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WO2003076655A2 - Verfahren zur bestimmung eines nukleinsäureanalyten - Google Patents

Verfahren zur bestimmung eines nukleinsäureanalyten Download PDF

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WO2003076655A2
WO2003076655A2 PCT/EP2003/002712 EP0302712W WO03076655A2 WO 2003076655 A2 WO2003076655 A2 WO 2003076655A2 EP 0302712 W EP0302712 W EP 0302712W WO 03076655 A2 WO03076655 A2 WO 03076655A2
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WO
WIPO (PCT)
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analyte
probe
probes
hybridization
bound
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2003/002712
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English (en)
French (fr)
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WO2003076655A3 (de
Inventor
Rudolf Rigler
Adrian Honegger
Klaus DÖRRE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gnothis Holding SA
Original Assignee
Gnothis Holding SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10211321A external-priority patent/DE10211321A1/de
Application filed by Gnothis Holding SA filed Critical Gnothis Holding SA
Priority to AU2003212358A priority Critical patent/AU2003212358A1/en
Publication of WO2003076655A2 publication Critical patent/WO2003076655A2/de
Publication of WO2003076655A3 publication Critical patent/WO2003076655A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • the invention relates to a method for determining a nucleic acid analyte by hybridization with two or more hybridization probes.
  • molecular beacons as hybridization probes for the detection of nucleic acid target molecules in a sample is known (see US Pat. No. 5,607,834).
  • Molecular beacons usually contain a so-called hairpin structure consisting of a star with two mutually complementary sequence sections and a loop, a fluorescent label group and a quench group.
  • the stem sequence which is not capable of binding to the target molecule, serves to keep the fluorescent labeling group and the quench group in proximity when the probe is not bound to the analyte. In this way, photons that are absorbed by the fluorescent label group are not emitted as fluorescent photons, but the energy is transferred to the quench group.
  • the loop sequence is complementary to the target molecule to be detected.
  • the loop opens and hybridizes with the target molecule.
  • the fluorescent label group is removed from the vicinity of the quench group, whereby fluorescence occurs and can be measured.
  • Molecular beacons are used in particular for homogeneous detection methods in which it is not possible or desirable to isolate hybridization products of the target nucleic acid and the probe from an excess of the hybridization probes, such as in real-time monitoring of polymerase chain reactions.
  • the use of a combination of hybridization probes in a detection method is known, one probe carrying a fluorescence donor group and the other probe carrying a fluorescence acceptor group. When hybridizing both probes to a target nucleic acid, a detectable energy transfer between the donor and acceptor groups can take place (see, for example, US Pat. No. 4,996, 143).
  • One object of the present invention is to develop a method for determining nucleic acid analytes in which the disadvantages mentioned above can be at least partially avoided.
  • This task is solved by using at least two co-res po ndies and h yb ri disie r ng sso ndengel.
  • These corresponding hybridization probes are selected such that they have a hairpin structure, the loop sections of the hairpins comprising the probe sequences complementary to a nucleic acid analyte.
  • the stars are formed by two mutually complementary arm sequences, which are arranged at the ends of the probe sequences.
  • the sterns of both probe molecules are complementary to one another.
  • the selection of star and loop sequences is such that a hybrid formed between the loop and a complementary sequence of the analyte is more stable than the hybrid of the complementary ones Sequences of the star is. This can be done by adjusting the length and / or the G / C portion of the respective hybridizing areas accordingly.
  • Both hybridization probes are furthermore selected such that they bind to the analytes adjacent to one another, preferably in the immediate vicinity without any space between, the adjacent stem sections of the probes additionally hybridizing with one another.
  • a first label group is preferably attached to the 3 'end of the first probe and a second label group is preferably attached to the 5' end of the second probe.
  • the star keeps the two labeling groups, preferably luminescence or fluorescence labeling groups, at a small spatial distance from one another. In this way, an interaction between the two marker groups, for example an energy transfer between an energy donor and an energy acceptor group, is possible.
  • a luminescence or fluorescence donor group can be excited with a laser, which transfers its energy to the acceptor group and excites the latter to fluoresce. The fluorescence of the acceptor group is then detected.
  • the analysis of the measurement signal can include a time-resolved determination.
  • the invention thus relates to a method for determining a nucleic acid analyte in a sample, comprising the steps:
  • the nucleic acid analytes determined by the method can be obtained from biological samples, especially from mammals such as humans, but also from other organisms, e.g. Microorganisms.
  • analytes can also be detected that have been generated in vitro from biological samples, cDNA molecules that have been produced from mRNA by reverse transcription.
  • the sample used for the method is preferably from an organism, e.g. from tissue or body fluid of an organism, especially from a human.
  • the method can be used, for example, to analyze gene expression, e.g. B. to determine a gene expression profile, or to analyze mutations, such as single nucleotide polymorphisms (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphisms
  • the method is also suitable for determining enzymatic reactions on nucleic acids, for example for determining Nucleic acid amplification reactions, especially in one or more thermocycling processes.
  • the hybridization probes used for the method according to the invention are preferably oligonucleotides, in particular DNA molecules.
  • corresponding nucleic acid analogs such as peptide nucleic acids (PNA), locked nucleic acids (LNA) or other nucleotide analogs, can also be used.
  • the length of the hybridization probes can in principle be chosen as in known probes and is usually in the range from 20 to 200 nucleotides.
  • the hybridization probes contain marker groups, preferably fluorescent marker groups, which differ in at least one measurement parameter, in particular selected from the emission wavelength and duration of the fluorescence.
  • marker groups preferably fluorescent marker groups, which differ in at least one measurement parameter, in particular selected from the emission wavelength and duration of the fluorescence.
  • one probe contains a donor labeling group and the other probe contains an acceptor labeling group, wherein an energy transfer can take place between the donor and acceptor labeling groups.
  • the analytes are detected by determining the binding of both probes to the analyte.
  • the determination preferably comprises the detection of an energy transfer between the marker groups of the first and second probe. Suitable combinations of donor and acceptor labeling groups for such energy transfer (FRET) are known to those skilled in the art (see e.g. U.S. Patent 4,996,143).
  • the method according to the invention can also include a so-called cross-correlation determination, in which at least two different markings, in particular fluorescence markings, are used, the correlated signal of which is determined.
  • the basic implementation of such a cross-correlation determination is, for example, in Schwüle et al. (Biophys. J. 72 (1 997), 1 878-1 886) and Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1 998), 97-1 09).
