WO2003087019A1

WO2003087019A1 - Hyaluronic acid modification product

Info

Publication number: WO2003087019A1
Application number: PCT/JP2003/004949
Authority: WO
Inventors: Tsuyoshi Shimoboji
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-04-18
Filing date: 2003-04-18
Publication date: 2003-10-23
Anticipated expiration: 2004-10-18
Also published as: US7456275B2; EP1496037A1; TW200307011A; EP1496037B1; AU2003235248A1; JPWO2003087019A1; JP5155513B2; US20050164980A1; EP1496037A4

Description

明細書

ヒアルロン酸修飾物技術分野

本発明は、新規なヒアル口ン酸修飾物、それを主成分とする関節疾患の処置製剤、及びそれを用いた関節疾患の処置方法に関する。また、本発明は、そのヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術用補助剤又は処置剤、及びそれを用いた外科手術方法にも関する。さらに、本発明は、そのヒアルロン酸修飾物を主成分とする組織修復剤、及びそれを用いた組織修復方法にも関する。背景技術

これまでの約 4 0年間、多くの関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症等の関節疾患処置方法が提案されてきた。現在、自家細胞移植による関節軟骨再生法も試みられているが、数度の手術を必要とし、簡便さに欠け、患者の負担が大きい。人工関節を用いる場合においては、生体適合性や耐久性の問題がある。これらの問題を解決する薬物による治療方法が長らく望まれている。

こうした状況の中、現在、医療の現場において、ヒアルロン酸を関節腔内に直接注入する治療法が広く用いられている (例えば、ァルツ（商品名）、製造生化学工業株式会社、販売科研製薬株式会社）。ヒアルロン酸は関節液の主成分の 1つであり、その粘弾性効果や炎症抑制効果により関節において鎮痛効果を発揮する。一般に、変形性関節症、慢性関節リウマチ等の関節症患者の関節液中において、ヒアルロン酸濃度、分子量が正常関節液に対し低下していることが知られており、このことが関節液の潤滑作用、ショックァブソーバー作用の低下に起因する疼痛症状の発生につながると考えられている。唯、ヒアルロン酸の関節腔内からのクリアランスは早く、その滞留時間を延長する目的で高分子量（1 9 0 万ダルトン程度）のヒアルロン酸を用いる事も試みられている（スべニール（商品名）：製造アベンテイスファーマ株式会社、販売中外製薬株式会社）力高分子量であるが故に低温流通が必要であり、また高粘度であるため注入圧が高くなる傾向がある。関節腔内における貯留は、 5日間程度（薬理と治療、 2 2 ( S-3) 、 S 779 (1994) ) 、鎮痛効果の持続も 1週間程度であり、患者のコンプライアンス低減のためにも更なる効果の持続が求められている。

一方、部分的に化学的な架橋を架ける事で滞留時間を延長することも試みられている (例えば、 S y n V i s k (商品名) 、 Ge n z yme B i o s u r g e r y社（日本公開特許公報特開平 4 _ 261664号（米国特許第 5399 351号、欧州特許第 466300号）； Re s t y l a n e (商品名）、 Q— MEDifc (D e rma t o l o g i c S u r g e r y, 24, 1 31 7— 1325 (1998) ) 等）力 S、架橋剤による炎症誘発等の問題が懸念される。また、ヒアル口ン酸間の水素結合等による物理架橋を利用したゲル素材の報告も有るが（国際公開公報 WO00Z27405号）、水溶液にすると架橋の崩壌が始まるため、現在用いられているヒアルロン酸製剤のような取り扱いやすい液剤（注射剤）での流通は難しい。

一方、温度応答性高分子として、ポリ N置換アクリルアミド誘導体、ポリ N置換メタアクリルアミド誘導体、ポリビュルメチルエーテル、ポリビュルアルコール部分酸化物等が知られている。生体に安全性の高い温度応答性高分子としては、医薬品に用いる素材として米国食品医薬品局（FDA) に認可されているポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドブロックポリマー（PEO— PPO—PEO：商品名 P 1 u r o 11 i c) が知られている（認可グレードは F 68及ぴ F 1 27) 。また、その類似のポリマーとしてポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサィドブロックポリマー（PPO—PEO— PPO：商品名 P 1 u r o n i c R ) が知られている。これらポリマー単独でも温度を上昇させることで粘度上昇、ゲル化することが報告されている（Ad v. D r u g. De l i v e r y Re v. , 31, 197— 221 (1 998) ) 力 S、そのためには 16 %w /v以上という高濃度が必要であり、安全性、薬物担持率の上で不利である。また、疎水部に p p oの代わりにポリ乳酸 Zポリグリコ一ル酸共重合体を用いた、ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸 Zポリグリコール酸共重合体一ポリェチレンオキサイドブロックポリマー（P E〇一 P LGA— P EO：商品名 Re g e 1 ) 又はポリ乳酸 Zポリグリコール酸共重合体ーポリエチレンォキサイドーポリ乳酸ノポリグリコール酸共重合体プロックポリマー（PLGA— PEO— PL GA：商品名 R e g e 1 ) 、或いは、疎水部に P P Oの代わりにポリ乳酸重合体を用いた、ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドプロックポリマー（PEO— PLA— PEO) 又はポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸ブロックポリマー（PLA— PEO— PLA) も同様の温度応答性機能を持つことが知られている（国際公開公報 WO 99ダ1 8142号）。また、このような温度応答性高分子と親水性高分子を組み合わせた、一般的な熱可逆性ハイド口ゲル材料の報告も有る（日本公開特許公報特開平 5— 262 882号、特開平 9一 227329号、特開平 1 1一 169703号、国際公開公報 WO 95Z15152号）力 S、ヒアルロン酸と PEO— PPO_PEO、 PPO— PEO— PPO、 P EO— P LGA— P EO、 PLGA— PEO— PL GA、 P E〇一 P LA— PEO又は P LA— PEO— P LAを組み合わせた例は示されておらず、更にこれらは外用剤 ·香粧品等を目的としたもので、関節腔内等の体内への注入を目的としたものでもない。ポリアクリル酸と PEO— P PO 一 PEOをグラフトした温度応答性高分子（国際公開公報 WO 97/2443 0号（米国特許第 57098 15号）、ヒアルロン酸にポリ N—イソプロピルァクリルアミドをグラフトした高分子（B i oma c r omo l . , 2, 85 6-863 (2001) ) も報告されているが、ポリアクリル酸、ポリ N—イソプロピルアクリルアミドは、変異原性のあるモノマーの残存等、安全性に問題がある。また、ヒアルロン酸と P 1 u r o n i cを結合させた素材（ J o u r n a 1 o f C o n t r o l l e d Re l e a s e, Vo l . 80， I s s u e s l— 3， p 69 - 77 (2002年 4月 23日））についても報告されているが、その素材自身の医薬用途については開示も示唆もされていない。なおこの文献に記載の素材の分子量は 12600であるため、生体排泄しにくいものであり、医薬用途には不適当である。

上述した如く、室温流通が可能であって粘度が低く注入しやすく、且つ長期に亘つて関節腔内に滞留し鎮痛効果を示すような実用的なヒアルロン酸製剤に適した安全なヒアルロン酸ベースの素材は現在のところ存在していない。

また、ヒアルロン酸製剤は眼科手術の補助剤等の用途（商品名： He a 1 o n ) 、組織修復剤としての用途等も知られているが、室温流通が可能であって粘度が低く注入しやすく、手術中に適度な粘度を有する外科手術用補助剤または処置剤は未だ知られていない。発明の開示

