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WO2003056324A2 - Titrationsverfahren - Google Patents

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WO2003056324A2
WO2003056324A2 PCT/EP2002/014060 EP0214060W WO03056324A2 WO 2003056324 A2 WO2003056324 A2 WO 2003056324A2 EP 0214060 W EP0214060 W EP 0214060W WO 03056324 A2 WO03056324 A2 WO 03056324A2
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titrant
drop
titration
titration method
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Advalytix AG
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Definitions

  • the invention relates to a titration method for liquids, in which an analyte is associated with a titration amount of a titrant and a parameter is examined which changes when the titrant and analyte react.
  • the titrant In order to be able to carry out quantitative investigations, the titrant must be added to the analyte in very small amounts in order to be able to examine the change in parameters of the mixture as precisely as possible as a function of the amount of titrant. If only a small amount of material is available, many drops of small volume of the titrant must be reproducibly generated for the exact titration and combined in succession with the analyte. With increasingly smaller volumes, the flows are increasing laminar. Mixing the analyte with the titrant therefore turns out to be increasingly difficult with small volumes.
  • the object of the present invention is to provide a titration method which can be reproduced even with the smallest amounts of liquid in the range from one nanoliter to a few microliters and with which it is possible to titrate safely.
  • a drop of the analyte held together by its surface tension is applied to the essentially flat surface of a solid.
  • a titration amount of the titrant is brought into contact with the analyte drop for reaction, the amount of the titrant being smaller than the amount of the analyte drop.
  • a variable characteristic of the reaction between the titrant and analyte is measured. If necessary, a further small titration amount of the titrant is associated with the analyte in order to determine the change in the measured size with increasing amount of titrant.
  • solid body denotes both solid bodies made of crystalline material, for example LiNbO 3 or quartz, and structures made of other materials, for example plastic.
  • Both titrant and analyte can include pure liquids, mixtures, dispersions or suspensions, as well as liquids containing solid particles.
  • the titrant or the analyte biological material such as. B. cells, macromolecules, proteins, antibodies, antigens or DNA.
  • the analyte is a single drop which is held together by its surface tension.
  • the method according to the invention allows the macroscopic titration to be miniaturized by several orders of magnitude. With a limited amount of sample, the concentration can be much higher, so that the method according to the invention is suitable for the detection of the smallest sample amounts or for the analysis of the smallest volumes. Due to the small volumes in the range of a few nanoliters, the diffusion lengths are short and the reaction times are short.
  • a measurand z. B. serve the conductivity, the pH or the heat of reaction, which change when adding the titrant to the analyte.
  • an indicator can also be solved, the z. B. causes a color change. With a certain concentration ratio between titrant and analyte in the analyte drop, this indicator causes a color change.
  • Other measurands known from macroscopic titration can also be used.
  • the method according to the invention is preferably carried out on a solid-state chip, as described, for. B. is known from semiconductor technology. Such chips can be processed very easily with known techniques and allow the application z. B. of electrodes or functionalized layers using known lithographic techniques. Such chip units can be used in the context of “lab-on-the-chip” technology (cf. O. Müller, Laborwelt 1/2000, pages 36-38) in the miniaturization of chemical and biological processes. Several can be used on such a chip Analysis stations can be arranged with which the titration method according to the invention can be carried out or other analysis steps can be carried out, and integration with other units of a lab-on-the-chip is also easy to implement.
  • a surface sound wave is advantageously sent in the direction of the analysis point during the reaction between analyte and titrant.
  • the impulse transmission of a surface sound wave sets the liquid on the surface in motion and leads to its mixing.
  • the impulse of the surface sound wave is brought about by the mechanical deformation of the surface or by the interaction of changes in the electrical field caused by the mechanical deformation of the surface with charged or polarizable particles which may be present in the liquid.
  • the titrant can be brought into contact with the drop of analyte drop by drop using a pipetting robot or piezo dispenser.
  • a pipetting robot or piezo dispenser it is particularly simple and advantageous if drops of the titrant on the solid surface itself are moved in the direction of the analyte.
  • the movement of the titration amount in the direction of the analyte drop can also be triggered with the aid of a surface sound wave.
  • the movement on the surface through the impulse transmission of a surface sound wave enables a particularly directed and defined movement.
  • the suitable frequency of the surface sound wave depends on the diameter of the drop to be moved and can e.g. B. can be determined in preliminary tests.
  • the surface sound waves advantageously used to mix the liquid on the analysis point and / or to move the titration amount of the titrant to the analysis point can be generated with the help of one or more interdigital transducers on a piezoelectric solid surface, the radiation direction of which corresponds to the direction of the desired pulse transmission.
  • a piezoelectric surface can e.g. B. from a LiNbO 3 - or quartz crystal.
  • a piezoelectric coating, e.g. B. ZnO can be provided from a different material.
  • the surface can also be provided with a sufficiently thin, biocompatible protective layer.
  • a drop of the titrant is applied to the solid surface, which is held together due to its surface tension.
  • the small amount of the titrant is withdrawn from this drop and fed to the analyte drop on the analysis point, this small amount of titration of the titrant moving on the surface.
  • the analyte is advantageously brought to a specially functionalized analysis point on the solid surface, the surface of which is more wetted by the analyte than the surrounding solid surface.
  • Such an analysis point holds the drop of the analyte at a predetermined location, so that the analyte cannot flow apart or drift away.
  • the titrant drop serving as a reservoir from which the small amount of titration of the titrant which is fed to the analyte drop is drawn off, can be located on an anchor point on the surface of the solid which wets better with the liquid of the titrant than its surrounding solid surface. This ensures that the titrant remains at a certain point on the surface and does not leave it without external force.
  • the titration amount of the titrant which is fed to the analyte can advantageously be moved on the solid surface along a path whose surface wets the titrant better than its surrounding surface.
  • the titration quantity preferably moves on this path, so that a controlled movement is ensured.
  • Such a path can e.g. B. can be achieved by modulating the wetting properties, as described for the movement of amounts of liquid on surfaces in DE-A-100 55 318.
  • the reservoir drop on the anchor point can be passed through a path connected to the anchor point and / or the analysis point, the connection comprising an area so narrow that the reservoir drop on the anchor point does not leave the anchor point without external force due to its surface tension. If the reservoir drops are driven on this path to this narrow point by external force, it will tear off in a defined manner.
