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WO2003097842A1 - Mesure du processus de recombinaison non-homologue de l'adn dans des cellules de mammifere - Google Patents

Mesure du processus de recombinaison non-homologue de l'adn dans des cellules de mammifere Download PDF

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WO2003097842A1
WO2003097842A1 PCT/FR2003/001486 FR0301486W WO03097842A1 WO 2003097842 A1 WO2003097842 A1 WO 2003097842A1 FR 0301486 W FR0301486 W FR 0301486W WO 03097842 A1 WO03097842 A1 WO 03097842A1
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double
cells
dna molecule
stranded dna
site
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PCT/FR2003/001486
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English (en)
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WO2003097842A8 (fr
Inventor
Sylvie Huck
Bernard Lopez
Josée BARBAT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Publication of WO2003097842A8 publication Critical patent/WO2003097842A8/fr
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    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Definitions

  • the invention relates to a method for measuring the
  • NHEJ Non-homologous DNA joining or Non-Homologous End Joining
  • DNA undergoes programmed, spontaneous, environmental or induced damage, the repair of which is necessary for the maintenance of the integrity of genetic material and cell survival .
  • These lesions are, for the most part, faithfully repaired; however, repair defects and abnormalities in recombination lead to mutations and rearrangements in the genome which may be responsible for initiating carcinogenesis events and genetic predispositions to various pathologies.
  • Ionizing radiation is responsible for various DNA damage, among which double chain breaks (CDC) are known to be responsible for the most toxic radio-induced biological effects (mutations, chromosomal instability, etc.). .). CDC can also occur following stops in the replication fork, notably generated by certain drugs used in chemotherapy.
  • CDC double chain breaks
  • Double chain breaks can be repaired by recombination processes which are mainly of two types: 25 • Homologous recombination, which makes it possible to repair CDCs using intact homologous sequences of a donor molecule (homologous chromosome, sister chromatid, homologous sequence on a plasmid); a homology of several tens of bases is necessary between the two partners of the recombination. 30 • Recombination by end religion or non-homologous end joining (NHEJ), which does not require strong homologies between the sequences of the two ends of the CDC. In mammals, CDC repair is mainly carried out by the non-homologous recombination process or NHEJ process which religates the broken ends.
  • non-homologous recombination processes can also be involved in biological phenomena having less favorable effects for the cell:
  • - cells deleted or defective for cellular proteins involved in the NHEJ process exhibit increased sensitivity to ionizing radiation; Consequently, to optimize radio- and chemotherapeutic treatments, in particular anti-cancer treatments, the use of inhibitors of the NHEJ process could increase the effectiveness of said treatments and therefore reduce the doses used both in radiotherapy and in chemotherapy. This could reduce the secondary risks associated with the treatment itself and improve the patient's comfort.
  • the proteins involved in the NHEJ process also participate in the maintenance of telomeres, essential in actively replicating cells such as tumor cells. Inhibition of this pathway could also sensitize proliferating cells to genotoxic stresses.
  • the cellular machinery of the NHEJ process would be involved in the integration of retroviras into the cellular genome, since the viral genome integrates, after double-strand breakage of cellular DNA.
  • the proteins involved in the NHEJ process constitute new pharmacological targets representing an additional solution in the context of HAART.
  • Inhibitors of the NHEJ process would constitute an effective route in the treatment against retroviruses such as NIH, for example by inhibiting the phenomenon of integration of the virus.
  • substrates which are an extrachromosomal (plasmid) or intrachromosomal DNA fragment comprising genetic markers.
  • Certain substrates have one or more I-Sce I cleavage sites.
  • I-Sce I is a particular restriction enzyme from the category of meganucleases; it is coded by an intron from the mitochondria of the yeast Saccha- romyces cerevisiae, its specificity and precision are important, thanks to its recognition site which exceeds 12 bp to reach 18 bp or more and is asymmetrical.
  • the insertion of the I-Sce I site therefore ensures a unique cut in the genome of mammalian cells and makes it an ideal tool for the study of CDC repair; the I-Sce I sites make it possible to cause a CDC directed inside the cell, and the genetic markers to identify the mode of repair of the DNA involved.
  • the methods which use a plasmid substrate essentially comprise: the transient transfection of mammalian cells with previously linearized plasmids and the analysis (PCR, Southern-Blot, sequencing) of the repair of this plasmid DNA (efficiency and fidelity), after extraction and amplification in bacteria (Smith et al; NAR, 2001, 29 (23), 4783-4792; Escarceller et al., J Mol. Biol, 1998, 279, 375-385).
  • Methods which use a chromosomal substrate essentially include: integration into the genome of mammalian cells of an I-Sce I site placed in a drug resistance gene, the directed double-strand cleavage of the substrate and l analysis of DNA repair, either by acquiring drug resistance (selective system: Lukacsovich et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5649; Liang et al., PNAS, 1998, 95, 5172-; either by direct DNA analysis (non-selective system: Liang et al., Cited above; Lin et al, Mol. Cell. Biol., 1999, 8353-8360, Lin et al., Genetics , 2001, 158, 1665-1674).
  • Lukacsovich et al. describe a selective system comprising a gene of the thymidine kinase (tk), interrupted by a site I-Sce I, stably integrated in a single copy in the genome of tk fibroblasts.
  • the enzyme I-Sce I is introduced by electroporation, either alone to identify phenomena of non-homologous recombination, or accompanied by constructs serving as a substrate for homologous recombination: pTARG (which has the tk gene with an interruption by introduction of a reverse sequence of 104 pairs bases) or pAL2 (carrying the wild-type tk gene.) Repair phenomena (homologous or non-homologous) are analyzed by PCR and Southern Mot.
  • This method which is based on the acquisition of drug resistance, only allows the analysis of unfaithful non-homologous repair (loss of the I-Scel site to recover the reading frame of the resistance gene) and not the efficacy non-homologous reparation, insofar as faithful or unfaithful events which do not restore the open reading frame are not revealed.
  • this method is long (several weeks to count the recombinant clones resistant to the antibiotic), expensive in cell culture, and difficult to automate.
  • repair of the CDCs which can be done by different mechanisms of homologous recombination [by gene conversion, associated or not with a crossing over, or by DNA matching single-strand or SSA (Single-Strand Annealing) ⁇ , is measured by the frequency of the neo + recombinant clones (neo hyg " or neo hyg).
  • the neo gene is amplified by PCR and the amplified products are digested with the enzymes Nco I and / or I-Sce I and the homologous repairs (Nco 1+ / I-Sce I- ) or unfaithful non-homologs (Nco I- / I-Sce I-) are identified by Southern-Blot.
  • This method which is based on DNA analysis, is shorter than the previous one, but it only allows the analysis of unfaithful non-homologous repair (loss of the I-Sce site / to recover the reading frame of the resistance gene) and not the efficacy of non-homologous repair.
  • NHEJ non-homologous recombination
  • the present invention thus relates to an isolated hybrid double-stranded DNA molecule, intended for use as a non-homologous recombination substrate, characterized in that it comprises: - a single unidirectional promoter and at least two different reporter genes , respectively A and C in the direction of transcription; the only reporter gene under the control of said promoter being the reporter gene A, and
  • first cleavage site being located between the promoter and the reporter gene A and the second cleavage site being located upstream of the reporter gene C or in it.
  • the repair may be faithful or unfaithful: it is faithful when the two ends of the double-chain break are religated without modification of sequence, otherwise (substitution, insertion, deletion of one or more nucleotides) , she is unfaithful.
  • the hybrid double-stranded DNA molecule also comprises a third reporter gene B located between the reporter gene A and the second site of directed double-strand cleavage, which reporter gene B is reversed with respect to the direction of transcription of said promoter.
  • the double-stranded DNA molecule according to the invention or non-homologous recombination substrate therefore essentially comprises three elements which are necessary and sufficient to assess the type of repair involved (deletion if 2 reporter genes A and C; deletion or inversion if 3 reporter genes A, B, C), as well as the effectiveness and fidelity of this repair, namely :
  • a promoter - at least two different reporter genes A and C; preferably three genes (A, B and C), and
  • the directed double-stranded cleavage sites are cleavage sites of a restriction enzyme such as a rare site restriction enzyme or a meganuclease; these restriction enzymes are defined on the site http://www.meganuclease.com.
  • the non-homologous recombination substrate according to the invention makes it possible to quickly measure (revelation 24 to 72 hours after breakage) the repair, whether it is faithful or unfaithful.
  • the use of the substrate also makes it possible to screen for new inhibitory molecules for the proteins involved in the process of repairing non-homologous DNA or Non-Homologous End Joining (NHEJ).
  • NHEJ Non-Homologous End Joining
  • the construction of the substrate is such that after double-strand cutting with an endonuclease (restriction enzyme) then repair, only one of the three reporter genes (A, B or C) is placed under the control of the promoter and is expressed:
  • the reporter gene A is expressed if there is no cut or if the repair leads to the reconstitution of the initial molecule; the B gene which is reversed and the C gene are not expressed,
  • the reporter gene C is expressed if the repair leads to the simple deletion of the DNA fragment included between the two cleavage sites; deletion of genes A and B places the C gene immediately behind the promoter, and
  • the reporter gene B when it is present, is expressed if the repair leads to the inversion of the DNA fragment comprised between the two cleavage sites; the inversion places the B gene immediately behind the promoter, the A gene which is inverted and the C gene which is distant do not express themselves.
  • the first site of directed double-strand cleavage is located between the promoter and the reporter gene A and the second site of double-stranded directed cut is located between reporter genes B and C.
  • the directed double-strand cleavage sites can be found in coding or non-coding sequences.
  • these double-stranded cut-off sites are placed in coding regions (in one of the reporter genes), it is necessary for the repair to reconstitute a functional reporter gene or, on the contrary, to inhibit a gene (negative or positive selection). . In this case, you can only measure true events or unfaithful events (depending on whether you make a positive or negative selection).
  • said directed double-stranded cleavage sites are in the same orientation (direct orientation).
  • said sites are in opposite orientation (reverse orientation).
  • said sites are cleavage sites of a restriction enzyme selected from the group consisting of restriction enzymes with rare site and mega- nucleases; preferably, said rare site restriction enzyme has an asymmetric (non-palindromic) site and said meganuclease is I-Sce I.
  • the substrate also makes it possible to directly differentiate between faithful and unfaithful events.
  • I-Sce I recognizes an 18 bp site and when it cleaves this site, it leaves 4 outgoing nucleotides. But unlike conventional restriction enzymes, the I-Sce I site is not palindromic. Thus, if the two cleavage sites are in direct orientation, the outgoing nucleotides produced are perfectly complementary and the repair can be faithful or unfaithful. If the two sites are in reverse orientation, the outgoing nucleotides are not complementary and the repair must necessarily modify the ends to perform ligation; she must be unfaithful. In this orientation, events are therefore a direct measure of unfaithful reparation.
  • the two constructions therefore give additional information.
  • the possibility of having a substrate with the two types of orientation has the additional advantage of being able to directly differentiate between faithful and unfaithful events without having to sequence the recombinant molecules.
  • two substrates comprising two I-Sce I sites respectively in direct and reverse orientation and two reporter genes A and C or a single substrate comprising two I-Sce I sites in direct or reverse orientation and three reporter genes A, B and C advantageously make it possible to measure the efficiency and the fidelity of the non-homologous recombination, 48 h after directed double-strand cutting and repair;
  • the substrate comprising two I-Sce I sites in direct orientation measures: (i) the sum of faithful and unfaithful repairs, by the expression of C which results from the deletion of the internal fragment and, in the case of three different reporter genes , (ii) necessarily unfaithful repair, by the expression of B which results from the inversion of the internal fragment, and
  • the overall efficiency of non-homologous recombination is measured, either by the proportion of cells expressing one of the reporter genes B or C in the total cell population (B cells + + C cells, case of a single substrate A , B, C), or by the sum of the proportion of cells expressing the reporter gene C in the total cell population (or in the population of transfected cells, if the transfection efficiency varies according to the substrate), obtained with each substrates (direct orientation and reverse orientation).
  • the fidelity of non-homologous recombination can be measured by comparing the proportion of cells expressing the reporter gene C, obtained with the substrate in direct orientation and that in reverse orientation.
  • the major DNA changes can be measured with the two types of substrates, 5 days after the DNA cut (time required for protein turnover), by the proportion of cells expressing the reporter gene C, and optionally B in all of the cells which have undergone significant repair (cells expressing none of the reporter genes).
  • any promoter which is active in mammalian cells can be used.
  • the early promoter of cytomegalovirus (CMV) the promoter of the T antigen of the SV40 virus, of the thymidine kinase of the herpes simplex virus or of the phosphoglycerate kinase, the LTR fragment of retroviras and inducible promoters such as that of metallothionine or those of the Tet on / off type.
  • CMV cytomegalovirus
  • T antigen of the SV40 virus of the thymidine kinase of the herpes simplex virus or of the phosphoglycerate kinase
  • the LTR fragment of retroviras such as that of metallothionine or those of the Tet on / off type.
