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WO2003000723A1 - Transportproteine für stickstoffhaltige heterozyklen und hierfür codierende nukleinsäuren - Google Patents

Transportproteine für stickstoffhaltige heterozyklen und hierfür codierende nukleinsäuren Download PDF

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WO2003000723A1
WO2003000723A1 PCT/EP2002/006837 EP0206837W WO03000723A1 WO 2003000723 A1 WO2003000723 A1 WO 2003000723A1 EP 0206837 W EP0206837 W EP 0206837W WO 03000723 A1 WO03000723 A1 WO 03000723A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
nucleic acid
oxo
sequence
heterocycle
Prior art date
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Ceased
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PCT/EP2002/006837
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English (en)
French (fr)
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WO2003000723B1 (de
Inventor
Wolf B. Frommer
Karin Schumacher
Marcelo Desimone
Elisabetta CATONI MÜLLER
Melanie Hilpert
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Publication of WO2003000723A1 publication Critical patent/WO2003000723A1/de
Publication of WO2003000723B1 publication Critical patent/WO2003000723B1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the invention relates to nucleic acids which contain the coding region for a transport protein for nitrogen-containing heterocycles, in particular their oxo derivatives.
  • the invention further relates to the use of nucleic acids and vectors, mobile elements, host cells and plants and their parts and seeds which contain such nucleic acids.
  • the invention also relates to methods for producing plants which have been transformed with the nucleic acids.
  • the invention also relates to transport proteins for nitrogen-containing heterocycles.
  • Transporters play a special role for living organisms. You decide whether a substance is taken up or released into or out of a cell or organism and also control the transport and distribution of the substances between cells. As a rule, transporters are at the beginning or end of a metabolic pathway and therefore generally perform superordinate control functions. Transport processes for the distribution of assiliates, metabolites and phytohormones are of great importance in higher plants. In this context, particular mention should be made of transport processes for nitrogen-containing heterocycles, since these compounds play a central role in the metabolism of the plant.
  • the nitrogen fixed in the root nodules in the form of allantoin and its degradation product Allantoat are transported from the roots of the roots to the shoot.
  • transporters probably also play an important role in non-legumes, for example during senescence.
  • the nucleobases contain a considerable amount of the total nitrogen in the form of N-containing heterocycles.
  • N-containing heterocycles During senescence there is a general mobilization of the nutrients in the dying tissues, which are then transported to the corresponding storage organs or fruits. By removing and breaking down N-containing heterocycles, the nitrogen they contain can be recovered.
  • N-containing heterocycles in particular their oxo derivatives, also play an important role in the plant's secondary metabolism, for example when hormones transmit signals.
  • hormones e.g. to name compounds such as nicotine, barbituric acid or caffeine.
  • pesticides which are derivatives of hydantoin, are another important class of oxo derivatives of N-containing heterocycles.
  • Transport adenine and cytosine are important compounds such as e.g. Allantoin, hydantoin, oxypurinol, uracil, urate (uric acid or salts thereof) or xanthine cannot be transported.
  • nucleic acid which contains the coding region for a transport protein for nitrogen-containing heterocycles, in particular their oxo derivatives, the nucleic acid coding for a transport protein which encodes one or more compounds selected from the group consisting of an oxo derivative with at least two oxo groups in the ring system of the heterocycle, except caffeine, and an oxo derivative with at least three oxo groups in the ring system of the heterocycle.
  • Preferred oxo derivatives with at least two oxo groups (-CO-) in the ring system are hydantoin, oxypurinol, uracil and xanthine.
  • Preferred oxo derivatives with at least three oxo groups in the ring system are allantoin and urate.
  • the present invention also relates to a nucleic acid which contains the coding region for a transport protein for nitrogen-containing heterocycles, in particular its oxo derivatives, the nucleic acid a) a DNA sequence which is suitable for a peptide according to one of the sequences of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 22 coded, or b) comprises a nucleotide sequence complementary to the DNA sequence according to a), or c) comprises an RNA sequence or DNA / RNA mixed sequence corresponding to the DNA sequence according to a), or d) hybridizes with a nucleic acid which has the DNA sequence according to a) or a nucleotide sequence complementary to the DNA sequence according to a).
  • the sequences of SEQ ID NO: 15 to SEQ ID NO: 22 mentioned are variants of the following consensus sequence, which contains a potential ATP binding site and is common to transport proteins of the UPS family described here for the first time:
  • nucleic acids according to the invention code for transport proteins which occur in different tissues and control both the import and the export of N-containing heterocycles, in particular of their oxo derivatives.
  • N-containing heterocycles used here includes
  • Nucleobases and their derivatives as well as substances chemically related to nucleobases include, for example, the purine bases adenine and guanine as well as derivatives such as xanthine, hypoxanthine, allantoin, urate (uric acid and its salts), xanthosine or inosine.
  • cytokinins e.g. Zeatin, isopentenyladenine or kinetin and certain alkaloids such as e.g. Caffeine, theophylline, theobro in or nicotine are included in this term.
  • the N-containing heterocycles also include the pyridine bases cytosine, thymine and uracil and derivatives such as barbiturates. Also folic acid, oxypurinol and
  • nucleobases can also be modified and coupled, for example, to sugar or other building blocks.
  • the term thus also includes ribosides such as adenosine or cytidine, but also cytokine ribosides.
  • oxo derivatives of N-containing heterocycles used here means that at least one oxo group (-CO-) occurs in the ring system of the heterocycle.
  • allantoin, allopurinol, barbiturates, cytosine, guanine, folic acid, hydantoin, inosine, oxypurinol, paraxanthine, theobromine, theophylline, thymine, uracil, urate, xanthine and xanthosine are oxo derivatives of N-containing heterocycles.
  • N-heterocycle transporters proteins which are involved in the transport of N-containing heterocycles, that is to say, for example, one of the abovementioned compounds, through a biomembrane.
  • This transport can take place actively or passively.
  • the method described by Ninnemann et al. (1994, EMBO J. 15, 3464-3471) can be used.
  • the transport proteins have no relationship to the allantoin transporter DAL4 known for yeast ⁇ Saccharomyces cerevisiae) and are also not related to the PUP family (Gillissen et al., 2000, The Plant Cell 12, 291-300) ,
  • the nucleotide sequences of the nucleic acids according to the present invention can be DNA or RNA sequences, but also mixed sequences of DNA and RNA nucleotides.
  • the term “an RNA sequence corresponding to the DNA sequence” designates an RNA sequence which has the same sequence of the purine and pyrimidine bases as a DNA sequence, but instead of the base thymine in the DNA sequence, but has the base uracil.
  • a DNA / RNA mixing sequence is understood here to mean a nucleotide sequence which contains both DNA nucleotides and RNA nucleotides. Chimeric oligonucleotides represent such mixed sequences, for example.
  • hybridizing means hybridizing under normal conditions, as described in Sa brook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., 1989), preferably under stringent conditions.
  • Stringent hybridization conditions are, for example: hybridization in 4 x SSC at 65 ° C and subsequent multiple washing in 0.1 x SSC at 65 ° C for a total of about 1 hour.
  • Hybridization conditions that are not very stringent are, for example: hybridization in 4 x SSC at 37 ° C. and then repeated washing in 1 x SSC at room temperature.
  • stringent hybridization conditions used here can also mean: hybridize at 68 ° C. in 0.25 M sodium phosphate, pH 7.2, 7%
  • the nucleic acid a) preferably comprises a DNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7, or b) one to the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 complementary nucleotide sequence, or c) one of the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 corresponding RNA sequence or DNA / RNA mixing sequence, or d) hybridizes with a nucleic acid which contains the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or one complementary to the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, S
  • the invention also relates to nucleic acid constructs, vectors or mobile genetic elements which contain at least one nucleic acid according to the present invention.
  • Nucleic acid constructs according to the invention are composed of several nucleic acids and, in addition to a nucleic acid according to the invention, also contain, for example, a regulating element which controls the expression of the nucleic acid in a cell. Examples of such regulating elements are constitutive or inducible promoters, such as the viral CaMV35S promoter (Pietrzak et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868).
  • the construct can also be in a vector or mobile genetic element.
  • Vectors or mobile genetic elements which are suitable for introducing nucleic acids into host cells, for example viruses, bacteriophages, cosmids, plasmids, artificial yeast chromosomes, T-DNA, transposons, insertion sequences etc., are well known to the person skilled in the field of molecular cloning techniques.