  • the method according to the invention is based on the fact that a combination of hybridization probes is used which hybridize to adjacent sequence sections of the analyte.
  • a combination of probes is preferably used, the first probe binding to a region of the analyte which is immediately 3 ′ to the region to which the second probe binds.
  • the first probe conveniently carries its label group directly at its 3 'end and the second probe carries its label group at the 5' end.
  • a change e.g. B.
  • E n e rg i etra n s f e between two marker groups is made easier.
  • the hybridization probes used in the method according to the invention are preferably so-called molecular beacons which, when bound to the analyte, have an increase in the signal strength of the labeling group. This can be achieved, for example, if the signal of the labeling group is at least partially deleted by the presence of a quench group on the probe, if the probe is not bound to the analyte.
  • the signal strength is preferably increased by at least a factor of 2, particularly preferably at least by a factor of 5.
  • the method according to the invention is preferably carried out with low concentrations of the analyte or hybridization probes present in the sample and with a very small sample volume.
  • the sample volume is preferably in the range of ⁇ 1 0 "6 I and particularly preferably ⁇ 10 ⁇ 8 1.
  • a microwave structure with several recesses for receiving sample liquid can be used as the carrier, the individual wells having a diameter of between 10 and 1000 ⁇ m, for example. Suitable microstructures are described, for example, in DE 1 00 23 421 .6 and DE 1 00 65 632.3.
  • the carrier can contain temperature control elements, for example Peltier elements, which enable temperature regulation of the carrier and / or individual sample containers therein.
  • the carrier used for the method is expediently equipped in such a way that it enables optical detection of the sample.
  • a carrier which is optically transparent at least in the region of the sample containers is therefore preferably used.
  • the carrier can either be completely optically transparent or contain an optically transparent base and an optically opaque cover layer with cutouts in the sample containers.
  • Suitable materials for supports are, for example, composite supports made of metal (e.g. silicon for the cover layer) and glass (for the base). Such supports can be produced, for example, by applying a metal layer to the glass with predetermined cutouts for the sample containers.
  • plastic carriers e.g. made of polystyrene or polymers based on acrylate or methacrylate. It is further preferred that the carrier has a cover for the sample containers in order to provide a closed system which is essentially isolated from the surroundings during the measurement.
  • electrical fields in particular in the area of the sample containers, can be generated in the carrier in order to achieve a concentration of the analytes to be determined in the measurement volume.
  • Examples of electrodes which are suitable for generating such electrical fields are described, for example, in DE 101 03 304.4.
  • the analyte is particularly preferably detected by fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the measurement of one or a few analyte molecules is preferably carried out in a measurement volume which is part of the sample volume, the concentration of the analyte molecules to be determined preferably being ⁇ 10 "6 mol / l and the measurement volume preferably being ⁇ 10 " 14 I.
  • Measurement signals originating from the marker groups of the hybridization probes are determined by luminescence measurement.
  • the detection can also be carried out by time-resolved decay measurement, a so-called time / gating, the signal of the marker groups, e.g. the fluorescence within the measurement volume is excited and then the detection interval on the detector is preferably opened at a time interval of> 100 ps.
  • time / gating the signal of the marker groups, e.g. the fluorescence within the measurement volume is excited and then the detection interval on the detector is preferably opened at a time interval of> 100 ps.
  • a confocal single-molecule analysis is carried out such that the distance between the measurement volume in the sample liquid and the focusing optics of the light source used to excite fluorescence marking groups in the sample liquid is> 1 mm and the sample liquid is a light source, in particular from the Focusing optics is thermally insulated.
  • the sample liquid is a light source, in particular from the Focusing optics is thermally insulated.
  • the carrier is preferably a microstructure with several, preferably at least 10 2 containers for holding a sample liquid, the sample liquid in the separate containers being able to come from one or more sources.
  • the sample liquid can be introduced into the containers of the carrier, for example by means of a piezoelectric liquid dispensing device.
  • the containers of the carrier are designed in such a way that they enable the detection reagent to be bound with the analyte in solution.
  • the containers are preferably indentations in the carrier surface, these indentations generally being able to have any shape, for example circular, square, diamond-shaped, etc.
  • the carrier can also comprise 10 3 or more separate containers.
  • the optical excitation device comprises a strongly focused light source, preferably a laser beam, which is focused on the measurement volume in the sample liquid by means of corresponding optical devices.
  • the light source can also contain two or more laser beams, which are then focused on the measurement volume by different optics before entering the sample liquid.
  • the detection device can contain, for example, a fiber-coupled avalanche photodiode detector or an electronic detector.
  • excitation or / and detection matrices consisting of a dot matrix of laser dots, generated by diffraction optics or a quantum well laser, and a detector matrix, generated by an avalanche photodiode matrix or electronic detector matrix, for example a CCD camera, can also be used , be used.
  • the light source comprises one or more laser beams, which are split into multiple foci by guiding through one or more diffraction-optical elements, as described in DE 101 26083.0.
  • the carrier can already be provided in a prefabricated form, luminescence-labeled detection reagents, preferably luminescence-labeled hybridization probes or primers, being introduced into several separate containers of the carrier.
  • the carrier containing the detection reagents is then advantageously dried.
  • a prefabricated carrier which contains a large number of separate, e.g. 100 containers, into which different detection reagents, e.g. Reagents for the detection of nucleic acid hybridization, such as primers and / or probes, are present.
  • This carrier can then be mixed with an organism to be examined, e.g. a human patient, sample can be filled so that different analytes are determined from a single sample in the respective containers.
  • Such carriers can be used, for example, to create a gene expression profile, e.g. for the diagnosis of diseases or for the determination of nucleic acid polymorphisms, e.g. to detect a certain genetic predisposition.
  • Fluorescent labels such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, CY3, CY5 or derivatives thereof, are preferably used as labeling groups.
  • the fluorescent labeling groups can be differentiated using the emission wavelength, the lifetime of the excited states or a combination thereof.
  • the invention also relates to a reagent kit for determining nucleic acid analytes, comprising at least two hybridization probes capable of binding to the analyte, each carrying different labeling groups, and, if they are not bound to the analyte, in a hairpin structure comprising a star with two mutually complementary sections and a loop comprising the sequence capable of binding to the analytes, one of which can bind the first hybridization probe adjacent to a second hybridization probe to the analyte, the labeling groups of the two hybridization probes being arranged such that, when the probes are bound to the analyte, they can interact with one another, the sequences being in the asterisks of the first and second hybridization probes are complementary to one another, that when the probes are bound to the analyte, hybridization between sequences from the asterisks from the first and the second probe can take place.
