien oder minimale Substanzmengen zudosiert werden sollen. Hier ist zum Beispiel die Dosage von Katalysatoren oder die Dosage von biologischen Wirkstoffen zu nennen. Wirkstoffe sind meist extrem teuer und nur in konzentrierter Form langzeitstabil . Sie werden erfindungsge- maß mit Fiüssigkeitsmodulen (s.u.) in kleinsten Mengen und in beliebiger Kombination dosiert.
c) Modul Flüssigkeitsvorlage
Das Modul Flüssigkeitsvodage besteht aus folgenden wesentlichen Bauteilen (Zeichnung 1):
- Vorratsbehälter Flüssigkeit
- Druckausgleichsleitung, abgezweigt aus der Druckausgleichskapillare - Zuleitung zum Taktventil und zur Venturidüse
- Taktventil
- Venturidüse
Die Flüssigkeitsvorlage ist mit einer zur Reaktionsflüs- sigkeit im Kulturgefäß zu dosierenden Flüssigkeit gefüllt, wobei ein Restvolumen von Gas von mindestens 2% des Volumens der Vorlage zum Druckausgleich vorhanden sein muß. Ist das Transportmedium eine Flüssigkeit, entfällt das Restvolumen das Gases in der Vorlage und der Druckaus- gleich über Kapillaren (Zeichnung 2) . Dafür kann die Vorlage zur Vermeidung von Unterdruck mit atmosphärischem Außendruck belüftet werden. Die Flüssigkeitsvorlage kann beliebig, hängend, stehend, liegend zur Vorrichtung angebracht werden, wobei die Druckausgleichsleitung in das vorhandene Gasvolumen münden sollte. Die Flüssigkeitsvorlage hat gegenüber dem Flüssigkeitsvolumen der Reaktionsflüssigkeit ein Volumen von 0,5% bis 50%, bevorzugt 5%. Sie ist über eine Zuleitung mit dem Taktventil VI, dieses mit der Venturidüse VD1, verbunden. Liefert das Modul Gasversorgung oder Antriebspumpe einen Strom von Transportmedium über die Venturidüse, entsteht am Seiteneinlass der Düse ein Unterdruck gegenüber dem sonst druckausgegliche- nen System. Bei gleichzeitiger Öffnung des Taktventils VI wird somit Flüssigkeit aus der Flüssigkeitsvodage zum Gasstrom in der Düse hin angesaugt. Die angesaugte Menge der Flüssigkeit korreliert mit folgenden Parametern
Tabelle 2
- Düsenabmessungen
- Druck und Gasström über die Düse
- Querschnitte der Zuleitung und des Taktventils
- Viskosität der Flüssigkeit - Temparatur
und kann daher quantitativ und reproduzierbar kalibriert werden. Es läßt sich folglich nur durch die Taktzeit des Ventils VI bei konstanten Parametern gemäß Tabelle 2 eine quantitative Dosierung von Flüssigkeitsaliquots zum Transportmedium durchfuhren. Im Auslaß der Düse wird die angesaugte Flüssigkeit und das Transportmedium homogen vermischt. Zwischen dem Modul Gasversorgung oder Modul Antrieb (Zeichnung 1 und 2) und dem Modul Kulturgefäß kön- nen mehrere Module Flüssigkeitsvorlage, bevorzugt 4 Module, zwischengeschaltet werden. Die Schaltung kann parallel (bevorzugt) oder hintereinander erfolgen. Auf diese Weise wird es möglich, in das Transportmedium gleichzeitig keine bis mehrere unterschiedliche Flüssigkeiten quantitativ zu dosieren, diese in beliebiger Menge zu kombinieren und vor dem Einlaß ins Kulturgefäß homogen zu durchmischen. In biologischen Kulturen sind neben der Titration des pH Wer- tes mit Säuren und Laugen und dem Zusatz von Mitteln zur Schaumbekämpfung vor allem sogenannte "fed batch" Verfahren gebräuchlich. Hierbei wird der Kultur geregelt ein oder mehrere Substrate, z.B. Kohlenstoff oder Stickstoffquelle, zudosiert. Die vorliegende Vorrichtung ermöglicht auf einfachste Weise, die Zusammensetzung der Flüssigdosa- ge zu variieren. So können zeitabhängig oder in Abhängigkeit von kulturspezifischen Regelparametern nur über die Variation der Taktzeit Substratgradienten erstellt werden oder zusätzliche Nährstoffe beigemischt werden, z.B. Wachstumsfaktoren, Mineralien oder Vitamine aus weiteren Flüssigkeitsmodulen.
