WO2003055507A1

WO2003055507A1 - Remedies for anorexia or lifestyle-related diseases and method of screening the same

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Publication number: WO2003055507A1
Application number: PCT/JP2002/013757
Authority: WO
Inventors: Eiji Sugaru; Mitsugu Yamanaka; Junji Ichihara; Mutsuo Taiji
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2003-07-10
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Description

明細書

拒食症又は生活習慣病治療薬及びそのスクリ一二ング方法技術分野

本発明は、視床下部で発現するォーファン G P C Rの発現又は機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬に関する。詳細には、本発明は、該 G P C R m R N Aのアンチセンス核酸、該核酸を含む発現ベクターもしくは該発現べクタ一でトランスフクトされた宿主細胞を有効成分とする拒食症治療薬、あるいは該 G P C Rに対してアンタゴニスト活性を有する物質を有効成分とする拒食症治療薬に関する。さらに、本発明は、該 G P C R及び G蛋白質の共発現系及びそれを用いた拒食症治療活性化合物のスクリーニング方法に関する。本発明はまた、該 G P C Rの発現又は機能を増強する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬に関する。詳細には、本発明は、該 G P C Rに対してァゴニスト活性を有する物質を有効成分とする生活習' 病治療薬に関する。さらに、本発明は、該 G P C R 及び G蛋白質の共発現系及びそれを用いた生活習慣病治療活性化合物のスクリ一ユング方法に関する。背景技術

近年、食生活の西洋化や社会的ストレスの増加等により、肥満とそれに付随する生活習慣病、特に II 型糖尿病患者の増加が著しい。本症例の治療には、はじめに運動療法や食事療法が行われるが、本療法によっても体重コントロールが不十分な場合には薬物療法が行われる。この際、摂食量と体重、血糖コントロールが良好で、かつ安全な治療薬が望まれている。

一方、現代のストレス社会は、安易なダイエットの流行とも相まって、思春期の女性を中心に拒食症のような心因性の摂食障害の急増をもたらしている。これらの病気を根本的に治療するには、心理的な問題を解決することが不可欠である力サポート的な治療として摂食行動を強制的にコントロールするための薬物療法が施されることもある。この場合の治療薬も、体重や血糖値をコントロールしながら摂食を促進し得るものであることが要求される。

摂食のコントロールは主に中枢神経系で行われており、特に視床下部には、食欲等の人間の本能的な行動を支配する神経系が多く存在している。実際に、ラットの視床下部腹内側核を破壌すると過食と肥満をもたらし、一方、視床下部外側核を破壌すると摂食行動を行わなくなる。また、これまでに、摂食調節にかかわるレプチン、神経ペプチド Y ( PY) 等の神経ペプチドの受容体が視床下部に局在することが示されており、このことからも視床下部が摂食行動に重要な器官であることは明白である。

視床下部をはじめとする中枢神経系における生理活性物質の受容体、特に G蛋白質共役型レセプター（G P C R ) 力摂食行動と相関することが明らかとなつている。例えば、セロト-ン 5— T H T₂ Cレセプターのノックアウト（K〇）マウスは慢性的な過食をきたすことが知られている。また、メラノコルチン 4レセプターのアンタゴニストは摂食を増加させ、逆に、 N P Y Υ 5レセプターのァンタゴニストは摂食を抑制する。

従って、視床下部の神経系を刺激することは摂食行動等に影響を及ぼすものと考えられ、視床下部で発現する G P C Rを介したシグナル伝達を、低分子化合物を用いて代替的に操作することは、摂食量と体重、血糖等をコントロールするという上記の目的にかなうものである。しかし、このような作用機序を持つ薬剤は現在のところ上市されておらず、このような薬剤の開発が大いに望まれるところである。

従って、本発明の目的は、外的因子、特に摂食行動に関わる G P C Rの発現もしくは機能を抑制あるいは促進する因子を作用させることによって、摂食行動を調節し、もって過食、肥満症を主因とする生活習慣病、あるいは拒食症を治療する手段を提供することである。また、本発明の別の目的は、過食もしくは拒食といった摂食障害、肥満症等の調節作用を有する化合物、並びにそのような化合物のスクリーエング方法を提供することである。発明の開示

上記の目的を達成するために、本発明者らはまず、視床下部に発現する受容体をコードする遺伝子につき検討した結果、あるォーファン GPCR (以下、 GP RC 5Dという）の遺伝子力 S肥満モデルマウスの視床下部に発現していることを見出した。そこで、本発明者らは、当該受容体をコードする mRN Aのアンチセンスオリゴ DNAを肥満モデルマウスに投与してその発現を阻害したところ、実際に摂餌量が増加し、また血糖値が上昇した。このことから、 GPRC 5Dは摂食行動を負に調節るシグナル伝達に関与する受容体であること、従って、この受容体の発現もしくは機能を阻害する物質は、拒食症のよ,うな摂食障害に対して治療効果を発揮することが明らかとなった。また反対に、. この受容体の発現もしくは機能を増強する物質は、過食、肥満等に由来する I I型糖尿病をはじめとする生活習慣病に治療効果を発揮するはずである。そこで、本発明者らは、 GPR C 5Dと各種 G蛋白質の共発現系のシリーズを構築し、それを用いて G PRC 5 Dのァゴニスト又はアンタゴニストを探索することにより、拒食症又は生活習慣病に対して治療活性を有する化合物をスクリーニングする方法を開発して、本発明を完成するに至った。.