  • LTR-type promoters are particularly interesting, since they are capable of operating remotely.
  • any gene whose expression is detectable by simple and sensitive means fluorescence, luminescence, immunoenzymatic techniques (ELISA) or radioimmunological techniques (RIA)
  • ELISA immunoenzymatic techniques
  • RIA radioimmunological techniques
  • CD4 the genes coding for surface antigens such as for example CD4, CD8 or the molecules of the major histocompatibility complex (MHC) such as the H2 antigens of MHC class I of the mice (H2-K, H-2D, H2-L), intrinsically fluorescent proteins such as GFP (Green Fluorescent Protein) and their different color variants (YFP for Yellow Fluorescent Protein, RFP for Red Fluorescent Protein or BFP for Blue Fluorescent Protein), the gene LacZ ( ⁇ -galactosidase) and antibiotic resistance genes (neomycin, hygromycin, puromycin, blasticidin, zeocin).
  • MHC major histocompatibility complex
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • YFP Yellow Fluorescent Protein
  • RFP
  • the double-stranded DNA molecule also comprises a cassette for the expression of a selection marker such as a metabolic marker or a gene for resistance to an antibiotic (neomycin, hygromycin, puromycin, blasticidin, zeocin), useful for the selection of modified cells having integrated a copy of said double-stranded DNA molecule into their genome.
  • a selection marker such as a metabolic marker or a gene for resistance to an antibiotic (neomycin, hygromycin, puromycin, blasticidin, zeocin), useful for the selection of modified cells having integrated a copy of said double-stranded DNA molecule into their genome.
  • said reporter genes A, B, C are selected from the group consisting of antigens H2, CD4 and CD8.
  • the present invention also relates to a vector, characterized in that it comprises a double-stranded DNA molecule, as defined above.
  • nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic host cell
  • choice of an appropriate vector depends on the envisaged use for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form or else integration into the chromosomal material of the host ), as well as the nature of the host cell.
  • the vector is selected from the group consisting of plasmids, integrative viral vectors such as AAN, retroviras and lentiviruses, and homologous recombination vectors.
  • said vector is selected from the group consisting of the sequences SEQ ID ⁇ O: 1 and SEQ ID ⁇ O: 2 corresponding respectively to the plasmids called pSH-Del and pSH-Iv.
  • These plasmids include the CMV promoter, two I-Sce I sites respectively in direct or reverse orientation and the coding sequences of the antigens H2-K (orientation 5'-3 '), CD8 (orientation 3'-5') and CD4 (orientation 5'-3 '), functionally linked to a polyadenylation signal.
  • the present invention also relates to a modified cell comprising a double-stranded DNA molecule or a vector as defined above.
  • the modified cell according to the invention is modified by genomic integration of a copy of said double-stranded DNA molecule.
  • the modified cell as defined above is a mammalian cell.
  • the present invention also relates to a recombinant non-human mammal, comprising a double-stranded DNA molecule as defined above.
  • the modified cell or of the recombinant non-human mammal as defined above, they also comprise a cassette for expression of a restriction enzyme selected from the group consisting of restriction enzymes with site rare and meganucleases.
  • they further comprise the sequence coding for Bcl-2 or a Bcl-2 expression cassette, such as that described in HUANG DC et al. (EMBO J., 1997, 16, 15, 4628-4638).
  • said rare site restriction enzyme has an asymmetric (non-palindromic) cleavage site.
  • said restriction enzyme is the meganuclease I-Sce I.
  • a subject of the present invention is also a method for measuring the non-homologous recombination process (NHEJ) in mammalian cells, characterized in that it comprises at least the following steps: ai) culturing mammalian cells modified comprising a hybrid double-stranded DNA molecule as defined above, said cells being advantageously modified either using naked DNA or using a vector containing said double-stranded DNA molecule strand, in accordance with the methods set out above, bi) cleavage of the DNA of said cells, at said double-strand cleavage sites of said hybrid double-strand DNA molecule (s), by an appropriate means, ci) analysis of expression of reporter genes A, and C, and optionally B, in said cells by appropriate means, and di) measuring the efficiency and fidelity of DNA repair of said cells by determining the proportion of cells expressing the reporter gene C and optionally the reporter gene B.
  • NHEJ non-homologous recombination process
  • the present invention also relates to a method for screening for modulators of the non-homologous recombination process (NHEJ) in mammalian cells, characterized in that it comprises at least the following steps: a 2 ) the culture of modified mammalian cells as defined above, b 2 ) the treatment of said modified cells with at least one test substance, c 2 ) the cleavage of the DNA of said cells, at said double-strand cleavage sites of said or said hybrid double-stranded DNA molecule (s), by an appropriate means, d 2 ) analysis of the expression of reporter genes A and C and optionally B in said treated or untreated cells, by an appropriate means, and e 2 ) measuring the activity of said substance on the efficiency and fidelity of DNA repair by comparison, between treated and untreated cells, of the proportion of cells expressing the reporter gene C and optionally the reporter gene B.
  • NHEJ non-homologous recombination process
  • they comprise the implementation, in parallel, of two types of modified cells comprising a hybrid double-stranded DNA molecule including two reporter genes A and C and two cleavage sites directed double-strand, in direct and reverse orientation respectively.
  • said cells modified in step ai or a 2 comprise a molecule of hybrid double-strand DNA including three reporter genes A, B and C and two sites of double-strand cleavage directed in direct or reverse orientation.
  • said directed double strand cleavage of DNA in step bi or c is carried out by a restriction enzyme selected from the group consisting of site restriction enzymes rare and meganucleases; preferably, said rare site restriction enzyme has an asymmetric site and said meganuclease is I-Sce I; preferably, said restriction enzyme is introduced into said cells modified by an appropriate vector, as defined above.
  • a restriction enzyme selected from the group consisting of site restriction enzymes rare and meganucleases; preferably, said rare site restriction enzyme has an asymmetric site and said meganuclease is I-Sce I; preferably, said restriction enzyme is introduced into said cells modified by an appropriate vector, as defined above.
  • the analysis of the expression of the reporter genes A and C and optionally B in step Ci or d 2 is carried out by flow cytometry or by an immunoenzymatic method (ELISA), either directly or using 'antibodies specific for said reporter genes, coupled to an appropriate marker.
  • the present invention also relates to a kit for measuring the non-homologous recombination process (NHEJ) in mammalian cells, characterized in that it comprises at least one double-stranded DNA molecule or a modified mammalian cell. as defined above.
  • NHEJ non-homologous recombination process
  • the present invention also relates to the use of the screening method as defined above, for the selection of anti-cancer or anti-retroviral drugs.
  • the present invention also relates to a modulator of the non-homologous recombination process (NHEJ), characterized in that it is obtained by the screening method as defined above.
  • NHEJ non-homologous recombination process
  • the present invention also relates to a medicament comprising a modulator as defined above.
  • the present invention also relates to the use of the modulator as defined above, for the preparation of an anti-cancer or anti-retroviral drug.
  • NHEJ non-homologous recombination process
  • the modified mammalian cells containing a chromosomal copy of this substrate which are used in the method according to the invention make it possible to specifically measure the process of non-homologous recombination (NHEJ). in a chromosomal context.
  • this method takes account of faithful or unfaithful events since the cuts in the present invention can be made in non-coding regions.
  • the method according to the invention can be easily automated; the cells transformed with the hybrid DNA sequence or substrate according to the invention are seeded in each well of a culture plate (96-well plates), then they are infected with an expression vector coding for a restriction enzyme non-palindromic rare site or meganuclease (I-Sce I). After incubation with a commercial antibody specific for each transgene (alone or as a mixture), the expression of the reporter gene is measured directly in each well (flow cytometry, ELIS A). In addition, if the reporter genes encode a surface antigen, there is no need to lyse the cells, which facilitates automation.
  • I-Sce I restriction enzyme non-palindromic rare site or meganuclease
  • the invention also includes other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the non-homologous recombination substrate (NHEJ) and of the screening method for objects. of the present invention as well as to the accompanying drawings in which:
  • FIG. 1 illustrates the strategy for cloning the I-Sce I sites in non-homologous recombination plasmid substrates pSH-Del (SEQ ID NO: 1) and pSH-Iv (SEO ID NO: 2):
  • a first oligonucleotide (1LO, SEQ ID NO: 3) containing 5 'in 3', a first site N7ze I, a site Xba I, a site I-Sce I (orientation 5 ' -3 ') and a second Nhe I site and a second oligonucleotide (1 UP, SEQ ID ⁇ O: 4) complementary to the previous one, are hybridized and cloned in both orientations at the NAe I site of the plasmid pdD ⁇ A6N5-His.
  • the plasmids obtained respectively contain a fragment Ii including an I-Sce I site in 3'-5 'orientation (pSH-Iv) and a fragment I ⁇ including an I-Sce I site in 5'-3' orientation (pSH-Del ).
  • a 119 bp fragment was amplified by PCR using the primers PI (SEQ ID NO: 5) and P2 (SEQ ID NO: 6), then a 30 bp fragment containing the Cla I, Sce I and Xba I, obtained by hybridization of the oligonucleotides 2LO (SEQ ID NO: 7) and 2 UP (SEQ ID NO: 8) was inserted at the site Nde I of the 119 bp fragment to give fragment I 2 .
  • This fragment was cloned at the BstE II site of the preceding plasmids to give the plasmids pSH-Iv and pSH-Del containing 2 I-Sce I sites respectively in reverse and direct orientation.
  • FIG. 2 illustrates the structure of a non-homologous recombination plasmid substrate (NHEJ) of sequence SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) or SEQ ID NO: 1 (pSH-De
  • these plasmids are derived from the plasmid pcDNA6 / N5-His (I ⁇ VITROGE ⁇ ) carrying the genes for resistance to ampicillin (ampR) and to blasticidin ( blastiR), by inserting the following fragments respectively at the N7ze I, BamH I, Xho I, BstE H and BstB I site of the multiple cloning site located between the hCMN promoter and the polyadenylation signal of the BGH gene: a fragment I- * containing an I-Sce I site in 5'-3 'or 3'-5' orientation, a fragment A containing the coding sequence of the mouse H2-K d antigen (5'-3 'orientation) immediately followed by the signal polyadenylation of the SV40 virus, a fragment B containing the coding sequence of the mouse CD8 antigen (orientation 3'-5 ') immediately followed by the polyadenylation signal
  • the distances between the fragments are indicated in number of bp, the large arrows in bold indicate the orientation of the coding sequences and the small arrows indicate the position and the orientation of the primers 1 and 2 (S ⁇ Q ID ⁇ O: 7 and S ⁇ Q ID ⁇ O : 8) used for the analysis of clones of modified mammalian cells having integrated at least one copy of the recombination substrate.
  • FIG. 3 illustrates the measurement of the non-homologous recombination process (NH ⁇ J) in modified mammalian cells containing the non-homologous recombination substrate according to the invention (H2 cells CD4 " CD8 " ): the expression of antigens H2, CD4 and CD8 is analyzed by flow cytometry or by ⁇ LISA, approximately 48 h to 72 h after the transfection of an expression vector for the enzyme I-Sce I; the overall efficiency of non-homologous DNA repair in mammalian cells is measured by the percentage of cells expressing CD8 or CD4 (CD4 + + CD8 *), for both types of substrates.
  • the fidelity of the recombination can be measured by the difference between the proportion of CD4 + cells obtained with the substrate in direct orientation and that in reverse orientation.
  • the vertical arrows shims indicate the position of the I-Sce I sites and the horizontal arrows, the orientation of the coding sequences of the antigens H2 (5'-3 '), CD8 (3'-5') and CD4 (5'-3 '), relative to the promoter hCMN (P); the solid arrows represent the antigens which are expressed and the dotted arrows represent the antigens which are not expressed.
  • Example 1 Construction of non-homologous recombination substrates according to the invention ( Figures 1 and 2) 1) Equipment and methods
  • the plasmid pcD ⁇ A6N5-HisC (INVITROGEN) which contains: (i) the promoter of human cytomegaloviras (hCMN) linked to a multiple cloning site, for the insertion of the sequences of interest, and to the polyadenylation signal of the hormone of bovine growth (BGH), (ii) the gene for resistance to blasticidin under the control of the EM-7 promoter, for the selection of modified mammalian cells having integrated the sequences of interest into their genome and (iii) the gene of ampicillin resistance, for the selection of recombinant clones having inserted a DNA fragment into the multiple cloning site of the plasmid, was used to constrain two non-homologous recombinant plasmid substrates respectively named pSH-Del and PSH-Iv.
  • plasmids which contain the hCMN promoter, two I-Sce I sites in direct orientation (pSH-Del, FIG. 1) or reverse (pSH-Iv, FIG. 1) and the mouse H2K d , CD8 and CD4 antigens, have were constructed by successive cloning of 5 fragments (A, I 2 , I ⁇ B and C in the order of cloning), respectively at the BamH l, BstE H, Nhe I, Xho I and BstB I sites of the plasmid pcD ⁇ A6 / N5- HisC ( Figure 2).
