WO2003007990A1

WO2003007990A1 - Agoniste de la myosine

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Publication number: WO2003007990A1
Application number: PCT/JP2001/006210
Authority: WO
Inventors: Junji Ichihara; Mutsuo Taiji; Ryu Nagata; Katsunori Maruta; Kazuhiko Horigome; Shinichi Kojima
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Priority date: 2001-07-18
Filing date: 2001-07-18
Publication date: 2003-01-30

Description

明細書ミオシン作動薬技術分野

本発明はミオシン作動薬、およびその応用に関し、さらに詳しくは、筋肉の主たる構造タンパク質であるミオシンの A T P消費活性を促進する物質、およびその種々の医療分野への応用に関する。以下、本明細書においては、上記物質の糖尿病治療への応用を中心にして本発明を説明する。

背景技術

近年、食生活の欧米化、運動不足、社会的ストレスの増加などにより、糖尿病患者の増加が著しい。経口糖尿病治療剤としてスルホニルゥレア剤（ S U剤）が多用されている。しカゝし、その作用が膝臓におけるインスリン分泌促進作用であることから、副作用として低血糖を引き起こすことなどが知られている。また、 S U剤の多用は膝臓の疲弊による二次無効を引き起こす。近年、再評価されているビグアナィド剤は、末梢組織のィンスリン感受性改善薬として良好な血糖コントロールが可能である。しかし、副作用として乳酸ァシドーシスの発症が懸念されている。また、最近見出されたチアゾリジンジオン系糖尿病治療薬（「糖尿病 2」：日本臨床、第 7 2 5卷、 1 2 5—1 4 5頁 (平成 9年)）は末梢のインスリン抵抗性改善効果を有し、良好な血糖コントロールが可能である。ところが、副作用として重篤な肝臓障害等が報告され、安全性面に問題がある。

一方、糖尿病治療に関して、運動療法はインスリンの感受性を上昇させ、筋肉における糖取り込みゃグリコーゲン合成を促進することから、食事療法と共に治療に実施される非常に重要な治療法である。しかしながら、継続して実施することが難しい。

発明の開示

このような状況下、本発明者らは、副作用の少ない新規な抗糖尿病薬を開発すベく研究を重ねた結果、式（I ) ： Ar'-A¹— N N-L— N— A²— Ar²

\ f \ ^ f

[式中、 A r ¹および A r ²は同一または異なって、各々、置換されていてもよいフェ二ル基または置換されていてもょレヽへテロアリ一ル基を表す；

A¹および A²は同一または異なって、各々、単結合またはアルキレン基を表す；

Lは式：一 C(=O)— X¹— L¹— X²— L²— X³— C( = O)—で表される基、ォキサリル基または力ルポエル基を表す；

X¹および X³は同一または異なって、各々、単結合、 NR¹基または酸素原子を表す；

R¹は水素原子またはアルキル基を表す；

X²は単結合、置換されていてもよいアルキレン基、置換されていてもよいへテロァリレン基、置換されていてもよいフエ二レン基、置換されていてもよいシクロアルキリデン基、置換されていてもよいシクロアルキレン基、置換されていてもよい 2価の脂肪族複素環基、置換されていてもよいビニレン基、ェチニレン基、硫黄原子、酸素原子または式：一 N(R²)— C( = 0)—、一 N(R³)— C(= O)— N(R⁴)—、 _N(R²)_C (=0)— 0—、一 O_C(=0)— O—、一 O— C(=0)_、一 C(=O)—、もしくは一N[_C(=O)_R⁵]—で表される基を表す：

R R³、 R⁴および R⁵は同一または異なって、各々、水素原子またはアルキル基を表す；

L¹および L ²は同一または異なって、各々、単結合、置換されていてもよいアルキレン基、ビニレン基または置換されていてもよいフエ二レン基を表す；ただし、 X²が単結合、置換されていてもよいビ-レン基、ェチ-レン基、硫黄原子、酸素原子または式：一N(R²)— C( = O)—、一N(R³)— C(=0)— N(R⁴)—、 —N(R²)— C (=0)_0—、一 O— C(=0)_〇一、 -O-C (=

O)—、一 C(=0)—、もしくは _N[— C(=0)— R⁵]—で表される基であるときに L¹または L²が単結合となることはない。また、 L¹または L²がビニレン基である場合、それぞれ X ¹または X ³は単結合である ] で表されるジピペラジン誘導体またはその塩が糖尿病治療薬として優れていることを見出し、これを特許出願した（特願平 1 1— 3 2 6 7 5 1、出願日：平成 1 1年 1 1月 1 7日）。しかしながら、本発明者らは、式（I )のジピペラジン誘導体がどのような作用機作により糖尿病治療に有効であるかは、特願平 1 1— 3 2 6 7 5 1の出願時までには+分解明することができなかった。本発明者らは、式

( I )の化合物の作用機作を解明することができれば、さらに有用な糖尿病治療薬の探索が容易になるのではないかと考え、鋭意作用機作の研究にとり組んだ。本発明者らは、アジド化したジピぺラジン誘導体を筋筒細胞の膜画分と混合した後光照射することにより、この誘導体を標的タンパク質と結合させ、これを対照と、電気泳動法により比較することにより、その標的タンパク質がミオシンの軽鎖であることを見出した。ミオシンは筋肉の主な構造タンパク質であり、その軽鎖は筋肉の収縮、弛緩に直接、深く関与していることが知られている。式（I ) のジピペラジン誘導体は、このミオシン軽鎖に結合することにより、ミオシンの AT P消費活性を促進し、それによつて糖尿病治療効果が発揮されると考えられる。すなわち、ミオシンの A T P消費活性が促進されると、細胞内のグルコースが消費され、これを捕うために血中のグルコースが細胞内に取り込まれ、その結果血糖値が低下する。ミオシンの A T P消費活性が促進された状態は、運動を行なった時の効果そのものであり、したがって、式（ I )のジピペラジン誘導体のミォシンの軽鎖への結合は、筋肉において、さらに負荷のかかったエネルギー消費の高い運動を行うことの代替となるものである、ということができる。

以上述べた理由で、ミオシンの軽鎖に結合する物質は、式（I )のジピペラジン誘導体に限らず、すべて糖尿病治療に有効であることは明らかである。さらに、ミォシンの軽鎖に結合する物質は、筋肉細胞の細胞の運動に負荷を与えることからミ才シンの A T P消費活性を促進することになり、その結果、筋肉細胞の運動エネルギーの消費機能を促進することになる。このように、細胞内および血中のグルコースを減少させ、筋肉細胞の運動エネルギーの消費機能を促進することから、このような物質は肥満の解消や高脂血症の改善にも有用である。

一方、ミオシンの軽鎖に結合する物質は、筋肉細胞の運動に負荷を与えること力ら、運動機能が低下、遅延することをもたらすことになる。その結果、筋肉の弛緩を招来することになり、このような物質は高血圧の改善にも有効である。さらには、（文献 Biophysical jurnal 71， 2733—2741， 1996， Yuri Tsuda et al. )の記載にもあるように、局所麻酔剤であるリドカイン、テトラ力インがミオシンモーター活性の低下作用を有すること力ゝら、ミオシンの軽鎖に結合する物質は局所麻酔作用を有し皮下、筋注、経皮的投与することにより局所麻酔剤として使用することができる。

ミオシンの軽鎖に結合し、上記の種々の治療活性を発揮しうる物質は、本発明による発見、すなわち、式（I )のジピペラジン誘導体はミオシンの軽鎖に結合するという事実に基づいて容易にスクリーニングすることができる。すなわち、ミォシンの軽鎖との結合を直接測定するか、あるいは式（I )のジピペラジン誘導体とミオシンの軽鎖との混合物に被検物質を加えた後、遊離の該誘導体またはミオシンの軽鎖を測定することにより、該被検物質がミォシンの軽鎖との結合能を有するか否かを判定することができる。より具体的には、以下の手法でスタリーュングすることができる。

①表面ブラズモン共鳴法によるミオシン軽鎖と相互作用を示す化合物の検索表面プラズモン共鳴法はセンサーチップ表面に結合した分子により、表面層近くでの屈折率に変化が生じ、その変化を表面プラズモンシグナルの変化として検出する方法である。装置として例えばビアコア社の B I A C O R E 2 0 0 0または B I A C O R E 3 0 0 0を使用することにより、相互作用を測定することが可能である。