すなわち、本発明は、視床下部で発現する G PC R、 GPRC 5Dの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬を提供する。 GPRC 5 Dの発現を特異的に抑制し得る物質としては、好ましくは G PRC 5 Dをコードする mRNAのアンチセンス核酸が挙げられる。この場合、アンチセンス核酸はそれ自体としてだけでなく、該核酸をコードする発現ベクターや、該発現べクタ一を導入された宿主細胞の形態でも提供され得る。一方、 GPRC5Dの機能を特異的に抑制し得る物質としては、当該受容体のアンタゴエストが挙げられる。本発明はまた、 G PRC 5Dの発現もしくは機能を増強する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。 G P R C 5 Dの機能を特異的に増強し得る物質としては、当該受容体の生理的リガンドゃァゴニストが挙げられる。

従って、別の本発明は、 GPRC 5Dのアンタゴニスト又はァゴニストをスクリーニングすることによる、拒食症又は生活習慣病に対して治療活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。当該方法は、 G PRC 5 D又はその均等物を含む脂質二重層膜と、あるファミリーに属する G蛋白質ひサブユニット（以下、 Go; ともいう）の受容体結合領域及び任意の G蛋白質 α サブュ-ットのグァニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドとを、必須の構成要素として少なくとも包含する系を 1構成単位とし、該構成単位を Ga の各フアミリーの受容体結合領域について構築して得られる、一連の受容体一 G蛋白質共発現系において、 G蛋白質の GDP ■ GTP交換反応又は該 G蛋白質が作用する効果器の活性を、被験物質の存在下及び非存在下で比較することを特徴とする。従って、本発明はまた、上記のような一連の受容体一 G蛋白質共発現系からなる、拒食症又は生活習慣病に対して治療活性を有する物質のスクリーニング系を提供する。

本発明はさらに、上記スクリーニング系及びスクリーニング方法により得られる、拒食症又は生活習慣病に対して治療活性を有する物質を有効成分とする拒食症治療薬又は生活習慣病治療薬を提供する。

本発明のさらなる特徴及び本発明の利点は、以下の '「発明を実施するための最良の形態」の記載から明らかとなるであろう。図面の簡単な説明

図 1は、肥満マウスの摂餌量に及ぼす G PRC 5 Dのアンチセンス DN A投与の効果（投与直後〜 48時間後）を示す。黒色のカラムはコントロール DNA投与群、白色のカラムはアンチセンス DNA投与群における摂餌量（平均士標準偏差、コントロール DNA投与群 n = 4、アンチセンス DNA投与群 n = 4) をそれぞれ示している。図中の *は両群間に有意な差があることを示している（Pく 0. 0 5、 Studentの t検定）。

図 2は、肥満マウスの血糖値に及ぼす G P R C 5 Dのアンチセンス DN A投与の効果（投与直後〜 4 8時間後）を示す。黒色のカラムはコントロール DNA投与群、白色のカラムはアンチセンス DNA投与群における血糖値（平均土標準偏差、コントロール DNA投与群 n = 4、アンチセンス DNA投与群 n = 4) をそれぞれ示している。図中の *は両群間に有意な差があることを示している（p < 0. 0 5、 Studentの t検定）。

図 3は、正常マウスおよび肥満マウスにおける GPRC 5 D遺伝子の飽食および絶食状態での発現変動を示す。黒色のカラムは飽食時、白色のカラムは絶食時における G P RC 5 D/GAPDH比（平均土標準偏差、各群 n = 3) をそれぞれ示している。

図 4は、 G PRC 5 Dを単独で、あるいは各種 G o;蛋白質と融合して一過的に発現させた CHO— K 1細胞の抽出液中の c AMP濃度を示す。 m o c kは、 pcDNA3.1 (+)で、 G P R C 5 Dは pcC5D で、 G P R C 5 D— G sは pcC5D/His/G ひ S2 で、 G P R C 5 D— G iは pcC5D/His/G a i2 で、 G P R C 5 D_G qは pcC5D/His/G a 16 でそれぞれトランスフエクトした C HO— K 1細胞を示している。発明を実施するための最良の形態

本発明は、視床下部で発現する GP CR、 G PRC 5 Dの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬を提供する。

「GPR C 5 D」は、代謝型グルタミン酸レセプター様ファミリー（ファミリ一 C) の第 5群に分類される一連のヒト G P CRのアミノ酸配列を用いた E S T データベースのホモロジ一検索により新たに見出された、配列番号 2記載のァミノ酸配列からなるヒト G P CR蛋白質の 1つである（Brauner - Osborne ら， Biochim. Biophys. Acta, J518(3)： 237-48 (2001) ;GeneBankに受託番号: AF209923, XM006896, 匪 018654 として登録されている）。しかしながら、その生理機能や生' 理的リガンド、共役する G蛋白質（αサブユニット）のサブタイプ等については不明のままであった。本発明者らは、この受容体遺伝子が肥満モデルマウス視床下部で発現していることに着目-して研究を進めた結果、上述のように、この蛋白' 質が摂食中枢の刺激に関与する膜受容体であることを見出した。

ヒト G PRC 5 Dに対応する G P CRホモログが他の哺乳動物にも存在することが知られている。 [例えば、マウスから、ヒト GPRC 5Dとアミノ酸レべルで約 8 2%の同一性を有するホモログ mG p r c 5 d (配列番号 4) が見出されている（Brauner-Osborneら，上述； GeneBankに受託番号： AF218809として登録されている）以下、単に「GPRC 5D」と記載される場合は、ヒト GPRC 5 Dとそのマウスホモログとを包括的にいうものと理解されたい]。従て、本発明の拒贪症治療薬は、ヒトのみならず他の哺乳動物における摂餌障害の治療への使用をも意図している。現代の社会環境は家畜やペット等の動物にとっても高ストレス環境であるといえ、したがって、本発明は獣医学の分野への適用においても有用である。