  • a reservoir drop e.g. B. also by the transmission of impulses from surface sound waves, are moved on the surface over one or more small surface sections, which are more wetted by the liquid of the titrant than their surroundings.
  • the area of this partial surface area is chosen so small that it is smaller than the contact area of the drop with the surface. If the reservoir drop is passed one or more times over such partial surface areas, a small amount of the titrant remains on these holding points and can be moved in the direction of the analyte drop for titration. In this way, a small amount of titration can be divided in a very simple and reproducible manner.
  • thermodynamic boundary conditions In order to prevent the small amounts of liquid from evaporating too quickly, the titration process for maintaining defined thermodynamic boundary conditions is advantageously carried out in a climatic chamber.
  • the method according to the invention enables the miniaturization of the macroscopic titration. Volumes ranging from a few nanoliters to several microliters can be titrated. In particular when using surface sound waves, in addition to moving the titrant on the surface, the surface sound wave can be used for mixing in order to make the titration result more reproducible. Analysis methods such as scintillation proximity assay (SPA) or fluorescence resonance energy transfer (FRET), as described in J. Osborn, Life Science News, March 2001, pages 1-4, “A review of radioactive and non-radioactive-based techniques used in life science applications - Part II "High-throughput screening”.
  • SPA scintillation proximity assay
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • FIG. 2 shows another embodiment of the titration method according to the invention
  • Figure 4 shows a process step in a preferred embodiment of the titration method according to the invention.
  • Figure 1 shows a solid state chip, for. B. a piezoelectric lithium niobatch chip 5, on whose surface 7 the titration method according to the invention can be carried out.
  • a drop 1 of an analyte in the order of magnitude of 0.5 nl to 100 nl is located on an analysis point 15, the wetting properties of which differ from its surroundings.
  • the analyte include e.g. B. an aqueous solution
  • the analysis point 15 is hydrophilic compared to the surrounding solid surface. This can e.g. B. can be achieved by making the surrounding surface hydrophobic by silanization.
  • For a typical amount of liquid from 0.5 nl to 10 nl is suitable for.
  • a reservoir drop 3 of the titrant solution is located on an anchor point 16.
  • the anchor point 16 is also designed such that it wets more with the titrant solution than the
  • Analysis point 15 and anchor point 16 are connected to one another via a path 18, which likewise has such wetting properties that it wets better with the titrant solution than the surrounding solid surface.
  • the path 18 is restricted at the narrow points 14, 12 such that the drops located on the anchor point 16 or analysis point 15 do not leave the analysis point 15 or the anchor point 16 without external force due to their surface tension.
  • interdigital transducers which are suitable for exciting surface sound waves on the surface 7 of the lithium niobate crystal 5.
  • the interdigital transducers consist of two electrodes with finger-like interlocking extensions. Creating an alternating field z. B. in the order of 100 MHz to the electrodes of an interdigital transducer leads to the excitation of a surface sound wave with a wavelength that corresponds to the finger spacing of the interdigitated electrodes and the direction of propagation is substantially perpendicular to the finger electrodes.
  • interdigital transducers 9 this is indicated schematically by arrow 10, for example.
  • Each transducer comprises a large number of interlocking fingers, only a few of which are shown schematically and not to scale. Other transducer geometries can also be used, as are known from the technology of surface acoustic wave filters.
  • the interdigital transducers 9 are aligned in such a way that a surface sound wave excited by them moves in the direction of the analysis point 15.
  • the interdigital transducer 11 causes a surface acoustic wave in the direction 19.
  • the interdigital transducer 13 finally effects a surface acoustic wave in the direction 21.
  • the electrical connections are not shown to the electrodes of the interdigital transducers, which are provided in a conventional manner.
  • FIG. 23 shows a schematic representation of the tip of a piezo dispenser known per se for applying the reservoir drop 3 of the titrant to the anchor point 16.
  • the outflow of the liquid from the dispenser tip 23 is indicated by the arrow 24.
  • the method according to the invention can be carried out as follows on the device shown.
  • a drop of analyte 1 is applied to analysis point 15 using a dispenser head tip (not shown) similar to dispenser tip 23. Due to the specially selected wetting properties of the analysis point 15 compared to the wetting properties of the surrounding solid surface 7, the drop 1, which is held together by its surface tension, does not leave the analysis point 15.
  • a drop of the titrant 3 is applied to the anchor point 16 with the dispenser tip 23. Also due to its surface tension and the wetting properties of the anchor point in comparison to the wetting properties of the surrounding solid surface 7 (e.g. hydrophilic in comparison to the surrounding solid surface in the case of an aqueous titrant solution), this drop 3 does not leave the anchor point 16.
  • the volumes of analyte or titrant applied can range from one picoliter to several 100 microliters.
  • the impulse transmission of the surface sound wave moves the drop 3 in the direction of the constriction 14, which connects the anchor point 16 with the path 18.
  • a small amount of the drop 3 moves over the constriction 14 and tears off in a defined manner when dimensioned accordingly.
  • the necessary reduction in width at the constriction 14 can, for. B. have been determined by preliminary tests.
  • the dismissed separated amount of titrants can e.g. B. be a few nanoliters, but should be less than about a tenth of the amount of analyte at analysis point 15.
  • the withdrawn part 17 of the titrant, the titration amount, also moves away from the anchor point 16 by means of pulse transmission of the surface sound wave, which is generated with the interdigital transducer 13. With the aid of a second transducer 11, the movement of the small titration quantity of the titrant in the direction of the analysis point 15 is continued.
  • the small amount of titrant 17 strikes the analyte drop 1 at the analysis point 15.
  • a surface sound wave which is generated by one of the interdigital transducers 9, the reaction between the titrant and analyte can be accelerated.
  • the surface sound wave can be detected after passing through the analysis point 15.
  • the reaction of the analyte with the titrant can, for. B. have changed the attenuation of the surface sound wave, so that information about the reaction can be obtained.
  • the exact amount of analyte on the analysis point 15 can be determined from the attenuation of a surface sound wave by comparison with corresponding reference measurements.
  • a surface acoustic wave can be sent from each of the interdigital transducers 9 in the direction of the analysis point 15 in order to accelerate the reaction or to effectively mix the liquid.
  • a correspondingly pulsed surface sound wave which is generated with the interdigital transducer 13
  • a plurality of small titrant quantities 17 can be moved in a defined manner in the direction of the analysis point 15 in the manner described for carrying out a titration 1.
