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WO2003000286A1 - Remedies for eosinophilic diseases - Google Patents

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WO2003000286A1
WO2003000286A1 PCT/JP2002/006219 JP0206219W WO03000286A1 WO 2003000286 A1 WO2003000286 A1 WO 2003000286A1 JP 0206219 W JP0206219 W JP 0206219W WO 03000286 A1 WO03000286 A1 WO 03000286A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
disease
apoptosis
eosinophilia
human
eosinophils
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2002/006219
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kenju Miura
Maki Matsubayashi
Hirohisa Saito
Kenji Matsumoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Suntory Biomedical Research Co Ltd
Suntory Ltd
Asubio Pharma Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Suntory Pharma Co Ltd
Daiichi Suntory Biomedical Research Co Ltd
Suntory Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Priority to BR0210578-0A priority Critical patent/BR0210578A/pt
Priority to IL15947802A priority patent/IL159478A0/xx
Priority to CA002451138A priority patent/CA2451138A1/en
Priority to EP02741233A priority patent/EP1405645A4/en
Priority to NZ530001A priority patent/NZ530001A/en
Priority to JP2003506929A priority patent/JPWO2003000286A1/ja
Application filed by Daiichi Suntory Pharma Co Ltd, Daiichi Suntory Biomedical Research Co Ltd, Suntory Ltd filed Critical Daiichi Suntory Pharma Co Ltd
Priority to AU2002315848A priority patent/AU2002315848B2/en
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Priority to US10/739,300 priority patent/US20040156847A1/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation

Definitions

  • the present invention is caused by increased eosinophils in peripheral blood or tissue, which contains a substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction as an active ingredient.
  • the present invention relates to a remedy or a method for treating eosinophilia disease.
  • inflammatory cells such as mast cells, lymphocytes, eosinophils, and basophils
  • Conventional inflammation treatment especially allergic inflammation treatment, focuses on how to prevent mast cells and basophil degranulation / specific tissue reaction by basophil release / chemical mediator release by specific IgE, that is, migration, invasion and activation of inflammatory cells I left.
  • hyposensitization therapy, degranulation inhibition and chemical mediator release inhibitors, and chemical mediator antagonists have greatly contributed to the treatment of allergic inflammation.
  • apoptosis prolongs the survival of eosinophils in localized inflammation, prolongs inflammation by causing increased activated eosinophils to undergo necrosis (necrosis) and efflux of granule proteins, and suppresses apoptosis.
  • Eosinophils that do not almost express Bcl-2 which plays a major role in apoptosis, can easily undergo apoptosis by removing cytokins that support survival (IL-3, IL-5, GM-CSF, IFN- ⁇ , etc.). Induction of eosinophil apoptosis at the end of inflammation control is a very attractive subject. In other words, how to induce eosinophil apoptosis is important to end inflammation.
  • TGF- / 3 an anti-Fas antibody, and FasL, which can induce apoptosis to eosinophils
  • FasL an anti-Fas antibody
  • TGF- / 3 an anti-Fas antibody
  • FasL FasL
  • CD30 was identified in 1982 as a cell surface molecule recognized by the monoclonal antibody Ki-1, which was prepared using Hodgkin's disease-derived Reed-Sternberg cell line L428 as an antigen. Reported (Nature, 299: 65, 1982).
  • tumor cells such as some non-Hodgkin's lymphoma, anaplastic large cell lymphoma, malignant melanoma and mesenchymal tumor, various cell lines, T activated by mitogen, It is known to be expressed in B cells, T cells transformed with viruses (HIV, HTLV-I, -IL EBV), B cells, activated macrophages, activated NK cells, uterine decidual cells, and the like.
  • CD30 a signal via CD30 induces apoptosis in certain cells (clinical immunity, 34: 67-71, 2000). Also, the structure of the extracellular domain indicates that the CD30 molecule belongs to a member of the TNF receptor (TNFR) super family, and that the CD30 ligand (CD153) is a member of the TNF super family. It has been reported that the intracellular domain of CD30 has no death domain found in Fas or the like, has two TNFR associated factor (TRAF) binding sites, and activates NF-kB via TRAF molecules. (Int. Immunol. 10: 203, 1998).
  • TNFR TNF receptor
  • CD30 the signal of CD30 depends not only on the ligand but also on its expression level, that is, overexpression itself causes self-activation and ligand-independent activation of NF-kB.
  • CD30 expression levels vary considerably between cell types, activation, and differentiation stages, suggesting that the diverse effects of CD30 may be due to differences in expression levels, but where expression levels alone cannot explain
  • differences in the intracellular stimulus transmission system modify the effects on cells.
  • CD30 and disease are related to serum CD30 serum levels in patients with Hodgkin's disease, AIDS, hepatitis B, atopic disease, Omerni syndrome, or autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus.
  • an object of the present invention is to provide a therapeutic agent or method for eosinophilia using a substance that induces rapid and potent apoptosis of eosinophils. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve such problems, and as a result, it has been found that a signal via CD30 by an anti-human CD30 monoclonal antibody or the like induces a rapid and powerful apoptosis to eosinophils, and is useful for allergic diseases.
  • the present inventors have newly found that an eosinophilia disease can be effectively treated, and have completed the present invention.
  • the present inventors found that CD30 regulates eosinophil apoptosis, and when soluble CD30 inhibits apoptosis induction, eosinophilia-related diseases and eosinophilia develop. Based on that hypothesis, he continued his research. As a result, a signal via CD30 selectively induces apoptosis in human peripheral blood eosinophils, and can induce apoptosis more rapidly and more strongly than known signals.
  • the present invention has been completed based on the finding that the pathway is independent of IL-5 signal transduction rather than antagonism to the signal.
  • the present invention was completed based on the finding that a substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction can be used as a therapeutic agent for eosinophilia disease.
  • the present invention includes the following.
  • a therapeutic agent for eosinophilia disease which comprises as an active ingredient a substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction.
  • the therapeutic agent for eosinophilia disease according to the above (1) which is a peptide or a low molecular compound.
  • a substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction is an immunoglobulin or an active fragment thereof (these are naturally derived or obtained by genetic recombination techniques).
  • the therapeutic agent for eosinophilia disease according to the above (1).
  • a substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and Z or a molecule involved in CD30 signal transduction is a CD30 ligand or an active fragment thereof (which can be obtained from natural sources or obtained by genetic recombination techniques).
  • the therapeutic agent for eosinophilia disease according to the above (1).
  • the substance according to the above (1), wherein the substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction is a nucleic acid encoding a CD30 ligand or an active fragment thereof. Agent for treating eosinophilia.
  • nucleic acid is a DNA encoding an amino acid described in SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence of CD153).
  • the substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and Z or a molecule involved in CD30 signal transduction is a substance that causes a phagocytic cell to express and / or secrete a CD30 ligand.
  • the therapeutic agent for eosinophilia according to the above.
  • the substance according to the above (1), wherein the substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction is a substance that has CD30 expression regulation and / or aggregation regulation ability.
  • Agent for treating eosinophilia is a substance that has CD30 expression regulation and / or aggregation regulation ability.
  • Eosinophilia disease is an allergic disease, respiratory disease, skin disease, self-immune disease, immunodeficiency disease, gastrointestinal disease, neoplastic disease, parasitic infectious disease or idiopathic eosinophil
  • the skin disease was selected from the group consisting of: atopic dermatitis, deprived measles, angioedema, psoriasis, Kimura's disease, Episodic angioedema with eosinophilia, eosinophilic pustular folliculitis, and lymphomatosis
  • the autoimmune disease is a disease selected from the group consisting of polyarteritis, rheumatoid arthritis, and systemic lupus erythematosus.
  • immunodeficiency diseases high I g E syndrome, Wiscott-Aldrich syndrome
  • gastrointestinal disease is a disease selected from the group consisting of allergic gastroenteritis, eosinophilic gastroenteritis, ulcerative colitis, and Tengitis. Therapeutic agent.
  • a method for treating eosinophilia which comprises administering a substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction.
  • an immunoglobulin or an active fragment thereof wherein the substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and Z or a molecule involved in CD30 signal transduction recognizes a site recognized by Ber-H8 or HRS-4 Alternatively, the method for treating an eosinophilia disease according to the above (22), which comprises administering a low molecular compound.
  • a substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction is an immunoglobulin or an active fragment thereof (these are naturally derived or obtained by genetic recombination techniques).
  • a substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and Z or a molecule involved in CD30 signal transduction is a CD30 ligand or an active fragment thereof (these are naturally derived or obtained by genetic recombination techniques).
  • (2) 2 The method for treating eosinophilia according to the above.
  • the eosinophil according to the above (22), wherein the substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction is a nucleic acid encoding a CD30 ligand or an active fragment thereof.
  • nucleic acid is DNA encoding an amino acid described in SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence of CD153).
  • the substance that induces eosinophil apoptosis through CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction is a substance that causes a phagocytic cell to express and / or secrete a CD30 ligand (22) )
  • the eosinophil according to (22) above, wherein the substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction is a substance that has CD30 expression regulation and / or aggregation regulation ability.
  • a method for treating a pluripotent disease is a substance that causes a phagocytic cell to express and / or secrete a CD30 ligand.
  • Eosinophilia is an allergic disease, respiratory disease, skin disease, self-immune disease, immunodeficiency disease, gastrointestinal disease, neoplastic disease, parasitic infectious disease or idiopathic eosinophil
  • the skin disease was selected from the group consisting of atopic dermatitis, measles, angioedema, psoriasis, Kimura's disease, Episodic angioedema with eosinophiUa, eosinophilic pustular folliculitis, and lymphocytic hill disease
  • the autoimmune disease is a disease selected from the group consisting of polyarteritis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus-death.
  • gastrointestinal disease is a disease selected from the group consisting of allergic gastroenteritis, eosinophilic gastroenteritis, ulcerative colitis, and Tengitis. Method of treatment.
  • a method for diagnosing eosinophilia which comprises measuring soluble CD30 in blood and using the increase or decrease in the concentration as an index.
  • a method for selecting a CD30-mediated eosinophil apoptosis inducer comprising the following steps: (a) primary selection based on inhibition of anti-CD30 antibody binding to CD30-expressing cells; (ii) peripheral blood; A secondary selection method based on induction of apoptosis of cord blood or bone marrow-derived cultured eosinophils, and (III) a tertiary selection method based on induction of apoptosis of peripheral blood eosinophils.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of CD30 expression analysis on human peripheral blood eosinophils using six kinds of mouse anti-human CD30 monoclonal antibodies or control mouse IgG.
  • FIG. 3 is an electrophoretogram showing the results of CD30 mRNA expression analysis in human peripheral blood eosinophils.
  • FIG. 4 is a graph showing the test results of apoptosis induction by human anti-human CD30 monoclonal antibody on human peripheral blood eosinophils.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of examining individual differences among eosinophil donors in inducing human peripheral blood eosinophil apoptosis by an anti-human CD30 monoclonal antibody.
  • FIG. 6 is a graph showing the time course of induction of human peripheral blood eosinophil apoptosis by anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8.