センサーチップにミオシン軽鎖 (例えば 1〜1 0 μ g )を固定し、被検化合物の溶液をチップ表面に通液し、表面プラズモンシグナルを測定する。被検化合物の溶解に使用した溶液をブランクとし、ブランクに対する表面プラズモンシグナルの増加により、相互作用を確認する。

②ミオシン軽鎖と式（ I )のジピペラジン誘導体の標識体との相互作用を阻害する化合物の検索

ミオシン軽鎖またはミオシン (例えば 1〜 1 0 μ g )をゲル、ビーズ (例えば 1 0 μ 1のアマシャム ·フアルマシア ·バイオテク株式会社製の C N B r活性化セファロース 4 ファストフロー）あるいはメンブラン（例えばミリポア社製のィモビロン一 P トランスファーメンブレン)上に固定し、、被検化合物の溶液と混ぜ、ラジオアイソトープあるいは蛍光ラベルした式（ I )の化合物の溶液と混合静置し、該ゲル、ビーズあるいはメンプランを生理食塩水で洗浄した後に、ラジオアイソトープ量あるいは蛍光を測定する。被検ィヒ合物を含まない対照と比較しラジオアイソトープ量あるいは蛍光の減少により、相互作用を確認する。

以上のことから、本発明の目的は、以下の通り要約することができる。すなわち、本発明は、

( 1 )ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする糖尿病治療剤、

( 2 )ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする筋肉細胞の運動機能促進剤、

( 3 )ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする抗肥満薬、

( 4 )ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする高脂血症治療剤、

( 5 )ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする高血圧治療剤、 ( 6 )ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする局所麻酔剤、

( 7 )式（I )のジピペラジン誘導体を有効成分とする糖尿病治療剤、筋肉組織の運動機能促進剤、抗肥満薬、高脂血症治療剤、高血圧治療剤または局所麻酔剤、

( 8 )センサーチップにミォシンの軽鎖を固定し、被検化合物の溶液をチップ表面に通液した後、表面プラズモンシグナルを測定することからなる、ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物のスクリーニング法、

( 9 )上記（ 8 )のスクリ一ユング法で検出されたミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物、

( 1 0 )ミオシン軽鎖またはミォシン (例えば 1〜 1 0 μ g )をゲノレ、ビーズ (例えば 1 0 μ 1のアマシャム ·フアルマシア■バイォテク株式会社製の C N B r活 †生化セファロース 4 ファストフロー）あるいはメンブラン（例えばミリポア社製のィモビロン一 Pトランスファーメンプレン)上に固定し、、被検化合物の溶液と混合し、次いで標識したミォシンの軽鎖への結合能を有する既知の化合物と混合した後、該ゲル、ビーズまたはメンブランを洗浄し、該標識化合物の残存量を測定することからなるミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物のスクリーユング法、

(11)上記（10)のスクリーニング法で検出されたミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物、

(12)ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とするミオシンの AT P消費活性促進剤、および

(13)ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物が、式（ I )のジピペラジン誘導体である上記（ 12 )に記載の A T P消費活性促進剤、

を提供するものである。

発明を実施するための最良の形態

本発明のミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物とは、式（ I )のジピペラジン誘導体およびそれと同等の結合能を有する化合物を表す。

式（I)の化合物は、既述した通り特願平 1 1— 326751に記載されている力その製造方法の概略は次の通りである。

Ar i— A¹と A r ²— A²とが同一である場合：

製造法（1)

Z-L— Ζ + Pg-N NH ►

v_y

10 11

Pg-N N-L— Ν N-Pg HN N-L— N NH

12 13

15

(式中、 Ar \ A¹および Lは前記式 1の場合と同じ意味を表す。 Yは塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メタンスルホニルォキシ、トルエンスルホニルォキシ、トリフルォロメタンスルホニルォキシ等の脱離基を表す。 Zは水酸基または塩素原子を表す。 P gは保護基を表す）

式 10において Zが水酸基である化合物と式 11の化合物を脱水縮合剤の存在下で縮合させることによって式 1 2の化合物を得る。ここでの縮合反応は、例えばジクロロメタン、クロロホノレム、酢酸ェチノレ、テトラヒドロフラン（T H F)またはジメチルホルムアミド（DM F)等の有機溶媒中で行うことができる。反応温度としては一 1 0 °Cから 6 0 °Cの範囲が挙げられる。脱水縮合剤としては例えばジシク口へキシルカルポジィミド、 1ーェチル一 3—（ 3，一ジメチルァミノプロピル)カルポジイミドなどが挙げられ、反応助剤とともに用いられる。反応助剤としては例えば N—ヒドロキシベンズトリアゾール、 N, N—ジメチルー 4ーァミノピリジン等が挙げられる。また、脱水縮合剤として例えば N, N—ビス（ 2— ォキソ一 3—ォキサゾリジニル）ホスフィン酸ク口リドを例えばトリェチルァミンの様な有機塩基と組み合わせて用いることもできる。 '

式 1 0において Zが塩素原子である場合、式 1 1の化合物を例えばトリェチルァミンの様な有機塩基の存在下式 1 0の化合物と縮合させ式 1 2の化合物に導くことができる。縮合反応は、例えばジクロロメタン、クロ口ホルム、酢酸ェチル、 T H Fまたはジメチノレホノレムァミド等の有機溶媒中で行うことができる。反応温度としては一 1 0 °Cから 6 0 °Cの範囲が挙げられる。

式中 P gで表される保護基としては、通常用いられる各種のアミノ基保護基を用いることが可能であるが、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、 t e r t一ブトキシカルポニル、ベンジルォキシカルボニル等の力ルバメート型の保護基、 N—ァセチル、 N—ベンゾィル等のアミド型の保護基、ベンジル、二トロ、一トノレエンスルホニル、メタンスルホニル等が挙げられる。続いて、保護基 P gを除去することにより式 1 3の化合物を得る。保護基の除去は一般的な方法（例えば、 T. W. Greene and P. G. M. uts, "Protective Groups in

Organic Synthesis", 2nd Ed. , John Wiley and Sons, inc. , New York (1991) , p. 315-362)に従って行うことができる。

式 1 3の化合物を、塩基の存在下、式 1 4の化合物と反応させることで、式 1

5の化合物を製造することができる。反応は、常法の N—アルキル化反応の条件に従って実施することができる。具体的には、塩基としては、例えば、水素化ナトリウム、水素化カリウム等の水素化アルカリ金属、ナトリウムアミド、リチウムアミド等のアルカリ金属アミド、カリウム tーブトキシド、ナトリゥムメトキシド等のアルカリ金属アルコキシド、炭酸力リゥム、炭酸ナトリゥム等の炭酸塩、トリェチルァミンなどの有機塩基等が挙げられる。塩基の使用量としては、例えば、式 1 3の化合物に対して 2〜1 0当量が挙げられ、好ましくは 3〜 5当量が挙げられるが、ただし、式 1 3の化合物が塩酸塩等の塩である場合は、その塩の当量分だけ、塩基を過剰に加える必要がある。式 1 4の化合物の使用量としては、例えば、式 1 3の化合物に対して 2〜 6当量が挙げられ、好ましくは 2 . 2〜 2 当量が挙げられる。反応溶媒としては、例えば、 T H F、 DMF等の不活性有機溶媒等が挙げられる。反応温度としては、例えば、 0 °C〜反応溶媒の沸点が挙げられ、好ましくは室温〜 8 0 °Cの範囲が挙げられる。

製造法（2 )

/~ /~\ _Λ —

HN^ ^ ^-L-N^ ^ ^NH + Ar¹-A-CO-R¹⁰ ——

13 ⁸

Ar¹— A-CH-N N— L— N N-CH-A-Ar

\ _ / \ ^ /

17

(式中、 A r ¹および Lは前記式 1の場合と同じ意味を表す。 R ¹ °は水素原子またはアルキル基を表し、式：一 A— C (R ^{1 0}) H—で表される基は前記式 1の A ¹ がアルキレン基である場合に相当する）

本発明化合物に含まれる式 1 7の化合物は、前記式 1 3の化合物と式 1 8のァルデヒド化合物またはケトン化合物を用いて、水素化ホウ素ナトリゥムゃ水素化シァノホゥ素ナトリウムなどの存在下メタノールなどのアルコール溶媒中、室温で行う還元的ァミノ化反応あるいは水素化ァセトキシホウ素ナトリウムとジクロロェタン等のハロゲン化炭化水素中、室温で行う還元的ァミノ化反応によっても合成することができる。