  • the method according to the invention can be used, inter alia, to carry out ITC (isothermal calorimetric titration) or DSC (differential scanning calorimetry), as described by I. Jelesarov and HR Bosshard in J. Mol. Recognit. 1999; 12: 3-18 are described in a review article.
  • ITC isothermal calorimetric titration
  • DSC differential scanning calorimetry
  • FIG. 2 does not show the transducers 9 that may be provided for mixing.
  • the same reference numerals otherwise designate the same elements as in FIG. 1.
  • the conductivity of the analyte 1 is measured for titration.
  • electrodes 25 are provided on the surface 7 of the solid-state chip 5 and are connected to the analysis point 15. Electrical connections lead to a conductivity measuring device 27.
  • the successive addition of titrant in small quantities 17 changes the conductivity of the analysis drop 1, which can be determined with the help of the conductivity measuring device 27.
  • analysis point 15 is made of non-conductive material.
  • FIG. 3 shows a further procedure according to the invention.
  • an optical measurement is carried out.
  • the transducers 9 that may be provided for mixing are not shown.
  • a light-emitting diode 31 or another suitable light source illuminates the solid-state chip 5 from below.
  • the optical signal is collected and forwarded to an evaluation device (not shown) and evaluated in a manner known per se.
  • the color change of an analyte can be measured in which an indicator is dissolved, which changes after adding a certain amount of titrants. If a non-transparent substrate is used, the light path can also be chosen parallel to the surface 7 of the chip 5.
  • FIGS. 1 to 3 are illustrations of comparable elements as in FIGS. 1 to 3.
  • a reservoir drop 3 is located on one of the anchor points 16.
  • the reservoir drop is generated by pulse transmission of a surface acoustic wave which is generated with the interdigital transducer 13 which is closest to the corresponding anchor point 16 3 driven in the direction of the second anchor point 16.
  • the impulse transmission of another surface sound wave, which is generated with the interdigital transducer 13, which is closest to the second anchor point the reservoir drop is driven back again. He moves back and forth along the indicated route 43.
  • a surface area 41 it crosses one or more times a surface area 41, the area of which is smaller than the contact area of the reservoir drop 3 with the solid surface 7.
  • This surface area 41 has such wetting properties that the liquid of the reservoir drop 3 wets it more than its surrounding solid surface. After the surface area 41 has been crossed one or more times, a small amount of titrant 17 has detached from the reservoir drop 3. In the case of an aqueous titrant solution, the surface area 41 has, for. B. hydrophilic properties.
  • the reservoir drop 3 and the titrant drop 17 can be moved along paths which are preferably wetted, as have already been described with reference to FIGS. 1 to 3 and are designated there with the reference symbol 18. Such paths advantageously have a lateral extent which is smaller than the diameter of the surface area 41. However, the method according to the invention and the described separation of the small amount of titrants 17 can be done even without such paths, so that they are not shown in Figure 4.
  • FIG. 4 With the method shown in Figure 4 z. B. 20 picoliter small droplets 17 from a reservoir drop 3 with 50 nanolitem. A plurality of surface regions 41 can be provided on the path of the reservoir drop 3 if a plurality of titrant quantities 17 are to be separated off at the same time. Depending on the property of the liquid to be manipulated in the reservoir drop 3, suitable geometries for the surface area 41 can be determined by appropriate preliminary tests, for. B. circular or annular.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Titrationsverfahren für kleinste Flüssigkeitsmengen, bei dem ein durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltener Tropfen (1) eines Analyten auf die im wesentlichen ebene Oberfläche (7) eines Festkörpers, vorzugsweise eines Festkörperchips, aufgebracht wird, eine Menge (17) des Titranten mit dem Analyttropfen (1) zur Reaktion in Kontakt gebracht wird, die kleiner ist als die Menge des Analyttropfens, und eine für die Reaktion zwischen Titrant und Analyt charakteristische Grösse während und/oder nach der Reaktion gemessen wird.

Description

Titrationsverfahren
Die Erfindung betrifft ein Titrationsverfahren für Flüssigkeiten, bei dem ein Analyt mit einer Titrationsmenge eines Titranten in Verbindung gebracht wird und ein Parameter untersucht wird, der sich bei Reaktion von Titrant und Analyt ändert.
In der Biologie und Chemie müssen häufig kleinste Flüssigkeitsmengen auf diese Weise analysiert werden. Mögliche Meßgrößen sind z. B. der pH-Wert der Flüssigkeit, die Konzentration von Molekülen mit oxidierenden oder reduzierenden Gruppen oder auch von Schwermetallen.
Oftmals stehen von den zu untersuchenden Materialien nur äußerst geringe Mengen zur Verfügung. Um quantitative Untersuchungen machen zu können, muß der Titrant dem Analyten in sehr kleinen Mengen zugeführt werden, um möglichst genau die Änderung von Parametern des Gemisches durch Zugabe des Titranten in Abhängigkeit der Titrantenmenge untersuchen zu können. Ist nur wenig Material vorhanden, so müssen zur genauen Titration viele Tropfen geringen Volumens des Titranten reproduzierbar erzeugt und nacheinander mit dem Analyten vereinigt werden. Bei zunehmend kleineren Volumina sind die Strömungen zunehmend laminar. Ein Mischen des Analyten mit dem Titranten stellt sich bei kleinen Volumina daher als zunehmend schwierig heraus.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Titrationsverfahren anzugeben, das auch mit kleinsten Flüssigkeitsmengen im Bereich von einem Nanoliter bis wenigen Mikrolitem reproduzierbar ist und mit dem man sicher titrieren kann.
Diese Aufgabe wird mit einem Titrationsverfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Die Unteransprüche sind auf vorteilhafte Ausgestaltungen gerichtet.
Erfindungsgemäß wird ein durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltener Tropfen des Analyten auf die im wesentlichen ebene Oberfläche eines Festkörpers aufgebracht. Eine Titrationsmenge des Titranten wird mit dem Analyttropfen zur Reaktion in Kontakt gebracht, wobei die Menge des Titranten kleiner ist als die Menge des Analyttropfens. Während oder nach der Reaktion wird eine für die Reaktion zwischen Titrant und Analyt charakteristische Größe gemessen. Gegebenenfalls wird eine weitere kleine Titrationsmenge des Titranten mit dem Analyten in Verbindung gebracht, um die Änderung der gemessenen Größe mit zunehmender Titrantenmenge zu bestimmen.