  • FIG. 7 is an electrophoretic diagram showing the results of testing the induction of human peripheral blood eosinophil apoptosis by anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 using DNA fragmentation as an index.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of a comparative study of the ability of the anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 and the anti-human Fas monoclonal antibody to induce human peripheral blood eosinophil apoptosis.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of examining the ability of anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 to induce apoptosis on neutrophils.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of examining the ability of anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 to induce apoptosis of lymphocytes.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of examining the ability of anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 to induce apoptosis in cultured human mast cells.
  • FIG. 12 is a graph showing the effect of high concentrations of IL-5 on the induction of human peripheral blood eosinophil apoptosis by anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of apoptotic induction of an anti-mouse CD30 monoclonal antibody (YMSM636.4.10) against human peripheral blood eosinophils.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of studies on induction of apoptosis of mouse CD30 ligand on human peripheral blood eosinophils.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of an examination of apoptosis induction against human peripheral blood eosinophils by polystyrene microbead-immobilized anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8.
  • Fig. 16 shows the results of a phagocytosis test with human umbilical cord blood-derived macrophages on human peripheral blood eosinophils whose apoptosis was induced by polystyrene microbead-immobilized anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8. It is a graph.
  • Fig. 17 shows PMA-stimulated human monocyte cell line U937 cells against human peripheral blood eosinophils that were induced to undergo apoptosis by polystyrene microbead-immobilized anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8. It is a graph which shows the result of a phagocytosis test.
  • the molecule involved in CD30 signal transduction means not only a molecule directly or indirectly acting on CD30 expressed on the surface of eosinophils, but also a molecule involved in intracellular signal transduction of CD30, It also refers to molecules involved in each step of cell signaling from the cell surface to the nucleus. Therefore, in the present invention, the substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction may be extracellular or intracellular, A substance that directly or indirectly acts on each molecule in various steps to induce eosinophil apoptosis.
  • Substances that induce eosinophil apoptosis through CD30 and / or molecules involved in CD30 signal transduction are not only anti-CD30 antibodies, but also conditions that can induce apoptosis in eosinophils and can be applied clinically. Any substance may be used as long as the conditions are satisfied.
  • CD30 ligand for example, CD30 ligand, a phagocytic cell expressing and / or secreting CD30 ligand, a substance capable of regulating CD30 expression and / or aggregation, a substance capable of expressing and / or secreting CD30 ligand in phagocytic cells
  • a CD30-mediated eosinophil apoptosis-inducing substance obtained by a screening method described below can be mentioned.
  • Phagocytic cells that express and / or secrete CD30 ligand, substances that have the ability to regulate CD30 expression and Z or aggregation, and substances that cause phagocytic cells to express and / or secrete CD30 ligand are also CD30. And it can be expected to induce eosinophil apoptosis via molecules involved in Z or CD30 signaling.
  • Phagocytic cells expressing and / or secreting CD30 ligand, CD30 expression In order to select a substance capable of regulating and / or regulating aggregation and a substance capable of expressing and / or secreting CD30 ligand from cells having phagocytic ability, for example, immunostaining of phagocytic cells with anti-CD30 ligand antibody, culture supernatant of phagocytic cells An ELISA for the CD30 ligand in can be used.
  • a substance that induces eosinophil apoptosis via a molecule involved in CD30 and / or CD30 signaling is preferably an immunity that recognizes a site recognized by the anti-CD30 antibody Ber-H8 or HRS-4. It is globulin or its active fragment, peptide or low molecular compound. Ber-H8 and HRS-4 are described in the literature (Hybridoma 19, 43-48, 2000) as mouse anti-human CD30 monoclonal antibodies, and are commercially available (for Ber-H8, see PharMingen, San Diego, (Available from CA, HRS-4 from Immunotech, Marseilles, France).
  • Particularly preferred as a substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction is at least the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (112 to 412 of the amino acid sequence of CD30). Or an active fragment thereof that recognizes part or all of Particularly preferred immunoglobulins are anti-CD30 monoclonal antibodies.
  • any highly purified anti-CD30 monoclonal antibody can be used, regardless of its origin and type.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • the animal species of the monoclonal antibody producing cell is not particularly limited as long as it is a mammal, and may be derived from a human antibody or a non-human mammal.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals other than humans are preferably monoclonal antibodies derived from egrets or rodents because of their ease of preparation.
  • the rodent is not particularly limited, but mouse, rat, hamster and the like are preferably exemplified.
  • a human antibody produced using a transgenic animal is also a preferred example.
  • anti-CD30 monoclonal antibody examples include, but are not limited to, Ber-H8 or HRS-4.
  • An anti-CD30 monoclonal antibody can be basically produced using a known technique. That is, CD30 is used as a sensitizing antigen, and immunized according to the usual immunization method. It can be produced by fusing with a known parent cell by the method and screening for a monoclonal antibody-producing cell by an ordinary screening method.
  • the monoclonal antibody used in the present invention is not limited to the monoclonal antibody produced by the hybridoma, but may be an artificially modified antibody for the purpose of, for example, reducing the antigenicity to humans. Is also good.
  • Such chimeric antibodies can be produced using known methods for producing chimeric antibodies, in particular, using genetic recombination techniques.
  • reshaped (reshaped) humanized antibodies can also be used in the present invention.
  • This is a method in which the complementarity-determining region of a human antibody is replaced by the complementarity-determining region of a non-human mammal, for example, a mouse antibody, and general gene recombination techniques are also known.
  • a reshaped humanized antibody useful in the present invention can be obtained.
  • the substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and Z or a molecule involved in CD30 signal transduction may be a CD30 ligand or an active fragment thereof.
  • Preferred CD30 ligands include, for example, human-derived CD153 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and mouse-derived CD153 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, but are not limited thereto.
  • the substance that induces eosinophil apoptosis via CD30 and Z or a molecule involved in CD30 signaling may be a nucleic acid encoding a CD30 ligand or an active fragment thereof.
  • Preferred nucleic acids encoding CD30 ligand include, for example, DNA encoding the amino acid described in SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence of human-derived CD153) and DNA encoding the amino acid described in SEQ ID NO: 5 (amino acid sequence of mouse-derived CD153). But not limited to these.
  • an anti-CD30 antibody against CD30-expressing cells eg, Lurkat, K562, RD, etc.
  • an anti-CD30 antibody against CD30-expressing cells eg, Lurkat, K562, RD, etc.
  • Primary selection based on inhibition of binding secondary selection based on induction of apoptosis of peripheral blood, cord blood or bone marrow-derived cultured eosinophils, and apoptosis of peripheral blood eosinophils Based on induction Tertiary sorting method, but is not limited to this.
  • Whether or not it has an apoptosis-inducing effect can be determined by using as an index whether or not eosinophil cells exhibit characteristics unique to apoptosis. Specifically, morphological characteristics such as cell volume reduction, DNA fragmentation, and formation of apoptotic bodies can be observed by transmission electron microscopy, or the eosinophil cell viability can be used as an index.
  • the cell volume can be measured by, for example, an electronic sizing technique using a Coulter-type cell size analyzer. DNA fragmentation between nucleosomes can be detected as a DNA ladder, and a commercially available ladder detection kit for apoptosis detection (eg, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) can be used.
  • Cell viability can be assessed, for example, by mitochondrial dehydrogenase activity using a colorimetric MTT assay. Instead of MTT, a formazan reagent such as WAT-1 or WST-8 can be used. Additionally, cell viability can be measured using the exclusion of trypable viable cells. Alternatively, using a commercially available kit such as the MEBCYTO-Apoptosis Kit (Medical Biological Laboratories, Nagoya, Japan), FITC-labeled AnnexinV-bound apoptotic cells can be measured with a flow cytometer (for example, FACScan Becton Dickinson). it can.
  • a flow cytometer for example, FACScan Becton Dickinson
  • eosinophil cells after apoptosis undergo detoxification by phagocytosis of phagocytic cells such as macrophages before leakage of granule proteins due to cell membrane destruction. Removed without causing damage to tissues and cells.
  • phagocytic elimination of apoptotic cells by phagocytic cells is thought to involve the following four processes.
  • Phagocytic cells are already adjacent to apoptotic cells at the site of inflammation.
  • Phagocytic cell recognition of apoptotic cells Phagocytic cells recognize phagocytic marker molecules on the apoptotic cell surface via phagocytic receptors. Phosphatidylserine (PS) is the best known phagocytic marker molecule. Phagocytic receptors include PS-recognizing class B scavengers and receptor receptors, type I (SR-B I) and LOX-l (lectin- like oxiddized low-density lipoprotein receptor- 1)
  • Phagocytic cells phagocytose Uptake of apoptotic cells by phagocytic cells (phagocytosis): Phagocytic cells phagocytose by signals from phagocytic receptors, but the signaling mechanism is unknown.
  • eosinophilia disease include, for example, allergic disease, respiratory disease, skin disease, autoimmune disease, immunodeficiency disease, digestive organ disease, idiopathic eosinophilia syndrome, neoplastic disease (for example, , Hodgkin's disease) and parasitic infectious diseases.
  • CD30 and / or ⁇ selected as described above induce eosinophil apoptosis via a molecule involved in CD30 signal transduction. It is prepared by using a carrier, excipient, and other additives that are used in ordinary formulation, containing the substance as an active ingredient.
  • Pharmaceutical carriers and excipients include, for example, lactose, magnesium stearate, starch, talc, gelatin, agar, pectin, gum arabic, olive oil, sesame oil, cocoa butter, ethylene glycol, etc. Commonly used items can be given.
  • the solid composition for oral administration tablets, pills, capsules, powders, granules and the like are used.
  • at least one active ingredient has at least one inert diluent, such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone, It is mixed with magnesium aluminate metasilicate.
  • the composition may contain additives other than diluents which are inactive in accordance with conventional practice, for example, lubricating agents such as magnesium stearate, disintegrating agents such as calcium cellulose glycolate, gluminic acid or aspartic acid. Such a solubilizing agent may be included.
  • the tablets or pills may be coated with sugar coating such as sucrose, gelatin, hydroxypropylmethylcellulose monophthalate, a film of gastric or enteric substance, or with two or more layers, if necessary. You may. Also included are capsules of absorbable materials such as gelatin.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, It contains syrups, elixirs and the like, and may contain commonly used inert diluents, for example, purified water, ethanol and the like.
  • the composition may contain, in addition to the inert diluent, adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, preservatives, and the like.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • Aqueous solutions and suspensions include, for example, water for injection and physiological saline for injection.
  • Non-aqueous solutions and suspensions include, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, Polysorbate 80 (registered trademark) and the like.
  • Such compositions may also contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, stabilizing agents (eg, lactose), and solubilizing agents (eg, glutamic acid, aspartic acid). Is also good.
  • Injectables may be in the form of solutions or lyophilized for reconstitution before use.
  • an excipient for freeze-drying for example, sugar alcohols and sugars such as mannitol and glucose can be used.
  • a virus vector preferably a lentivirus vector, an adeno-associated virus vector, more preferably an adenovirus vector, or a chemically synthesized ribosome, a virus envelope, or a virus envelope
  • a promoter sequence that functions in the host cell, such as cytomegalovirus promoter-1 (CMV promoter).
  • CMV promoter cytomegalovirus promoter-1
  • the therapeutic agent for eosinophilia disease of the present invention is preferably administered by an administration method generally used in medicine, for example, an oral administration method or a parenteral administration method.