  • This reagent kit is preferably used for the method according to the invention.
  • Another way of reducing interference in cross-correlation is to carry out a time-resolved measurement by time gating.
  • This method can optionally also be carried out independently of the probes described above for the determination of (any) analytes by cross-correlation or coincidence analysis by means of optical excitation of several luminescent molecules in one or more confocal detection volumes.
  • several spectrally distinguishable marker groups bound to the analyte are repeated with a high pulse frequency, which is in the order of the dead time of the detector, preferably in the range from 1 0 to 0, 1 MHz (corresponding to time intervals of 0, 1 -10 ⁇ s), for example of about 1 MHz (corresponding to 1 ⁇ s).
  • You can do this by appropriate electronic background analysis, calculating a Correlation or / and coincidence curve "correctly" occurring correlation signals can be distinguished from background signals which are created by a newly desired interferer z (C rossal k) with the marker groups.
  • the invention preferably comprises the combination of three
  • Excitation laser (ii) combination of molecular beacon hybridization probes, such that energy transfer between the two marker groups of the hybridization probes can only take place when bound to the correct analyte and
  • the method is particularly suitable for the detection of single molecule analytes by confocal detection, preferably by means of fluorescence correlation spectroscopy. Due to the low concentrations of analytes and hybridization probes prevailing in the context of fluorescence correlation spectroscopy, there is almost no unspecific energy transfer between the two labeling groups. A high level of sensitivity can be achieved by suitable statistical data evaluation.
  • the method allows cross-correlation determination with only a single excitation light source, in particular a single laser. Undesired interference between the marker groups can be largely eliminated by using the molecular beacon probes. Overall, this leads to a significant increase in sensitivity compared to known fluorescence correlation spectroscopic detection methods.
  • Figure 1 shows an embodiment of the method according to the invention.
  • a sample containing a nucleic acid analyte (T) is brought into contact with a detection reagent, comprising two hybridization probes (S 1 f S 2 ), which are present as hairpin structures, each with an asterisk and a loop.
  • the probe S binds directly to the target nucleic acid T on the 3 'side of the probe S 2.
  • the probe S has a first fluorescent labeling group (F,) at its 3' end and a quench group (Q ⁇ at its 5 'end
  • the probe S 2 has a second fluorescent labeling group (F 2 ) at its 5 'end and a quench group (Q 2) at its 3' end, if the probes are not bound to the analyte (T) fluorescent marker groups and the Quench phenomenon in close spatial proximity, so that an originating from the fluorescent groups signal is at least deleted erise
  • T analyte
  • Q 2 quench group
  • the two fluorescent labeling groups (F 1 # F 2 ) are arranged in close spatial proximity to one another, since the 5'-sided stem section of S 2 can hybridize with the 3'-sided stem section of S ,. Because of this spatial proximity, there is the possibility that the two fluorescent marker groups (F 1 # F 2 ) act as fluorescent donor and fluorescent acceptor groups, so that when the first group is excited, energy is transferred to the second group and a fluorescent radiation emitted by the second group is detected can.
  • Another aspect of the invention relates to a method for determining an analyte by cross-correlation or coincidence analysis by means of optical excitation of several luminescent, for example fluorescent Molecules in at least one confocal detection volume, comprising the steps:
  • Figure 2 shows an embodiment of this aspect of the invention.
  • Two spectrally different luminescent labeling groups e.g. a green (g) and a red (r) fluorescent marker group, sequentially excited at short clock intervals, which are of the order of the detector's dead time.
  • Green (g) and red (r) laser pulses are used for excitation.
  • a "correct" signal is when a green photon (g) is picked up with a green laser pulse and a red photon (r) with a red laser pulse. If, on the other hand, a red photon (r *) is caught with a green laser pulse, this is an undesirable interference (crosstalk).
  • This - with conventional ones Methods that cannot be resolved - event can be filtered out of the overall signal by suitable electronic measures, whereby a new correlation or coincidence curve can be determined. In this way a significant reduction in the background is achieved.

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Abstract

Das Verfahren betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Nukleinsäureanalyten durch Hybridisierung mit zwei oder mehreren Hybridisierungssonden.

Description

Verfahren zur Bestimmung eines Nukleinsaureanalyten
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Nukleinsaureanalyten durch Hybridisierung mit zwei oder mehreren Hybridisierungssonden.
Die Verwendung von Molecular Beacons als Hybridisierungssonden zum Nachweis von Nukleinsäure-Zielmolekülen in einer Probe ist bekannt (siehe US-Patent 5,607,834). Molecular Beacons enthalten üblicherweise eine sogenannte Hairpinstruktur bestehend aus einem Stern mit zwei zueinander komplementären Sequenzabschnitten und einem Loop, eine Fluoreszenz- markierungsgruppe und eine Quenchgruppe. Die nicht mit dem Zielmolekül bindefähige Stemsequenz dient dazu, die Fluoreszenzmarkierungsgruppe und die Quenchgruppe in Nachbarschaft zu halten, wenn die Sonde nicht an den Analyten gebunden ist. Auf diese Weise werden Photonen, die durch die Fluoreszenzmarkierungsgruppe absorbiert werden, nicht als Fluoreszenzphotonen emittiert, sondern die Energie wird auf die Quenchgruppe übertragen. Die Loop-Sequenz ist mit dem nachzuweisenden Zielmolekül komplementär. Bei Bindung der Sonde an das Zielmolekül öffnet sich der Loop und hybridisiert mit dem Zielmolekül. Auf diese Weise wird die Fluoreszenzmarkierungsgruppe aus der Nachbarschaft der Quenchgruppe entfernt, wodurch Fluoreszenz auftritt und gemessen werden kann. Molecular Beacons werden insbesondere für homogene Nachweisverfahren eingesetzt, bei denen es nicht möglich oder wünschenswert ist, Hybridisierungsprodukte der Zielnukleinsäure und der Sonde aus einem Überschuss der Hybridisierungssonden zu isolieren, wie etwa bei der Echtzeit-Überwachung von Polymerase-Kettenreaktionen. Weiterhin ist die Verwend ung einer Kombinationen von Hybridisierungssonden in einem Nachweisverfahren bekannt, wobei eine Sonde eine Fluoreszenz-Donorgruppe und die andere Sonde eine Fluoreszenz-Akzeptorgruppe trägt. Bei der Hybridisierung beider Sonden an eine Ziel-Nukleinsäure kann ein nachweisbarer Energietransfer zwischen Donor- und Akzeptorgruppe erfolgen (siehe z.B. US-Patent 4,996, 143).