d) Modul Dosiervorlage für Gase
Das Modul Dosiervorlage für Gase (Zeichnung 3 und 4) besteht aus folgenden wesentlichen Bauteilen
- Gasbehälter B2, über Stempel im Füllvolumen verstellbar
- Gaseinlaß
- Dreiwegeventil
Das Dreiwegeventil wird vom Gaseinlaß zum Gasbehälter B2 geschaltet. Der Behälter füllt sich mit Gas, wobei über den eingebauten Stempel das Füllvolumen variiert werden kann, somit aber quantitativ bekannt ist. Soll nun eine Gasdosage erfolgen, wird das Dreiwegeventil für eine definierte Taktzeit zur Venturidüse hin umgeschaltet, wobei sichergestellt sein sollte, daß an der Düse ein Unterdruck, der durch das Transportmedium erzeugt wird, anliegt. Bei bekanntem Vordruck am Gaseinlaß, Füllvolumen des Gasbehälters und der Taktzeit des Dreiwegeventils läßt sich so eine quantitative Gasdosage erreichen. Zwischen dem Modul Gasversorgung oder Modul Antrieb (Zeichnung 1 und 2) und dem Modul Kulturgefäß können mehrere Module Gasdosage, bevorzugt 2 Module, zwischengeschaltet werden. Die Schaltung kann parallel (bevorzugt) oder hintereinander erfolgen. Auf diese Weise wird es möglich, in das Transportmedium gleichzeitig kein bis mehrere unterschiedliche Gase quantitativ zu dosieren, diese in beliebiger Menge zu kombinieren und vor dem Einlaß ins Kulturgefäß homogen zu durchmischen. Die Gasmodule können an Stelle oder in beliebiger Kombination mit den Flüssigkeitsmodulen eingesetzt werden. In biologischen Zellkultu- ren wird häufig C02 zur Regelung des pH Wertes eingesetzt, das mit diesem Modul unter Vermeidung von Gasblasen in der Reaktionsflüssigkeit einfach und quantitativ dosiert werden kann. Weiterhin kann durch die Gasdosage eine künstliche Atmosphäre im Kulturgefäß geschaffen und geregelt wer- den, die für biologische Kulturen vorteilhaft ist. Zu nennen sind hier beispielsweise die Kultur von Pflanzenzellen, die eine höhere C02 Konzentration (als Substrat) bevorzugen oder die Anzucht anaerober Organsimen unter Stickstoff- oder Schwefelatmosphäre .
e) Modul Kulturgefäß
Das Modul Kulturgefäß besteht im wesentlichen aus folgenden Bauteilen: - Kulturgefäß KG1, gefüllt mit der Reaktionsflüssigkeit und darüber liegenden Gasraum (headspace) und Verschluß des Gefäßes - Zuleitung für das Transportmedium - Einlaßventil EVl mit Zuleitung in den Headspace des Kulturgefäßes
- Einlaßventil EV2 mit Zuleitung in die Reaktionsflüssigkeit - Belüfterdüse BDI in der Reaktionsflüssigkeit
- Ausströmerdüse AD1 im Headspace des Kulturgefäßes
Durch die am Verschluß des Kulturgefäßes angebrachten Einlaßventile kann gewählt werden, ob das Transportmedium in den Luftraum des Kulturgefäßes (headspace) oder in die Reaktionsflüssigkeit dosiert werden soll. Das Einlassventil EVl zum headspace führt zu einer im Luftraum angebrachten Verneblerdüse AD1, die nochmals eine Zerstäubung des Transportmediums bewirkt. Das gesamte, vernebelte Transportmedium und die Dosagen sinken einheitlich auf die Oberfläche der Reaktionsflüssigkeit. Diese Feinverteilung bewirkt eine schnelle Mischung des Transportmediums und der Dosagen mit der Reaktionsflüssigkeit und