本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、ヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩に、ポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドブロックポリマー、ポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド一ポリ乳酸ポリグリコール酸共重合体一ポリエチレンォキサイドブロックポリマー、ポリ乳酸 Zポリグリコール酸共重合体一ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸 zポリグリコール酸共重合体プロックポリマ一、ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドブロックポリマー及びポリ乳酸ーポリエチレンォキサイドーポリ乳酸プロックポリマーから選択されるプロックポリマーを結合させることにより上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、ヒアルロン酸及び Z又はその薬学的に許容される塩と、ポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドブロックポリマー、ポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドブロックポリマー、ポリエチレンオキサイド一ポリ乳酸/ ポリグリコ一ル酸共重合体ーポリエチレンォキサイドプロックポリマー、ポリ乳酸 /ポリグリコール酸共重合体ーポリエチレンォキサイドーポリ乳酸/ポリグリコール酸共重合体ブロックポリマー、ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドブロックポリマー及びボリ乳酸一ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸ブロックポリマーから選択されるブロックポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物に関する。

また、本発明は、前記ブロックポリマーが、ポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドブロックポリマー又はポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドブロックポリマーである前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。

また、本発明は前記ブロックポリマーの大部分が、その片末端のみでヒアルロン酸及び Z又はその薬学的に許容される塩に結合している前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。

また、本発明は、前記ブロックポリマーが、その片末端のみでヒアルロン酸及び Z又はその薬学的に許容される塩に結合している前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。

また、本発明は、前記ブロックポリマーが、ヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩のカルボキシル基に結合している前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。

また、本発明は、生理食塩水中及び/又はリン酸生理食塩水中における前記ヒアル口ン酸修飾物の相転移温度が、前記ヒアルロン酸修飾物 1 0 . 0 % w V以下の濃度で、 2 0 °C以上 3 5 °C以下であることを特徴とする前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。

また、本発明は、前記プロックポリマーの重量平均分子量が 1 2 0 0ダルトン以上であることあることを特徴とする前記ヒアル口ン酸修飾物にも関する。また、本発明は、前記ブロックポリマーの、ヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩への導入率が、ヒアルロン酸及び Z又はその薬学的に許容される塩中のダルク口ン酸当たり 8モル％以上であることあることを特徴とする前記ヒアル口ン酸修飾物にも関する。

また、本発明は、前記ヒアルロン酸及ぴ Z又はその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が 1 5 0万ダルトン以下であることを特徴とする前記ヒアルロン酸修飾物にも関する。

さらに、本発明は、ヒアルロン酸修飾物を主成分とする医薬組成物にも関するまた、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする関節疾患の処置製剤にも関する。

また、本発明は、前記の関節疾患が関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症又は肩関節周囲炎である、前記ヒアル口ン酸修飾物を主成分とする関節疾患の処置製剤にも関する。

また、本発明は、注射用製剤である前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする関節疾患処置製剤にも関する。

また、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物の有効量を患者に投与することからなる、関節疾患の処置方法にも関する。

さらに、本発明は、前記の関節疾患が関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症又は肩関節周囲炎である、前記ヒアルロン酸修飾物の有効量を患者に投与することからなる、関節疾患の処置方法にも関する。

更に、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤にも関する。

また、本発明は、前記の外科手術が眼科手術または内視鏡的粘膜切除術である、前記ヒアル口ン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤にも関する。また、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む外科手術方法にも関する。

また、本発明は、前記の外科手術が眼科手術または内視鏡的粘膜切除術である、前記ヒアル口ン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む外科手術方法にも関する。

さらに、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物を主成分とする組織修復剤にも関する。

また、本発明は、柔組織の損傷、外科手術後の萎縮性不整、モース（Mohs' )化学外科損傷、しわ、又はしわの裂傷傷跡を修復することに用いられる、前記ヒアル口ン酸修飾物を主成分とする組織修復剤にも関する。

さらに、本発明は、前記ヒアルロン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む組織修復方法にも関する。

また、本発明は、柔組織の損傷、外科手術後の萎縮性不整、モース（Mohs' )ィ匕学外科損傷、しわ、又はしわの裂傷傷跡を修復する、前記ヒアルロン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む糸且織修復方法にも関する。図面の簡単な説明図 1は、実施例 1—1で得られた本発明ヒアル口ン酸修飾物のプロトン NMR チヤ一トである。

図 2は、実施例 1一 2で得られた本発明ヒアル口ン酸修飾物のプロトン NMR チヤ一トである。

図 3は、実施例 2—1で得られた本発明ヒアル口ン酸修飾物のプロトン NMR チヤ一トである。

図 4は、実施例 2— 2で得られた本発明ヒアル口ン酸修飾物のプロトン NMR チヤ一トである。

図 5は、比較例 1で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトン NMRチヤ一トである。

図 6は、比較例 2で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトン NMRチャートで feる。

図 7は、比較例 3で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトン NMRチヤ一トである。

図 8は、比較例 4で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトン NMRチャートである。

図 9は、比較例 5で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトン NMRチャートである。

図 1 0は、比較例 6で得られたヒアル口ン酸修飾物のプロトン NMRチヤ一トである。

図 1 1は、比較例 7で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトン NMRチヤ一トである。

図 1 2は、比較例 8で得られたヒアルロン酸修飾物のプロトン NMRチヤ一トである。

図 1 3は、試験例 1で得られた実施例 2— 4のヒアル口ン酸修飾物の粘度の温度応答性である。

図 1 4は、試験例 1で得られた実施例 2— 4のヒアル口ン酸修飾物投与後の関節幅の経時変化である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を更に具体的に説明する。

本発明のヒアルロン酸修飾物は、ヒアルロン酸（H Aとも略す）及ぴ Z又はその薬学的に許容される塩と、ポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドブロックポリマー、ポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドプロックポリマー、ポリェチレンォキサイドーポリ乳酸/ポリグリコール酸共重合体一ポリエチレンォキサイドプロックポリマー、ポリ乳酸/ポリグリコ一ル酸共重合体ーポリエチレンォキサイドーポリ乳酸 Zポリグリコ一ル酸共重合体ブロックポリマー、ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドプロックポリマー又はポリ乳酸 —ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸プロックポリマーから選択されるプロックポリマーとが結合したものである。ここで、ヒアルロン酸は、 β—D— N—ァセチルダルコサミンと β— D—グルクロン酸が交互に結合した直鎖状の高分子多糖で、次のような基本構造を有する。

(式中、 ηは、特に限定されないが、例えば、 1 0 0〜 1 0 , 0 0 0の整数である）

本発明のヒアルロン酸修飾物は、生体内（例えば関節腔内等）に注入した際、体温で相転移し、相転移に伴う疎水結合による物理的架橋によつてその粘弾性を急増させる。即ち、本発明のヒアルロン酸修飾物は、相転移温度以下においては、架橋のかかったゲル状態ではなく流動性のあるゾル状態である。

この目的のために、本発明のヒアルロン酸修飾物においては、前記ブロックポリマーの大部分が、その片末端のみでヒアルロン酸及び Ζ又はその薬学的に許容される塩に結合していることが望ましい。尚、ここで「ブロックポリマーの大部分が、その片末端のみでヒアルロン酸及び z又はその薬学的に許容される塩と結合している」とは、通常雰囲気下' 2 0 °C以下の状態において、得られたヒアル口ン酸修飾物の流動性が保たれている（得られたヒアル口ン酸修飾物がゾル状態である）結合状態を指す。更に、原料のヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩と得られたヒアルロン酸修飾物とを比較した際、その粘度に顕著な差が見られない結合状態であることが好ましい。また、前掲の「大部分」とは、前述の結合状態を満足する割合であれば特に限定されないが、具体的には、その片末端のみでヒアルロン酸及ぴノ又はその薬学的に許容される塩と結合しているブ口ックポリマーの量が、結合している全ブロックポリマーの量に対して 7 0 % w /w以上である状態を指し、好ましくは 8 5 %w/w以上である状態を指し、特に好ましくは 9 5 % wZw以上である状態を指す。尚、何れの場合においても、ブロックポリマーの両末端がヒアル口ン酸及び/又はその薬学的に許容される塩に導入されている率は、ヒアルロン酸及びノ又はその薬学的に許容される塩中のダルク口ン酸当たり 5モル％以下であり、好ましくは 3モル⁰ /₀以下であり、特に好ましくは 1モル％以下である。当然のことながら、本発明ヒアルロン酸修飾物は、前記プロックポリマーが、その片末端のみでヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩に結合しているヒアルロン酸修飾物のみで構成されていてもよい。