Bei einem Nachweis von Ziel-Nukleinsäuremolekülen durch gleichzeitige Bindung von zwei oder mehr unterschiedlichen Hybridisierungssonden sind unerwünschte Wechselwirkungen (Anregung mit einer Wellenlänge, aber Nachweis in beiden Kanälen) ein großes Problem, das zu einer Verschlechterung der Sensitivität und einer Erhöhung der Messdauer führt. Dieses Problem besteht insbesondere bei der Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie, bei der nur wenige Moleküle bzw. sogar nur Einzelmoleküle nachgewiesen werden sollen.
Eine der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht darin, ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäure-Analyten zu entwickeln, bei dem die oben genannten Nachteile zumindest teilweise vermieden werden können.
Diese Aufgabe wird durch Verwendung von mindestens zwei miteinander ko r res p o nd i e re nd e n H y b ri d i s i e ru n g sso n d e n g e l ö st . D i ese korrespondierenden Hybridisierungssonden werden derart ausgewählt, dass sie eine Hairpinstruktur aufweisen, wobei die Loop-Abschnitte der Hairpins die zu einem Nukleinsäure-Analyten komplementären Sondensequenzen umfassen. Die Sterns werden durch zwei zueinander komplementäre Armsequenzen gebildet, die an den Enden der Sondensequenzen angeordnet sind. Darüber hinaus sind die Sterns beider Sondenmoleküle komplementär untereinander. Die Auswahl von Stern- und Loopsequenzen ist derart, dass ein zwischen dem Loop und einer komplementären Sequenz des Analyten gebildetes Hybrid stabiler als das Hybrid der komplementären Sequenzen der Sterns ist. Dies kann durch entsprechende Einstellung der Länge oder/und des G/C-Anteils der jeweiligen hybridisierenden Bereiche erfolgen.
Beide Hybridisierungssonden werden weiterhin so ausgewählt, dass sie benachbart zueinander, vorzugsweise in unmittelbarer Nachbarschaft ohne Zwischenraum zwischen an den Analyten binden, wobei die benachbarten Stemabschnitte der Sonden zusätzlich miteinander hybridisieren. Eine erste Markierungsgruppe ist vorzugsweise 3'-Ende der ersten Sonde angebracht und eine zweite Markierungsgruppe ist vorzugsweise am 5'-Ende der zweiten Sonde angebracht. Nach Hybridisierung an den Analyten und der zusätzlichen Hybridisierung zwischen den beiden Sonden hält der Stern die beiden Markierungsgruppen, vorzugsweise Lumineszenz- bzw. Fluoreszenzmarkierungsgruppen, in geringem räumlichen Abstand zueinander. Auf diese Weise ist eine Wechselwirkung zwischen beiden Markierungsgruppen, beispielsweise ein Energietransfer zwischen einer Energiedonor- und einer Energieakzeptorgruppe, möglich. So kann eine Lumineszenz- bzw. Fluoreszenz-Donorgruppe mit einem Laser angeregt werden, die ihre Energie auf die Akzeptorgruppe überträgt und diese zur Fluoreszenz anregt. Die Fluoreszenz der Akzeptorgruppe wird dann nachgewiesen. Alternativ oder zusätzlich kann die Analyse des Messsignals eine zeitaufgelöste Bestimmung umfassen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung eines Nukleinsäure-Analyten in einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Probe, die den Analyten enthalten kann,
(b) Bereitstellen von mindestens zwei mit dem Analyten bindefähigen Hybridisierungssonden, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen tragen, und, wenn sie nicht an den Analyten gebunden sind, in einer Hairpinstruktur umfassend einen Stern mit zwei zueinander komplementären Abschnitten und einen Loop umfassend die mit den Analyten bindefähige Sequenz vorliegen, wobei eine erste Hybridisierungssonde benachbart von einer zweiten Hybridisierungssonde an den Analyten binden kann, wobei die Markierungsgruppen der beiden Hybridisierungssonden derart angeordnet sind, dass sie, wenn die Sonden an den Analyten gebunden sind, eine Wechselwirkung miteinander eingehen können, wobei die Sequenzen in den Sterns der ersten und zweiten Hybridisierungssonden untereinander komplementär sind, dass, wenn die Sonden an den Analyten gebunden sind, eine Hybridisierung zwischen Sequenzen aus den Sterns der ersten und der zweiten Sonde erfolgen kann,
(c) Inkontaktbringen der Probe mit den Hybridisierungssonden unter Bedingungen, bei denen eine Hybridisierung der Sonden mit dem Analyten erfolgen kann, und
(d) Nachweisen der gleichzeitigen Hybridsierung von mindestens zwei Sonden mit dem Analyten.
Die durch das Verfahren bestimmten Nukleinsäure-Analyten, z.B. DNA oder/und RNA, können aus biologischen Proben, insbesondere aus Säugern, wie dem Menschen, aber auch aus anderen Organismen, z.B. Mikroorganismen, stammen. Darüber hinaus können auch Analyten nachgewiesen werden, die in vitro aus biologischen Proben erzeugt worden sind, cDNA-Moleküle, die durch reverse Transkription aus mRNA hergestellt worden sind. Die für das Verfahren verwendete Probe stammt vorzugsweise aus einem Organismus, z.B. aus Gewebe oder Körperflüssigkeit eines Organismus, insbesondere aus einem Menschen.
Das Verfahren kann beispielsweise zu einer Analyse der Genexpression, z. B. zur Ermittlung eines Genexpressionsprofils, oder zur Analyse von Mutationen, z.B. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP), eingesetzt werden. Das Verfahren eignet sich jedoch auch zur Bestimmung enzymatischer Reaktionen an Nukleinsäuren, beispielsweise zur Bestimmung von Nukleinsäureamplifikationsreaktionen, insbesondere in einem oder mehreren Thermocycling-Prozessen.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Hybridisierungssonden sind vorzugsweise Oligonukleotide, insbesondere DNA-Moleküle. Es können jedoch auch entsprechende Nukleinsäureanaloga, wie etwa Peptidnukleinsäuren (PNA), Locked Nukleinsäuren (LNA) oder andere Nukleotidanaloga, eingesetzt werden. Die Länge der Hybridisierungssonden kann grundsätzlich wie bei bekannten Sonden gewählt werden und liegt üblicherweise im Bereich von 20 bis 200 Nukleotiden.