  • Sal I of 800 bp of the plasmid pSMLyt2aMMCL / 2 (described in Turner et al. Ce / 7, 1990, 60, 755-765, supplied by Dr. D. Littman), containing the coding sequence of the mouse CD8 antigen mutated at positions 691 and 697 (Cys 227 Ala and Cys 229 Ala) and (ii) the Sca l-Hind HJ fragment of 570 bp from the plasmid pTK-Hygro (Genbank U02428, supplied by CLONTECH), containing 60 bp of sequence 3 ' and the polyadenylation signal of the thymidine kinase gene (TkpA), were successively inserted between the Xba I and Xho I sites and the BamH I and Hind m sites of the plasmid pcDNA3 (INVITROGEN), then the BamH ⁇ -Hind JR fragment of the plasmid thus obtained
  • the fragment containing the coding sequence of the CD8 antigen (positions 13 to 756 of the Genbank sequence M12825) can be amplified by PCR from cDNA of CD8 + T lymphocytes, using corresponding primers at the 5 'and 3' ends of said coding sequence.
  • This fragment containing part of the coding sequence (extracellular, transmembrane domains and a fragment of the cytoplasmic domain) and of the 3 'non-coding sequence of the CD4 antigen, was obtained by digestion of the plasmid pMN7L3T4-Tl (described in Turaer et al., Cited above, and supplied by Dr. D.
  • said fragment may be amplified by PCR from AD ⁇ c of CD4 + T lymphocytes, using primers corresponding to the 5 'and 3' ends of the coding sequence of the CD4 antigen (positions 170 and 1439 of the Genbank sequence X04836).
  • fragment Ii was cloned in the 2 orientations (5'-3 'orientation for pSH-Del and 3'-5' orientation for pSh-Iv), at the Nhe I site (FIG. 1),
  • FIG. 2 illustrates the general structure of the plasmid substrates pSH-Del and pSH-Iv having the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 respectively, after linearization at the Sca I site.
  • These substrates derived from the pcDNA6 / N5-HisC vector, successively comprise: - the hCMN promoter (from the pcD ⁇ A6 / N5-HisC vector), - an I-Sce I site, in 5'-3 'or 3'-5' orientation, in a non-coding sequence of approximately 150 bp, and located approximately 75 bp downstream of the end of the hCMN promoter sequence ,
  • the map of the plasmid pSH-Del (SEQ ID NO: 1) is presented in the Table below; the sequences in italics correspond to those of the plasmid pcDNA6 and the sequences in bold to those which have been inserted, the positions of the primers useful for PCR are also indicated and the primers allowing the detection of non-homologous recombination events are underlined.
  • Table I map of the plasmid pSH-Del
  • Example 2 Construction of a modified mammalian cell line by integration of a copy of the substrate according to the invention 1) Materials and methods a) Selection of stable clones Hamster cells (CHO-K1 line, ATCC No. CCL -61) are cultured in DMEM medium (GIBCO) containing 10% fetal calf serum (GIBCO), at 37 ° C., in the presence of 5% CO 2 .
  • DMEM medium GIBCO
  • fetal calf serum fetal calf serum
  • 10 6 cells were electroporated (1000 N, 25 ⁇ F) with 0.1 ⁇ g of the substrate plasmids as described in Example 1 previously linearized at the Sca I site. The cells were then seeded in Petri dishes (100 mm in diameter) containing 10 ml of DMEM medium as defined above.
  • blasticidin was added to the culture medium (5 ⁇ g / ml), and the resistant clones were removed after 10 days of culture in selective medium.
  • the presence of the H2-K antigen and the absence of CD4 antigen are analyzed by flow cytometry (FACS), for each clone selected.
  • the cells are detached in the presence of PBS containing 50 mM of EDTA, rinsed with PBS, then incubated simultaneously with an anti-H2-K d antibody coupled to phycoerythrin (clone SF1.1, BD
  • the cells are analyzed by flow cytometry and the clones expressing the H2-K d antigen but not the CD4 antigen and the CD8 antigen (clones H2 + CD4 " CD8 " ) are preserved.
  • the genomic AD ⁇ of each clone is extracted by conventional techniques, according to the protocols described in Current Protocols in Molecular Biology, cited above.
  • the presence of at least one complete copy of a substrate in the genome of the clones is analyzed by PCR using a complementary sense primer.
  • the ampicillin gene (primer 2 of sequence SEQ ID NO: 9 corresponding to positions 9341-9345 of pSH-Del, FIG. 2) and an antisense primer complementary to the CMN promoter (primer 1 of sequence SEQ ID ⁇ O : 10 corresponding to positions 871-848 of pSH-Del, FIG. 1).
  • the results are confirmed in Southern blot, using a labeled probe corresponding to the blasticidin gene.
  • CD4 and the CD8 antigen were isolated after transfection of pSH-Iv (11 clones) and pSH-Del (8 clones). Among these clones, at least 5 contain a single copy of the substrate integrated into their genome.
  • the enzyme I-Sce I is introduced into the cells previously treated with the test molecule, using a plasmid expression vector as described in Rouet et al., P. ⁇ .AS, 1994, 91, 6064-6068 or of a retroviral vector derived from the plasmid pTRIPdelta, described in Zennou et al., Cell, 2000, 101, 173-185, according to the conventional protocols known to those skilled in the art.
  • the cells are infected with the retroviral vector which makes it possible to carry out a double-strand cut in 100% of the cells.
  • the cells are detached in the presence of PBS containing 50 mM EDTA, rinsed with PBS, then the expression of the different antigens is analyzed by one of the following techniques: fluorometry or ELISA. Ci) fluorometry . (flow cytometry or fluorescence microscopy)
  • the cells are incubated simultaneously with an anti-H2K d antibody (clone SF1.1, BD PHARMINGEN) then a secondary antibody (donkey anti-mouse IgG antibody) coupled to cyanine (715-176-150, JACKSON, INTERCHIM ), an anti-CD4 antibody coupled to fluorescein isothiocyanate (RM- 4-5, BD PHARMINGEN) and an anti-CD8 antibody coupled to phycoerythrin (53-6.7, PHARMINGEN), according to the supplier's recommendations.
  • the percentage of cells expressing H2, CD8, CD4 or none of these antigens is analyzed by flow cytometry or by counting the cells observed by fluorescence microscopy.
  • c 2 ELISA
  • the cells are incubated in 96-well plates coated with rabbit polyclonal anti-CD4 or anti-CD8 antibodies and then lysed in the presence of an appropriate buffer. The plates are washed, then the antigen-antibody complexes formed are revealed in the presence of a rat monoclonal antibody coupled to alkaline or fluorescent phosphatase.
  • the percentage of cells expressing CD8 or CD4 is analyzed using an ELISA reader.
  • the cells are rinsed in PBS without Ca ++ Mg " " " " and incubated with 50 mM PBS / EDTA buffer for 5 minutes. Before detachment of the cells, the PBS / EDTA is aspirated and the cells are taken up in PBS without Ca "1""1" Mg ++ . After centrifugation for 5 minutes at 1500 rpm, the cells are fixed with 4% paraformaldehyde (PAF) for 20 minutes. The cells are then washed with PBS, then 10 6 cells are incubated with 0.5 ⁇ g of antibody in 30 ⁇ l of PBS / BSA 0.5% for 45 minutes with regular shaking.
  • PAF paraformaldehyde
  • the cells are first incubated with the primary anti-mouse monoclonal antibody H-2Kd (Pharmingen, clone SF- 1.1), then with the secondary anti-mouse antibody Cy TM 5 conjugate (Jackson Immunosearch). Labeling with anti-mouse monoclonal antibodies CD4 FITC conjugate (Pharmingen, clone RM4-5) and anti-mouse CD8 PE conjugate ( Pharmingen, clone 53-6.7) are done during a single incubation. Each incubation is followed by washing with PBS / BSA, and centrifugation for 5 minutes at 1500 rpm.
  • the cells are taken up in 500 ⁇ l of 0.1% PBS / PAF and analyzed with FACS. This device analyzes the presence or absence of the fluorescence corresponding to a given fluorochrome, thus discriminating the populations expressing an antigen (+) from those which do not express it (-). Analysis of the results is performed by Cell Quest software
  • This software also makes it possible to determine the percentages of cells simultaneously presenting two or three of these characteristics (H2Kd "
  • measurement of non-homologous recombination (NHEJ) in treated or untreated cells The overall efficiency of non-homologous DNA repair in mammalian cells is measured by the percentage of cells expressing CD8 or CD4 ( CD4 + / CD8 + ), for both types of substrates.
  • the fidelity of the recombination can be measured by the difference between the percentages of CD4 cells obtained with the substrates in direct orientation (pSH-Del) and reverse (pSH-Iv).
  • CD4 and the CD8 antigen (clones H2 + CD4 " CD8 " ) isolated after transfection of pSH-Iv and pSH-Del were transiently transfected with an expression plasmid of the enzyme I-Sce I (efficiency of 20 %). At different times after transfection, the percentages of cells expressing the CD4 and CD8 antigens in the total cell population were determined by analysis by flow cytometry. The results obtained with the chromosomal recombination substrates containing two sites I- Sce I, respectively in direct (pSH-Del) and reverse (pSH-Iv) orientation, are presented in Tables II and m below.
  • NHEJ The main pathway of NHEJ is controlled by the heterodimer KU80 / KU70, the catalytic subunit DNA-PKcs and ligase 4 with its co-factor XRCC4. A mutation in one of these genes makes cells radiosensitive. This metabolic pathway and its proteins are the main targets for screening anti-NHEJ molecules.
  • the literature suggests, however, that this path is not the only one, and several studies in other organisms and in extrachromosomal contexts suggest that there is a parallel mechanism of NHEJ.
  • the substrate according to the invention was integrated under conditions similar to those of Example 2 in a mutant cell line for KU80, the xrs6 line (ECACC 96012301), and showing an increased radio-sensitivity.
  • the results obtained show a good efficiency in repairing cuts induced by I-Scel (similar to that obtained in control cells), but this repair is not very faithful and very many modifications are measured.
  • inhibiting the KU pathway can effectively radio-sensitize but risks activating an alternative pathway of repair which generates genetic modifications with often deleterious consequences (for example tumorigensis).
  • the screen of anti-NHEJ molecules must therefore be evaluated on the main DNA-PK route but also on the alternative route demonstrated by the experiments carried out with the substrate according to the invention. We must therefore be able to measure the effectiveness of this alternative route.
  • the substrate according to the invention is capable of this, in particular in the cell line xrs6 (defective for KU) in which the DNA-PK pathway is inactive, but the imitating alternative pathway is very effective.
  • Example 5 Measurement of non-homologous recombination (NHEJ) in lines overexpressing the anti-apoptotic oncogene Bcl-2.
  • the oncogene Bcl-2 inhibits the induction of 0 apoptosis and therefore allows the proliferation of tumor cells.
  • the use of the substrate according to the invention has made it possible to show that in addition to its anti-apoptotic role, Bcl-2 stimulates repair by NHEJ.
  • Anti-tumor strategies focused on Bcl-2 must take into account this parameter (measurable with substrate 5 according to the invention) in order to assess the impact of a potentially anti-Bcl-2 molecule on the efficacy but also the quality of repair.
  • a vector encoding Bcl-2 such as that described in HUANG DC et al. (EMBO J., 1997, 16, 15, 4528-4638) was introduced in cells having the NHEJ substrate, obtained as described in Example 2.
  • the clones expressing Bcl-2 are selected on a medium containing puromycin.
  • the overexpression of Bcl-2 in these cells makes it possible to increase by a factor of 2 the frequency of appearance of CD4 + and CD8 + , and therefore the efficiency of repair of double chain breaks by NHEJ.
  • This stimulation of the NHEJ by the overexpression of Bcl-2 does not have an effect on the fidelity of the repair. Indeed, no significant difference is observed following the sequencing of repair scars.

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Abstract

Molécule d'ADN double-brin hybride isolée, destinée ô être utilisée comme substrat de recombinaison non-homologue, comprenant : un seul promoteur unidirectionnel et au moins deux gènes rapporteurs différents, respectivement A et C dans le sens de la transcription ; le seul gène sous le contrôle dudit promoteur étant le gène rapporteur A, et deux sites de coupure double-brin dirigée identiques, le premier site de coupure étant situé entre le promoteur et le gène rapporteur A et le second site de coupure étant situé en amont du gène rapporteur C ou dans celui-ci et utilisation de ladite molécule d'ADN double-brin hybride pour mesurer le processus de recombinaison non-homologue de l'ADN ou Non-Homologous End Joining (NHEJ) dans des cellules de mammifères, ainsi que pour cribler des médicaments anti-cancéreux ou anti-rétroviraux.

Description

MESURE DU PROCESSUS DE RECOMBINAISON NON-HOMOLOGUE DE L' ADN DANS DES CELLULES
DE MAMMIFERE
L'invention concerne une méthode de mesure du processus de
5 recombinaison non-homologue de l'ADN ou Non-Homologous End Joining (NHEJ) dans des cellules de mammifère, des molécules d'ADN double-brin hybrides et des cellules modifiées pour la mise en œuvre de cette méthode, ainsi que leur utilisation pour le criblage de médicaments anti-cancéreux ou anti-rétro viraux.