製造法（3 )

7-—7 + Ar¹— Α¹-

10 16-1 15 (式中、 Z、 L、 A r ¹および A ¹は前記式 1の場合と同じ意味を表す）本発明化合物 1 5は式 1 0の化合物と式 1 6 _ 1のピペラジン誘導体を前述の化合物 1 0と 1 1との縮合反応と同様の条件で縮合させることによつても合成することができる。

製造法（4 )

Η-Χ¹ _¹-Χ²- Χ³-Η 19-1 Ar 1'-A 1¹— Ν Ν-1 -Ν Ν-Α¹— Ar¹

15

Γ~\ CO(OCCI₃)₂ 19-1 / \ / \

Pg-N ΝΗ ^; ► ► Pg-N N-L— Ν Ν一 Pg

\_^

11 12

(式中、 A r A \ X ¹、 X ²、 X 3 L ¹および L ²は前記式 1の場合と同じ意味を表す。但し、 X ¹または X ³が単結合である場合を除く。また、上記化合物 1 2および 1 5においては、 Lがォキサリル基またはカルボ-ル基である場合を除く。 Y ¹は塩素原子または一 0— C C 1 ₃を表す）

X ¹および X ³が N R ¹または酸素原子であるとき、式 1 6—1のピペラジン誘導体にへキサクロロジメチルカルボナート（トリフォスゲン）を作用させて式 2 0 - 1の活性中間体を生成させ、続いて、式 1 9一 1の化合物と塩基の存在下反応させることで式 1 5の本発明化合物を得る力、または式 1 1の化合物にへキサクロロジメチルカルボナート（トリフォスゲン）を作用させ、続いて式 1 9— 1の化合物と塩基の存在下に反応させることで式 1 2の保護されたピペラジン誘導体を得ることができる。

塩基としては、例えば、水素化ナトリウム、水素化力リゥム等の水素化アル力リ金属、ナトリゥムアミド、リチウムアミド等のアルカリアミド、カリウム t一ブトキシド、ナトリウムメトキシド等のアル力リ金属アルコキシド、炭酸力リゥム、炭酸ナトリウム等の炭酸塩、トリェチルァミンなどの有機塩基等が挙げられる。式 16—1の化合物または式 11の化合物とへキサクロロジメチルカルボナート（トリフォスゲン）との反応およびそれに続く式 19一 1の化合物との反応の反応溶媒としては、例えば、 THF、 DMF等の不活性有機溶媒等が挙げられる。へキサクロロジメチルカルボナート（トリフォスゲン）との反応の反応温度としては、例えば、 0°C〜室温の範囲が挙げられる。式 19_ 1の化合物との反応の反応温度としては 0 °C〜反応溶媒の沸点が挙げられ、好ましくは室温〜 80 °Cの範囲が挙げられる。

式 12の保護されたピペラジン誘導体からは前述の方法によつて本発明化合物に導くことができる。

製造法（5)

_CO(OCCl3)2 16-1 _Ari,_Ai__N- 、_Ν一し— Ν' 、_Ν— —

Η-χ^ι χ ι χ³-!·)

19-1 15

CO(OCCI₃)₂ 11

Η-Χ' ■¹-Χ²- ■²-Χ³-Η Pg-N N-L— N-Pg

19-1

12

(式中、 X¹、 X²、 X³、 L¹および L ²は前記式 1の場合と同じ意味を表す。伹し、 X¹または X³が単結合である場合を除く。また、上記化合物 12および 1 5においては、 Lがォキサリル基またはカルボニル基である場合を除く）

X ¹および X ³が NR¹または酸素原子であるとき、式 19—1の化合物にへキサクロロジメチルカルボナート（トリフォスゲン)を作用させて式 Y ¹一 C 0— X ェ一ぃ一 ²— L²— X³— CO— は前記と同じ意味を表す)で表される活性中間体を生成させた後、続いて、塩基の存在下で式 16—1の化合物と反応させることで式 15の本発明化合物を得る力、、または塩基の存在下で活性中間体を式 11の化合物と反応させることで式 12の保護されたピペラジン誘導体を得ることができる。

塩基としては前記製造法 ( 4 )の場合と同様な例を挙げることができる。

式 19— 1の化合物とへキサク口口ジメチルカルボナート（トリフォスゲン)との反応の反応溶媒としては、例えば、 THF、 DMF等の不活性有機溶媒等が挙げられ、反応温度としては、例えば、 0°C〜室温の範囲が挙げられる。製造法（6)

1 1 9 9 3 CO(CCI₃)₂ 16-1

HO-CO-X¹-L¹-X²-L²-X³-H _―——►

21

HO— CO ~ X CO一 N N- -A¹—— Ar¹

22-1

16-1

Ar¹-A¹— N N-L— N vl 卜 N-A¹— Ar¹

15

(式中、 Ar A X¹、 X²、 X³、 L¹および L ²は前記式 1の場合と同じ意味を表す。但し、 X¹または X³が単結合である場合を除く。また、上記化合物 15においては、 Lがォキサリル基またはカルポニル基である場合を除く）式 21において X ³が N R ¹または酸素原子である化合物を出発原料に用 1ヽる場合、初めに式 21の化合物にへキサク口口ジメチルカルボナート（トリフォスゲン）を作用させ活性中間体を生成させた後、続いて、式 16— 1の化合物と塩基の存在下反応させることで式 22— 1の化合物を得る。ここでへキサクロロジメチルカルナ一 1、（トリフォスゲン)を作用させる際の条件と式 16― 1の化合物と塩基の存在下反応させる際の条件は前述と同様である。式 22—1の化合物と式 16—1の化合物を前述の縮合条件を用いて縮合させることで式 15の本発明化合物を得る。この一連の反応で式 16—1の化合物の代わりに前記式 11の化合物を用い後に脱保護を行えば、前記式 13の化合物を得ることができる。式 13の化合物は前述のように式 15の本発明化合物に導くことができる。

製造法（7) Ar¹— A¹-N NH + CO(OCCI₃)₂ ►

16-1

23-1

(式中、 A r ¹および A ¹は前記式 1の場合と同じ意味を表す）

製造法 1で述べた方法で本発明化合物である式 2 3一 1の化合物を製造するのは困難な場合がある。その場合、本発明化合物である式 2 3—1の化合物は式 1 6— 1の化合物に、塩基の存在下、 6分の 1から 5分の 1当量のへキサクロロジメチルカルボナート（トリフォスゲン）を作用させることで得ることができる。塩基としてはトリェチルァミンなどの有機塩基等が挙げられる。反応溶媒としては、例えば、 T H F、 DMF等の不活性有機溶媒等が挙げられる。反応温度としては、例えば、 0 °C〜室温の範囲が挙げられる。

A r A ¹と A r ²—A ²とが異なる場合：

製造法（8 )

(1)

/™ \ I \ Ar¹-A¹-Y , , / ~ \ / " \

HN N-L— N NH ► Ar¹-A¹— N—L— N NH

\ ^ / 。 \ ^ / \ _ / \ ^ /

13 ► Ar¹-A¹— N N-L— N N-A²— Ar^

\ _ / \ _ /

1

(3)

. , / " \ , 1) H-L-H 19

Ar -A¹— N N-CO-Y¹ —― 1

20-1 2) Αι^-Α²— N N-CO-Y¹

20-2

16-2

► 1

(5)

Ar¹-A¹— N N-CO-Y¹ + A ²— N NH >

20-1 16-2

Ar¹— A¹— N N-CO-N N - A²— Ar²

\ _ / \ _^ /

23

(式中、八！"¹、 A\ X¹、 X²、 X³、 L、 L¹およびし²は前記式 1の場合と同じ意味を表す。但し、上記方法（3)および方法（4)においては、 X¹または X³ が単結合である場合と、 Lがォキサリル基またはカルボュル基である場合とを除 <)

例えば、

(1)式 13の化合物に 1当量の Ar i—Ai— Yを作用させ、続いて生成物にさらに 1当量の A r ²— A²— Yを作用させることによって式 1の本発明ィ匕合物を得ることができる。反応条件としては前述の N—アルキル化の条件を用いることができる。

(2)式10の化合物と 1当量の式 16—1の化合物を反応させ、続いて生成物にさらに 1当量の式 16— 2の化合物を作用させることによって式 1の本発明化合物を得ることができる。反応条件としては前述の縮合反応の条件を用いることができる。