Für die Zwecke der vorliegenden Schrift bezeichnet der Begriff „Festkörper" sowohl Festkörper aus kristallinem Material, z. B. LiNbO3 oder Quarz, als auch Strukturen aus anderen Materialien, z. B. Kunststoff.
Sowohl Titrant als auch Analyt können dabei unter anderem reine Flüssigkeiten, Mischungen, Dispersionen oder Suspensionen, sowie Flüssigkeiten, in denen sich feste Teilchen befinden, umfassen. Ebenso können der Titrant bzw. der Analyt biologisches Material, wie z. B. Zellen, Makromoleküle, Proteine, Antikörper, Antigene oder DNA enthalten.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der Analyt ein einzelner Tropfen, der durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird. Es sind keine Reaktionsgefäße notwendig, die die Titration z. B. durch Adhäsion negativ beein- flussen könnten. Es besteht keine Randwechselwirkung mit ggf. vorhandenen Gefäßseitenwänden und die Titration sehr kleiner Flüssigkeitsmengen wird ermöglicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt eine Miniaturisierung der makroskopischen Titration um mehrere Größenordnungen zu. Es kann bei begrenzter Probenmenge die Konzentration sehr viel höher sein, so daß sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis kleinster Probenmengen bzw. zur Analyse kleinster Volumina eignet. Aufgrund der kleinen Volumina im Bereich von einigen Nanolitern sind die Diffusionslängen klein und die Reaktionszeiten kurz.
Als Meßgröße können z. B. die Leitfähigkeit, der pH-Wert oder die Reaktionswärme dienen, die sich bei Zugabe des Titranten zum Analyten ändern. Im Analyten kann ferner ein Indikator gelöst sein, der z. B. einen Farbumschlag bewirkt. Bei einem bestimmten Konzentrationsverhältnis zwischen Titrant und Analyt im Analyttropfen wird durch diesen Indikator ein Farbumschlag bewirkt. Andere aus der makroskopischen Titration bekannte Meßgrößen können ebenfalls eingesetzt werden.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren auf einem Festkörperchip durchgeführt, wie er z. B. aus der Halbleitertechnik bekannt ist. Solche Chips lassen sich mit bekannten Techniken sehr einfach prozessieren und erlauben die Aufbringung z. B. von Elektroden oder funktionalisierten Schichten mit bekannten lithographischen Techniken. Solche Chipeinheiten können im Rahmen der „lab-on- the-chip"-Technologie (vgl. O. Müller, Laborwelt 1/2000, Seiten 36-38) bei der Miniaturisierung chemischer und biologischer Prozesse eingesetzt werden. Auf einem solchen Chip können mehrere Analysestationen angeordnet sein, mit denen das erfindungsgemäße Titrationsverfahren durchgeführt werden kann bzw. andere Analyseschritte vorgenommen werden können. Außerdem ist eine Integration mit anderen Einheiten eines Lab-on-the-chip leicht realisierbar.
Wird die Titrationsmenge des Titranten z. B. mit einem Pipettierroboter bzw. einem Piezodispenser auf die Oberfläche aufgebracht, so wird die kleine Menge des Analyttropfens bereits durch den Aufprall der Titerlösung auf den Analyt teilweise gemischt. Um die Reaktion zwischen Titrant und Analyt zu befördern bzw. auf einem Analysepunkt befindliche Flüssigkeit zu durchmischen, wird während der Reaktion zwischen Analyt und Titrant vorteilhafterweise eine Oberflächenschallwelle in Richtung des Analysepunktes geschickt. Der Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle versetzt die Flüssigkeit auf der Oberfläche in Bewegung und führt zu deren Durchmischung. Der Impuls der Oberflächenschallwelle wird dabei durch die mechanische Deformation der Oberfläche oder durch die Wechselwirkung von durch die mechanische Deformation der Oberfläche hervorgerufenen Änderungen des elektrischen Feldes mit ggf. in der Flüssigkeit vorhandenen geladenen oder polarisierbaren Teilchen bewirkt.
Der Titrant kann tropfenweise mit Hilfe eines Pipettierroboters oder Piezodispen- sers mit dem Analytentropfen in Verbindung gebracht werden. Besonders einfach und vorteilhaft ist es jedoch, wenn Tropfen des Titranten auf der Festkörperoberfläche selbst in Richtung des Analyten bewegt werden. Die Bewegung der Titrationsmenge in Richtung des Analytentropfens kann ebenfalls mit Hilfe einer Oberflächenschallwelle ausgelöst werden. Die Bewegung auf der Oberfläche durch den Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle ermöglicht eine besonders gerichtete und definierte Bewegung. Die geeignete Frequenz der Oberflächenschallwelle hängt vom Durchmesser des zu bewegenden Tropfens ab und kann z. B. in Vorversuchen bestimmt werden.
Die zur Durchmischung der Flüssigkeit auf dem Analysepunkt und/oder zur Bewegung der Titrationsmenge des Titranten zum Analysepunkt vorteilhafterweise eingesetzten Oberflächenschallwellen können mit Hilfe eines oder mehrerer Inter- digitaltransducer auf einer piezoelektrischen Festkörperoberfläche erzeugt werden, deren Abstrahlrichtung der Richtung des gewünschten Impulsübertrages entspricht. Eine solche piezoelektrische Oberfläche kann z. B. aus einem LiNbO3- oder Quarzkristall gebildet sein. Ebenso kann auch eine piezoelektrische Beschichtung, z. B. ZnO, aus einem anderen Material vorgesehen sein. Die Oberfläche kann auch mit einer ausreichend dünnen biokompatiblen Schutzschicht versehen sein. Allgemein ist die Verwendung von Interdigitaltransducem zur Erzeugung von Oberflächen- schallwellen zur Bewegung von kleinen Flüssigkeitsmengen in DE-A-100 55 318 beschrieben.