kann zu einer effektiveren Nutzung der dosierten Flüssigkeit führen. Die Effektivität von Antischaummittein, die in dieser Weise dosiert werden, kann hierdurch bis um das Zehnfache gesteigert werden, folglich der Verbrauch entsprechend minimiert werden. Weiterhin ist es möglich, nur einen Gasstrom ohne zudosierte Flüssigkeit zur Schaumbekämpfung einzuset- zen. Der Schaum wird durch den Strom des Gases einfach "niedergeblasen". Häufig reicht dieser Effekt für die Schaumbekämpfung schon aus, ohne daß nachfolgend An- tischaummittel in oben beschriebener Weise dosiert werden muß. Die Vermeidung von Antischaummittein in biologischen Prozessen ist oberstes Ziel, da diese negative Auswirkungen auf die Kultur selbst und den späteren Aufreinigungs- prozess haben können, sowie biologisch schlecht abbaubar sind und somit nicht einfach entsorgt werden können. Headspace Dosierungen in oben beschriebener Weise werden überwiegend eingesetzt werden, wenn nur eine Oberflächenbelüftung der Reaktionsflüssigkeit gewünscht ist, z.B. bei anaeroben Kulturen oder wenn Flüssigkeiten dosiert werden, die eine schneite Wirkung auf die Reaktionsflüssigkeit haben sollen. Als Beispiel sei hier die Titration des pH Wertes mit Säuren oder Laugen genannt, sowie die Schaumbekämpfung in oben beschriebener Weise. Das Einlaßventil EV2 führt zu einer in der Reaktionsflüssigkeit angebrachten Venturidüse BDI. Das Transportmedium (und die Dosagen) strömt durch die Belüfterdüse BDI in die Reaktionsflüssigkeit. Hierbei wird am seitlichen Einlaß der Düse durch den entstehenden Unterdruck Reaktionsflüssigkeit angesaugt, die im Auslaßbereich der Düse effektiv vermischt wird. Sollen die Mikroorganismen (z.B. Gewebezellen) nicht den Scherkräften in der Düse ausgesetzt werden, ist die seitliche Einlaßöffnung mit einer Filtermembran verschließbar. Neben dem Mischeffekt, der die Mischzeiten der Reaktionsflüssigkeit drastisch verkürzt undden deutlich beschleu- nigten Gasaustauschraten entstehen (bei Transportmedium Gas) sehr viel kleinere Luftblasen als bei Begasungen entsprechend dem Stand der Technik. Diese kleineren Blasen erhöhen die für den Gasaustausch zwischen Luftblase und Reaktionsflüssigkeit zur Verfügung stehende Grenzfläche, erhöhen also die Gasaustauschrate und verbleiben länger in der Reaktionsflüssigkeit als große Blasen, erhöhen also den "gas hold up" und somit wieder die Gasaustauschrate. Das Gas wird effektiver genutzt, so daß, abhängig von der Art der Kultivierung, auf ein Schütteln oder Rühren des Kulturgefäßes ggf. verzichtet werden kann. Desweiteren wird durch kleinere Blasen die Tendenz zur Schaumbildung minimiert. Werden auf diese Weise Aerosole dosiert, z.B. Substrate im Gasstrom, führen die kürzeren Mischzeiten zu einer schnelleren, homogenen Verteilung in der Reaktionsflüssigkeit. Substratgradienten auf Grund schlechter Mischung können vermieden werden, die Kultur wird gleichmäßig in der gewünschten Weise versorgt.