(3)式 19において、 X¹および X³が NR¹または酸素原子であるとき、トリエチルァミンなどの有機塩基の存在下、式 19の化合物と式 20— 1の活性中間体とを反応させ、続いて式 20— 2の活性中間体を作用させることで式 1の本発明化合物を得ることができる。反応溶媒としては、例えば、 THF、 DMF等の不活性有機溶媒等が挙げられる。反応温度としては 0°C〜反応溶媒の沸点が挙げられ、好ましくは室温〜 80°Cの範囲が挙げられる。式 20— 1ぉょぴ式 20— 2 の活性中間体の発生方法は式 2 0の化合物の場合と同様である。

( 4 )式 2 1において X ³が N R ¹または酸素原子である化合物を出発原料に用いる場合、式 2 1の化合物に初めにへキサクロ口ジメチルカルポナート（トリフォスゲン)を作用させ活性中間体を生成させた後、続いて、式 1 6—1の化合物と塩基の存在下反応させることで式 2 2— 1の化合物を得る。ここでへキサクロ口ジメチルカルボナート（トリフォスゲン）を作用させる際の条件と式 1 6— 1のィ匕合物と塩基の存在下反応させる際の条件は前述と同様である。式 2 2—1の化合物と式 1 6— 2の化合物を前述の縮合条件を用いて縮合させることで式 1の本発明化合物を得る。

( 5 )式 2 3の本発明化合物を得る場合、初めに前述のように式 2 0—1で表される活性中間体を生成させこれに式 1 6— 2の化合物を塩基の存在下反応させるとよい。塩基としてはトリエチルァミンなどの有機塩基等が挙げられる。反応溶媒としては、例えば、 T H F、 DMF等の不活性有機溶媒等が挙げられる。反応温度としては、例えば、 0 °C〜室温の範囲が挙げられる。

上記方法（1 )〜（3 )にぉぃて、基 Lが非対称の場合には式 1の化合物はそのような非対称化合物の混合物として得られるが、カラムクロマトグラフィ一を用いる精製法、蒸留による精製法、あるいは、再結晶法などの通常の精製法により、各化合物を分離精製することができる。

A r i— A ¹と A r ² _A ²とが異なる本発明化合物を得るためには、通常の保護および脱保護の技術を用いたほうが好ましい場合もある。通常の保護、脱保護の技術は T. . Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd Ed. , John Wiley and Sons, inc. , New York (1991)に詳しく述ベられている。また、本発明化合物を合成する際必要に応じていつでも保護、脱保護の技術を用いることもできる。

式 1のジピペラジン誘導体は、例えば水、メタノール、エタノール、アセトン等の溶媒中で、薬学上許容される酸、例えば塩酸、シユウ酸、メタンスルホン酸などと混合することで、塩にすることができる。

以上のようにして得られる式 1のジピペラジン誘導体もしくはその塩、およびその製造中間体は、通常行われる一般的方法により精製することができる。そのような精製法としては、例えばカラムクロマトグラフィーを用いる精製法、蒸留による精製法、あるいは、再結晶法を用いることができる。

なお、上記式 1のジピペラジン誘導体における各基は具体的には下記のものが含まれる。

置換されていてもよいへテロアリール基の、「ヘテロァリール基」としては、例えば 1〜 3個の窒素原子、酸素原子および/または硫黄原子を含有する単環もしくは 2環の 5〜 7員のへテロアリール基が挙げられる。具体的にはピリジル、ピヲジル、ピリダジニル、イソチアゾリル、ピロリル、フリル、チェニル、チアゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、チアジァゾリル、ピラゾリル、ォキサゾリル、ィソォキサゾリル、チォフエニル、ピラジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、イミダゾロン一 1—ィル、ォキサジァゾリル、トリアゾリノン一^ ( レ、ビラニル等の単環のへテロアリール基、並びに、インドリル、クロメ-ル、キノ .リグレ、イソキノリノレ、キノリュノレ、ベンゾフリノレ、ベンゾチェエノレ、ベンズォキサゾリノレ、ベンゾチアゾリ/レ、ベンズイソキサゾリノレ、ベンズイソチアゾリノレ、ベンゾトリァゾリル、ベンズィミダゾリノレ、 1， 3—ベンゾジォキソリノレ、 2 , 3

—ジビドロ一 1， 4—ベンゾジォキシニノレ等の 2環のへテロァリール基等が挙げられる。

置換されていてもよいフエニル基、置換されていてもよいへテロァリ一ノレ基、置換されていてもよいへテロァリレン基、および置換されていてもよいフエニレン基における「置換基」としては、例えば下記の置換基が挙げられ、これらの任意の 1または複数の置換基で置換してもよい。

置換基：水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、シァノ基、ニトロ基、アルキル基、アルコキシ基、力ルバモイル基、スルファモイル基、アルカノィル基、アルカノィルォキシ基、アルカノィルァミノ基、アルコキシカルボニル基、アルコキシ力ルポニルァミノ基、アルキルスルホニル基、アルキルチオ基、ウレイド基、ハロゲン置換アルキル基、ハロゲン置換アルコキシ基、アルキル置換力ルバモイル基等（なお、これらの置換基は、ここに記載の他の置換基によって置換されていてもよい)。好ましい「置換基」の例としては、ハロゲン原子、シァノ基、ハロゲン置換アルキル基およびハロゲン置換アルコキシ基、アルキル基、アルコキシ基、力ルバモイル基、アルキル置換力ルバモイル基等が挙げられる。

ァノレキレン基としては、例えば、炭素原子数 1〜6の直鎖状または分枝鎖状のアルキレン基が挙げられる。具体的には、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、へキサメチレン、メチルメチレン、ェチルメチレン、ジメチノレメチレン、 1， 1ージメチノレエチレン、 1 , 2—ジメチノレエチレン、 1ーメチノレトリメチレン、 2—メチノレトリメチレン、 1， 1一ジメチノレトリメチレン、 1 , 2—ジメチルトリメチレン、 1 , 3—ジメチルトリメチレン、 2 , 2—ジメチノレトリメチレン、 1—ェチノレトリメチレン、 2—ェチルトリメチレン等が挙げられる。

炭素原子数 3〜5のアルキレン基は直鎖状または分枝鎖状であってよく、具体的には、例えばトリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ェチルメチレン、ジメチルメチレン、 1， 1—ジメチノレエチレン、 1， 2—ジメチノレエチレン、 1ーメチノレトリメチレン、 2—メチノレトリメチレン、 1， 1—ジメチ /レトリメチレン、 1， 2—ジメチルトリメチレン、 1 , 3—ジメチ /レトリメチレン、 2 , 2 - ジメチルトリメチレン、 1ーェチルトリメチレン、 2一ェチルトリメチレン等が挙げられる。

炭素原子数 2〜1 0のアルキレン基は直鎖状または分枝鎖状であってよく、具体的には、例えばエチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、へキサメチレン、ヘプタメチレン、ォクタメチレン、ノナメチレン、デカメチレン、メチノレメチレン、ェチノレメチレン、ジメチノレメチレン、 1 , 1ージメチノレエチレン、 1， 2—ジメチルエチレン、 1—メチノレトリメチレン、 2—メチノレトリメチレン、 1 , 1—ジメチルトリメチレン、 1， 2—ジメチルトリメチレン、 1， 3 _ジメチノレトリメチレン、 2， 2—ジメチノレトリメチレン、 1—ェチノレトリメチレン、 2—ェチノレトリメチレン、 1 , 1—ジェチノレトリメチレン、 1 , 2—ジェチルトリメチレン、 1 , 3—ジェチルトリメチレン、 2 , 2—ジェチノレトリメチレン等が挙げられる。

炭素原子数 3〜1 0のアルキレン基は直鎖状または分枝鎖状であってよく、具体的には、例えばトリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、へキサメチレン、ヘプタメチレン、ォクタメチレン、ノナメチレン、デカメチレン、ェチノレメチレン、ジメチルチレン、 1， 1ージメチルエチレン、 1 , 2—ジメチルェチレン、 1—メチノレトリメチレン、 2—メチノレトリメチレン、 1 , 1—ジメチゾレトリメチレン、 1， 2—ジメチルトリメチレン、 1， 3—ジメチルトリメチレン、 2， 2—ジメチノレトリメチレン、 1ーェチノレトリメチレン、 2—ェチノレトリメチレン、 1 , 1ージェチノレトリメチレン、 1 , 2—ジェチノレトリメチレン、 1 , 3—ジェチルトリメチレン、 2， 2—ジェチルトリメチレン等が挙げられる。

