[go: up one dir, main page]

WO2003004065A1 - Methode de transport de polymere physiologique au moyen d'une proteine presentant une sequence repetitive rxp - Google Patents

Methode de transport de polymere physiologique au moyen d'une proteine presentant une sequence repetitive rxp Download PDF

Info

Publication number
WO2003004065A1
WO2003004065A1 PCT/JP2002/006703 JP0206703W WO03004065A1 WO 2003004065 A1 WO2003004065 A1 WO 2003004065A1 JP 0206703 W JP0206703 W JP 0206703W WO 03004065 A1 WO03004065 A1 WO 03004065A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
gene
cells
peptide
useful
Prior art date
Application number
PCT/JP2002/006703
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yukihiro Nishiyama
Tetsuo Koshizuka
Original Assignee
M's Science Corporation
Nagoya Industrial Science Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by M's Science Corporation, Nagoya Industrial Science Research Institute filed Critical M's Science Corporation
Priority to EP02743781A priority Critical patent/EP1402903A4/en
Priority to US10/482,803 priority patent/US20050220806A1/en
Priority to JP2003510074A priority patent/JPWO2003004065A1/ja
Publication of WO2003004065A1 publication Critical patent/WO2003004065A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently transporting physiological macromolecules such as useful proteins, peptides, and genes in a living body. Such a method is particularly useful for gene therapy.
  • HIV-1 TAT Vives. E., Brod in, P., and Lebleu, B. (1997) A truncated HIV-1 Tat pro te in basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus.J Biol Chem. 272, 16010-7), antennas (Derossi, D., Joliot, A / H /. Chassaing, G., and Prochiantz, A. (1994) The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem. 269, 10444-50), etc.
  • Disclosure of the invention Disclosure of the invention
  • the present invention solves the above problems, and provides a method for binding an intercellular transport protein with a physiological macromolecule such as a useful protein, a peptide, or a gene, and introducing the protein into a target cell such as a diseased cell.
  • a physiological macromolecule such as a useful protein, a peptide, or a gene
  • the present inventors have found that at the C-terminus, for example, the HS VUS 11 protein, which is the US 11 gene product of HS V, the formula: Arg—Xa—Pro (where Xaa is hydrophobic or (Representing acidic amino acid residues). Proteins with tripeptide repeats enriched in positively charged residues, as shown in Figure 2, interact with the negative charge of the cytoplasmic membrane and depend on energy such as ATP. Without the need to transport useful proteins, peptides or genes between cells.
  • the C-terminal has a repeating structure of a peptide unit represented by the formula: Ar g—Xa a—Pro (where X aa represents a hydrophobic or acidic amino acid residue)
  • a protein is linked to at least one of a) a useful protein, b) a peptide and c) a gene; and To create a method for introduction into target cells.
  • a biotransport agent of a complex comprising at least one of a protein, b) a peptide and c) a gene;
  • a protein having a peptide unit repeating structure represented by the formula: Arg_Xaa-Pro (where Xaa represents a hydrophobic or acidic amino acid residue) at the C-terminus and a) a useful protein A method for treating a disease in a human or animal, which comprises administering to a patient a complex comprising at least one of a peptide and c) a gene.
  • a positively charged residue represented by the formula: Arg—Xaa—Pro (where Xaa represents a hydrophobic or acidic amino acid residue; hereinafter abbreviated as RXP) at the C-terminus is abundant.
  • RXP hydrophobic or acidic amino acid residue
  • a protein having a triplicate repeat is used.
  • Xaa is not particularly limited as long as it is a hydrophobic or acidic amino acid residue, and examples of the hydrophobic amino acid residue include alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline and the like.
  • the acidic amino acid residue include aspartic acid and glutamic acid.
  • a protein having an RXP repeat at the C-terminus can be used, and any protein having an RXP repeat at the C-terminus may be used.
  • a method for introducing an RXP repeat into the C-terminus a method known per se can be used.
  • the number of RXP repetitions at the C-terminal may be about 10 to 40.
  • proteins with an RXP repeat at the C-terminus include, for example, simple HSV US11 protein, which is a US11 gene product of herpes virus (hereinafter abbreviated as HSV).
  • HSV herpes virus
  • the number of RXP repeats at the C-terminus of HSVUS11 protein is 19 times.
  • the method for obtaining the purified HSVUS 11 protein is not limited to the following, and may be performed according to a known method. A preferred method for obtaining purified HSVUS 11 protein is described below.
  • the HSVUS 11 Open Reading Frame is located between nucleotides 147247 and 147699 of the HSV-2 genome.
  • US 11-F (ATTA)
  • the nucleotide sequence encoding the HSVUS11 protein is amplified from HSV-2 186 genomic DNA by Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as PCR method) using CGGGT.
  • the obtained PCR product was digested with Sa1I and NotI, inserted into the frame of E. coli expression vector pET-28a (manufactured by Novagen), and plasmid pET-28a- US 11 is made and cloned.
  • E. coli expression vector pET-28a manufactured by Novagen
  • plasmid pET-28a- US 11 is made and cloned.
  • To regulate expression use the 1 a c per night and the t ac promoter-inducible IPTG.
  • This plasmid is transformed into E. coli BL21DE3 strain (manufactured by NoVagen) to express a large amount of the 6 ⁇ His-added US11 fusion protein.
  • US 11 fusion protein-expressing cells to which 6 ⁇ His had been added were lysed and separated by sonication in PBS, and cell debris was removed by centrifugation. Obtained by eluting proteins.
  • the useful protein that can be used in the present invention is not particularly limited, and is preferably a protein useful for prevention or treatment of human or animal diseases, and is particularly difficult to enter into cells such as diseased cells.
  • a useful protein with some medicinal properties Is preferred. Any useful protein may be used, for example, cytokins, interferon- ⁇ , ⁇ , ⁇ or ⁇ , vertebrate in evening feron, animal-derived interferon inuinterferon ( ⁇ , ⁇ , Each type of ⁇ ), feline interferon ⁇ and the like.
  • hemagglutinin (hemagglutinin) of influenza ⁇ and ⁇ viruses
  • HA 2 component of hemagglutinin of influenza ⁇ and B viruses and their peptide analogs
  • M2 protein of influenza A virus and influenza C virus HEF evening protein.
  • Useful proteins can be obtained in purified form according to known methods.
  • Useful proteins can be obtained by removing impurities such as proteases by various types of chromatography, collecting the target protein, and concentrating it, taking into account properties such as salt stability, hydrophobicity, and biological specificity.
  • chromatographies include gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography and the like.
  • the peptide that can be used in the present invention may be any peptide that is useful in vivo, for example, it can be obtained by converting the above-mentioned useful protein into a peptide form, Peptides that retain their properties are preferred. Preference is given to peptides having modified proteins useful for the prevention or treatment of human or animal diseases. Means for obtaining a peptide by modifying a protein include, for example, a protein degradation method such as hydrolysis. Further, a peptide obtained by mixing individual amino acids may be used.
  • Peptides are usually produced by a method of introducing amino acids in a stepwise manner by an organic chemical synthesis method, but may also be produced by enzymatic hydrolysis of natural proteins, peptide synthesis by an enzymatic method, or the like. Is also good.
  • Solid phase is a method for introducing amino acids stepwise by organic chemical synthesis.
  • Peptide synthesis or liquid phase peptide synthesis is known, and is described in detail, for example, in Nobuo Izumiya et al., "Basic and Experimental Peptide Synthesis” (Maruzen Co., Ltd.).
  • Known methods for obtaining peptides by enzymatic hydrolysis of natural protein include, for example, a method of hydrolyzing milk casein with trypsin, or a method of obtaining a blood pressure lowering peptide by hydrolyzing corn protein with microorganism-derived samolysin. (Susumu Maruyama, Bioscience and Industry, 47, 38-42, 1989).
  • condensation and substitution There are two types of enzymatic peptide synthesis methods: condensation and substitution.
  • the former involves the substitution of an amide component with a carboxyl component having a free carboxyl group, and the latter involves the substitution of an amamine component with an ester or amidated carboxyl component. And the like. Any of these may be performed according to a known method.
  • the present invention can also be used to introduce useful genes into a living body.
  • a gene useful for prevention or treatment of human or animal diseases that is, a gene used for gene therapy can be mentioned.
  • the gene is preferably in the form of a plasmid, and the gene inserted into the vector may be, for example, a genomic DNA of an organism that produces a useful protein expressed in cells (hereinafter abbreviated as the original protein). If the organism is a eukaryote, the DNA is designed as type ⁇ and designed based on the base sequence of the original protein and obtained by PCR using the prepared primer DNA. be able to.
  • cDNA is directly reverse-transcribed using a preparation of total RNA or mRNA fraction from cells * tissues.
  • RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • those produced according to a known oligonucleotide synthesis method may be used. Specifically, for example, a DNA synthesizer using the phosphoramidite method mode 1 3 9 2 (Perkin Elmer Inc.) Chemical synthesis using a DNA synthesizer.
  • the method of obtaining the genomic DNA and the cDNA of the organism that produces the original protein is appropriately selected depending on the type of the organism, and is not particularly limited. For example, see “Molecular Cloning, 2nd Edition (Cold Spring's Harbor Laboratory) (1989) "(J. Samblook et al., Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • the gene to be introduced into the target cell is not particularly limited.
  • a gene for a disease that is, a gene that acts antagonistically against a disease or a gene that complements a lack in a disease can be used. .
  • Examples of such a gene include a gene that expresses the above-mentioned useful protein in a living body, for example, a receptor for cytoforce, a growth factor, an antibody or an antibody fragment, a cytoforce or a growth factor, Proteins, enzymes, thrombosis-inducing substances, and aggregation-inhibiting substances, proteins that have antiproliferative or cytostatic activities, proteins that have fibrinolytic activity, viral coat proteins, bacterial and parasite antigens, tumor antigens, blood And genes encoding pharmaceutically active substances selected from the group consisting of circulating proteins, peptide hormones, and ribonucleic acids such as ribozyme and antisense RNA.
  • genes for specific diseases include S ⁇ D for inflammatory diseases, anti-inflammatory cytodynamics, and peptides that act antagonistically on cell adhesion factors.
  • Gene a gene encoding a normal enzyme for an enzyme deficiency, a gene encoding a normal receptor for a receptor deficiency, or a virus for killing virus-infected cells for a viral infection
  • Genes encoding toxins such as thymidine kinase and diphtheria toxin, and antisense inhibiting the replication of viruses, genes encoding triple helix, lipozyme, decoy, transdominant mutant, etc., and cancer cells against cancer.
  • Chimiji to kill Genes encoding toxins such as kinases and diphtheria toxins, and genes encoding antisense, lipozyme, triple helix, etc. to inactivate oncogenes, and cancers such as P53 to normalize cancer cells
  • the gene used in the present invention can be prepared by inserting it into a plasmid vector or a phage vector that can be replicated in target cells according to a conventional method.
  • a plasmid form is preferred.
  • the vector it is preferable to use an expression vector which is constructed so that a large amount of stable mRNA is produced and the resulting mRNA is efficiently translated in target cells.
  • a transformant having the recombinant vector to be prepared can be easily screened, and the recombinant vector can be stably maintained in target cells.
  • the erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin It may carry a drug resistance gene such as a resistance gene.
  • Plasmid vectors used to insert genes include, for example, plasmid pET-28a, pFLAG-CMV-5a pCDM8, pcDNA lZ Amp, pcDL-SRa, BCMGSNeo, pSV2-neo> pSV -2 gpt, pEF—B ⁇ S, pCEV4, pME18S, pKY4, pK223-3, pVL1392, pVL1393, Ti plasmid, Riplasmid, pBI121, pUB110, p And plasmid vectors such as UC118.
  • the plasmid can be appropriately selected depending on the type of the gene to be inserted, and a commercially available plasmid may be used.
  • Commercially available plasmids include, for example, pET-28a (Novagen), FLAG-CMV -5a (manufactured by Novagen).
  • phage vector for example, Agtll phage, AgtlO phage and the like can be used. In each case, a recombinant vector corresponding to the parent vector used is obtained.
  • the phage vector can be appropriately selected depending on the gene to be inserted, but a commercially available phage vector may be used.
  • the expression cassette used for the gene to be inserted is not particularly limited as long as it can express the gene in the target cell.