本発明の拒食症治療薬は、 GPRC 5 Dの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分として含有する。ここで「発現」とは、受容体蛋白質が産生され且つ機能的な状態で細胞膜上に配置されることをいう。従って、「発現を抑制する物質」は、遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、蛋白質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル、膜への輸送レベル及び蛋白質フォールデイングのレベル等の、い力なる段階で作用するものであってもよい。一方、「機能を抑制する物質」とは、いったん機能的な状態で細胞膜上に配置された受容体に作用して、その活性型と不活性型との平衡状態を、少なくともより活性側にシフトさせない物質をいう。

GPRC 5 Dの発現を抑制する物質としては、転写抑制因子、 RNAポリメラーゼ阻害剤、 RNA分解酵素、蛋白質合成阻害剤、蛋白質分解酵素、蛋白質変性剤等が例示されるが、細胞内で現する他の遺伝子 ·蛋白質に及ぼす悪影響を最小限にするためには、標的分子に特異的に作用し得る物質であることが重要である。従って、 GPRC 5Dの発現を抑制する物質の好ましい一態様は、 GPRC 5Dの mRNA (配列番号 1 (O R Fのみを示している）又は 3記載の塩基配列からなる）もしくは初期転写産物のアンチセンス核酸である。「ア^チセンス核酸」とは、標的 m RNA (初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的 mRNA (初期転写産物）とハイブリダィズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダィズした状態で該標的 mRNA (初期転写産物）にコードされるポリぺプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類は DNAであつても RN Aであってもよいし、あるいは DNAZRNAキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明のアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチォリン酸型（リン酸結合の P = 0を P = Sに置換）や 2， - O-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリボソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。 .

本発明のアンチセンス核酸の長さは、 GPRC 5 Dの mRNAもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダィズし得る限り特に制限はなく、短いもので約 1 5 塩基程度、長いもので mRNA (初期転写産物）の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、好ましくは約 1 5〜約 30塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。アンチセンス核酸が約 25me rのオリゴ DNAの場合、生理条件下で GPRC 5 Dの mRNAとハイプリダイズし得る塩基配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、通常、約 80%以上の同一性を有するものであればよい。本発明のアンチセンス核酸の標的配列は、了ンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、 G PRC 5 D蛋白質もしくはその機能的断片の翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、 GPRC 5 Dの: mRNAの全配列であっても部分配列であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列は GPRC 5Dの mRNAの 5，末端からコード領域の C末端まで（配列番号 1 記載の塩基配列中塩基番号 1〜1035、又は配列番号 3記載の塩基配列中塩基番号 1〜1047で示される塩基配列）に位置することが望ましい。好ましくは 5' 末端からコード領域の N末端側の領域であり、最も好ましくは開始コドン (配列番号 3記載の塩基配列においては塩基番号 148〜1 50) 近傍の塩基配列である。また、標的配列は、それに相補的なアンチセンス核酸がヘアピン構造等の二次構造を形成しないようなものを選択することが好ましい。

さらに、本発明のアンチセンス核酸は、 GPRC 5Dの mRNAもしくは初期転写産物とハイブリダィズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖 DNAである GPRC 5 D遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、 mRNAへの転写を阻害し得るものであってもよい。

GPRC 5 Dの発現を抑制する物質の別の好ましい一態様は、 G P R C 5 Dの mRNAもしくは初期転写産物を、コード領域（配列番号 1記載の塩基配列中塩基番号 1〜 1035、又は配列番号 3記載の塩基配列中塩基番号 148〜 1 '04 7で示される塩基配列）の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザィムである。「リボザィム」とは核酸を切断する酵素活性を有する RN Aをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴ DNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限り DNAをも包含する概念として用いるものとする。リポザィムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイ口ィドゃウィルソィド等の感染性 RN Aに見られるセルフスプライシング RN A があり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約 40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーへッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約 1 0塩基程度）を mRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的 mRNAのみを^ 異的に切断することが可能である。このタイプのリポザィムは、 RNAのみを基質とするので、ゲノム DN Aを攻撃することがないというさらなる利点を有する。 GPRC 5Dの mRNA が自身で二本鎖構造をとる場合には、 R N Aヘリ力ーゼと特異的に結合し得るゥィルス核酸由来の RN Aモチーフを連結したハイプリッドリボザィムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる Natl. Acad. Sci. USA, ^(10)： 5572-5577 (2001)]。さらに、リボザィムを、それをコードする D N A を含む発現ベクターの形態で使用する場合には、細胞質への移行を促進するために、 t RNAを改変した配列をさらに連結したハイプリッドリボザィムとすることもできる Nucleic Adds Res. , 29(13)： 2780-2788 (2001)]。 · GPRC 5 Dの発現を抑制する物質のさらに別の一態様は、 GPRC 5Dの m R N Aもしくは初期転写産物のコ一ド領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な二本鎖オリゴ RNAである。短い二本鎖 RN Aを細胞内に導入するとその RNAに相; ¾的な mRNAが分解される、いわゆる RNA干渉（RNA i ) と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから [Mature, （6836)： 494-498 (2001)]、リボザィムの代替技術として注目されている。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリポザィムは、 GPRC 5 Dの c DNA配列もしくはゲノミック DNA配列に基づいて mRNAもしくは初期転写産.物の標的配列を決定し、市販の DNA/RNA自動合成機（アブライド - バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。 RNA i活性を有する二本鎖オリゴ RNA は、センス鎖及びァンチセンス鎖を D N AZR N A自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約 90〜約 95 °Cで約 1分程度変性させた後、約 30〜約 70°Cで約 1〜約 8時間ァニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラヅプするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーシヨンすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。