アルキル基としては、例えば炭素数 1〜 6の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル、ェチル、プロピル、 1ーメチルェチル、ブチノレ、 2—メチノレプロピル、 1， 1ージメチノレエチノレ、ペンチル、 3—メチノレブチル、へキシノレ、 4—メチノレペンチル等が挙げられる。

ハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。

ハ口ゲン置換アルキル基およびノヽ口ゲン置換アルコキシ基とは、それぞれ 1または複数のハ口ゲン原子が置換したアルキル基およびアルコキシ基を意味し、好ましい例としては、それぞれ例えばトリフルォロメチル、トリフルォロメトキシ等が挙げられる。

アルコキシ基としては、例えば炭素数 1〜 6の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルコキシが挙げられ、具体的にはメトキシ、エトキシ、プロボキシ、 1—メチノレエトキシ、ブトキシ、 2—メチルプロポキシ、 1 , 1—ジメチルエトキシ、ペントキシ、 3一メチルブトキシ、へキソキシ、 4ーメチノレペントキシ等が挙げられる。アルカノィル基としては、例えば炭素数 1〜6の直鎖状もしくは分岐鎖状のァルカノィル基が挙げられ、具体例としてはホルミル、ァセチル、プロパノィル、 n—ブタノィル及びビバ口ィルが挙げられる。

アルキル置換力ルバモイル基としては、具体的にはェチルカノレバモイル、ジメチルカルバモイル等のモノ一もしくはジーアルキル力ルバモイルが挙げられる。置換されていてもよいアルキレン基、置換されていてもよい炭素原子数 3〜 1 0のアルキレン基、置換されていてもよい炭素原子数 2〜1 0のアルキレン基、置換されていてもよい炭素原子数 3〜 5のアルキレン基、置換されていてもよいシクロアルキリデン基、および置換されていてもよいシクロアルキレン基の「置換基」としては、例えばノヽロゲン原子、水酸基、アルコキシ基等が挙げられる。置換されていてもよいビニレン基の「置換基」としては、例えばアルキル基、ハロゲン原子等が挙げられる。ビニレン基とじてはシス一またはトランス一ビニレン基が挙げられる。

フエ二レン基としては 1， 2—フエ二レン基、 1， 3—フエ二レン基、 1， 4— フエ二レン基が挙げられる。

ヘテロァリレン基としては、例えば窒素原子、酸素原子および硫黄原子から選ばれるへテロ原子 1〜 2個を含有する単環の 5〜 6員へテロアリレン基が挙げられる。具体的にはピリジン一ジィル、ピラジン一ジィル、ピリミジン一ジィル等のへテロ原子として 1〜 2個の窒素原子のみを含有する単環の 6員環へテロァリレン、並びに、イソチアゾーノレージィノレ、ピロ一ノレ一ジィノレ、フランージィノレ、チォフェンージィル、チアゾーノレージィノレ、イミダゾーノレージィノレ、チアジアゾ一ノレージィノレ、ピラゾーノレ一ジィノレ、ォキサゾーノレ一ジィノレ、イソォキサゾーノレ ―ジィル、ィミダゾ口ン一ジィル、ォキサジァゾールージィル等の単環の 5員環ヘテロァリレン基等が挙げられる。

2価の脂肪族複環基としては、例えば窒素原子、硫黄原子および酸素原子からなる群から独立して任意に選択される 1〜 3個のへテロ原子を含む 5員環または 6員環の 2価の脂肪族複素環基等が挙げられる。 2価の 5員環脂肪族複素環基の具体例としては、例えばピロリジンージィル、ピロリンージィル、イミダゾリジンージィル、ビラゾリジン一ジィル、テトラヒドロフランージィル、テトラヒドロチォフェンージィル、ジォキソラン一ジィル等の窒素原子、硫黄原子および酸素原子からなる群から独立して任意に選択される 1または 2個の原子を含む 2 価の 5員環脂肪族複素環基が挙げられる。 2価の 6員環脂肪族複素環基として具体的には、例えばピぺリジン一ジィル、ピぺラジン一ジィル、モルホリン一ジィル、テトラヒドロピラン一ジィル、ジォキサン一ジィル等の窒素原子、硫黄原子および酸素原子からなる群から独立して任意に選択される 1または 2個の原子を含む 2価の 6員環脂肪族複素環基が挙げられる。

置換されていてもよい 2価の脂肪族複素環基の「置換基」としては、例えばァルキル基、ォキソ基等が挙げられる。シクロアルキリデン基としては、例えばシクロプロピリデン基、シクロブチリデン基、シクロペンチリデン基、シクロへキシリデン基などの炭素原子数 3〜 6 のシクロアルキリデン基が挙げられる。

シクロアルキレン基としては、例えばシクロプロピレン基、シクロブチレン基、 1， 2—シクロペンチレン基、 1， 3—シクロペンチレン基、 1， 2—シクロへキシレン基、 1 , 2—シクロへキシレン基、 1， 3—シクロへキシレン基、 1，4一シク口へキシレン基などの炭素原子数 3〜 6のシクロアルキレン基が挙げられる。ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物を治療に使用する場合には、これを医薬組成物とし、経口的または非経口的 (例えば、静脈内、動脈內、皮下、もしくは筋肉内注射、局所的、経直腸的、経皮的、または経鼻的）に投与することができる。経口投与のための組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤などが挙げられ、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射用水性剤、もしくは油性剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤、持続性製剤などが挙げられる。これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、製剤分野において通常使用される無毒性力つ不活性な担体もしくは賦形剤を含有することができる。このような剤形は、医薬として許容される通常の担体、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤と本発明の有効成分を配合することにより製造することができる。投与量、投与回数は、患者の症状、症歴、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、例えば成人 (体重 6 0 k g )に経口投与する場合、通常、 1日当たり 1〜 3 0 0 m g、好ましくは 1〜5 O m gの範囲で適宜調整して、一回または数回に分けて投与することができる。

以下に製造例および実施例をあげて本発明をより詳細に説明する。

製造例 1

4一 [ 4— (トリフルォロメチル)ベンジル]一 N— [ 4— ( { 4— [ 4一（トリフルォ口メチル）ベンジル]一 1一ピぺラジュル}カルボ-ノレ）フエニル]一 1一ピペラジンカルボキサミドの合成

( 1 ) 4一 [ ( 1一ピペラジニルカルボ-ル)ァミノ]安息香酸の合成

トリホスゲン（2 . 9 7 g、 1 0 . O mm o 1 )を丁11 （1 O m l )に溶かして 0°Cで撹拌し、 p—ァミノ安息香酸（2.74 g、 20. Ommo 1)の THF (1 80ml)溶液を 1時間かけて滴下した。そのまま 0 °Cで 1時間撹拌した後、 1 —ピペラジンカルボン酸 t e r t—プチル（5.60 g、 30. Ommo 1 )を加えて室温で 30分間撹拌した。反応を飽和重層水を加えて終結させ、水層を酢酸ェチルで洗浄した。水層を濃塩酸を少しずつ加えて pH3〜4にして、 THFで抽出した。 THF層は 1Nの希塩酸で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去すると、標題化合物を白色固体として（5.08 g、 14. 5mmo l、 7 2. 7%)得た。

¾ NMR (CDC1₃， 300 MHz) δ 8.92 (s, 1 Η)， 7.82 (d， 2 Η， J = 8.8 Hz), 7.58 (d, 2 H, J = 8.8 Hz), 3.45一 3.43 (m， 4 H), 3.37 - 3.35 (in, 4 H),

1.42 (s, 9 H)

(2) 4— [4— ({[4_( t e r t _ブトキシカルボ二ル）一 1—ピペラジニル]力ルポ二ノレ }ァミノ）ベンゾィノレ]— 1—ピぺラジンカルボン酸 t e r t一プチルの合成