  • the nucleic acid according to the invention is preferably contained in the construct, the vector or mobile genetic element in antisense orientation. "Antisense Orientation" one
  • nucleic acid means that transcription of the nucleic acid results in an mRNA whose nucleotide sequence is complementary to the natural (endogenous) mRNA, so that its translation is hindered or prevented.
  • Antisense orientation of an RNA means that the
  • RNA sequence is complementary to an endogenous mRNA and its translation is hindered or prevented by attachment. If a nucleic acid according to the invention is introduced in the antisense orientation, for example with the aid of a vector, into the genome of a plant cell, this can suppress the formation of the plant's own N-heterocycle transporter molecules.
  • the translation of the mRNA of the endogenous N-heterocycle transporter is hindered by the attachment of an antisense RNA to the mRNA.
  • the antisense RNA is formed by transcription of the DNA sequence. In the case of one of the DNA sequences speaking RNA sequence, this can itself represent the antisense RNA.
  • nucleic acids chimeric oligonucleotides composed of RNA and DNA sequences, as described, for example, by Rice et al. , 2000, Plant Physiology 123, 427-437, to use in order to mute the endogenous N-heterocycle transporter gene.
  • the affected cells are largely prevented from forming N-heterocycle transporters.
  • tissue-specific promoters By coupling to suitable tissue-specific promoters, it is also possible to specifically reduce or suppress the formation of N-heterocycle transporters in certain tissues or organs of the plant, for example in the leaves.
  • the invention further relates to eukaryotic or prokaryotic host cells which contain at least one nucleic acid according to the present invention.
  • the nucleic acid is preferably contained in the host cell in an antisense orientation. However, it can also be contained in a sense orientation in an RNA double strand or a chimeric oligonucleotide in the host cell. This also enables the endogenous N-heterocycle transporter gene to be muted.
  • the nucleic acid can be introduced into plant cells, for example, by transformation, microinjection, protoplast fusion, electroporation, virus infection or other techniques known to the person skilled in the art.
  • the invention also relates to plants and parts or seeds of plants which have been transformed with at least one nucleic acid according to the present invention.
  • the plants can be legumes, for example soybeans, peas, beans or peanuts. But there are also many others
  • Plants in question for example potatoes, tomatoes, cotton, sugar beets, sugar cane, tobacco, coffee, rapeseed, castor oil, rice or maize plants etc.
  • the transgenic plants, their parts or their seeds are preferably transformed with the nucleic acid in an antisense orientation.
  • plants are obtainable, for example, in which the expression of an N-heterocycle transporter gene is suppressed.
  • the invention also relates to transport proteins for nitrogen-containing heterocycles, in particular their oxo derivatives, the one or more compounds selected from the group consisting of an oxo derivative with at least two oxo groups in the ring system of the heterocycle, excluding caffeine, and an oxo derivative with at least three oxo -Groups in the ring system of the heterocycle.
  • the oxo derivative with at least two oxo groups in the ring system is preferably hydantoin, oxypurinol, uracil and xanthine.
  • Preferred oxo derivatives with at least three oxo groups in the ring system are allantoin and urate.
  • the invention also relates to transport proteins for nitrogen-containing heterocycles, in particular their oxo derivatives, the amino acid sequence a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 , SEQ ID NO: 20,
  • the amino acid sequences mentioned form the consensus sequences already described above.
  • the amino acid sequence of the transport proteins according to the invention preferably comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 or is homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14.
  • the transport proteins transport N-containing heterocycles and belong to a completely new class of transport proteins that have no relationship to the yeast-known allantoin transporter DAL4 or the PUP family from Aramidopsis. Both structurally and in the substrate spectrum differ significantly from the known transport proteins.
  • homologous means that a polypeptide or protein has a significant similarity to a comparison sequence.
  • homologous sequences are, for example, those which, with the aid of the similarity algorithm BLAST (Altschul et al., 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol. 215, 403-410), have a significant similarity to comparison sequences. Sequences are understood to be significantly similar here which, when compared with comparison sequences, for example using the BLAST program of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) with standard parameters, have a significance level p of ⁇ 10 "5 Comparison sequences are at least 70%, preferably 85%, particularly preferably over 95% identical.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the N-heterocyclic transporters provided by the present invention enable, in particular, the development and production of pesticides (herbicides) which act specifically on the transporters or their biosynthesis and in this way prevent the growth of undesirable organisms, for example wild plants. Together with the use of modified N-heterocycle transporters in useful plants, this can be used, for example, to selectively prevent undesired plants from growing.
  • pesticides hereins
  • this can be used, for example, to selectively prevent undesired plants from growing.
  • the present invention also relates to a method for producing a transgenic plant, comprising the steps of introducing at least one nucleic acid according to the invention into a plant cell and regenerating a plant from this plant cell.
  • the nucleic acid in antisense orientation is preferably used here.
  • plants can be obtained which can be well controlled with regard to the import and export as well as the metabolism of N-containing heterocycles.
  • plants with increased expression of endogenous transporters of N-containing heterocycles can be produced by the process according to the invention.
  • the transport of allantoin e.g. in legumes and possibly also the rate of fixation can be influenced by atmospheric nitrogen.
  • These plants can have improved N-mobilization.
  • plants can also be produced whose endogenous N-heterocycle transporters are not expressed, only to a small extent or only in certain tissues.
  • the oil / protein ratio could be specifically interfered with.
  • both a reduction and an increase in the protein content can be an important breeding goal.
  • the method according to the invention can also be used to influence the N-heterocyclic transporter properties of a plant in such a way that the specificity of the transport system changes, so that the transport of new compounds is made possible.
  • changes are also possible which change the affinity or substrate specificity of the transporter such that there is a more efficient transport of N-containing heterocycles from senescent leaves. This applies, for example, to alkaloids that the transporters have not yet recognized, synthetic hormones that are poorly transported and N-containing heterocycles that are not transported efficiently enough.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid according to the invention for producing a transgenic plant cell or plant with an increased expression of the coding region of the transport protein for nitrogen-containing heterocycles compared to the wild type. This makes it possible to obtain plants which, for example, enrich certain alkaloids more than wild-type plants.
  • the invention relates to the use of a nucleic acid according to the invention in an antisense orientation for the production of a transgenic plant cell or plant with an expression of the coding region of the transport protein for nitrogen-containing heterocycles which is reduced compared to the wild type.
  • the invention is described in more detail below with reference to FIGS. 1 to 5. It shows:
  • FIG. 1 shows a scheme for complementing the dal4 / dal5 double mutant (yeast) with AtUPSl and (B) growth of complemented dal4 / dal5 double mutants (dal4 / dal5 UPSl) in comparison to non-complemented double mutants (dal4 / dal5) on medium with allantoin as the sole nitrogen source.
  • FIG. 2 shows a comparison of the allantoin uptake rate of the yeast strain GEM42:: pFL61-UPSl transformed with a nucleic acid according to the invention and of the strain GEM42:: pFL61 transformed without the nucleic acid according to the invention.
  • the substrate concentration ( 14 C-allantoin) was 200 mM.
  • FIG. 3 shows an analysis of the substrate specificity of the UPS1-N heterocycle transporter expressed in yeast.
  • the relative uptake (100%) of 14 C-labeled allantoin in the presence of unlabeled adenine, allantoin, allopurinol, cytidine, cytosine, guanine, uric acid, hydantoin, hypoxanthine, imidazole, inosine, caffeine, oxypurinol and paraxanthine is given , Pyrimidine, theobromine, theophylline, uracil, uridine, xanthine and
  • FIG. 4 Growth of dal / dal5 double mutants complemented with UPS5b or UPSl in comparison to non-complemented double mutants (vector) on medium with allantoin as the sole nitrogen source.
  • Figure 5 is a schematic representation of the assumed structure of UPSl.
  • FIG. 6 Streams generated in .Xenopus oocytes into which UPS1 mRNA was injected (bottom) at an allantoin concentration of 0.2 mM, pH 5 and 8.5. Oocytes into which no UPS1 mRNA was injected served as a control (above).
  • FIG. 7 shows an analysis of the substrate specificity of the UPSl-N heterocycle transporter expressed in Xenopus oocytes. The relative uptake of hydantoin, xanthine, urate, cytosine, thymine and uracil compared to allantoin (100%) is indicated. The concentration of the substrates was 0.5 mM in each case.