  • an administration method generally used in medicine for example, an oral administration method or a parenteral administration method.
  • the active ingredient is an antibody
  • parenteral administration route for example, injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, pulmonary, etc.
  • parenteral administration route for example, injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, pulmonary, etc.
  • parenteral administration route for example, injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, pulmonary, etc.
  • Oral administration is also possible.
  • the amount of the substance which induces eosinophil apoptosis via the active ingredient CD30 and / or a molecule involved in CD30 signal transduction contained in the preparation of the present invention depends on the type of disease to be treated, the severity of the disease, although it can be determined according to the age of the patient and the like, the final administration concentration is generally 0.01 to 50 Omg Zm, preferably 0.1 to 200 mg / 1. Industrial applicability
  • the present invention relates to a substance which induces eosinophil apoptosis via a molecule involved in CD30 and Z or CD30 signal transduction, is useful as a therapeutic agent for eosinophilia-disease,
  • the induction of sphere apoptosis is useful as a therapeutic method for eosinophilia based on a new mechanism.
  • diseases include allergic diseases, parasitic infections, and autoimmune diseases in which eosinophils play a central role in the inflammatory reaction.
  • the therapeutic agent for eosinophilia of the present invention is much faster and more potent on human peripheral blood eosinophils than anti-Fas antibody, which is conventionally considered to induce eosinophil apoptosis. Can be induced.
  • the cell specificity of apoptosis induction for eosinophils is extremely high, and it does not induce apoptosis in neutrophils, lymphocytes, and mast cells.
  • induction of apoptosis of eosinophils by the therapeutic agent for eosinophilia disease of the present invention is not attenuated by IL-5 or the like. Therefore, the therapeutic agent for eosinophilia disease of the present invention can be expected as a clinically extremely useful therapeutic agent.
  • Example 1 CD30 expression analysis in human peripheral blood eosinophils
  • Heparin-collected human peripheral blood was diluted with PBS, layered on Percoll (specific gravity 1.090 g / ml, Pharmacia, Uppsala, Sweden), and centrifuged (1500 rpm, 30 minutes). Most Low-temperature purified water was added to the lower granulocyte fraction to cause hemolysis. Subsequently, an eosinophil fraction was obtained by negative selection using anti-CD16 antibody-immobilized magnetic beads (MACS CD16 micro beads, Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Germany). The eosinophil viability (trypan blue dye exclusion method, manufactured by Nakarai) and purity (DIFF-QUICK staining, manufactured by Kokusai Reagent Co., Ltd.) were 99% or more, respectively.
  • Mouse anti-human CD30 monoclonal antibodies include HRS-4 (Immunotech, Marseilles, France), Ber-H2 (DAKO, Glostrup, Denmark), Ber-H8 (PharMingen, San Diego, CA), AC-10 (Ancel, Bayport, MN), 1G12 (YLEM Avezzano, Roma, Italy) and Ki-1 (YLEM Avezzano, Roma, Italy), and MOPC-21 (Sigma Chemical Co., St. ouis, MO) as control mouse IgG. Was.
  • An upstream sense primer (5'-GCC CAG GAT CAA GTC ACT CAT-3 ') recognizing the 3'-untranslated region of the human CD30 gene (SEQ ID NO: 3) and a downstream antisense Using a primer (5'-TAC ACG TCT GAA GGC CCT AGG-3 ') (SEQ ID NO: 4), a 501 bp fragment was subjected to PCR by a thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Biosystem).
  • Anti-human CD30 monoclonal antibody was prepared at various concentrations (0.01, 0.1, 1 and 10 Ug / ml) with PBS, added to a 24-well microplate (Costar Corp., Cambridge, Mass.) At 1 ml and added at 4 The mixture was allowed to stand for 12 hours to solidify. After washing, 2 ml of 1% human serum albumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) was added and blocking was performed at 37 for 2 hours.
  • IMDM Iscove's
  • GIBCO 10 ⁇ 5 -mercaptoethanol
  • GIBCO Penicillin / Streptomycin
  • lng / ml human recombinant IL-5 R & D systems, Inc., Minneapolis, MN
  • GIBCO Penicillin / Streptomycin
  • lng / ml human recombinant IL-5 R & D systems, Inc., Minneapolis, MN
  • the anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 induced apoptosis in human peripheral blood eosinophils in a concentration-dependent manner.
  • HRS-4 is immobilized at 1 and 10 g / ml concentrations, 16.3% and 78.8% eosinophils, respectively
  • Ber-H8 is immobilized at 0.01, 0.1, 1 and 10 g / ml concentrations, respectively.
  • apoptosis was induced in 7.8%, 11.4%, 44.8% and 71.9% of eosinophils, respectively (FIG. 4).
  • Example 4 Examination of individual differences of eosinophil donors in inducing human peripheral blood eosinophil apoptosis by anti-human CD30 monoclonal antibody
  • the apoptosis-inducing ability of an anti-human CD30 monoclonal antibody on eosinophils isolated from three peripheral blood was examined.
  • the anti-human CD30 monoclonal antibody was immobilized at a concentration of 10 g / ml.
  • the anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 potently induced apoptosis of peripheral blood eosinophils from all donors (FIG. 5: average value of three individuals). Therefore, it was shown that the ability of HRS-4 and Ber-H8 to induce apoptosis of peripheral blood eosinophils did not vary among eosinophil donors.
  • Example 5 Time course of induction of human peripheral blood eosinophil apoptosis by anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8
  • Apoptosis induction of anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 against isolated human peripheral blood eosinophils was examined using DNA fragmentation as an index. Eosinophils were added to a plate on which HRS-4 and Ber-H8 were immobilized at a concentration of 10 ⁇ g / ml and cultured for 24 hours. The cells were collected and apoptosis ladder detection kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) to extract DNA and perform agarose gel electrophoresis. The DNA fragmentation was examined.
  • Heparin-collected human peripheral blood was diluted with PBS, layered on Percoll (specific gravity 1.090 g / ml, Pharmacia, Uppsala, Sweden), and centrifuged (1500 rpm, 15 minutes). Low-temperature purified water was added to the lowermost granulocyte fraction to cause hemolysis. Next, a neutrophil fraction was obtained by positive selection using anti-CD16 antibody-immobilized magnetic beads (MACS CD16 micro beads> Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Germany). Neutrophil survival was 99%. Apo! Cis-inducing ability of immobilized anti-human CD30 monoclonal antibody against isolated human peripheral blood neutrophils was measured by flow cytometry overnight. Was.
  • silica gel (Immunological Research Laboratories) was added to human peripheral blood collected from heparin, and the mixture was allowed to act for 1 hour with 37 to remove macrophages. After dilution with PBS, LSM (specific gravity 1.077 g / ml, ICN) ), And centrifuged (1500 rpm, 15 minutes) to obtain a lymphocyte fraction. Lymphocyte viability was 99%. Similarly, the apoptosis-inducing ability of the immobilized anti-human CD30 monoclonal antibody on the isolated human peripheral blood lymphocytes was measured using a flow cytometer. Neither HRS-4 nor Ber-H8, which induces apoptosis on eosinophils, induced apoptosis on lymphocytes (FIG. 10).
  • apoptosis-inducing ability of the immobilized anti-human CD30 monoclonal antibody on cultured human mast cells was measured using a flow cytometer. Neither HRS-4 nor Ber-H8, which induce apoptosis on eosinophils, induced apoptosis on cultured human mast cells (FIG. 11).
  • Cultured human mast cells were obtained from peripheral blood-derived mature cells obtained according to the method of Saito et al. (J. Immunol. L57, 343-350, 1996 and J. Allergy Clin. Immunol. L06, 321-328, 2000). Mast cells (P-Mast) and cord blood-derived mature mast cells (C-Mast) were used.
  • Example 9 Effect of high concentration of IL-5 on induction of human peripheral blood eosinophil apoptosis by anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8
  • the signal of CD30-mediated human peripheral blood eosinophil apoptosis includes a pathway involving and not involving IL-5.
  • IL-5 a pathway involving and not involving IL-5.
  • apoI cis induction of HRS-4 and Ber-H8 was not reduced.
  • Example 12 Investigation of apoptosis induction by polystyrene microphone mouth beads immobilized anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 on human peripheral blood eosinophils Polystyrene microphone mouth beads on isolated human peripheral blood eosinophils Apoptosis induction by immobilized anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 was examined. According to the method of Kitara et al. (Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 18,: 675-686, 1998), beads of polystyrene mic mouth with a diameter of 1.444 / M washed with O.IM borate buffer.
  • apoptosis cells were counted using a flow cytometer.
  • the polystyrene microbeads were excluded by gating the forward scattered light and the side scattered light on the dot blot.
  • the anti-human CD30 monoclonal antibodies HRS-4 and Ber-H8 induce apoptosis on human eosinophils even when immobilized on polystyrene mic mouth beads as well as immobilized on microplates. It has been found.
  • Example 13 3 Phagocytic test by phagocytic cells on human peripheral blood eosinophils whose apoptosis was induced by HRS-4 and Ber-H8, anti-human CD30 monoclonal antibodies immobilized on polystyrene microbeads
  • Apoptosis with polystyrene microphone mouth beads immobilized anti-HRS-4 and Ber-H8 was carried out on isolated eosinophils induced with phagocytic cells.
  • CD34-negative cells were fractionated from human cord blood mononuclear cell fraction, and 10 ng / ml of human recombinant M-CSF ( Macrophages were cultured for 7 days in the presence of Macrophage-corony stimulating factor (R & D) to prepare mature macrophages. Subsequently, the eosinophils in the process of inducing apoptosis by reacting anti-HRS-4 and Ber-H8 on polystyrene microbeads for 30 minutes were subjected to the method of Fadok et al. (J. Biol.
  • the cells were subjected to a phagocytosis test using cord blood-derived macrophages which had been cultured on a chamber slide (NUNC) for 24 hours in advance.
  • NUNC a chamber slide
  • the difference in the concentration of eosinophil-derived neurotoxin (EDN) leaked into each culture supernatant after 4 hours of eosinophil monoculture and eosinophil / macrophage co-culture was used as an indicator of phagocytosis. did.
  • the EDN concentration was measured using an ELISA kit (MBL).
  • Eosinophils induced to undergo apoptosis by HRS-4 and Ber-H8 immobilized with polystyrene microphone mouth beads were phagocytosed by co-culture with cord blood-derived macrophages.
  • EDN leaked into the culture supernatant was reduced.
  • cord blood-derived macrophages showed remarkable phagocytosis on eosinophils whose apoptosis was induced by HRS-4 (Fig. 16).
  • eosinophils reacted with anti-human CD30 monoclonal antibody Ber-H2 immobilized on polystyrene microbeads and control mouse IgG EDN leakage was extremely low irrespective of single culture or co-culture.