4_[(1ーピペラジニルカルボエル）ァミノ]安息香酸（5.06 g、 14.5m mo 1)を DMF6 Omlに溶力し、 1—ピぺラジンカルボン酸 t e r t—プチノレ（2.98 g、 15. 9mmo l)、 1—ェチノレ _ 3—（ 3，ージメチルァミノプロピル）カルポジィミド塩酸塩 (WS C I—塩酸塩、 3.34 g、 17.4mmo 1 ) 1ーヒドロキシベンゾトリァゾール（ 2.35 g、 17.4mmo 1 )、トリェチノレァミン（2.4ml、 17mmo 1)を順次加えて室温で 27時間撹拌した。飽和重層水を加えて、反応を終結させ、酢酸ェチルで抽出した。これを飽和重層水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸ェチル：へキサン =2 ： 1→3 ： 1)で精製し、標題化合物を白色固体として 4.90 g (9.47mmo 1 , 65. 3%)得た。

¾ NMR (CDC1₃, 300 MHz) δ 7.41 - 7.34 (m, 4 H)， 6.53 (s， 1 H), 3.51 -

3.44 (ra， 16 H)， 1.48 (s, 9 H)， 1.47 (s, 9 H)

( 3 ) N— [ 4—（ 1 _ピペラジニルカルポニル）フェュノレ]— 1—ピペラジンカルボキサミドの合成

4-[4-({[4-( t e r t—ブトキシカノレポ二ノレ）_ 1ーピぺラジュノレ]力ノレボニル }ァミノ）ベンゾィノレ]— 1—ピぺラジンカルボン酸 t e r t—プチル（4. 90 g、 9.47mmo 1 )を酢酸（6 Om 1 )に溶かして、 4 N塩化水素 Zジォキサン（ 20 m 1 )を加え、 30分間 50 °Cで撹拌した。溶媒を留去して、トルエン、メタノールで数回、酢酸を共沸留去することにより、標題化合物を白色固体として（4.46 g、 11.4mmo l、 100%)得た。

(4)目的化合物の合成

( 3 )で得た N— [ 4— ( 1—ピペラジ-ルカルポエル）フェニル]— 1—ピペラジンカルボキサミド（1 10mg、 0.282mm o 1 )を DMF ( 6 m 1 )に溶かして、炭酸カリゥム（195mg、 1.4 lmmo 1 )および 4— (トリフルォロメチル)ベンジルブ口マイド（270mg、 1.13 mm o 1 )を力 tlえて 50。Cで 5時間撹拌し、室温で終夜撹拌した。水を加えて反応を終結させ、酢酸ェチルで抽出した。飽和重層水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した。残さをクロ口ホルムに溶かして、シリカゲノレ力ラムクロマトグラフィー（酢酸ェチル：メタノール =20 ： 1→10 ： 1)で精製することで、標題化合物（69. 7 mg、 O. 110mmo l、 39.0 %)を白色固体として得た。

¾腳 R (CDC1₃, 300 MHz) 8 7.60 - 7.57 (ra, 4 H), 7.47 - 7.43 (m, 4 H)， 7.37 - 7.27 (ra, 4 H)， 6.88 (s, 1 H)， 3.58 - 3.51 (ra, 12 H), 2.49 - 2.46 (m, 8 H)

製造例 2

4— ( 4一アジドベンジル）一N— (4— {[4一（4一アジドべンジノレ） _ 1—ピぺラジ -ル]カノレポ-ノレ }フェ二ノレ）一 1一ピペラジンカルボキサミドの合成

( 1) 4—アジドベンジルアルコールの合成

4ーァミノべンジルアルコール（4. 93 g、 40. Ommo 1)を 25m 1の 4. 3 N希塩酸に溶かし、 0。Cで攪拌した。この溶液に、亜硝酸ナトリウム（ 2.90 g、 42.0 mm o l)を 10mlの蒸留水に溶かした水溶液を滴下した。そのまま、 0°C攪拌を 2時間続けた後、濾別して濾液を 0°C攪拌しながら、アジ化ナトリゥム（2, 73 g、 42. Ommo 1)を 1 Om 1の蒸留水に溶かした水溶液を滴下した。滴下後、室温でさらに 2時間攪拌した。酢酸ェチルを加えて抽出し、有機層を飽和重曹水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去して標題化合物を褐色結晶として 5. 12 g (34. 3mmo 1, 85.8%)得た。 ¾ NMR (CDC1₃， 300 MHz) S 7.36 (d， 2 H, J = 8.1 Hz) , 7.02 (d, 2 H, J = 8.1 Hz)， 4.67 (s， 2 H)

(2) 4— (4—アジドベンジル）一 N— (4— {[4ー（4—アジドベンジル）一 1― ピペラジニノレ]カノレポ二ノレ }フエ二ノレ） - 1 -ピペラジン力ノレボキサミドの合成上記（1)の化合物（99.0mg、 664/xmo l)を 5mlの THFに溶かして、 0°Cで攪拌した。この溶液に、メタンスルホ二ノレクロライド（83. 7m g、 730 /mo l)、トリエチノレアミン（300 μ 1、 2.2 mm ο 1 )をゆっくりカロえた。 0でで 2時間攪拌した後、参考例 2の化合物（143mg、 366/ mo 1)を加えた。続いて、 40°Cに加熱して、 2時間攪拌した。飽和重曹水で反応を終結させ、酢酸ェチル—トルエン（2 ： 1)で抽出した。飽和重曹水で洗浄して、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（齚酸ェチル：メタノール =40 ： 1→10 ： 1)で精製して、標題化合物を白色結晶として、 37. Omg (63.8 Aimmo 1、 17.

4%)得た。

^XH NMR (CDC1₃, 300 MHz) δ 7.38-7.29 (m, 8 Η), 7.01 (d, 2 Η, J = 3.3 Hz) , 6.98 (d, 2 H, J = 3.3 Hz), 6.54 (s， 1 H)， 3.80—3.45 (m, 8 H)， 3.51 (s， 2 H), 3.49 (s, 2 H), 2.49-2.35 (m, 8 H)

実施例 1

製造例 1の化合物の糖消費促進作用

(1)細胞の調製

L 6細胞を 6 X 10³細胞 Zゥェルの濃度で 96穴プレートに播種し、 10 % FBS、 a-MEM(High Glucose)培地で十分コンフルェントになるまで培養した。 D a y 0に培地を 2%FB S、 a—MEM (High Glucose)培地に交換し、 D a y 2および D a y 3の細胞を筋筒細胞として使用した。

(2)薬物添加

製造例 1の化合物を使用直前に 2 % F B S、 a -MEM (High Glucose)培地で希釈した。細胞プレートの培地を除去し、希釈した化合物溶液を各ゥエルに添加した。 C0₂インキュベーターで約 24時間培養した。 ( 3 )培養上清中ダルコース消費量測定

培養後の培養上清を回収し、 0.1%SDSを含む生理食塩水で希釈し、攪拌した。希釈したサンプルを、 96穴プレートに分注した反応液（グルコース C I Iテストヮコ一、和光純薬 439-90901)に添加し、攪拌後室温で 15分放置した。 505 nmの吸光度と 750 nmの吸光度（バックグラウンドのコントロール)の差を測定し、標準品（キット付属のスタンダードより調製、濃度 10 0-50 Omg/d 1 )から求めた検量線に内挿して、グルコース濃度を求めた。

(4)結果の解析

陽性コントロール（メトホノレミン塩酸塩 10 mM)によるダルコース消費の変動幅 (促進量）を基準（ 100 %)として計算した製造例 1の化合物によるグルコース消費の変動幅を以下の表に示す。

実施例 2

製造例 1の化合物の血糖値低下作用

(1)使用動物

日本クレアより 7週齢の雌性 d b/d bマウス（体重約 35 g、 S PFグレード）を購入した。 C E— 2飼料（日本クレア）、および上水（ォートクレーブ滅菌）を自由摂取させ、標準の大ケージにて予備飼育を 1週問行った後、実験に使用した (実験開始時は 8週齢)。

(2)投与用薬物の調製

投与用薬物は粉末 C E一 2飼料に、製造例 1の化合物を 0.001%、 0.00 3%、 0.01%の割合で混合した。

(3)実験スケジュール

実験開始 3前日（Da y O)に HbAl c値を測定し、実験当日（D a y 1 )に血糖値と体重を測定し、 HbAl c値と血糖値と体重をもとに偏りがないよう 1群