  • FIG. 8 Growth of dal4 / dal5 yeast double mutants complemented with UPS2 (bottom) and UPS1 (middle) in comparison to non-complemented mutants (top) on minimal medium with allantoin as the sole nitrogen source.
  • Figure 9 Streams generated in .Xenopus oocytes into which UPS2 mRNA was injected at a concentration of 0.5 M allantoin and pH 5.
  • FIG. 10 shows an analysis of the substrate specificity of the UPS2-N heterocycle transporter expressed in Xenopus oocytes.
  • the relative uptake of hydantoin, xanthine, uracil, cytosine and thymine is given in
  • the concentration of the substrates was 0.1 mM (pH 5.5).
  • Figure 11 is a schematic representation of a construct for muting members of the UPS family in Arabidopsis. N-heterocycle transporters were cloned by complementing mutant yeasts. Complementation refers to a compensation of a genetic functional defect that is reflected in the phenotype while maintaining the mutation (s) on which the defect is based. Complementation occurs, for example, when a genetic defect in a gene means that it is no longer possible to take up a media component required for growth and this defect is eliminated by the presence of an intact gene that takes over the function of the defective gene. so that growth can now take place again.
  • the genes DAL4 and DAL5 were first switched off by homologous recombination in the uracilauxotrophic yeast strain S23344c (Saccharomyces cerevisiae) (see FIG. 1A).
  • This dal4 / dal5 / ura3 mutant which is referred to below as the dal4 / dal5 double mutant or as GEM42, is unable to grow on media which contain allantoin as the sole nitrogen source.
  • GEM42 was cDNA from Arabidopsis thaliana seedlings using the yeast expression vector pFL61 (Minet & Lacroute, 1990, Curr. Genet. 18, 287-291) according to the method of Dohmen et al.
  • Yeast 7, 691-692 About 1 ⁇ g of the vector with a cDNA insert was used for this. Yeast transformants that could grow on minimal medium with 0.15% allantoin as the only nitrogen source were increased. Plasmid DNA was isolated from these cells by standard methods. The GEM42 strain was transformed again with the isolated plasmid. In this way a plasmid pFL61-
  • This plasmid has an insert with a size of 1.2 kb, which contains the UPS1-N heterocycle transporter gene (SEQ ID NO: 1).
  • the nucleic acid according to SEQ ID NO: 1 codes for a protein according to SEQ ID NO: 8.
  • For the corresponding N-heterocycle transporter is used in the following the short name UPSl.
  • genes according to SEQ ID NO 2 to SEQ ID NO 7 also confer the property of the dal4 / dal5 mutant in this system
  • FIG. 8 shows growth of yeast double mutants complemented with UPS2 and UPS1 in comparison to non-complemented mutants on minimal medium with allantoin as the sole nitrogen source.
  • the yeast strain GEM42 :: pFL61-UPSl obtained by transforming GEM42 with the plasmid pFL61-UPS1 was used for tests for the uptake of allantoin or other N-containing heterocycles.
  • the N-heterocycle transporter gene was under the control of the yeast phosphoglycerate kinase promoter.
  • the UPS1 protein expressed by the yeast strain GEM42:: pFL61-UPS1 was subjected to a hydrophobicity analysis according to Kyte and Doo-little.
  • the UPSI protein has ten highly hydrophobic regions that are long enough to span the membrane once (FIG. 5). This shows that UPS1 is a membrane protein.
  • the allantoin intake was also determined in the presence of a tenfold excess of unlabelled allantoin. It was found completely unexpectedly that other N-containing heterocycles, for example uric acid, hydantoin, cytosine, oxypurinol, uracil and xanthine, were also taken up by the yeast cells (see FIG. 3). With the help of the transporters according to the invention, the yeast cells also took up numerous other N-containing heterocycles in addition to allantoin.
  • N-containing heterocycles for example uric acid, hydantoin, cytosine, oxypurinol, uracil and xanthine
  • UPS transporters the unique feature of having two alternative or complementary transport mechanisms.
  • UPS transport proteins The substrate specificity of the UPS transport proteins was first shown indirectly on the basis of inhibition studies (competition) in the yeast system (see FIG. 3). In order to obtain more direct evidence for potential UPS substrates, various oxo derivatives of N-containing heterocycles were tested in an oocyte system (with. -Xenopus oocytes). As shown in Figure 7, pyrimidines, imidazoles and purines, which have two typical oxo derivatizations, are good substrates for UPSl.
  • UPS2 transports allantoin, but also other oxo derivatives of N-containing heterocycles, such as hydantoin, xanthine, uracil, cytosine and thymine (see FIG. 9).
  • substrate affinities For example, xanthine and cytosine are less well transported by UPS2 than by UPS1.
  • the pH dependence of the transport both in yeast cells and in .Xenopus oocytes FIG.
  • Arabidopsis plants were transformed with a nucleic acid according to the present invention.
  • the transformation was carried out using Agro acterium tumefaciens (strain C58C1, pGV2260) (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788).
  • the DNA transfer into the agrobacteria was carried out by direct transformation using the method of Höfgen and Willmitzer, 1988, Nucl. Acids Res. 16, 9877.
  • the plasmid DNA of transformed agrobacteria was determined by the method of Birnboim and Doly, 1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523, isolated and analyzed by electrophoresis after suitable restriction cleavage.
  • A. thaliana was carried out by means of vacuum infiltration (modified according to Bechtold et al., 1993, Comptes Rendus de 1 'Academie des Sciences Serie III, Sciences de la Vie 316: 1194-1199). Pots (diameter 10 cm) were filled with earth and then covered with a fly net. A. Sown thaliana seeds. Six to eight weeks after sowing, the plants were used for vacuum infiltration. For vacuum infiltration, 2 1 liter cultures in YEB + antibiotic (50 ⁇ g / ml Kan and 100 ⁇ g / ml Rif) were grown at 28 ° C. from the corresponding Agrobactium strains.
  • the cells were harvested at 3000 g and resuspended in 600 ml of infiltration medium (0.5 ⁇ MS medium (Sigma), 5% sucrose, 44 ⁇ M benzylaminopurine).
  • infiltration medium 0.5 ⁇ MS medium (Sigma), 5% sucrose, 44 ⁇ M benzylaminopurine.
  • the bacterial suspension was filled into 250 ml mason jars and placed in a desiccator.
  • the A. thaliana vials were immersed "upside down" in the bacterial suspension, then a vacuum was applied for 5 min. After 3-4 weeks, the seeds of these plants were harvested.
  • the seeds were shaken in 4% sodium hypochloride, 0.02% Triton for 10 minutes, centrifuged at 1500 g, washed four times with sterile water and resuspended in 3 ml 0.05% agarose per 5000 seeds.
  • Seed agarose solution was applied to MSS medium (1 x MS, 1% Saccha rose, 0.8% agarose, 50 ⁇ g / ml kanamycin, pH 5.8) (plates with 13.5 cm diameter for 5000 seeds). To reduce the loss of moisture, the plates were sealed with para-film. The kanamycin resistant plants were transferred to soil. Seeds from these plants were harvested and analyzed.
  • the muting of members of the UPS family in Arabidopsis can be brought about, for example, with the aid of a construct, as is shown schematically in FIG. 11.
  • a construct can be produced using the usual methods of genetic engineering.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die die codierende Region für ein Transportprotein für stickstoffhaltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, enthalten. Die Erfindung stellt Nukleinsäuren, entsprechende Transportproteine sowie ein Verfahren zur Transformation von Pflanzen mit den erfindungsgemässen Nukleinsäuren zur Verfügung, um eine gezielte Kontrolle des Im- und Exports von N-haltigen Heterozyklen, insbesondere von Allantoin, bei Pflanzen zu ermöglichen.

Description

TRANSPORTPROTEINE FÜR STICKSTOFFHALTIGE HETEROZYKLEN UND HIERFÜR CODIERENDE
NUKLEINSÄUREN
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die die codierende Region für ein Transportprotein für stickstoffhaltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, enthalten. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der Nukleinsäuren sowie Vektoren, mobile Elemente, Wirtszellen und Pflanzen sowie de- ren Teile und Samen, die solche Nukleinsäuren enthalten. Weiter betrifft die Erfindung auch Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die mit den Nukleinsäuren transformiert sind. Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch Transportproteine für stickstoffhaltige Heterozyklen.