  • an expression cassette capable of expressing a gene in an animal-derived cell can be used, preferably an expression cassette capable of expressing a gene in a mammal-derived cell, and more preferably a human-derived cell. This is an expression cassette that allows gene expression.
  • Expression vectors usually contain regulatory sequences to express or favor expression of the gene.
  • Each regulatory sequence may be native or foreign to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the gene.
  • Such regulatory sequences include, but are not limited to, promoters, leaders, polyadenylation sequences, propeptide sequences, enhancers, signal sequences, splicing signals, polyA addition signals, SV40 replication origin, and transcription factor. Including overnight.
  • the regulatory sequences preferably include at least a promoter, and transcription and translation termination signals.
  • the promoter may be any suitable promoter sequence, which is a base sequence recognized in the target cell.
  • lac promoted SRa promoted, SV40 promoted, LTR promoter, CMV (sa (Itomegalovirus) promoter, HS VTK promoter and the like.
  • CMV sa (Itomegalovirus) promoter
  • HS VTK promoter a transcription terminator sequence of each gene derived from a virus
  • various mammals and birds may be used.
  • the SV40 virus of the simian virus is used.
  • the expression vector may also include a signal sequence related to secretion of the protein.
  • a signal sequence a signal sequence of a gene to be introduced or a signal sequence of a different gene can be used.
  • an insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence and the like can be used.
  • the expression vector may also include one or more nucleic acid sequences encoding one or more factors that favor expression of the enzyme gene, for example, an activator (eg, a trans-acting factor), a chaperone, and a processing protease. Any factor that is functional in the target cell can be used in the expression vector of the present invention.
  • a protein having an RXP repeat at the C-terminus and a plasmid into which a useful protein, peptide, or gene is inserted form a complex by non-covalent bonding.
  • a complex of a protein having an RXP repeat at the C-terminus and a plasmid into which a useful protein, peptide, or gene has been inserted moves into the nucleolus of the target cell and its surrounding cells.
  • a protein having an RXP repeat at the C-terminus is preferably added to PBS or serum-starved medium in a sterile tube, preferably about 1% of the total amount. No. 100 amount (wZw) is added. Next, about 0.25 to 1 part by weight of a useful protein is added and mixed.
  • the complex After mixing, the complex is incubated by about 15 to 30: about, preferably about 20 to 25, and about 20 to 50 minutes, preferably about 30 to 40 minutes. Is formed.
  • the complex thus obtained is administered to a living body.
  • the method of administration into a living body include a method of administering directly into a living body by injection or the like, and a method of removing target cells such as diseased cells from a patient's body, transforming them, and then returning them to the body. May be used.
  • the method of direct administration into a living body is not particularly limited, and for example, it can be locally administered by injection or the like into an intravenous, intraarterial, intraportal, intracranial, intrapleural, or intraperitoneal cavity.
  • the dosage varies depending on the type of plasmid having the RXP repeat at the C-terminus, useful proteins, peptides, or genes inserted, etc., and cannot be specified unconditionally.In adults, however, it is usually 1 to 100 Omg Z kg.
  • an amount of the conjugate is administered.
  • the dose can be appropriately determined by a doctor with reference to the patient's medical condition and condition.
  • the target cells are first extracted from the patient's body.
  • Such cells are not particularly limited and include, for example, bone marrow cells, myeloma cells, liver cells, alveolar cells, muscle cells, lymph cells, lymphadenomas cells, mammary gland stimulating cells, skin fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells , Stromal cells, liver, kidney, spleen, thymus, thymus, placenta, uterus, lung, etc., parenchymal cells, chondrocytes, nerve cells and the like.
  • Examples of a method of extracting cells from the body of a patient include a method of collecting a body fluid such as blood from the patient, but are not particularly limited, and can be performed according to a known method.
  • the present invention can be used for various mammalian cells, for example, HS-68 cells, NI H3T3 cells, C2C12 cells, CEM-SS cells, HEPG cells, Hela cells, monkey cells COS-7 Cells, Vero cells, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dh fr gene-deficient Chinese Eight Muscle Yuichi cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dh fr—) cells), mouse L cells Mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells, 293 cells, C127 cells, BALBZ3T3 cells, Sp-2 cells and the like.
  • the cells are grown on the medium under conditions that promote growth.
  • a medium containing a carbon source and a nitrogen source can be used.
  • the carbon source include sugars and organic acids, and examples of the sugars include glucose, glycerol, starch, dextran, molasses, and the like.
  • the nitrogen source include an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source. Examples of the organic nitrogen source include casein, peptone, meat extract, yeast extract, casamino acid, and glycine. Examples of the source include ammonium sulfate and ammonium nitrate.
  • the medium was removed from the cells to transform, by adding complex prepared in the above-described condition to the desired cells, about 5% C 0 2 to about 1 hour humidification atmosphere containing As described above, by incubating at about 35 to 40 ° C., preferably at about 37, the complex and the cells are brought into sufficient contact.
  • the incubation is carried out for about 1-2 hours, about 15-42, preferably about 30-40. At this time, if necessary, aeration and stirring can be performed.
  • Nutrients may be added to the medium as needed. Such nutrients include, for example, serum, amino acids, vitamins, nucleic acids, salts, and the like. You.
  • a synthetic medium mainly composed of a sugar and an inorganic nitrogen source can be used.
  • a solid medium is used as the medium, agar is further added.
  • an antibiotic may be added to the medium in order to stably maintain the transformant and suppress the growth of a strain that does not have the transformant. Examples of such antibiotics include penicillin, erythromycin, neomycin, chloramphenicol, bacitracin, D-cycloserine, ampicillin and the like.
  • soybean oil, lard oil, various surfactants and the like may be added to the medium as an antifoaming agent.
  • the pH of the medium is usually about 5 to 9 and preferably about 6.5 to 7.5 from the viewpoint of the pH at which the transformant can grow.
  • the resulting transformant is returned to the patient.
  • Such a method is not particularly limited, and it can be administered to a patient in need of treatment by, for example, intravenous administration, local administration to an affected part, oral administration, or the like.
  • pharmaceutically acceptable additives such as carriers, excipients, stabilizers, and solubilizing agents are added to make the preparation suitable for the administration.
  • Became cells a stable line of African green monkey kidney cells, were grown in Eag1e minimum required medium (MEM) containing 5% pesticide serum.
  • PCR primers were US 11 BamHI (ATTA). The PCR product was cut with BamHI and NotI and cloned with pcDNA3.1 (+). For Vero cells, Gibc oBRL recommended Protoco And transferred by using the Lipofectamine reagent.
  • the transfer of PcDNA-US11 into cells was examined by indirect immunofluorescence using antiserum.
  • the antiserum was prepared using two eggs and using an emulsion containing about 0.6 mg of HS VUS11 protein to which 6 x His expressed in Escherichia coli was added, using MPL + TDM + CWS emulsion adjuvant system (RIBII m munoChem Research, Inc., Montana). Inoculation was performed by subcutaneous injection on the shaved back. Continuous stimulation was performed with the same adjuvant and 0.6 mg of purified protein. A total of three stimuli were given, each two weeks after the first injection.
  • Egret polyclonal anti-US11 antiserum reacts strongly with proteins with apparent molecular weights of 20 kDa and 21 kDa present in lysates of HSV-2 infected cells.
  • a perforated polyclonal anti-US11 antiserum was used at a dilution of 1Z500 (w / w). After incubation at 37 for 30 minutes, the cover glass was washed in PBS and labeled with a secondary antibody for 30 minutes at 37 ° C.
  • FITC-conjugated goat anti-money IgG (manufactured by MBL) was used. After washing with PBS, the cover glass was immediately mounted on a slide glass using PermaF1u0r (manufactured by Immunon). Thereafter, analysis was performed using a Zeiss laser single-scanning microscope LSM510.
  • pFLAG—US11 that expresses the US111-FLAG fusion protein
  • the US111GFPFW and US111GFPRv—PCR products were combined with pFLAG—CMV—5a Bgl II / S p FLAG-US11 was created by insertion at the a1I site and cloned.
  • Plasmid pFLAG-CMV-5a (Sigma) expresses the US111-FLAG fusion protein under the control of the HCMVis ediate early promoter.
  • Anti-FLAG mouse monoclonal antibody (Sigma) diluted to 1100 (w / w) as the primary antibody, FITC-conjugated goat anti-mouse IgG (Sigma) Indirect immunofluorescence measurement was carried out in the same manner as in Test Example 1 except that) was used.
  • pEGFP-C1-US11 and pEGFP-N3-US11 were constructed.
  • the forward PCR primer was a US 11 GF incorporating a B 1 II site.
  • the reverse primer for pEGFP—C 1 -US 11 is US 11 G
  • the reverse primer for pEGFP—N3—US 11 is US 11 GFPR V-(AATCGTCGACGGCAAGC CCGCGGGTTGC) integrated at the Sa 1 I site. there were.
  • the PCR product of each pair was digested with Bg1II / Sa1I as a Bg1II—Sa1I fragment, inserted into pEGFP—C1 and pEFGP—N3, and pEGFP—C1—US11 pEGFP-N3-US11 was prepared.
  • the plasmid was transferred to the cells in the same manner as in Test Example 1, and after 40 hours, the cells were fixed with cold acetone. Indirect immunofluorescence measurement was performed in the same manner as in Test Example 1, using Egret polyclonal anti-US11 antiserum as the primary antibody and FITC-conjugated goat anti-Egret IgG (manufactured by MBL) as the secondary antibody. .
  • the US11 fusion protein with 6xHis was shown to enter the cell at 4 and be accumulated mainly in the nucleolus.
  • the cytoplasmic fluorescence was stronger in cells incubated at 4 than at 37.
  • internalization of HSVUS 11 protein into cells was shown to be via an energy-independent pathway.
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • HSVUS 11 protein of simple virus was used as a useful protein.
  • Purified IFN-produced protein was prepared by the following method. 8-week-old female Injected lmgZ of dead cells prepared by heating Corynebacterium parvum (ATCC 11827) at 60 for 1 hour intraperitoneally to 600 CD-1 mice, and cultivating them for 7 days by the usual method Thereafter, one purified lipopolysaccharide derived from E. coli was injected intravenously. After 1 to 2 hours, the analogy is dislocated, the mouse is sacrificed, the heart is collected, the liver is removed, and crushed and extracted with a homogenizer in 8 volumes of 5 OmM phosphate buffer (pH 7.3). did.
  • the extract was centrifuged at about 8,000 rpm for 20 minutes, and about 9 L of the obtained supernatant was saturated with 50 mM phosphate buffer (PH7.3) containing saturated ammonium sulfate at 45% saturation with ammonium sulfate. After standing at 4X: for 18 hours, the mixture was centrifuged at about 8,000 rpm for 30 minutes to obtain about 19 L of a supernatant containing the protein.
  • PH7.3 phosphate buffer
  • the column was loaded on a 25 OmL DEAE-Sepharose (Pharmacia) column which had been equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.5) in advance. After washing the column with the same fresh buffer, a 20 mM phosphate buffer (pH 6.5) was passed through the column with SV 1.2 under a gradient of sodium chloride from 0 M to 0.2 M. The protein eluted at a sodium chloride concentration of around 0.13 M.
  • Purified HSVUS 11 protein was obtained by the following method. First, US 11 _F (ATTAGGATCCATGGCATCC GGGGTTTCC) was used as a formal primer and US 11 —R (TTATG
  • the nucleotide sequence encoding the 11 protein was amplified from HSV-2186 genomic DNA by Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as PCR method).
  • the obtained PCR product is digested with Sa1I and NotI, inserted into the frame of Escherichia coli expression vector pET-28a (manufactured by Novagen), and plasmid pET-28a-US11 is inserted. Created and cloned.
  • This plasmid was transformed into Escherichia coli strain BL21DE3 (Novagen) to express a large amount of the 6 ⁇ His-added US11 fusion protein.
  • the US11 fusion protein-expressing cells to which 6xHis had been added were lysed and separated by ultrasonication in PBS, the cell debris was removed by centrifugation, and the 6xHis fraction containing 30 OmM imidazole was removed. Obtained by eluting the added US11 fusion protein.
  • useful proteins, peptides, genes, and the like are efficiently transported to cells in vivo.
  • the useful protein when a useful protein is delivered to a cell, the useful protein can be delivered without inactivating or denaturing the drug.
  • drugs that are difficult to enter into a cell can be easily delivered to the cell. Because it can be introduced directly, the drug's significant effects can be achieved.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