Die Hybridisierungssonden beinhalten Markierungsgruppen, vorzugsweise Fluoreszenzmarkierungsgruppen, die sich mindestens in einem Messparameter, insbesondere ausgewählt aus Emissionswellenlänge und Dauer der Fluoreszenz, unterscheiden. Besonders bevorzugt enthält eine Sonde eine Donormarkierungsgruppe und die andere Sonde eine Akzeptormarkierungsgruppe, wobei ein Energietransfer zwischen Donor- und Akzeptormarkierungsgruppe stattfinden kann.
Der Nachweis der Analyten erfolgt dadurch, dass die Bindung beider Sonden an den Analyten ermittelt wird. Vorzugsweise umfasst die Bestimmung den Nachweis eines Energietransfers zwischen den Markierungsgruppen der ersten und zweiten Sonde. Geeignete Kombinationen von Donor- und Akzeptormarkierungsgruppen für einen derartigen Energietransfers (FRET) sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. US-Patent 4,996,143).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann jedoch auch eine sogenannte Kreuzkorrelationsbestimmung umfassen, bei der mindestens zwei unterschiedliche Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, eingesetzt werden, deren korreliertes Signal bestimmt wird. Die grundsätzliche Durchführung einer solchen Kreuzkorrelationsbestimmung ist beispielsweise bei Schwüle et al. (Biophys. J. 72 ( 1 997), 1 878-1 886) und Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 ( 1 998), 97-1 09) beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, dass man eine Kombination von Hybridisierungssonden verwendet, die an benachbarte Sequenzabschnitte des Analyten hybridisieren. Vorzugsweise verwendet man eine Kombination von Sonden, wobei die erste Sonde an einen Bereich des Analyten bindet, der unmittelbar 3'-seitig desjenigen Bereichs liegt, an den die zweite Sonde bindet. In diesem Fall trägt die erste Sonde ihre Markierungsgruppe günstigerweise unmittelbar in ihrem 3'-Ende und die zweite Sonde ihre Markierungsgruppe am 5'-Ende. Auf diese Weise liegt bei der Bindung beider Sonden an den Analyten ein oder sehr geringer Abstand zwischen beiden Markierungsgruppen vor, durch den eine We c h s e l w i r ku n g , z . B . E n e rg i etra n sf e r zw i sc h e n be i d e n Markierungsgruppen, erleichtert wird.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Hybridisierungssonden sind vorzugsweise sogenannte Molecular Beacons, die bei Bindung an den Analyten eine Steigerung der Signalstärke der Markierungsgruppe aufweisen. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, wenn das Signal der Markierungsgruppe durch das Vorhandensein einer Quenchgruppe auf der Sonde mindestens teilweise gelöscht wird, wenn die Sonde nicht an den Analyten gebunden ist. Die Steigerung der Signalstärke erfolgt vorzugsweise um mindestens den Faktor 2, besonders bevorzugt mindestens um den Faktor 5.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise mit geringen Konzentrationen des in der Probe vorhandenen Analyten bzw. der Hybridisierungssonden sowie mit einem sehr geringem Probenvolumen durchgeführt. Das Probenvolumen liegt vorzugsweise im Bereich von < 1 0"6 I und besonders bevorzugt < 10~8 1. Zur Bestimmung solcher Proben kann als Träger eine Mikrowellstruktur mit mehreren Vertiefungen zur Aufnahme von Probeflüssigkeit verwendet werden, wobei die einzelnen Wells beispielsweise einen Durchmesser zwischen 10 und 1 000 μm aufweisen. Geeignete MikroStrukturen sind z.B. in DE 1 00 23 421 .6 und DE 1 00 65 632.3 beschrieben. Weiterhin kann der Träger Temperatur- Steuerungselemente, z.B. Peltier-Elemente, beinhalten, die eine Temperaturregelung des Trägers oder/und einzelner Probebehältnisse darin ermöglichen.
Der für das Verfahren verwendete Träger ist zweckmäßigerweise so ausgestattet, dass er eine optische Detektion der Probe ermöglicht. Vorzugsweise wird daher ein zumindest im Bereich der Probenbehältnisse optisch transparenter Träger verwendet. Der Träger kann dabei entweder vollständig optisch transparent sein oder eine optisch transparente Basis und eine optisch undurchlässige Deckschicht mit Aussparungen in den Probenbehältnissen enthalten. Geeignete Materialien für Träger sind beispielsweise Verbundstoffträger aus Metall (z.B. Silizium für die Deckschicht) und Glas (für die Basis) . Derartige Träger können beispielsweise durch Aufbringen einer Metallschicht mit vorgegebenen Aussparungen für die Probenbehältnisse auf das Glas erzeugt werden. Alternativ können Plastikträger, z.B. aus Polystyrol oder Polymeren auf Acrylat-oder Methacrylatbasis, eingesetzt werden. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Träger eine Abdeckung für die Probenbehältnisse aufweist, um während der Messung ein geschlossenes und von der Umgebung im Wesentlichen isoliertes System bereitzustellen.
Weiterhin können im Träger elektrische Felder, insbesondere im Bereich der Probenbehältnisse, erzeugt werden, um eine Konzentrierung der zu bestimmenden Analyten im Messvolumen zu erreichen. Beispiele für Elektroden, die zur Erzeugung solcher elektrischer Felder geeignet sind, sind z.B. in DE 101 03 304.4 beschrieben. Besonders bevorzugt erfolgt der Nachweis des Analyten durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS). Dabei erfolgt vorzugsweise die Messung von einem oder wenigen Analytmolekülen in einem Messvolumen, welches Teil des Probenvolumens ist, wobei die Konzentration der zu bestimmenden Analytmoieküle vorzugsweise <10"6 mol/l beträgt und das Messvolumen vorzugsweise <10"14 I ist. Es werden dabei von den Markierungsgruppen der Hybridisierungssonden stammende Messignale durch Lumineszenzmessung ermittelt. Auf Einzelheiten zu apparativen Details des Verfahrens und zur Durchführung des Verfahrens geeigneter Vorrichtungen wird auf EP-B-0679251 verwiesen.