Transporter spielen für lebende Organismen eine besondere Rolle. Sie entscheiden über die Aufnahme oder Abgabe eines Stoffes in eine oder aus einer Zelle bzw. einem Organismus und steuern darüber hinaus den Transport und die Verteilung der Stoffe zwischen Zellen. Transporter stehen in der Regel am Anfang oder Ende eines Stoffwechselwegs und nehmen daher grundsätzlich übergeordnete Kontrollfunktionen wahr. In höheren Pflanzen sind Transportprozesse zur Verteilung von Assi- ilaten, Metaboliten und Phytohormonen von hoher Bedeutung. In diesem Zusammenhang sind insbesondere Transportprozesse für stickstoffhaltige Heterozyklen zu erwähnen, da diese Verbindungen im Stoffwechsel der Pflanze in zentraler Rolle mitwirken.
So wird bei einigen tropischen Leguminosen, wie z.B. der wirtschaftlich sehr wichtigen Sojabohne, der in den Wurzel- knöllchen fixierte Stickstoff in Form von Allantoin und seinem Abbauprodukt Allantoat aus den Wurzelknöliehen in den Sproß transportiert. Auch in Nicht-Leguminosen spielen derartige Transporter aber wahrscheinlich eine wichtige Rolle, beispielsweise während der Seneszenz. In allen Pflanzen liegt z.B. mit den Nukleoba- sen eine beträchtliche Menge des Gesamtstickstoffs in Form von N-haltigen Heterozyklen vor. Während der Seneszenz kommt es zu einer allgemeinen Mobilisierung der Nährstoffe in den absterbenden Geweben, die dann in entsprechende Speicherorgane oder Früchte transportiert werden. Durch den Abtransport und den Abbau von N-haltigen Heterozyklen kann der in ihnen enthaltene Stickstoff wieder zurückgewonnen werden.
Darüber hinaus spielen N-haltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, auch im Sekundärstoffwechsel der Pflanze, beispielsweise bei der Signalübertragung durch Hormone, eine wichtige Rolle. In diesem Zusammenhang sind z.B. Verbindungen wie Nikotin, Barbitursäure oder Coffein zu nennen. Ferner sind Pestizide, die Derivate von Hydantoin darstellen, eine weitere wichtige Klasse von Oxoderivaten N-haltiger Heterozyklen.
Bei Pflanzen ist über die beteiligten Transportproteine trotz ihrer erheblichen Bedeutung bislang wenig bekannt. In DE 19907209, WO 00/49152 sowie in Gillissen et al . (2000), The Plant Cell 12, 291-300, ist eine Familie von Transportprotei- nen (AtPUP) aus Arabidopsis beschrieben, die beispielsweise
Adenin und Cytosin transportieren. Nachteil dieser Transportproteine ist aber, daß sie wichtige Verbindungen wie z.B. Allantoin, Hydantoin, Oxypurinol, Uracil, Urat (Harnsäure oder Salze hiervon) oder Xanthin nicht transportieren können.
Dabei wäre es wünschenswert, wenn solche Proteine bzw. hierfür codierende Nukleinsäuren verfügbar wären, um bei Nutzpflanzen gezielt in den Stoffwechsel dieser Verbindungen und von Derivaten dieser Verbindungen eingreifen zu können. Bis- lang ist man weitgehend auf rein züchterische Maßnahmen ange- wiesen, um beispielsweise bei Sojabohnen eine Verbesserung des Öl/Protein-Verhältnisses zu erzielen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Nukleinsäu- ren zur Verfügung zu stellen, die eine gezielte Kontrolle des Im- und Exports von N-haltigen Heterozyklen, die von den bekannten Transportern nicht transportiert werden, bei Pflanzen ermöglichen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Nuklein- säure, die die codierende Region für ein Transportprotein für stickstoffhaltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, enthält, wobei die Nukleinsäure für ein Transportprotein codiert, das eine oder mehrere Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Oxoderivat mit mindestens zwei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus, ausgenommen Koffein, und einem Oxoderivat mit mindestens drei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus, transportiert. Bevorzugte Oxoderivate mit mindestens zwei Oxo-Gruppen (-CO-) im Ringsy- stem sind Hydantoin, Oxypurinol, Uracil und Xanthin. Bevorzugte Oxoderivate mit mindestens drei Oxo-Gruppen im Ringsystem sind Allantoin und Urat .
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure, die die codierende Region für ein Transportprotein für stickstoffhaltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, enthält, wobei die Nukleinsäure a) eine DNA-Sequenz, die für ein Peptid gemäß einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 15 bis SEQ ID NO: 22 codiert, oder b) eine zu der DNA-Sequenz gemäß a) komplementäre Nukleotid- sequenz, oder c) eine der DNA-Sequenz gemäß a) entsprechende RNA-Sequenz oder DNA/RNA-Mischsequenz umfaßt, oder d) mit einer Nukleinsäure, die die DNA-Sequenz gemäß a) oder eine zu der DNA-Sequenz gemäß a) komplementäre Nukleotidse- quenz aufweist, hybridisiert. Die genannten Sequenzen der SEQ ID NO: 15 bis SEQ ID NO: 22 sind Varianten der folgenden Consensus-Sequenz, die eine potentielle ATP-Bindungsstelle enthält und Transportproteinen der hier erstmals beschriebenen UPS-Familie gemeinsam ist:
Phe- [Leu,Tyr] -Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Xaa-Arg-Ala-Ile-Lys- Val- [Leu, Phe] -Gly-Lys- [Ser,Arg]
Die Angabe von Aminosäuren in eckigen Klammern bedeutet hierbei, daß sowohl die eine als auch die andere der in der Klammer angegebenen Aminosäure an dieser Stelle in der Sequenz vorkommen kann.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codieren für Transportproteine, die in verschiedenen Geweben vorkommen und sowohl den Im- als auch den Export von N-haltigen Heterozyklen, insbesondere von deren Oxoderivaten, kontrollieren.
Der hier verwendete Begriff "N-haltige Heterozyklen" umfaßt
Nukleobasen und ihre Derivate sowie mit Nukleobasen chemisch verwandte Stoffe. Hierzu zählen beispielsweise die Purinbasen Adenin und Guanin sowie Derivate wie Xanthin, Hypoxanthin, Allantoin, Urat (Harnsäure und deren Salze) , Xanthosin oder Inosin. Auch Cytokinine, wie z.B. Zeatin, Isopentenyladenin oder Kinetin und bestimmte Alkaloide, wie z.B. Coffein, Theo- phyllin, Theobro in oder Nikotin werden von diesem Begriff umfaßt. Zu den N-haltigen Heterozyklen zählen aber auch die Pyri idinbasen Cytosin, Thymin und Uracil und Derivate wie beispielsweise Barbiturate. Auch Folsäure, Oxypurinol und
Allopurinol werden von dem Begriff umfaßt. Weiterhin können die Nukleobasen auch modifiziert und beispielsweise an Zucker oder andere Bausteine gekoppelt sein. Somit umfaßt der Begriff auch Riboside wie z.B. Adenosin oder Cytidin, aber auch Cytokininriboside. Der hier verwendete Begriff "Oxoderivate von N-haltigen Heterozyklen" bedeutet, daß wenigstens eine Oxo-Gruppe (-CO-) im Ringsystem des Heterozyklus vorkommt. Danach sind beispielsweise Allantoin, Allopurinol, Barbiturate, Cytosin, Guanin, Folsäure, Hydantoin, Inosin, Oxypurinol, Paraxanthin, Theo- bromin, Theophyllin, Thymin, Uracil, Urat, Xanthin und Xanthosin Oxoderivate von N-haltigen Heterozyklen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codieren für Proteine (im folgenden auch kurz als "N-Heterozyklentransporter" bezeichnet) , die an dem Transport von N-haltigen Heterozyklen, also beispielsweise einer der vorgenannten Verbindungen, durch eine Biomembran beteiligt sind. Dieser Transport kann aktiv oder passiv erfolgen. Zum Nachweis der Transporteraktivität kann beispielsweise die von Ninnemann et al . (1994, EMBO J. 15, 3464-3471) beschriebene Methode angewendet werden. Die Transportproteine weisen keinerlei Verwandtschaft zu dem für Hefe { Saccharomyces cerevisiae) bekannten Allantoin-Transpor- ter DAL4 auf und sind auch nicht mit der PUP-Familie (Gillis- sen et al . , 2000, The Plant Cell 12, 291-300) verwandt.
