WO2003056008A1

WO2003056008A1 - Regulation de l'expression de genes associes a la mobilite bacterienne

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Publication number: WO2003056008A1
Application number: PCT/JP2002/013523
Authority: WO
Inventors: Taku Oshima; Chieko Wada; Hirotada Mori; Sota Hiraga
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-12-25
Filing date: 2002-12-25
Publication date: 2003-07-10
Anticipated expiration: 2004-06-25
Also published as: JP2003189861A

Description

明細書細菌の運動性関連遺伝子群発現の制御技術分野

本発明は、細菌の運動性関連遺伝子群の発現を制御することよりなる細菌の変異方法、特に細菌の運動性関連遺伝子群の発現を制御することにより、細菌を変異させて、該細菌の宿主細胞への侵入性を制御し、細菌の感染性を減少する方法、及び該細菌のワクチン生産株としての利用に関する。背景技術

大腸菌（ E . c o 1 i ) のゲノム配列は既に完全解読されており ( Science, 277, 1453- 1474, 1997)、遺伝子機能及びその相互作用を決定する上で、「トランスクリプトーム分析」と呼ばれる遺伝子発現プロフィールの包括的分析法が、優先的な手法となった。機能ゲノム科学における最新かつ高効率的な方法として、マイクロアレイ法及び二次元（ 2— D ) ゲル電気泳動法があげられる。かかる方法を用いることにより、研究者らが細胞の複雑なミクロ機構に新たな考察を加えることが可能になつた。熱ショックに対する応答時における、環境条件変化時における、また遺伝子分裂後における遺伝子発現を考察するため、マイクロアレイを使ったゲノム包括的な発現分析が従来実施されてきた（Nucleic Acids Res. 27， 3821-3835, 1999、 J. Bacteriol. 181, 6425-6440, 1999、 J. Biol. Chem. 275, 29672-29684, 2000)。 2— Dゲル電気泳動を禾 lj用したプ Cl テオ一ムアプローチはまた、 I H F、 H— N S、又は F i s等の核様体変異株 ( J. Bacteriol. 177, 5707-5710, 1995、 Eur. J. Biochem. 244, 767-73, 1997、 Electrophoresis 20, 798-805， 1999) におレて、環境朿 'J 激に対する応答性（低温ショック、熱ショック、及び外因ピロリン酸）

(Pro atl. Acad. Sci. USA. 87, 5589-5593， 1990、 Res. Microbiol. 147, 597-608, 1996)、及び成長期（ growth phase) における分析（EMBO J.15, 3219-3228, 1996) などのタイプの分析にとられてきた手法である _c 突然変異の増加、組換え過多、及び転写改変等の高度な多面表現型を示す D am欠損変異体から明らかなように、 D amは、大腸菌において重要な生理的役割を担っていることが知られている（Marinus, MG. in Eschericia coli and Salmonella ： celluar and Molecular Biology, F. Neidhardt, Ed. (American Society for Microbiology, Washington, DC, ed.2， 1996), pp782-791、 J. Bacteriol.182, 463-468， 2000)。 D amは、染色体複製の開始時期を決定し、 G AT C配列におけるアデニン残基のメチル化により不適正塩基対の修復や遺伝子転写発現を調節する。例えば、酸化ストレスに応答する包括的レギユレ一夕一である〇 X y Rは、非メチル化 G AT C部位の認識配列を m om遺伝子の調節領域に結合させ、オペロンの発現を抑制する（EMBO. J.8, 2403-2410, 1989)。さらに、大腸菌ゲノム全体の protection分析の結果から C R P、 F n r、及び I H F等の包括的レギュレーターが、多くの GAT C配列を D a によるメチル化から防いでいることが明らかになった（ Nature, 360, 606-610, 1992、 Nat. Biotechnol. 16, 566-571, 1998)。 p a pオペロンの上流にある 2つの G AT C部位のメチル化状態は、調節タンパク質二種、すなわちロイシン応答性調節タンパク質（L r p) 及び P a p I の結合を調節することにより p a p転写を制御している（Cell 76, 577-588, 1994、 EMBO. J.9, 4045-4054， 1990、 EMBO J.14， 5785-5797, 1995)。

コンピューターによる大腸菌ゲノムの部分解析の結果、 GAT C配列は独特の分布を示し、クラスターを形成し、また F n r及び C R P認識配列と重複していることがわかつた（J. Mol. Biol.257, 574-585, 1996) _c このことから、 D amが、転写レギユレ一夕一又は R N Aポリメラーゼの認識配列を修飾することによりタンパク質一 DN A相互作用に影響を及ぼしていると想定される（Marinus, MG. in Eschericia coli and Salmonella ： celluar and Molecular Biology, F. Neidhardt, Ed. (American Society for Microbiology, Washington, DC, ed.2, 1996), pp782-791)。大腸菌において、転写レギユレ一夕一の認識部位内又はその近傍に G AT C配列をもつ多くの遺伝子は、恐らく D amメチル化により調節されていると考えられる。しかしながら、 D amによる転写調節の正確な機構、並びにその本当の生物学的機能は未だ明らかになっていない。

大腸菌において呼吸やエネルギー産出に関与する多くの遺伝子は T C Aサイクルの酵素に関与する遺伝子を含め、 GAT Cクラス夕一を有している（J. Mol. Biol.257, 574-585, 1996)。呼吸の間に産生される酸化遊離基が、細胞内の巨大分子を損傷することもあり、殆どの生物においては加齢に伴ってタンパク質酸化と DN A損傷が増加することが知られている。大腸菌では、好気的成長条件下の定常期において、反応酸素の蓄積が細胞に有害な影響を及ぼしている。大腸菌の好気的成長の定常期において、 T CAサイクル酵素遺伝子数種の発現低下がみられることが明らかになつている（Mol. Microbiol.12， 833-843, 1994、 EMBO J.15, 3219-3228, 1996)。また、 TC Aサイクル酵素、並びに分子シャペロン及び核様体タンパク質等のタンパク質数種は強力に酸化され、その活性を失う（Genes Dev.12， 3431-3441, 1998)。一方、同一条件下で、スーパ一ォキシドジスム夕一ゼ（S o d A及び S o d B) 及びシャペロン夕ンパク質 D n a Kが誘導される（Genes Dev. 12， 3431-3441, 1998、 J. Biol. Chem.274, 26027-26032, 1999) ₀ 上記の結果力、ら、定常期におけるタンパク質の酸化を減少させるベく T C Aサイクル酵素の発現が下方調節され、酸化ストレスから細胞を防御すべく、スーパ一ォキシドジスム夕ーゼ及びシャペロンタンパク質 D n a Kが上方調節されることが、示唆される。

酸素（0 ₂ ) 存在下でピルビン酸は、ピルビン酸デヒドロゲナ一ゼ酵素の作用により Acetyl— CoAに転化し、 T C Aサイクルに入る。水素分子を N A D +に転位させながら、基質は順次酸化される。産出された N A D Hはュビキノンで酸化され、電気が呼吸鎖を通って N A D Hから最終的な電気受容体である O ₂に流れる（J. Biochem. 120, 1055- 1063, 1996)。かかる酸化サイクルにおいて O ₂が産生される（図 6参照のこと） _c しかし、充分量の〇₂が存在しないときには、その代わりとなる硝酸塩等の電気受容体が電気の流れを補助している。嫌気的条件下にて増殖したネズミチフス菌（Salmonella typhimurium) 及び大腸菌は、硝酸塩、フマル酸塩、及び酸素の勾配に対し、走気性及び電気受容走性と呼ばれる走性応答を示す（ J. Bacteriol. 140, 567-573, 1979、 Mol. Microbiol. 28， 683-690, 1998, Annu. Rev. Microbiol. 53, 103- 128, 1999)。力力、る走 '14 応答は、細胞のレドックス状態において産生されるセンサータンパク質である A e rタンパク質によって調節される。 A e rは、シグナル形質導入経路が外的刺激に適応し、 C h e Aのリン酸化を調節する際のエネルギートランデューサ一のひとつであり、 C h e Y応答性レギユレ一夕一のリン酸化状態を調節している（PNAS 94, 10541- 10546, 1997、 Mol. Microbiol. 28, 683-690, 1998)。