片末端のみでヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩と結合しているプロックポリマーの量の結合している全ブロックポリマーの量に対する率、並びにプロックポリマーの両末端がヒアルロン酸及び z又はその薬学的に許容される塩に導入されている率を定量する方法としては、プロトン NMRで得られるブロックポリマーの導入量と、ブロックポリマーを結合させる前段階におけるヒドラジド化もしくはァミノ化されたヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩中の、ヒドラジド（H Z ) 基又はアミノ基の実際の減少量との比較から求めることができる。例えばプロックポリマーを結合させる前段階においてヒドラジド化されたヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩を用いる場合、ァジピン酸ジヒドラジドでヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体（HA— H Z ) のプロトン NMRから得られるフリーなヒドラジド基由来のピーク（2 . 2 〜2 . 3 p p m) は、ブロックポリマーの導入率に比例して減少するはずであるから、このピークとヒアルロン酸由来のピーク（2 . 1 p p m) の比を実測する

(X) 。一方で、ブロックポリマーの導入が 1 0 0 %片末端であると仮定して、ブロックポリマー導入率から比例的に計算されるフリーなヒドラジド基由来のピークの、ヒアルロン酸由来のピークに対する比を計算する（Y) 。この実測値の比が理論値の比より小さくなった割合が両末端で結合したブロックポリマーの割合になる。グルクロン酸に対するプロックポリマーの導入率を∑%、 HA - H Z のヒドラジド基導入率を11%とすると、片末端のみでヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩と結合しているブロックポリマーの量の結合してレ、る全ブロックポリマーの量に対する率（％) は、（1— (H— Z ) / Z ( 1 - X/Y ) ) X I 0 0で表される。また同様に両末端がヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩に導入されている率（％) は、グルクロン酸当たり、（H— Z ) X ( 1 - X/Y) で表される。

また、生理食塩水中及ぴ Z又はリン酸生理食塩水中における本発明のヒアルロン酸修飾物の相転移温度が、本発明のヒアルロン酸修飾物 1 0 . 0 %w/ v以下の濃度で、 2 0 °C以上 3 5 °C以下であることが望ましい。尚、ここでいう相転移温度とは、ヒアルロン酸修飾物の粘度の温度変化をコーン一プレート型粘度計等の粘度計で測定した際、粘度の変化がその最大変化量の 1 0 %に達した温度をいう。従ってこの相転移は、本発明の目的に合致する範囲で、所謂ゾルーゲル転移であってもよいし、ゾル状態からより粘度の高いゾル状態への転移であってもよレ、。

本発明に用いられるヒアルロン酸及び Z又はその薬学的に許容される塩は、粘度を注入しやすい程度に抑え、且つ室温流通を可能とするため、重量平均分子量で 1 5 0万ダルトン以下であるものを用いることが好ましい。重量平均分子量の下限値については特に限定されないが、重量平均分子量が下がるに伴い、温度上昇に伴う粘度上昇を達成する為により高いヒアルロン酸濃度が必要となってくるため、 1万ダルトン以上であることが好ましい。ここで、ヒアルロン酸及ぴ Z又はその薬学的に許容される塩の重量平均分子量の測定方法については、光散乱法等、各種の公知の方法を利用することができる。尚、このようなヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、或いは市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社等から）入手することも可能である。

また、ここでヒアルロン酸の薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリゥム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩を挙げることができる。この中で、特に好ましい塩は、医薬品として繁用されているナトリウム塩である。

本発明に用いられるポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドーポリエチレンオキサイドブロックポリマー（PEO— PPO— PEO) 、ポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドプロックポリマー（P PO— PE〇一 P P〇）、ポリエチレンオキサイド一ポリ乳酸 /ポリグリコール酸共重合体一ポリエチレンォキサイドブロックポリマー（PE

O-P LGA-P EO) 、ポリ乳酸/ポリグリコール酸共重合体一ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸 Zポリグリコ一ル酸共重合体ブロックポリマー（ P L G A -P EO-P LGA) 、ポリエチレンオキサイド一ポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドブロックポリマー（PEO— P LA— PEO) 及ぴポリ乳酸ーポリエチレンオキサイド一ポリ乳酸プロックポリマー（P LA— PEO— P LA) から選択されるブロックポリマーは、前述した如く本発明のヒアルロン酸修飾物の相転移温度が 20 °C以上 35 °C以下となるように、 1. 0 % w/ Vの生理食塩水中及ぴ /又は 1. 0%wZvのリン酸生理食塩水中におけるそれらポリマーの低温臨界溶液温度（LCST) を調整したものを用いる。具体的には、 1. 0%wZvの生理食塩水中及び/又は 1. 0 % wZ Vのリン酸生理食塩水中（好ましくは 1. 0%w/vのリン酸生理食塩水中）において、前記ブロックポリマーの LCST が 1 5°C以上 40°C以下であるものを用いればよい。ここでいう LCSTとは、前記の溶液中に溶解させたブロックポリマーの 500 nmにおける吸光度を温度変化させながら測定した際、その吸光度変化が最大変化量の 10%に達した温度をいう。また、上記相転移温度の範囲内で異なる LCSTを持つ複数の前記ブロックポリマーを組み合わせて使用してもよいが、好ましくは 1種のブロックポリマーを使用するのがよい。本発明に用いられるポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドーポリエチレンオキサイドブロックポリマー（P E〇一 P PO— P EO) 、ポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドブロックポリマー（PPO— PEO— PPO) 、ポリエチレンオキサイド一ポリ乳酸 Z ポリグリコ一ル酸共重合体一ポリエチレンオキサイドブロックポリマー（ P E O -P LGA-PEO) 、ポリ乳酸/ポリグリコール酸共重合体—ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸 Zポリグリコ一ル酸共重合体ブロックポリマー（PLGA— PEO-PLGA) 、ポリエチレンオキサイド一ポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドブロックポリマー（PEO—PLA— PEO) 及びポリ乳酸一ポリエチレンオキサイド一ポリ乳酸ブロックポリマー（P LA— PEO— P LA) から選択されるブロックポリマーは、これに限定されるものではないが、一般的には次のような基本構造を有する。

(1) PEO— PPO— PEOトリブロックポリマー

C¾

I

HO-(C¾CH,0)_x-(CH₂CHO)_y-(CH₂CH₂0)_x-H (1)

(2) PPO— PEO— PPOトリブロックポリマ

CH₃ CH₃

HO-(CHCH₂0)_x,-(CH₂CH₂0)_y,-(CH₂CHO)_x,-H (2)

(3) PEO— PLGA— PEOトリブロックポリマー又は P E O— P L A— P EOトリブロックポリマー

O CH₃ O

II I II

HO-(CH₂CH₂0)_p-(C-CH-0)_q-(C-CH2-0-)_r-(CH2CH₂0)_p-H (3) (4) PLGA— PEO— PLGAトリブロックポリマー又は P LA-PEO- P L Aトリブロックポリマー

CH₃0 O O CH₃ O

I II II II I II

H-(0-CH-C)_r(0-CH₂-C)_m-(0-CH₂CH₂)_n.-0-(C-CH-0)₁-(C-CH₂-0)_m-H (4)