GPRC 5 Dの機能的な発現を翻訳後レベルで抑制する物質の好ましい一態様は、 GPRC 5Dに対する抗体もしくはそのフラグメントである。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。抗 GPRC 5 D抗体のフラグメントは、 GPRC 5 Dに対する抗原結合部位（CDR) を有する限りいかなるものであつてもよく、例えば、 Fab、 F(ab')₂、 ScFv、 minibody等が挙げられる。

例えば、ポリクローナル抗体は、 GPRC 5 D蛋白質あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ゥシ血清アルブミン、 KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) 等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、巿販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に 2〜 3週間おきに 2〜 4回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約 3〜約 1 0日後に全血を採取して抗血情を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ゥサギ、ャギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。

また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例えば、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん一基礎と臨床一」、第 2- 14頁、サイエンスフォーラム出版、 19⁸⁵年）により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に 2 〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約 3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、 NS-1, P3X63Ag8 など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイプリド一マを得る。細胞融合は PEG法 [ Immunol. Methods, 81(2)： 223-228 (1985)] でも電圧パルス法 ybridoma， 7(6)： 627-633 (1988)] であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、周知の E I Aまたは R I A 法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することによ • り選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のィンビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイプリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。

しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、本発明の抗 GP RC 5D抗体は、ヒトと他の動物（例えば、マウス等）のキメラ抗体であることが好ましく、ヒト化抗体であることがさらに好ましい。ここで「キメラ抗体」とは免疫動物由来の可変部（V領域）とヒト由来の定常部（。領域）を有する抗体をいい、「ヒト化抗体」とは CDRを除いて他の領域をすベてヒト抗体に置き換えた抗体をいう。キメラ抗体やヒト化抗体は、例えば、上記と同様の方法により作製したマウスモノクローナル抗体の遺伝子から V領域もしくは CD Rをコードする配列を切り出し、ヒト骨髄腫由来の抗体の C領域をコードする DNAと融合したキメラ遺伝子を適当な発現ベクター中にクローニングし、これを適当な宿主細胞に導入して該キメラ遺伝子を発現させることにより取得することができる。

GPRC 5 Dの機能的な発現を翻訳後レベルで抑制する物質の別の好ましい態様は、 GPRC 5 Dに特異的に結合してその機能的発現を阻害するオリゴヌクレオチド、即ちァプタマ一である。 GPRC 5 Dに対するアブタマ一は、例えば、以下の手順により取得することができる。即ち、まず、 DNAZRNA自動合成機を用いてランダムにオリゴヌクレオチド（例えば、約 60塩基）を合成し、ォリゴヌクレオチドのプールを作製する。次に、目的の蛋白質、即ち G P R C 5 D と結合するオリゴヌクレオチドをァフイエティーカラムで分離する。分離したォリゴヌクレオチドを P C Rで増幅し、前述の選抜プロセスで再度選抜する。この過程を約 5回以上繰り返すことによって、 G P R C 5 Dに親和性の強いァプタマ一を選抜することができる。

G P R C 5 Dの発現を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬は、標的組織（即ち、視床下部）の細胞内に取り込まれて初めてその治療活性を発揮し得る力有効成分である核酸や蛋白質分子は細胞内に吸収されにくく、しかも体内で速やかに分解されやすい。また、通常これらの分子の取り込みはエンドサイト一シスにより行われるので、リソソーム酵素による分解を受けやすい。従って、 G P R C 5 Dの発現を抑制する物質を、視床下部の細胞に安定な状態で送達し、細胞膜の透過性を.向上させ、リソソーム Zエンドソームからの薬剤の遊離を 4¾進するようなドラッグデリバリーシステム（D D S ) の設計が重要である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のオリゴ核酸分子の場合、上述のようにリン酸結合や糖部分（2 ' 位、 3 ' 位等）を修飾した核酸の他、リン酸と糖部分をぺプチド結合に置き換えた P N A、リン酸骨格の代わりにモルフィン骨格を有するオリゴヌクレオチド等、化学修飾により、ヌクレアーゼに対する安定性、細胞内移行、リソソームノエンドソームからの遊離を改善させることが可能であり、これらの修飾ォリゴ核酸は D N AZ R N A自動合成機を用いて容易に調製することができる。

—方、ポリ L一リジン、アビジン、コレステロール又はリン脂質成分等の付属基をオリゴヌクレオチドゃ抗体分子に結合させることによって、細胞膜透過性を向上させることもできる。

さらに、オリゴヌクレオチドゃ抗体分子をカチオン性リボソームに被包して製剤化することもできる。リボソーム中に被包することにより、有効成分はヌクレァーゼゃプ口テアーゼによる分解から保護され、且つリボソーム膜の力チオン性表面は細胞表面の陰性荷電分子と結合してェンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。カチオン性リボソームは、例えば、 DOTMA、 DDAB、 DM R I E等のカチオン性脂質と、膜融合能を持つ中性脂質 DOPEを混合して調製することができる。核酸や蛋白質はポリアユオン性であるので、カチオン性リポソームと混合することにより容易に複合体を形成する。また、リボソーム膜に視床下部の細胞で特異的に発現する細胞表面分子に対する抗体もしくはリガンドを組み込むことにより、細胞特異的なターゲッティングを行うこともできる。例えば抗 GPRC 5 D抗体自体をリボソーム膜に組み込むこともできる。