従来、 f 1 a、 m 0 t、及び c h e遺伝子等の運動性関連遺伝子の変異は、サルモネラ菌類の感染性（virulence) を減少させると報告されてきた ( Infect. Immun. 56, 1967- 1973, 1988、 Infect. Immun. 60， 2475-2480, 1992) 一方で、ネズミチフス菌における細菌感染性に対する D a mの主要な役割が、近年報告されている（Science, 284, 967-970, 1999)。 D a m欠損ネズミチフス菌変異体は、粘膜部位に定着（colonize) できるが、組織内部に深く侵入することはできない。 D a m欠損変異体は非侵入性だが、非食菌性細胞における正常な細胞内増殖が観察された。宿主細胞に侵入する過程で、 D a mが多数の遺伝子の発現を制御することが明らかになった。しかしながら、ネズミチフス菌の細胞内侵入の正確な機構及びプロセスは未だ解明されていない。

本発明の課題は、細菌の運動性関連遺伝子群の発現を制御することにより細菌を変異する方法、特に細菌の運動性関連遺伝子群の発現をゆるやかに制御することにより、細菌を変異させて、該細菌の宿主細胞への侵入性をゆるやかに制御し、細菌の感染性を減少させつつ宿主に常在させる方法を提供すること、及び該細菌のワクチン生産株としての利用を提供することにある。発明の開示

本発明者らは、細菌の D N Aメチル化酵素である D a mの生物学的機能を解明すべく、マイクロアレイ及びプロテオ一ム法を用いて、増殖サイクルを通して環境条件を種々に変化させる中での大腸菌における遺伝子発現を分析した。その結果、エネルギー及びヌクレオチド代謝、細胞プロセス、及び翻訳関連遺伝子を含む数多くの遺伝子が D a mによって上方調節されたり、下方調節されたりすることを見いだした。そして、大腸菌の d a m遺伝子（ d a m D N Aメチラーゼ遺伝子）欠損株において、走化性や走酸素性をつかさどる遺伝子群の発現や、嫌気的呼吸に関与する酵素類の発現や、及び鞭毛関連遺伝子の発現が大きく変化しており、該遺伝子の発現が細菌の運動性に深く関与していることから、該細菌の運動性関連遺伝子群の発現のグロ一バルな制御が、細菌の宿主細胞へ侵入性を制御可能にすることを見い出し、本発明をなした。すなわち、本発明は、細菌の運動性関連遺伝子群の発現を制御することにより、細菌を変異させ、細菌の宿主細胞へ侵入性を制御することにより細菌の感染性を欠損或いは減少させた細菌を製造することよりなるものである。本発明の、変異して感染性を減少した細菌は、ワクチン生産株として利用することができる。

すなわち、本発明は、細菌の運動性関連遺伝子群の発現を制御することを特徴とする細菌の変異方法（請求項 1 ) や、細菌の運動性関連遺伝子群の発現を、細菌の D N Aメチル化酵素遺伝子を変異させて制御することを特徴とする請求項 1記載の細菌の変異方法（請求項 2 ) や、細菌の D N Aメチル化酵素遺伝子が、 D a m D N Aメチラ一ゼ遺伝子であることを特徴とする請求項 2記載の細菌の変異方法（請求項 3 ) や、細菌の運動性関連遺伝子群の発現の制御が、運動性関連遺伝子群の D N Aの G A T C配列のアデニンのメチル化の減少によることを特徴とする請求項 3記載の細菌の変異方法（請求項 4 ) からなる。

また、本発明は、細菌の運動性関連遺伝子群の発現の制御が、 T C A サイクル酵素類をコ一ドする遺伝子の発現の制御であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の細菌の変異方法（請求項 5 ) や、細菌の運動性関連遺伝子群の発現の制御が、嫌気的呼吸に関与する酵素類をコードする遺伝子の発現の制御であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の細菌の変異方法（請求項 6 ) や、細菌の運動性関連遺伝子群の発現の制御が、走性関連遺伝子類の発現の制御であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の細菌の変異方法（請求項 7 ) や、細菌の運動性関連遺伝子群の発現の制御が、鞭毛関連遺伝子の発現の制御であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の細菌の変異方法（請求項 8 ) からなる。さらに、本発明は、請求項 1〜 8のいずれか記載の細菌の変異方法により変異させたことを特徴とする細菌変異株（請求項 9 ) や、細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項 9記載の細菌変異株（請求項 1 0 ) や、細菌の変異が、運動性関連遺伝子群の発現の制御により、細菌の宿主細胞侵入性を制御したものであることを特徴とする請求項 9又は 1 0 記載の細菌変異株（請求項 1 1 ) や、請求項 9〜 1 1のいずれか記載の細菌変異株を、ワクチン生産株として用いることを特徴とするワクチンの製造方法（請求項 1 2 ) や、請求項 1 2記載の製造方法により製造されたワクチン（請求項 1 3) からなる。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の実験例において、大腸菌ゲノム全体にわたる遺伝子の上流領域における G AT Cクラス夕一の頻度分布の様子を示す図である。

第 2図は、本発明の実験例において、異なる好気的条件下での細胞成長の様子を示す図である。

第 3図は、本発明の実験例において、 4 0 2 7大腸菌遺伝子における発現プロフィ一ルのクラスターグラム、すなわち A d am変異の効果を示す写真である。

第 4図は、本発明の実験例において、対数期又は定常期での野生型及び Δ d am変異体株におけるタンパク質の分析を F RHR 2 - D P AGE (プロテオーム）により行った結果を示す写真である。

第 5図は、本発明の実験例において、マイクロアレイ分析（イタリツク文字）及び 2— D PAGE分析（普通の文字）の結果、 TCAサイクル酵素の△ d a m株における発現を示す図である。

第 6図は、本発明に関連し、大腸菌での代謝エネルギー及び〇₂の産生における酸化プロセスの様子を示す概略図である。

第 7図は、本発明に関連し、細菌の走化性、移動度、硝酸塩還元、及び宿主侵入の関係を図式化した概略図である。発明の実施の形態

本発明は、細菌の運動性関連遺伝子群の発現を制御して、細菌を変異させる方法よりなり、細菌の運動性関連遺伝子群の発現をグローバルに制御して、細菌の宿主細胞への侵入性を制御し、細菌の感染性を欠損或いは減少させて、ワクチン生産株としての利用を可能とすることよりなるものである。細菌の運動性関連遺伝子群としては、走化性や走酸素性等の走性をつかさどる遺伝子、 T C Aサイクル酵素類をコードする遺伝子、嫌気的呼吸に関与する酵素類の遺伝子、及び鞭毛関連遺伝子などが挙げられる。

走性関連遺伝子としては、 a e r、 t a r , t a p, c h e A、 c h e Y、 mo t A、 mo t Bなどが、 T C Aサイクル酵素類をコードする遺伝子としては、 g l t A、 l p d A、 a c n B i c d A、 s d h A、及び md hなどが、嫌気的呼吸に関与する酵素類の遺伝子としては、硝酸塩レダクターゼなどが、及び鞭毛関連遺伝子としては、鞭毛の形成や運動に関連する f 1 a、 mo t , 及び c h eなどが挙げられる。細菌のこれらの運動性関連遺伝子群の発現を制御するには、これらの運動性関連遺伝子の塩基配列の部分の欠失や変異、或いはアンチセンスのような手段で行うことができるが、運動性関連遺伝子群の発現をグローバルに制御するには、例えば、 d amのような DN Aメチル化酵素遺伝子を変異させて、効果的に行うことができる。