PPO— PE〇一 PPOトリブロックポリマー及ぴ P EO— P PO— P EOトリブロックポリマーにおいては、疎水性の P P Oブロックと親水性の P E〇ブロックの比率は、これに限定されないが、例えば、 90〜10%w/w： 10〜9 0%wZwが好ましい。 PEO— PLGA— PEOトリブロックポリマー L GA— PEO— PLGAトリブロックポリマー、 PEO— PLA— PE〇トリブ口ックポリマー及ぴ P LA-P EO-P LAトリプロックポリマーにおいて、疎水性の P LGA又は P LAブロックと親水性の PEOブロックの比率は、これに限定されないが、例えば、 51〜83%w/w： 1 7〜49%w/wが好ましい。また、 PLGA又は PLAブロックにおいて、ラタテート含量は、好ましくは 30〜 100モル⁰ /。、より好ましくは 50〜 100モル⁰ /₀であり、グリコレート含量は、好ましくは 0〜70%、より好ましくは 0〜50%である。

また、本発明のヒアルロン酸修飾物が充分な架橋強度を発現できるためには、前記プロックポリマーの重量平均分子量は 1200ダルトン以上であることが好ましい。さらに、生分解後の体内からの排泄性を考慮すると、ブロックポリマーとして PEO— P P〇一 P EO又は P PO— P EO— P P〇を用いる場合は、その重量平均分子量は 1 200ダノレトン以上 1万ダルトン以下であることがより好ましい。ブロックポリマーとして PEO— P LGA— P EO、 PLGA— PEO 一 P LGA、 P EO— P LA— P EO又は P LA—PEO— P LAを用いる場合は、 PLGA又は PL A自体は生分解性であるので、 PEO成分の重量平均分子量が 1万ダルトン以下であることがより好ましい。尚、ここでいう PE〇一 PL GA— PEO、 P LGA— P E〇一 P LGA、 P E O— P L A— P E O又は P L A— PEO— PL A、或いは PE〇の重量平均分子量とは、ポリエチレンォキサイドを標準物質に用い、ゲ^/パーミエーシヨンクロマトグラフィ（GPC) で測定した際の重量平均分子量をいう。

尚、このような PEO— P PO— PEOは商品名 P 1 u r o n i cとして、また P PO—P EO_P POは商品名 P 1 u r o n i cRとしてそれぞれ市販されており、例えば B A S F武田ビタミン株式会社、旭電化工業株式会社等から入手することが可能である。それらの合成方法は、 C o l l o i d s a n d Su r f a c e s A、 96、 1 -46 (1 995) 等に記載されている。また、 PEO— PLGA—PEO及びPLGA_PEO_PLGAは商品名 R e g e 1として市販されており、例えば Ma c r oMe d社、 A 1 k e r me s社等から入手することが可能である。それらの合成方法は、 J. B i ome d. Ma t . Re s. 、 6 1、 1 88— 196 (2002) 、 WO 99/18142号公報等に記載されている。

ヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩にブロックポリマーを結合させる方法としては特に制限されないが、例えば、ヒドラジド化（国際公開公報 WO 95Z1 51 68号（米国特許第 561 6568号、米国特許第 5652 347号、米国特許第 587441 7号）等）或いはジァミン化合物をカルポジイミド等の力ップリング剤で結合、了ミノ化したヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩と片末端の水酸基を、 4一二トロフエエルクロロフオルメイト化（国際公開公報 WO 95Z24430 (米国特許第 648621 3号））或いはジ一 N—ヒドロキシスクシンイミドからなる架橋剤を DMS〇中でピリジン等の塩基性有機溶媒下で反応させ、 N—ヒドロキシスクシンイミド化した前記ブロックポリマーを反応させる方法、或いは、 4—ニトロフエニノレクロロフオルメイト化した後ジァミン、あるいはジヒドラジドと反応させ、アミノ基あるいはヒドラジド基を片末端に修^ ίした前記プロックポリマーとヒアル口ン酸及ぴ ζ又はその薬学的に許容される塩のカルボキシル基をカルポジィミド等のカツプリング剤を用いて結合させる方法等が挙げられる。なお、参考のために示すと、上記ヒアルロン酸又はその塩とブロックポリマーの片末端の水酸基との結合は、次のスキーム（1) 〜（4) のように模示することができる。但し、これはポリマー同士の反応を説明のために単に摸示したに過ぎず、本発明の結合方法はこれに何ら制限されるものではない。例えば、下記スキーム中、ヒアルロン酸を、 HA— COOHとして示したが、ヒアルロン酸中のカルボキシ基は基本構造の繰返し単位の数（前記 n) だけ存在する。スキーム（1) carbodnmide

HA-COOH + H₂N-R-NH₂ ► HA-CO-NH-R-NH₂

(1) (2) (3)

(式中、 HA— COOHはヒアルロン酸を示し；そして、 H₂N— R— NH₂はジヒドラジドまたはジァミンを示す〔R = NH— CO— A— CO— NHの場合にジヒドラジド〕 ) スキーム（2)

HO-TBP-OH

(4)

N0₂-Ph-0-CO-0-TBP-OH ► H₂N-R"-NH-CO-0-TBP-OH

(6) (8)

HA-CO-NH-R-NH-CO-O-TBP-OH

(9) (式中、 HO— TB P— OHは前記の各種トリプロックポリマーを示し； P hはフエニルを示し； H₂N— R"— NH₂はジヒドラジドまたはジァミンを示す

〔R" =NH— CO— A— CO— NHの場合にジヒドラジド〕；そして、その他の略号は上記と同様である。）

スキーム—（3)_

HO-

HA-CO-HN-R-NH₂

(3)

HA-CO-NH-R-NH-TBP-OH

(12) (式中、略号は上記と同様である。）スキーム _(4)

H₂N-R"-NH-CO-0-TBP-OH

(8)

HA-COOH

(1)

HA-CO-NH-R"-NH-CO-0-TBP-OH

(12)

(式中、略号は上記と同様である。）上記スキームに示した反応の反応条件は、国際公開公報 W095/1516 8号、国際公開公報 WO 95/24430等の記載を参照して決定することができる。例えば、スキーム（1) では、ヒアルロン酸（1) を、ジヒドラジド（ 2 ) とジシク口へキシルカルボジィミド、ジメチルァミノプロピルカルボジィミドなどのジカルポジイミドの存在下反応させ、末端アミノ化ヒアルロン酸（3) を得る。通常、この反応は、水及び/又は水溶性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール類、ジオール類）中、 0〜100°C 、好ましくは 10° (〜 40°Cの温度で、 0· 5〜48時間行う。スキーム（2) では、トリブロックポリマー（4) と 4—ニトロフエ二ノレクロ口ホルメート（5 ) を、塩化メチルなどのハロゲン化炭化水素溶媒中、トリェチルァミン等の塩基の存在下、 0〜40°〇で0. 5〜24時間反応させて 4 トロフエニルホルメート化トリブロックポリマー（6) を得る。この化合物（6) は、末端アミノ化ヒアルロン酸 (3) と、水及び Z又は水溶性溶媒中で、 0°C〜40°Cで、 0. 5 〜48時間反応させて、目的とするトリブロックポリマー結合ヒアルロン酸（9 ) を得る。一方、化合物（6) とジァミン（7) とを、ハロゲン化炭化水素溶媒中、 0〜40°Cで、 0. 5〜48時間反応させて末端アミノ化トリプロックポリマー（8) を得る。この化合物（8) を、ヒアルロン酸 (1) と反応させて、目的とするトリブロックポリマー結合ヒアルロン酸（12) を得る（スキーム（'4 ) ) 。なお、スキーム（3) では、トリブロックポリマー（4) と、 N—ヒドロキシスクシンイミド（NHS) (10) とを反応させて、 NHS活性ィ匕トリブ口ックポリマー（1 1) を得、これを末端アミノ化ヒアルロン酸（3) と反応させて、目的とするトリブロックポリマー結合ヒアルロン酸（12) を得る。なお、上記反応において、ブロックポリマーのうち、大部分が片末端の水酸基のみに活性化官能基が導入されたプロックポリマーを得ることは、各原料の仕込量を調整することによって、容易に行うことができる。例えば、活性化官能基の反応時の仕込み量をブロックポリマーの末端官能基と等モル以下として反応させれば、片末端のみ活性化されたブロックポリマーを主成分として得ることができる。さらに、活性化官能基の反応時の仕込み量を減らせば、活性ィヒされていないブロックポリマーの割合は増すが、片末端のみが活性化されたプロックポリマーの割合も増す。