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich dadurch aus, das sie für einen völlig neuen Anwendungsbereich Funktionsmodule in geeigneter Weise zusammenbringt und so eine bisher aufwendige und komplexe Technik in einer einfachen, kom- pakten Vorrichtung vereint. Der Einsatz der Vorrichtung für biotechnologische Prozesse unter sterilen Bedingungen wird möglich. Hierdurch werden regelungstechnisch Bereiche zugänglich, die bisher mit dem Stand der Technik nicht bedient werden konnten. Als Beispiel sei hier die neuer- dings durchgeführte Parallelfermentation von Kulturgefäßen, üblicherweise bis zu 16 Gefäße, genannt (Das GIP GmbH, www.dasgip.de), die der Medien und Verfahrensoptimierung von biologischen Verfahren dient. Hierbei sollen unter möglichst produktionsnahen Bedingungen Einwirkungen verschiedener Parameter auf das Ergebnis der Kultur untersucht werden, wobei meß- und regeltechnisch möglichst schon die Bedingungen der Produktionsanlage erwünscht wären, d.h. effektive Begasung und Dosage verschiedener Flüssigkeiten. Wie bereits ober erwähnt, würde eine derarti- ge Parallelfermentation 96 Pumpen, 96 Regler und 16 geregelte Zuluftstrecken erfordern und ist damit technisch und wirtschaftlich praktisch nicht mehr realisierbar und erreicht trotzdem nicht, sogar wenn als Kulturgefäß Blasensäulen eingesetzt werden, die meß- und regeltechnischen Bedingungen einer Produktionsanlage. Der Trend geht zu einer weiteren Miniaturisierung und Erhöhung der Zahl der Kulturgefäße, um parallel in kürzerer Zeit mehr Ergebnisse in reproduzierbarer und quantifizierbarer Form (dokumentierbar) zu erhalten. Dies ist mit dem Stand der Technik nicht mehr realisierbar, wohl aber mit der vorliegenden Erfindung. Die Funktionsmodule können in beliebiger Größe hergestellt werden und so an die Größe des Kulturge- fäßes angepasst werden, wobei die Volumen der Kulturgefäße zwischen 1 mi und 50 Kubikmeter liegen können. Bei Kulturgefäßen mit einem Flüssigkeitsvolumen von 1 ml bis 500 ml kann die gesamte Vorrichtung inkl. der Flüssigkeits- und Gasvorlagen und der Ventilsteuerung am Hals des Kulturge- fäßes befestigt. Der Datenaustausch mit der Steuer EDV erfolgt über Infrarotschnittstelle. Es ist somit zum Kulturgefäß nur eine Zuleitung, bestehend aus Gaszuführung und Spannungsversorgung erforderlich. Eine weitere Miniaturisierung der Vorrichtung kann dadurch erfolgen, daß die Funktionsteile und Zuleitungen in entsprechende Werkstoffe, wie Stahl oder Kunststoffe, geätzt, geschnitten oder gespritzt werden und die Ventilfunktion durch eingelegte Dichtungen, die über Stößei betrieben werden, oder beliebige andere Miniventile realisiert werden kann. Die erfin- dungsgemäße Vorrichtung kann mit Einbauten im Kulturgefäß, z.B. Patentanmeldung mit dem Titel "Vorrichtung als Einsatz für Kulturgefäße zur optimierten Begasung und Dosierung von geschüttelten oder gerührten Dreiphasensystemen" (Aktenzeichen wird nachgereicht) kombiniert werden. Durch Kombination entsteht ein leistungsfähiges Kulturgefäß, das auf einfachste Weise in fast beliebigem Maßstab die komplette Meß- und Regeltechnik und die verfahrenstechnischen Parameter eines Hochleistungsfermenters wiedergibt und simulieren kann.