運動性関連遺伝子群には、 D amメチル化酵素がメチル化するコンセンサス配列 G AT Cが存在しており、 D a mのような DN Aメチル化酵素によるこれらの配列のメチル化が、該運動性関連遺伝子の発現に深く関与していることから、例えば、 d a mのような D N Aメチル化酵素遺伝子を変異させて、運動性関連遺伝子における D N A配列のメチル化を減少させ、これらの運動性関連遺伝子群の発現の制御をグローバルに行うことができる。 D N Aメチル化酵素遺伝子の変異は、該遺伝子の欠損、或いは遺伝子の塩基配列の部分的欠失、置換，挿入等の異性化方法等、適宜の方法を採用することができる。

本発明の細菌の変異方法により、細菌の運動性関連遺伝子群の発現を制御することにより、細菌の宿主細胞侵入性を制御することができ、該方法により感染性を欠損或いは減少した細菌は、ワクチン生産株として利用することができる。

以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

[実験と考察]

(大腸菌ゲノムにおける G A T Cクラス夕一の分布）

大腸菌染色体の調節領域における殆どの G A T C部位は、転写レギュレー夕一によつてメチル化を防いでいる。かかるメチル化は転写調節に重要な役割を担っていると考えられてきた（Nature, 360, 606-610, 1992, J. Bacteriol. 176, 3438-3441, 1994、 Nat. Biotechnol. 16, 566-571, 1998' J . Bac t . 180， S91 3-920, 1 998)。大腸菌ゲノムの一部に対して以前実施されたコンピューターによる配列解析結果から、 F N R又は C R P認識配列と、呼吸遺伝子又は D N A複製遺伝子の上流領域において重複する G A T Cの局地的増強は、それら遺伝子の発現に対する調節的役割を意味するものと考えられる（J. Mol. Biol. 257， 574-585， 1996)。そこで本 3¾明らは、大月ゥノム ( http://ecoii.aist-nara.ac. jp/FTP/ecoli.seq) 全体に存在する G A T C配列の分布を調べ、図 1 に示したその結果は、既報告の結果を追認し、かつ拡張するものであった（GAT C分布全体のつ—夕については、 http：〃 ecoli.aist-nara.a jp/microarray/dam/^参照のこと）。

5 0 0 b pの上流領域に、およそ 8 0 %の遺伝子は G AT C配列を 1 又は 2以上有し、 5 0 %は 2以上の G AT C配列をもち、 2 2 2の遺伝子は 5以上の G AT C配列を有している。 GAT C配列を最も多く含む遺伝子には、それぞれ 1 8及び 1 0の G AT C配列をもつ g i d A及び y a h Gが挙げられる。それとは対照的に G A T C密度の低い領域もあり、 r h s遺伝子ファミリ一がかかる領域に位置している。これらの知見の意義は現時点では不明であるが、上述した G AT C配列の偏在は、遺伝子発現及び/又はゲノム構造における機能的役割を示唆しているとも考えられる。 GAT C、並びに F N R及び C R Pを結合させるコンセンサス配列の分布は互いに、 g l t A、 s d h、 i c d A、 n a r G、 n a r Z、及び n a p Aの遺伝子/オペロンで重複しており、これらの包括的転写レギユレ一夕一を結合させるシス作用（cis-acting) エレメン卜の一部として G AT Cが機能しているという仮説を裏付けている。 G AT C配列のデォキシアデノシンメチル化の生物学的役割をさらに調ベるために、本発明らは、マイクロアレイ法及び 2 D— PAGE分析法を用いて、野生型及び Δ d am大腸菌株の包括的なゲノム発現を比較した。

(Δ d am変異体の遺伝子発現のマイクロアレイ分析）

D a mメチラーゼによる遺伝子調節の形態を考察するため、 D N Aマイクロアレイを用いてゲノムスケールで、大腸菌 A d a m変異体及び野生型株の遺伝子発現プロフィールを作製した。コンピュー夕一解析の結果、 1又は 2以上の G AT C配列が、 T C Aサイクル及び好気的又は嫌気的呼吸酵素をコードする遺伝子の上流に位置していることが解明され

0 た。そこで遺伝子発現プロフィール実験は、好気的及び低好気的条件下にて実施した。対数期及び定常期に細胞を回収し、全 RNAを単離した (図 2 )。 d amと反対方向にカナマイシンカセットを挿入した d am— 1 6 (Gene 73, 531-535, 1988) を d a m変異対立遺伝子として使用した。再現性を確認するために、変異体及び野生型の相対的 mRNAレべルを個別に 2回測定した。低好気的条件下での対数期培養においては、検出した 1 9 5 8個の遺伝子の内 1 6 6個（ 3 3 2スポット；全体の 8. 5 ) が有意の変化を示したが（ 2倍以上）、定常期では 1 7 2 4個の遺伝子の内 5 8個（ 3. 4 %) が発現変化を示した。一方、好気的条件下では、対数期では 1 7 9 9個の遺伝子の内 1 0 9個（全体の 3. 4 %) が、定常期では 2 1 2 1個の遺伝子の内 1 2 5個（ 5 · 9 %) が、 d a m欠損変異体において 2倍以上の変化を示した。

上記のデータを次に、ペア方式（pair wise) による相関統計 (correlation statistics) 及び K E G G経路データベース（Nucleic Acids Res.28， 27-30, 2000) により分析した。かかる分析から、 T CA サイクル酵素類をコ一ドする多くの遺伝子、また嫌気的呼吸、走化性（ィ匕学走性）及び鞭毛生合成に関与する遺伝子が、類似の発現プロフィールを示すことが見いだされた（図 3)。一例として、 T CAサイクル酵素類 ( g 1 t A、 1 p d A, a c n B > i c d A、 s d h A、及び md h) をコードするいくつかの遺伝子では、好気的条件下においてのみ定常期にその発現が増加した。これは、発現の異なる形態に起因するのでなく、むしろ採用した統計的分析法の限界によるものと考えられる。また Δ d a m変異体における、 r e c A、 l e x A、及び u v r AB等の S O S 関連遺伝子の発現が増加することは既に報告されている（Mol. Gen. Genet.201, 14-19, 1985)。本発明らはまた、好気的及び低好気的条件下での Δ d am変異体における S O S遺伝子数種の mRNAレベルが増加することも見いだした（図 3 )。

(Δ d am変異体を用いたタンパク質の二次元ゲル電気泳動（R FHR 2 - D PAGE))

DN Aマイクロアレイ分析において発現が有意に変化した遺伝子にコ一ドされるタンパク質の発現レベルを調べるために、対数期又は定常期において成長している野生型及び Δ d am細胞から画分化したタンパク質のプロテオ一ム分析を、 R FHR 2 - D P AG E (J. Biochem. 100， 1583-1594, 1986) を使用して実施した。予想どおり、多数の機能クラスターにおける遺伝子産物は野生型と比し、 Δ d am株でより多くみられた（表 1及び表 2、図 4 )。かかる産物には、エネルギー代謝（ a t p G、 f r d A, g a p A、 l p dA、 md h、 t k t； )、翻訳（ f u s A、 g l n S、 i n f C、 p p i B、 t u f A)、細胞エンベロープ（o mp F、 y e a F、 u n c D)、アミノ酸代謝（g l y A)、ヌクレオチド代謝（a d k、 d e o C、 g u a A, g u a B )> ストレス応答（ d n a K、 f k p A, g r o E L、 p p i B , t i g) にそれぞれ関与する遺伝子が含まれる。さらに酸化ストレス応答性遺伝子 s o d A、核様体タンパク質 h n s及び h 1 p A遺伝子産物、並びに O p p A、 R b s B、 A s g 2 , I p y R及び Y r b C夕ンパク質もまた定常期の Δ d am株において顕著に増加した。