明 现 曞
R X P繰り返し配列を有する倕ンパク質を甚いた生理的高分子の茞送方法 技術分野
本発明は有甚タンパク質、 ペプチド、 遺䌝子等の生理的高分子を生䜓䞭で効 率的に茞送する方法に関する。 このような方法は、 特に遺䌝子治療に有甚であ る。 背景技術
近幎、 遺䌝子工孊の進歩によっお、 遺䌝病等倚くの病気の原因ずなる遺䌝子 の異垞が D N Aレベルで解明されおきたこずで、 その異垞な遺䌝子を正垞に戻 し、 発珟させるこずによりその病気を治療するずいう治療法が考えられるよう になっおきた。
このような治療法においお、 有甚な遺䌝子を効率良く安党に暙的现胞ぞ茞送 し、 発珟させるための技術が技術的課題の 1぀ずなっおいる。
遺䌝子の现胞ぞの導入法ずしおは、 埓来マむクロむンゞェクション、 リン酞 カルシりム沈殿、 カチオンリポゟヌム、 りィルスベクタヌ、 ゚レクトロボレ䞀 シペン等が甚いられおいる。 しかしながら、 これらの方法は手間がかかるうえ に、 现胞毒性を有するずいう欠点があった。 たた、 遺䌝子の導入埌、 望たしい 遺䌝子の発珟を確認するために、 1 2〜8 0時間ずいう長い時間がかかるもの であった。
このような欠点を解決するために、 现胞間茞送胜を有するタンパク質を甚い お有甚タンパク質を盎接现胞に導入する方法が開発されおいる。 そのような现 胞間茞送胜を有するタ ンパク質ず しおは、 H I V— 1 T A T ( Vives. E. , Brod in, P. , and Lebl eu, B. (1997) A truncated HIV- 1 Tat pro te in basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem.272, 16010-7), アンテナぺデ ィ ァ ( Derossi,D. , Joliot,A/H/. Chassaing, G. , and Prochiantz, A. (1994) The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem.269, 10444-50) 等が知られおいるが、 これ らのタンパク質を甚いた堎合、 现胞に導入しょうずする有甚タンパク質の䞍掻 性化あるいは倉性を匕き起こすずいう問題点がある。 発明の開瀺
本発明は䞊蚘の問題を解決し、 现胞間茞送タンパク質を有甚タンパク質、 ぺ プチド、 遺䌝子等の生理的高分子ず結合させ、 眹患现胞等の暙的现胞に導入す る方法を提䟛する。
本発明者らは、 䟋えば HS Vの US 1 1遺䌝子産物である HS VUS 1 1倕 ンパク質等の、 C末端に匏 A r g— Xa a— Pro (匏䞭 X a aは疎氎性ある いは酞性のアミノ酞残基を衚す で瀺される正電荷残基を豊富に有するトリべ プチド反埩を持぀倕ンパク質が、 现胞質膜の負電荷ず盞互䜜甚するこずで AT Pのような゚ネルギヌに䟝存せずに有甚タンパク質、 ペプチドたたは遺䌝子を 现胞間茞送するこずを可胜にするこずを発芋した。
本発明者らは鋭意怜蚎した結果、 C末端に匏 Ar g— Xa a— Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞性のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニ ットの繰り返し構造を有するタンパク質ず a) 有甚タンパク質、 b) ペプチド および c) 遺䌝子等の少なくずも 1぀を結合させ、 a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子等の生理的高分子のうち少なくずも 1぀を眹患现胞 等の暙的现胞に導入する方法を創補するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) C末端に匏 A r g— X a a— Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞 性のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニットの繰り返し構造を有す るタンパク質に a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なく ずも 1぀を結合させ生物に投䞎するこずを特城ずする、 a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なくずも 1぀を生䜓内で茞送する方法、 (2) 遺䌝子がプラスミドに挿入されおいるこずを特城ずする䞊蚘 1) 蚘 茉の方法、
(3) 生䜓内での茞送が现胞間茞送であるこずを特城ずする䞊蚘 1) 蚘茉 の方法、
(4) 现胞間茞送が暙的现胞ぞの茞送であるこずを特城ずする䞊蚘 3) 蚘 茉の方法、
(5) 暙的现胞が眹患现胞であるこずを特城ずする䞊蚘 4) 蚘茉の方法、
(6) タンパク質が単玔ぞルぺスりィルスの US 1 1タンパク質であるこず を特城ずする䞊蚘 1) 蚘茉の方法、
(7) 有甚タンパク質がサむト力むン類たたはむンタ䞀プロン䞀 α、 β、 r もしくは ω、 であるこずを特城ずする䞊蚘 1) 蚘茉の方法、
(8) C末端に匏 Ar g— Xa a— Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞 性のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニッ卜の繰り返し構造を有す るタンパク質の a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なく ずも 1぀を生䜓内で茞送するための䜿甚、
(9) C末端に匏 A r g— Xa a— Pro (匏䞭 Xa aは疎氎性あるいは酞 性のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニッ卜の繰り返し構造を有す るタンパク質ず a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なく ずも 1぀を結合させた耇合䜓の生䜓内茞送剀、
(10) C末端に匏 A r g— Xa a— Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞 性のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドナニットの繰り返し構造を有す るタンパク質ず a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なく ずも 1぀を結合させた耇合䜓、
(1 1) 遺䌝子がプラスミドに挿入されおいるこずを特城ずする䞊蚘 10) 蚘茉の耇合䜓、
(12) タンパク質が単玔ぞルぺスりィルスの US 1 1タンパク質であるこず を特城ずする䞊蚘 10) 蚘茉の耇合䜓、
(13) C末端に匏 A r g_Xa a— Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞 性のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニッ卜の繰り返し構造を有す るタンパク質ず a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なく ずも 1぀を結合させた耇合䜓を患者に投䞎するこずを特城ずする人たたは動物 の病気の治療方法、
に関する。 発明を実斜するための最良の圢態
本発明においおは、 C末端に匏 A r g— Xa a— Pro (匏䞭 X a aは疎氎 性あるいは酞性のアミノ酞残基を衚す以䞋 RXPず略す で瀺される、 正電 荷残基を豊富に有するトリぺプチド反埩を持぀倕ンパク質が䜿甚される。 X a aは疎氎性あるいは酞性のアミノ酞残基であれば特に限定されず、 疎氎性アミ ノ酞残基の䟋ずしおは、 ァラニン、 む゜ロむシン、 ロむシン、 メチォニン、 フ ェニルァラニン、 プロリン等が挙げられる。 酞性アミノ酞残基ずしおは、 䟋え ばァスパラギン酞、 グルタミン酞等が挙げられる。
本発明で䜿甚されるタンパク質ずしおは C末端に RXP反埩を有するタンパ ク質を甚いるこずができ、 任意のタンパク質の C末端に RXP反埩を導入した ものであっおもよい。 C末端に RXP反埩を導入する方法ずしおは自䜓公知の 方法により行うこずができる。 C末端における RXP反埩回数は、 箄 10〜4 0皋床であればよい。
C末端に RXP反埩を有するタンパク質の奜たしい䟋ずしおは、 䟋えば単玔 ヘルぺスりィルス 以䞋、 HSVず略す の US 1 1遺䌝子産物である HS V US 1 1タンパク質が挙げられる。 HSVUS 1 1タンパク質の C末端におけ る RXP反埩回数は 19回である。
粟補 HSVUS 1 1タンパク質を埗る方法は、 以䞋に制限されるものではな く、 公知の方法に埓っお行っおもよい。 粟補 HSVUS 1 1タンパク質を埗る 奜たしい方法を以䞋に瀺す。
HSVUS 11のオヌプン · リ䞀ディング ·フレヌム Open Reading Frame ORF) は、 HSV— 2ゲノムのヌクレオチド 147247䜍ず 147699 䜍の間に䜍眮しおいる。 フォワヌドプラむマヌずしお US 1 1—F (ATTA
CGGGT) を甚いお HSVUS 11タンパク質をコヌドしおいる塩基配列を HS V— 2 1 8 6ゲノム DNAからポリメラ䞀れチェ䞀ンリアクション (Polymerase Chain Reaction以䞋 P C R法ず略称する で増幅する。