In einfacher Ausgestaltung dieser bevorzugten Ausführungsform wird ein Tropfen des Titranten auf die Festkörperoberfläche aufgebracht, der aufgrund seiner Oberflächenspannung zusammengehalten wird. Zur Titration wird aus diesem Tropfen die kleine Menge des Titranten abgezogen und dem Analyttropfen auf dem Analysepunkt zugeführt, wobei sich diese kleine Titrationsmenge des Titranten auf der Oberfläche bewegt. Dies garantiert eine höhere Reproduzierbarkeit der Tropfengröße als bei Verwendung eines bekannten Dispensers und eine höhere Treffgenauigkeit des Analyttropfens durch die Titrationsmenge.
Vorteilhafterweise wird der Analyt auf einen speziell funktionalisierten Analysepunkt auf der Festkörperoberfläche gebracht, dessen Fläche stärker von dem Analyten benetzt wird als die umgebende Festkörperoberfläche. Ein solcher Analysepunkt hält den Tropfen des Analyten an einer vorbestimmten Stelle, so daß ein Auseinanderfließen oder Wegdriften des Analyten verhindert wird.
Der als Reservoir dienende Titrantentropfen, aus dem die kleine Titrationsmenge des Titranten abgezogen wird, die dem Analyttropfen zugeführt wird, kann sich auf einem Ankerpunkt auf der Oberfläche des Festkörpers befinden, der mit der Flüssigkeit des Titranten besser benetzt als seine umgebende Festkörperoberfläche. Auf diese Weise ist sichergestellt, daß der Titrant an einer bestimmten Stelle der Oberfläche verbleibt und diese ohne äußere Krafteinwirkung nicht verläßt.
Die Titrationsmenge des Titranten, die dem Analyten zugeführt wird, kann vorteilhafterweise auf der Festkörperfläche entlang eines Pfades bewegt werden, dessen Oberfläche mit dem Titrant besser benetzt als seine umgebende Oberfläche. Die Titrationsmenge bewegt sich vorzugsweise auf diesem Pfad, so daß eine kontrollierte Bewegung sichergestellt ist. Ein solcher Pfad kann z. B. durch eine Modulation der Benetzungseigenschaften erreicht werden, wie sie zur Bewegung von Flüssigkeitsmengen auf Oberflächen in DE-A-100 55 318 beschrieben ist. Zur Abteilung einer kleinen Menge des Titranten von dem Reservoirtropfen auf dem Ankerpunkt kann der Reservoirtropfen auf dem Ankerpunkt über einen Pfad geführt werden, der mit dem Ankerpunkt und/oder dem Analysepunkt verbunden ist, wobei die Verbindung einen Bereich umfaßt, der so schmal ist, daß der Reservoirtropfen auf dem Ankerpunkt aufgrund seiner Oberflächenspannung den Ankerpunkt ohne äußere Krafteinwirkung nicht verläßt. Wird durch äußere Krafteinwirkung der Reservoirtropfen auf diesen Pfad an diese Engstelle getrieben, so reißt er definiert ab.
Alternativ kann ein Reservoirtropfen, z. B. ebenfalls durch den Impulsübertrag von Oberflächenschallwellen, auf der Oberfläche über einen oder mehrere kleine Oberflächenteilbereiche bewegt werden, die von der Flüssigkeit des Titranten stärker benetzt werden als ihre Umgebung. Die Fläche dieses Oberflächenteilbereiches ist dabei so klein gewählt, daß sie kleiner als die Berührungsfläche des Tropfens mit der Oberfläche ist. Wird der Reservoirtropfen ein- oder mehrmals über solche Oberflächenteilbereiche geführt, verbleibt eine kleine Menge des Titranten auf diesen Haltepunkten zurück und kann zur Titration in Richtung des Analyttropfens bewegt werden. So kann auf sehr einfache und reproduzierbare Weise eine kleine Titrationsmenge abgeteilt werden.
Um zu verhindern, daß die kleinen Flüssigkeitsmengen zu schnell verdampfen, wird das Titrationsverfahren zur Aufrechterhaltung definierter thermodynamischer Randbedingungen vorteilhafterweise in einer Klimakammer durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Miniaturisierung der makroskopischen Titration. Es können Volumina im Bereich weniger Nanoliter bis mehrerer Mikroliter titriert werden. Im speziellen bei der Verwendung von Oberflächenschallwellen kann zusätzlich zur Bewegung des Titranten auf der Oberfläche die Oberflächenschallwelle zur Durchmischung eingesetzt werden, um das Titrationsergebnis reproduzierbarer zu machen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können besonders vorteilhaft auch Analyseverfahren wie Scintillation Proximity Assay (SPA) oder Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) durchgeführt werden, wie sie in J. Osborn, Life Science News, March 2001 , Seiten 1-4, „A review of radioactive and non-radioactive-based techniques used in life science applications - Part II „High-throughput screening" beschrieben sind.
Die Erfindung wird anhand besonderer Ausgestaltungen, die in den beiliegenden Figuren schematisch und nicht maßstabsgetreu dargestellt sind, näher erläutert. Dabei zeigt:
Figur 1 die Durchführung eines erfindungsgemäßen Titrationsverfahrens,
Figur 2 eine andere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Titrationsverfahrens,
Figur 3 eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Titrationsverfahrens, und
Figur 4 einen Verfahrensschritt bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Titrationsverfahrens.
Figur 1 zeigt einen Festkörperchip, z. B. einen piezoelektrischen Lithiumniobatchip 5, auf dessen Oberfläche 7 das erfindungsgemäße Titrationsverfahren durchgeführt werden kann. Ein Tropfen 1 eines Analyten in der Größenordnung von 0,5 nl bis 100 nl befindet sich auf einem Analysepunkt 15, dessen Benetzungseigenschaften sich von seiner Umgebung unterscheiden. Umfaßt der Analyt z. B. eine wäßrige Lösung, so ist der Analysepunkt 15 hydrophil im Vergleich zur umgebenden Festkörperoberfläche. Dies kann z. B. dadurch erreicht werden, daß die umgebende Oberfläche durch Silanisierung hydrophob gemacht wird. Für eine typische Flüssigkeitsmenge von 0,5 nl bis 10 nl eignet sich z. B. ein Analysepunkt mit einer Fläche von z. B. 100 μm x 100 μm. Auf einem Ankerpunkt 16 befindet sich ein Reservoirtropfen 3 der Titrantenlösung. Der Ankerpunkt 16 ist ebenfalls derart ausgestaltet, daß er mit der Titrantenlösung stärker benetzt als die umgebende Festkörperoberfläche.