(表 1 )

対麵 (好気的条件下）

つノフ Λノタンパク質 <~ΠΜΔ

タンパク質詳細機能的

シヨン ldam/i½ の数

OmpF ompF 外膜タンパク質 F IE体細胞ェンベロ一プ CD 1. 5 1 1

YeaF yeaF ムレイン合成足ンパク質細エンベロープ CD 1. 3 1.4 1

Asg2 ansB ァスパラギナーゼ Π前駆体中枢中間代謝 PRS 1. 4 0.2 2

Tkt1 tktA トランスケトラーゼ 1 エネル^"代謝 PRS 1. 2 1.6 3

GuaA guaA GMPシンテタ一ゼヌクレ才チド代謝 PRS 1. 4 1.7 1

ImdH guaB IMPデヒドロゲナ一ゼヌクレ才チド代謝 PRS 1. 5 1.1 3

OppA oppA ペリプラスムォリゴペプチド結合タンパク質/へ。プチト'分泌 PRS 1. 4 0.9 1

DnaK dnaK DnaKタンパク質ス卜レス応答 PRS 1. 2 1.3 1

0J

SodA sodA ス一/ 一ォキシドジスムタ一ゼストレス応答 CD 1. 3 0.6 1

Syq glnS グルタミニル tRNAシンテタ一ゼ翻訳 PRS 1. 4 1.8 5

RbsB rbsB D"リホ' -ス結合へ。リブラスムタン/ ク質輸^結合タンパク質 PRS 1. 3 1.4 4

OmpF ompF 外膜タンパク質 F 細胞エンベロープ CD 1 . 2 2. 2 1

YeaF yeaF ムレイン合成補酵素足場タンパク質細胞エンベロープ CD 5. 8 1 . 3 1

Asg2 ansB ァスパラギナ一ゼ Π前駆体中枢中間代謝 PRS 1 . 4 3. 0 2

IpyR P a 無機ピロホスファターゼ中枢中間代謝 PRS 1 . 4 nd 1

AtpG atpG ΑΤΡシンターゼ _r鎖エネルギー代謝 CD 2. 5 1 . 6 3

DldH IpdA ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼエネルギー代謝 CR 2. 8 1 . 9 1

FrdA frdA eフマル酸レダクターゼフラボタンパク質サブュニ .ットエネルギー代謝 CD 1 . 3 2. 6 4

G3P 1 gapA グリセルアルデヒド- 3 -リン酸デヒドロゲナ一ゼ A エネルギー代謝 CR 3. 5 1 . 7 2 dh mdh リンゴ酸デヒドロゲナーゼエネルギー代謝 PRS 1 . 3 2. 2 0

Deo deoC デォキシリポリボースリン酸アルドラーゼヌクレオチド代謝 PRS 1 . 3 1 . 6 2

GuaA guaA GMPシンタ一ゼヌクレオチド代謝 PRS 1 . 7 nd 1

ImbH guaB Imp デヒドロゲナ一ゼヌクレオチド代謝 PRS.CD 1 . 9, 2. 0 > 1 . 3 3

Kad adk アデニル酸キナーゼヌクレオチド代謝 PRS 1 . 4 nd 4

OppA oppA ペリプラスムオリゴペプチド結合タンパク質タンパク質ノへ' チ分泌 PRS.CD 1 . 5, 1 . 4 1 . 4 1

HlpA hlpA ヒストン様タンパク質調節機能 CR 1 . 5 1 . 5 3

H - NS hns DNA結合タンパク質調節機能 CR 1 . 8 0. 8 0

DnaK dnaK DnaKタンパク質ストレス応答 CD 1 . 9 0. 7 1

PkbA fkpA FkbP型ぺプチジル-プロリルシス-トランスイソメラ-ーゼストレス応答 PRS.CD 1 . 4, 2. 5 1 . 3 2

GroEし groEL GroELタンパク質ストレス応答 CR 3. 9 1 . 2 5

SodA sodA スーパ一オキサイドジスムターゼストレス応答 CD 1 . 3 1 . 1 1

Tig tig 誘因（trigger)因子 . ストレス応答 CR 1 . 7 1 . 2 0

CypB PPiB ぺプチジルプロリルイソメラ一ゼ翻訳 PRS 1 . 7 1 . 2 5

EF- G fusA 伸長因子 G 翻訳 CD 2. 4 0. 8 1

EF-Tu tufA 翻訳伸長因子 EF - Tu 翻訳 CR 2. 4 1 . 5 2

IF3 infC 開始因子 IF - 3 翻訳 PRS.CR 1 . 4, 1 . 4 0. 6 1

Syq glnS グルタミニル tRNA シンターゼ翻訳 PRS 1 . 7 1 . 3 5 bsB rbsB D リポース結合ペリプラスムタンパク質前駆体輸送ノ結合タンパク質 PRS 1 . 9 0. 9 4

YrbC yrbC 仮説上のタンパク質 PRS 1 . 5 0. 7 1

≠ 2 以上の結果からは、 T C Aサイクル関連酵素類、並びにプリン · ピリミジンサルベージ経路に含まれる G u a A並びに I md H、 D e o Cの発現は、 D amによって調節されることが強く示唆される（以下の項を参照のこと）。またこの分析結果からは、タンパク質のフォールデイングや輸送に関する翻訳機構及びシャペロン系に関与している遺伝子産物は. 好気的条件下では、野生型より d am変異体でより高頻度に発現されることが明らかになつた（表 1及び表 2、図 4)。このことからこれらの夕ンパク質が、 GAT C配列の D amメチル化により好気的条件下にて直接的或いは間接的に下方調節されると考えられる。

しかしながら、マイクロアレイにより得られたデータとプロテオーム分析により得られたデータ（特に対数期で高い）の間には整合しない点もいくつか見受けられる。かかる非整合性は、抽出方法、感度及び分離度の違い、 RNA標識化効率、ハイプリダイゼーションダイナミックス、及び R N A集団の違いなどマイクロアレイと 2 _Dの方法論に元々存在する偏りに起因すると考えられる。一方、 RN A及び夕ンパク質半減期、二次構造、シャペロン防御、並びに翻訳効率等の天然の細胞プロセスにより、上記二方法から得られた結果の違いを説明することもできる。ゲノムとプロテオームから得られる結果が異なるので、本分野の研究においては両分析を実施することが要求される。補足データは、 http://ecoli.aist-nara.ac.Jp/proteome/dam/T '^ Hi れている。

(T C Aサイクル酵素及び他の呼吸酵素の発現にみる A d a m変異体の効果）

マイクロアレイ分析により、 T CAサイクルに関与する大部分の遺伝子の発現は、好気的条件下で、また特に定常期で、野生型より A d am 変異体においてより高頻度に発現されることが明らかになった（図 5 )。かかる遺伝子には、 g 1 t A (クェン酸シン夕ーゼ） l p d A (リポアミドデヒドロゲナ一ゼ 'サブュニット E 3 )、 a c n B (アコ二夕ット酸ヒドラ夕一ゼ 2 )、 i c d A (イソクェン酸デヒドロゲナ一ゼ）、 s d h A (コハク酸デヒドロゲナーゼ）、及び m d h (リンゴ酸デヒドロゲナーゼ）が含まれる。マイクロアレイの結果同様に 2 — D P A G E分析においても、 M d h及び D 1 d H等のタンパク質レベルは△ d a m変異体においてより高かった（ 1 . 3倍以上）（図 4 B)。これらの結果からは、翻訳段階での G AT Cのデォキシアデノシンメチル化によって、 T C A サイクル酵素類の細胞レベルが直接又は間接的にネガティブ制御されていることが考えられる。呼吸鎖の NADZNAD Hサイクル（NAD H デヒドロゲナーゼ I ) に関与するタンパク質をコードする n u 0オペ口ン遺伝子の発現もまた、野生型より A d a m変異体において著しく高頻度だった（ c a . 2. 2倍）。