6匹に群分けし、標準の中ケージに個別飼育で実験を開始し、 14日間混餌投与を行った。 14日目に 2時間絶食させた後、尾静脈より採血し、アントセンス I

I (バイエル '三共）を用いて血糖値を測定した。結果を以下の表に示す。製造例 1の化合物

0 0.001 0.003 0.01 混餌量 (％) 血糖値 (m_g/ d 1) 420±71 269±85 130±27 89 ±29 実施例 3

本発明化合物の対象となる結合タンパク質の解析

製造例 2のアジド体を L 6細胞 (筋筒細胞）の膜画分と混合した対照サンプルおよび製造例 2のアジド体を L 6細胞の膜画分と混合した後に光照射によりクロスリンクさせたサンプルについて、タンパク質の変動を SDS— PAGE法により比較した。変動の認められたタンパク質を酵素消化し、マススペクトル解析するぺプタイド ·フィンガープリント法により同定した。

(1)実験方法

( i)製造例 2のアジド体の L 6細胞タンパク質へのクロスリンク

L 6細胞（ラット筋細胞） T 15 OX 10プレート分を冷 P B Sで 2回洗浄した。セスクレイパーにて細胞を回収し、 50ml遠沈管に入れ、 4°Cで、 2000 r pm 10分間遠心し細胞を集めた。細胞を適当量 (約 10ml)の細胞膜抽出バッファー（5 OmM T r i s— HC 1、 1 OmM Mg C 1₂ 2.5mM E DTA、 pH7.4)に懸濁し、テフロンホモジナイザーを用いて 400 r pm、 X 20ストロークで破碎した。 4°Cで、 2000 r pm、 10分間遠心し、上清を回収した。超遠心（40000〜48000 g)を行い、沈殿を約 1 m 1の細胞膜抽出バッファ一にて懸濁し、テフロンホモジナイザーを用いて 700 r pm、 x 5ストロークで溶解した。タンパク質定量を行い、約 lm_g mlになるよう希釈し、分注し一 80 °Cで保存した。

製造例 2のアジド体を 40 Mになるよう添加し U V照射した。本化合物は C L- 100 OUVクロスリンカー（フナコシ社）を用いて 254 nmの UVを 60 0000 JZ cm²で照射することにより蛋白質とクロスリンクする。 UV照射しないサンプルを対照サンプルとした。

(ii) SDS— PAGE法による解析

13 X 13 c mのポリアクリルアミドゲル (濃縮ゲル： T 4 %、 p H 6.8分離ゲル： T 15%、 pH8.8ゲル厚 lmm)に 40 μ g/lレーン（1 Omm幅）をアプライし、スラブ型泳動漕を用いて泳動した。サンプルバッファーには還元剤を添加せず、非還元条件下で泳動した。泳動バッファ一としては定法の Tr i s—グリシン一 SDS系を使用した。 100Vで泳動を開始し、プロモフエノールブルー（B P B)が分離ゲノレに入った後に、 150 Vで展開した。 B P Bが下端に移動した時点で泳動を終了した。タンパク質を第一化学社製の銀染色試薬「第一」を用いて染色した。. .

(iii)酵素消ィ匕

クロスリンクしたサンプルで低下が認められたタンパク質バンドについて構造角军析するため、対照サンプルを SDS— PAGEした分子量約 20 k D aの銀染色で染まったバンドをカッターナイフで切り出し、エツペンドルフチューブに入れ、 50 mM炭酸水素ァンモユウム溶液を 200 1添加し 10分間静置し、 1 00%ァセトニトリルを 200 1添加し 10分間放置した。その後、ァセトニトリルを除き、 s p e e d V a cでゲルを乾固した。次に、 10 mM ジチォスレイトール（DTT)を含有する 5 OmM炭酸水素アンモニゥム溶液を 200 At 1 添加し、 56 °Cで 30分間インキュベートした。インキュベート終了後、サンプルを室温にもどし、 50 mMョゥ化ァセトアミド溶液に置き換え、遮光条件下室温で 30分間反応させた。反応終了後、液を除き 50 mM炭酸水素アンモニゥム溶液を 200 μ 1添加し、 10分間放置し、続いて 100 %ァセトニトリルに置き換え 10分間放置した。もう一度、前述の操作を繰り返し、 s p e e d V a c でゲルを乾燥させた。乾燥したゲノレに、 l O ng/μ Ι トリプシン (ベーリンガ一 ·マンノヽィム社製 Trypsin、 modified^ sequence grade; / 25mM尿酸 τ 素ァンモユウム溶液を 5 μ 1添加し、 25 mM炭酸水素ァンモユウム液を 15 1加え、 37 °Cで 20時間酵素消化をおこなつた。

酵素消化終了後、ゲルを 25 mM炭酸水素アンモニゥム液 50 1、ァセトニトリノレ 50/i l、 25 mM炭酸水素アンモニゥム液 50 μ 1で抽出し、ァセトニトリル 50 / 1、ギ酸（5μ 1)、それぞれ添加後 20分間放置することにより、ぺプチドの抽出をおこなった。抽出液はプールし、 s p e e d V a cで乾燥後、 0.5%トリフロロ酢酸 10 μ 1に再溶角し、 Z i pチップを用いて脱塩し、 M S分析のサンプルとした。 (iv)マススぺクトノ HI军析

マススぺクトノレ用のサンプルプレート上に、マトリックス溶液 (飽和 a— CH CA) 0.5 μ 1添加し、その上からサンプル 0. 5 μ 1を加え風乾した。風乾後、サンプルプレートを Vo y a g e r R P— D E (日本パーセプティブ）に揷入し分析した。

(2)実験結果

SSG5485アジド体の L 6細胞タンパク質へのクロスリンクさせたサンプルおよび対照サンプルについて、 SDS— PAGE法による解析を行った。光照射によりクロスリンクさせたサンプルで分子量約 20 k D aのバンドが約 50 % 減少することが確認された。対照サンプノレから、分子量約 20 kDaのバンドを切り取り、トリプシンによる酵素消化をした後に、質量分析法によるペプチドマスフインガープリント法で解析した結果、 984.443、 1281. 59、 13 82.7、 1542.68、 1784.8、 2356. 16の MH+分子イオンピークが検出された。ロックフェラ一大学の解析ソフト ProFound (http： //prowl. rockfeller. edu/cgi - bin/ProFound)を用いて、 NC B I (National Center for

Biotechnology Information)のデータベースを検索した結果、ラットミオシン軽鎖（Rat Myosin Light chain I) (分子量 21 Kd a、理論！） I 4.9、 SWISS - Plot P17209)と同定された。

この実験結果から、 SSG5485アジド体がクロスリンクすることにより量が低下したタンパク質がラットミオシン軽鎖である事が明らかになった。

実施例 4

製造例 1の化合物により発現変動する蛋白質の解析

製造例 1の化合物で 24時間処理した L 6細胞および未処理 L 6細胞からタンノ、。ク質を抽出したサンプルについて二次元電気泳動法により解析した。変動したタンパク質をマススぺクトノレ法により同定した。

(1)サンプル調製

製造例 1の化合物を添加し、径 8 c mのシャーレで 24時間培養した L 6細胞および未処理 L 6細胞からタンパク質を下記の I E Fサンプル緩衝液 200 μ 1 で抽出した。 I E Fサンプノレ緩衝液： 7 Μ尿素、 2 Μチォゥレア、 4 %チヤップス、 1%トライトン X— 1 00、 0. 8% I PG緩衝液 3— 10、 1 %ジチォスレイト一ノレ DTT、 20mMトリス、 5 mMぺフアブロック（Pefabloc)。

( 2 )二次元電気泳動法による解析

上記サンプル溶液（ 3 O O/i g相当、約 50 μ 1)に膨潤緩衝液 20 μ \を添加し、一次元目電気泳動ゲル、ドライストリップ DryStrip H 4— 7、 1 8 cm を終夜膨潤させた。膨潤バッファー： 8M尿素、 0. 5%トライトン X— 100、 2% I PG緩衝液 3 _ 1 0、 1 5 m g / 1 DTT。 200〜3 500 で1 時間、 3500Vで 3時間、等電点電気泳動した。

二次元目電気泳動は、 1 0 m g Zm 1 DTTを含む平衡化緩衝液で 20分間、 45 m g /m 1ョードアセトアミドを含む平衡化緩衝液で 20分間平衡化した後、

1 1. 5%のアクリルアミドゲルを用い、サンプルがゲルに入るまで、 100 V の定電圧で、その後 50 m AZゲルの定電流で約 4 h r泳動した。銀染色キット (アマシャム■ ファノレマシア ·バイオテク社製）を用いて染色した。