Alternativ kann die Detektion auch durch zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time/Gating erfolgen, wobei das Signal der Markierungsgruppen, z.B. die Fluoreszenz, innerhalb des Messvolumens angeregt werden und anschließend vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von >100 ps das Öffnen des Detektionsintervalls am Detektor erfolgt. Diese Messmethode ist beispielsweise von Rigler et al. in "Ultrafast Phenomena" D.H. Auston, Hrsg., Springer 1984, beschrieben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird eine konfokale Einzelmolekülanalyse so durchgeführt, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen in der Probenflüssigkeit und der Fokussieroptik der zur Anregung von Fluoreszenz-Markierungsgruppen in der Probenflüssigkeit verwendeten Lichtquelle >1 mm und die Probenflüssigkeit eine Lichtquelle, insbesondere von der Fokussier-Optik thermisch isoliert ist. Ein derartiges Verfahren und eine hierfür geeignete Vorrichtung ist beispielsweise in DE 101 11 420.6 beschrieben. Durch thermische Isolierung der Probenflüssigkeit von apparativen Komponenten kann die Temperatur der Probe unabhängig eingestellt und während des Verfahrens variiert werden. Somit können temperaturveränderliche Prozesse, z.B. die Bestimmung von Nukleinsäuren- Hybridisierungsschmelzkurven oder die Bestimmung von Nukleinsäure- Amplifikationsreaktionen, durchgeführt werden.
Der Träger ist vorzugsweise eine MikroStruktur mit mehreren, vorzugsweise mindestens 1 02 Behältnissen zur Aufnahme einer Probeflüssigkeit, wobei die Probeflüssigkeit in den separaten Behältnissen aus einer oder mehreren Quellen stammen kann. Das Einbringen der Probeflüssigkeit in die Behältnisse des Trägers kann z.B. mittels einer piezoelektrischen Flüssigkeitsabgabe- Vorrichtung erfolgen.
Die Behältnisse des Trägers sind so ausgestaltet, dass sie eine Bindung des Nachweisreagenz mit dem Analyten in Lösung ermöglichen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Behältnissen um Vertiefungen in der Trägeroberfläche, wobei diese Vertiefungen grundsätzlich eine beliebige Form aufweisen können, z.B. kreisförmig, quadratisch, rautenförmig etc. Der Träger kann auch 1 03 oder mehr separate Behältnisse umfassen.
Die optische Anregungseinrichtung umfasst eine stark fokussierte Lichtquelle, vorzugsweise einen Laserstrahl, der mittels entsprechender optischer Einrichtungen auf das Messvolumen in der Probenflüssigkeit fokussiert wird. Die Lichtquelle kann auch zwei oder mehrere Laserstrahlen enthalten, die dann jeweils vor Eintritt in die Probeflüssigkeit durch unterschiedliche Optiken auf das Messvolumen fokussiert wird. Die Detektionseinrichtung kann beispielsweise einen fasergekoppelten Avalanche-Fotodiodendetektor oder einen elektronischen Detektor enthalten. Es können jedoch auch Anregungs- oder/und Detektions- Matrices, bestehend aus einer Punktmatrix von Laserpunkten, erzeugt durch eine Diffraktionsoptik oder einen Quanten-Well-Laser sowie einer Detektormatrix, erzeugt durch eine Avalanche-Fotodiodenmatrix oder elektronische Detektormatrix, z.B. eine CCD-Kamera, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Lichtquelle einen oder mehrere Laserstrahlen, die mittels Leiten durch ein oder mehrere diffraktionsoptische Elemente in multiple Foci aufgespalten werden, wie in DE 101 26083.0 beschrieben.
Der Träger kann in vorgefertiger Form bereits gestellt werden, wobei in mehrere separate Behältnisse des Trägers lumineszenzmarkierte Nachweisreagenzien, vorzugsweise lumineszenzmarkierte Hybridisierungssonden bzw. -primer, eingefüllt werden. Anschließend wird der die Nachweisreagenzien enthaltende Träger günstigerweise getrocknet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein vorgefertigter Träger bereitgestellt, der eine Vielzahl von separaten, z.B.100 Behältnissen enthält, in die jeweils unterschiedliche Nachweisreagenzien, z.B. Reagenzien zum Nachweis einer Nukleinsäurehybridisierung, wie Primer oder/und Sonden, eingefüllt vorliegen. Dieser Träger kann dann mit einer aus einem zu untersuchenden Organismus, z.B. einem menschlichen Patienten, stammenden Probe gefüllt werden, so dass in den jeweiligen Behältnissen unterschiedliche Analyten aus einer einzigen Probe bestimmt werden. Derartige Träger können beispielsweise zur Erstellung eines Genexpressionsprofils, z.B. für die Diagnostik von Krankheiten, oder zur Bestimmung von Nukleinsäurepolymorphismen, z.B. zum Nachweis einer bestimmten genetischen Prädisposition, verwendet werden.
Vorzugsweise werden als Markierungsgruppen Fluoreszenzmarkierungen verwendet, wie etwa Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, CY3, CY5 oder Derivate davon. Die Unterscheidung der Fluoreszenzmarkierungsgruppen kann über die Emissionswellenlänge, über die Lebensdauer der angeregten Zustände oder über eine Kombination davon erfolgen.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch einen Reagenzienkit zur Bestimmung von Nukleinsaureanalyten, umfassend mindestens zwei mit dem Analyten bindefähige Hybridisierungssonden, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen tragen, und, wenn sie nicht an den Analyten gebunden sind, in einer Hairpinstruktur umfassend einen Stern mit zwei zueinander komplementären Abschnitten und einen Loop umfassend die mit den Analyten bindefähige Sequenz vorliegen, wobei eine erste Hybridisierungssonde benachbart von einer zweiten Hybridisierungssonde an den Analyten binden kann, wobei die Markierungsgruppen der beiden Hybridisierungssonden derart angeordnet sind, dass sie, wenn die Sonden an den Analyten gebunden sind, eine Wechselwirkung miteinander eingehen können, wobei die Sequenzen in den Sterns der ersten und zweiten Hybridisierungssonden untereinander komplementär sind, dass, wenn die Sonden an den Analyten gebunden sind, eine Hybridisierung zwischen Sequenzen aus den Sterns aus der ersten und der zweiten Sonde erfolgen kann.
Dieser Reagenzienkit wird vorzugsweise für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt.
Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung von Interferenz bei der Kreuzkorrelation besteht darin, eine zeitaufgelöste Messung durch Time- Gating durchzuführen. Dieses Verfahren kann gegebenenfalls auch unabhängig von den zuvor beschriebenen Sonden für die Bestimmung von (beliebigen) Analyten durch Kreuzkorrelation oder Koinzidenzanalyse mittels optischer Anregung von mehreren lumineszierenden Molekülen in einem oder mehreren konfokalen Detektionsvolumina durchgeführt werden. Hierbei werden mehrere an den Analyten gebundene spektral unterscheidbare Markierungsgruppen repetitiv mit hoher Pulsfrequenz, die in der Größenordnung der Totzeit des Detektors liegt, vorzugsweise im Bereich von 1 0 bis 0, 1 MHz (entsprechend Zeitintervallen von 0, 1 -10 μs), z.B. von etwa 1 MHz (entsprechend 1 μs), angeregt. Dabei können durch entsprechende elektronische Hintergrundanalyse unter Berechnung einer Korrelations- oder/und Koinzidenzkurve " korrekt" auftretende Korrelationssignale von Hintergrundsignalen unterschieden werden, die d u rch ei n e u nerwünsc hte I nterferen z ( C rosstal k) beid er Markierungsgruppen entstehen.
Die Erfindung umfasst vorzugsweise die Kombination von drei
Technologien, nämlich:
(i) Mehrfarbendetektion, vorzugsweise unter Verwendung eines
Anregungslasers, (ii) Kombination von Molecular Beacon-Hybridisierungssonden, derart, dass nur bei Bindung an den richtigen Analyten ein Energietransfer zwischen den beiden Markierungsgruppen der Hybridisierungssonden erfolgen kann und
(iii) spezifischer Nachweis des Zielmoleküls durch multiple Laser- Anregung unter Erzeugung einer zum spezifischen Nachweis des Analyten geeigneten Koinzidenz-Funktion.
Das Verfahren eignet sich besonders beim Nachweis von Einzelmolekül- Analyten durch konfokale Detektion, vorzugsweise mittels Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie. Aufgrund der im Rahmen der Fluoreszenz- Korrelationspektroskopie vorherrschenden geringen Konzentrationen an Analyten und Hybridisierungssonden findet nahezu kein unspezifischer Energietransfer zwischen beiden Markierungsgruppen statt. Durch geeignete statistische Datenauswertung kann eine hohe Sensitivität erreicht werden. Das Verfahren erlaubt eine Kreuzkorrelationsbestimmung mit nur einer einzigen Anregungslichtquelle, insbesondere einem einzigen Laser. Unerwünschte Interferenzen zwischen den Markierungsgruppen können durch Verwendung der Molecular Beacon-Sonden weitgehend ausgeschaltet werden. Dies führt insgesamt zu einer signifikanten Erhöhung der Sensitivität gegenüber bekannten Fluoreszenz- korrelationsspektroskopischen Nachweisverfahren. Figur 1 zeigt eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens. Eine Probe, die einen Nukleinsaureanalyten (T) enthält, wird mit einem Nachweisreagenz in Kontakt gebracht, umfassend zwei Hybridisierungssonden (S1 f S2), die als Hairpin-Strukturen mit jeweils einem Stern und einem Loop vorliegen. Die Sonde S, bindet unmittelbar 3'-seitig der Sonde S2 an die Zielnukleinsäure T. Die Sonde S, weist an ihrem 3'- Ende eine erste Fluoreszenzmarkierungsgruppe (F,) und an ihrem 5'-Ende eine Quenchgruppe (Q^ auf. Die Sonde S2 weist an ihrem 5'-Ende eine zweite Fluoreszenzmarkierungsgruppe (F2) und an ihrem 3'-Ende eine Quenchgruppe (Q2) auf. Wenn die Sonden nicht an den Analyten (T) gebunden sind, befinden sich die Fluoreszenzmarkierungsgruppen und die Quenchgruppen in unmittelbarer räumlicher Nachbarschaft, so dass ein von den Fluoreszenzgruppen stammendes Signal zumindest teileise gelöscht wird. Bei Bindung an den Analyten wird die räumliche Nähe der Fluoreszenz-markierungsgruppen {F F2) gegenüber den Quenchgruppen (Q1 # Q2) aufgehoben, so dass sie eine höhere Fluoreszenzintensität aufweisen.
Bei Bindung an den Analyten sind die beiden Fluoreszenz- markierungsgruppen (F1 # F2) in unmittelbarer räumlicher Nähe zueinander angeordnet, da der 5'-seitige Stemabschnitt von S2 mit dem 3'-seitigen Stemabschnitt von S, hybridisieren kann. Aufgrund dieser räumlichen Nähe besteht die Möglichkeit, dass die beiden Fluoreszenzmarkierungsgruppen (F1 # F2) als Fluoreszenzdonor- und Fluoreszenzakzeptorgruppen wirken, so dass bei Anregung der ersten Gruppe ein Energietransfer auf die zweite Gruppe erfolgt und eine von der zweiten Gruppe emittierte Fluoreszenzstrahlung nachgewiesen werden kann.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten durch Kreuzkorrelation oder Koinzidenzanalyse mittels optischer Anregung von mehreren lumineszierenden, z.B. fluoreszierenden Molekülen in mindestens einem konfokalen Detektionsvolumen, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Probe, umfassend verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen, (b) Bestrahlen der Probe mit einer optischen Anregungs- und Fokussiereinrichtung, umfassend mehrere separate Lichtquellen jeweils zur Anregung einzelner Spezies von lumineszierenden Molekülen in mindestens einem konfokalen Detektionsvolumen, das Teil der Probe ist, wobei . die Einstrahlung von einzelnen Lichtquellen zu jeweils verschiedenen Zeitintervallen und repetitiv erfolgt und
(c) Auffangen von Emissionsstrahlung aus dem mindestens einen Messvolumen durch einen oder mehrere Detektoren und Auswerten der aufgefangenen Strahlung, wobei Signale, die während eines Zeitintervalls aufgefangen werden, in dem eine erste Spezies von lumineszierenden Molekülen angeregt wird, die aber von einer zweiten Spezies stammen, bei der Auswertung nicht berücksichtigt bzw. herausgefiltert werden.
Figur 2 zeigt eine Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung. Dabei werden 2 spektral unterschiedliche lumineszierende Markierungsgruppen, z.B. eine grüne (g) und eine rote (r) Fluoreszenzmarkierungsgruppe, sequenziell in kurzen Taktintervallen angeregt, die in der Größenordnung der Totzeit des Detektors sind. Zur Anregung werden jeweils grüne (g) und rote (r) Laserpulse verwendet.