本発明において使用されるジァミン、ジヒドラジドは特に限定されないが、例えばジァミンとしては、ジアミノエタン、ジァミノプロパン、等のジアミノアノレカン類、 N—リジルージアミノエタン、 N， N ' —ジリジルージアミノエタン等のモノ、またはジ（リジル）ジァミノアルカン類、アミノ基を 2つ以上もつぺプチド等が挙げられる。ジヒドラジドとしては、コハク酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドリジド、スベリック酸ジヒドラジド、ォキサリック酸ジヒドラジド、マ口ニック酸ジヒドラジド等が挙げられる。 P L G Aや P P〇等の疎水部を末端に持つものは水中でのヒアルロン酸もしくはその誘導体へのグラフト反応性が低くなるため、ヒアルロン酸もしくはその誘導体をトリプチルアンモニゥム塩にすることで DM S O等の極性有機溶媒に可溶とし、極性有機溶媒中で上記の反応を行うと良い。また、上記においてヒドラジド化を経由する場合は、本発明のヒアル口ン酸修飾物中に残存する未反応のヒドラジド基を無水コハク酸等と反応させ、フリーのヒドラジド基をなくしておくことが生体への適用上好ましい。

前記ブロックポリマーのヒアルロン酸及び Z又はその薬学的に許容される塩への導入率については、相転移に伴う充分な粘度の変化を得る為、ヒアルロン酸中のグルクロン酸当たり、 8モル％以上であることが好ましい。尚、前記ブロックポリマーのヒアル口ン酸及びノ又はその薬学的に許容される塩への導入率はプロトン NMR法で、ヒアルロン酸由来のプロトン（N— a c e t y l a t e ) と前記ブロックポリマー由来のプロトンの面積比から算出すればよい。

このようにして得られた本発明のヒアルロン酸修飾物は、高分子量のヒアルロン酸を用いていないため、室温流通が可能である。また、相転移温度を 2 0 °C以上 3 5 °C以下に調整することにより、室温においては粘度が低く取り扱いやすい (注射等により注入しやすい）一方、生体内（例えば関節腔内）に注入した際、相転移温度まで温められることによって粘弾性が急増する。

本発明のヒアルロン酸修飾物は、生体内（例えば関節腔内）に注入した際、長期に亘つて生体内に滞留することが好ましい。ここでいう長期とは、従来のヒアルロン酸製剤では達成できなかった期間、即ち 1週間以上をいい、好ましくは 2 週間以上である。尚、このような生体内（例えば関節腔内）における滞留期間を測定するには、例えば、放射性ラベルイ匕して標識化したヒアルロン酸を用いる方法（薬理と治療、 2 2、 3 2 5— 3 5 0、 1 9 9 4 ) 、又はフルォレセインイソチオシァネート（F I T C ) 等の蛍光ラベル化して標識化したヒアルロン酸を用いる方法等の従来のヒアルロン酸製剤で試みられている方法、或いは、ヒアルロニダーゼでヒアルロン酸部分を分解し、前記ブロックポリマーを G P Cで定量する方法、あるいは、投与後の関節幅の経時的減少を直接測定する方法等を用いて測定すればよい。

上述したように、本発明のヒアルロン酸修飾物は、室温流通が可能であって粘度が低く注入しやすく、且つ長期（2週間以上）に渡って関節腔内に滞留可能であり、また高い安全性が予想されるため、今までにない実用的なヒアルロン酸製剤の主成分として、関節疾患の処置に非常に有用である。

尚、ここでいう「関節疾患」とは、関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症、肩関節周囲炎等の疾患をいう。「処置」とは、前記関節疾患の治療、予防、病態の進展抑制（悪化の防止や現状維持）等のための処置をいう。

また、本発明のヒアルロン酸修飾物は、上述したような特性を利用して、外科手術に用いる補助又は処置剤、薬物徐放用担体、再生医療、組織工学に用いられる細胞増殖用マトリックスなどへの応用も可能である。例えば、本発明のヒアル口ン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤は、例えば、目艮科手術または内視鏡的粘膜切除術（EMR) に用いることができる（WO O 2 / 0 5 6 9 1 4号公報等参照）。さらに、本発明のヒアルロン酸修飾物は、柔組織の損傷を強化し修復する用途にも応用することができる（特開平 1 0—3 2 4 7 0 1号公報参照）。例えば、本発明のヒアルロン酸修飾物は、柔組織の損傷たとえばざ瘡の傷跡、外科手術後の萎縮性不整、モース（Mohs' )化学外科損傷、口びるおょぴ老令のしわの裂傷傷跡のような損傷、あるいはしわ自体を修復するのに安全に使用することができる。

本発明のヒアルロン酸修飾物は、その有効量に、適宜、製薬上許容しうる担体、賦型剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、香料、着色剤を加えて医薬組成物として用いることができる。本発明の医薬組成物は、例えば、注射剤、溶液剤、経皮吸収剤、軟膏、ローション、カプセル剤等に製剤化することができる。製剤中のヒアルロン酸修飾物の含有量は、例えば、製剤全体に対して、 0 . 0 1〜9 9 . 9 % wZw、好ましくは、 0 . ：!〜 7 0 % ノである。

本発明のヒアル口ン酸修飾物を関節疾患処置製剤あるいは外科手術補助又は処置剤として製剤化するに際しては、特に限定されないが、例えば、生理食塩水やリン酸生理食塩水等に所望の濃度に溶解させ、注射用製剤として製剤化することができる。この際、必要に応じて、酸又は塩基を加えることにより、溶液を所望の p Hに調製してもよい。また、ナトリウム塩、カリウム塩等の 1価の金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩等の 2価の金属塩等の無機塩等を加えることにより、溶液を所望の塩濃度に調製してもよレ、。更に、所望に応じて、安定化剤等が加えられていてもよい。このようにして調製された、本発明のヒアルロン酸修飾物を溶解させた溶液を、デイスポーザプル注射筒等の注射器に予め充填させた形で流通させてもよい。

本発明のヒアルロン酸修飾物を主成分とする関節疾患処置製剤を注射用製剤として投与するに際しては、本発明のヒアル口ン酸修飾物が 0 . 0 1 %〜 5 0 %w / Vの溶液濃度、好ましくは 0 . 0 5 %〜 2 0 % w/ Vの溶液濃度、特に好ましくは 0 . 5 %〜 1 0 % w / Vの溶液濃度のものを、 1回あたり l〜3 m Lを患者に投与すればよい。但し、この投与量は、医師の指示、対象となる患者、又は疾患や疾患の重篤度、或いは原料となるヒアル口ン酸の分子量等により、それぞれ最適な投与量に適宜増減してもよい。

本発明のヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤を注射剤として用いる場合は、本発明のヒアルロン酸修飾物が 0 . 0 1 %〜5 0 %w/ v の溶液濃度、好ましくは 0 . 0 5 %〜 2 0 % w/ Vの溶液濃度、特に好ましくは 0 . 5 %〜 1 0 % w/ Vの溶液濃度のものを、必要量手術の対象部位に適用すればよい。例えば、このような製剤を、径が 2 0〜2 2 Gで、注射針のチューブの有効長が 1 0 0 0〜2 5 0 O mmの注射針を有する内視鏡用注射針を用いて、手術の対象部位に適用し、胃や腸などの粘膜組織の切除に利用することができる。例えば、ポリープや癌などの切除予定の粘膜下層に、内視鏡用注射針を介して上記製剤を注入して切除予定部位を隆起させ、その隆起部分をスネアやニードルナィル等で切除する。なお、上記製剤を眼科手術補助剤として用いる場合は、例えば、白内障手術において、上記製剤を、手術スペース（前房深度と呼ばれる）の維持や角膜内皮などを物理的侵襲から保護するために注入する。例えば、混濁した水晶体核を除去したのち、上記製剤を注入することにより、前房深度を十分に維持しつつ、眼内レンズを揷入することができる。