埗られた PCR産物を S a 1 Iず No t Iで切断し、 倧腞菌発珟べクタ䞀 p ET- 28 a (No v ag e n瀟補 の枠内に挿入し、 プラスミド pET— 2 8 a— US 1 1を䜜補しおクロヌン化する。 発珟を調節するためには 1 a cォ ペレ䞀倕䞀ず t a cプロモヌタヌ誘導性 I PTGを甚いる。 このプラスミドを 倧腞菌 BL 21DE3æ ª (No V a g e n瀟補 に圢質転換し、 6 xH i sが 付加した US 1 1融合タンパク質を倧量に発珟させる。 6 xH i sが付加した US 1 1融合タンパク質発珟现胞を PBS䞭で超音波にお溶解分離し、 现胞片 を遠心分離によっお取り陀き、 30 OmMむミダゟヌル含有画分で 6 xH i s が付加した US 1 1融合タンパク質を溶出するこずで埗られる。
本発明で䜿甚されうる有甚タンパク質ずしおは、 特に限定されるものではな く、 人たたは動物の病気の予防たたは治療に有甚なタンパク質が奜たしく、 特 に埓来眹患现胞等の现胞に入れるのが困難である薬効性のある有甚タンパク質 が奜たしい。 有甚タンパク質ずしおはどのようなものでもよく、 䟋えばサむト 力むン類、 むンタヌフェロン—α、 β、 ァ たたは ω、 脊怎動物のむン倕䞀プ ロン、 動物由来のむンタヌフェロンであるィヌむンタ䞀プロン α、 β、 τ の各タむプ、 ネコむンタヌフェロン ω 等が挙げられる。 たた、 むンフルェン ザ Α、 Βりィルスのぞマグルチニン 赀血球凝集玠、 むンフル゚ンザ Αたたは Bりィルスの赀血球凝集玠の H A 2成分、 およびそれらのペプチド類䌌䜓、 ィ ンフルェンザ Aりィルスの M 2タンパク質、 ィンフルェンザ Cりィルスの H E F倕ンパク質等が挙げられる。
有甚タンパク質は、 公知の方法に埓っお粟補品を入手するこずができる。 有 甚タンパク質は、 䟋えば塩安定性、 疎氎性、 生物孊的特異性等の性質を考慮し お、 各皮クロマトグラフィヌによっおプロテアヌれ等の䞍玔物を陀去し、 目的 のタンパク質を回収し、 濃瞮するこずによっお埗られる。 各皮クロマトグラフ ィ䞀ずしおは、 䟋えばゲル濟過クロマトグラフィヌ、 むオン亀換クロマトダラ フィ䞀、 逆盞クロマトグラフィヌ、 ァフィ二ティクロマトグラフィヌ、 疎氎性 クロマトグラフィヌ等が挙げられる。
本発明で䜿甚されうるペプチドずしおは、 生䜓内で有甚であるペプチドであ ればどのようなものでもよく、 䟋えば䞊蚘の有甚タンパク質をペプチド態に改 倉するこずで埗られ、 しかも有甚タンパク質の有甚性を保持しおいるペプチド が奜たしい。 奜たしくは人たたは動物の病気の予防たたは治療に有甚な倕ンパ ク質を改倉したペプチドが挙げられる。 タンパク質を改倉しおペプチドを埗る 手段ずしおは、 䟋えば加氎分解等のタンパク質の分解方法等が挙げられる。 た た、 個々のアミノ酞を混合しお埗られるペプチドであっおもよい。 ペプチドは 通垞有機化孊的な合成方法によりアミノ酞を段階的に導入する方法により補造 されるが、 他に、 倩然タンパク質の酵玠加氎分解法、 酵玠法によるペプチド合 成法等によっお補造したものであっおもよい。
有機化孊的な合成方法によりアミノ酞を段階的に導入する方法ずしおは固盞 ぺプチド合成たたは液盞べプチド合成法が知られおおり、 䟋えば泉屋信倫他著 「ペプチド合成の基瀎ず実隓」 䞞善 株) に詳现に蚘茉されおいる。
倩然倕ンパク質の酵玠加氎分解によりぺプチドを埗る方法ずしおは、 䟋えば 牛乳カれィンをトリプシンで加氎分解し、 あるいはずうもろこしタンパク質を 埮生物由来のサ䞀モラむシンで加氎分解し血圧降䞋ペプチドを埗る方法等が知 られおいる 䞞山進 『バむオサむ゚ンスずむンダストリ䞀』、 4 7巻、 38〜42 頁、 1 9 8 9幎)。
酵玠法によるペプチド合成法ずしおは、 瞮合、 眮換の 2皮の方法があり前者 ではフリヌのカルボキシル基を有する力ルポキシル成分にァミン成分を眮換さ せ、 埌者でぱステルたたはアミド化したカルボキシル成分にァミン成分を眮 換させる方法等を挙げるこずができる。 これらはいずれも公知の方法に埓っお よい。
本発明は生䜓にずっお有甚な遺䌝子を生䜓内に導入するのにも甚いるこずが できる。 䟋えば人たたは動物の病気の予防たたは治療に有甚な遺䌝子、 すなわ ち遺䌝子治療に甚いられる遺䌝子が挙げられる。 遺䌝子はプラスミドの圢であ るのが望たしく、 ベクタヌ䞭に挿入される遺䌝子は、 䟋えば现胞内で発珟する 有甚なタンパク質 以䞋、 元のタンパク質ず略称する を産生する生物のゲノ ム D NA (生物が真栞生物である堎合は c D NA) を铞型ずしお、 元のタンパ ク質の塩基配列をもずにしお蚭蚈され、 䜜補されたプラむマヌ D N Aを利甚し お P C R法を行うこずによっお埗るこずができる。 c D N Aは现胞 *組織より å…š R NAたたは mR N A画分を調補したものを甚いお盎接リバヌス · トランス クリプタヌセ 'ホリメラヌセ ·チェヌン ·リァクション (Reverse Transcr iptase Polymerase Chain Reac t i on以䞋 R T- P C R法ず略称する によっお増幅す るこずもできる。 たたさらに、 自䜓公知のオリゎヌクレオチドの合成法に埓぀ お補造されたものを甚いおもよい。 具䜓的には、 䟋えばフォスフォアミダむト 法を利甚した D N A合成機 m o d e 1 3 9 2 (パヌキン ·゚ルマ䞀株匏䌚瀟補 等の D N A合成機で化孊合成する方法が挙げられる。
元のタンパク質を産生する生物のゲノム D NAや c D NAの取埗法は、 その 生物の皮類によっお適宜遞択され、 特に制限されるものではなく、 䟋えば、 文 献 「モレキュラヌ ·クロヌニング第 2版 コヌルド ·スプリング'ハヌバヌ · ラポラトリヌ1989幎」 (J. Samblook et al . , Molecular Cloning 2nd ed. , Cold Spr ing Harbor Laboratory Press (1989) に蚘茉されおいる方法に埓うこずが できる。
暙的现胞 䟋えば眹患现胞 に導入される遺䌝子ずしおは特に限定されない が、 䟋えば疟患に察する遺䌝子、 即ち、 疟患に察しお拮抗的に䜜甚する遺䌝子 や疟患における欠劂を補足する遺䌝子等を甚いるこずができる。 そのような遣 䌝子ずしおは、 具䜓的には䞊蚘の有甚タンパク質を生䜓内で発珟する遺䌝子、 䟋えばサむト力むン、 成長因子、 抗䜓たたは抗䜓断片、 サむト力むンたたは成 長因子に察するレセプ倕䞀、 増殖防止たたは现胞増殖抑制䜜甚を有するタンパ ク質、 酵玠、 血栓誘発物質、 および凝集抑制物質、 フむブリン溶解䜜甚を有す るタンパク質、りィルスコヌトタンパク質、现菌性抗原および寄生動物性抗原、 腫瘍抗原、 血液埪環に効果を有するタンパク質、 ペプチドホルモン、 およびリ ボザィムおよびアンチセンス R N Aのようなリボ栞酞からなる矀より遞択され る薬理掻性物質をコヌドする遺䌝子が挙げられる。
さらに、 特定の疟患に察する代衚的な遺䌝子ずしおは、 炎症性疟患に察しお は S〇D , 抗炎症性のサむト力むン類、 现胞接着因子に拮抗的に䜜甚するぺプ チドをコ䞀ドする遺䌝子、 酵玠欠損症に察しおは正垞な酵玠をコヌドする遺䌝 子、 受容䜓欠損症に察しおは正垞な受容䜓をコヌドする遺䌝子、 りィルス感染 症に察しおはりィルス感染现胞を殺傷するためのチミゞンキナヌれ、 ゞフテリ ァトキシン等の毒玠をコヌドする遺䌝子やりィルスの耇補等を阻害するアンチ センス、 トリプルぞリックス、 リポザィム、 デコむ、 トランスドミナントミュ —タント等をコヌドする遺䌝子、 癌に察しおは癌现胞を殺傷するためのチミゞ ンキナヌれ、 ゞフテリァトキシン等の毒玠をコヌドする遺䌝子や癌遺䌝子を䞍 掻性化するためのアンチセンス、 リポザィム、 トリプルぞリックス等をコヌド する遺䌝子や、 癌现胞を正垞化するための P 53等の癌抑制遺䌝子、 抗癌剀に 察する倚剀耐性に関䞎する遺䌝子を䞍掻性化するためのアンチセンス、 トリプ ルヘリックス、 リボザィム等をコヌド.する遺䌝子、 家族性高コレステロヌル血 症に察しおは LDLレセプ倕䞀をコヌドする遺䌝子等が挙げられる。
本発明で䜿甚される遺䌝子は、 垞法に埓っお暙的现胞の䞭で耇補可胜なブラ スミドベクタヌやファヌゞベクタヌ等に挿入しお䜜補するこずができる。 本発 明においおは、 プラスミドの圢態が奜たしい。 ベクタヌずしおは、 安定な mR NAを倧量に぀くり、 生じた mRNAが暙的现胞の䞭でも効率よく翻蚳される ように䜜られおいる発珟ベクタヌを甚いるのが奜たしい。 たた、 耇数の遺䌝子 を導入する堎合は、 同䞀の遺䌝子であっおも異なる遺䌝子であっおも、 耇補起 点 o r i ) の異なるベクタヌを甚いるのが望たしい。
プラスミドベクタヌずしおは、 䜜補する組換えベクタヌを保有する圢質転換 䜓を容易にスクリヌニングでき、 たた、 暙的现胞の䞭で組換えベクタヌを安定 に保持させる点から、 䟋えば゚リスロマむシン耐性遺䌝子、 ネオマむシン耐性 遺䌝子、 カナマむシン耐性遺䌝子等の薬剀耐性遺䌝子を保有しおもよい。
遺䌝子を挿入するのに甚いるプラスミドベクタヌずしおは、 䟋えばプラスミ ド pET— 28 a、 p FLAG-CMV- 5 a pCDM8、 p cDNA lZ Amp, p cDL-SRa, BCMGSNe o、 pSV2-n e o> p S V- 2 gp t、 pEF— B〇S、 pCEV4、 pME 18 S, pKY4、 pK 2 23— 3、 p VL 1392, pVL 1393、 T iプラスミド、 R iプラスミ ド、 pB I 121、 pUB 1 10、 p U C 1 18等のプラスミドベクタヌが挙 げられる。 プラスミドは挿入する遺䌝子の皮類によっお適宜に遞択するこずが でき、 垂販されおいるプラスミドを甚いおもよい。 垂販されおいるプラスミド ずしおは、 䟋えば pET—28 a (Nov age n瀟補、 FLAG-CMV -5 a (No v age n瀟補 等が挙げられる。