Au cours de la vie somatique et de la transmission de l'information 10 génétique, l'ADN subit des lésions programmées, spontanées, environnementales ou induites, dont la réparation est nécessaire pour le maintien de l'intégrité du matériel génétique et la survie cellulaire. Ces lésions, de nature très diverses, sont, pour la plupart, réparées fidèlement ; toutefois, les défauts de réparation et les anomalies de la recombinaison conduisent à des mutations et des réarrangements du génome qui 15 peuvent être à l'origine des événements d'initiation de la cancérogenèse et de prédispositions génétiques à des pathologies diverses.
Les radiations ionisantes sont à l'origine de différentes lésions de l'ADN, parmi lesquelles les cassures double-chaîne (CDC) sont connues comme étant responsables des effets biologiques radio-induits les plus toxiques (mutations, insta- 20 bilité chromosomique, etc.). Les CDC peuvent également se produire à la suite d'arrêts de la fourche de réplication, notamment générés par certaines drogues utilisées en chimiothérapie.
Les cassures double-chaîne peuvent être réparées par des processus de recombinaison qui sont principalement de deux types : 25 • La recombinaison homologue, qui permet de réparer les CDC en utilisant des séquences homologues intactes d'une molécule donneuse (chromosome homologue, chromatide sœur, séquence homologue sur un plasmide) ; une homologie de plusieurs dizaines de bases est nécessaire entre les deux partenaires de la recombinaison. 30 • La recombinaison par religature des extrémités ou recombinaison non-homologue (Non-Homologous End Joining, NHEJ), qui ne nécessite pas de fortes homologies entre les séquences des deux extrémités de la CDC. Chez les mammifères, la réparation des CDC s'effectue principalement par le processus de recombinaison non-homologue ou processus NHEJ qui religature les extrémités cassées.
Outre leur participation au maintien de l'intégrité du génome, les processus de recombinaison non-homologue peuvent aussi être impliqués dans des phénomènes biologiques ayant des effets moins favorables pour la cellule :
- les cellules délétées ou défectives pour les protéines cellulaires impliquées dans le processus NHEJ présentent une sensibilité accrue aux radiations ionisantes ; en conséquence, pour optimiser les traitements radio- et chimio-thérapeu- tiques, notamment anti-cancéreux, l'utilisation d'inhibiteurs du processus NHEJ pourrait augmenter l'efficacité desdits traitements et donc diminuer les doses utilisées aussi bien en radiothérapie qu'en chimiothérapie. Ceci pourrait permettre de diminuer les risques secondaires associés au traitement lui-même et d'améliorer le confort du malade. - les protéines impliquées dans le processus NHEJ participent également au maintien des télomères, essentiel dans les cellules en réplication active telles que les cellules tumorales. L'inhibition de cette voie pourrait également sensibiliser les cellules proliférantes à des stress génotoxiques.
- enfin, la machinerie cellulaire du processus NHEJ serait impliquée dans l'intégration des retroviras dans le génome cellulaire, puisque le génome viral s'intègre, après cassure double-brin de l'ADN cellulaire. Les protéines impliquées dans le processus NHEJ constituent de nouvelles cibles pharmacologiques représentant une solution supplémentaire dans le cadre des multithérapies. Des inhibiteurs du processus NHEJ constitueraient une voie efficace dans le traitement contre les rétro- virus comme le NIH, par exemple en inhibant le phénomène d'intégration du virus.
Toutefois, l'isolement de tels inhibiteurs du processus ΝHEJ implique de disposer d'outils simples, sensibles et spécifiques, adaptés à l'analyse quantitative rapide des événements de recombinaison non-homologue dans une cellule de mammifère ; de tels outils doivent permettre, non seulement d'analyser les proces- sus de recombinaison ou de réparation mis en jeu, mais aussi de mesurer leur efficacité. Il existe aujourd'hui différentes méthodes d'analyse de la réparation des cassures double-chaîne :
Certaines se font directement sur les cellules après irradiation, soit par évaluation de la survie cellulaire, soit par analyse de l'ADN par électrophorèse en champ puisé. Ces méthodes sont approximatives car elles ne permettent pas d'analyser précisément les processus de recombinaison (homologue ou non-homologue) impliqués dans la réparation et des études supplémentaires, au niveau moléculaire, sont nécessaires pour identifier la nature de ces processus.
D'autres méthodes, plus précises, utilisent un substrat qui est un fragment d'ADN extrachromosomique (plasmidique) ou intrachromosomique comprenant des marqueurs génétiques. Certains substrats possèdent un ou plusieurs sites de coupure I-Sce I. I-Sce I est une enzyme de restriction particulière de la catégorie des méganucléases ; elle est codée par un intron de la mitochondrie de la levure Saccha- romyces cerevisiae, sa spécificité et sa précision sont importantes, grâce à son site de reconnaissance qui excède 12 pb pour atteindre 18 pb ou plus et est asymétrique. L'insertion du site I-Sce I assure donc une coupure unique dans le génome des cellules de mammifère et en fait un outil idéal pour l'étude de la réparation des CDC ; les sites I-Sce I permettent de provoquer une CDC dirigée à l'intérieur de la cellule, et les marqueurs génétiques d'identifier le mode de réparation de l'ADN mis enjeu. 1) Les méthodes qui utilisent un substrat plasmidique comprennent essentiellement : la transfection transitoire de cellules de mammifère par des plasmides préalablement linéarisés et l'analyse (PCR, Southern-Blot, séquençage) de la réparation de cet ADN plasmidique (efficacité et fidélité), après extraction et amplification dans des bactéries (Smith et al; N.A.R., 2001, 29 (23), 4783-4792 ; Escarceller et al., J Mol. Biol, 1998, 279, 375-385).
Ces méthodes ne permettent pas de mesurer la réparation dans un contexte chromosomique mais dans un contexte plasmidique, ce qui modifie énormément les contraintes et est générateur d'artefacts ; beaucoup d'événements peuvent être générés par la transfection elle-même et le nombre de copies par cellule est difficile- ment contrôlable. En outre, le passage en bactéries peut également affecter les résultats ; par exemple, des cellules mutantes pour le gène KU (défaut de réparation des cassures double-chaîne et sensibilité aux radiations), analysées par cette méthode, ne montrent pas de diminution de l'efficacité de réparation mais seulement une diminution de sa fidélité.
En outre, ces méthodes présentent l'inconvénient d'être longues, difficilement automatisables et peu sensibles ; elles ne permettent pas de détecter de différences dans la réparation, inférieures à un facteur 10.
2) Les méthodes qui utilisent un substrat chromosomique comprennent essentiellement : l'intégration dans le génome de cellules de mammifère d'un site I-Sce I placé dans un gène de résistance à une drogue, la coupure double-brin dirigée du substrat et l'analyse de la réparation de l'ADN, soit par l'acquisition de la résistance à la drogue (système sélectif : Lukacsovich et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5649 ; Liang et al., P. N. A. S., 1998, 95, 5172-;, soit par analyse directe de l'ADN (système non-sélectif : Liang et al., précité ; Lin et al, Mol. Cell. Biol., 1999, 8353-8360, Lin et al., Genetics, 2001, 158, 1665-1674).
De manière plus précise : - Lukacsovich et al. (précité) décrivent un système sélectif comprenant un gène de la thymidine kinase (tk), interrompu par un site I-Sce I, intégré de façon stable, en un seul exemplaire dans le génome de fibroblastes tk". L'enzyme I-Sce I est introduite par électroporation, soit seule pour identifier des phénomènes de recombinaison non-homologue, soit accompagnée de constructions servant de substrat pour une recombinaison homologue : pTARG (qui possède le gène tk avec une interruption par introduction d'une séquence inversée de 104 paires de bases) ou pAL2 (porteur du gène tk sauvage). Les phénomènes de réparation (homologues ou non- homologues) sont analysés par PCR et Southern Mot.
Cette méthode qui repose sur l'acquisition de la résistance à la drogue ne permet d'analyser que la réparation non-homologue infidèle (perte du site I- Scel pour récupérer le cadre de lecture du gène de résistance) et non pas l'efficacité de la réparation non-homologue, dans la mesure où les événements fidèles ou infidèles qui ne restaurent pas le cadre de lecture ouvert ne sont pas révélés. En outre, cette méthode est longue (plusieurs semaines pour comptabiliser les clones recombinants résistants à l'antibiotique), coûteuse en culture cellulaire, et difficilement automatisable.
- Liang et al. (précité) décrivent un système sélectif comprenant un gène marqueur hygR entouré de deux gènes de la néomycine (néo) en répétition directe, intégré de façon stable, en un seul exemplaire, dans le génome de cellules de mammifère : le premier en 5' (S2neo) contient un site I-Sce I et possède un site Ncol muté, le second en 3' (3 'néo) est un fragment tronqué de 0,7 kb du gène néo sauvage, mais possède une séquence comprenant le site Ncol fonctionnel, qui peut servir à réparer S2néo. La cellule qui possède ce substrat est résistante à l'hygromycine mais pas au G418. Après introduction de l'enzyme I-Sce I dans les cellules, la réparation des CDC, qui peut se faire par différents mécanismes de recombinaison homologue [par conversion génique, associée ou non à un crossing over, ou bien par appariement de l'ADN simple-brin ou SSA (Single-Strand Annealing)}, est mesurée par la fréquence des clones recombinants néo+ (néo hyg" ou néo hyg ).
Cette méthode qui repose sur l'acquisition de la résistance à la drogue ne permet pas d'analyser la NHEJ mais uniquement la recombinaison homologue. - Liang et al., précité, décrivent également un système non sélectif pour identifier les événements homologues et non-homologues (NHEJ) ; dans ce système non sélectif, des cellules contenant le substrat chromosomique précédent, cultivées en milieu non sélectif, sont électroporées avec un plasmide d'expression du gène I-Sce I . Puis, 0, 4 et 24 h plus tard, le gène néo est amplifié par PCR et les produits amplifiés sont digérés avec les enzymes Nco I et/ou I-Sce I et les réparations homologues (Nco 1+ / I-Sce I-) ou non-homologues infidèles (Nco I- / I-Sce I-) sont identifiées par Southern-Blot.
Cette méthode, qui repose sur l'analyse de l'ADN, est moins longue que la précédente, mais elle ne permet d'analyser que la réparation non-homologue infidèle (perte du site I-Sce/ pour récupérer le cadre de lecture du gène de résistance) et non pas l'efficacité de la réparation non-homologue.
Il apparaît donc qu'on ne dispose à l'heure actuelle, d'aucune méthode d'analyse de la réparation des cassures CDC par recombinaison, qui soit spécifique du processus NHEJ et permette en outre une analyse qualitative et quantitative de ce mécanisme (efficacité et fidélité).
Or, compte tenu des implications médicales du processus NHEJ et en particulier de l'intérêt de trouver des inhibiteurs de ce processus, il existe un réel besoin de disposer d'une méthode spécifique, rapide, sensible et simple à mettre en œuvre, permettant d'analyser qualitativement et quantitativement la recombinaison non-homologue (NHEJ) dans les cellules de mammifère.
C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont mis au point un subs- trat qui permet effectivement d'identifier spécifiquement le processus NHEJ et d'en mesurer l'efficacité et la fidélité dans les cellules de mammifère.
La présente invention a ainsi pour objet une molécule d'ADN double-brin hybride isolée, destinée à être utilisée comme substrat de recombinaison non-homologue, caractérisée en ce qu'elle comprend : - un seul promoteur unidirectionnel et au moins deux gènes rapporteurs différents, respectivement A et C dans le sens de la transcription ; le seul gène rapporteur sous le contrôle dudit promoteur étant le gène rapporteur A, et
- deux sites de coupure double-brin dirigée identiques, le premier site de coupure étant situé entre le promoteur et le gène rapporteur A et le second site de coupure étant situé en amont du gène rapporteur C ou dans celui-ci.
Dans le processus NHEJ, aucune homologie de séquence n'est nécessaire pour la réparation de la CDC. Aussi lorsqu'il y a deux CDC, la religature des deux extrémités de la double chaîne d'ADN peut donc aboutir à trois types d'événements, à savoir : (i) la reconstitution de la molécule initiale, (ii) la délétion simple du fragment d'ADN compris entre les deux sites de coupure et (iii) l'inversion du fragment d'ADN.
En outre, la réparation peut-être fidèle ou infidèle : elle est fidèle lorsque les deux extrémités de la cassure double-chaîne sont religaturés sans modification de séquence, dans le cas contraire (substitution, insertion, délétion d'un ou de plusieurs nucléotides), elle est infidèle.
Selon un mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin hybride selon l'invention, elle comprend également un troisième gène rapporteur B situé entre le gène rapporteur A et le second site de coupure double-brin dirigée, lequel gène rapporteur B est inversé par rapport au sens de la transcription dudit promoteur.