Analysepunkt 15 und Ankerpunkt 16 sind über einen Pfad 18 miteinander verbunden, der ebenfalls solche Benetzungseigenschaften aufweist, daß er mit der Titrantenlösung besser benetzt als die umgebende Festkörperoberfläche. Der Pfad 18 ist an den Engstellen 14, 12 derart eingeschränkt, daß die auf dem Ankerpunkt 16 bzw. Analysepunkt 15 befindlichen Tropfen aufgrund ihrer Oberflächenspannung den Analysepunkt 15 bzw. den Ankerpunkt 16 ohne äußere Krafteinwirkung nicht verlassen.
9, 11 und 13 bezeichnen Interdigitaltransducer, die geeignet sind, Oberflächenschallwellen auf der Oberfläche 7 des Lithiumniobatkristalles 5 anzuregen. Die Interdigitaltransducer bestehen in ihrer einfachsten Form aus zwei Elektroden mit fingerartig ineinander greifenden Fortsätzen. Anlegen eines Wechselfeldes z. B. in der Größenordnung von 100 MHz an die Elektroden eines Interdigitaltransducers führt zur Anregung einer Oberflächenschallwelle mit einer Wellenlänge, die dem Fingerabstand der fingerartig ineinander greifenden Elektroden entspricht und deren Ausbreitungsrichtung im wesentlichen senkrecht zu den Fingerelektroden ist. Im Fall der Interdigitaltransducer 9 wird dies beispielsweise durch den Pfeil 10 schematisch angedeutet. Jeder Transducer umfaßt eine große Anzahl von ineinander greifenden Fingern, von denen jeweils nur einige schematisch und nicht maßstabsgetreu dargestellt sind. Es sind auch andere Transducergeometrien einsetzbar, wie sie aus der Technologie der Oberflächenschallwellenfilter bekannt sind.
Die Interdigitaltransducer 9 sind derart ausgerichtet, daß sich eine durch sie angeregte Oberflächenschallwelle in Richtung des Analysepunktes 15 bewegt. Der Interdigitaltransducer 11 bewirkt eine Oberflächenschallwelle in Richtung 19. Der Interdigitaltransducer 13 bewirkt schließlich eine Oberflächenschallwelle in Richtung 21. Nicht gezeigt sind der Übersichtlichkeit halber die elektrischen Anschlüsse an die Elektroden der Interdigitaltransducer, die in konventioneller Weise vorgesehen sind.
23 zeigt in schematischer Darstellung die Spitze eines an sich bekannten Piezo- dispensers zur Aufbringung des Reservoirtropfens 3 des Titranten auf den Ankerpunkt 16. Das Abfließen der Flüssigkeit aus der Dispenserspitze 23 ist mit dem Pfeil 24 angedeutet.
Auf der gezeigten Vorrichtung kann das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt werden.
Zunächst wird mit einer nicht gezeigten Dispenserkopfspitze ähnlich der Dispenserspitze 23 ein Tropfen des Analyten 1 auf den Analysepunkt 15 aufgebracht. Aufgrund der speziell gewählten Benetzungseigenschaften des Analysepunktes 15 verglichen mit den Benetzungseigenschaften der umgebenden Festkörperoberfläche 7 verläßt der Tropfen 1 , der durch seine Oberflächenspannung zusammengehalten wird, den Analysepunkt 15 nicht. Mit der Dispenserspitze 23 wird ein Tropfen des Titranten 3 auf den Ankerpunkt 16 aufgebracht. Ebenfalls aufgrund seiner Oberflächenspannung und der Benetzungseigenschaften des Ankerpunktes im Vergleich zu den Benetzungseigenschaften der umgebenden Festkörperoberfläche 7 (z. B. hydrophil im Vergleich zur umgebenden Festkörperoberfläche bei einer wäßrigen Titrantenlösung) verläßt dieser Tropfen 3 den Ankerpunkt 16 nicht. Die aufgebrachten Volumina des Analyten bzw. des Titranten können im Bereich von einem Pikoliter bis mehreren 100 Mikrolitem sein.
An den Interdigitaltransducer 13 wird jetzt eine Wechselfrequenz, z. B. einiger 100 MHz, angelegt, so daß eine Oberflächenschallwelle in Richtung 21 generiert wird. Der Impulsübertrag der Oberflächenschallwelle bewegt den Tropfen 3 in Richtung der Engstelle 14, die den Ankerpunkt 16 mit dem Pfad 18 verbindet. Eine kleine Menge des Tropfens 3 bewegt sich über die Engstelle 14 und reißt bei entsprechender Dimensionierung definiert ab. Die notwendige Verringerung der Breite an der Engstelle 14 kann z. B. durch Vorversuche festgestellt worden sein. Die abge- trennte Titrantenmenge kann z. B. einige Nanoliter betragen, sollte jedoch kleiner sein als etwa ein Zehntel der Analytenmenge auf dem Analysepunkt 15.
Der abgezogene Teil 17 des Titranten, die Titrationsmenge, bewegt sich ebenfalls durch Impulsübertrag der Oberflächenschallwelle, die mit dem Interdigitaltransducer 13 erzeugt wird, von dem Ankerpunkt 16 weg. Mit Hilfe eines zweiten Transducers 11 wird die Bewegung der kleinen Titrationsmenge des Titranten in Richtung des Analysepunktes 15 fortgesetzt.
Die kleine Titrantenmenge 17 trifft auf den Analyttropfen 1 auf dem Analysepunkt 15. Mit Hilfe einer Oberflächenschallwelle, die von einem der Interdigitaltransducer 9 erzeugt wird, kann die Reaktion zwischen Titrant und Analyt beschleunigt werden. Mit einem zweiten Interdigitaltransducer 9 kann die Oberflächenschallwelle nach dem Durchlaufen des Analysepunktes 15 detektiert werden. Durch die Reaktion des Analyten mit dem Titranten kann sich z. B. die Dämpfung der Oberflächenschallwelle verändert haben, so daß Information über die Reaktion erhalten werden kann. Außerdem kann durch Vergleich mit entsprechenden Referenzmessungen die genaue Menge des Analyten auf dem Analysepunkt 15 aus der Dämpfung einer Oberflächenschallwelle festgestellt werden.
Bei anderer Verfahrensführung kann von jedem der Interdigitaltransducer 9 eine Oberflächenschallwelle in Richtung Analysepunkt 15 geschickt werden, um die Reaktion zu beschleunigen bzw. die Flüssigkeit effektiv zu durchmischen.