また、エンドサイトーシスにより取り込まれたリボソームをリソソーム酵素に. よる分解から保護するために、 pH感受性リボソーム（酸性 pHで膜が不安定ィ匕し、リソソームと融合する前にエンドソーム小胞から細胞質に内容物が遊離される）や、紫外線照射等によりウィルス RNAを完全に断片化したセンダイウィルスとの融合リボソーム（センダイウィルスの膜融合能を用いてエンドサイトーシス経路を回避する）を使用することも好ましい。

上記のような剤形に設計された本発明の拒食症治療薬は、適当な無菌のビヒクルに溶解もしくは懸濁して、経口的又は非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは視床下部付近への局所投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、側脳室内への局所投与が挙げられる。

本発明の拒食症治療薬の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人 1日あたり有効成分量として約 0. 0008〜約 2. 5mg/k g、好ましくは約 0. 008〜約 0. 025mg/k gの範囲であり、これを 1回もしくは数回に分けて投与することができる。

G PRC 5 Dの発現を抑制する物質が、アンチセンス核酸、リポザィム又はァプタマーのような核酸分子（以下、有効核酸分子ともいう）である場合、本発明の拒食症治療薬は、該有効核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の有効核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の視床下部細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーダ一に機能的に連結されている力あるいは投与された動物の視床下部細胞内で、一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得るような位置に配置されていなければならない。使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の視床下部細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、 S V 4 0由来初期,プロモーター、サイトメガロウィルス L T R、ラウス肉腫ウィルス L T R、 M o M u L V由来 L T R、ァデノウィルス由来初期プロモーター等のウィルスプロモーター、並びに ]3—ァクチン遺伝子プロモーター、 P G K遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。「一定の条件下に機能的に連結された形態に変化し得る'ような位置に配置される」とは、例えば、以下でさらに詳述するように、プロ'モーターと有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドが、該プロモーターからの有効核酸分子の発現を妨げるのに十分な長さを有するスぺーサー配列により隔てられた、同方向に配置される 2つのリコンピナーゼ認識配列によって分断された構造を有し、該認識配列を特異的に認識するリコンビナーゼの存在下に該スぺーサー配列が切り出されて、有効核酸分子をコードするポリヌクレオチドがプロモータ^ "に機能的に連結されるように配置されることをいう。

本発明の発現べクターは、好ましくは有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネータ一領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬斉 IJ に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。発現ベクターが上述のようにリコンビナーゼ認識配列に挟まれたスぺーサー配列を有する場合、該選択マーカー遺伝子は当該スぺーサ一配列内に配置することもできる。

本発明の発現ベクターに使用されるベクターは特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシェアウィルス、ボックスウィルス、ポリオゥイノレス、シンドビスゥイノレス、センダイウィルス等のウイノレスベタターが挙げられる。アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約 4週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（I T R ) を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。

アンチセンス核酸ゃリボザィム等の有効核酸分子は本来異物であり、これらの構成的且つ過剰な発現は、当該遺伝子を導入された宿主動物にとって毒性が強く、副作用を引き起こす場合も考えられる。従って、本発明の好ましい態様においては、発現ベクターは、不要な時期及びノ又は不要な部位での有効核酸分子の過剰発現による悪影響を防ぐために、有効核酸分子を時期特異的及び/又は視床下部細胞特異的に発現させることができる。このようなベクターの第一の実施態様としては、投与対象となる動物の視床下部細胞において特異的に発現する遺伝子由来のプロモーターに機能的に連結した有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドを含むベクターが挙げられる。例えば、 G P R C 5 D遺伝子のネィテイヴなプロモーター等が挙げられる。

本発明の時期特異的且つ視床下部特異的発現べクターの第二の実施態様として、外因性の物質によってトランスに発現が制御される誘導プロモーターに機能的に連結した有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）'ヌクレオチドを含むベタターが挙げられる。誘導プロモーターとして、例えば、メタ口チォネイン一 1遺伝子プロモーターを用いた場合、金、亜鉛、カドミウム等の重金属、デキサメサゾン等のステロイド、アルキル化剤、キレート剤またはサイト力インなどの誘導物質を、所望の時期に視床下部に局所投与することにより、任意の時期に視床下部特異的に有効核酸分子の発現を誘導することができる。

本発明の時期特異的且つ視床下部特異的発現ベクターの別の好ましい態様は、プロモーターと有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドと力該プロモーターからの有効核酸分子の発現を妨げるのに十分な長さを有するスぺーサー配列により隔てられた、同方向に配置される 2つのリコンビナーゼ認識配列によって分断された構造を有するベクターである。該ベクターが視床下部の細胞内に導入されただけではプロモーターは有効核酸分子の転写を指示することができない。しかしながら、所望の時期に視床下部に該認、識配列を特異的に認識するリコンビナーゼを局所投与するか、あるいは該リンビナーゼをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを局所投与して該リコンビナーゼを視床下部の細胞内で発現させると、該認識配列間で該リコンビナーゼを介した相同組換えが起こり、その結果、該スぺーサー配列が切り出され、有効核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されて、所望の時期に視床下部特異的に有効核酸分子が発現される。