La molécule d'ADN double-brin selon l'invention ou substrat de recombinaison non-homologue, comprend donc essentiellement trois éléments qui sont nécessaires et suffisants pour évaluer le type de réparation mis enjeu (délétion si 2 gènes rapporteurs A et C ; délétion ou inversion si 3 gènes rapporteurs A, B, C), ainsi que l'efficacité et la fidélité de cette réparation, à savoir :
- un promoteur, - au moins deux gènes rapporteurs différents A et C ; de préférence trois gènes (A, B et C), et
- deux sites de coupure double-brin dirigée identiques, en orientation directe ou inverse.
Au sens de la présente invention, les sites de coupure double-brin dirigée sont des sites de coupure d'une enzyme de restriction telle qu'une enzyme de restriction à site rare ou une méganucléase ; ces enzymes de restriction sont définies sur le site http://www.meganuclease.com.
Le substrat de recombinaison non-homologue selon l'invention permet de mesurer rapidement (révélation 24 à 72 heures après cassure) la réparation, qu'elle soit fidèle ou infidèle. L'utilisation du substrat permet aussi de cribler de nouvelles molécules inhibitrices des protéines impliquées dans le processus de réparation d'ADN non-homologue ou Non-Homologous End Joining (NHEJ).
La construction du substrat est telle qu'après coupure double-brin avec une endonucléase (enzyme de restriction) puis réparation, seul un des trois gènes rapporteurs (A, B ou C) est placé sous le contrôle du promoteur et s'exprime :
- le gène rapporteur A s'exprime s'il n'y a pas de coupure ou si la réparation conduit à la reconstitution de la molécule initiale ; le gène B qui est inversé et le gène C ne s'expriment pas,
- le gène rapporteur C s'exprime si la réparation conduit à la délétion simple du fragment d'ADN compris entre les deux sites de coupure ; la délétion des gènes A et B place le gène C immédiatement derrière le promoteur, et
- le gène rapporteur B, lorsqu'il est présent, s'exprime si la réparation conduit à l'inversion du fragment d'ADN compris entre les deux sites de coupure ; l'inversion place le gène B immédiatement derrière le promoteur, le gène A qui est inversé et le gène C qui est éloigné ne s'expriment pas.
Selon le produit (A, B ou C) détecté par des moyens appropriés notamment des anticorps spécifiques des produits A, B ou C, on en déduit le méca- nisme, l'efficacité et la fidélité de la réparation. La détection spécifique permet aussi bien d'identifier que de quantifier l'événement.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, le premier site de coupure double-brin dirigée est situé entre le promoteur et le gène rapporteur A et le second site de coupure double-brin dirigée est situé entre les gènes rapporteurs B et C.
En effet, les sites de coupure double-brin dirigée peuvent se trouver dans des séquences codantes ou non codantes. Cependant, lorsque ces sites de coupure double-brin dirigée sont placés dans des régions codantes (dans l'un des gènes rapporteurs), il est nécessaire que la réparation reconstitue un gène rapporteur fonctionnel ou au contraire inhibe un gène (sélection négative ou positive). Dans ce cas, on ne peut mesurer que des événements fidèles ou que des événements infidèles (selon que l'on procède à une sélection positive ou négative).
En revanche, lorsque les sites de coupure sont placés dans des régions non codantes, l'ensemble des événements est pris en compte et le rapport entre fidélité et mutagenèse peut être mesuré. En effet, certains traitements peuvent affecter non pas l'efficacité mais la fidélité du mécanisme de réparation. En outre, l'expression du gène rapporteur n'est pas conditionnée par l'événement de recombinaison, laissant ainsi le « choix » (fidélité ou mutagenèse) au mécanisme de réparation. Ainsi, si le site de coupure est dans une région non codante, on peut avantageusement mesurer la fidélité de la réparation sans pression de sélection. Cette disposition, qui présente l'avantage particulier de découpler efficacité et fidélité de réparation, est donc préférée.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la molé- cule d'ADN double-brin selon l'invention, lesdits sites de coupure double-brin dirigée sont dans la même orientation (orientation directe).
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, lesdits sites sont en orientation opposée (orientation inverse). Selon une disposition avantageuse des modes de réalisation précédents, lesdits sites sont des sites de coupure d'une enzyme de restriction sélectionnée dans le groupe constitué par les enzymes de restriction à site rare et les méga- nucléases ; de préférence, ladite enzyme de restriction à site rare possède un site asymétrique (non-palindromique) et ladite méganucléase est I-Sce I.
En effet, selon l'orientation des sites de coupure asymétrique, le substrat permet en plus de différencier directement les événements fidèles ou infidèles. Par exemple, I-Sce I reconnaît un site de 18 pb et lorsqu'elle clive ce site, elle laisse 4 nucleotides sortants. Mais à l'inverse des enzymes de restriction classiques, le site I- Sce I n'est pas palindromique. Ainsi, si les deux sites de coupure sont en orientation directe, les nucleotides sortants produits sont parfaitement complémentaires et la réparation peut être fidèle ou infidèle. Si les deux sites sont en orientation inverse, les nucleotides sortants ne sont pas complémentaires et la réparation doit obligatoirement modifier les extrémités pour effectuer la ligature ; elle doit être obligatoirement infidèle. Dans cette orientation, les événements sont donc une mesure directe de la réparation infidèle.
Les deux constructions donnent donc des informations complémen- taires. En outre, la possibilité d'avoir un substrat avec les deux types d'orientation présente l'avantage supplémentaire de pouvoir différencier directement les événements fidèles ou infidèles sans avoir à séquencer les molécules recombinantes.
Ainsi, deux substrats comprenant deux sites I-Sce I respectivement en orientation directe et inverse et deux gènes rapporteurs A et C ou un seul substrat comprenant deux sites I-Sce I en orientation directe ou inverse et trois gènes rapporteurs A, B et C, permettent avantageusement de mesurer l'efficacité et la fidélité de la recombinaison non-homologue, 48 h après coupure double-brin dirigée et réparation ;
- Le substrat comprenant deux sites I-Sce I en orientation directe mesure : (i) la somme des réparations fidèles et infidèles, par l'expression de C qui résulte de la délétion du fragment interne et, dans le cas de trois gènes rapporteurs différents, (ii) la réparation nécessairement infidèle, par l'expression de B qui résulte de l'inversion du fragment interne, et
- Le substrat avec les deux sites I-Sce I en orientation inverse mesure : (iii) la réparation nécessairement infidèle, par l'expression de C qui résulte de la délétion du fragment interne et, dans le cas de trois gènes rapporteurs différents, (iv) la somme des réparations fidèles et infidèles, par l'expression de B qui résulte de l'inversion du fragment interne. » L'efficacité globale de la recombinaison non-homologue est mesurée, soit par la proportion de cellules exprimant l'un des gènes rapporteurs B ou C dans la population cellulaire totale (cellules B+ + cellules C , cas d'un seul substrat A, B, C), soit par la somme de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C dans la population cellulaire totale (ou dans la population de cellules transfectées, si l'efficacité de transfection varie en fonction du substrat), obtenue avec chacun des substrats (orientation directe et orientation inverse).
" La fidélité de la recombinaison non-homologue peut être mesurée par la comparaison de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C, obtenue avec le substrat en orientation directe et celui en orientation inverse.
En outre, les remaniements importants de l'ADN peuvent être mesurés avec les deux types de substrats, 5 jours après la coupure de l'ADN (temps nécessaire au renouvellement (turn-over) des protéines), par la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C, et éventuellement B dans l'ensemble des cellules ayant subi une réparation notable (cellules n'exprimant aucun des gènes rapporteurs).
Comme promoteur, on peut utiliser tout promoteur qui est actif dans des cellules de mammifère. A titre d'exemple non-limitatif, on peut citer : le promoteur précoce du cytomégalovirus (CMV), le promoteur de l'antigène T du virus SV40, de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex ou de la phosphoglycérate kinase, le fragment LTR des retroviras et les promoteurs inductibles comme celui de la métallothionine ou ceux du type Tet on/off. Les promoteurs de type LTR sont particulièrement intéressants, puisqu'ils sont capables de fonctionner à distance.
Comme gène rapporteur, on peut utiliser tout gène dont l'expression est détectable par des moyens simples et sensibles (fluorescence, luminescence, tech- niques immunoenzymatiques (ELISA) ou radioimmunologiques (RIA)). A titre d'exemple non-limitatif on peut citer les gènes codant pour des antigènes de surface comme par exemple CD4, CD8 ou les molécules du complexe majeur d'histocompati- bilité (CMH) comme les antigènes H2 du CMH de classe I de la souris (H2-K, H-2D, H2-L), des protéines à fluorescence intrinsèque comme la GFP (Green Fluorescent Protein) et leurs différents variants de couleur (YFP pour Yellow Fluorescent Protein, RFP pour Red Fluorescent Protein ou BFP pour Blue Fluorescent Protein), le gène LacZ (β-galactosidase) et les gènes de résistance aux antibiotiques (néomycine, hygromycine, puromycine, blasticidine, zéocine).
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la molécule d'ADN double-brin selon l'invention, elle comprend également une cassette d'expres- sion d'un marqueur de sélection tel qu'un marqueur métabolique ou un gène de résistance à un antibiotique (néomycine, hygromycine, puromycine, blasticidine, zéocine), utile pour la sélection de cellules modifiées ayant intégré une copie de ladite molécule d'ADN double-brin dans leur génome.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la molé- cule d'ADN double-brin selon l'invention, lesdits gènes rapporteurs A, B, C sont sélectionnés dans le groupe constitué par les antigènes H2, CD4 et CD8.
La présente invention a également pour objet un vecteur, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN double-brin, telle que définie ci-dessus.
De nombreux vecteurs où l'on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte euca- ryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
Selon un mode de réalisation avantageux du vecteur selon l'invention, il est sélectionné dans le groupe constitué par les plasmides, les vecteurs viraux intégratifs tels que l'AAN, les retroviras et les lentivirus, et les vecteurs de recombinaison homologue. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit vecteur est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID ΝO : 1 et SEQ ID ΝO: 2 correspondant respectivement aux plasmides dénommés pSH-Del et pSH-Iv. Ces plasmides comprennent le promoteur CMV, deux sites I-Sce I respectivement en orientation directe ou inverse et les séquences codantes des antigènes H2-K (orientation 5'-3'), CD8 (orientation 3'-5') et CD4 (orientation 5'-3'), liées de façon fonctionnelle à un signal de polyadénylation. La présente invention a également pour objet, une cellule modifiée comprenant une molécule d'ADN double-brin ou un vecteur tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de la cellule modifiée selon l'invention, elle est modifiée par intégration génomique d'une copie de ladite molécule d'ADN double-brin.
De préférence, la cellule modifiée telle que définie ci-dessus est une cellule de mammifère.
La présente invention a également pour objet un mammifère non- humain recombinant, comprenant une molécule d'ADN double-brin telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de la cellule modifiée ou du mammifère non-humain recombinant tels que définis ci-dessus, ils comprennent également une cassette d'expression d'une enzyme de restriction sélectionnée dans le groupe constitué par les enzymes de restriction à site rare et les méganucléases. Selon un autre mode de réalisation avantageux de la cellule modifiée ou du mammifère non-humain recombinant selon l'invention, ils comprennent en outre la séquence codant pour Bcl-2 ou une cassette d'expression de Bcl-2, telle que celle décrite dans HUANG D.C. et al. (EMBO J., 1997, 16, 15, 4628-4638).
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite enzyme de restriction à site rare possède un site de coupure asymétrique (non- palindromique).
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite enzyme de restriction est la méganucléase I-Sce I.
La présente invention a également pour objet une méthode de me- sure du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifères, caractérisée ne ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : ai) la culture de cellules de mammifère modifiées comprenant une molécule d'ADN double-brin hybride telle que définie ci-dessus, lesdites cellules étant avantageusement modifiées soit à l'aide d'ADN nu, soit à l'aide d'un vecteur contenant ladite molécule d'ADN double-brin, conformément aux méthodes exposées ci-dessus, bi) la coupure de l'ADN desdites cellules, au niveau desdits sites de coupure double-brin de ladite ou desdites molécule(s) d'ADN double-brin hybride(s), par un moyen approprié, ci) l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A, et C, et éven- tuellement B, dans lesdites cellules par un moyen approprié, et di) la mesure de l'efficacité et de la fidélité de la réparation de l'ADN desdites cellules par détermination de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C et éventuellement le gène rapporteur B.