Ausführungsbeispiel . Materalien:
Kulturgefäß: 1000 ml Erlenmeyerkolben (Enghals) mit Kappsenberg. Mediumszusammensetzung:
Hefeextrakt für die Mikrobiologie 20 g/1
Glucose für die Mikrobiologie 1 g/1
Ammoniumsulfat 1,5 g/1
Kochsalz 0,1 molar Magnesiumchlorid 0,5 g/1
Kaliumphosphatpuffer 0,1 molar, pH 7,2 als
Lösungsmittel
Olivenöl, extravirgine 1 ml/1
Dreiwegeventil DVl: The Lee Company, Typ LHDA12311115H
Taktventil VI, V2 : The Lee Company, Typ LFVA 123021 OH
Einlaßventil EV1,EV2: The Lee Company, Typ LFVA 123021 OH
Venturidüse VD1 VD2 : Spraying Systems, Typ
Belüfterdüse BDI: Spaying Systems, Typ Ausströmerdüse AD1 : Spaying Systems, Typ
Luftbehälter Bl : Braun Melsungen, Einwegspritze 50 ml mit
Luer Lock
Luftfilter FI : Sartorius, Einmalsterilfilter, 0,2 um
Flüssigkeitsvorlagen: Einmalampullen, 25 ml mit Bördelkap- pe und Gummidichtung
Schläuche: Teflonschlauch, 1 mm Innendurchmesser
Kupplungen: LuerLock
Schaumdetektion: isolierte Nadel mit Masseschluß zur
Reaktionsflüssigkeit Ventilsteuerung: Braun Melsungen DCU 3 System
Die Medienbestandteile sind beim einschlägigen Fachhandel in gleicher Qualität erhältlich. Die Bestandteile Glucose und Magnesiumchlorid wurden als geeignete Aliquots separat sterilisiert und anschließend unter stehlen Bedingungen zugegeben. Das Kulturgefäß wurde mit 500 ml Medium befüllt und im Autoklaven sterlisiert. Die Zuleitungen zum Head- space und zur Reaktionsflüssigkeit mit den Düsen wurden durch eine Bohrung im Deckel geführt, verschlossen und ebenfalls mit dem Gefäß mitsterilisiert. Die Trennung zur erfindungsgemäßen Vorrichtung erfolgte am Ausgang der Einlaßventile. Als Flüssigkeitsvorlagen dienten jeweils 24 ml Glucoselösung (100 g/1) und 24 ml Antischaummittel (Dow Silikonöl, 10 % Suspension) , die jeweils separat sterilisiert wurden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung wurde, soweit die einzelnen Bauteile keine andere Befestigung vorsahen, gemäß Zeichnung 1 mit Luer Lock Verbindungen und Teflonschläuchen verbunden und auf einer Arbeitsplatte befestigt. Der Leitungsteil zwischen Luftfilterausgang und Ausgang der Einlaßventile sowie die zu- und Abführungen der Flüssigkeitsvorlage wurden mit 10 m Natronlauge dekontaminiert (2h), und anschließend mit sterilem 0,1 m Phosphatpuffer pH Wert = 7,2, gespült. Nach der Sterilisation und dem Abkühlen des Kulturgefäßes erfolgte die Beimpfung mit einer Reinkultur des Mikroorganismus mit je einem Milliliter unter sterile Bedingungen. Die Reinkultur wurde aus einem Röhrchen mit E. coli, K12, erhältlich bei der deutschen Stammsammlung (DSM Hannover) und Kultivierung des Inhalts dieses Röhrchens in 10 ml Standard 1 Medium (Merck Darmstadt) bei 37 °C über 12 Stunden unter sterilen Bedingungen hergestellt. Die optische Dichte der Reinkultur betrug zum Zeitpunkt der Überimpfung 0,9 OD (546 nm . Die Vorrichtung wurde mit den Einlaßventilen mit dem Kulturgefäß und mit den Modul Gasversorgung gekoppelt. An die Flüssigkeitsvorlage 1 wurde die Glucoselösung, an die zweite das Antischaummittel angeschlossen. Die Flüssigkeitsvorlagen wurden stehend benutzt. Als Anschluß für die Drucküberlagerung wurde eine kurze, für die Flüssigkeitsentnahme eine lange Einmalinjektionsnadel benutzt, die steril durch die Gummidichtung geführt wurde. Am Drucklufteinlaß wurde Pressluft mit einem Überdruck von 0,5 bar angeschlossen. Das Volumen des Gasbehälters wurde auf 25 ml eingestellt. Die gesamte Vorrichtung und das Kulturgefäß wurden in einem Inkubator auf 37 °C temperiert. Das Kulturgefäß wurde nicht geschüttelt, da alleine der Gasstrom für ausreichende Gasversorgung der Kultur sorgte. Die Ventile der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurden mit der Steuereinheit DCU3 verbunden und wie in Tabelle 3 gezeigt, geregelt:
Tabelle 3
Gasversorgung:
Taktrate 15 Füllungen und Gasströme pro Minute, entspricht einem VF von 45 oder 22,5 1 Luft /h, Einlaßventil EVl ge- schlössen, EV 2 offen, d.h. Gasstrom in die Reaktionsflüssigkeit
Flüssigvorlage 1, Substrat:
Taktventil VI, geöffnet viermal pro Minute für 0,2 Sekun- den, zeitgleich mit der Schaltung eines Gasstroms zum Kulturgefäß, DVl zum Kulturgefäß hin offen, EV2 offen, entspricht einer Glucosedosage von 1 mi pro Stunde
Flüssigvorlage 2, Antischaummittel: Taktventil V2 normalerweise geschlossen. Wenn die Aufnehmernadel ein Schaumsignal anzeigt, läuft folgender Algo- rythmus ab: Einlaßventil EV2 wird geschlossen, Einlaßventil EVl geöffnet, d.h. Headspacebegasung Start eines Timers. Ist das Schaumsignal der Aufnehmemadel nach 8 Sekunden negativ, wird das Ventil EVl geschlossen und das Ventil EV2 geöffnet, Rückkehr zum Normalbetrieb. Liegt das Schaumsignal weiterhin an, wird zeitgleich mit jedem Takt der Gasversorgung das Taktventil V2 für 1 Sekunde geöffnet und so Antischaummittel (18,7 ml/h) in den Luftstrom der Gasversorgung gemischt. Liegt das Schaumsignal nach weiteren 16 Sekunden immer noch an, wird das Ventil EV2 zusätzlich geöffnet, um die Kultur wieder mit Gas zu versorgen. Dieser Zustand wird beibehalten, bis das Signal der Aufnehmernadel negativ ist. Danach Rückkehr in den Normalbetrieb .
Nach 24 Stunden wurde die Kultivierung der Mikroorganismen gestoppt und die optische Dichte (OD) bei 546 nm in einem Photometer bestimmt. Die OD von ca. 90 entspricht dem zu erwartenden Wert in einem Hochleistungsfermenter und überzeugte von der Leistungsfähigkeit der Vorrichtung. Die Substratvodage war zu diesem Zeitpunkt gänzlich aufge- braucht. An Antischaummittel wurde ein Verbrauch von etwa etwa 2 ml gemessen, deutlich weniger als die Menge, die ein herkömmlicher Fermenter für diesen Ansatz gebraucht hätte (etwa 12 ml, abhängig von Regelalgorithmus) .
Bei der Durchführung dieses Ausführungsbeispiels waren besonders deutlich zu erkennen:
- Die kompakte, einfache Ausführungsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung
- Die Effektivität des"gepulsten" Begasungssystems in Kom- bination mit der Belüfterdüse
- Die entstehenden, extrem feinen Gasblasen
- Die kurzen Mischzeiten des Systems - Die Leistungsfähigkeit der Schaumbekämpfung durch den erfindungsgemäßen Aufbau
- Die exakte gleichmäßige Dosierung der Flüssigkeiten.
Es soll nochmals darauf hingewiesen werden, das diese Ergebnisse, die denen eines Hochleistungsfermeners entsprechen, ohne Schütteln oder Rühren des Kulturgefäßes erreicht wurden. In Kombination mit Einsätzen, durch Schüttler oder Rührer, läßt sich die Leistungsfähigkeit weiter steigern.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur dosierten Zugabe von einem oder mehreren Fluiden oder Fluidgemischen in ein oder mehrere Kulturgefäße, gekennzeichnet durch die Verwendung von mindestens einem Carrierfluid, das quantitativ, diskontinuierlich aus einem unter Druck stehenden Vorratsgefäß mit definiertem Innenvolumen über ein Taktventil entnommen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Carriergases oder einer Carriergasmischung.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Carrierflüssigkeit oder einer Carrierflüssigkeitsmischung.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, gekennzeichnet dadurch, dass das/die zu dosierende (n) Fluid(e) dem/den Carrierfluid (en) über eine oder mehrere Venturidüsen dosiert zugemischt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, gekennzeichnet dadurch, dass die Zuleitung ins Reaktionsmedium im
Kulturgefäß zur besseren Durchmischung über eine Venturidüse erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, gekennzeichnet dadurch, dass ein Filter o.a. am Seiteneinlass der
Venturidüse im Reaktionsmedium den Eintritt von Mikroorganismen in die Düse verhindert.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, gekennzeichnet durch eine Zuführung in den Headspace des Kulturgefäßes .