(3)トリプシン消化

上記の変化が顕著であったスポットをゲルから切出し、洗浄後、 1 OmM D

TT、 56 °Cで 30分間還元し、つづいて、 5 OmMヨウ化ァセトアミドで 30 分間アルキル化の操作をおこなった。還元アルキル化終了後、ゲルの洗浄をおこない、スピードバックを用い減圧下、乾固させたゲルに酵素液（トリプシン 0. 0 1 x g ^ 1 )を 5 μ 1添加し、 37 °Cで終夜酵素消化をおこなつた。

(4)マススぺクトル分析

酵素消化後、 100%ァセトニトリルと 5 OmM炭酸水素アンモニゥムを用い、ゲルから消化されたペプチドを抽出し、スピードバックを用い減圧下、乾固した。次に、 0. 5%トリフルォロ酢酸（TFA) 1 0 1で再溶解し、ジップチップ（ミリポア社製)で脱塩した。脱塩したサンプル（6 μ 1)の內、 0. 5 μ 1を MALD I一 TO Fサンプノレプレート上にのせ、プレート上でマトリックス液（α— CH

C Α飽和液） 0. 5 μ 1と混ぜ乾固させた。 M Sの測定は、 M A L D I— T O F (日本パーセプティブ社製、ボイジャー Voyager DE-RP)を用いておこなった。得られたペプチドのマススぺクト罕析は、プロフアウンド ProFound検索プログラムを使いデータベース検索をおこなつた。 ( 5 )実験結果

S S G 5 4 8 5処理した L 6細胞サンプルおょぴ対照サンプルについて、 S D S— P AG E法による解析を行った結果、分子量 2 1 k D a、等電点 5のタンパク質が増カロした。マススぺクトノ析の結果、ラットミオシン軽鎖 1、アトリアルァイソフォームと同定された。

本実験結果から、製造例 1の化合物は筋収縮に重要なミオシンの代謝経路に作用することが明らかになつた。

実施例 5

ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物のスクリ一ユング方法

文献 [Anal Biochem. 1998 Dec 15 ;265 (2) : 340- 50. Markgren P0 et al. ]に記載されている一般的な方法を用いた。ミオシン軽鎖またはミオシン (例えば 1〜 1 0 μ g )を 1 0 mMの酢酸バッファー（ ρ H 4 )に溶解し、ビアコアのセンサーチップ CM 5の表面のマトリッタスにカルボキシル基を介して固定ィヒした。

H B Sバッファー（アマシャム■フアルマシア ·バイオテク株式会社製）をセンサーチップに 2 0 1 /分の流速で流し、バックグラウンドの値を記録した。途中から HB Sバッファーに 1 0 n M〜 1 0 μ Mの濃度で溶解した被検化合物に切り替えて 1分間流し、薬剤の結合に伴う値の変化を記録した。再び、薬剤を含まない H B Sバッファーに切り替え、結合した薬剤の解離に伴う値の変ィ匕を記録した。結合と解離の速度、あるいは最大結合量から被検化合物とミオシン軽鎖との親和性を計算した。

ジピペラジン誘導体の標識体のミオシン軽鎖への結合を指標としたスクリーェング法は、例えば、文献 J. Med. Chera, 42, 4370-4376, 2000 Maria A.

Bednarek et al. に記載の方法に準じ、 0. 5% ポリエチレンイミン■プレゥエツト ·フイノレター (polyethylenimine prewet filter)を用ヽて実施でさる。

実施例 6

製造例 1の化合物の血圧降下作用

製造例 1の化合物をラットもしくはマウスに経口投与したのちに、血圧降下作用は、例えば、ラット 'マウス用無加温型非観血式血圧計 (室町機械）を用いて、尾動脈圧の経時変ィ匕を測定することにより、非観血的に測定できる。実施例 7

製造例 1の化合物の局所麻酔作用

製造例 1の化合物をラットもしくはマウスに皮下注射もしくは経皮的に投与した後、物理的刺激に対する反応をスコァ化して観察することにより評価できる。実施例 8

製造例 1の化合物のミオシンの A T P消費活性作用

ゥサギの骨格筋より単離精製したミオシンを用いて、製造例 1の化合物の存在 Γ \ 文!^ (Biochemical and Biophysical research communications 230, 76- 80, 1997, Atsuko Hikikoshi Iwane et al. )に記載の方法により、ミオシンの A T P消費活性を測定することができる。

産業上の利用の可能性

本発明において、式（I )で示されるジピペラジン誘導体は、筋肉細胞中のミオシンの軽鎖に結合することにより、ミオシンの AT P消費活性を促進し、その結果細胞内のグルコース消費を高め、ひいては血糖値を低下させることが判明した。したがって、ミオシンの軽鎖に結合する物質は式（I )の化合物と同様、糖尿病治療剤として使用でき、また、ミオシンの軽鎖に結合する物質は、筋肉組織の運動機能促進剤、抗肥満薬および高脂血症治療剤、高血圧治療剤、局所麻酔剤としても使用することができる。

Claims

請求の範囲

1. ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする糖尿病治療剤。

2. ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする筋肉組織の運動機能促進剤。

3. ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする抗肥満薬。

4. ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする高脂血症治療剤。

5. ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする高血圧治療剤。

6. ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とする局所麻酔剤。

7. ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物が、式（ I ) ：

[式中、 A r ¹および A r ²は同一または異なって、各々、置換されていてもよいフエニル基または置換されていてもよいへテロァリ一ル基を表す；

Lは式：一C (=〇）一 X¹— I^— X²—]^²— X³— C(=0)—で表される基、ォキサリル基またはカルボエル基を表す；

R¹は水素原子またはアルキル基を表す；

X ²は単結合、置換されていてもよいアルキレン基、置換されていてもよいへテロァリレン基、置換されていてもよいフエエレン基、置換されていてもよいシクロアルキリデン基、置換されていてもよいシクロアルキレン基、置換されていてもよい 2価の脂肪族複素環基、置換されていてもよいビニレン基、ェチニレン基、硫黄原子、酸素原子または式：一 N(R²)— C( = 0)—、 -N(R³)-C(= O)— N(R⁴)—、一 N(R²)— C (=0)— O—、一 0— C( = O)— O—、 — O— C(=0)—、一 C(=0)_、もしくは一 N [— C(=0)—R⁵]—で表される基を表す；

R²、 R³、 R⁴および R⁵は同一または異なって、各々、水素原子またはアルキル基を表す；

L¹および L ²は同一または異なって、各々、単結合、置換されていてもよいアルキレン基、ビ-レン基または置換されていてもよいフエ二レン基を表す；ただし、 X ²が単結合、置換されていてもよいビニレン基、ェチニレン基、硫黄原子、酸素原子または式：一 N(R²)— C(=0)—、 -N(R³)-C(=0)- N(R⁴)—、一 N(R²)— C (=〇）— O—、一 O— C(=0)_0—、一〇— C(= O)—、一 C(=0)—、もしくは一 N[_C( = 0)_R⁵]—で表される基であるときに L¹または L ²が単結合となることはない。また、 L¹または L ²がビニレン基である場合、それぞれ X ¹または X ³は単結合である ]

で示されるジピペラジン誘導体である請求項 1〜 6に記載の糖尿病治療剤、筋肉組織の運動機能促進剤、抗肥満薬、高脂血症治療剤、高血圧治療剤または局所麻酔剤。

8. センサーチップにミオシンの軽鎖を固定し、被検化合物の溶液をチップ表面に通液した後、表面プラズモンシグナルを測定することからなる、ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物のスクリーニング法。

9. 請求項 8記載のスタリー-ング法で検出されたミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物。

10. ミオシンの軽鎖またはミオシンをゲル、ビーズまたはメンプラン上に固定した後、被検化合物の溶液と混合し、次いで標識したミオシンの軽鎖またはミォシンへの結合能を有する既知の化合物と混合した後、該ゲル、ビーズまたはメンプランを洗浄し、該標識化合物の残存量を測定することからなるミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物のスクリ一二ング法。

11. 請求項 10記載のスクリーニング法で検出されたミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物。

12. ミォシンの軽鎖への結合能を有する化合物を有効成分とするミオシンの AT P消費活性促進剤。

13. ミオシンの軽鎖への結合能を有する化合物が、式（ I )のジピペラジン誘導体である請求項 12に記載の ATP消費活性促進剤。