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Description

明細書
好酸球増多性疾患治療薬 技術分野
本発明は、 CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好 酸球アポト一シスを誘導する物質を有効成分とする、 末梢血中又は組織中に増加 した好酸球に起因する好酸球増多性疾患の治療薬又は治療方法等に関する。 背景技術
炎症の病態では、 肥満細胞、 リンパ球、 好酸球、 好塩基球等複数の炎症性細胞 が複数のメデイエ一夕一を介して、 複雑なネットワークを形成し組織障害をもた らしている。 従来の炎症治療、 特にアレルギー炎症治療は特異的 IgEによる肥満 細胞 ·好塩基球の脱顆粒/ケミカルメディエーター放出による組織反応、 即ち炎 症性細胞の遊走 ·浸潤 ·活性化をいかに阻止するかに主眼を置いてきた。 また、 減感作療法、 脱顆粒阻害 ·ケミカルメディエー夕一遊離抑制薬、 ケミカルメディ エー夕一拮抗薬はアレルギー炎症治療に大きく貢献してきた。 この IgE依存性メ 力二ズムの抑制は、 アレルギー治療の中心であり、 現在でも新しいケミカルメデ イエ一夕一とくにエイコサノィド合成阻害薬 ·拮抗薬が盛んに開発されている。 一方、 近年の研究により、 好酸球顆粒タンパクが直接組織障害や炎症を誘導す ることから、 好酸球が炎症反応とくにアレルギー性炎症の中心的な役割を担って いることが明らかとなってきた。即ち、炎症病態における好酸球については、 「骨 髄での産生亢進」 、 「病変組織への選択的浸潤及び活性化」 、 そして 「生存期間 の延長」 が知られている。 その結果、 生き延びた活性化好酸球の増加に伴い、 細 胞毒性のある好酸球顆粒タンパクの継続的な放出により重篤な組織障害がもたら される。 また、 臨床所見からも、 例えば慢性気管支喘息患者の末梢血好酸球増多 が観察される。 さらに、 末梢血好酸球数又は肺胞洗浄液中好酸球数と気道過敏症 とは相関すること、 症状の改善とともに末梢血好酸球数が正常化することが報告 されている。 従って、 アレルギー疾患、 寄生虫感染症、 自己免疫疾患など様々な 疾患の基本病態は炎症反応であることから、 好酸球の制御も炎症の重要な治療目 標の一つである。
現在まで、 好酸球を標的とした炎症治療の研究としては、 「骨髄での産生亢進 抑制」 、 「組織への選択的浸潤抑制」 、 「遊走阻害」 、 「活性化 （脱顆粒） 抑制」 、
「顆粒タンパク （MBP,EPO，ECP,EDN) 又は活性酸素種の不活化」 等が挙げら れ、 eosinophilopoietic cytokineである IL-5のシグナル阻止（IL-5R抗体、 soluble IL-5R又は IL-5抗体）によるァレルギ一性炎症に対する臨床応用も進められてい る。 しかし、 現在まで、 好酸球を標的とする治療法は臨床的には確立されていな い。
さらに、 炎症局所においてアポトーシスの抑制により好酸球の生存が延長され、 増加した活性化好酸球がネクローシス （壊死） にいたり顆粒タンパクが流出する ことにより炎症が遷延化されること、 及びアポトーシス抑制を担う Bcl-2をほと んど発現していない好酸球は、 生存を支えるサイト力イン （IL-3， IL-5， GM-CSF, IFN-ァ等） の除去により容易にアポトーシスに誘導されることから、 炎症の制御 終息における好酸球のアポトーシス誘導が大変魅力ある課題となっている。 換言 すれば、 炎症を終息させるためにはいかに好酸球のアポトーシスを誘導するかが 重要である。
以前より好酸球にアポトーシスを誘導できる TGF- /3、抗 Fas抗体、 FasLの治 療への応用が考えられている。 また、 ステロイドの抗炎症作用の一部は好酸球に 対するアポト一シス誘導であることが示唆されている （J.Clin.Invest.88:1982- 1987,1991) 。 しかしながら、 抗 Fas抗体投与は劇症肝炎を誘発し副作用が問題 である （Cell, 88:355-365,1997) 、 又はステロイドの好酸球に対するアポ! ^一シ ス誘導は IL-5 等により減殺される等の報告がある （J.Clin.Invest.88:1982- 1987,1991) 。 即ち、 現在まで好酸球に対するアポトーシス誘導による好酸球増 多性疾患に有効な治療剤や治療方法はない。
一方、 CD30は 1982年に、 ホジキン病由来の Reed-Sternberg細胞株 L428を 抗原として作製された単クローン抗体 Ki-1 に認識される細胞表面分子として同 定され、 ホジキン病細胞特異的な抗原として報告された （Nature,299:65，1982)。 その後、 一部の非ホジキンリンパ腫、 anaplastic large cell lymphoma, 悪性黒色 腫及び間葉系腫瘍等の腫瘍細胞、各種細胞株、マイトージェンで活性化された T、 B細胞、 ウィルス (HIV、 HTLV-I,-IL EBV)によって形質転換した T、 B細胞、 活性化マクロファージ、 活性化 NK細胞、 子宮脱落膜細胞等に発現していること が知られている。 これまでの解析により CD30からのシグナルは、 T細胞の増殖 や細胞死、 サイトカイン産生の亢進等多岐に渡る作用を示すことが報告されてい る （Blood, 83:2045,1994) がまだ不明な点も多い。 CD30欠損マウスでは、 胸腺 の CD4,8 double positive細胞数の劇的な増加が観測され、 胸腺細胞 （自己反応 性 T細胞） に対するネガティブセレクションが阻害されていることが示唆されて いる （J.Exp.Med., 187:427-432， 1998) 。 CD30リガンド結合部位を認識するある 種の単クローン抗体自体が anaplastic large cell lymphomaに対する抗腫瘍効果 を示すことが報告されている。 従って、 CD30を介するシグナルはある種の細胞 に対してアポトーシスを誘導することが示唆されている （臨床免疫， 34:67- 71,2000)。また、 CD30分子は細胞外ドメインの構造から TNFレセプター (TNFR) スーパ一ファミリ一のメンバ一に属し、 CD30リガンド (CD153)は TNFスーパ一 ファミリ一のメンバ一であることが示された。 CD30の細胞内ドメインは Fasな どに認められる death domain をもたず、 2 ケ所の TNFR associated factor(TRAF)結合部位をもち、 TRAF分子を介して NF-kBを活性化することが 報告されている （Int.Immunol.10:203, 1998) 。
さらに最近、 CD30のシグナルはリガンドだけでなく、 その発現レベルにも依 存していること、 即ち過剰発現自体により自己活性化を起こしリガンド非依存的 に NF-kBを活性化することも報告された （臨床免疫， 34:812-819,2000) 。 CD30 の発現レベルは細胞種、 活性化、 分化段階でかなり異なることから、 CD30の多 様な作用の一因は発現レベルの差異によるものと考えられるが、 単に発現レベル だけでは説明が付かない場合も多く、 それ以外にも細胞内の刺激伝達系などの差 違が細胞に与える作用を修飾していることが示唆されている。 CD30と疾患の関 連としては、 ホジキン病、 AIDS、 B型肝炎、 アトピー性疾患、 Omerni症候群の 患者、 又は慢性関節リゥマチや全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患患者 で可溶型 CD30 の血清レベルの上昇が挙げられる （Proc.Na . Acad.Sci.U.S.A.， 94:8670-8674, 1997, J.Neuroimmunol., 97， 182-190, 1999, J.Neurol.Sci., 171:49-55， 1999, Clin.Endocrinol., 49:609-613, 1998, Br. J.Dermatol., 140:73-78, 1999 ) 。 とくに、 ホジキン病患者血清中の可溶型 CD30レベルが上昇している こと、アトピー性皮膚炎における血清 ECP(Eosinophil Cationic Protein)レベル、 又は AIDSのステージや予後と血清可溶型 CD30レベルが相関していることから、 これらの疾患への CD30の関与が示唆されている。
一方、 ホジキン病では好酸球が増加していることも報告されている (Ann.Oncol.,8:89-96,1997,Blood,95:1207-1213,2000) が、 その原因、 メカニズ ムは不明であり、 好酸球に CD30が発現しているという報告はない。 したがって、 好酸球の増多と可溶型 CD30レベルの上昇とを結びつけた報告は現在までに全く なされていない。
炎症を終息させるには、 好酸球の新たな産生や病変組織への浸潤 ·活性化の抑 制及び活性化好酸球の死滅が必要である。 しかし、 ネクローシス （壊死） による 好酸球の死滅では、 細胞膜破壊による顆粒タンパクの漏出により組織がさらに障 害を受け炎症が悪化する。 従って、 本発明は好酸球に対し迅速で強力なアポトー シスを誘導する物質を用いる好酸球増多性疾患に対する治療剤又は治療方法等を 提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者はかかる課題を解決するべく鋭意検討した結果、 抗ヒト CD30単クロ ―ン抗体等による CD30を介するシグナルが好酸球に対し迅速で強力なアポトー シスを誘導し、 アレルギー疾患を含む好酸球増多性疾患を有効に治療し得ること を新規に見出して、 本発明を完成させるに至った。
今日まで、 ヒトの末梢血好酸球に CD30分子が発現していること、 及び CD30 を介するシグナルが好酸球に対しアポト一シスを誘導するという生理活性はまつ たく知られておらず、 本発明によって初めて明らかにされたものである。
本発明者は、 CD30は好酸球のアポトーシスを制御しており、 可溶型 CD30に よりアポトーシス誘導が阻害された場合、 好酸球増多に起因する疾患や好酸球増 多症を発症するとの仮説に基づき鋭意研究を進めた。 その結果、 CD30を介する シグナルがヒト末梢血好酸球に対し選択的にアポトーシスを誘導し、しかも既知 のシグナルよりも迅速で強力にアポトーシスを誘導でき、単に IL-5による生存シ グナルに対する拮抗ではなく IL-5 のシグナル伝達とは独立した経路によるとい う知見を得て本発明は完成された。 詳細は実施例に示すが、 CD30 リガンド結合 部位を認識するある種の抗ヒト CD30単クローン抗体を固相化したプレートにて、 IL-5の共存下ヒト末梢血好酸球を培養すると、 50%以上の好酸球が 1-4時間とい う短時間でアポトーシスに導かれることを見いだした。
従って、 CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸 球アポトーシスを誘導する物質が好酸球増多性疾患治療剤になりうるという知見 を得て本発明を完成した。
すなわち、 本発明としては以下のものを挙げることができる。
( 1 ) CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポトーシスを誘導する物質を有効成分とする好酸球増多性疾患治療剤。
( 2 ) CD30及びノ又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポトーシスを誘導する物質が、 Ber-H8又は HRS-4が認識する部位を認識する免 疫グロブリン若しくはその活性フラグメント、 ペプチド又は低分子化合物である 上記 （1 ) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
( 3 ) CD30及び 又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポト一シスを誘導する物質が、 免疫グロブリン又はその活性フラグメント （これ らは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（1 ) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
( 4 )少なくとも配列番号 1記載のアミノ酸配列（CD30のァミノ酸配列のうち、 112 - 412位のアミノ酸配列） の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はそ の活性フラグメントである上記 （2 ) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
( 5 ) 免疫グロブリンが Ber-H8又は HRS-4である上記（4 )記載の好酸球増多 性疾患治療剤。
( 6 ) CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポト一シスを誘導する物質が、 CD30 リガンド又はその活性フラグメント （これ らは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（1 ) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
( 7 ) CD30 リガンドが CD153である上記 （6 ) 記載の好酸球増多性疾患治療 剤。
(8) CD30及び 又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポト一シスを誘導する物質が、 CD30 リガンド又はその活性フラグメントをコー ドする核酸である上記 （1) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
(9)核酸が配列番号 2 (CD153のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードする DNAである上記 （8) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