La présente invention a également pour objet une méthode de cri- blage de modulateurs du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a2) la culture de cellules de mammifère modifiées telles que définies ci-dessus, b2) le traitement desdites cellules modifiées par au moins une substance à tester, c2) la coupure de l'ADN desdites cellules, au niveau desdits sites de coupure double-brin de ladite ou desdites molécule(s) d'ADN double-brin hybride(s), par un moyen approprié, d2) l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A et C et éventuellement B dans lesdites cellules traitées ou non-traitées, par un moyen approprié, et e2) la mesure de l'activité de ladite substance sur l'efficacité et la fidélité de la réparation de l'ADN par comparaison, entre les cellules traitées et non- traitées, de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C et éventuellement le gène rapporteur B.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux des méthodes précédentes, elles comprennent la mise en œuvre, en parallèle, de deux types de cellules modifiées comprenant une molécule d'ADN double-brin hybride incluant deux gènes rapporteurs A et C et deux sites de coupure double-brin dirigée, respectivement en orientation directe et inverse.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux des méthodes précédentes, les dites cellules modifiées à l'étape ai ou a2 comprennent une molécule d'ADN double-brin hybride incluant trois gènes rapporteurs A, B et C et deux sites de coupure double-brin dirigée en orientation directe ou inverse.
Selon encore un autre mode de mise en œuvre avantageux des méthodes précédentes, ladite coupure double brin dirigée de l'ADN à l'étape bi ou c , est réalisée par une enzyme de restriction sélectionnée dans le groupe constitué par les enzymes de restriction à site rare et les méganucléases ; de préférence, ladite enzyme de restriction à site rare possède un site asymétrique et ladite méganucléase est I-Sce I ; de manière préférée ladite enzyme de restriction est introduite dans lesdites cellules modifiées par un vecteur approprié, tel que défini ci-dessus. Avantageusement, l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A et C et éventuellement B à l'étape Ci ou d2 est effectuée en cytométrie de flux ou par une méthode immunoenzymatique (ELISA), soit directement, soit à l'aide d'anticorps spécifiques desdits gènes rapporteurs, couplés à un marqueur approprié.
La présente invention a également pour objet un kit de mesure du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADN double-brin ou une cellule de mammifère modifiée telles que définies ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé de criblage tel que défini ci-dessus, pour la sélection de médicaments anti-cancéreux ou anti-rétroviraux.
La présente invention a également pour objet un modulateur du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ), caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé de criblage tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un médicament com- prenant un modulateur tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation du modulateur tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament anti-cancéreux ou anti-rétroviral.
Les avantages de la méthode de mesure du processus de recombinai- son non-homologue (NHEJ) telle que définie ci-dessus sont les suivants : - spécificité
Du fait de la structure particulière du substrat de recombinaison, les cellules de mammifère modifiées contenant une copie chromosomique de ce substrat qui sont mises en œuvre dans la méthode selon l'invention, permettent de mesurer spécifiquement le processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans un contexte chromosomique. En outre, cette méthode prend en compte les événements fidèles ou infidèles puisque les coupures dans la présente invention peuvent se faire dans des régions non-codantes.
- sensibilité L'utilisation d'un seul substrat comprenant trois gènes rapporteurs différents ou de deux substrats comprenant des sites de coupure en orientation directe et inverse et deux gènes rapporteurs différents, lesquels gènes rapporteurs sont sous le contrôle transcriptionnel d'un seul promoteur, permet une détection sensible de l'ensemble des événements de recombinaison non-homologue (réparation fidèle ou infidèle par délétion ou par inversion).
- simplicité
L'analyse de l'expression des trois transgènes dans les cellules de mammifère modifiées est effectuée très facilement (FACS, ELISA), à l'aide d'anticorps commerciaux et permet de mesurer directement le processus de recombi- liaison non-homologue (NHEJ). Contrairement, aux méthodes de l'art antérieur telles que décrites ci-dessus, les résultats sont interprétables sans avoir à séquencer les molécules recombinantes.
Elle peut même être effectuée simultanément avec un triple marquage d'anticorps dans le même tube ou le même puits. - rapidité
A la différence des méthodes de l'art antérieur précédemment citées elle est rapide puisque les résultats sont obtenus en 24 h à 72 h.
En raison de ces différents avantages, la méthode selon l'invention est facilement automatisable ; les cellules transformées par la séquence d'ADN hybride ou substrat selon l'invention sont ensemencées dans chaque puits d'une plaque de culture (plaques à 96 puits), puis elles sont infectées par un vecteur d'expression codant pour une enzyme de restriction à site rare non-palindromique ou une méganucléase (I-Sce I). Après incubation avec un anticorps commercial spécifique de chaque transgène (seul ou en mélange), on mesure l'expression du gène rapporteur, directement, dans chaque puits (cytométrie de flux, ELIS A). En outre, si les gènes rapporteurs codent pour un antigène de surface, il n'est pas nécessaire de lyser les cellules, ce qui facilite l'automatisation.
Par comparaison, l'automatisation est beaucoup plus compliquée à mettre en œuvre avec les procédés de l'art antérieur. Par exemple, dans le cas d'un procédé utilisant des substrats plasmidiques (épisomiques), il faut ensemencer les cellules dans les plaques, transfecter chaque puits, extraire les plasmides de chaque puits, puis les utiliser pour transformer des bactéries (un clone par puits).
Ces différents avantages permettent d'envisager le criblage à grande échelle de molécules pharmacologiques capables d'inhiber le processus de recombinaison non-homologue (molécules anti-NHEJ).
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du substrat de recombinaison non-homologue (NHEJ) et du procédé de criblage objets de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 illustre la stratégie de clonage des sites I-Sce I dans les substrats plasmidiques de recombinaison non-homologue pSH-Del (SEQ ID NO: 1) et pSH-Iv (SEO ID NO: 2) :
- V.^J ^ . W.ύU.^]ïï...? ^^ty.Û..'- un premier oligonucléotide (1LO, SEQ ID NO: 3) contenant de 5' en 3', un premier site N7ze I, un site Xba I, un site I-Sce I (orientation 5'-3') et un second site Nhe I et un deuxième oligonucléotide (1 UP, SEQ ID ΝO : 4) complémentaire du précédent, sont hybrides et clones dans les deux orientation au site NAe I du plasmide pdDΝA6N5-His. Les plasmides obtenus contiennent respectivement un fragment Ii incluant un site I-Sce I en orientation 3'-5' (pSH-Iv) et un fragment I\ incluant un site I-Sce I en orientation 5'-3' (pSH-Del).
- P.ap.Ω?a nférieur.: un fragment de 119 pb a été amplifié par PCR à l'aide des amorces PI (SEQ ID NO: 5) et P2 (SEQ ID NO: 6), puis un fragment de 30 pb contenant les sites Cla I, Sce I et Xba I, obtenu par hybridation des oligonucléotides 2LO (SEQ ID NO: 7) et 2 UP (SEQ ID NO: 8) a été inséré au site Nde I du fragment de 119 pb pour donner le fragment I2. Ce fragment a été clone au site BstE II des plasmides précédents pour donner les plasmides pSH-Iv et pSH-Del contenant 2 sites I-Sce I respectivement en orientation inverse et directe.
- la figure 2 illustre la structure d'un substrat plasmidique de recom- binaison non-homologue (NHEJ) de séquence SEQ ID NO: 1 (pSH-Del) ou SEQ ID
NO: 2 (pSH-Iv), après linéarisation au niveau du site Sca I : ces plasmides dérivent du plasmide pcDNA6/N5-His (IΝVITROGEΝ) portant les gènes de résistance à l'ampi- cilline (ampR) et à la blasticidine (blastiR), par insertion des fragments suivants respectivement au site N7ze I, BamH I, Xho I, BstE H et BstB I du site de clonage multiple situé entre le promoteur hCMN et le signal de polyadénylation du gène BGH : un fragment I-* contenant un site I-Sce I en orientation 5'-3' ou 3'-5', un fragment A contenant la séquence codante de l'antigène H2-Kd de souris (orientation 5'-3') immédiatement suivie du signal de polyadénylation du virus SV40, un fragment B contenant la séquence codante de l'antigène CD8 de souris (orientation 3'-5') immédiatement suivie du signal de polyadénylation du gène tk du viras de l'Herpès simplex, un fragment I2 contenant un site I-Sce I en orientation 5'-3' et un fragment C contenant la séquence codante de l'antigène CD4 de souris (orientation 5'-3'). Les distances entre les fragments sont indiquées en nombre de pb, les grandes flèches en gras indiquent l'orientation des séquences codantes et les petites flèches indiquent la position et l'orientation des amorces 1 et 2 (SΕQ ID ΝO: 7 et SΕQ ID ΝO:8) utilisées pour l'analyse des clones de cellules de mammifère modifiées ayant intégré au moins une copie du substrat de recombinaison.
- la figure 3 illustre la mesure du processus de recombinaison non- homologue (NHΕJ) dans des cellules de mammifères modifiées contenant le substrat de recombinaison non-homologue conforme à l'invention (cellules H2 CD4"CD8") : l'expression des antigènes H2, CD4 et CD8 est analysée par cytométrie de flux ou par ΕLISA, environ 48 h à 72 h après la transfection d'un vecteur d'expression de l'enzyme I-Sce I ; l'efficacité globale de la réparation non-homologue de l'ADN dans des cellules de mammifère est mesurée par le pourcentage de cellules exprimant CD8 ou CD4 (CD4+ + CD8*), et ce pour les deux types de substrats. La fidélité de la recombinaison peut être mesurée par la différence entre la proportion de cellules CD4+ obtenue avec le substrat en orientation directe et celui en orientation inverse. Les flèches verti- cales indiquent la position des sites I-Sce I et les flèches horizontales, l'orientation des séquences codantes des antigènes H2 (5'-3'), CD8 (3'-5') et CD4 (5'-3'), relativement au promoteur hCMN (P) ; les flèches en trait plein représentent les antigènes qui sont exprimés et les flèches en pointillés représentent les antigènes qui ne sont pas expri- mes.
Exemple 1 : Construction de substrats de recombinaison non-homologue selon l'invention (figures 1 et 2) 1) Matériel et méthodes
Les constructions ont été réalisées en utilisant les protocoles classi- ques de préparation, de clonage et d'analyse de l'ADΝ tels que ceux décrits dans Cur- rent Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wïley and son Inc, Library ofCongress, USA).
Le plasmide pcDΝA6N5-HisC (INVITROGEN) qui contient : (i) le promoteur du cytomégaloviras humain (hCMN) lié à un site multiple de clonage, pour l'insertion des séquences d'intérêt, et au signal de polyadénylation de l'hormone de croissance bovine (BGH), (ii) le gène de la résistance à la blasticidine sous le contrôle du promoteur EM-7, pour la sélection de cellules de mammifère modifiées ayant intégré les séquences d'intérêt dans leur génome et (iii) le gène de résistance à l'ampicil- line, pour la sélection des clones recombinants ayant inséré un fragment d'ADN dans le site multiple de clonage du plasmide, a été utilisé pour constraire deux substrats plasmidiques de recombinaison non-homologue dénommés respectivement pSH-Del et pSH-Iv.
Ces plasmides qui contiennent le promoteur hCMN, deux sites I-Sce I en orientation directe (pSH-Del, figure 1) ou inverse (pSH-Iv, figure 1) et les anti- gènes H2Kd, CD8 et CD4 de souris, ont été construits par clonages successifs de 5 fragments (A, I2, I^ B et C dans l'ordre du clonage), respectivement aux sites BamH l, BstE H, Nhe I, Xho I et BstB I du plasmide pcDΝA6/N5-HisC (figure 2).
De manière plus précise, les 5 fragments ont été obtenus de la façon suivante: - fragment
Ce fragment Nhe I d'environ 50 pb de séquence non-codante, contenant un site I-Sce I entre les positions 7 et 24 (vecteur pSH-Iv) ou entre les positions 30 et 47 (pSH-Del), a été obtenu par hybridation des oligonucléotides 1LO (SEQ ID NO: 3, figure 1) et 1UP (SEQ ID NO: 4, figure 1).
- fragment A
Ce fragment BamH I d'environ 1,5 kb issu du plasmide pKC-Kd.wt (Lalanne et al., N.A.R., 1983, 11, 1567-1577), contient la séquence codante (positions
26 à 1132 de la séquence Genbank J00402) et un fragment de séquence 3' non-codante de l'antigène H2-Kd, ainsi que les séquence de l'intron de l'antigène t et du signal de polyadénylation du viras SV40.
- fragment B Ce fragment a été obtenu de la façon suivante : (i) le fragment Xba I-
Sal I de 800 pb du plasmide pSMLyt2aMMCL/2 (décrit dans Turner et al. Ce/7, 1990, 60, 755-765, fourni par le Dr. D. Littman), contenant la séquence codante de l'antigène CD8 de souris mutée en positions 691 et 697 (Cys227Ala et Cys229Ala) et (ii) le fragment Sca l-Hind HJ de 570 pb du plasmide pTK-Hygro (Genbank U02428, fourni par CLONTECH), contenant 60 pb de séquence 3' et le signal de polyadénylation du gène de la thymidine kinase (TkpA), ont été insérés successivement entre les sites Xba I et Xho I et les sites BamH I et Hind m du plasmide pcDNA3 (INVITROGEN), puis le fragment BamH Ï-Hind JR du plasmide ainsi obtenu contenant les séquences CD8 et TkpA, a été réparé par la polymérase de Klenow. De manière alternative, le fragment contenant la séquence codante de l'antigène CD8 (positions 13 à 756 de la séquence Genbank M12825) peut-être amplifié par PCR à partir d'ADNc de lymphocytes T CD8+, à l'aide d'amorces correspondant aux extrémités 5' et 3' de ladite séquence codante.