Die Nukleotidsequenzen der Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können DNA- oder RNA-Sequenzen, aber auch Mischsequenzen aus DNA- und RNA-Nukleotiden sein. Der Begriff "eine der DNA-Sequenz entsprechende RNA-Sequenz" bezeichnet hierbei eine RNA-Sequenz, die die gleiche Abfolge der Purin- und Pyrimidinbasen wie eine DNA-Sequenz, anstelle der Base Thymin in der DNA-Sequenz aber die Base Uracil aufweist. Unter einer DNA/RNA-Mischsequenz wird hier eine Nukleotidse- quenz verstanden, die sowohl DNA-Nukleotide als auch RNA-Nu- kleotide enthält. Chimäre Oligonukleotide stellen beispielsweise solche Mischsequenzen dar.
Der hier verwendete Begriff "Hybridisieren" bedeutet Hybridi- sieren unter üblichen Bedingungen, wie sie in Sa brook et al . (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Aufl., 1989) beschrieben sind, bevorzugt unter stringenten Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbe- dingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 x SSC bei 65 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 x SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde. Wenig stringente Hybridi- sierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 x SSC bei 37 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 1 x SSC bei Raumtemperatur. Der hier verwendete Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" kann auch bedeuten: Hybri- disieren bei 68 °C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7 %
SDS, 1 mM EDTA und 1 % BSA für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 x SSC und 0,1 % SDS bei 68 °C.
Bevorzugt umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure a) eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7, oder b) eine zu der DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 oder SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 oder SEQ ID NO: 7 komplementäre Nukleotidsequenz, oder c) eine der DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4 oder SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 entsprechende RNA-Sequenz oder DNA/RNA-Mischse- quenz , oder d) hybridisiert mit einer Nukleinsäure, die die DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 oder eine zu der DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID NO: 7 komplementäre Nukleotidsequenz aufweist.
Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren oder mobile genetische Elemente, die mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten. Nukleinsäurekonstrukte gemäß der Erfindung sind aus mehreren Nukleinsäuren zusammengesetzt und enthalten neben einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure beispielsweise auch ein regulierendes Elementen, das die Expression der Nukleinsäure in einer Zelle kontrolliert. Beispiele für solche regulierenden Elemente sind konstitutive oder induzierbare Promotoren, wie z.B. der virale CaMV35S-Promotor (Pietrzak et al . , 1986, Nucl. Acids Res . 14, 5857-5868). Das Konstrukt kann auch in einem Vektor oder mobilen genetischen Element vorliegen.
Vektoren oder mobile genetische Elemente, die zur Einführung von Nukleinsäuren in Wirtszellen geeignet sind, beispielsweise Viren, Bakteriophagen, Cosmide, Plasmide, künstliche Hefechromosomen, T-DNA, Transposons, Insertionssequenzen usw. , sind dem Fachmann auf dem Gebiet molekularer Klonie- rungstechniken wohlbekannt.
Bevorzugt ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in dem Konstrukt, dem Vektor oder mobilen genetischen Element in Anti- sense-Orientierung enthalten. "Antisense-Orientierung" einer
Nukleinsäure bedeutet in Bezug auf DNA, daß eine Transkription der Nukleinsäure in einer mRNA resultiert, deren Nukleotidsequenz komplementär ist zu der natürlichen (endogenen) mRNA, so daß deren Translation behindert oder verhindert wird. "Antisense-Orientierung" einer RNA bedeutet, daß die
RNA-Sequenz zu einer endogenen mRNA komplementär ist und deren Translation durch Anlagerung behindert oder verhindert. Wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Antisense-Orientierung beispielsweise mit Hilfe eines Vektors in das Genom einer Pflanzenzelle eingeführt, kann dies zur Unterdrückung der Bildung der pflanzeneigenen N-Heterozyklentransporter-Mo- leküle führen. Hierbei ist die Translation der mRNA des endogenen N-Heterozyklentransporters durch Anlagerung einer Anti- sense-RNA an die mRNA behindert. Im Falle der Einführung ei- ner DNA-Sequenz wird die Antisense-RNA durch Transkription der DNA-Sequenz gebildet. Im Falle einer der DNA-Sequenz ent- sprechenden RNA-Sequenz kann diese selbst die Antisense-RNA darstellen. Eine posttranskriptionelle Stummschaltung (PTGS = posttranscriptional gene silencing) des endogenen N-Hetero- zyklentransportergens kann auch durch Co-Suppression oder RNA-Interferenz herbeigeführt werden, indem die DNA-Sequenz oder eine der DNA-Sequenz entsprechende RNA-Sequenz in Sense- Orientierung in die Pflanzenzelle eingeführt wird, wobei die RNA im Falle der RNA-Interferenz als Doppelstrang-RNA verwendet wird. Darüber hinaus ist es auch möglich, aus RNA- und DNA-Sequenzen zusammengesetzte Nukleinsäuren, chimäre Oligo- nukleotide, wie sie beispielsweise von Rice et al . , 2000, Plant Physiology 123, 427-437, beschrieben werden, einzusetzen, um ein Stummschalten des endogenen N-Heterozyklen- transportergens zu bewirken. Die betroffenen Zellen sind weitgehend daran gehindert, N-Heterozyklentransporter zu bilden. Durch eine Kopplung an geeignete gewebespezifische Promotoren ist es auch möglich, gezielt die Bildung von N-Hete- rozyklentransportern in bestimmten Geweben oder Organen der Pflanze, etwa in den Blättern, zu vermindern oder zu unter- drücken.
Ferner betrifft die Erfindung eukaryotische oder prokaryoti- sche Wirtszellen, die mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten. Bevorzugt ist die Nuklein- säure hierbei in Antisense-Orientierung in der Wirtszelle enthalten. Sie kann aber auch in Sense-Orientierung in einem RNA-Doppelsträng oder einem Chimären Oligonukleotid in der Wirtszelle enthalten sein. Dies ermöglicht ebenfalls die Stummschaltung des endogenen N-Heterozyklentransportergens .
Die Nukleinsäure können beispielsweise durch Transformation, Mikroinjektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Virusinfektion oder andere Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, in Pflanzenzellen eingebracht werden. Die Erfindung betrifft auch Pflanzen sowie Teile oder Samen von Pflanzen, die mit mindestens einer Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert sind. Die Pflanzen können Leguminosen, beispielsweise Sojapflanzen, Erbsen, Bohnen oder Erdnüsse sein. Es kommen aber auch zahlreiche andere
Pflanzen in Frage, beispielsweise Kartoffeln, Tomaten, Baumwolle, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Tabak, Kaffee, Raps, Ricinus, Reis- oder Maispflanzen usw. Bevorzugt sind die transgenen Pflanzen, deren Teile oder deren Samen mit der Nukleinsäure in Antisense-Orientierung transformiert. Hierdurch sind beispielsweise Pflanzen erhältlich, bei denen die Expression eines N-Heterozyklentransportergens unterdrückt ist.
Die Erfindung betrifft auch Transportproteine für stickstoff- haltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, die eine oder mehrere Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Oxoderivat mit mindestens zwei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus, ausgenommen Koffein, und einem Oxoderivat mit mindestens drei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus, transportieren. Bevorzugt handelt es sich bei dem Oxoderivat mit mindestens zwei Oxo-Gruppen im Ringsystem um Hydantoin, Oxypurinol, Uracil und Xanthin. Bevorzugte Oxoderivate mit mindestens drei Oxo-Gruppen im Ringsystem sind Allantoin und Urat.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus Transportproteine für stickstoffhaltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, deren Aminosäuresequenz a) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20,
SEQ ID NO: 21 oder SEQ ID NO: 22, oder b) eine zu der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 oder SEQ ID NO: 22 homologe Aminosäure- sequenz umfaßt. Die genannten Aminosäuresequenzen bilden die bereits oben beschriebene Consensus-Sequen .
Bevorzug umfaßt die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Tranportproteine die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 oder ist zu der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 homolog. Die Transportproteine transportieren N-haltige Heterozyklen und gehören zu einer völlig neuartigen Klasse von Transportproteinen, die keinerlei Verwandtschaft zu dem aus Hefe bekannten Allantoin-Transporter DAL4 oder der PUP-Familie aus Ara- bidopsis aufweisen. Sie unterscheiden sich sowohl strukturell als auch im SubstratSpektrum deutlich von den bekannten Transportproteinen.