ファヌゞベクタヌずしおは、 䟋えば、 Agtllファヌゞ、 AgtlOファヌゞ等を 利甚するこずができる。 いずれも、 甚いた芪ベクタヌに察応する組換えべクタ —が埗られる。 ファヌゞベクタ䞀は、 挿入する遺䌝子によっお適宜遞択するこ ずができるが垂販されおいるものを甚いおもよい。
組換えプラスミド䜜補の䞀般的手法は、 「サムブロック他線集、 モレキナラ 侀 ·クロヌニング第 2版 コヌルド ·スプリング ·ハヌバヌ ·ラボラトリヌ (1989幎」 (J. Samblook et al. , Molecular Cloning 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) に蚘茉されおいる。
挿入する遺䌝子に甚いられる発珟カセットは、 暙的现胞内で遺䌝子を発珟さ せるこずができるものであれば、 特に制限されるこずなく䜕でも甚いるこずが できる。 発珟カセットずしおは、 動物由来の现胞内で遺䌝子発珟が可胜な発珟 カセットを甚いるこずができ、 奜たしくは哺乳類由来の现胞内で遺䌝子発珟が 可胜な発珟カセットであり、 より奜たしくはヒト由来の现胞内で遺䌝子発珟が 可胜な発珟カセットである。
発珟ベクタヌには、 遺䌝子を発珟させるため、 たたは発珟に有利ずなるよう に通垞は調節配列を含む。 各々の調節配列はその遺䌝子のアミノ酞配列をコ䞀 ドする塩基配列に察しおネィティブであっおも倖来性であっおもよい。 このよ うな調節配列は、 これらに限られないが、 プロモヌタヌ、 リヌダ䞀、 ポリアデ ニル化配列、 プロペプチド配列、 ェンハンサヌ、 シグナル配列、 スプラむシン グシグナル、 ポリ A付加シグナル、 S V40耇補オリゞンおよび転写倕䞀ミネ 䞀倕䞀を含む。 なかでも調節配列ずしおは、 少なくずもプロモヌタヌ、 および 転写ならびに翻蚳終止シグナルを含むのが奜たしい。
プロモヌタヌずしおは、 暙的现胞䞭で認識される塩基配列である適切なプロ モヌタヌ配列であればいかなるものでもよい。 䟋えば、 l acプロモヌ倕䞀、 SRaプロモ䞀倕䞀、 SV40プロモヌ倕䞀、 LTRプロモヌタヌ、 CMV (サ ィトメガロりィルスプロモヌタ䞀、 H S V-T Kプロモヌタヌ等が挙げられる。 転写倕䞀ミネ䞀倕䞀ずしおは、 転写を終結させるために暙的现胞䞭で認識さ れる配列であればよく、 䟋えばりィルス由来、 各皮哺乳動物および鳥類由来の 各遺䌝子の転写タヌミネヌタ䞀配列を甚いるこずができ、 具䜓的には、 シミア ンりィルスの S V 4 0倕䞀ミネ䞀倕䞀等が甚いられる。
発珟ベクタヌにはタンパク質の分泌に係るシグナル配列も含み埗る。 シグナ ル配列ずしおは、 導入する遺䌝子のシグナル配列を甚いるこずもできるし、 異 なる遺䌝子のシグナル配列を甚いるこずもできる。 䟋えばむンシュリン ·シグ ナル配列、 α—むンタヌフェロン ·シグナル配列、 抗䜓分子 · シグナル配列等 が利甚できる。
発珟ベクタヌには、 酵玠遺䌝子の発珟に有利である 1たたは耇数の因子、 䟋 えばァクティベヌタ䞀 䟋えばトランス䜜甚因子、 シャペロンおよびプロセッ シングプロテアヌれをコヌドする 1たたは耇数の栞酞配列も含み埗る。 暙的ず する现胞内で機胜的であるいずれかの因子も本発明に係る発珟ベクタヌに甚い るこずができる。
C末端に R X P反埩を有するタンパク質ず有甚タンパク質、 ペプチド、 遺䌝 子を挿入したプラスミド等ずは非共有結合によっお耇合䜓を圢成する。 C末端 に R X P反埩を有するタンパク質ず有甚タンパク質、 ペプチド、 遺䌝子を挿入 したプラスミド等ずの耇合䜓は暙的现胞およびその呚蟺现胞の栞小䜓䞭ぞず移 動する。
1 0 k D aより分子量の倧きい有甚タンパク質ず耇合䜓を圢成する堎合、 䟋 えば滅菌チュヌブ内の P B Sあるいは血枅欠乏培地に、 C末端に R X P反埩を 有するタンパク質を、 党量に察しお奜たしくは玄 1ノ1 0 0量 wZw) 添加 する。次に玄 0 . 2 5〜1重量郚皋床の有甚タンパク質を添加し、混合させる。 ペプチドたたは 1 0 k D a以䞋の䜎分子量有甚タンパク質あるいは遺䌝子を 挿入したプラスミドの堎合、 滅菌チュヌブ内の P B Sあるいは血枅欠乏培地に、 P B Sで玄 1 1 0量 wZw) に垌釈した C末端に R X P反埩を有するタン パク質を党量に察しお玄 1 Z 1 0 0量 w/w) 添加する。 次に玄 1 0 0〜 5 0 0重量郚皋床のペプチドあるいは 1 0 k D以䞋の䜎分子量有甚タンパク質を 添加し、 混合させる。
混合させた埌、 箄 1 5〜3 0 :皋床、 奜たしくは玄 2 0〜2 5で皋床で玄 2 0〜5 0分間皋床、 奜たしくは玄 3 0〜4 0分間皋床むンキュベヌトするこず により耇合䜓を圢成させる。 このようにしお埗られた耇合䜓を生䜓内に投䞎す る。 生䜓内ぞの投䞎方法ずしおは、 泚射等によっお盎接生䜓内に投䞎する方法 ず、 眹患现胞等の暙的现胞を患者の䜓内から摘出し、 圢質転換させた埌に䜓内 ぞ戻す方法等が挙げられ、 いずれの方法を甚いおもよい。
生䜓内に盎接投䞎する方法ずしおは特に制限されず、䟋えば静脈内、動脈内、 門脈内、 頭蓋内、 胞膜内、 腹腔内等に泚射等によっお局所的に投䞎するこずが できる。
投䞎量は C末端に R X P反埩を有するタンパク質、 有甚タンパク質、 ぺプチ ドあるいは遺䌝子を挿入したプラスミドの皮類等によっお異なるため䞀抂には 蚀えないが、 成人の堎合通垞 1乃至 1 0 0 O m g Z k g量の耇合䜓を投䞎する のが奜たしい。 投䞎量は、 医者が患者の病状 ·状態等を参考にしお適宜決定す るこずができる。
患者の䜓内から暙的ずなる现胞を摘出し、 圢質転換させた埌に生䜓内に再び 戻す方法ずしおは、 たず患者の䜓内から暙的ずなる现胞を摘出する。 そのよう な现胞ずしおは特に限定されず、 䟋えば骚髄现胞、 骚髄腫现胞、 肝现胞、 肺胞 现胞、 筋现胞、 リンパ现胞、 リンパ腺腫现胞、 乳腺刺激现胞、 皮膚繊維芜现胞、 䞊皮现胞、 内皮现胞、 間質现胞、 肝臓、 腎臓、 脟臓、 胞腺、 滕臓、 胎盀、 子宮、 肺等の噚官の実質现胞、 軟骚现胞、 神経现胞等が挙げられる。 现胞を患者の䜓 内から摘出する方法ずしおは、 䟋えば患者から血液等の䜓液を採取する方法が 挙げられるが特に限定されず、 公知の方法に埓っお行うこずができる。 さらに本発明は様々な哺乳動物现胞にも䜿甚するこずができ、 䟋えば H S - 68现胞、 N I H3T3现胞、 C 2 C 12现胞、 CEM— SS现胞、 HEPG 现胞、 He l a现胞、 サル现胞 COS— 7现胞、 Ve r o现胞 チャむニヌズ ハムスタヌ现胞 CHO (以䞋、 CHO现胞ず略蚘する、 dh f r遺䌝子欠損チ ャィニヌズ八ムス倕䞀现胞 CHO (以䞋、 CHO (dh f r—)现胞ず略蚘する、 マりス L现胞、 マりス At T— 20现胞、 マりスミ゚ロヌマ现胞、 ラット GH 3现胞、 ヒト FL现胞、 293现胞、 C 127现胞、 BALBZ3T3现胞、 Sp— 2现胞等が挙げられる。
䞊蚘の现胞は増殖を促進する条件䞋で培地䞊で増殖される。 培地ずしおは、 炭玠源および窒玠源が含有されるものが䜿甚できる。炭玠源ずしおは、䟋えば、 糖、 有機酞等が挙げられ、 糖ずしおは、 䟋えば、 グルコヌス、 グリセロヌル、 柱粉、 デキストラン、 糖蜜等が挙げられる。 窒玠源ずしおは、 䟋えば、 有機窒 玠源、 無機窒玠源等が挙げられ、 有機窒玠源ずしおは、 䟋えば、 カれむン、 ぺ プトン、 肉゚キス、 酵母゚キス、 カザミノ酞、 グリシン等が挙げられ、 無機窒 玠源ずしおは、䟋えば、硫酞アンモニゥム、硝酞アンモニゥム等が挙げられる。 圢質転換させるために现胞から培地を取り陀き PB Sによっお掗浄した埌、 前述した条件で調敎した耇合䜓を目的の现胞に添加し、 箄 5 %の C 02含有の加 湿倧気䞭で玄 1時間以䞊、 箄 35〜40°C皋床、 望たしくは玄 37 でむンキ ュベヌ卜するこずで䞊蚘耇合䜓ず现胞を充分接觊させる。
次に现胞に完党成長培地を玄 lml付加し、 箄 0. 5〜 2時間皋床、 有甚倕 ンパク質の堎合には奜たしくは玄 0. 5〜1時間皋床、 ペプチドたたは䜎分子 量有甚タンパク質、 あるいはプラスミドの堎合には玄 1〜2時間皋床、 箄 15 〜42 皋床、 奜たしくは玄 30〜40 皋床でむンキュベヌトする。 このず き所望により通気や撹拌を行うこずもできる。
培地には、 必芁に応じお栄逊物質を添加添加しおもよい。 このような栄逊物 質ずしおは、 䟋えば、 血枅、 アミノ酞、 ビタミン類、 栞酞、 塩類等が挙げられ る。 培地ずしおは、 䟋えば、 糖ず無機窒玠源を䞻䜓ずする合成培地を䜿甚する こずができる。培地ずしお固䜓培地を䜿甚する堎合は、さらに寒倩を添加する。 たた、 圢質転換䜓を安定に保持させ、 圢質転換䜓を保有しない株の成育を抑 制する点から、 培地に抗生物質を添加しおもよい。 このような抗生物質ずしお は、 䟋えば、 ペニシリン、 ゚リスロマむシン、 ネオマむシン、 クロラムプ二 コヌル、 バシトラシン、 D—サむクロセリン、 アンピシリン等が挙げられる。 曎に、 必芁により、 消泡剀ずしお、 倧豆油、 ラヌド油および各皮界面掻性剀等 を培地に添加しおもよい。 培地の pHは、 圢質転換䜓が生育可胜な pHの芳点 から、 通垞玄 5〜9皋床ずされ、 箄 6. 5〜7. 5皋床ずするこずが奜たしい。 埗られた圢質転換䜓を患者の䜓内に戻す。 そのような方法ずしおは特に制限 されず、 䟋えば静脈内投䞎、 患郚ぞの局所投䞎、 経口投䞎等により治療を必芁 ずする患者に投䞎可胜である。 投䞎の目的で必芁ならば、 薬孊的に蚱容される 担䜓、 賊圢剀、 安定化剀、 溶解補助剀等の添加物を加えお前蚘投䞎に適した補 剀ずする。なお、 これらの遺䌝子療法を実斜するための䞀般的手順は、䟋えば、 島田隆、 斉藀泉、 小柀敏也線集、 『実隓医孊別冊バむオマニュアル UPシリヌズ 遺䌝子治療の基瀎技術』、 1996幎、 矊土瀟発行に詳述されおいる。 実斜䟋