Durch eine entsprechend gepulste Oberflächenschallwelle, die mit dem Interdigitaltransducer 13 erzeugt wird, können in definierter Weise mehrere kleine Titran- tenmengen 17 in Richtung des Analysepunktes 15 in beschriebener Weise zur Durchführung einer Titration 1 bewegt werden.
Mehrere entsprechende Vorrichtungen können auf einem Chip parallel vorgesehen sein, so daß eine parallele Durchführung mehrerer Experimente möglich ist. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich unter anderem ITC (Isothermal Calorimetric Titration) oder DSC (Differential Scanning Calorimetry) durchführen, wie sie von I. Jelesarov und H. R. Bosshard in J. Mol. Recognit. 1999; 12: 3-18 in einem Übersichtsartikel beschrieben sind.
In Figur 2 ist ein alternatives Verfahren dargestellt. Der Übersichtlichkeit halber zeigt Figur 2 nicht die zur Durchmischung ggf. vorgesehenen Transducer 9. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen ansonsten gleiche Elemente wie in Figur 1. Bei dem Verfahren, das in Figur 2 dargestellt ist, wird zur Titration die Leitfähigkeit des Analyten 1 gemessen. Dazu sind auf der Oberfläche 7 des Festkörperchips 5 Elektroden 25 vorgesehen, die mit dem Analysepunkt 15 verbunden sind. Elektrische Verbindungen führen zu einem Leitfähigkeitsmeßgerät 27. Durch sukzessive Zugabe von Titrant in kleinen Mengen 17 ändert sich die Leitfähigkeit des Analysetropfens 1 , was mit Hilfe des Leitfähigkeitsmeßgerätes 27 festgestellt werden kann. Zur Durchführung eines solchen erfindungsgemäßen Verfahrensablaufes ist der Analysepunkt 15 aus nicht leitfähigem Material hergestellt.
In Figur 3 ist eine weitere erfindungsgemäße Verfahrensführung dargestellt. Anstelle der Leitfähigkeitsmessung der Figur 2 wird eine optische Messung durchgeführt. Wiederum sind die zur Durchmischung ggf. vorgesehenen Transducer 9 nicht dargestellt. Eine Leuchtdiode 31 oder eine andere geeignete Lichtquelle beleuchtet den Festkörperchip 5 von unten. Zum Beispiel mit Hilfe einer Glasfaser 29 wird das optische Signal aufgefangen und an eine nicht gezeigte Auswerteeinrichtung weitergeleitet und in an sich bekannter Weise ausgewertet. Mit Hilfe dieser Ausführungsform kann z. B. der Farbumschlag eines Analyten gemessen werden, in dem ein Indikator gelöst ist, der nach Zugabe einer bestimmten Titrantenmenge umschlägt. Wird ein nicht transparentes Substrat eingesetzt, so kann der Lichtweg auch parallel zur Oberfläche 7 des Chips 5 gewählt werden.
Die beschriebenen erfindungsgemäßen Ausgestaltungen des Verfahrens nutzen die Engstelle 14, um eine definierte Menge 17 des Titranten von dem Titranten 3 abzuziehen. In Figur 4 ist eine alternative Möglichkeit zur Abtrennung einer kleinen Titrantenmenge dargestellt. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen vergleichbare Elemente wie in den Figuren 1 bis 3. Ein Reservoirtropfen 3 befindet sich auf einem der Ankerpunkte 16. Durch Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle, die mit dem Interdigitaltransducer 13, der dem entsprechenden Ankerpunkt 16 am nächsten ist, erzeugt wird, wird der Reservoirtropfen 3 in Richtung des zweiten Ankerpunktes 16 getrieben. Der Impulsübertrag einer anderen Oberflächenschallwelle, die mit dem Interdigitaltransducer 13 erzeugt wird, der dem zweiten Ankerpunkt am nächsten ist, wird der Reservoirtropfen wieder zurückgetrieben. Dabei bewegt er sich entlang der angedeuteten Strecke 43 hin und her. Er überquert dabei ein- oder mehrfach einen Oberflächenbereich 41 , dessen Fläche kleiner ist als die Berührungsfläche des Reservoirtropfens 3 mit der Festkörperoberfläche 7. Dieser Oberflächenbereich 41 hat derartige Benetzungseigenschaften, daß die Flüssigkeit des Reservoirtropfens 3 ihn stärker benetzt als seine umgebende Festkörperoberfläche. Nach ein- oder mehrfacher Überquerung des Oberflächenbereiches 41 hat sich aus dem Reservoirtropfen 3 eine kleine Titrantenmenge 17 abgelöst. Bei wäßriger Titrantenlösung hat der Oberflächenbereich 41 z. B. hydrophile Eigenschaften.
Nachdem die kleine Titrantenmenge 17 auf diese Weise von dem Reservoirtropfen 3 abgetrennt worden ist, kann mit Hilfe des Impulsübertrages einer Oberflächenschallwelle, die z. B. in Richtung 45 mit dem Interdigitaltransducer 11 erzeugt werden kann, die Titrantenmenge 17 von dem Oberflächenbereich 41 fortbewegt werden, z. B. in Richtung eines in der Figur 4 nicht gezeigten Analysepunktes, um dort mit einem Analyttropfen vereinigt zu werden, wie es oben mit Bezug zu Figuren 1 bis 3 beschrieben ist.
Der Reservoirtropfen 3 und der Titrantentropfen 17 können dabei entlang von bevorzugt benetzten Pfaden bewegt werden, wie sie bereits mit Bezug zu den Figuren 1 bis 3 beschrieben sind und dort mit dem Bezugszeichen 18 bezeichnet sind. Solche Pfade haben vorteilhafterweise eine laterale Ausdehnung, die kleiner ist als der Durchmesser des Oberflächenbereiches 41. Das erfindungsgemäße Verfahren und das beschriebene Abtrennen der kleinen Titrantenmenge 17 lassen sich jedoch auch ohne derartige Pfade durchführen, so daß diese in Figur 4 nicht dargestellt sind.