- fragment I?. Ce fragment BstE H d'environ 150 pb de séquence non-codante issue du gène de résistance à l'hygromycine (positions 3057 à 2938 du plasmide pDR2 de séquence Genbank U02428), contenant un site I-Sce I situé entre les positions 71 et 88, a été obtenu de la façon suivante : un fragment de 119 pb a été amplifié par PCR à l'aide des amorces PI (SEQ ID NO: 5) et P2 (Seq ID NO: 6), puis un fragment de 30 pb contenant les sites Cla I, Sce I et Xba I, obtenu par hybridation des oligonucléotides 2LO (SEQ ID NO: 7, figure 1) et 2 UP (SEQ ID NO: 8, figure 1) a été inséré au site Nde I du fragment de 119 pb. - fragment C
Ce fragment, contenant une partie de la séquence codante (domaines extracellulaire, transmembranaire et un fragment du domaine cytoplasmique) et de la séquence 3' non-codante de l'antigène CD4, a été obtenu par digestion du plasmide pMN7L3T4-Tl (décrit dans Turaer et al., précité, et fourni par le Dr. D. Littman) par EcoR I et Hind JH, puis réparation, par la polymérase de Klenow, du fragment de 1500 pb ainsi obtenu ; de manière alternative, ledit fragment peut-être amplifié par PCR à partir d'ADΝc de lymphocytes T CD4+, à l'aide d'amorces correspondant aux extrémités 5' et 3' de la séquence codante de l'antigène CD4 (positions 170 et 1439 de la séquence Genbank X04836).
Les fragments obtenus ont été insérés successivement aux sites de clonage suivants du plasmide pcDΝA6N5-HisC (figures 1 et 2):
- le fragment A a été clone en orientation 5'-3', au site BamH I (figure 2), - le fragment I2 a été en orientation 5 '-3', au site BstE II (figure 1),
- le fragment Ii a été clone dans les 2 orientations (orientation 5'-3' pour pSH-Del et orientation 3'-5' pour pSh-Iv), au site Nhe I (figure 1),
- le fragment B a été clone en orientation 3 '-5 'au site Xho I, préalablement réparé par la polymérase de Klenow (figure 2) et - le fragment C a été clone en orientation 5 '-3' au site BstB I, préalablement réparé par la polymérase de Klenow (figure 2).
Les plasmides obtenus, contenant deux sites I-Sce I en orientation directe ou en orientation inverse, sont dénommés respectivement pSH-Del et pSH-Iv. 2) Résultats La figure 2 illustre la structure générale des substrat plasmidiques pSH-Del et pSH-Iv présentant respectivement les séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2, après linéarisation au niveau du site Sca I.
Ces substrats, dérivés du vecteur pcDNA6/N5-HisC, comprennent successivement : - le promoteur hCMN (issu du vecteur pcDΝA6/N5-HisC), - un site I-Sce I, en orientation 5'-3' ou 3'-5', dans une séquence non- codante d'environ 150 pb, et situé environ 75 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMN,
- la séquence de l'antigène H2Kd liée au signal de polyadénylation de SN40 (en orientation 5 '-3') ; l'ATG et le codon stop étant situés environ 200 pb et
1290 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMN,
- la séquence de l'antigène CD8 liée au signal de polyadénylation du gène tk (en orientation 3'-5') ; l'ATG et le codon stop étant situés environ 3170 pb et 2380 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMN, - un site I-Sce I, en orientation 5'-3', dans une séquence non-codante d'environ 150pb, et situé environ 3190 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMN,
- la séquence de l'antigène CD4 (en orientation 5'-3') liée au signal de polyadénylation du gène BGH (issue du vecteur pcDΝA6N5-HisC) ; l'ATG et le codon stop étant situés environ 3490 pb et 4865 pb en aval de la fin de la séquence du promoteur hCMN,
- et tous les autres éléments constitutifs du vecteur pcDΝA6 situés en amont du promoteur hCMN et en aval du signal de polyadénylation du gène BGH, notamment le gène de résistance à la blasticidine permettant de sélectionner des cellules eucaryotes ayant intégré une copie du substrat de recombinaison.
La carte du plasmide pSH-Del (SEQ ID NO: 1) est présentée dans le Tableau ci-dessous ; les séquences en italique correspondent à celles du plasmide pcDNA6 et les séquences en gras à celles qui ont été insérées, les positions des amorces utiles pour la PCR sont également indiquées et les amorces permettant la détection des événements de recombinaison non-homologue sont soulignées. Tableau I: carte du plasmide pSH-Del
Figure imgf000024_0001
Exemple 2: Construction d'une lignée de cellules de mammifère modifiée par intégration d'une copie du substrat selon l'invention 1) Matériels et méthodes a) Sélection de clones stables Les cellules de hamster (lignée CHO-K1, ATCC n°CCL-61) sont cultivées dans du milieu DMEM (GIBCO) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (GIBCO), à 37° C , en présence de 5 % CO2.
106 cellules ont été électroporées (1000 N, 25μF) avec 0,lμg des plasmides substrats tels que décrits à l'exemple 1 préalablement linéarisés au niveau du site Sca I. Les cellules ont été ensuite ensemencées dans des boîtes de Pétri (100 mm de diamètre) contenant 10 ml de milieu DMEM tel que défini ci-dessus.
48 h après l'électroporation, de la blasticidine a été ajoutée dans le milieu de culture (5 μg/ml), et les clones résistants ont été prélevées après 10 jours de culture en milieu sélectif. b) analyse des clones t>ι) analyse des. tijâènes exprimés
La présence de l'antigène H2-K et l'absence d'antigène CD4 sont analysées par cytométrie de flux (FACS), pour chaque clone sélectionné.
De manière plus précise, les cellules sont décollées en présence de PBS contenant 50 mM d'EDTA, rincées avec du PBS, puis incubées simultanément avec un anticorps anti-H2-Kd couplée à la phycoérythrine (clone SF1.1, BD
PHARMIΝGEΝ) et un anticorps anti-CD4 couplé à l'isothiocyanate de fluorescéine
(RM-5, BD PHARMIΝGEΝ), en suivant les recommandations du fournisseur.
Les cellules sont analysées en cytométrie de flux et les clones exprimant l'antigène H2-Kd mais pas l'antigène CD4 et l'antigène CD8 (clones H2+CD4"CD8") sont conservés. b ) analyse de l'A ^.^én rni ue
L'ADΝ génomique de chaque clone est extrait par les techniques classiques, selon les protocoles décrits dans Current Protocols in Molecular Biology, précité.
La présence d'au moins une copie complète d'un substrat dans le génome des clones est analysée par PCR à l'aide d'une amorce sens complémentaire du gène de l'ampicilline (amorce 2 de séquence SEQ ID NO: 9 correspondant aux positions 9341-9345 de pSH-Del, figure 2) et d'une amorce anti-sens complémentaire du promoteur CMN (amorce 1 de séquence SEQ ID ΝO: 10 correspondant aux positions 871-848 de pSH-Del, figure 1). Les résultats sont confirmés en Southern blot, à l'aide d'une sonde marquée correspondant au gène de la blasticidine.
2) Résultats
Des clones stables exprimant l'antigène H2-Kd mais pas l'antigène
CD4 et l'antigène CD8 (clones H2+CD4" CD8") ont été isolés après transfection de pSH-Iv (11 clones) et pSH-Del (8 clones). Parmi ces clones, 5 au moins contiennent une copie unique du substrat intégrée dans leur génome.
Exemple 3 : Criblage de molécules modulant la recombinaison non-homologue
(ΝHE J) selon le procédé de l'invention (figure 3).
1) Matériels et méthodes a) Traitement des cellules de mammifère modifiées selon l'invention par la molécule à tester.
Des cellules de mammifère modifiées obtenues à l'exemple 2 (105 à
106 cellules H2+CD4"CD8") sont cultivées en milieu DMEM contenant 10 % de sérum de veau foetal et 5 μg/ml de blasticidine, puis la molécule à tester est ajoutée dans le milieu de culture. b) Induction de la cassure double brin par l'enzyme I-Sce I
L'enzyme I-Sce I est introduite dans les cellules préalablement traitées par la molécule tester, à l'aide d'un vecteur d'expression plasmidique tel que décrit dans Rouet et al., P.Ν.A.S., 1994, 91, 6064-6068 ou d'un vecteur rétroviral dérivé du plasmide pTRIPdelta, décrit dans Zennou et al., Cell, 2000, 101, 173-185, selon les protocoles classiques connus de l'Homme du métier. De préférence, les cellules sont infectées par le vecteur rétroviral qui permet de réaliser une coupure double-brin dans 100 % des cellules. c) analyse de l'expression des différents antigènes 1. Méthode A
3 jours après l'introduction du vecteur d'expression dans les cellules modifiées traitées par la molécule à tester, les cellules sont décollées en présence de PBS contenant 50 mM d'EDTA, rincées avec du PBS, puis l'expression des différents antigènes est analysée par l'une des techniques suivantes : fluorométrie ou ELISA. Ci) fluorométrie. (cytométrie de flux ou microscopie de fluorescence)
Les cellules sont incubées simultanément avec un anticorps anti- H2Kd (clone SF1.1, BD PHARMINGEN) puis un anticorps secondaire (anticorps d'âne anti-IgG de souris) couplé à la cyanine (715-176-150, JACKSON, INTERCHIM), un anticorps anti-CD4 couplé à l'isothiocyanate de fluorescéine (RM- 4-5, BD PHARMINGEN) et un anticorps anti-CD8 couplé à la phycoérythrine (53- 6.7, PHARMINGEN), en suivant les recommandations du fournisseur. Le pourcentage de cellules exprimant H2, CD8, CD4 ou bien aucun de ces antigènes est analysé en cytométrie de flux ou par comptage des cellules observées en microscopie de fluorescence. c2) ELISA
Les cellules sont incubées dans des plaques à 96 puits recouvertes d'anticorps anti-CD4 ou anti-CD8 polyclonal de lapin puis lysées en présence d'un tampon approprié. Les plaques sont lavées, puis les complexes antigène-anticorps formés sont révélées en présence d'un anticorps monoclonal de rat couplé à la phosphatase alcaline ou fluorescent.
Le pourcentage de cellules exprimant CD8 ou CD4 est analysé à l'aide d'un lecteur ELISA.
2. Méthode B
En variante, les cellules sont rincées dans du PBS sans Ca++ Mg""" et incubées avec un tampon PBS/EDTA 50 mM pendant 5 minutes. Avant décollement des cellules, le PBS/EDTA est aspiré et les cellules sont reprises dans du PBS sans Ca"1""1" Mg++. Après centrifugation 5 minutes à 1500 rpm, les cellules sont fixées à la paraformaldéhyde (PAF) 4% pendant 20 minutes. Les cellules sont ensuite lavées au PBS, puis 106 cellules sont incubées avec 0,5 μg d'anticorps dans 30 μl de PBS/BSA 0.5 % pendant 45 minutes sous agitation régulière. Les cellules sont d'abord incubées avec l'anticorps primaire monoclonal anti-souris H-2Kd (Pharmingen, clone SF-1.1), puis avec l'anticorps secondaire anti souris conjugué Cy™5 (Jackson Immunore- search). Les marquages par les anticorps monoclonaux anti-souris CD4 conjugué FITC (Pharmingen, clone RM4-5) et anti-souris CD8 conjugué PE (Pharmingen, clone 53-6.7) sont faits lors d'une seule et unique incubation. Chaque incubation est suivie d'un lavage au PBS/BSA, et d'une centrifugation 5 minutes à 1500 rpm.
Après le marquage CD4-FITC/CD8-PE, les cellules sont reprises dans 500 μl de PBS/PAF 0,1 % et analysées au FACS. Cet appareil analyse la présence ou l'absence de la fluorescence correspondant à un fluorochrome donné, discriminant ainsi les populations exprimant un antigène (+) de celles qui ne l'expriment pas (-). L'analyse des résultats est effectuée par le logiciel Cell Quest
(Becton Dickinson) qui permet de déterminer les pourcentages de cellules H2Kd" ou +,
CD4" ou +, et CD8" ou +. Ce logiciel permet par ailleurs de déterminer les pourcentages de cellules présentant simultanément deux ou trois de ces caractéristiques (H2Kd"
CD4+, H2Kd" CD8+, CD4+ CD8+, H2Kd" CD4" CD8", etc...) par analyse une à une des cellules de la population totale. d) mesure de la recombinaison non-homologue (NHEJ) dans les cellules traitées ou non traitées L'efficacité globale de la réparation non-homologue de l'ADN dans des cellules de mammifère est mesurée par le pourcentage de cellules exprimant CD8 ou CD4 (CD4+ / CD8+), et ce pour les deux types de substrats.
La fidélité de la recombinaison peut être mesurée par la différence entre les pourcentages de cellules CD4 obtenus avec les substrats en orientation directe (pSH-Del) et inverse (pSH-Iv).