"Homolog" bedeutet hier, daß ein Polypeptid oder Protein eine signifikante Ähnlichkeit mit einer Vergleichssequenz auf- weist. Homologe Sequenzen sind beispielsweise solche, die unter Zuhilfenahme des Similaritätsalgorithmus BLAST (Altschul et al . , 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol . 215, 403-410) eine signifikante Ähnlichkeit mit Vergleichssequenzen aufweisen. Als signifikant ähnlich werden hier Sequenzen verstanden, die beim Vergleich mit Vergleichssequenzen beispielsweise unter Verwendung des BLAST-Programms des National Centre for Biotechnology Information (NCBI) mit Standardparametern ein Signifikanzniveau p von < 10"5 aufweisen. Als homolog gelten des weiteren Sequenzen, die mit Ver- gleichssequenzen zu mindestens 70 %, bevorzugt zu 85 %, besonders bevorzugt zu über 95 % identisch sind.
Die mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellten N-Heterozyklentransporter ermöglichen insbesondere die Entwicklung und Herstellung von Pestiziden (Herbiziden) , die gezielt auf die Transporter oder deren Biosynthese wirken und auf diese Weise Wachstum von unerwünschten Organismen, beispielsweise von Wildpflanzen, verhindern. Zusammen mit dem Einsatz veränderter N-Heterozyklentransporter in Nutzpflanzen kann dies z.B. genutzt werden, um selektiv unerwünschte Pflanzen am Wachstum zu hindern.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die Schritte Einführen mindestens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine Pflanzenzelle und Regenerieren einer Pflanze aus dieser Pflanzenzelle. Bevorzugt wird hierbei die Nukleinsäure in Antisense-Orientierung verwendet .
Mit Hilfe des Verfahrens sind Pflanzen erhältlich, die bezüg- lieh des Im- und Exports sowie des Stoffwechsels von N-haltigen Heterozyklen gut kontrollierbar sind. Beispielsweise können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Pflanzen mit verstärkter Expression endogener Transporter N-haltiger Heterozyklen hergestellt werden. Insbesondere kann der Transport von Allantoin z.B. in Leguminosen und damit möglicherweise auch die Fixierungsrate von atmosphärischem Stickstoff beeinflußt werden. Diese Pflanzen können eine verbesserte N-Mobi- lisierung aufweisen. Es können aber auch Pflanzen hergestellt werden, deren endogene N-Heterozyklentransporter nicht, nur in geringem Maße oder nur in bestimmten Geweben exprimiert werden. So könnte beispielsweise bei der Sojabohne gezielt in das Öl/Protein-Verhältnis eingegriffen werden. Abhängig vom Verwendungszweck kann sowohl eine Verringerung als auch eine Steigerung des Protein-Gehaltes ein wesentliches Zuchtziel sein.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Verfahren aber auch eingesetzt werden, um die N-Heterozyklentransportereigen- schaften einer Pflanze so zu beeinflussen, daß es zu einer Veränderungen der Spezifität des Transportsystems kommt, so daß der Transport neuer Verbindungen ermöglicht wird. Bei- spielsweise sind auch Veränderungen möglich, die die Affinität oder Substratspezifität des Transporters dahingehend verändern, daß es zu einem effizienteren Transport von N-haltigen Heterozyklen aus seneszenten Blättern kommt. Dies be- trifft z.B. Alkaloide, die bisher von den Transportern nicht erkannt werden, synthetische Hormone, die schlecht transportiert werden und N-haltige Heterozyklen, die nicht effizient genug transportiert werden.
Außerdem kann die Verteilung von Pestiziden, die auf der chemischen Strukturgrundlage des Hydantoinringes aufgebaut sind (Marton et al . , 1993, J. Agr. Food Chem. 41, 148-152; Sakai et al., 1993, J. Pest. Sei., 18, 217-223) dadurch beeinflußt werden. Auch der Einsatz neuer Pestizide bei Pflanzen mit veränderten N-Heterozyklentransportern wird hierdurch ermöglicht. Beispielsweise können auch Herbizide entwickelt und eingesetzt werden, die gezielt auf N-Heterozyklentransporter unerwünschter Pflanzen gerichtet sind, aber die gegebenenfalls entsprechend veränderten Transporter der gewünschten Nutzpflanzen nicht angreifen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze mit einer gegenüber dem Wildtyp erhöh- ten Expression der codierenden Region des Transportproteins für stickstoffhaltige Heterozyklen. Hierdurch sind Pflanzen erhältlich, die beispielsweise bestimmte Alkaloide stärker als Wildtyppflanzen anreichern.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in Antisense-Orientierung zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze mit einer gegenüber dem Wildtyp verminderten Expression der codierenden Region des Transportproteins für stickstoffhal- tige Heterozyklen. Die Erfindung wird im weiteren anhand der Figuren 1 bis 5 näher beschrieben. Es zeigt:
Figur 1 (A) ein Schema zur Komplementation der dal4/dal5- Doppelmutante (Hefe) mit AtUPSl sowie (B) Wachstum von komplementierten dal4/dal5-Doppelmutanten (dal4/dal5 UPSl) im Vergleich zu nicht-komplemen- tierten Doppelmutanten (dal4/dal5) auf Medium mit Allantoin als alleiniger Stickstoffquelle.
Figur 2 einen Vergleich der Allantoinaufnahmerate des mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure transformierten Hefestamms GEM42 : :pFL61-UPSl und des ohne die erfindungsgemäße Nukleinsäure transformierten Stamms GEM42: :pFL61. Die Substratkonzentration (14C-Allan- toin) betrug 200 mM.
Figur 3 eine Analyse der Substratspezifitat des in Hefe exprimierten UPSl-N-Heterozyklentransporters . Ange- geben ist die relative Aufnahme (100%) von 14C-mar- kiertem Allantoin in Anwesenheit von unmarkiertem Adenin, Allantoin, Allopurinol, Cytidin, Cytosin, Guanin, Harnsäure, Hydantoin, Hypoxanthin, Imidazol, Inosin, Koffein, Oxypurinol, Paraxanthin, Pyrimidin, Theobromin, Theophyllin, Uracil, Uridin, Xanthin und
Xanthosin. Die Konzentration von 14C-Allantoin betrug 0.2 M, die der anderen Substanzen 2 mM. Werte < 100% weisen auf Verdrängung des Substrats 14C- Allantoin am Transportermolekül durch die jeweils andere Verbindung hin.
Figur 4 Wachstum von mit UPS5b oder UPSl komplementierten dal /dal5-Doppelmutanten im Vergleich zu nicht-kom- plementierten Doppelmutanten (Vector) auf Medium mit Allantoin als alleiniger Stickstoffquelle. Figur 5 eine schematische Darstellung der angenommenen Struktur von UPSl .
Figur 6 Ströme, erzeugt in .Xenopus-Oocyten, in die UPSl-mRNA injiziert wurde (unten) , bei einer Allantoin-Konzen- tration von 0,2 mM, pH 5 und 8,5. Als Kontrolle (oben) dienten Oocyten, in die keine UPSl-mRNA injiziert wurde.
Figur 7 eine Analyse der Substratspezifizität des in Xenopus-Oocyten exprimierten UPSl-N-Heterozyklentrans- porters . Angegeben ist die relative Aufnahme von Hydantoin, Xanthin, Urat, Cytosin, Thymin und Uracil im Vergleich zu Allantoin (100 %) . Die Konzentration der Substrate betrug jeweils 0,5 mM.
Figur 8 Wachstum von mit UPS2 (unten) und UPSl (Mitte) komplementierten dal4/dal5-Hefe-Doppelmutanten im Vergleich zu nicht komplementierten Mutanten (oben) auf Minimalmedium mit Allantoin als einziger Stickstoffquelle.
Figur 9 Ströme, erzeugt in .Xenopus-Oocyten, in die UPS2-mRNA injiziert wurde, bei einer Konzentration von 0,5 M Allantoin und pH 5.
Figur 10 eine Analyse der Substratspezifizität des in Xenopus-Oocyten exprimierten UPS2-N-Heterozyklentrans- porters . Angegeben ist die relative Aufnahme von Hydantoin, Xanthin, Uracil, Cytosin und Thymin im
Vergleich zu Allantoin (100 %) . Die Konzentration der Substrate betrug jeweils 0,1 mM (pH 5.5).