(10) CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポトーシスを誘導する物質が、 CD30 リガンドの発現及び 又は分泌している 貪食能を有する細胞である上記 （1) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
(11) CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポトーシスを誘導する物質が、 貪食能を有する細胞に CD30リガンドを発現及 び 又は分泌させる物質である上記 （1) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
(12) CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポト一シスを誘導する物質が、 CD30発現調節及び 又は凝集調節能を有する 物質である上記 （1) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
(13) 好酸球増多性疾患が、 アレルギー疾患、 呼吸器疾患、 皮膚疾患、 自己免 疫疾患、 免疫不全疾患、 消化器疾患、 腫瘍性疾患、 寄生虫感染性疾患又は特発性 好酸球増加症候群から成る群から選ばれた疾患である上記 （1) 乃至 （12) 記 載の好酸球増多性疾患治療剤。
(14) アレルギー疾患が、 薬剤アレルギー、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎か ら成る群から選ばれた疾患である上記 （13) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
(15) 呼吸器疾患が、 好酸球肺浸潤症である上記 （13) 記載の好酸球増多性 疾患治療剤。
(16) 皮膚疾患が、 ァトピー性皮膚炎、 奪麻疹、 血管浮腫、 乾癬、 木村氏病、 Episodic angioedema with eosinophilia, 好酸球性膿胞毛胞炎、 リンパ腫瘍丘診 から成る群から選ばれた疾患である上記 （13) 記載の好酸球増多性疾患治療剤。
(17) 自己免疫疾患が、 多発性動脈炎、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマト 一デスから成る群から選ばれた疾患である上記 （13) 記載の好酸球増多性疾患 治療剤。 (18) 免疫不全疾患が、 高 IgE症候群、 Wiscott-Aldrich症候群、 Omenn症候 群から成る群から選ばれた疾患である上記 （13) 記載の好酸球増多性疾患治療 剤。
(19) 消化器疾患が、 アレルギー性胃腸炎、 好酸球性胃腸炎、 潰瘍性大腸炎、 滕炎から成る群から選ばれた疾患である上記 （13) 記載の好酸球増多性疾患治 療剤。
(20) 腫瘍性疾患が、 ホジキン病である上記 （13) 記載の好酸球増多性疾患 治療剤。
(21) 寄生虫感染性疾患が、 ァニサキス症、 旋毛虫症、 糞線虫症、 日本住血吸 虫症、 肺吸虫症から成る群から選ばれた疾患である上記 （13) 記載の好酸球増 多性疾患治療剤。
(22) CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポトーシスを誘導する物質を投与することからなる好酸球増多性疾患治療方法。
(23) CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポト一シスを誘導する物質が、 Ber-H8又は HRS-4が認識する部位を認識する 免疫グロブリン若しくはその活性フラグメント又は低分子化合物を投与すること からなる上記 （22) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。
(24) CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポト一シスを誘導する物質が、 免疫グロブリン又はその活性フラグメント （こ れらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（2 2) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。
(25) 少なくとも配列番号 1記載のアミノ酸配列 （CD30のアミノ酸配列のう ち、 112-412位のアミノ酸配列） の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又 はその活性フラグメントである上記 （23) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。 (26)免疫グロプリンが Ber-H8又は HRS-4である上記（24)記載の好酸球 増多性疾患治療方法。
(27) CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポ! シスを誘導する物質が、 CD30 リガンド又はその活性フラグメント （こ れらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（2 2) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。
(28) CD30 リガンドが CD153である上記 （27) 記載の好酸球増多性疾患 治療方法。
(29) CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポトーシスを誘導する物質が、 CD30 リガンド又はその活性フラグメントをコ ードする核酸である上記 （22) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。
(30)核酸が配列番号 2 (CD153のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードす る DNAである上記 （29) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。
(31) CD30及び 又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポトーシスを誘導する物質が、 CD30 リガンドの発現及び Z又は分泌している 貪食能を有する細胞である上記 （22) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。
(32) CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポトーシスを誘導する物質が、 貪食能を有する細胞に CD30リガンドを発現及 び Z又は分泌させる物質である上記 （22) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。 (33) CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポトーシスを誘導する物質が、 CD30発現調節及び 又は凝集調節能を有する 物質である上記 （22) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。
(34) 好酸球増多性疾患が、 アレルギー疾患、 呼吸器疾患、 皮膚疾患、 自己免 疫疾患、 免疫不全疾患、 消化器疾患、 腫瘍性疾患、 寄生虫感染性疾患又は特発性 好酸球増加症候群から成る群から選ばれた疾患である上記 （22) 乃至 （33) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。
(35) アレルギー疾患が、 薬剤アレルギー、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎か ら成る群から選ばれた疾患である上記 （34) 記載の好酸球増多性疾患治療方法。
(36) 呼吸器疾患が、 好酸球肺浸潤症である上記 （34) 記載の好酸球増多性 疾患治療方法。
(37) 皮膚疾患が、 ァトピー性皮膚炎、 奪麻疹、 血管浮腫、 乾癬、 木村氏病、 Episodic angioedema with eosinophiUa, 好酸球性膿胞毛胞炎、 リンパ腫瘍丘診 から成る群から選ばれた疾患である上記 （34) 記載の好酸球増多性疾患治療方 法。 (38) 自己免疫疾患が、 多発性動脈炎、 慢性関節リウマチ、 全身性エリテマト —デスから成る群から選ばれた疾患である上記 （34) 記載の好酸球増多性疾患 治療方法。
(39) 免疫不全疾患が、 高 IgE症候群、 Wiscott-Aldrich症候群、 Omenn症候 群から成る群から選ばれた疾患である上記 （34) 記載の好酸球増多性疾患治療 方法。
(40) 消化器疾患が、 アレルギー性胃腸炎、 好酸球性胃腸炎、 潰瘍性大腸炎、 滕炎から成る群から選ばれた疾患である上記 （34) 記載の好酸球増多性疾患治 療方法。
(41) 腫瘍性疾患が、 ホジキン病である上記 （34) 記載の好酸球増多性疾患 治療方法。
(42) 寄生虫感染性疾患が、 ァニサキス症、 旋毛虫症、 糞線虫症、 日本住血吸 虫症、 肺吸虫症から成る群から選ばれた疾患である上記 （34) 記載の好酸球増 多性疾患治療方法。
(43) 血中の可溶性 CD30を測定し、 その濃度の増減を指標とすることからな る好酸球増多性疾患の診断方法。
(44) CD30を介する好酸球アポト一シス誘導物質の選別方法であって、 以下 のステップ： （ァ） CD30発現細胞に対する抗 CD30抗体結合の阻害に基づく一 次選別、 （ィ） 末梢血、 臍帯血又は骨髄由来培養好酸球のアポトーシス誘導に基 づく二次選別、 及び （ゥ） 末梢血好酸球のアポトーシス誘導に基づく三次選別、 からなる当該選別方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 6種のマウス抗ヒト CD30単クローン抗体又はコントロールマウス IgGを用いたヒト末梢血好酸球における CD30発現解析の結果を示すグラフであ る。
図 2は、 IL-5 により活性化した好酸球を用いた場合の、 6種のマウス抗ヒト CD30単クローン抗体又はコントロールマウス IgGを用いたヒト末梢血好酸球に おける CD30発現解析の結果を示すグラフである。 図 3は、 ヒト末梢血好酸球における CD30 mRNAの発現解析の結果を示す電 気泳動の図である。
図 4は、 ヒ卜末梢血好酸球に対する抗ヒト CD30単クローン抗体によるアポト 一シス誘導の試験結果を示すグラフである。
図 5は、 抗ヒト CD30単クローン抗体によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘 導における好酸球提供者の個人差の検討結果を示すグラフである。
図 6は、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によるヒト末梢血 好酸球アポトーシス誘導の経時変化を示すグラフである。
図 7は、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によるヒト末梢血 好酸球アポトーシス誘導を DNA断片化を指標として試験した結果を示す電気泳 動の図である。
図 8は、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8と抗ヒト Fas単ク ローン抗体とのヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導能を比較検討した結果を示す グラフである。
図 9は、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8の好中球に対する アポトーシス誘導能の検討結果を示すグラフである。
図 1 0は、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8のリンパ球に対 するアポトーシス誘導能の検討結果を示すグラフである。
図 1 1は、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8の培養ヒトマス ト細胞に対するアポトーシス誘導能の検討結果を示すグラフである。
図 1 2は、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によるヒト末梢 血好酸球アポトーシス誘導に対する高濃度 IL-5の影響を示すグラフである。 図 1 3は、 ヒト末梢血好酸球に対する抗マウス CD30 単クローン抗体 (YMSM636.4.10) のアポト一シス誘導の検討結果を示すグラフである。
図 1 4は、 ヒト末梢血好酸球に対するマウス CD30リガンドのアポト一シス誘 導の検討結果を示すグラフである。
図 1 5は、 ヒト末梢血好酸球に対するポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒ ト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によるアポト一シス誘導の検討結 果を示すグラフである。 図 1 6は、 ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球に対する、 ヒト臍帯血由来マクロファージによる貪食試験の結果を示すグラフである。
図 1 7は、 ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によりアポトーシスを誘導されたヒ卜末梢血好酸球に対する、 PMA刺激ヒト単球系細胞株 U937細胞による貪食試験の結果を示すグラフであ る。 発明を実施するための最良の形態
本発明において、 CD30のシグナル伝達に関与する分子とは、 好酸球表面で発 現する CD30に直接又は間接に作用する分子のみならず、 CD30の細胞内シグナ ル伝達に関わる分子を意味し、 細胞表面から核までの細胞シグナル伝達の各ステ ップに関与する分子をも意味する。 従って、 本発明において、 CD30及び 又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物 質とは、 細胞外であっても、 あるいは細胞内であっても、 このような種々のステ ップにおける各分子に直接又は間接に作用して好酸球アポトーシスを誘導する物 質をいう。