さらに、対数期及び定常期のいずれにおいても Δ d a m株で S o d A (過酸化ジスム夕一ゼ A) 及び D n a Kの発現レベルが増加することが 2 - D P AG Ε分析からわかった（図 4 Α及び表 1、表 2 )。マイクロアレイの分析結果からも、定常期における s o d B (過酸化ジスム夕ーゼ B) mR N Aの発現増強が確認できた（ 2. 7倍）。 A d a m変異体における好気的呼吸鎖、過酸化ジスム夕一ゼ（S o d A、 S o d B)、及び分子シャペロン（D n a K) の成分合成量が増加していることから、野生型よりも変異体の方がより多くのエネルギー（A T P ) 及び〇₂を産出し（図 6を参照）、またかかる酵素類が、過剰な酸素遊離基が及ぼす有害影響から細胞を防御していることが考えられる。好気的条件での定常期では T C Aサイクル酵素類のレベルは減少することが知られている (Mol. Microbiol. 12, 833-843, 1994、 EMBO J. 15, 3219-3228, 1996)。この制御機構はエネルギー産出量を調製し、過剰〇₂の産生を抑制する。 S ο d Aの発現も好気的条件下では抑制されることが報告されてお

6 り、主にこの酵素が、好気的培養における過酸化ジスム夕ーゼ活性をもたらしてレる（J. Biochem. 120, 1055- 1063， 1996)。 S o d Aと S o d Bの合成は定常期後期に好気的条件下で誘導され、夕ンパク質の酸化を防いでレる（J. Biol. Chem. 274， 26027-26032, 1999)。野生型との!:匕較で、対数期及び定常期のいずれにおいても Δ d a m変異体で s o d A及び s o d Bがより高頻度に発現されることから、 D a mは、エネルギー代謝のレベルを成長率のレベルに合わせて酸化による損傷から細胞を守つていると考えられる。

(低好気的条件下での遺伝子発現プロフィール）

好気的条件下での分析に加え、低好気的条件下での発現プロフィールについてもマイクロアレイを使って実験した。かかる条件下では Δ d a m変異体で、多くの呼吸遺伝子、特に硝酸塩レダクターゼの発現が著しく減少した（図 3参照）。よってこれらの酵素は、転写段階で D a mメチル化により直接又は間接的にポジティブ制御されていると考えられる。この結果と上述の結果を総合すると、 G A T Cのデォキシアデノシンメチル化が、環境変化、特に呼吸鎖における最終受容体である酸素や硝酸塩の存在量の変化に対する大腸菌の適応系の重要な要素であるという興味深い可能性が考えられる。

ある種の鞭毛関連遺伝子の発現もまた、上記条件下で D a mの影響を受けた。鞭毛性、運動性、及び走化性遺伝子は、領域 I ( 2 4分間）、 II ( 4 1分間）、 III a及び III b ( 4 3分間）という染色体上の異なる 4領域においてクラスターを形成することが知られている（Macnab, RM., in Eschericia coli and Salmonella： celluar and Molecular Biology, F. Neidhardt, Ed. (American Society for Microbiology, Washington, DC, ed. 2, 1996),pp l23- 145)。領域 IIに特異的に位置する殆どの遺伝子の発現は、野生型に比べ Δ d a m株において著しく低頻度だった（表 3 B )。

7 (表 3 ) 発現率（ ldam WT)

遺伝子詳細

対数期定常期

A. 硝酸塩還元酵素遺伝子

narG 呼吸硝酸塩還元酵素 1 ひ鎖 0.28

narH 呼吸硝酸塩還元酵素 1 鎖 0.028

nsrl 呼吸硝酸塩還元酵素 1 r鎖ぐ 0.037

na 呼吸硝酸塩還元酵素 2 QT鎖 0.22

napA 推定硝酸塩還元酵素 0.24

B. 鞭毛、運動性、走化性遺伝子

flhE FlhEタンノク質 0.1 6 0.58

flhA FlhAタンパク質 1 .30 1 .04

fl hB Flh Bタンパク質 1 .40 1 .73

che . CheYフォスファターゼ 0.25 nd

走化性タンパク質 CheY、

cheY nd nd

走化性反応調節タンパク質

走化性タンパク質

cheR nd 0.54

メチルトランスフェラーゼ

タンパク質一グルタミン酸

cheB 0.28 nd

メチルエステラーゼ

tap メチル受容走化性タンパク質 Π 0.37 0.45

tar メチル受容走化性タンパク質 Π 0.29 0.32

走化性タンパク質 CheW、

cheW 0.59 0.58

適合タンパク質

走化性タンパク質 CheA、

cheA 0.50 0.71

CheYキナーゼ

motB 走化性 MotBタンパク質 0.65 0.63

motA 走化性タンパク質 M otA 0.49 0.70

fl hC 鞭毛転写活性体 FlhC 1 .23 0.82

flh D 鞭毛転写活性体 FlhD 0.83 0.60

C. 走化性、走気性遺伝子

tr_g メチル受容走化性タンパク質 m 0.81

tap メチル受容走化性タンパク質 Π 0.37

tar メチル受容走化性タンパク質 Π 0.29

aer 走気性受容体 0.24

tsr メチル受容走化性タンパク質 I 0.65

( Δ d a m変異体における電子受容体走性関連遺伝子の発現）低好気的条件下でさらに遺伝子発現の分析を行ったところ、エネルギ —代謝のレベルをモニタ一するセンサータンパク質をコードする a e r の発現が、野生型に比べ A d am株において著しく低下した（表 3 C)。かかるタンパク質は、電気輸送系の複合体と相互作用し、 FADのレドックス状態における呼吸活性を監視モニターする。酸素濃度等の環境シグナルは C h e A及び C h e Yに伝達され、走気性と呼ばれるプロセスにより大腸菌の運動性を制御している（Mol. Microbiol. 28， 683-690, 1998、図 7を参照）。限られた酸素供給量の中で大腸菌細胞は、至適酸素濃度を備えた環境に移動する。その一方で硝酸塩等の別の受容体が酸素の代わりに電気受容体として機能し、走気性様行動を誘導する（J. Bacteriol.140, 567-573, 1979、 Mol. Microbiol.28, 683-690, 1998)。 t a rや t a p等の走化性関連遺伝子の発現もまた Δ d am株において減少することは興味深い（表 3 C)。表 3 Bに示した結果と総合すると、走性関連遺伝子 ( a e r , t a r , t a p, c h e A、 c h e Y、 mo t A、 m o t B) 及び数種の鞭毛遺伝子の発現は、 A d am変異体において著しく減少していた。

これと関連して、走化性と運動性関連遺伝子との発現の動的平衡が、鞭毛指向性及び細胞侵入性の調節に重要な役割を担っていると示唆されることを上記した (Infect. Immun.60, 2475-2480, 1992)。

(遺伝子発現において考えられる D a m仲介転写調節）

上記の結果及び検討に基づき、大腸菌における多くの遺伝子発現は、 DNAのD amメチル化により直接又は間接的に調節されると推定されたが、かかる調節の詳細な機構は実際に実験を行って解明する必要がある（J. Mol. Biol.257, 574-585, 1996)。 T CAサイクル、硝酸塩レダクターゼ、 S O S誘導、及び酸化経路に関わる多くの遺伝子の上流領域における G AT C配列と調節配列の間に実際にみられる重複について表 4 に示した。 GAT C配列の多くは F NR及び Z又は C R P認識部位に存在していた。 G AT C配列が転写調節認識配列内に存在しない場合があるものの、見いだされた調和発現の一部が、 D a mメチル化による上記遺伝子類の転写調節を直接反映していることを上記の結果は強く示唆している。