Figur 11 eine schematischen Darstellung eines Konstruktes für die Stummschaltung von Mitgliedern der UPS-Familie in Arabidopsis. Die Klonierung von N-Heterozyklentransportern erfolgte durch Komplementation von Hefemutanten. Mit Komplementation bezeichnet man eine sich im Phänotyp widerspiegelnde Kompensa- tion eines genetischen Funktionsdefektes unter Beibehaltung der dem Defekt zugrundeliegenden Mutation (en) . Komplementation liegt beispielsweise dann vor, wenn ein genetischer Defekt in einem Gen dazu führt, daß die Aufnahme einer für das Wachstum notwendigen Medienkomponente nicht mehr möglich ist und durch die Anwesenheit eines intakten Gens, das die Funktion des defekten Gens übernimmt, dieser Defekt aufgehoben wird, so daß nunmehr ein Wachstum wieder erfolgen kann.
Zur Komplementation wurden in dem uracilauxotrophen Hefestamm S23344c { Saccharomyces cerevisiae) zunächst die Gene DAL4 und DAL5 durch homologe Rekombination ausgeschaltet (s. Fig. 1A) . Diese dal4/dal5/ura3-Mutante, die im folgenden als dal4/dal5- Doppelmutante oder als GEM42 bezeichnet wird, ist nicht in der Lage, auf Medien, die Allantoin als einzige Stickstoff- quelle enthalten, zu wachsen. GEM42 wurde mit cDNA aus jungen Keimlingen von Arabidopsis thaliana unter Verwendung des Hefe-Expressionsvektors pFL61 (Minet & Lacroute, 1990, Curr. Genet. 18, 287-291) nach der Methode von Dohmen et al . , 1991, Yeast 7, 691-692, transformiert. Etwa 1 μg des Vektors mit einer cDNA-Insertion wurde hierfür verwendet. Hefetransfor- manten, die auf Minimalmedium mit 0.15% Allantoin als einziger Stickstoffquelle wachsen konnten, wurden vermehrt. Aus diesen Zellen wurde Plasmid-DNA nach Standardverfahren isoliert. Der Stamm GEM42 wurde erneut mit dem isolierten Plas- mid transformiert. Auf diese Weise wurde ein Plasmid pFL61-
UPS1 erhalten, das die dal4/dal5-Doppelmutation komplementieren konnte (s. Fig. 1B) . Dieses Plasmid weist eine Insertion mit einer Größe von 1.2 kb auf, die das UPSl-N-Heterozyklen- transportergen (SEQ ID NO: 1) enthält. Die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1 codiert für ein Protein gemäß SEQ ID NO: 8. Für den entsprechenden N-Heterozyklentransporter wird im folgenden die Kurzbezeichnung UPSl verwendet .
Auch die Gene gemäß SEQ ID NO 2 bis SEQ ID NO 7 verleihen der dal4/dal5-Mutante in diesem System die Eigenschaft, auf
Allantoin als einziger N-Quelle wachsen zu können. In Fig. 4 ist dies für UPS5 (SEQ ID NO: 6 und 7) und PvUPS (SEQ ID NO: 5) dargestellt. Fig. 8 zeigt Wachstum von mit UPS2 und UPSl komplementierten Hefe-Doppelmutanten im Vergleich zu nicht komplementierten Mutanten auf Minimalmedium mit Allantoin als einziger Stickstoffquelle.
Der durch Transformation von GEM42 mit dem Plasmid pFL61-UPSl erhaltene Hefestamm GEM42 : :pFL61-UPSl wurde für Untersuchun- gen zur Aufnahme von Allantoin oder anderen N-haltigen Heterozyklen verwendet. Das N-Heterozyklentransportergen stand dabei unter der Kontrolle des Promotors der Phosphoglycerat- kinase aus Hefe.
Das von dem Hefestamm GEM42 : :pFL61-UPSl exprimierte UPSl-Pro- tein wurde einer Hydrophobizitätsanalyse nach Kyte und Doo- little unterzogen. Das UPSl-Protein weist zehn stark hydrophobe Regionen auf, die lang genug sind, um jeweils einmal die Membran zu durchspannen (Fig. 5) . Dies zeigt, daß UPSl ein Membranprotein ist.
Um die Aufnahme von Allantoin durch GEM42 : :pFL61-UPSl quantifizieren zu können, wurde 14C-markiertes Allantoin eingesetzt. Dieses wurde durch enzymatische Modifikation der ver- wandten Verbindung Harnsäure, die kommerziell als 1C-Derivat erhältlich ist, hergestellt. Hierzu wurde 14C-markierte Harnsäure mit hochreiner Uricase (Sigma) enzymatisch umgesetzt. Der Reinheitsgrad des erhaltenen Produkts 14C-Allantoin wurde mittels HPLC-Untersuchungen ermittelt. Die Aufnahme von 1C- Allantoin durch Hefezellen des Stamms GEM42 , die mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 1, die für UPSl codiert, transformiert wurden, ist in Fig. 2 dargestellt. Als Kontrolle wurden GEM42-Zellen verwendet, die lediglich mit dem Konstrukt ohne UPSl transformiert wurden.
Für vergleichende Untersuchungen zu den TransportCharakteristiken der Transporterproteine wurden Kompetitionsstudien durchgeführt, wie sie prinzipiell bei Ninnemann et al . , 1994, EMBO J. 15, 3464-3471, beschrieben sind. Hierzu wurde die Al- lantoinaufnahme in Gegenwart eines zehnfachen Überschusses eines anderen N-haltigen Heterozyklus (Adenin, Allopurinol, Cytidin, Cytosin, Guanin, Harnsäure, Hydantoin, Hypoxanthin, Imidazol, Inosin, Koffein, Oxypurinol, Paraxanthin, Pyrimi- din, Theobromin, Theophyllin, Uracil, Uridin, Xanthin und Xanthosin) untersucht. Zur Kontrolle wurde auch die Allantoi- naufnahme in Gegenwart eines zehnfachen Überschusses von unmarkiertem Allantoin ermittelt. Völlig unerwartet wurde hierbei festgestellt, daß andere N-haltige Heterozyklen, beispielsweise Harnsäure, Hydantoin, Cytosin, Oxypurinol, Uracil und Xanthin, ebenfalls von den Hefezellen aufgenommen wurden (s. Fig. 3). Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Transporter nahmen die Hefezellen also neben Allantoin auch noch zahlreiche andere N-haltige Heterozyklen auf.
Bei weiteren Untersuchungen wurde festgestellt, daß die Auf- nähme von 14C-Allantoin UPSl-exprimierenden Hefezellen in saurem Medium (Maximum bei pH 4.75) stimuliert wurde. In alkalischem Medium (pH 8.5) wurde dagegen keine Aufnahme mehr gemessen. Um zu klären, ob Protonen direkt am Transportmechanismus von UPS beteiligt sind, wurde UPSl bzw. UPS 2 in Xeno- pus-Oocyten exprimiert (s. Fig. 6, 9). Nach Zugabe von Allantoin (0,2 M bzw. 0,5 mM) konnten Ströme in UPSl- und UPS2- exprimierenden Oocyten gemessen werden. Diese Ströme sind auf den Transport von positiv geladenen Substanzen zurückzuführen. Da Allantoin bei pH 5 überwiegend (>99 %) in elektrisch neutraler Form vorliegt, sind die gemessenen Ströme als ein
Cotransport von Protonen zu interpretieren. Dieser Transport- mechanismus ist typisch für viele TransportSysteme der pflanzlichen Plasmamembran, wobei durch ATPasen erzeugte Differenzen in der Protonkonzentration als Energetisierungs- mechanismus benutzt werden. Dieser Transportmechanismus wird als "sekundärer aktiver Cotransport" bezeichnet. Im Gegensatz dazu benutzen z. B. ABC-Transporter direkt die Energie der ATP-Spaltung und führen einen "primären aktiven Transport" durch. UPS-Proteine besitzen allerdings auch eine typische konservierte Domäne für die ATP-Bindung, was dafür spricht, daß ATP einen Einfluß auf den Transport hat. Somit käme den
UPS-Transportern die bisher einzigartige Eigenschaft zu, über zwei alternative oder ergänzende Transport-Mechanismen zu verfügen.
Die Substratspezifität der UPS-Transportproteine wurde zuerst anhand von Inhibitionsstudien (Kompetition) im Hefesystem indirekt gezeigt (s. Figur 3). Um direktere Beweise für potentielle UPS-Substrate zu gewinnen, wurden verschiedene Oxoderivate von N-haltigen Heterozyklen in einem Oocytensystem (mit. -Xenopus-Oocyten) getestet. Wie in Figur 7 dargestellt, sind Pyrimidine, Imidazole und Purine, die zwei typische Oxo- Derivatisierungen besitzen, gute Substrate für UPSl.