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, gekennzeichnet durch eine Vernebelungseinrichtung wie z.B. eine Ausströmdüse am Eintritt in den Headspace.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, gekennzeichnet durch eine Umschaltung der Zuführung ins Kulturgefäß von der Zuführung ins Reaktionsmedium zur Zuführung in den Headspace und zurück.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, gekennzeichnet dadurch, dass das Carriergas oder die Carriergasmischung aus einem Gasbehälter unter Überdruck entnommen wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, gekennzeich- net dadurch, dass der Druck im Gasbehälter während des
Prozesses nach einem oder mehreren Entnahmen einmal oder mehrfach über eine Zuleitung wieder erhöht wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11 zur Dosierung von mehreren Fluiden, gekennzeichnet dadurch, dass diese dem Carrierfluid über verschiedene Venturidüsen in Serien- oder Parallelschaltung, bevorzugt in Parallelschaltung, zugleich oder in beliebiger Reihenfolge zugemischt werden.
13. Vorrichtung zur Dosierung von Gasen oder Flüssigkeiten oder Gemischen daraus zum Einsatz an Kulturgefäßen für biologische und (bio) chemische Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung aus mindestens einem Modul Gasversorgung gemäß Zeichnung 1 oder einem Modul Antriebspumpe gemäß Zeichnung 2 zur Erzeugung eines Carrierfluids, einer Venturidüse mit Taktventil und Flüssigkeitsvorlage mit einer Druckausgleichskapillare, oder einer Dosiervorlage für Gase, und einer Zuleitung, die in der Reaktionsflüssigkeit oder im Headspace des Kulturgefäßes mündet, besteht. Das Modul Gasversorgung oder das Modul Antriebspumpe erzeugt einen Strom von Carrierfluid, kontinuierlich oder diskontinuierlich, über die Zuleitung zum Kulturgefäß hin.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, das das Volumen des Gasbehälters Bl zwischen 1% und
40% des Volumens des Kulturgefäßes beträgt.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, das das Volumen des Gasbehälters durch einen Stempel im Bereich von 0% bis 100% des Gesamtvolumens variiert werden kann.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Taktrate des/der Ven- tils(e) auf den "gas hold up" der Gasblasen im Kulturgefäß abgestimmt werden kann, bevorzugt mit diesem identisch ist und die Menge des durchgesetzten Gases durch Verstellen des Stempels gemäß Anspruch 3 erfolgt.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 1 Modul Flüssigkeitsvorlage oder Gasvorlage gemäß Zeichnung 1 zwischen Dreiwegeventil und Kulturgefäß geschaltet wird.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 17, da- durch gekennzeichnet, daß das Modul Flüssigkeitsvorlage aus mindestens einer Venturidüse und einem Flüssigkeitsbehälter besteht und der Druckausgleich entweder über die Druckausgleichskapillare zum Gasbehälter oder durch eine Verbindung mit der Außenatmosphäre erfolgen kann.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeitsvorlagen beliebig, hängend, stehend, liegend zur Vorrichtung angebracht sind und immer einen Luftraum von mindestens 2% des Gesamtvolumens aufweisen, in den der Druckausgleichs erfolgen kann.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 19, da- durch gekennzeichnet, daß die Gasdosiervorlage mindestens aus einem Gaseinlaß, einem Dreiwegeventil oder 2 Ventilen, einem Gasbehälter mit variablen Innenvolumen
(analog Anspruch 15) besteht und eine Ventilöffnung mit einem Seiteneinlaß einer Venturidüse verbunden ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Abmessungen der Komponenten der Vorrichtung und somit die erfindungsgemäßen Eigenschaften an Kulturgefäße von 1 Milliliter bis 50 Liter Volumen angepasst werden kann.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß mit der Vorrichtung, insbesondere auch gemäß Anspruch 8, bessere Durchmischungen und Austauschraten mit der Reaktionsflüssigkeit er-
5 zielt werden, so daß auf ein Schütteln oder Rühren des Kulturgefäßes, abhängig von der Art der Kultivierung, verzichtet werden kann.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 22, da- 10 durch gekennzeichnet, daß durch die Art der diskontinuierlichen Begasung und des Gaseintrags die Neigung zur Schaumbildung der Reaktionsflüssigkeit reduziert wird.