(表 4 )

クルーフ退 1E子 GATC部位の数結合コンセンサス

TCA gltA 2 Fnr, Crp

sucA, sucD 1 r nr, Crp

icdA 1 Fnr, Crp

mdh 0 ―

IpdA 1

NADZ NAD Hサイクル nuoA 2

硝酸 ¾還元酵素 narG HI 1 Fnr， Crp

narZ 3 Fnr， Crp

napA 2 Fnr *

走気性、走化性 aer 3

鞭毛 tar 2

motA 1

flhD 2 Crp

SOS recA

ruvA

lexA

酸化的ストレス sodA

sod B

(ネズミチフス菌の A d a m変異体における低侵入性表現型の考えられる推刚)

ネズミチフス菌の A d a m変異体は細胞侵入性及び感染性を欠損していることが近年報告されている（Science, 284， 967-970, 1999、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11578- 11583, 1999)。 D a mにより調節される特異的遺伝子の関与は未だ解明されていないが、かかる表現型は、宿主細胞及びマクロファージ内での増殖能を含むサルモネラ菌類の病原機構から区 ¾りされる ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11578- 11583, 1999) , その一方で、鞭毛生合成、走化性、及び運動性に関与する遺伝子は、宿主細胞に侵入する際に重要な役割を果たしており（Infect. Immun. 56, 1967-1973, 1988、 Infect. Immun. 60, 2475-2480, 1992)、硝酸塩レダクターゼをコードする _{n a} r G及び n a r Zが細菌感染性に関係していることが知られている（Mol. Microbiol. 35， 1017-1025, 2000、 Microbiology 145, 3035-3045, 1999)。本発明の結果は、低好気的条件下では、ある種の走化性関連遺伝子（表 3 Bの領域 11)、及び硝酸塩還元関連遺伝子（表 3 A) の発現量が、野生型に比べ Δ d am変異体で極めて低いことを示している。これらの A d am特異的発現プロフィールが、ネズミチフス菌 Δ d am変異体の低侵入性表現型に関係していることが考えられる（図 7 )。公開データベースに登録されているネズミチフス菌と大腸菌との高度な配列相似性を考慮すると、 D amは両細菌において同様な調節機能をもっと考えられる。

(評価）

D amメチラーゼは、大腸菌及びネズミチフス菌を含むプロテオバクテリア鋼、ガンマサブクラスという限定された細菌種に存在している。 D amによるメチル化は、大腸菌における代謝、感染性、複製、及び不適正塩基対の修復の調節に関係している（Marinus, MG. in Eschericia coli and Salmonella ： celluar and Molecular Biology, F. Neidhardt, Ed. (American Society for Microbiology, Washington, DC, ed.2, 1996), pp782-791, J. Bacteriol. 182, 463-468, 2000、 Science, 284, 967-970, 1999、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11578-11583, 1999)。さら ίこ D amによる D N Aメチル化は、姉妹染色体分離の系統化に不可欠である。また S e Q A及び M u k F E Bも、姉妹染色体の位置決定に重要な役割を果たしており、興味深いことに D am、 S e q A、及び Mu k F E B は、大腸菌及び関連細菌においてのみ存在している（Genes Cells 5, 327-341, 2000)。ユーバクテリアにおける D a mメチラーゼは、限定的にしか見いだされていないが、 D N Aメチル化は遺伝子発現調節の普遍的な機構であり、細菌だけでなく真核生物にもみられる機構である。一例として C p Gメチラーゼは、哺乳類の遺伝子発現に対し重要な役目を負い、かかるメチラ一ゼの発現自体は腫瘍タイプや細胞年齢に依存している（Pro Natl. Acad. Sci.USA.96, 8681-8686, 1999)。

本発明で得られた結果からは、 d amによるメチレ一シヨンが異なる成長期、種々の酸素供給条件下において、様々な要求を満たすべく細胞エネルギーレベルを適応させることに重要な役割を担っていることが示唆される。好気的条件下では、 A d am変異体は、明らかにそのエネルギー合成レベルを成長条件に順応し得ず、酸化ストレスが部分的に誘導された。さらに、低好気的条件下における△ d am変異体は野生型に比ベ、走気性及び電気受容体走性遺伝子の発現の減少を示し、低好気的条件下では Δ d am変異体もそのエネルギー合成を順応させることができないことを示唆している。かかる D amメチル化による遺伝子発現の成長依存的制御は、 D amがその代表的なメチル化であり環境変化に応答して細胞活性を順応させて生存をはかるという重要な役目を担っている大腸菌及び関連細菌で観察される。

[実験方法]

(バクテリアの株、培地及び成長コンディション）

バクテリアの株は E . c o l i K 1 2株由来の、 K K 4 6 (YK1100:trpC994l) (Mol. Gen. Genet. 250, 241-251, 1996) と KK 3 3 5 (dam-16::kam) (Gene 73, 531-535, 1988) を使用した。 KK 3 3 5は d a m欠損変異体（A d am) で KK 4 6由来である（Hiraga, unpablished data)。すべての培養は L B (Luria Bertani) 培地にて行つた。好気的な培養条件は 3 7 、 1 リットルフラスコ中 2 0 0 m l の液体培地を入れた状態で 1 7 0 r pmの回転とした。また、低好気的な培養条件は 3 0 0 m l のフラスコを用いた以外は好気的な条件下と同じとした。

(R N Aの単離）

細胞懸濁液からの全 RN Aの調製はホットフエノール法を改良した方法に従って行った (J. Biol. Chem.260， 3063-3070， 1985)。ゾクテリアを培養後、細胞を 2分間遠心（ 1 2， 0 0 0 X g) することにより回収し、該細胞を 0. 5 m l の溶液 A ( 0. 5 % S D S、 2 0 mMの酢酸ナトリウム、 1 0 mMの EDTA) と懸濁した後、 6 0でに温めておいた酸性フエノール（p H 5. 5 ) 0. 5 m 1 とピペッティングにより混合した。この混合液を 6 0 で 5分間静置した後、 1 2 0 0 0 r pmで 3 分間遠心をかけ、沈殿を得た。さらにもう一度溶液 Aとフエノールの処理を繰り返して行った。沈殿に対してフエノール Zクロ口ホルム（ 1 ： 1、 H 5. 5 ) 溶液を加え懸濁した後、 3倍量のエタノールを加え R NAを沈殿させた。遠心の後 RN Aのペレットを乾燥し、 5ユニットの R n a s e— f r e e DN a s e (宝酒造株式会社、大津、日本）を含む D N a s e溶液（ 1 0 0 mMの酢酸ナトリウム、 5 0 mMの Mg S 0₄) で溶解し、室温で 1時間静置した。さらに 2度目のフエノールクロロホルム溶液処理と RN A沈殿処理を行った。精製された全 RN A を、分解されていないかどうか及びゲノム D N Aのコン夕ミネーシヨンなしに 2 3 と 1 6 Sのリボソーム RNAを得ることができているかを調べるために、 1 %ァガロースゲル電気泳動にかけた。

( E . c o l iのマイクロアレイの準備）

宝酒造株式会社（大津、日本）への注文により調整されたグラススライド上のマイクロアレイを使用した。アレイは E. c o l iからの 40 2 7遺伝子からなり、本発明者らの研究室において以前にクローン化されている（詳細はホームページ： http：〃 ecoli.aist-nara.ac.jp)。ヒ卜 /3 ァクチンの遺伝子を陰性のコントロールとして用いた。スライドにスポットする E . c o l i遺伝子は以下のベクター特異的なプライマーを用いて P C R で増幅した。（プライマー 1 ： 5'- ATCACCATCACCATACGGATCCGGCCCTGA-3'：配列番号 1 ( P 1 )、プライマ一 2： 5'-TTCTTCTCCTTTACTGCGGCCGCATAGGCC-3'：配列番号 2 ( P 2 ))