なお、本発明の組織修復剤は、例えば、上記のような組成を有する注射用製剤、溶液剤、経皮吸収剤、軟膏又はローションのような製剤として組織の修復が必要な部位に適用することができる。実施例

以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

以下の実施例においては、 NMRスペクトルは核磁気共鳴装置 JNM—EC A500 (日本電子株式会社製）を用いて測定した。

〔実施例 1〕

(実施例 1一 1 )

(1) 二ト口フエニルフオルメイト化した P 1 u r o n i c L 62 D (P 1 u r o n i c L 62D-NP C) の合成

P l u r o n i c L— 62D (商品名）（分子量 2360ダルトン、 L C S T28°C、 B AS F武田ビタミン株式会社製） 8mmo l、 4— N—ニトロフエニルク口口フオルメィト（東京化成株式会社製） l Ommo lを l O OmLの塩化メチレン（S i gma社）に溶かし、 10 mm o 1のトリェチルァミンを加え室温で 12時間反応させた後、エーテルで洗浄後エバポレータで濃縮し、ニトロフエニルフオルメイト化した P 1 u r 0 n i c L 62D (P l u r o n i c L 6 2D-NP C) 1 7. 2 gを得た。

(2) ヒドラジド（HZ) 基が導入されたヒアルロン酸（HA— HZ) の合成分子量 5. 8 X 10⁵ダルトンのヒアルロン酸（HA) (電気化学工業株式会社製） l O Omgを 0. 25 %濃度で蒸留水に溶解し、 5 N塩酸で p Hを 4. 7 〜4. 8に調製した。 1一ェチル一 3— 3—ジメチルァミノプロピルカルボジィミド（EDC) とアジピン酸ジヒドラジド（ADH) を、 HA ： EDC ： ADH = 1 : 5 : 40モル比になるよう添カ卩し、 5N塩酸でpHを4. 7〜4. 8に保ちながら室温で 2時間反応させた。 100 mM塩化ナトリゥム溶液、 25 %ェタノール溶液で透析（スぺクトラポア 7、分画分子量（MWC O) ： 12 k— 14 kダルトン）し、凍結乾燥して標題のヒドラジド（HZ) 基が導入されたヒアルロン酸（HA— HZ) 85m gを得た。

得られた HA— HZ中の HZ導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 H Aの力ノレボン酸の 68%が HZ化されていた（HA： N— a c e t y l a t e、 2. l p pm、 HZ : Me t hy l e n e、 1. 7 p pm、 2. 4 p pmゾ。

(3) ヒアル口ン酸に PEO— PPO— PEOを結合させたヒアルロン酸修飾物の合成

前記（2) で得られた HA— HZ 1 Omgを 1 OmLの 1 0 OmMリン酸緩衝溶液（PB、 pH8. 0) に溶かし、同じく前記（1) で得られた P l u r o n i c L62D_NPCを、 HZ ： NP C= 1 ： 20モル比になるよう添カロし、 4°Cで 1日間反応させた。 pHを 1 1にして過剰の NPCを加水分解した後、 4 °Cで水に対して透析（スベタトラポア 7、 MWCO ： 300 kダルトン）することで精製、エバポレーシヨンで濃縮した。標題のヒアルロン酸にポリエチレンォキサイド一ポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドプロックポリマ一 (PEO-PPO-PEO) を結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。

得られた HA— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン NM R法で定量したところ、 H Aのカルボン酸の 1 3モル⁰ /₀に P 1 u r o n i cが導入されていた（HA： N- a c e t y l a t e、 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t hy l、 I . 2 p pm) 。

また、このヒアルロン酸修飾物の 4 % V / Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °C で液体、 36 °Cでゲル化した。

(実施例 1一 2 )

(1) HZが導入されたヒアルロン酸（HA— HZ) の合成分子量 1. 9 X 10⁵ダルトンの HA (電気化学工業株式会社製） 10 Omg を 0. 5%濃度で蒸留水に溶解したほかは前述の実施例 1一 1の（2) と同様の方法で、標題の HZが導入された HA (HA-HZ) 83 m gを得た。得られた HA— HZ中の HZ導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 HAのカルボン酸の 64%が HZ化されていた（HA： N— a c e t y 1 a t e、 2. I p p m、 HZ : Me t hy l e n e、 1. 7 p pm、 2. 4 p pm) 。

(2) ヒアル口ン酸に PEO— PPO— PE〇を結合させたヒアル口ン酸修飾物の合成

前記（1) で得られた HA— HZ 1 Omgを 1 OmLの 10 OmMリン酸緩衝溶液（PB、 pH8. 0) に溶かし、実施例 1一 1の（1) と同様の方法で得られた P l u r o n i c L62D_NPCを、 HZ ： NPC= 1 ： 20モル比になるよう添加し、 4 °Cで 1日間反応させた。 p Hを 1 1にして過剰の N P Cを加水分解させた後、 4°Cで水に対して透析（スぺクトラポア 7、 MWCO : 300 kダノレトン）することで精製、エバポレーシヨンで濃縮した。標題のヒアルロン酸に PEO— PPO— PEOを結合させたヒアル口ン酸修飾物を得た。

得られた H A— P 1 u r o n i c中の P l u r o n i c導入率をプロトン NM R法で定量したところ、 HAのカルボン酸の 30モル％に l u r o n i cが導入されていた (HA： N— a c e t y l a t e, 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t hy l、 1. 2 p pm) 。

また、このヒアルロン酸修飾物の 6 % V Z V酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでゲル化した。

(実施例 1一 3 )

(1) HZが導入されたヒアルロン酸（HA— HZ) の合成

分子量 2. 5 X 10⁴ダルトンの H A (電気化学工業株式会社製） 1 0 Omg を 1 %濃度で蒸留水に溶解したほかは前述の実施例 1一 1の（ 2 ) と同様の方法で、標題の HZが導入された HA (HA-HZ) 88 m gを得た。得られた HA 一 HZ中の HZ導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 HAのカルボン酸のら 5 %が HZィヒされていた（HA： N- a c e t y l a t e、 2. l p pm、 HZ ： Me t hy l e n e 1. 7 p pm、 2. 4 p pmU 。

(2) ヒアル口ン酸に PEO— PPO— PEOを結合させたヒアル口ン酸修飾物の合成

前記（1) で得られた HA— HZ 1 Omgを 1 OmLの 10 ΟιηΜリン酸緩衝溶液（P B、 p H 8. 0 ) に溶かし、実施例 1一 1の（ 1 ) と同様の方法で得られた P l u r o n i c L 62D— NPCを、 HZ ： NP C= 1 ： 20モル比になるよう添加し、 4°Cで 1日間反応させた。 pHを 1 1にして過剰の NPCを加水分解させた後、 4°Cで水に対して透析（スぺクトラポア 7、 MWCO : 50 k ダルトン）、さらにジメチルスルホキシド (DMSO) に対して透析し、再度水に置換した後凍結乾燥、標題のヒアルロン酸に P E O— P P O— P E Oを結合させたヒアル口ン酸修飾物を得た。

このヒアルロン酸修飾物の 10 % V / V酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでゲルイ匕した。

〔実施例 2〕

(実施例 2— 1 )

(1) 二ト口フエニノレフオノレメイト化した P l u r o n i c L 92 (P l u r o n i c L 92 -NPC) の合成

P l u r o n i c L 92 (商品名）（分子量 3650ダルトン、 L C S T 1 7°C、 B AS F武田ビタミン株式会社製）を用いるほかは、実施例 1— 1の（1 ) と同様の方法で、二トロフエニルフオルメイト化した P 1 u r o n i c L 92 (P 1 u r o n i c L 92-NPC) 27. 3 gを得た。