[詊隓䟋 1 ]
アフリカミドリザルの腎臓现胞の安定な系統であるべ口现胞を、 5%ゥシ血 枅を含有する E a g 1 e最少必芁培地 MEM) 䞭で生育した。
HSV— 2タンパク質の现胞間茞送胜を調べるために、 プラスミド p c DN A-US 1 1を構築した。 PCRプラむマヌは US 11 B amH I (ATTA た。 PCR産物を B amH Iず No t Iで切断した埌、 p cDNA3. 1 (+ ) でクロヌン化した。 ベロ现胞ぞは、 G i b c oBRL瀟が掚奚するプロトコ䞀 ルに埓っお、 リポプクタミン詊薬を䜿甚するこずによっお移入された。
抗血枅を甚いた間接免疫蛍光法によっお P cDNA— US 1 1の现胞ぞの移 入を調べた。 抗血枅は 2矜のゥサギを甚いお、 倧腞菌で発珟した 6 xH i sが 付加した HS VUS 1 1タンパク質玄 0. 6 mg含有ェマルゞペンを甚いお、 MPL + TDM+CWSェマルゞペンアゞュバントシステム R I B I I m munoChem Re s e a r c h, I nc., モンタナ で免疫反応を行い 生産した。 接皮は、 毛を剃った背䞭に皮䞋泚射するこずで行われた。 同じアゞ ュバントず粟補タンパク質 0. 6mgを甚いお、 連続的に刺激した。 合蚈 3回 にわた぀お刺激を䞎え、 第 1回目の泚射の埌それぞれ 2週間間隔で䞎えられた。 最埌の免疫反応から 2週間埌、 心臓から血液を採取した。 ゥサギポリクロヌナ ル抗 US 1 1抗血枅は HSV— 2感染现胞の溶解物䞭に存圚する芋かけ分子量 20 kDaず 21 k D aのタンパク質ず匷く反応する。
现胞を PBSで掗浄し、 45分間 4 で 4%パラホルムアルデヒド PFA) で固定した。 PF Aで固定した埌、 0. 05%トリトン X— 100を含む PB Sで 45分間掗浄した。
䞀次抗䜓は、 ゥサギポリクロヌナル抗 US 11抗血枅を 1Z500 (w/w) の割合で垌釈しお甚いた。 37でで 30分間むンキュベヌトした埌、 カバヌガ ラスを PBS䞭で掗浄し、 37°Cで 30分間二次抗䜓で暙識した。
二次抗䜓は、 F I TC抱合ャギ抗ゥサギ I gG (MBL補 を甚いた。 PB Sで掗浄埌、 カバヌガラスをすみやかに P e r ma F 1 u 0 r ( I mmu n o n瀟補 を甚いおスラむドガラス䞊にのせた。 その埌、 Z e i s sレヌザ䞀走 査顕埮鏡 LSM510で解析した。
US 1 1の蛍光は栞小䜓だけでなく现胞質でも芳察された。 たた、 呚蟺にあ る倚数の现胞の栞小䜓でも匷い蛍光が怜出された。
[詊隓䟋 2] HSVUS 1 1タンパク質の现胞間での広がりをさらに調査するために、 U S 1 1侀 FLAG融合タンパク質を発珟する p FLAG— US 1 1を構築し、 その掻性胜に぀いお調べた。 この堎合、 䞀次抗䜓には抗 FLAGマりスモノク ロヌナル抗䜓が US 11—FLAG融合タンパク質の怜出に甚いられた。
US 1 1侀 FLAG融合タンパク質を発珟する p FLAG— US 1 1を䜜補 するために、 US 1 1 GFPFWず US 1 1 GFPRv—の PCR産物を、 p FLAG— CMV— 5 aの Bg l I I /S a 1 I郚䜍に挿入しお p F LAG— US 11を䜜補し、 クロヌン化した。 プラスミド pFLAG— CMV— 5 a (S i gma瀟 は、 HCMVi讓 ediate early プロモヌタヌの制埡䞋で、 US 1 1侀 FLAG融合タンパク質を発珟する。
䞀次抗䜓に抗 FLAGマりスモノクロヌナル抗䜓 S i gma瀟補 を 1 100 (w/w) の割合で垌釈したもの、 二次抗䜓には F I TC抱合抱合ャギ 抗マりス I gG (S i g ama瀟補 を甚いた以倖は、 詊隓䟋 1ず同様にしお 間接免疫蛍光枬定を行った。 抗 FLAGマりスモノクロヌナル抗䜓は、 pFL AG— CMV— 5 aベクタヌの MC S䞭で、 K p n I郚䜍以降に䜍眮する 8ァ ミノ酞塩基配歹1 J (As p-Tr y-Ly s -As p— As p - A s p - A s p — Ly s) を認識する。
少数の现胞においお栞小䜓ず现胞質の䞡方が匷く染色され、 さらにその呚蟺 现胞では栞小䜓が染色された。 埓っお、 倧倚数の现胞は栞小䜓染色パタヌンを 瀺しおいた。
[詊隓䟋 3]
HSVUS 1 1タンパク質の现胞間茞送胜がより倧きなポリペプチドを融合 する時に保持されるのかどうかを調べるために、 US 1 1— EGFPあるいは EGFP-US 11発珟プラスミドを構築した。
US 1 1ず EGFPの融合タンパク質を発珟するために、 pEGFP— C 1 -US 1 1ず pEGFP— N3—US 1 1を構築した。 それら䞡方に察しお、 フォワヌド PCRプラむマヌは B 1 I I郚䜍を組み蟌んでいる US 11 GF ぀た。 pEGFP— C 1 -US 1 1に察するリバヌスプラむマヌは U S 1 1 G で、 pEGFP— N3—US 1 1に察するリバヌスプラむマ䞀は S a 1 I郚䜍 に組み蟌たれた US 1 1 GFPR V - (AATCGTCGACGGCAAGC CCGCGGGTTGC) であった。
各ペアの PCR産物を、 Bg 1 I I— S a 1 I断片ずしお Bg 1 I I /S a 1 Iで切断し、 pEGFP— C 1ず pEFGP— N3に挿入し、 pEGFP— C 1— US 1 1ず pEGFP— N3—US 1 1を䜜補した。
詊隓䟋 1ず同様にしお现胞にプラスミドを移入し、 40時間埌现胞を冷ァセ トンで固定した。 䞀次抗䜓にゥサギポリクロヌナル抗 US 11抗血枅、 二次抗 䜓には F I TC抱合ャギ抗ゥサギ I gG (MBL瀟補 を甚いお、 詊隓䟋 1ず 同様にしお間接免疫蛍光枬定を行぀た。
US 1 1 _£0 ぁるぃは50??_131 1のいずれにおいおも移入现 胞では栞小䜓ず现胞質の䞡方が、 それらの呚囲の现胞でも蛍光が芳察された。 たた、 倧倚数の现胞は栞小䜓染色パタヌンを瀺しおいた。 これは、 现胞間移入 掻性がこれらの融合タンパク質で保持されおいるこずを瀺す。 [詊隓䟋 4]
现胞内に倖因性の HS VUS 1 1タンパク質が移入されるかを怜蚎した。 粟補 6 xH i sが付加した US 1 1融合タンパク質を 10 OmMN a C 1ず 1 0%グリセロヌルを含む PBSに察しお透析し、 〇PT I MEM (G i b e oBRL瀟補 に垌釈した。 5%ゥシ血枅を含有する E a g 1 e最少必芁培地 (MEM) 䞭で生育したアフリカミドリザルの腎臓现胞の安定な系統であるべ 口现胞を 2回 PB Sで掗浄した。 次に、 さたざたな濃床の粟補 HSVUS 1 1 タンパク質の存圚䞋で、 现胞を 37 で 10分間むンキュベヌトした。 再床冷 PBSでし぀かりず掗浄した埌、 现胞を冷アセトンで固定し、 ゥサギポリクロ 䞀ナル抗 US 1 1抗血枅、 二次抗䜓に F I TC抱合ャギ抗ゥサギ I gG抗䜓を 甚いお詊隓䟋 1ず同様にしお間接免疫蛍光枬定を行った。
US 11特異的蛍光は䞻に栞小䜓で芳察されたが、 より高濃床の HSVUS 1 1タンパク質でむンキュベヌトした堎合では、 栞小䜓だけでなく现胞質でも 怜出するこずができた。 これらの結果は、 倖因性の HSVUS 1 1タンパク質 が现胞内に入るこずを瀺す。 [詊隓䟋 5]
゚ンドサむト䞀シスのような゚ネルギヌ䟝存経路が、 HSVUS 1 1タンパ ク質の现胞ぞの内圚化に関䞎しおいるのかどうかを怜蚎するために、 詊隓䟋 4 ず同様にし、 4 の条件䞋で、 6 xH i sが付加した US 1 1融合タンパク質 の现胞摂取量を怜定した。
6 xH i sが付加した US 1 1融合タンパク質は 4 で现胞内にはいり、 お もに栞小䜓に集積されるこずが瀺された。 现胞質の蛍光は、 4 でむンキュべ ヌトした现胞の方が 37 でしたものよりも匷かった。 よっお、 HSVUS 1 1タンパク質の现胞ぞの内圚化ぱネルギヌ非䟝存性の経路によるこずが瀺さ れた。
[実斜䟋 1 ]
有甚なタンパク質ずしお、 免疫担圓现胞においおむンタヌフェロン—ァ 以 䞋、 I FN—ァ ず略す の産生を誘導するタンパク質を甚いた。 C末端に RX P反埩を有するタンパク質ずしおは単玔ぞルぺスりィルスの HSVUS 1 1倕 ンパク質を甚いた。
粟補 I FN—ァ 産生タンパク質を以䞋の方法によっお調敎した。 8週霢の雌 CD- 1マりス 600匹の腹腔内にコリネバクテリゥム ·パルバム ATCC 1 1827) を 60でで 1時間加熱しお調補した死菌䜓を lmgZ匹泚射投䞎 し、 通垞䞀般の方法で 7日間飌育埌、 静脈内に倧腞菌由来の粟補リポ倚糖を 1 匹泚射投䞎した。 1〜2時間埌、 類掚を脱臌させおマりスを屠殺し、 心 臓採血埌、 肝臓を摘出し、 8倍容の 5 OmM燐酞緩衝液 pH7. 3) 䞭、 ホ モゲナむザ䞀により砎砕しお抜出した。 抜出物を玄 8 000 r pmで 20分 間遠心分離し、 埗られた䞊枅玄 9 Lに飜和硫酞アンモニゥムを含む 5 OmMリ ン酞緩衝液PH7. 3)を硫酞アンモニゥムが 45%飜和になるように加え、 4 Xで 18時間静眮埌、 箄 8 000 r pmで 30分間遠心分離しお圓該タン パク質を含む䞊枅玄 19 Lを埗た。