Entsprechend wurden auch die Transporteigenschaften von UPS2 mit Hilfe des Oocytensystems bestimmt. UPS2 ist, ebenso wie z.B. UPSl und 5, in der Lage, den Phänotyp der dal4/dal5-He- femutante zu revertieren (Figur 8) und Allantoin zu transportieren. UPS2 transportiert Allantoin, aber auch andere Oxoderivate von N-haltigen Heterozyklen, wie Hydantoin, Xanthin, Uracil, Cytosin und Thymin (s. Figur 9) . Allerdings sind Unterschiede in den Substrataffinitäten festzustellen. Beispielsweise werden Xanthin und Cytosin durch UPS2 schlechter transportiert als durch UPSl. Die pH-Abhängigkeit des Transports sowohl in Hefezellen als auch in .Xenopus-Oocyten (Figur 10) weist darauf hin, daß auch hier ein „sekundärer aktiver Cotransport" vorliegt. Arabi dopsis-Pflanzen wurden mit einer Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert. Die Transformation wurde mit Hilfe von Agro acterium tumefaciens (Stamm C58C1, pGV2260) durchgeführt (Deblaere et al . , 1985, Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788). Der DNA-Transfer in die Agrobakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen und Willmitzer, 1988, Nucl. Acids Res. 16, 9877. Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Me- thode von Birnboim und Doly, 1979, Nucl. Acids Res. 7, 1513- 1523, isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gele- lektrophoretisch analysiert.
Die Transformation von A . thaliana wurde mittels Vakuum-In- filtration (modifiziert nach Bechtold et al . , 1993, Comptes Rendus de 1 'Academie des Sciences Serie III, Sciences de la Vie 316: 1194-1199) ausgeführt. Töpfe (Durchmesser 10 cm) wurden mit Erde gefüllt und anschließend mit einem Fliegennetz überspannt. Auf diesem Netz wurden A . thaliana-Samen ausgesät. Sechs bis acht Wochen nach dem Aussäen wurden die Pflanzen für die Vakuum-Infiltration benutzt. Zur Vakuum-Infiltration wurden von den entsprechenden Agroba c t erium-Stämmen 2 1 Liter Kulturen in YEB + Antibiotikum (50 μg/ml Kan und 100 μg/ml Rif) bei 28°C angezogen. Bei einer OD6oo von 1,5 wurden die Zellen bei 3000 g geerntet und in 600 ml Infiltra- tionsmedium (0,5 x MS Medium (Sigma) , 5% Saccharose, 44 μM Benzylaminopurin) resuspendiert. Die Bakteriensuspension wurde in 250 ml Weckgläser gefüllt und in einen Exsikkator gestellt. Die A . thaliana-Vϊ.lanzen wurden "kopfüber" in die Bakteriensuspension getaucht, dann wurde für 5 min Vakuum angelegt. Nach 3-4 Wochen wurden die Samen dieser Pflanzen geerntet. Zur Oberflächensterilisation wurden die Samen 10 min lang in 4% Natriumhypochlorid, 0,02% Triton geschüttelt, bei 1500 g abzentrifugiert, viermal mit sterilem Wasser gewaschen und in 3 ml 0.05% Agarose pro 5000 Samen resuspendiert. Die
Samen-Agarose-Lösung wurde auf MSS Medium (1 x MS, 1% Saccha- rose, 0,8% Agarose, 50 μg/ml Kanamycin, pH 5,8) ausgebreitet (Platten mit 13,5 cm Durchmesser für 5000 Samen) . Zur Reduzierung des Feuchtigkeitsverlustes wurden die Platten mit Pa- rafilm verschlossen. Die kanamycinresistenten Pflanzen wurden in Erde umgesetzt. Samen dieser Pflanzen wurden geerntet und analysiert.
Die Stummschaltung von Mitgliedern der UPS-Familie in Arabi- dopsis kann beispielsweise mit Hilfe eines Konstruktes her- beigeführt werden, wie es schematisch in Fig. 11 dargestellt ist. Die Herstellung eines solchen Konstruktes kann mit den üblichen Methoden der Gentechnik vorgenommen werden.

Claims

PATENTANSPRUCHE
1. Nukleinsäure, die die codierende Region für ein
Transportprotein für stickstoffhaltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure für ein Transportprotein codiert, das eine oder mehrere Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oxoderivat mit mindestens zwei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus, ausgenommen Koffein b) einem Oxoderivat mit mindestens drei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus transportiert .
2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich a) bei dem Oxoderivat mit mindestens zwei Oxo-Gruppen im
Ringsystem des Heterozyklus um Hydantoin, Oxypurinol,
Uracil oder Xanthin, b) bei dem Oxoderivat mit mindestens drei Oxo-Gruppen im
Ringsystem des Heterozyklus um Allantoin oder Urat handelt.
3. Nukleinsäure, die die codierende Region für ein Transportprotein für stickstoffhaltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure a) eine DNA-Sequenz, die für ein Peptid gemäß einer der
Sequenzen der SEQ ID NO: 15 bis SEQ ID NO: 22 codiert, oder b) eine zu der DNA-Sequenz gemäß a) komplementäre
Nukleotidsequenz, oder c) eine der DNA-Sequenz gemäß a) entsprechende RNA-Sequenz oder DNA/RNA-Mischsequenz umfaßt, oder d) mit einer Nukleinsäure, die die DNA-Sequenz gemäß a) oder eine zu der DNA-Sequenz gemäß a) komplementäre
Nukleotidsequenz aufweist, hybridisiert.
4. Nukleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure a) eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 6 oder SEQ ID
NO : 7 , oder b) eine zu der DNA-Sequenz gemäß a) komplementäre Nukleotidsequenz, oder c) eine der DNA-Sequenz gemäß a) entsprechende RNA-Sequenz oder DNA/RNA-Mischsequenz umfaßt, oder d) mit einer Nukleinsäure, die die DNA-Sequenz gemäß a) oder eine zu der DNA-Sequenz gemäß a) komplementäre Nukleotidsequenz aufweist, hybridisiert.
5. Nukleinsäurekonstrukt, Vektor oder mobiles genetisches Element, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Nukleinsäurekonstrukt, Vektor oder mobiles genetisches Element nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in Antisense-Orientierung enthalten ist.
7. Eukaryotische oder prokaryotische Wirtszelle, enthaltend mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
8. Eukaryotische oder prokaryotische Wirtszelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in Antisense-Orientierung enthalten ist.
9. Pflanze oder Teile davon, transformiert mit mindestens einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
10. Transgene Pflanze nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze mit der Nukleinsäure in Antisense- Orientierung transformiert ist.
11. Transgene Samen von Pflanzen nach einem der Ansprüche 9 oder 10.
12. Transportprotein für stickstoffhaltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, dadurch gekennzeichnet, daß das Transportprotein eine oder mehrere Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oxoderivat mit mindestens zwei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus, ausgenommen Koffein b) einem Oxoderivat mit mindestens drei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus transportiert .
13. Transportprotein nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich a) bei dem Oxoderivat mit mindestens zwei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus um Hydantoin, Oxypurinol, Uracil oder Xanthin, b) bei dem Oxoderivat mit mindestens drei Oxo-Gruppen im Ringsystem des Heterozyklus um Allantoin oder Urat handelt.
14. Transportprotein für stickstoffhaltige Heterozyklen, insbesondere deren Oxoderivate, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des Transportproteins a) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 oder SEQ ID NO: 22, oder b) eine zu der Aminosäuresequenz gemäß a) homologe Aminosäuresequenz umfaßt .
15. Transportprotein nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz des Transportproteins a) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 oder b) eine zu der Aminosäuresequenz gemäß a) homologe Aminosäuresequenz umfaßt.
16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, umfassend die Schritte
Einführen mindestens einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine Pflanzenzelle und
Regenerieren einer Pflanze aus dieser Pflanzenzelle.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure in Antisense-Orientierung verwendet wird.
18. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze mit einer gegenüber dem Wildtyp erhöhten Expression der codierenden Region des Transportproteins für stickstoffhaltige Heterozyklen.
19. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Antisense-Orientierung zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle oder Pflanze mit einer gegenüber dem Wildtyp verminderten Expression der codierenden Region des Transportproteins für stickstoffhaltige Heterozyklen.
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