(2) ヒアル口ン酸に PPO— PEO— PPOを結合させたヒアルロン酸修飾物の合成

実施例 1— 1の（2) で得られた HA— HZを用い、 P l u r o n i c L 62 D— NPCの代わりに前記（1) で得られた P l u r o n i c L 92— NPCを用いるほかは、実施例 1一 1の（3) と同様の方法で、標題のヒアルロン酸にポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドブロックポリマー（P PO— PEO— P PO) を結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られた H A— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 H Aのカルボン酸の 27モル⁰ /₀に P 1 u r o n i cが導入されていた（HA： N- a c e t y l a t e、 2. l p pm、 P 1 u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t hy l、 1. 2 p pm) 。このヒアルロン酸修飾物の 2 % V Z Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでゲル化した。

(実施例 2— 2 )

実施例 1—2の（1) で得られた HA— HZを用いるほかは、実施例 2—1の (2) と同様の方法で、標題のヒァルロン酸に？？0_?£0— ??0を結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られた HA— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 H Aのカルボン酸の 29 モノレ⁰ /₀に P 1 u r o n i cが導入されていた（HA： N— a c e t y l a t e, 2. 丄 p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t h y 1、 1. 2 p p m)

このヒアルロン酸修飾物の 4 % V Z Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでゲル化した。

(実施例 2— 3 )

実施例 1—3の（1) で得られた HA— HZを用いるほかは、実施例 2—1の (2) と同様の方法で、標題のヒアルロン酸に PP〇— PEO— PPOを結合させたヒアル口ン酸修飾物を得た。

このヒアルロン酸修飾物の 10 % V Z Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでゲル化した。

(実施例 2— 4) (1) ヒドラジド（HZ) 基が導入されたヒアルロン酸（HA— HZ) の合成分子量 1. 5 X 10⁶ダルトンのヒアルロン酸（H A) (電気化学工業株式会社製） l O Omgを 0. 1。/。濃度で蒸留水に溶解し、 5 N塩酸で p Hを 4. 7〜 4. 8に調製した。 1—ェチルー 3— 3—ジメチルァミノプロピルカルボジイミド（EDC) とアジピン酸ジヒドラジド（ADH) を、 HA： EDC ： ADH = 1 : 5 : 40モル比になるよう添カロし、 5N塩酸でpHを4. 7〜4. 8に保ちながら室温で 2時間反応させた。 100 mM塩化ナトリウム溶液、 25 %エタノール溶液で透析（スぺクトラポア 7、分画分子量（MWC O) : 12 k— 14 k ダルトン）し、凍結乾燥して標題のヒドラジド（HZ) 基が導入されたヒアル口ン酸（HA— HZ) 88mgを得た。

得られた HA— HZ中の HZ導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 H Aのカルボン酸の 61%が HZ化されていた（HA： N- a c e t y 1 a t e、 2. l p pm_N HZ : Me t hy l e n e, 1. 7 p pm、 2. 4 p p m) ₀ (2) ヒアルロン酸に P PO— PEO— PPOを結合させたヒアルロン酸修飾物の合成

実施例 2— 4の（1) で得られた HA— HZを用いるほかは、実施例 2—1の

(2) と同様の方法で、標題のヒァルロン酸に？？0_?£0— ??0を結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。 4°Cで水に対して透析（スぺクトラポア 7、 M WCO : 300 kダルトン）することで精製、エバポレーションで濃縮した。得られた HA— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン NMR法で定量したところ、 HAのカルボン酸の 9モル％に 1 u r 0 n i cが導入されて!/ヽた (HA： N— a c e t y l a t e, 2. l p pm、 P 1 u r o n i c : P r o p y l e n e o x i d eの M e t hy l、 1. 2 p pm) 。

このヒアルロン酸修飾物の 1 % Vノ Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでゲル化した。

〔比較例 1〕

P l u r o n i c L— 31 (商品名）（分子量 1 100ダルトン、 LCST 39°C、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例 1 _ 1と同様の方法で、ヒアル口ン酸に PEO— PPO— PEOを結合させたヒアル口ン酸修飾物を得た。得られた H A— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン N MR法で定量したところ、 H Aのカルボン酸の 1.4モル％に卩 1 u r o n i c が導入されていた（HA： N- a c e t y l a t e、 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t h y 1 1. 2 p p m) ₀ このヒアルロン酸修飾物の 2 % V / V ン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cで白濁ィヒしたが、顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。〔比較例 2〕

P l u r o n i c L— 3 1 (商品名）（分子量 1100ダルトン、 L C S T 39°C、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例 1 _ 2と同様の方法で、ヒアルロン酸に PEO— P PO— PEOを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られた H A— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン N MR法で定量したところ、 H Aのカルボン酸の 0. 5モル。 /₀に P 1 u r o n i c が導入されていた（HA： N— a c e t y l a t e, 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t h y l、 1. 2 p pm) 。このヒアルロン酸修飾物の 4 % V Z Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36°Cで白濁化したが、顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。

〔比較例 3〕

P l u r o n i c L— 3 1 (商品名）（分子量 1100ダルトン、 L C S T 39°C、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例 1_ 3と同様の方法で、ヒアル口ン酸に PEO— PPO— PEOを結合させたヒアル口ン酸修飾物を得た。得られた H A— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン N MR法で定量したところ、 H Aのカルボン酸の 2. 0モル⁰ /₀に P 1 u r o n i c が導入されていた（HA： N- a c e t y l a t e, 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t h y l、丄. 2 p pmノ。このヒアルロン酸修飾物の 10 % V / Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36°Cで白濁化したが、顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。〔比較例 4〕

P 1 u r o n i c L一 64 (商品名）（分子量 2900ダルトン、 LCST 54°C, 旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例 1— 1と同様の方法で、ヒアルロン酸に PEO— PPO— PEOを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られた H A— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン N MR法で定量したところ、 H Aのカルボン酸の 1 1モル％に？ 1 u r o n i cが導入されていた（HA： N— a c e t y l a t e, 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t hy l、 1. 2 p pm) 。

このヒアルロン酸修飾物の 2 % V Z Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでも液体、 55 °Cでゲル化した。

〔比較例 5〕

P l u r o n i c L— 64 (商品名）（分子量 2900ダルトン、 L C S T 54°C、旭電化工業株式会社製）を用いるほかは、実施例 1一 2と同様の方法で、ヒアルロン酸に PEO— PPO— PEOを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られた H A— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン N MR法で定量したところ、 H Aのカルボン酸の 15モル⁰ /₀に P 1 u r o n i 。が導入されていた（HA： N— a c e t y l a t e, 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t hy l、 1. 2 p pm) 。

このヒアルロン酸修飾物の 4 % V / V ン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでも液体、 54 °Cでゲル化した。〔比較例 6〕

P l u r o n i c L— 64 (商品名）（分子量 2900ダルトン、 LCST 54°C, 旭電化工業株式会社製）を角いるほかは、実施例 1一 3と同様の方法で、ヒアルロン酸に P E〇一 P PO— P EOを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。得られた HA— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン N MR法で定量したところ、 HAのカルボン酸の 19モル⁰ /₀に P 1 u r o n i c力 S 導入さていた（HA： N— a c e t y l a t e、 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t hy l、 1. 2 p p m) 。

このヒアルロン酸修飾物の 10 % V / V ン酸生理食塩性溶液は、 25 °cで液体、 36 °Cでも液体、 55 °Cでゲル化した。〔比較例 7〕

実施例 1— 1で、 P l u r o n i c L 62 D— NP Cを、 HZ ： NP C= 1 ： 2モル比になるよう添加するほかは、実施例 1 _ 1と同様の方法で、ヒアル口ン酸に PEO— P PO— PEOを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。

得られた HA— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン NMR 法で定量したところ、 HAのカルボン酸の 7. 0モル⁰ /₀に P 1 u r o n i cが導入されていた（HA : N— a c e t y l a t e、 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t hy l、 1. 2 p pm) 。