CD30及びノ又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポト —シスを誘導する物質としては、 抗 CD30抗体のみならず、 好酸球にアポトーシ スを誘導できて臨床適用し得る条件を満たす限りにおいてどのような物質であつ てもよい。 例えば、 CD30 リガンド、 CD30 リガンドを発現及び 又は分泌して いる貪食能を有する細胞、 CD30発現調節及びノ又は凝集調節能を有する物質、 貪食能を有する細胞に CD30リガンドを発現及び/又は分泌させる物質又は後述 する選別法で得られる CD30を介する好酸球アポトーシス誘導物質が挙げられる。
CD30 リガンドを発現及び 又は分泌している貪食能を有する細胞、 CD30発 現調節及び Z又は凝集調節能を有する物質、 貪食能を有する細胞に CD30リガン ドを発現及び Z又は分泌させる物質も、 CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達 に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導することが期待できる。 なお、 CD30 リガンドを発現及び/又は分泌している貪食能を有する細胞、 CD30発現 調節及び 又は凝集調節能を有する物質、 貪食能を有する細胞に CD30リガンド を発現及び 又は分泌させる物質を選別するには、 例えば抗 CD30リガンド抗体 により、貪食細胞の免疫染色、貪食細胞の培養上清中の CD30リガンドの ELISA を用いることができる。
CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポト —シスを誘導する物質として好ましいのは、 抗 CD30抗体である Ber-H8又は HRS-4が認識する部位を認識する免疫グロブリン若しくはその活性フラグメン ト、ペプチド又は低分子化合物である。 Ber-H8及び HRS-4はマウス抗ヒト CD30 単クローン抗体として文献 （Hybridoma 19,43-48,2000) に記載されており、 ま た市販されている（Ber-H8については PharMingen, San Diego, CAから、 HRS-4 については、 Immunotech, Marseilles, Franceから入手できる） 。
また、 CD30及び 又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球 アポトーシスを誘導する物質として特に好ましいのは、 少なくとも配列番号 1記 載のアミノ酸配列 （CD30のアミノ酸配列のうち、 112 - 412位のアミノ酸配列） の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はその活性フラグメントである。 特 に好ましい免疫グロブリンは抗 CD30単クローン抗体である。
抗 CD30単クローン抗体としては、高純度に精製された抗 CD30単クローン抗 体であれば全て使用でき、 その由来および種類を問わないが、 特に哺乳動物由来 の単クローン抗体が好ましい。
単クローン抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、 ヒト抗 体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。 ヒト以外の哺乳動物由来の単ク ローン抗体としては、 その作製の簡便さからゥサギあるいはげつ歯類由来の単ク ローン抗体が好ましい。 げっ歯類としては、 特に制限されないが、 マウス、 ラッ ト、 ハムスターなどが好ましく例示される。 さらに、 トランスジエニック動物を 用いて作製したヒト抗体も好ましい例である。
このような抗 CD30単クローン抗体としては、 Ber-H8又は HRS-4を例示する ことができるが、 これに限定されない。 抗 CD30単クローン抗体は、 基本的には 公知技術を使用して作製できる。 すなわち、 CD30を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合 法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法により、 単クロ一 ン抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
本発明に使用される単クローン抗体は、 ハイプリドーマが産生する単クローン 抗体に限られるものではなく、 ヒ卜に対する異種抗原性を低下させること等を目 的として人為的に改変したものであってもよい。 例えば、 ヒト以外の哺乳動物、 例えば、 マウスの単クローン抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域と <TXF FR=0002 HE=250 WI=080 LX=1100 LY=0300>からなるキメラ抗体を使用する. ことができ、 このようなキメラ抗体は、 既知のキメラ抗体の製造方法、 特に遺伝 子組換技法を用いて製造することができる。 さらに、再構成（r e s h a p e d ) したヒト型化抗体を本発明に用いることもできる。 これはヒト以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換し たものであり、 その一般的な遺伝子組換手法も知られている。 その既知方法を用 いて、 本発明に有用な再構成ヒト型化抗体を得ることができる。
また、 本発明では、 CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を 介して好酸球アポトーシスを誘導する物質として、 CD30 リガンド又はその活性 フラグメントであってもよい。 好ましい CD30リガンドとしては、 例えば配列番 号 2のアミノ酸配列を有するヒト由来 CD153や配列番号 5のアミノ酸配列を有 するマウス由来 CD153を挙げることができるが、 これらに限定されない。 さら に、 CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァポ トーシスを誘導する物質は、 CD30 リガンド又はその活性フラグメントをコード する核酸であってもよい。好ましい CD30リガンドをコードする核酸としては、 例えば配列番号 2 (ヒト由来 CD153のアミノ酸配列） 記載のアミノ酸をコード する DNAや配列番号 5 (マウス由来 CD153のアミノ酸配列）記載のアミノ酸を コードする DNAを挙げることができるが、 これらに限定されない。
CD30及びノ又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介する好酸球アポト 一シス誘導物質の選別法の一例としては、 CD30発現細胞（例えば、 Lurkat, K562、 RDなど） に対する抗 CD30抗体 （例えば、 HRS-4、 Ber-H8、 YMSM636.4.10 など） 結合の阻害に基づく一次選別、 末梢血、 臍帯血又は骨髄由来培養好酸球の アポトーシス誘導に基づく二次選別、 及び末梢血好酸球のアポトーシス誘導に基 づく三次選別による選別法が挙げられるが、 これに限定されるものではない。 アポトーシス誘導効果を有しているか否かについては、 好酸球細胞がアポトー シス特有の特徴を呈しているか否かを指標にして判断することができる。 具体的 には、 細胞容積の減少、 D NAの断片化、 アポトーシス小体の形成などの形態学 的特徴の透過電子顕微鏡による観察、 あるいは好酸球細胞の生存率を指標にする ことができる。 細胞容積は、 例えば Coulter型細胞サイズ解析機による電子的サ ィズ決定技術により測定できる。 ヌクレオソーム間の D N Aの断片化は D N Aラ ダ一として検出することができ、 アポトーシス検出用の市販のラダ一検出キット (例 Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) を用いること ができる。 細胞生存率は、 例えば比色 MTTアツセィを用いるミトコンドリアデ ヒドロゲナ一ゼ活性により評価することができる。 MTT に代えて、 WAT-1 や WST-8などのホルマザン試薬を用いることもできる。 さらには、生存細胞がトリ パンブル一を排除することを用いて細胞生存率を測定できる。 あるいは、 MEBCYTO -Apoptosis Kit (Medical Biological Laboratories, Nagoya, Japan) などの市販キットを用いて、 FITC標識 AnnexinVの結合したアポトーシス細胞 をフロ一サイトメ一ター （例えば、 FACScan Becton Dickinson ) にて計測する こともできる。
顆粒蛋白の漏出を伴う細胞のネクロ一シスの場合と異なり、 アポトーシス後の 好酸球細胞は、 細胞膜破壊による顆粒夕ンパク漏出前にマクロファージ等の食細 胞の貪食により無毒化処理を受け、 周囲の組織 ·細胞に障害を生じさせずに除去 される。
一般に、 アポトーシス細胞に対する食細胞による貪食排除には以下の 4つの過 程があると考えられている。
1 . アポトーシス細胞周辺への食細胞の遊走：炎症局所ではすでに食細胞はアポ トーシス細胞と隣接している。
2 . 食細胞によるアポトーシス細胞の認識：食細胞は貪食受容体を介して、 アポ トーシス細胞表面上の貪食目印分子を認識する。 貪食目印分子としては、 フォス ファチジルセリン （PS) が最もよく知られている。 貪食受容体としては、 PSを 認識するクラス Bスカベンジャ一レセプ夕一タイプ I (SR-B I )や LOX- l(lectin- like oxiddized low-density lipoprotein receptor- 1)力 口]疋'されてレ る。
3 . 食細胞によるアポトーシス細胞の取り込み （貪食） ：貪食受容体からのシグ ナルにより食細胞は貪食するが、 シグナル伝達機構は不明である。
4 . 貪食されたアポトーシス細胞のリソゾームなど細胞内器官への輸送、 処理。 好酸球増多性疾患の具体例としては、 例えば、 アレルギー疾患、 呼吸器疾患、 皮膚疾患、 自己免疫疾患、 免疫不全疾患、 消化器疾患、 特発性好酸球増加症候群、 腫瘍性疾患 （例えば、 ホジキン病） 及び寄生虫感染性疾患等を挙げることができ る。
本発明の好酸球増多性疾患治療剤には、 上記のようにして選別された CD30及 び/ ^ は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポト一シスを誘 導する物質を有効成分として含み、 さらに通常の製剤化の際に用いられる担体や 賦形剤、 その他の添加剤を用いて調製される。
製剤用の担体ゃ賦形剤としては、 例えば、 乳糖、 ステアリン酸マグネシウム、 デンプン、 タルク、 ゼラチン、 寒天、 ぺクチン、 アラビアゴム、 オリ一ブ油、 ゴ マ油、 カカオバタ一、 エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげる ことができる。
経口投与のための固体組成物としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒 剤などが用いられる。 このような固体組成物においては、 少なくともひとつの有 効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、 例えば、 乳糖、 マンニトール、 ブ ドウ糖、 ヒドロキシプロピルセルロース、 微結晶性セルロース、 デンプン、 ポリ ビニルピロリドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。 組成 物は、 常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、 例えば、 ステアリン酸マ グネシゥムのような潤滑剤、 繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、 グ ル夕ミン酸またはァスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。 錠剤 または丸剤は、 必要によりショ糖、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピルメチルセル口 一スフタレ一トなどの糖衣や胃溶性または腸溶性物質のフィルムで被覆してもよ いし、 2つ以上の層で被覆してもよい。 さらに、 ゼラチンのような吸収されうる 物質のカプセルも含まれる。
経口投与のための液体組成物は、 薬剤的に許容される乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 エリキシル剤などを含み、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例 えば精製水、 エタノールなどを含んでいてもよい。 この組成物は、 不活性な希釈 剤以外に湿潤剤、 懸濁剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 防腐剤など を含んでいてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、 無菌の水性または非水性の溶液剤、 懸濁 剤、 乳濁剤が含まれる。 水性の溶液剤、 懸濁剤としては、 例えば、 注射用水およ び注射用生理食塩液が含まれる。 非水性の溶液剤、 懸濁剤としては、 例えば、 プ ロピレンダリコール、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のような植物油、 ェ 夕ノールのようなアルコール類、 ポリソルベート 80 (登録商標） などが含まれる。 このような組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 （例え ば、 乳糖） 、 溶解補助剤 （例えば、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸） のような補 助剤を含んでいてもよい。 これらは、 例えば、 精密ろ過膜によるろ過滅菌、 高圧 蒸気滅菌のような加熱滅菌、 あるいは、 殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によ つて無菌化することが可能である。 注射剤は溶液製剤であっても、 使用前に溶解 再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。 凍結乾燥のための賦形剤と しては例えばマンニトール、 ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用すること が出来る。