La comparaison des valeurs obtenues dans les cellules traitées ou non traitées permet de déterminer si la molécule à tester module l'efficacité et/ou la fidélité de la recombinaison non-homologue de type NHEJ.
2) Résultats Des clones stables exprimant l'antigène H2-K mais pas l'antigène
CD4 et l'antigène CD8 (clones H2+CD4" CD8") isolés après transfection de pSH-Iv et pSH-Del ont été transfectés de façon transitoire par un plasmide d'expression de l'enzyme I-Sce I (efficacité de 20 %). A différents temps après la transfection, les pourcentages de cellules exprimant les antigènes CD4 et CD8 dans la population cellulaire totale ont été déterminés par analyse en cytométrie de flux. Les résultats obtenus avec les substrats chromosomiques de recombinaison contenant deux sites I- Sce I, respectivement en orientation directe (pSH-Del) et inverse (pSH-Iv), sont présentés dans les Tableaux II et m ci-dessous.
Tableau H
Figure imgf000029_0001
Dans les conditions de transfection utilisées (efficacité de 20 %), on observe la présence de cellules CD4+ résultant de la réparation de l'ADN par délétion mais pas de cellules CD8+ résultant de la réparation de l'ADN par inversion. On observe également une augmentation croissante avec le temps, des cellules H2"CD4" CD8" résultant d'un remaniement important de l'ADN. En particulier, le triple marquage simultané, selon la méthode B exposée ci-dessus montre encore plus rapidement que la majorité des événements de réparation est fortement mutagène puisqu'elle aboutit à la disparition simultanée des trois marqueurs. On observe en effet 90 % de cellules H2" CD4" CD8". La détection simultanée de H2, CD4 et CD8 avec un triple marquage d'anticorps dans le même tube ou le même puits présente les deux avantages suivants : elle permet de mesurer les événements (CD4+ ou CD8"1") dans les cellules H2", c'est-à-dire dans des cellules dont on est sur qu'elles ont reçu l'enzyme I-
Scel et que celle-ci a clivé. Cela constitue donc un marqueur interne de la coupure. En effet d'une part l'efficacité de transfection par le plasmide codant pour l'enzyme n'est pas toujours la même, et la reproducibilité de l'efficacité de coupure par l'enzyme est un paramètre non maîtrisé. Ne s'intéresser qu'aux cellules H2" affranchit des problèmes potentiels de différences d'efficacité de transfection et/ou de coupure par I- Scel.
Dans le cadre du criblage, elle permet de mesurer tous les événements dans un même tube ce qui facilite, l'automatisation et le criblage à grande échelle.
L'utilisation simultanée des deux substrats permet à la fois de mesurer l'efficacité globale de la recombinaison non-homologue par le pourcentage de CD4+ obtenu avec pSH-Del, et la fidélité de cette recombinaison par comparaison avec les pourcentages de CD4+ obtenus avec pSH-Iv qui mesure la réparation néces- sairement infidèle de l'ADN.
Ces résultats démontrent que les substrats pSH-Del et pSH-Iv permettent de mesurer l'efficacité et la fidélité de la recombmaison non-homologue dans des cellules de mammifère. Exemple 4 : Mesure de la recombmaison non-homologue (NHEJ) dans un mutant défectif pour KU80.
La voie principale de NHEJ est contrôlée par l'hétérodimère KU80/KU70, la sous-unité catalytique DNA-PKcs et la ligase 4 avec son co-facteur XRCC4. Une mutation dans l'un de ces gènes rend les cellules radiosensibles. Cette voie métabolique et ses protéines sont les cibles principales pour cribler des molécules anti-NHEJ. La littérature suggère cependant que cette voie n'est pas la seule et plusieurs travaux chez d'autres organismes et dans des contextes extrachromosomiques suggèrent qu'il existe un mécanisme parallèle de NHEJ.
Afin d'analyser l'impact de l'inactivation de cette voie classique de NHEJ sur la réparation des cassures double brin dans des cellules de mammifères et dans un contexte intrachromosomique, le substrat selon l'invention a été intégré dans des conditions similaires à celles de l'Exemple 2 dans une lignée cellulaire mutante pour KU80, la lignée xrs6 (ECACC 96012301), et montrant une radio-sensibilité accrue. Les résultats obtenus montrent une bonne efficacité de réparation des coupures induites par I-Scel (similaire à celle obtenue chez les cellules témoins), mais cette réparation est très peu fidèle et de très nombreux remaniements sont mesurés.
Figure imgf000031_0001
Ces résultats montrent que l'inhibition de la voie KU (voie principale de NHEJ) peut être contrebalancée par un système alternatif efficace mais qui génère 5 de nombreux remaniements génétiques.
Dans un cadre thérapeutique, inhiber la voie KU peut effectivement radio-sensibiliser mais risque d'activer une voie alternative de réparation qui génère des remaniements génétiques aux conséquences souvent délétères (par exemple tumo- rigenèse). Le crible de molécules anti-NHEJ doit donc être évalué sur la voie princi- 0 pale DNA-PK mais aussi sur la voie alternative mise en évidence par les expériences effectuées avec le substrat selon l'invention. Il faut donc être capable de mesurer l'efficacité de cette voie alternative. Le substrat selon l'invention en est capable, en particulier dans la lignée cellulaire xrs6 (défective pour KU) dans laquelle la voie DNA-PK est inactive, mais la voie alternative imitatrice est très efficace. 5 Exemple 5 : Mesure de la recombmaison non-homologue (NHEJ) dans des lignées surexprimant l'oncogène anti-apoptotique Bcl-2.
A la suite de stress génotoxique, la cellule peut réparer son ADN ou induire la mort cellulaire programmée (apoptose), évitant ainsi la prolifération de cellules porteuses d'altérations génétiques. L'oncogène Bcl-2 inhibe l'induction de 0 l'apoptose et permet donc la prolifération de cellules tumorales. De nombreuses stratégies thérapeutiques proposent d'inhiber Bcl-2 et/ou de stimuler l'apoptose. L'utilisation du substrat selon l'invention a permis de montrer qu'en plus de son rôle anti-apoptotique, Bcl-2 stimule la réparation par NHEJ. Les stratégies anti-tumorales axées sur Bcl-2 doivent prendre en compte ce paramètre (mesurable avec le substrat 5 selon l'invention) afin d'évaluer l'impact d'une molécule potentiellement anti-Bcl-2 sur l'efficacité mais aussi la qualité de réparation.
De manière plus précise, un vecteur codant pour Bcl-2 tel que celui décrit dans HUANG D.C. et al. (EMBO J., 1997, 16, 15, 4528-4638) a été introduit dans les cellules possédant le substrat NHEJ, obtenues comme décrit à l'Exemple 2. Les clones exprimant Bcl-2 sont sélectionnés sur un milieu contenant de la puromycine. La surexpression de Bcl-2 dans ces cellules permet d'augmenter d'un facteur 2 la fréquence d'apparition des CD4+ et des CD8+, et donc l'efficacité de réparation des cassures double chaîne par NHEJ. Cette stimulation du NHEJ par la surexpression de Bcl-2 ne s'accompagne pas d'un effet sur la fidélité de la réparation. En effet aucune différence significative n'est observée suite au séquençage des cicatrices de réparation.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Molécule d'ADN double-brin hybride isolée, destinée à être utilisée comme substrat de recombinaison non-homologue, caractérisée en ce qu'elle comprend : - un seul promoteur unidirectionnel et au moins deux gènes rapporteurs différents, respectivement A et C dans le sens de la transcription ; le seul gène sous le contrôle dudit promoteur étant le gène rapporteur A, et
- deux sites de coupure double-brin dirigée identiques, le premier site de coupure étant situé entre le promoteur et le gène rapporteur A et le second site de coupure étant situé en amont du gène rapporteur C ou dans celui-ci.
2°) Molécule d'ADN double-brin selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend également un troisième gène rapporteur B situé entre le gène rapporteur A et le second site de coupure double-brin dirigée, lequel gène rapporteur B est inversé par rapport au sens de la transcription dudit promoteur. 3)° Molécule d'ADN double brin selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que lesdits sites de coupure double-brin dirigée sont dans la même orientation.
4)° Molécule d'ADN double brin selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que lesdits sites de coupure double-brin dirigée sont en orientation opposée.
5°) Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 , caractérisée en ce que le second site de coupure double-brin dirigée est situé entre les gènes rapporteurs B et C.
6°) Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des reven- dications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdits sites de coupure double-brin dirigée sont des sites de coupure d'une enzyme de restriction sélectionnée dans le groupe constitué par les enzymes de restriction à site rare et les méganucléases.
7°) Molécule d'ADN double-brin selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite enzyme de restriction à site rare possède un site asymétrique. 8°) Molécule d'ADN double-brin selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite méganucléase est I-Sce I. 9°) Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend également une cassette d'expression d'un marqueur de sélection.
10°) Molécule d'ADN double-brin selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, caractérisée en ce que lesdits gènes rapporteurs A, B, C sont sélectionnés dans le groupe constitué par les antigènes H2, CD4 et CD8.
11°) Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN double brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12°) Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les plasmides, les vecteurs viraux intégratifs tels que l'AAN, les retroviras et les lentiviras, et les vecteurs de recombinaison homologue.
13°) Necteur selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID ΝO : 1 et SEQ ID ΝO: 2.
14°) Cellule modifiée par une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou un vecteur selon l'une quelconque des revendications 11 à 13.
15°) Cellule selon la revendication 14, modifiée par intégration génomique d'une copie de ladite molécule d'ADN double-brin.
16°) Cellule de mammifère modifiée selon la revendication 14 ou la revendication 15.
17°) Mammifère non-humain recombinant, comprenant une molécule d'ADN double brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 18°) Cellule modifiée selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 ou mammifère non-humain recombinant selon la revendication 17, caractérisés en ce qu'ils comprennent également une cassette d'expression d'une enzyme de restriction telle que définie à l'une quelconque des revendications 6 à 8.
19°) Cellule modifiée selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, ou mammifère non-humain recombinant selon la revendication 17, caractérisés en ce qu'ils comprennent en outre la séquence de Bcl-2. 20°) Méthode de mesure du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : ai) la culture de cellules de mammifère modifiées par au moins une molécule d'ADN double-brin hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; lesdites cellules étant avantageusement modifiées conformément aux revendications 14 à 16, 18 et 19, bi) la coupure de l'ADN desdites cellules, au niveau desdits sites de coupure double-brin de ladite ou desdites molécule(s) d'ADN double-brin hybride(s), par un moyen approprié, ci) l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A, C et éventuellement B dans lesdites cellules par un moyen approprié, et di) la mesure de l'efficacité et de la fidélité de la réparation de l'ADN dans lesdites cellules par détermination de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C et éventuellement le gène rapporteur B.
21°) Méthode de criblage de modulateurs du processus de recombinaison non-homologue (NHEJ) dans des cellules de mammifère, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les étapes suivantes : a2) la culture de cellules de mammifère modifiées par au moins une molécule d'ADN double-brin hybride selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; lesdites cellules étant avantageusement modifiées conformément aux revendications 14 à 16, 18 et 19, b2) le traitement des cellules par au moins une substance à tester, c ) la coupure de l'ADN desdites cellules, au niveau desdits sites de coupure double-brin de ladite ou desdites molécule(s) d'ADN double-brin hybride(s), par un moyen approprié, d2) l'analyse de l'expression des gènes rapporteurs A, C et éventuellement B dans lesdites cellules traitées ou non-traitées, par un moyen approprié, et e2) la mesure de l'activité de ladite substance sur l'efficacité et la fidélité de la réparation de l'ADN par comparaison, entre les cellules traitées et non- traitées, de la proportion de cellules exprimant le gène rapporteur C et éventuellement le gène rapporteur B. 22°) Méthode selon la revendication 20 ou la revendication 21, caractérisée en ce que ladite coupure double-brin dirigée de l'ADN à l'étape bi ou c est réalisée par une enzyme de restriction telle que définie à l'une quelconque des revendications 6 à 8. 23°) Méthode selon la revendication 20 ou la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en œuvre, en parallèle, de deux types de cellules modifiées comprenant une molécule d'ADN double-brin hybride incluant deux gènes rapporteurs A et C et deux sites de coupure double-brin dirigée, respectivement en orientation directe et inverse. 24°) Méthode selon la revendication 20 ou la revendication 21, caractérisée en ce que les dites cellules modifiées à l'étape ai ou a2 comprennent une molécule d'ADN double-brin hybride incluant trois gènes rapporteurs A, B et C et deux sites de coupure double-brin dirigée en orientation directe ou inverse.
25°) Kit de mesure du processus de recombinaison non-homologue dans des cellules de mammifère, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une molécule d'ADN double brin selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ou des cellules de mammifère modifiées selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, 18 et 19.
26°) Utilisation du procédé selon la revendication 21, pour le cri- blage de médicaments anti-cancéreux ou anti-rétroviraux.
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