Die auf dem oder den Detektor(en) auftreffenden Photonen werden ausgewertet. Ein "korrektes" Signal ist, wenn bei einem grünen Laserpuls ein grünes Photon (g) und bei einem roten Laserpuls ein rotes Photon (r) aufgefangen wird. Wenn hingegen beispielsweise bei einem grünen Laserpuls ein rotes Photon (r*) aufgefangen wird, handelt es sich um eine unerwünschte Interferenz (Crosstalk). Dieses - mit herkömmlichen Methoden nicht auflösbare - Ereignis kann durch geeignete elektronische Maßnahmen aus dem Gesamtsignal herausgefiltert werden, wodurch eine neue Korrelations- bzw. Koinzidenzkurve ermittelt werden kann. Auf diese Weise wird eine signifikante Verringerung des Hintergrunds erreicht.

Claims

Ansprüche
Verfahren zur Bestimmung eines Nukleinsäure-Analyten in einer Probe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Probe, die den Analyten enthalten kann,
(b) Bereitstellen von mindestens zwei mit dem Analyten bindefähigen Hybridisierungssonden, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen tragen, und, wenn sie nicht an den Analyten gebunden sind, in einer Hairpinstruktur umfassend einen Stern mit zwei zueinander komplementären Abschnitten und einen Loop umfassend die mit den Analyten bindefähige Sequenz vorliegen, wobei eine erste Hybridisierungssonde benachbart von einer zweiten Hybridisierungssonde an den Analyten binden kann, wobei die Markierungsgruppen der beiden Hybridisierungssonden derart angeordnet sind, dass sie, wenn die Sonden an den Analyten gebunden sind, eine Wechselwirkung miteinander eingehen können, wobei die Sequenzen in den Sterns der ersten und zweiten Hybridisierungssonden untereinander komplementär sind, dass, wenn die Sonden an den Analyten gebunden sind, eine Hybridisierung zwischen Sequenzen aus den Sterns aus der ersten und der zweiten Sonde erfolgen kann,
(c) Inkontaktbringen der Probe mit den Hybridisierungssonden unter Bedingungen, bei denen eine Hybridisierung der Sonden mit dem Analyten erfolgen kann, und
(d) Nachweisen der gleichzeitigen Hybridsierung von mindestens zwei Sonden mit dem Analyten.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierungssonden Fluoreszenzmarkierungsgruppen tragen, die sich in mindestens einem Messparameter, insbesondere ausgewählt aus Emissionswellenlänge oder/und Lebensdauer der
Fluoreszenz, unterscheiden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (d) den Nachweis eines Energietransfers zwischen den
Markierungsgruppen der ersten und zweiten Sonden umfasst.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Hybridisierungssonden verwendet, wobei die erste Sonde an einen Bereich des Analyten bindet, der unmittelbar 3'-seitig desjenigen Bereichs liegt, an den die zweite Sonde bindet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Sonde ihre Markierungsgruppe am 3'-Ende und die zweite Sonde ihre Markierungsgruppe am 5'-Ende enthält.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungsgruppe von zumindest einer Sonde eine geringere Signalstärke aufweist, wenn die Sonde nicht an den Analyten gebunden ist, als wenn die Sonde an den Analyten gebunden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal der Markierungsgruppe durch eine Quenchgruppe zumindest teilweise gelöscht wird, wenn die Sonde nicht an den Analyten gebunden ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (d) einen Nachweis durch konfokale Detektion umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis eine Einzelmoleküldetektion umfasst.
1 0. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (d) einen Nachweis durch Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie oder/und Time-Gating umfasst.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man eine einzige Lichtquelle zur Anregung der Markierungsgruppen verwendet.
1 2. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, d ass man mehrere Lichtquellen zur Anregung d er Markierungsgruppen verwendet.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Anregung der Markierungsgruppen verwendete(n) Lichtquelle(n) in Form von repetitiven Pulsen in die Probe eingestrahlt wird (werden).
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Frequenz der Pulse im Bereich von 10 bis 0,1 MHz liegt.
15. Reagenzienkitzur Bestimmung von Nukleinsaureanalyten, umfassend mindestens zwei mit dem Analyten bindefähige Hybridisierungssonden, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen tragen, und, wenn sie nicht an den Analyten gebunden sind, in einer Hairpinstruktur umfassend einen Stem mit zwei zueinander komplementären Abschnitten und einen Loop umfassend die mit den Analyten bindefähige Sequenz vorliegen, wobei eine erste Hybridisierungssonde benachbart von einer zweiten Hybridisierungssonde an den Analyten binden kann, wobei die Markierungsgruppen der beiden Hybridisierungssonden derart angeordnet sind, dass sie, wenn die Sonden an den Analyten gebunden sind, eine Wechselwirkung miteinander eingehen können, wobei die Sequenzen in den Sterns der ersten und zweiten Hybridisierungssonden untereinander komplementär sind, dass, wenn die Sonden an den Analyten gebunden sind, eine
Hybridisierung zwischen Sequenzen aus den Sterns aus der ersten und der zweiten Sonde erfolgen kann.
16. Verwendung eines Reagenzienkits nach Anspruch 15 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
7. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten durch Kreuzkorrelation oder Koinzidenzanalyse mittels optischer Anregung von mehreren lumineszierenden Molekülen in mindestens einem konfokalen Detektionsvolumen, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Probe, umfassend verschiedene Spezies von lumineszierenden Molekülen,
(b) Bestrahlen der Probe mit einer optischen Anregungs- und Fokussiereinrichtung, umfassend mehrere separate Lichtquellen jeweils zur Anregung einzelner Spezies von lumineszierenden Molekülen in mindestens einem konfokalen
Detektionsvolumen, das Teil der Probe ist, wobei die Einstrahlung von einzelnen Lichtquellen zu jeweils verschiedenen Zeitintervallen und repetitiv erfolgt und
(c) Auffangen von Emissionsstrahlung aus dem mindestens einen Messvolumen durch einen oder mehrere Detektoren und
Auswerten der aufgefangenen Strahlung, wobei Signale, die während eines Zeitintervalls aufgefangen werden, in dem eine erste Spezies von lumineszierenden Molekülen angeregt wird, die aber von einer zweiten Spezies stammen, bei der Auswertung nicht berücksichtigt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitintervalle jeweils im Bereich von 0, 1 -10 s liegen.
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