E. c 0 1 i マイクロアレイは、現在は宝酒造株式会社（大津、日本）から入手可能である。

(ラベルされた c D NAの準備とアレイハイブリダイゼーション及びデ —夕の取得）

c D N Aラベルとマイクロアレイハイブリダーゼーションは Mガイド (http://cmgm.stanford.edu/ Drown/mguiae/index.html, Science 278, 680-686, 1997) に従って行った。蛍光ラベル化された c D N Aプローブを X L (Life Science) により供給されているキットにより調製し、 4 nm o 1 の C y 3 — d UT P又は C y 5 — d UD P (アマシャムフアルマシア） c D N Aプローブを、 C e n t r i — s e p ( Princeton Separations)、フェノールクロ口ホルム抽出とェタノ一ル沈殿により精製した。 c D N Aプローブを乾燥させた後、 9 / 1 の水で溶解した。 2つの c D NAプローブを、最終容量が 2 3 1 となるようにハイプリダイゼーシヨンバッファ" （ 4 X S S C、 0. 2 % S D S 5 X D e n h a r d t ' s s o l u t i o n , l O O n g /m 1サケ精子 D N A) を加え、 9 8 で 2分間、熱をかけることにより変性させた。変性させた c D N Aプローブをカバ一スリップの下のマイクロアレイに添加した。ハイブリダィゼーションを 6 5 "Cで 1 6時間行い、スライドを 6 0でで 5分間 2 X S S Cで洗い、さらに 6 0 で 0. 1 % 305を含む 0. 2 X S S Cで洗い、最終的に室温で 0. 2 X S S Cで洗った。スライドを GM S 4 1 8アレイスキャナー（Genetic Microsystems) を用いて蛍光強度をスキャンし、 1 6ビットイメージファイルに記録した。マイクロアレイの各々のスポットカらのシグナルは I ma g e n e s o f t w a r e (BioDiscovery, ロサンジェルス、 CA、 U S A) を用いて定量化した。

(マイクロアレイのデータ解析）

バックグラウンドから確かなデータと区別するために、本発明者らは最初にヒト /3ァクチン遺伝子からなるネガティブコントロールスポットの強度を最初に集積し、平均値と標準偏差を決定した。 E. c o 1 i遺伝子ハイプリダイゼーションからのデ一夕を 3つのグループに分類した, グループ 1の C y 3と C y 5のシグナル強度は、ネガティブコントロールの + 1 S Dより大きかった。グループ 2の C y 3か C y 5のどちらかのシグナル強度は、強度値 1 0 0 0よりも大きかった。グループ 3の C y 3と C y 5のシグナルは、ネガティブコントロールの + 1 S Dよりも低かった。本発明者はグループ 1のすベてのスポットの比率（C y 5ノ C y 3 ) の平均値を用いて、グループ 1のすベてのスポットを標準化した。比率（C y 5 ZC y 3 ) の平均を 1 と定義した。スポットが 0. 5より小さいか又は 2より大きいものを重要な変化として認識した。グループ 2のスポッ卜の比率は、 C y 3又は C y 5の蛍光シグナルの欠落のため決定はできなかった。 C y 3又は C y 5の最も高い強度（強度値 1 0 0 0を超える）を示すスポットは発現レベルが変化していると考えられた。グループ 3のスポットは検出不可能なものとして認識され、廃棄された。

(ラジカルフリ一高還元性 2次元ポリアクリルアミド電気泳動（R F H R 2 - D P AG E) 法によるプロテオーム分析）

E. c o 1 i をマイクロアレイ解析で用いた、同じ好気的な条件下で培養した。 4 0 0 m 1 の細胞を図 2の 1 (対数期、 OD 6 0 0 6 0 ) と 2 (定常期、約 8時間後）の時に回収した。湿重量が約 1. 0〜 1. 2 gの細胞を、 1. 5 m l のバッファー 1 ( l O O mM CH₃ CO〇 NH₄、 1 5mM (CH₃ C〇0) ₂Mg、 2 0 mM T r i s _HC l ( H 7. 6)、 6 mM )3—メルカプトエタノール、 0. 5mM フエ二ルメチルスルホニルフルオラィド（PMS F)) に懸濁し、超音波処理した後、 9 0 0 X gで 1 0分間遠心した。さらに上清（ s u p ) を 1 0 O O O X gで 2 0分間遠心した。沈殿（ P p t ) を 2 m 1 のバッファー 1で懸濁し、 l O O O O X gで 2 0分間遠心した。得られた沈殿を 0. 5〜 0. 7 m l のバッファ一 1で懸濁した。このフラクションを " CD" と定義した。 1 0 0 0 0 X gで 2 0分間遠心した後の上清を、さらに 1 O O O O O X gで 1 8 0分間遠心した。この上清を " R P S" と定義し、沈殿を 0. 5 m 1のバッファ一 1 と懸濁し、 1 7 O O O X gで 1 0分間遠心した。この上清を "C R" と定義した。

P R S、 C D、 C Rフラクションそれぞれを 3 3 mM M g C l ₂を含む 6 7 %酢酸の溶液に懸濁し、 1 0 0 0 0 X gで 1 0分間遠心した。沈殿を同じバッファーで懸濁し、溶離の操作を繰り返した。これらの 2 つの上清を化合させ、セフアデックス G— 2 5 (Medium) により脱塩した。このサンプルをそれから凍結乾燥した。

凍結乾燥させたタンパク（約 l〜 2 mgZゲル）を記載（J. Biochem. 100， 1583-1594, 1986、 http://www.osaka-med.ac.jp/~yhide/rfhr_2- d_page.htm) の方法で、 R F HR 2 - D P AG Eで解析した。ただし、サンプルチャージングバッファー（ 5 0 X) 中の氷酢酸の容量を 7 4m lではなく、 7. 4m l とし、 2 mmの厚さのゲルを、改良した溶液中で用いた。

R FHR 2 - D P AG Eの後、タンパク質を視覚化するためにゲルを C B B (Coomasie Brliant Blue) で染色した。タンパクのスポットをデンシトメ一夕一で定量化し、野生株のタンパクスポッ卜の濃度を

△ d a m株と比較した。 A d a m株で増加していたタンパクスポットを野生株と比較し、 RH F R 2 - D P A G Eのための遺伝子タンパクインデックス（http：〃 ecoli.aist-nara.ac.jp/) により確認した。遺伝子夕ンパクインデックスに含まれないスポットはべプチドシークェンスか又は MAL D I — TO FMSにより確認した。すなわち R F HR 2 - D P AG Eにより、タンパクを P VD F膜にプロットし、島津 P P S Q— 2 3ぺプチドシークェンサ一を用いるか又はタンパクスポットをプロテイナーゼ（エンドプロティナーゼ LysC) で消化し、 M AL D I — TO F M S解析（V o y a g e r ) により、 N末端アミノ酸シークェンスを決定した。

各々のタンパクの濃さをコントロールタンパクにより標準化したところ、野生株と Δ d am株との濃度の差は非常にわずかだった。本発明者は 2つか 3つのタンパクをコント口一ルタンパクとしてそれぞれのフラクシヨンで用いたところ、同じ結果を得た。図 4と表 1、表 2、表 3は、各々の Δ d am株タンパクと野生株との相対的な濃度の比率において、対数期では 1. 2又は定常期では 1. 3より多いいことを示すタンパクを示した。

(ソフトウエア分析）

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) パスヮエイつ夕べ一ス（Nucleic Acids Res. 28, 27-30, 2000) を生物学的なカスケ一ドで調節される D a mの解析に用いた。また、 G e n e s p r i n g v e r 3. 0 (Silicon Genetics, カリフォルニア）を、ソフトウェアツールとして統計学的解析に用いた。計算は Excel 2000を用いて行った。