また、 本発明の治療剤を遺伝子治療に用いる場合にはウィルスベクター、 好ま しくはレンチウィルスベクター、 アデノ随伴ウィルスベクター、 更に好ましくは アデノウイルスベクター、 又は化学合成リボソーム、 ウィルスエンベロープ、 若 しくはウィルスエンベロープと合成リボソームの複合体等公知の遺伝子治療に適 した媒体に、 宿主細胞内で機能するようなプロモーター配列、 例えばサイトメガ ロウィルスプロモータ一 (CMV promoter)等、 の下流に、 CD30及び/又は CD30 のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質に係 る核酸を組み込んだものを用いることができる。
本発明の好酸球増多性疾患治療剤は、 医薬に一般に使用されている投与方法、 例えば、 経口投与方法、 又は非経口投与方法によって投与するのが好ましい。 有 効成分が抗体である場合には通常非経口投与経路で、 例えば注射剤 （皮下注、 静 注、 筋注、 腹腔内注など） 、 経皮、 経粘膜、 経鼻、 経肺などで投与されるが、 経 口投与も可能である。
本発明の製剤中に含まれる有効成分である CD30及び 又は CD30のシグナル 伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質の量は、 治療す べき疾患の種類、 疾患の重症度、 患者の年齢などに応じて決定できるが、 一般に は最終投与濃度で 0 . 0 1〜5 0 O m g Zmし 好ましくは 0 . l〜2 0 0 m g / 1である。 産業上の利用可能性
本発明は、 CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介し好酸 球アポトーシスを誘導する物質は好酸球増多性疾患の治療薬として有用であり、 また、 CD30を介した好酸球アポトーシス誘導は新たな機序に基づく、 好酸球増 多性疾患に対する治療方法として有用である。 このような疾患としては、 好酸球 が中心的な役割を担っている基本病態が炎症反応である、 アレルギー疾患、 寄生 虫感染症、 自己免疫疾患等が例示される。
本発明の好酸球増多性疾患治療薬は、 従来好酸球のアポトーシスを誘導すると されている抗 Fas抗体と比較して、 ヒト末梢血好酸球に対してはるかに迅速かつ 強力にアポトーシスを誘導することができる。 また、 好酸球に対するアポトーシ ス誘導の細胞特異性が極めて高く、 好中球、 リンパ球、 マスト細胞にはアポトー シスを誘導しない。 さらには、 本発明の好酸球増多性疾患治療薬の好酸球に対す るアポトーシス誘導は IL-5等により減殺されない。従って、本発明の好酸球増多 性疾患治療薬は臨床的に極めて有用な治療薬として期待できる。 実施例
以下、 実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲を これらの実施例に限定するものではない。 実施例 1 ： ヒト末梢血好酸球における CD30発現解析
へパリン採血したヒト末梢血を PBS で希釈し、 Percoll (比重 1.090g/ml、 Pharmacia, Uppsala, Sweden) に重層後、 遠心分離 (1500rpm， 30分間）した。 最 下層の顆粒球画分に低温精製水を加え溶血させた。 ついで、 抗 CD16抗体固相化 magnetic beads ( MACS CD 16 micro beads、 Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Germany) を用いた negative selectionにより好酸球画分を得た。 好 酸球の生存率 （trypan blue dye exclusion法、 ナカライ社製） 及び純度 （DIFF- QUICK染色、 国際試薬株式会社製） はそれぞれ 99%以上であった。
分離したヒト好酸球を 2 X 105cells/tubeに調製し、 1次抗体として、 6種のマ ウス抗ヒト CD30単クローン抗体又はコントロールマウス IgG(10 g/ml)を 4 にて 30分反応させた。 洗浄後、 2次抗体として FITC標識ャギ抗マウス IgG F(ab')2を用いて染色 （4 にて 30分反応） し、 1%パラホルムアルデヒドにて固 定後、 フロ一サイトメ一ター （ FACScan Becton Dickinson ) にて検出した。 IL-5 (lng/ml,R&D systems, Inc., Mineeapolis，MN) で活性化 （37で， 30分） し た好酸球について同様に検討した。 マウス抗ヒト CD30単クローン抗体としては、 HRS-4 ( Immunotech , Marseilles, France ) 、 Ber-H2 ( DAKO, Glostrup, Denmark) 、 Ber-H8 (PharMingen, San Diego, CA) 、 AC-10 (Ancel, Bayport, MN)、 1G12 (YLEM Avezzano, Roma, Italy)及び Ki-1 (YLEM Avezzano, Roma, Italy) を、 コントロールマウス IgG としては MOPC-21 (Sigma Chemical Co. ,St丄 ouis, MO) を用いた。
6人の末梢血提供者の好酸球をフローサイトメトリーにより解析した結果、 ヒ ト末梢血好酸球は HRS-4および AC10により有意に染色され、 CD30発現が確認 された （図 1 ) 。 なお、 AC10染色による平均蛍光強度は 8.9± 3.2であり、 好酸 球における CD30発現は IL-5受容体ひ鎖の発現と同程度であることが判明した。 IL-5により活性化した場合は、 AC-10により有意な発現が観察され、また HRS-4 又は Ber-H8により、 発現増加傾向が認められた （図 2 ) 。 実施例 2 ：ヒト末梢血好酸球における CD30 mRNA発現解析
ヒト末梢血好酸球を Isogen (Nippon Gene, Osaka, Japan)により溶解し、 RNA を抽出後、 Invitrogen Corp (San Diego, CA) のキットを用いて cDNAへ逆転写 した。 ヒト CD30遺伝子の 3'-非翻訳領域を認識する上流域センスプライマ一 (5'-GCC CAG GAT CAA GTC ACT CAT-3') (配列番号 3 ) 及び下流域ァンチセ ンスプライマ一 （5'-TAC ACG TCT GAA GGC CCT AGG-3') (配列番号 4 ) を 用い、 サーマルサイクラ一 （Gene Amp PCR System 9700;PE Biosystem) によ り 501bpの断片を PCR反応 (94 1分 1サイクルで変性、 94t i分 /55 1分 /72で 2分 40サイクル、 最後に 72で 10分 1サイクルで伸長） により増幅した。 反応終 了後、 0.05% ethidium bromide (Sigma)を含む 0.8%ァガロースゲル（BRL Life Technologies Inc.)で電気泳動したところ、約 500bpのバンドとして目的の PCR 産物を確認した。 ヒト末梢血好酸球には CD30 mRNAが発現していることが示 された （図 3 ) 。 実施例 3 ：ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒト CD30単クローン抗体によるアポト 一シス誘導の検討
抗ヒト CD30単クローン抗体を PBS により種々の濃度 （0.01， 0.1, 1及び 10 U g/ml) に調製し、 24穴マイクロプレート （Costar Corp., Cambridge, MA) に lml添加後、 4 にて 12時間静置し固相化した。 洗浄後、 1% ヒト血清アルブミ ン （Sigma Chemical Co., St丄 ouis， MO) 2mlを添加し、 37でにて 2時間ブロッ キングした。 洗浄後、 10%FCS， 10·5Μ 2-メルカプトエタノール （GIBCO) , Penicillin/Streptomycin (GIBCO) 及び lng/mlヒト組換え IL-5 (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN) 含む IMDM (Iscove's mo ifiea Dulbecco's medium > GIBCO) 培地にて lxl06cells/ml に調製した分離ヒト末梢血好酸球を加えた。 37 ：、 時間培養後、 細胞を集め洗浄後、 アポトーシス細胞を MEBCYTO - Apoptosis Kit (Medical Biological Laboratories, Nagoya, dap an) にて俠出し 7 "こ。 FITC 標識 AnnexinV の結合したアポトーシス細胞をフローサイトメ一夕一 ( FACScan Becton Dickinson ) にて計測した。
その結果、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8は濃度依存的に ヒト末梢血好酸球に対してアポト一シスを誘導した。 HRS-4は 1及び 10 g/ml の濃度で固相化した場合、それぞれ 16.3%及び 78.8%の好酸球に、 Ber-H8は 0.01, 0.1, 1及び 10 g/mlの濃度で固相化した場合、 それぞれ 7.8%,11.4%，44.8%及び 71.9%の好酸球にアポトーシスを誘導した （図 4 ) 。 なお、 抗ヒト CD30単クロ ーン抗体 Ber-H2,AC10,1G12及び Kil，ならびにコントロールマウス IgGはヒト 末梢血好酸球に対してアポトーシスをまったく誘導しなかった。 実施例 4：抗ヒト CD30単クローン抗体によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘 導における好酸球提供者の個人差の検討
3人の末梢血から分離した好酸球に対する抗ヒト CD30単クローン抗体のアポ トーシス誘導能を検討した。 抗ヒト CD30単クローン抗体は 10 g/mlの濃度で 固相化した。 いずれの提供者の末梢血好酸球に対しても、 抗ヒト CD30単クロ一 ン抗体 HRS-4及び Ber-H8は強力にアポトーシスを誘導した（図 5： 3人の平均 値を示す） 。 従って、 HRS-4及び Ber-H8の末梢血好酸球アポトーシス誘導能に は、 好酸球提供者による個人差はないことが示された。 なお、 抗ヒト CD30単ク ローン抗体 Ber-H2,AC10,1G12及び Kil，ならびにコントロールマウス IgGはい ずれの提供者の好酸球に対してもアポトーシスを誘導しなかった。 実施例 5 ：抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によるヒト末梢血 好酸球アポトーシス誘導の経時変化
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber- H8のアポ 1 シス誘導の経時変化を検討した。 HRS-4及び Ber-H8を 10 g/ml の濃度で固相化したプレートに好酸球を添加して培養した場合、 いずれの抗体も 1時間後にはほぼ 50%の好酸球にアポトーシスを誘導し、 4時間後までにはアポ トーシス好酸球は 70%まで増加した （図 6 ) 。 従って、 HRS-4及び Ber-H8は末 梢血好酸球に対して非常に迅速にアポトーシスを誘導することが判明した。 実施例 6 ：抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によるヒト末梢血 好酸球アポトーシス誘導 （DNA断片化を指標）
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber- H8 のアポトーシス誘導を DNA断片化を指標として検討した。 HRS-4及び Ber-H8を 10^ g/mlの濃度で固相化したプレートに好酸球を添加して 24時間培 養後、 細胞を回収し、 アポトーシスラダー検出キット （Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan ) を用いて DNAを抽出し、 ァガロース電気泳動 にて DNA断片化を検討した。
HRS-4及び Ber-H8はいずれも好酸球 DNAの断片化を誘導した （図 7 ) 。 な お、抗ヒト CD30単クローン抗体 Ber-H2及びコントロールマウス IgGはいずれ も好酸球 DNAの断片化を誘導しなかった。 従って、 HRS-4及び Ber-H8のヒト 末梢血好酸球に対するアポトーシス誘導は DNA断片化を指標とした場合でも確 認できた。 実施例 7 ：抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8と抗ヒト Fas単ク ローン抗体とのヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導能の比較検討
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber- H8 と抗ヒト Fas 単クローン抗体 （CH-ll，Medical Biological Laboratories, Nagoya, Japan) とのアポト一シス誘導能を比較検討した。単クローン抗体を 10 g/mlの濃度で固相化したプレートに好酸球を添加し、 培養した。