この䞊枅を予め 1M硫酞アンモニゥムを含む 5 OmMリン酞緩衝液 pH7. 3) で平衡化させおおいたプ二ルセファロヌス フアルマシア補 4. 6L のカラムを甚い、 カラムを新鮮な同䞀緩衝液で掗净埌、 1Mから 0. 2Mに䞋 降する硫酞アンモニゥムの濃床募配䞋、 5 OmMリン酞緩衝液 pH7. 3) を SVO. 57で通液した。 硫酞アンモニゥム濃床が 0. 8M付近のずきに溶 出した圓該タンパク質を含む画分 4. 8Lを採取し、 膜濃瞮し、 20mMリン 酞緩衝液 PH6. 5) に察しお 4 °Cで 18時間透析埌、 予め 20mMリン酞 緩衝液 pH6. 5) で平衡化させおおいた DEAE—セファロ䞀ス フアル マシア補 25 OmLのカラムに負荷した。 カラムを新鮮な同䞀緩衝液で掗浄 埌、 0Mから 0. 2 Mに䞊昇する塩化ナトリりムの濃床募配䞋、 カラムに 20 mMリン酞緩衝液 pH6. 5) を SV 1. 2で通液したずころ、 圓該タンパ ク質が 0. 13 M付近の塩化ナトリりム濃床で溶出した。
圓該タンパク質を含む溶出液 26 OmLを採取し、 濃瞮し、 25mMビス䞀 トリス緩衝液 pH7. 1) に察しお 4でで 18時間透析埌、 予め新鮮な同䞀 の緩衝液で平衡化させおおいた Mo n o— P (フアルマシア補 24mLの力 ラムに負荷し、 pH7から pH4に䞋降する pH募配䞋、 カラムに 10% (v /v) ポリバッファヌ 74 (pH4. 0) を通液したずころ、 pHが 4. 8の ずきに圓該タンパク質が溶出した。 圓該タンパク質を含む溶出液 23mLを採 取し、 濃瞮し、 予め 7 mMリン酞氎玠ニナトリりム、 3 mMリン酞二氎玠ナト リりムおよび 139mM塩化ナトリりムからなる混液 pH7. 2) で平衡化 させおおいたスヌパヌデックス 75 (フアルマシア補 のカラムに負荷し、 新 鮮な同䞀混液を通液しおゲル濟過クロマトグラフィヌしたずころ、 分子量 1 9, 000ダルトン付近に圓該タンパク質が溶出した。 圓該タンパク質を含む画分 を採取した。 収量は、 マりス 1匹圓たり玄 0. 6 n gであ぀すこ。
粟補 HSVUS 1 1タンパク質は、 以䞋の方法によっお埗た。 たずフォヮ䞀 ドプラむマ䞀ずしお US 1 1 _F (ATTAGGATCCATGGCATCC GGGGTTTCC) ずリバヌスプラむマヌずしお US 1 1—R (TTATG
1 1タンパク質をコ䞀ドしおいる塩基配列を HSV— 2 186ゲノム DNAか らポリメラ䞀れチェヌンリアクション Polymerase Chain Reaction以䞋 P C R法ず略称する で増幅した。
埗られた PCR産物を S a 1 Iず No t Iで切断し、 倧腞菌発珟ベクタヌ p ET- 28 a (No v a g e n瀟補 の枠内に挿入し、 プラスミド pET— 2 8 a-US 1 1を䜜補しおクロヌン化した。 このプラスミドを倧腞菌 BL 21 DE 3æ ª Nov a g e n瀟補 に圢質転換し、 6 xH i sが付加した US 1 1融合タンパク質を倧量に発珟させた。 6 xH i sが付加した US 1 1融合倕 ンパク質発珟现胞を PBS䞭で超音波にお溶解分離し、 现胞片を遠心分離によ ぀お取り陀き、 30 OmMむミダゟ䞀ル含有画分で 6 xH i sが付加した US 1 1融合タンパク質を溶出するこずで埗た。
滅菌チュヌブ内に 5 mL P B Sを添加し、 䞊蚘の方法で埗られた H S VUS 1 1タンパク質 50 および I FN_r産生タンパク質 0. 5 gを添加し、 25でで 30分間ィンキュヌべ䞀卜し、 HS VUS 1 1タンパク質 · I FN— ァ産生タンパク質の耇合䜓を埗た。 産業䞊の利甚可胜性
本発明によっお有甚タンパク質、 ペプチドおよび遺䌝子等が生䜓内で现胞に 効率的に茞送される。 たた、 本発明を甚いるこずによっお、 有甚タンパク質を 现胞に茞送する際、 有甚タンパク質の倱掻あるいは倉性を起こすこずなく茞送 するこずができ、 さらに现胞に入れるのが困難である薬剀も现胞ぞ容易に盎接 導入するこずができるこずから、 薬剀の著しい効果を埗るこずができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. C末端に匏 Ar g— Xa a_Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞性 のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニッ卜の繰り返し構造を有する タンパク質に a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なくず も 1぀を結合させ生物に投䞎するこずを特城ずする、 a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なくずも 1぀を生䜓内で茞送する方法。
2. 遺䌝子がプラスミドに挿入されおいるこずを特城ずする請求の範囲第 1 項蚘茉の方法。
3. 生䜓内での茞送が现胞間茞送であるこずを特城ずする請求の範囲第 1項 蚘茉の方法。
4. 现胞間茞送が暙的现胞ぞの茞送であるこずを特城ずする請求の範囲第 3 項蚘茉の方法。
5. 暙的现胞が眹患现胞であるこずを特城ずする請求の範囲第 4項蚘茉の方 法。
6. タンパク質が単玔ぞルぺスりィルスの US 1 1タンパク質であるこずを 特城ずする請求の範囲第 1項蚘茉の方法。
7. 有甚タンパク質がサむト力むン類たたはむンタヌフェロン— α、 β、 r もしくは ω、 であるこずを特城ずする請求の範囲第 1項蚘茉の方法。
8. C末端に匏 Ar g_Xa a— Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞性 のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニッ卜の繰り返し構造を有する タンパク質の a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なくず も 1぀を生䜓内で茞送するための䜿甚。
9. C末端に匏 Ar g— Xa a_Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞性 のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニッ卜の繰り返し構造を有する タンパク質ず a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なくず も 1぀を結合させた耇合䜓の生䜓内茞送剀。
10. C末端に匏 A r g— X a a— Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞 性のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニッ卜の繰り返し構造を有す るタンパク質ず a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なく ずも 1぀を結合させた耇合䜓。
1 1. 遺䌝子がプラスミドに挿入されおいるこずを特城ずする請求の範囲第 10項蚘茉の耇合䜓。
12. タンパク質が単玔ぞルぺスりィルスの US 1 1タンパク質であるこず を特城ずする請求の範囲第 10項蚘茉の耇合䜓。
13. C末端に匏 Ar g— Xa a_Pro (匏䞭 X a aは疎氎性あるいは酞 性のアミノ酞残基を衚す で瀺されるペプチドュニッ卜の繰り返し構造を有す るタンパク質ず a) 有甚タンパク質、 b) ペプチドおよび c) 遺䌝子の少なく ずも 1぀を結合させた耇合䜓を患者に投䞎するこずを特城ずする人たたは動物 の病気の治療方法。
PCT/JP2002/006703 2001-07-05 2002-07-02 Methode de transport de polymere physiologique au moyen d'une proteine presentant une sequence repetitive rxp WO2003004065A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02743781A EP1402903A4 (en) 2001-07-05 2002-07-02 METHOD FOR TRANSPORTING PHYSIOLOGICAL POLYMER USING PROTEIN HAVING REPETITIVE RXP SEQUENCE
US10/482,803 US20050220806A1 (en) 2001-07-05 2002-07-02 Method of transporting physiological polymer using protein having rxp repeated sequence
JP2003510074A JPWO2003004065A1 (ja) 2001-07-05 2002-07-02 繰り返し配列を有するタンパク質を甚いた生理的高分子の茞送方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001204618 2001-07-05
JP2001-204618 2001-07-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003004065A1 true WO2003004065A1 (fr) 2003-01-16