上記ベクターに使用されるリコンビナーゼ認識配列は、投与対象に内在のリコンビ^ "一ゼによる組換えを防ぐために、内在のリコンビナーゼによっては認識されない異種リコンビナーゼ認識配列であることが望ましい。したがって、該べクターにトランスに作用するリコンビナーゼもまた異種リコンビナーゼであることが望ましい。このような異種リコンビ^ "一ゼと該リコンピナーゼ認識配列の組み合わせとしては、大腸菌のバタテリオファージ P 1由来の Creリコンビナーゼと lox P配列、あるいは酵母由来の Flpリコンピナーゼと frt配列が好ましく例示されるが、それらに限定されるものではない。

Cre リコンビナーゼはバタテリオファージで発見されたが、特異的な D NA組換え反応は、原核細胞だけでなく真核細胞である動物細胞や動物ウィルスでも機能することが知られている。同一 D N A分子上に同方向の 2つの ΙοχΡ配列が存在する場合は、 Cre リコンビナーゼはその間に挟まれた D N A配列を切り出して環状分子を形成させる（切り出し反応)。一方、異なる D N A分子上に 2つの ΙοχΡ 配列が存在し、その一方が環状 D N Aである場合はく ΙοχΡ配列を介して環状 D N Aが他方の D N A分子上に挿入される（揷入反応） . Mol. Biol. , 150: 4βΊ~Λ8& - (1981)； J. Biol. Chem. , 259： 1509 - 1514 (1984)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81： 1026-1029 (1984) ]。切り出し反応の例は、動物培養細胞 iNucleic Acids Res. , 17： 147-161 (1989)； Gene, 181： 207-212 (1996) ]、動物ウイノレス [尸 ro Natl. Acad. Sci. USA, 85： 5166-5170 (1988)； J. Virol. , 69： 4600-4606 (1995)； Nucleic-Acids Res. , 23： 3816-3821 (1995) ]、トランスジエニックマウス [尸 roc. Natl. Acad. Sci. USA, 89： 6232—6236 (1992)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89： 6861-6865 (1992) ; Cell, 73'· 1155-1164 (1993) ; Science, ' 265： 103 - 106 (1994) ] 等で報告されている。

リコンビナーゼ Zリコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用した本発明の時期特異的且つ視床下部特異的発現ベクターのプロモーターとしては、所望の時期及び部位での発現を確実にするために、好ましくはウィルス由来プロモーターや哺乳動物の構成蛋白質遺伝子のプロモターが使用される。

有効核酸分子をコードする発現ベクターを有効成分とする本発明の拒食症治. 療薬の投与は、治療対象動物自身の神経細胞を体外に取り出し、培養してから導入を行って体内に戻す ira法と、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行う in >o法のいずれかで行われる。 ex 法の場合、標的細胞へのベクターの導入は、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、 P E G法、エレクトロポレーション法等により行うことができる。 in vivo法の場合、ウィルスベクターは、注射剤等の形態で静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内等に投与される。あるいは、静脈内注射などによりベクターを投与すると、ウィルスベクターに対する中和抗体の産生が問題となるが、標的細胞の存在する視床下部付近、例えば側脳室内に局所的にベクターを注入すれば in situ法）、抗体の存在による悪影響を軽減することができる。

また、有効核酸分子をコードする発現ベクターとして非ウィルスベクターを使用する場合、該発現べクタ一の導入は、有効核酸分子自体を有効成分とする治療薬の剤形について上記したように、ポリ Lーリジン一核酸複合体などの高分子キャリア一を用いる力、リボソームに被包して行うことができる。あるいは、パーティクルガン法を用いてベクターを標的細胞に直接導入することもできる。

リコンビナーゼ Zリコンビナーゼ認識配列の相互作用を利用したベクターの使用において、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ自体を局所投与する場合、例えば、リコンビナーゼを適当な無菌のビヒクル（例えば、人工の脳髄液等）に溶解または懸濁して視床下部に注入すればよい。一方、トランスに作用する物質としてリコンビナーゼ発現ベクターを視床下部に局所投与する場合、該リコンビナーゼ発現ベクターは、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチド、投与対象の視床下部細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモータに機能的に連結した発現カセットを有するものであれば特に制限されない。使用されるプロモーターが構成プロモーターである場合、不要な時期におけるリコンビナーゼの発現を防ぐために、視床下部に投与されるベクターは、例えばアデノウィルスのように、.宿主細胞の染色体への組込みが稀なものであることが望ましい。しかしながら、，アデノウイルスベクターを使用した場合、リコンビナーゼの一過的発現はせいぜい 4週間程度しか持続しないので、治療が長期に及ぶ場合には第二、第三の投与が必要になる。リコンビナーゼを所望の時期に発現させる別のァプローチとして、メタ口チォネイン遺伝子プロモーターのような誘導プロモータ —の使用が挙げられる。この場合、レトロウイルス等のインテグレーション効率の高いウィルスベクターの使用が可能となる。