15 24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Kombination Gas/Flüssigkeitsdosierung, ob in die Reaktionsflüssigkeit oder in den Headspace des Kulturgefäßes, eine kürzere Mischzeit mit der Reaktionsflüssigkeit er-
20 reicht wird und somit Konzentrationsgradienten (z.B. Substrat) minimiert werden.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß insbesondere durch die Do-
25 sierung in den Headspace des Kulturgefäßes eine effektivere Ausnutzung der Eigenschaften der dosierten Flüssigkeiten erfolgt.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 25 , da- 30 durch gekennzeichnet, daß mit dem Einsatz der Vorrichtung der Verbrauch von Antischaummittein minimiert werden kann. Hierfür wird kurzzeitig der Gasfluß in die Reaktionsflüssigkeit abgeschaltet und auf die Ausströmerdüse der Head Space Dosierung geschaltet. Die ausströmende Luft "bläst" den Schaum auf die Flüssigkeitsoberfläche zurück. In den meisten Fällen genügt dieser Effekt, um die Schaumbildung zu reduzie- 5 ren. Im negativen Fall erfolgt eine Dosierung gemäß Anspruch 25, die in Kombination mit diesem Verfahren den Verbrauch von Antischaummittein auf 10 % gegenüber dem Stand der Technik senken kann.
10 27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß so die dosierten Flüssigkeiten oder eine Kombination mehrerer einen Effekt auf die Reaktionsflüssigkeit haben können, z.B. durch zeitabhängige Zugabe von Phagen zu Bakerienkulturen
15 oder Wachstumsfaktoren zu Zellkulturen oder pH Regelung mittels C02.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 27 dadurch gekennzeichnet, daß die in dieser Weise dosierten Gase 20 zur Schaffung einer künstlichen Atmosphäre in head space des Kulturgefäßes, z.B. anaerobe Athmosphäre oder mit C02 angereichert, mit definierter Zusammensetzung benutzt werden.
25 29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung nur mit einer Stromversorgung und Transportmedienversogung verbunden ist und alle meß- und regeltechnischen Parameter mit der Kontroll EDV über Infrarotschnittsteile
30 ausgetauscht werden.
30. Bioreaktor zur Kultivierung von Zellen, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 29, mit einem Kulturgefäß, mit einer oder mehreren Gasversorgungen und/oder einer oder mehreren Flüssigkeitsvorlagen sowie Zuführungseinrichtungen für Gase und/oder Flüssigkeiten, mittels welcher Gase und/oder Flüssigkeiten 5 dem Kulturgefäß zuführbar sind, wobei zwischen der
Zuführungseinrichtung und der Gasversorgung bzw. Flüssigkeitsvorlage eine Mischvorrichtung, insbesondere eine Venturidüse, zur Mischung von Gas und/oder Flüssigkeit aus der Gasversorgung bzw. Flüssigkeitsvorlage 10 geschaltet ist.
31. Bioreaktor nach Anspruch 30, wobei Gas und Flüssigkeit zu einem Aerosol gemischt werden.
15 32. Bioreaktor nach Anspruch 30 oder 31, wobei zwischen der Mischvorrichtung und der Gasversorgung bzw. der Flüssigkeitsvorlage ansteuerbare Ventile, insbesondere Taktventile geschaltet sind.
20 33. Verfahren zum Betrieb eines Bioreaktors nach einem der Ansprüche 30 bis 33, wobei ein Gas oder eine Flüssigkeit als Carrierfluid eingesetzt wird, wobei dem Carrierfluid in der Mischvorrichtung ein Gas oder eine Flüssigkeit zugemischt wird, und wobei die Mengenver-
25 hältnisse der miteinander gemischten Fluide definiert sind und gesteuert oder geregelt werden.
34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die gemischten Fluide in definiertem Mengenstrom dem Kulturgefäß zuge- 30 führt werden.
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