Family

ID=19041056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2002/006703 WO2003004065A1 (fr) 2001-07-05 2002-07-02 Methode de transport de polymere physiologique au moyen d'une proteine presentant une sequence repetitive rxp

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20050220806A1 (ja)
EP (1) EP1402903A4 (ja)
JP (1) JPWO2003004065A1 (ja)
WO (1) WO2003004065A1 (ja)

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUISSON MONIQUE: "The C-terminal region but not the Arg-X-Pro repeat of Epstein-Barr virus protein EB2 is required for its effect on RNA splicing and transport", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 73, no. 5, 1999, pages 4090 - 4100, XP002956393 *
DEROSSI DANIELE: "Cell internalization of the third helix of the antennapedia homeodomain is receptor-independent", J. BIOL. CHEM., vol. 271, 1996, pages 18188 - 18193, XP002024485 *
ELLIOTT GILLIAN: "Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein", CELL, vol. 88, 1997, pages 223 - 233, XP002956398 *
KOSHIZUKA TETSUO: "The US11 gene of herpes simplex virus has intercellular trafficking activity", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 288, 2 November 2001 (2001-11-02), pages 597 - 602, XP002956396 *
LAI ZHENNAN ET AL: "Intercellular delivery of a herpes simplex virus VP22 fusion protein from cells infected with lentiviral vectors", PROC NATL ACAD SCI, vol. 97, no. 21, 2000, USA, pages 11297 - 11302, XP002987634 *
PHELAN ANNE: "Intercellular delivery of functional p53 by the herpesvirus protein VP22", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 16, 1998, pages 440 - 443, XP002157802 *
PROCHIANTZ ALAIN: "Messenger proteins: homeoproteins, TAT and others", CURRENT OPINION IN CELL BIOLOGY, vol. 12, no. 4, 2000, pages 400 - 406, XP002956397 *
ROLLER RICHARD J.: "Structure and function in the herpes simplex virus 1 RNA-binding protein U(s)11: mapping of the domain required for ribosomal and nucleolar association and RNA binding in vitro", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 70, no. 5, 1996, pages 2842 - 2851, XP002956395 *
SCHAERER-UTHURRALT NATHALIE: "Distinct domains in herpes simplex virus type 1 US11 protein mediate post-transcriptional transactivation of human T-lymphotrophic virus type I envelope glycoprotein gene expression and specific binding to the Rex responsive element", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 79, no. PART 7, 1998, pages 1593 - 1602, XP002956394 *
See also references of EP1402903A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2003004065A1 (ja) 2004-10-21
EP1402903A1 (en) 2004-03-31
US20050220806A1 (en) 2005-10-06
EP1402903A4 (en) 2005-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9932377B2 (en) Mitochondrial targeting and therapeutic use thereof
AU621358B2 (en) Mutant human angiogenin (angiogenesis factor with superior angiogenin activity) genes therefor and methods of expression
CN100558745C (zh) 同种排斥反应的特匂性抑制
JP2010503616A (ja) アポトヌシスを抑制するための薬孊的組成物および前蚘薬孊的組成物をデリバヌするための方法
JPH04504125A (ja) 脊怎動物における倖因性ポリヌクレオチド配列の発珟
CN105770871A (zh) IdeS蛋癜酶(来自于酿脓铟球菌)圚自身免疫性疟病和移怍排斥的治疗䞭的甚途
KR20010015869A (ko) 레슀틎 및 귞의 사용 방법
CN104711243B (zh) 重组的匹性蛋癜酶蛋癜莚及其制倇方法和甚途
EP4086275A1 (en) Multimerization delivery system for intracellular delivery of molecule
CN116836233A (zh) 抗炎掻性倚肜及其应甚
US20170065684A9 (en) Phenotypic reversion of pancreatic carcinoma cells
EP1049487B1 (en) Treatment of acute intermittent porphyria (aip) and other porphyric diseases
CN108410893B (zh) 䞀种由NF-κB启劚的肿瘀细胞特匂效应基因衚蟟蜜䜓及其衚蟟产物和应甚
JP2001521733A (ja) ヒト䞊皮増殖因子ずヒトアンギオゲニンの融合タンパク質およびその補造方法
EP0568539A1 (en) Soluble mannose receptor peptides
US20040138115A1 (en) Local pain-combating agent
WO2003004065A1 (fr) Methode de transport de polymere physiologique au moyen d'une proteine presentant une sequence repetitive rxp
CN102260352B (zh) 靶向性癜细胞介玠融合蛋癜及其制倇方法䞎应甚
JPWO2003078460A1 (ja) ペプチド、該ペプチドを含有する医薬組成物及び癌治療甚医薬組成物
WO2001007065B1 (en) PRODUCTION OF rhPBGD AND NEW THERAPEUTIC METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH ACUTE INTERMITTENT PORPHYRIA (AIP) AND OTHER PORPHYRIC DISEASES
US20050181064A1 (en) Drugs comprising protein forming hollow nanoparticles and therapeutic substance to be transferred into cells fused therewith
NZ506695A (en) Utilization of cd137 in order to promote the profileration of peripheral monocytes
CN116789750B (zh) 预防和/或治疗宫颈癌的倚肜及其应甚
CN111909246A (zh) 高效感染支持细胞的aav突变䜓
CN116789751B (zh) 预防和/或治疗纀绎化疟病的倚肜及其应甚

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CN CO CR CU CZ DM DZ EC EE GD GE HR HU ID IL IN IS JP KG KR KZ LC LK LR LT LV MA MD MG MK MN MX NO NZ OM PH PL RO RU SG SI SK TJ TM TN TT UA US UZ VN YU ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002743781

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003510074

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10482803

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002743781

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2002743781

Country of ref document: EP