Mit dem in Figur 4 dargestellten Verfahren lassen sich z. B. 20 Pikoliter kleine Tröpfchen 17 von einem Reservoirtropfen 3 mit 50 Nanolitem abtrennen. Es können auf dem Weg des Reservoirtropfens 3 mehrere Oberflächenbereiche 41 vorgesehen sein, wenn mehrere Titrantenmengen 17 gleichzeitig abgetrennt werden sollen. Je nach Eigenschaft der zu manipulierenden Flüssigkeit in dem Reservoirtropfen 3 können durch entsprechende Vorversuche geeignete Geometrien für den Oberflächenbereich 41 festgelegt werden, z. B. kreis- oder ringförmig.
Das in Figur 4 beschriebene Verfahren zur Abtrennung einer kleinen Titrationsmenge 17 von einem Reservoirtropfen 3 kann selbstverständlich mit allen oben bereits beschriebenen Ausführungsformen zur Titration und der nachfolgenden Analyse kombiniert werden.

Claims

TitrationsverfahrenPatentansprüche
1. Titrationsverfahren für kleine Flüssigkeitsmengen, bei dem
a) ein durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltener Tropfen (1 ) des Analyten auf eine im wesentlichen ebene Oberfläche (7) eines Festkörpers, vorzugsweise eines Festkörperchips (5), aufgebracht wird,
b) eine Titrationsmenge (17) des Titranten mit dem Analyttropfen (1 ) zur Reaktion in Kontakt gebracht wird, die kleiner als die Menge des Analyttropfens (1 ) ist,
c) eine für die Reaktion zwischen Titrant und Analyt charakteristische Größe während und/oder nach der Reaktion gemessen wird, und
d) ggf. Wiederholung der Schritte b) und c).
2. Titrationsverfahren nach Anspruch 1 , bei dem während der Reaktion zwischen Analyt und Titrant eine Oberflächenschallwelle in Richtung (10) des Analyttropfens geschickt wird, um die Reaktion zwischen Titrant und Analyt zu befördern bzw. den Analyten und den Titranten zu durchmischen.
3. Titrationsverfahren nach Anspruch 2, bei dem die Titrationsmenge (17) des Titranten auf der Festkörperoberfläche (7) zum Analyten (1) bewegt wird.
4. Titrationsverfahren nach Anspruch 3, bei dem ein Reservoirtropfen (3) des Titranten auf die Festkörperoberfläche (7) aufgebracht wird, der aufgrund seiner Oberflächenspannung zusammengehalten wird, und zur Titration aus diesem Reservoirtropfen (3) die Titrationsmenge (17) des Titranten abgetrennt wird und dem Analyttropfen (1 ) zugeführt wird.
5. Titrationsverfahren nach Anspruch 4, bei dem die Bewegung der Titrationsmenge (17) durch den Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle ausgelöst wird.
6. Titrationsverfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, bei dem zur Erzeugung der Oberflächenschallwelle bzw. der Oberflächenschallwellen ein oder mehrere Interdigitaltransducer (9, 11 , 13) auf einer piezoelektrischen Festkörperoberfläche (7) mit einer Oberflächenschallwellenabstrahlrichtung in Richtung des gewünschten Impulsübertrages eingesetzt werden.
7. Titrationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der Tropfen (1 ) des Analyten auf einen Analysepunkt (15) auf der Festkörperoberfläche (7) gebracht wird, dessen Fläche stärker von dem Analyten benetzt wird als die umgebende Festkörperoberfläche (7).
8. Titrationsverfahren nach Anspruch 7, insoweit er direkt oder indirekt auf Anspruch 4 zurückbezogen ist, bei dem der Reservoirtropfen (3) auf einen Ankerpunkt (16) auf der Oberfläche (7) des Festkörpers (5) aufgebracht wird, dessen Fläche stärker vom Titranten benetzt wird als seine umgebende Festkörperoberfläche.
9. Titrationsverfahren nach einem der Ansprüche 7 oder 8, insoweit sie direkt oder indirekt auf Anspruch 4 zurückbezogen sind, bei dem die Titrationsmenge (17) des Titranten von dem auf die Festkörperoberfläche (7) aufgebrachten Reservoirtropfen (3) des Titranten auf einem Pfad (18) zum Analyttropfen (1 ) geführt wird, wobei zumindest ein Teil der Oberfläche des Pfades vom Titranten besser benetzt wird als die den Pfad umgebende Oberfläche.
10. Titrationsverfahren nach Anspruch 9, bei dem die Titrationsmenge (17) des Titranten von dem Reservoirtropfen (3) zum Analyttropfen (1 ) über einen Pfad (18) geführt wird, der mit dem Ankerpunkt (16) und/oder dem Analysepunkt (15) verbunden ist, wobei die Verbindung (14, 12) einen Bereich umfaßt, der so schmal ist, daß der Reservoirtropfen (3) auf dem Ankerpunkt (16) aufgrund seiner Oberflächenspannung den Ankerpunkt (16) ohne äußere Krafteinwirkung nicht verläßt.
11. Titrationsverfahren nach Anspruch 4 oder einem der Ansprüche 5 bis 9, insoweit sie direkt oder indirekt auf Anspruch 4 zurückbezogen sind, bei dem der Reservoirtropfen (3) zumindest einmal über zumindest einen Bereich (41 ) der Oberfläche (7) bewegt wird, der von der Flüssigkeit stärker benetzt wird als die umgebende Oberfläche, wobei die Fläche dieses Bereiches (41 ) kleiner ist als die Berührungsfläche des Reservoirtropfens (3) mit der Oberfläche, um eine Titrationsmenge (17) vom Reservoirtropfen (3) abzutrennen.
12. Titrationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , das in einer Klimakammer zur Kontrolle der thermodynamischen Randbedingungen durchgeführt wird.
13. Titrationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem eine Oberflächenschallwelle in Richtung (10) des Analysepunktes (15) während und/oder nach der Reaktion zwischen Titrant und Analyt (1 ) geschickt wird und die Änderung eines oder mehrerer Parameter der Oberflächenschallwelle durch die Wechselwirkung mit der Flüssigkeit auf dem Analysepunkt (15) gemessen wird.
14. Titrationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem während der Reaktion zwischen Titrant und Analyt die Reaktionswärme bestimmt wird.
15. Titrationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem die charakteristische Größe in Schritt c) die elektrische Leitfähigkeit umfaßt.
16. Titrationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem die charakteristische Größe in Schritt c) einen Farbumschlag umfaßt.
17. Titrationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem die charakteristische Größe in Schritt c) den pH-Wert umfaßt.
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