このヒアルロン酸修飾物の 2 % V Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでも顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。

〔比較例 8〕

実施例 1一 2で、 P l u r o n i c L 62 D— NP Cを、 HZ : NP C = 1 ： 2モル比になるよう添カ卩するほかは、実施例 1一 2と同様の方法で、ヒアルロン酸に PE〇一 PPO— PEOを結合させたヒアルロン酸修飾物を得た。

得られた HA— P 1 u r o n i c中の P 1 u r o n i c導入率をプロトン NMR 法で定量したところ、 HAのカルボン酸の 5. 8モル％に P 1 u r o n i cが導入されていた（HA： N— a c e t y l a t e, 2. l p pm、 P l u r o n i c ： P r o p y l e n e o x i d eの M e t hy l、 1. 2 p pmj 。

このヒアルロン酸修飾物の 4 °/。 V / Vリン酸生理食塩性溶液は、 25 °Cで液体、 36 °Cでも顕著な粘度上昇、ゲル化は認められなかった。 '

[試験例 1 粘度の温度応答性] 実施例 2— 4の 1%νΖνリン酸生理食塩性溶液の粘度の温度依存性を V i s c ome t e r RE 1 1 OR s y s t em (東機産業会社製）を用いて、コーン /プレート型、せん断速度 1. 0 ( s e c— 1 ) で測定した。 37°Cでの粘度は室温の 100倍以上となった。その結果を図 1 3に示す。

[試験例 2 関節腔内滞留性]

エーテル麻酔にかけたラットの下肢の毛を剃り、 26 G注射 tK寸シリンジにて関節腔内および皮下に実施例 2— 4で調製したサンプルを投与した。投与後のラットの膝関節幅をノギスにて経時的に測定し、投与前の膝関節幅からの膨張度を投与サンプルの滞留性の指標とした。関節幅は、ラットの関節幅を 3回測定し平均値を各時点の代表値とした。投与後 72時間でも生理食塩水投与の 3倍の関節幅を維持していた。その結果を図 14に示す。産業上の利用可能性

ヒアルロン酸及ぴノ又はその薬学的に許容される塩と、ポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドブロックポリマー（P EO-P PO-P EO) 、ポリプロピレンオキサイド一ポリエチレンオキサイド一ポリプロピレンオキサイドブロックポリマー（PPO— PEO— PPO) 、ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸/ポリグリコール酸共重合体一ポリエチレンォキサイドブロックポリマー（P EO— P LGA— P EO) 、ポリ乳酸 Zポリグリコ一ル酸共重合体ーポリエチレンォキサイドーポリ乳酸/ポリグリコ一ル酸共重合体ブロックポリマー（P LGA— P E〇_P LGA) 、ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドブロックポリマー（PEO— PLA— P EO) 及びポリ乳酸一ポリエチレンオキサイド一ポリ乳酸ブロックポリマー（P LA-PEO-P LA) から選択されるブロックポリマーとが結合した本発明のヒアル口ン酸修飾物は、室温流通が可能であり且つ粘度が低く取り扱いやすいにもかかわらず、生体内（例えば関節腔内）に注入後その粘弾性を急増させることが可能である。従って、本発明のヒアルロン酸修飾物は、今までにない実用的なヒアルロン酸製剤の主成分として、関節疾患の処置に非常に有用である。また、本発明のヒアルロン酸修飾物を主成分とする製剤は、眼科手術、内視鏡的粘膜切除術などの外科手術用補助剤又は処置剤としても有効に用いられる。さらに、本発明のヒアル口ン酸修飾物は、その特性を利用して、薬物徐放用担体などへの応用も期待できる。

Claims

請求の範囲

1 . ヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩と、ポリエチレンォキサィドーポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドブロックポリマー、ポリプロピレンォキサイドーポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドブロックポリマー、ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸 zポリグリコール酸共重合体ーポリエチレンォキサイドブロックポリマー、ポリ乳酸 zポリグリコール酸共重合体—ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸 Zポリグリコ一ル酸共重合体ブロックポリマー、ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドブロックポリマー及びポリ乳酸一ポリエチレンォキサイドーポリ乳酸ブロックポリマーから選択されるブロックポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物。

2 . 前記ブロックポリマーが、ポリエチレンオキサイド一ポリプロピレンォキサィドーポリエチレンォキサイドブロックポリマー又はポリプロピレンォキサイド一ポリエチレンォキサイドーポリプロピレンォキサイドブロックボリマ一である請求項 1記載のヒアル口ン酸修飾物。

3 . 前記ブロックポリマーの大部分が、その片末端のみでヒアロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩に結合している請求項 1又は 2に記載のヒアノレロン酸修飾物。

4 . 前記ブロックポリマーが、その片末端のみでヒアルロン酸及び Ζ又はその薬学的に許容される塩に結合している請求項 1又は 2に記載のヒアルロン酸修飾物

5 . 前記ブロックポリマーが、ヒアルロン酸及び Ζ又はその薬学的に許容される塩のカルボキシル基に結合している請求項 1〜 4のいずれか一項に記載のヒアル口ン酸修飾物。

6 . 生理食塩水中及び Ζ又はリン酸生理食塩水中における前記ヒアル口ン酸修飾物の相転移温度が、前記ヒアル口ン酸修飾物 1 0 . 0 % w/ V以下の濃度で、 2 0 °C以上 3 5 °C以下であることを特徴とする請求項 1〜 5のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物。

7 . 前記ブロックポリマーの重量平均分子量が 1 2 0 0ダルトン以上であることあることを特徴とする請求項 1〜 6のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物

8 . 前記プロックポリマーの、ヒアルロン酸及びノ又はその薬学的に許容される塩への導入率が、ヒアル口ン酸及ぴ Z又はその薬学的に許容される塩中のダルクロン酸当たり 8モル％以上であることあることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか一項に記載のヒアル口ン酸修飾物。

9 . 前記ヒアルロン酸及び/又はその薬学的に許容される塩の重量平均分子量が 1 5 0万ダルトン以下であることを特徴とする請求項 1〜 8のいずれか一項に記載のヒアル口ン酸修飾物。

1 0 . 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載のヒアル口ン酸修飾物を主成分とする医薬組成物。

1 1 . 請求項 1〜9のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物を主成分とする関節疾患の処置製剤。

1 2 . 前記の関節疾患が関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症又は肩関節周囲炎である請求項 1 1記載の関節疾患の処置製剤。

1 3 . 注射用製剤である請求項 1 1又は 1 2に記載の関節疾患の処置製剤。

1 4 . 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載のヒアル口ン酸修飾物の有効量を患者に投与することを含む、関節疾患の処置方法。

1 5 . 前記の関節疾患が関節軟骨欠損、慢性関節リウマチ、変形性関節症又は肩関節周囲炎である請求項 1 4記載の関節疾患の処置方法。

1 6 . 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載のヒアルロン酸修飾物を主成分とする外科手術補助又は処置剤。

1 7 . 前記の外科手術が眼科手術または内視鏡的粘膜切除術である請求項 1 6に • 記載の外科手術補助又は処置剤。

1 8 . 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載のヒアル口ン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む外科手術方法。

1 9 . 前記の外科手術が眼科手術または内視鏡的粘膜切除術である請求項 1 8に記載の外科手術方法。

2 0 . 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載のヒアル口ン酸修飾物を主成分とする組織修復剤。

2 1 . 柔組織の損傷、外科手術後の萎縮性不整、モース（Mohs' )化学外科損傷、しわ、又はしわの裂傷傷跡を修復することに用いられる請求項 2 0に記載の組織修復剤。

2 2 . 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載のヒアル口ン酸修飾物の必要量を対象部位に適用することを含む組織修復方法。

2 3 . 柔組織の損傷、外科手術後の萎縮性不整、モース（Mohs' )化学外科損傷、しわ、又はしわの裂傷傷跡を修復する請求項 2 2に記載の外科手術方法。