[図の説明]

図 1. 大腸菌ゲノム全体にわたる遺伝子の上流領域における GAT Cクラスターの頻度分布の様子を示す図である。それぞれの遺伝子の 5 0 0 p領域上流に存在する GAT C配列の数を、ゲノム内に想定される全てのオープンリーディングフレーム（OR F) で算出した。異なる数の G A T C配列が存在する O R Fの頻度をプロットした。

図 2. 異なる好気的条件下での細胞成長の様子を示す図である。 YL 1 1 0 0 (野生型、黒塗りの丸）及び KK 3 3 5 (A d am, 白抜きの四角）の好気的（A) 及び低好気的（B) 培養物の成長を、 6 0 0 nmの光学密度（OD) で観察した。第 1段階（対数期）及び第 2段階（定常期）において細胞を回収し、 RNA又はタンパク質を抽出して、それぞれマイクロアレイ及び 2—D P AGEにより分析した。

図 3. 40 2 7大腸菌遺伝子における発現プロフィールのクラスターグラム、すなわち Δ d am変異の効果を示す図である。遺伝子発現プロフィールはコラムに示した。成長期及び好気的条件は左のコラムに示した ( 1 ：好気的条件下での対数期、 2 ：好気的条件下での定常期、 3 :低好気的条件下での対数期、 4 ：低好気的条件下での定常期）。（参考図：マイクロアレイ分析の結果から、野生型に比し△ d a m株で増加した発現を赤で示し、緑色は発現の低下を示す。）各遺伝子の相対的発現レベルは 2回の実験結果から推定した。走化性、移動度、嫌気的呼吸、 S O S 応答、及び T C Aサイクルに関与する代表的ないくつかの遺伝子の発現プロフィールを示す。野生型と比較して Δ d am変異体における曝気及び成長期依存的変化； TC Aサイクル関連遺伝子セッ卜におけるより高度な発現（B ：好気的条件下での定常期）、及び走化性、鞭毛、硝酸塩関連遺伝子におけるより低度の発現（A ：低好気的条件下での対数期）を矢印で示した。

図 4. 対数期又は定常期での野生型及び△ d am変異体株におけるタンパク質の分析を F RHR 2 - D PAG E (プロテオーム）により行つた結果を示す図である。 Lブロス中で、かつ好気的条件下で成長させた野生型及び Δ d am細胞の試料を画分化し、「材料と方法」の項で記述した手法等に従い、 2 — D電気泳動法により分析した。 P R S (リポソ —ム後上清： post ribosomal supernatant；)、し！） (粗屑： crude debrisハ及び C R (粗リボソーム： crude ribosome) 画分の 2— Dパターンを、それぞれ（A)、（B)、及び（C) に示した。矢印は、野生型と比し、 Δ d am変異体において対数期で 1. 2倍、また定常期で 1. 3倍以上に増加したタンパク質を示す。上述の分析結果を表 1及び表 2にまとめた。 A d a m変異体と野生型株との間で、対数期の C Rの 2— Dパターンに有意の差はみられなかった。 2〜 4回実験を繰り返し、再現性を確認した。この図では代表的な結果を示した。

図 5. マイクロアレイ分析（イタリック文字）及び 2— D P AGE分析（普通の文字）の結果、 T CAサイクル酵素は、野生型に比し A d a m株において高度に発現されたことを示す図である。マイクロアレイ法による各遺伝子の発現率（A d a mZ野生型）を括弧内に示した。

図 6. 大腸菌での代謝エネルギー及び〇 ₂の産生における酸化プロセスの様子を示す概略図である。 T CAサイクル及び n u oオペロンの産物が、好気的呼吸機構の一部を成している。グルコースの解糖により産生されたピルビン酸は、 T C Aサイクルを開始する基質であり、 NADH は NADを酸化して産生される。 N ADZN ADHサイクルは循環し、 Q 8と結合して 0₂を産生する。この 0₂は、過酸化ジスム夕一ゼの S o d A及び S o d Bにより H₂0₂に転化される。

図 7. 走化性、移動度、硝酸塩還元、及び宿主侵入の関係を図式化した概略図である。好気的条件下では、呼吸鎖における最終的な受容体としての酸化物の量は少なかった。かかる条件下のとき大腸菌細胞においては、酸化物の代わりに硝酸塩を最終的受容体とし得る。低好気的条件下又は嫌気的条件下では A e rがエネルギー産生の不足を感知し、走気性及び電気受容走性が誘導される。走気性、移動度、鞭毛及び硝酸塩還元関連遺伝子は、細胞の生存維持の上で重要な役割を果たしている。また走化性を感知するタンパク質である T a r及び T a は、類似した走性プロセスに属し、走化性を誘導した。これらの遺伝子もまた、宿主細胞に侵入する際に重要な役割を担っている。産業上の利用可能性

本発明は、細菌の運動性関連遺伝子群の発現を制御することにより、細菌を変異させ、細菌の宿主細胞へ侵入性を制御することにより細菌の感染性を欠失或いは減少した細菌を製造することを可能とした。本発明の、変異して感染性を減少した細菌は、ワクチン生産株として利用することができる。すなわち、変異細菌菌株の宿主への感染性の低下は、これら運動性をつかさどる遺伝子群のグローバルな影響であることが示唆され、該細菌の運動性をつかさどる遺伝子群は、多くの細菌において、ゲノム上に集中して存在することから、本発明においては、この遺伝子群を一括して、変異させる方法により、細菌の感染性を欠失或いは減少させることが可能であることを見い出した。そして、この方法は、特定の細菌種に拘束されないことから、広い範囲の細菌種を対象に、効果的なワクチン生産株の製造を可能とする。

Claims

請求の範囲

1. 細菌の運動性関連遺伝子群の発現を制御することを特徴とする細菌の変異方法。

2. 細菌の運動性関連遺伝子群の発現を、細菌の DN Aメチル化酵素遺伝子を変異させて制御することを特徴とする請求項 1記載の細菌の変異方法。

3. 細菌の DNAメチル化酵素遺伝子が、 D amDN Aメチラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項 2記載の細菌の変異方法。

4. 細菌の運動性関連遺伝子群の発現の制御が、運動性関連遺伝子群の DNAの GATC配列のアデニンのメチル化の減少によることを特徴とする請求項 3記載の細菌の変異方法。

5. 細菌の運動性閧連遺伝子群の発現の制御が、 TCAサイクル酵素類をコ一ドする遺伝子の発現の制御であることを特徴とする請求項 1〜 4 のいずれか記載の細菌の変異方法。

6. 細菌の運動性関連遺伝子群の発現の制御が、嫌気的呼吸に関与する酵素類をコードする遺伝子の発現の制御であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の細菌の変異方法。

7. 細菌の運動性関連遺伝子群の発現の制御が、走性関連遺伝子類の発現の制御であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の細菌の変異方法。

8. 細菌の運動性関連遺伝子群の発現の制御が、鞭毛関連遺伝子の発現の制御であることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の細菌の変異方法。

9. 請求項 1〜 8のいずれか記載の細菌の変異方法により変異させたことを特徴とする細菌変異株。

1 0 .細菌が大腸菌であることを特徴とする請求項 9記載の細菌変異株。

1 1 . 細菌の変異が、運動性関連遺伝子群の発現の制御により、細菌の宿主細胞侵入性を制御したものであることを特徴とする請求項 9又は 1 0記載の細菌変異株。

1 2 . 請求項 9〜 1 1のいずれか記載の細菌変異株を、ワクチン生産株として用いることを特徴とするワクチンの製造方法。

1 3 . 請求項 1 2記載の製造方法により製造されたワクチン。