G P R C 5 Dの発現を抑制する物質が、アンチセンス核酸、リボザィム又はァプタマーのような核酸分子である場合、本発明の拒食症治療薬は、上記のような有効核酸分子をコードする発現べクターを含む宿主細胞を有効成分とすることもできる。使用される宿主細胞としては、上記のような発現ベクターの ex vivo 導入法において、投与対象から標的細胞として取り出される自己細胞、または同種異系（例えば、ヒトの場合、死産の胎児や脳死患者等）もしくは異種（ヒトの場合、プタゃサル等の他の哺乳動物）の個体から取り出した神経細胞、，あるいはそれらの神経幹細胞や E S'細胞を培養 ·分化させて得られる神経細胞などが例示される。中枢神経系は拒絶反応の最も起こりにくい器官 ·組織であるので、少量の免疫抑制剤の併用により異種細胞であっても生着させることが可能である。また、別の態様においては、投与対象となる動物の鼻腔、咽頭、口腔、腸管等に常在する細菌等を宿主細胞として、常法によりこれを有効核酸分子をコードする発現ベクターで形質転換し、得られる形質転換体を宿主細胞が通常存在する投与対象内の部位に送達することもできる。最近、薬物を脳に移行させる際、血液脳関門以外の経路として鼻から脳脊髄液に直接移行させる経路が検討されており、鼻腔常在菌の使用はこの目的に適うものである。

有効核酸分子をコードする発現ベクター又は該発現べクタ一を担持する宿主細胞を有効成分とする本発明の拒食症治療薬の投与量は、有効成分の種類、分子の大きさ、プロモーター活性、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、'体重、年齢等によって異なるが、有効核酸分子自体を有効成分とする治療薬を投与する場合の適切な投与量に相当する量の有効核酸分子を、ベクターもしくは宿主細胞を投与された動物の体内で発現させる程度であることが好ましく、例えば、成人 1 Sあたりベクター量として約 2〜約 2 0 μ g k g、好ましくは約 5〜約 1 0 g / k gである。

G P R C 5 Dは、摂食量を負に調節するシグナル伝達を仲介する膜受容体蛋白質であることから、この受容体の発現を増強することにより、摂食行動を抑制することができる。従って、本発明はまた、 G P R C 5 Dの発現を増強する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。一般に、「生活習慣病」は、食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒等の生活習慣がその発症，進行に関与する疾患群として規定されるが、本発明においては、特に「摂食量を抑制方向に調節することにより.治療効果がもたらされ得る疾患群」をいい、例えば、糖尿病、肥満症、高脂血症、高尿酸血症等が代表的なものとして含ま,れる。患者はこれらの疾患の 2つ以上を併発している場合が多い。

G PRC 5 Dの発現を増強する物質として'は、例えば、 GPRC 5D遺伝子からの RNA転写を促進し得るトランス活性化因子、スプライシングゃ mRNAの細胞質移行を促進し得る因子、 mRNAの分解を抑制する因子、リボソームの m RNAへの結合を促進し得る因子、 GPRC 5 D蛋白質の分解を抑制する因子、 GPRC 5 D蛋白質の膜への輸送を促進する因子等が挙げられるが、より直接的且つ特異的な物質として、 GPRC 5 D蛋白質もしくはその均等物、 GPRC 5 Dをコードする核酸を含む発現ベクター又は該発現ベクターを担持する宿主細胞が好ましく例示される。

ここで「GPRC 5D蛋白質」は、配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列からなる蛋白質であり、「その均等物」とは、配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列において 1もしくは 2以上（好ま.しくは 1〜50個、より好ましくは 1〜 30個、いっそう好ましぐは 1〜： L.0個、最も好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が置換、. 欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と同等のリガンドー受容体相互作用を示し、且つ Gひと共役して該サブュニットの GDP · GTP交換反応を促進する活性を有するポリペプチド、あるいはこの定義の範囲外ではあるが、ヒト及ぴマウスの G PRC 5 D遺伝子と分子進化論上同一の起源を有する遺伝子によりコードされる他の哺乳動物由来の蛋白質、即ちオルソログ（ortholog) をいう。したがって、本発明の生活習慣病治療薬は、ヒト及びマウスのみならず、他の哺乳動物における糖尿病、肥満症、高脂血症、高尿酸血症等の治療への使用をも意図している。近年のペットブームにより、過剰な給餌と運動不足の結果、肥満症等の生活習慣病様の疾患を発症する動物が増加していることから、本発明の治療薬は獣医学の分野においても極めて有用である。

G PRC 5 D蛋白質又はその均等物は、例えばヒト又はマウス、あるいはゥシ、ブタ、サル、ラット等の他の哺乳動物の視床下部組織由来の膜含有画分から、抗 GPRC 5 D抗体を用いたァフイエティークロマトグラフィ一により単離することができる。あるいは、当該組織由来の c DNAライブラリーもしくはゲノミックライプラリーから、 GPRC 5 Dの c DNAクローンをプローブとして単離される DNAクローンを適当な発現ベクター中にクローユングし、宿主細胞に導入して発現させ、細胞培養物の膜含有画分から抗 G PRC 5 D抗体や、 His-tag, GST-tag等を用いたアブイ-ティークロマトグラフィーにより精製することもできる。また、当該均等物は、 GPRC 5Dの cDN A配列（配列番号' 1記載の塩基配列中塩基番号 1〜1 0'3 5、又は配列番号 3記載の塩基配列中塩基番号 1 4 8〜1 04 7で示される塩基配列）を基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。保存的アミノ酸置換は周知であり、当業者は GPRC 5 Dの受容体特性を変化させない範囲で、 GPRC 5 D 蛋白質に適宜変異を導入することができる。しかしながら、リガンド結合ドメィン、好ましくはさらにィンバースァゴエストが結合し得る細胞外ループ及ぴ N末端鎖は高度に保存されている必要があるので、このような領域には変異を導入しないことが望ましい。 '