HRS-4及び Ber-H8は培養 1時間後にはほぼ 50%の好酸球にアポトーシスを誘 導し、 4時間後までにはアポトーシス好酸球は 70%まで増加した。 一方、 抗ヒト Fas単クローン抗体では培養 24時間後からアポト一シス好酸球が出現したが、 72時間後でもあまり増加しなかった （図 8 ) 。従って、 抗ヒト CD30単クローン 抗体 HRS-4及び Ber-H8は、 抗ヒト Fas単クローン抗体に比べて、 ヒト末梢血 好酸球に対して非常に迅速で、 強力にアポトーシスを誘導することが判明した。 実施例 8 ：抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8のアポ 1 ^一シス誘 導能の細胞選択性の検討
へパリン採血したヒト末梢血を PBS で希釈し、 Percoll (比重 1.090g/ml、 Pharmacia, Uppsala, Sweden) に重層後、 遠心分離 (1500rpm,15分間）した。 最下層の顆粒球画分に低温精製水を加え溶血させた。 ついで、 抗 CD16抗体固相 化 magnetic beads (MACS CD16 micro beads > Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Germany) を用いた positive selectionにより好中球画分を得た。 好 中球の生存率は 99%であった。 分離ヒト末梢血好中球に対する固相化抗ヒト CD30単クローン抗体のアポ! シス誘導能をフローサイトメ一夕一にて計測し た。
上述した 6種の抗ヒト CD30単クローン抗体はいずれも、 好中球に対してアポ トーシスを誘導しなかった （図 9 ) 。 6人の末梢血好中球を用いてさらに検討し たが、 6種の抗ヒト CD30単クローン抗体はいずれもアポトーシスを誘導しなか つた。
次いで、 へパリン採血したヒト末梢血にシリカゲル （免疫生物研究所） を添加 し、 37でで 1時間作用させマクロファージを除去し、 PBS で希釈後、 LSM (比 重 1.077g/ml, ICN社製） に重層後、 遠心分離 (1500rpm，15分間)し、 リンパ球画 分を得た。 リンパ球の生存率は 99%であった。 同様に分離ヒト末梢血リンパ球に 対する固相化抗ヒト CD30単クローン抗体のアポトーシス誘導能をフローサイト メータ一にて計測した。 好酸球に対してアポ卜一シスを誘導する HRS-4及び Ber-H8 はいずれも、 リンパ球に対してはアポトーシスを誘導しなかった （図 1 0 ) 。
さらに、 培養ヒトマス卜細胞に対する固相化抗ヒト CD30単クローン抗体のァ ポトーシス誘導能をフローサイトメータ一にて計測した。 好酸球に対してアポト 一シスを誘導する HRS-4及び Ber-H8はいずれも、培養ヒトマスト細胞に対して はアポトーシスを誘導しなかった （図 1 1 ) 。 培養ヒトマスト細胞としては、 斎 藤 ら の 方 法 （J.Immunol.l57，343-350，1996 及 び J.Allergy Clin.Immunol.l06，321-328，2000)に準じて得た末梢血由来成熟マスト細胞 （P- Mast) 及び臍帯血由来成熟マスト細胞 （C-Mast) を用いた。
なお、 CD30 陽性ヒ ト細胞株 Jurkat (T cell lymphoma)、 K562 (erythroieukemia)及ひ RD (rhabdomyosarcomaバこスオしても、 HRS-4及ひ Ber- H8はいずれも、 アポトーシスを誘導しなかった。
従って、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8はヒト末梢血好酸 球に選択的にアポトーシスを誘導することが判明した。 実施例 9 ：抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によるヒト末梢血 好酸球アポトーシス誘導に対する高濃度 IL-5の影響
これまで、 抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8は、 10ng/mlの ヒト組換え IL-5存在下、ヒト末梢血好酸球に対してアポトーシスを誘導すること を確認した。 しかし、高濃度の IL-5が存在していれば好酸球自体の生存能が増強 され、 HRS-4及び Ber-H8のアポトーシス誘導能は減殺される可能性がある。 そ こで、 0， 1, 10及び 100ng/mlの IL-5存在下、 HRS-4及び Ber-H8によるヒト末 梢血好酸球アポトーシス誘導能を検討した。 また、 好酸球提供者の個人差を考慮 し、 4人の末梢血好酸球を用いて実施した。
HRS-4は IL-5の濃度依存的にアポトーシスを誘導し、 IL-5非存在下ではアポ トーシスをまったく誘導せず、 100ng/ml存在下でも誘導した。 一方、 Ber-H8は、 IL-5の有無に関わらずアポトーシスを誘導した （図 1 2 ) 。
従って、 CD30を介するヒト末梢血好酸球アポト一シスのシグナルには IL-5が 関与する経路としない経路が存在していることが示唆された。 しかし、 少なくと も高濃度の IL-5が存在していても HRS-4及び Ber-H8のアポ I シス誘導は減 殺されないことが判明した。 実施例 1 0 ：ヒト末梢血好酸球に対する抗マウス CD30単クローン抗体のアポト 一シス誘導の検討
分離ヒ ト末梢血好酸球に対する抗マウス CD30 単クローン抗体 YMSM636.4.10 (Serotec Ltd, Oxford UK)及び 2SH12-5F-2D (BD PharMingeA, San Diego, USA)のアポ! シス誘導を検討した。 YMSM636.4.10を 10 g/ml の濃度で固相化したプレートにヒト好酸球を添加して培養した場合、 4時間後に はほぼ 30%の好酸球にアポトーシスを誘導した （図 1 3 ) 。 なお、 2SH12-5F-2D ならびにラットコントロール IgGはアポトーシスをまったく誘導しなかつた。 実施例 1 1 ：ヒト末梢血好酸球に対するマウス CD30リガンドのアポト一シス誘 導の検討
分離ヒト末梢血好酸球に対するリコンビナントマウス CD30 リガンド (R&D Systems Inc. Minneapolis, USA)のアポ 1 ^一シス誘導を検討した。 リコンビナン トマウス CD30リガンドを 10及び 100 g/mlの濃度で固相化したプレートにヒ ト好酸球を添加して培養した場合、 4時間後にはそれぞれ 28%及び 35%の好酸球 にアポトーシスを誘導した （図 1 4 ) 。 実施例 1 2 ：ヒト末梢血好酸球に対するポリスチレンマイク口ビーズ固相化抗ヒ ト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によるアポトーシス誘導の検討 分離ヒト末梢血好酸球に対するポリスチレンマイク口ビーズ固相化抗ヒト C D 30単クロ一ン抗体 HRS-4及び Ber-H8によるアポトーシス誘導を検討した。 紀 太らの方法 （Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 18, :675-686, 1998) に準じ、 O.IM ホウ酸緩衝液にて洗浄した直径 1.444 /Mのポリスチレンマイク口ビーズ (2.56% solid Latex , Sigma) 0.5mlに、 200 x gの抗ヒト CD30単クローン抗体を添加後、 4で12時間静置し固相化した。 洗浄後、 2.5%ヒト血清アルブミン 0.5mlを添加し、 4でにて 2時間ブロッキングした。洗浄後、 0.5mlPBSに懸濁し、 ポリスチレンマ イク口ビーズ固相化抗ヒト CD30単クローン抗体とした。 分離ヒト末梢血好酸球 2xl05cells及びポリスチレンマイクロビーズ固相化 HRS-4及び Ber-H8(10 1)を 96穴 U底マイクロプレート (NUNC社)に加えた。 37t:、 4時間培養後、 アポトー シス細胞をフローサイトメータ一にて計測した。 なお、 ポリスチレンマイクロビ ーズは前方散乱光及び側方散乱光のドットブロットにおけるゲーティングにより 除外した。
ポリスチレンマイクロビーズ固相化 HRS-4は 27.9%の好酸球に、 Ber-H8は 44.0%の好酸球にアポトーシスを誘導した (図 15)。 なお、 ポリスチレンマイクロ ビーズ固相化抗ヒト CD30単クローン抗体 Ber-H2ならびにコントロールマウス IgGはヒト末梢血好酸球に対してアポト一シスを誘導しなかった。 従って、 抗ヒ ト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8はマイクロプレートへの固相化と 同様に、 ポリスチレンマイク口ビーズに固相化した場合でもヒト好酸球に対して アポトーシスを誘導することが判明した。 実施例 1 3 ：ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒト CD30単クローン抗体 HRS-4及び Ber-H8によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球に対する 食細胞による貪食試験
ポリスチレンマイク口ビーズ固相化抗 HRS-4及び Ber-H8によりアポト一シス を誘導された分離好酸球に対する食細胞による貪食試験を実施した。 まず、
Brownらの方法 （J.Biol.Chem., 275: 5987-5996, 2000) に準じ、 ヒト臍帯血単 核球画分から CD34 陰性細胞を分画し、 10ng/ml のヒト組換え M-CSF (Macrophage-corony stimulating factor , R&D社)存在下、 7日間培養し、 成熟 マクロファージを調製した。 次いで、 ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗 HRS-4及び Ber-H8を 30分間反応させアポトーシス誘導途上にある好酸球を、 Fadok らの方法 (J.Biol.Chem., 276： 1071-1077, 2001) に準じ、 あらかじめ チャンバースライド (NUNC社)上で 24時間培養した臍帯血由来マクロファージ による貪食試験に供した。好酸球単独培養及び好酸球/マクロファージ共培養によ る 4 時間後のそれぞれの培養上清中に漏出した好酸球顆粒タンパク EDN(Eosinophil-derived neurotoxin)濃度の差を貪食作用の指標とした。 EDN 濃度は ELISAキット （MBL社） を用いて測定した。
ポリスチレンマイク口ビーズ固相化 HRS-4及び Ber-H8によりアポトーシスを 誘導された好酸球は臍帯血由来マクロファージとの共培養により貪食された結果、 培養上清中に漏出した EDNは減少した。 とくに、 HRS-4によりアポトーシスを 誘導した好酸球に対して、 臍帯血由来マクロファージは顕著な貪食作用を示した (図 16)。 なお、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒト CD30単クロ一ン抗 体 Ber-H2ならびにコントロールマウス IgGを反応させた好酸球の場合、 単独培 養、 共培養に関わらず EDN漏出は非常に少なかった。 また、 ヒト単球系細胞株 U937 (例えば、 ATCCから購入可能： ATCC No. CRL-1593.2) のマクロファー ジとしての機能を顕在化させて貪食能を引き出す目的で、 10ng/ml PMA(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate、 Sigma社)を用いて当該細胞を 1時間刺激し、 活性化 した当該細胞を 食細胞とした貪食試験でも同様の結果が得られた （図 17) 。
従って、 HRS-4及び Ber-H8によりアポト一シスを誘導されたヒト末梢血好酸 球は、 細胞膜破壊による顆粒タンパク漏出前にマクロファージ等の食細胞の貪食 により無毒化処理を受けることが示唆された。

Claims

請求の範囲
1 . CD30及び 又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポトーシスを誘導する物質を有効成分とする好酸球増多性疾患治療剤。
2 . CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポトーシスを誘導する物質が、 Ber-H8又は HRS-4が認識する部位を認識する免 疫グロプリン若しくはその活性フラグメント、 ぺプチド又は低分子化合物である 請求項 1記載の好酸球増多性疾患治療剤。
3 . CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポトーシスを誘導する物質が、 免疫グロブリン又はその活性フラグメントである 請求項 1記載の好酸球増多性疾患治療剤。
4. 少なくとも配列番号 1記載のアミノ酸配列（CD30のアミノ酸配列のうち、 112 - 412位のアミノ酸配列） の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はそ の活性フラグメントである請求項 2記載の好酸球増多性疾患治療剤。
5 . 免疫グロブリンが Ber-H8又は HRS-4である請求項 4記載の好酸球増多 性疾患治療剤。
6 . CD30及び/又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポト一シスを誘導する物質が、 CD30 リガンド又はその活性フラグメントである 請求項 1記載の好酸球増多性疾患治療剤。
7 . CD30及び Z又は CD30のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球ァ ポトーシスを誘導する物質が、 CD30 リガンド又はその活性フラグメントをコー ドする核酸である請求項 1記載の好酸球増多性疾患治療剤。
8 . 好酸球増多性疾患が、 アレルギー疾患、 呼吸器疾患、 皮膚疾患、 自己免疫 疾患、 免疫不全疾患、 消化器疾患、 腫瘍性疾患又は寄生虫感染性疾患から成る群 から選ばれた疾患である請求項 1記載記載の好酸球増多性疾患治療剤。
9 . アレルギー疾患が、 薬剤アレルギー、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎から 成る群から選ばれた疾患である請求項 8記載の好酸球増多性疾患治療剤。
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