GPRC 5 D蛋白質又はその均等物を有効成分とする生活習慣病治療薬は、抗 GPRC 5 D抗体を有効成分とする拒食症治療薬に関して上記したように、ポリ L一リジン、アビジン、コレステロール又はリン脂質成分等の付属基を結合させることによって、細胞膜透過性を向上させることができる。あるいは、本治療薬は、 GP liC 5 D蛋白質又はその均等物をカチオン性リボソームに被包して製剤化することもできる。蛋白質はポリア二オン性であるので、カチオン性リポソ一ムと混合することにより容易に複合体を形成する。また、リボソーム膜に視床下部の細胞で特異的に発現する細胞表面分子に対する抗体もしくはリガンドを組み込むことにより、細胞特異的なターゲッティングを行うこともできる。例えば、抗 G PRC 5 D抗体（好ましくは、アンタゴェスト活性又はインバースァゴニス 5 ト活性を有しない抗体）をリボソーム膜に組み込むこともできる。

GPRC 5D蛋白質又はその均等物を有効成分とする生活習慣病治療薬は、適. 当な無菌のビヒクルに溶解もしくは懸濁して、経口的又は非経口的に投与され得る。非経口的投与経路としては、例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、気道内等の全身投与、あるいは視床下部付近への局所投与が挙げられるが、これら 10 に限定されない。好ましくは、側脳室内への局所投与が挙げられる。

本生活習 ffi病治療薬の投与量は、投与経路、病気の重篤度、投与対象となる動

, . 物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人 1日 ' あたり有効成分量として約 0. 0008〜約 2. 5mg/k g、好ましくは約 0.

008〜約0. 025m g// k gの範囲であり、これを 1回もしくは数回に分け 15 て投与することができる。

GPRC 5 Dの発現を増強する物質が、 GPRC 5 D蛋白質又はその均等物である揚合、本発明の生活習慣病治療薬は、それらのポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターであってもよいし、また、該発現ベクターを担持する宿主細胞であってもよい。こごで使用ざれる発現ベクターや宿主細胞は、上記の拒食 20 症治療薬の場合と同様のものであってよい。さらに、これらの生活習慣病治療薬の投与経路及び投与量についても、上記の拒食症治療薬のそれぞれに関して例示したものを、同様に好ましく使用することができる。

本発明はまた、視床下部細胞の細胞膜上に発現した GPRC 5 Dの機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬、あるいは該機能を促進する物質を有効 25 成分とする生活習慣病治療薬を提供する。これらの治療薬は、 GPRC 5Dに対してァゴニスト活性、アンタゴニスト活性又はインバースァゴニスト活性を有する物質をスクリーユングすることによって得ることができる。従って、本発明はまた、 G PRC 5 Dの機能を抑制もしくは促進する物質のスクリーニング方法と、そのためのスクリーエング系を同時に提供する。

ここで「ァゴ二スト活性」とは、 GPRC 5D受容体に特異的に結合し、 GP R C 5 Dの活性型と不活性型の平衡状態をより活性側にシフトさせる性質をいう。従って、ァゴニスト活性を有する物質には、いわゆるフルァゴニストや部分ァゴ-ストの他、 G PRC 5 Dの生理的リガンドも包含される。「アンタゴニスト活性」とは、 GPRC 5 Dのリガンド結合部位に拮抗的に結合するが、活性型と不活性型の平衡状態にほとんど又は全く影響を及ぼさない性質をいう。従って、アンタゴニスト活性を有する物質とは、いわゆるェユートラルアンタゴニストをいい、インバースァゴ-ストば含まないものとする。「インバースァゴエスト活性」とは、 G P R C 5 Dの任意の部位に結合して、 G P R C 5 Dの活性型と不活性型の平衡状態をより不活性側にシフトさせる性質をいう。'尚、本明細書において、以下、単に「リガンド」という場合は、生理的リガンド、ァゴニスト、アンタゴ-スト及びインバースァゴエストをすべて包含するものとする。

本発明のスクリーユング系は、 GPRC 5 D蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜、並びにあるファミリーに属する Gaの受容体結合領域及び任意ののグァニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリぺプチドを、必須の構成要素として含む系を 1構成単位とし、該構成単位を Ga の各ファミリー（即ち、 G a_s、 G a^ Ga_q) の受容体結合領域について構築して得られる、一連の受容体一 G蛋白質共発現系である。 GPRC 5 D蛋白質又はその均等物は、上記の生活習慣病治療薬の有効成分として上記した通りのものである。 GPRC 5 D蛋白質又はその均等物を保持する脂質二重層膜の由来は、該受容体蛋白質が該膜上で本来の立体構造をと.ることができる限り特に制限されないが、好ましくはヒト、ゥシ、ブタ、サル、マウス、ラット等の哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核細胞の細胞膜を含有する画分、例えば、無傷細胞、細胞ホモジネート、あるいは該ホモジネートから遠心分離等により分画される細胞膜画分が挙げられる。し力、しながら、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、コレステロール等の各種脂質を適当な比率、好ましくは哺乳動物細胞や昆虫細胞等の真核細胞の細胞膜におけるそれに近い比率で混合した溶液から常法により調製される人工脂質二重膜もまた、本発明の一実施態様において好ましく使用され得る。 ·

G_sファミリーに属する Go; (Gひ _s)は、アデ-ル酸シクラーゼを効果器とし、その活性を促進するものであり、例えば、 Ga Go あるいは G。_lf 等が挙げられる。 Giファミリーに属する Gひ（Gc は、アデル酸シクラ一ゼを効果器とし、その活性を抑制するものであり、例えば、

あるいは G_z等が挙げられる。 .G_qファミリーに属する G a; (Ga_q) は、ホスホリパーゼ C を効果器とし、その活性を促進するものであり、例えば、 Ga_qあるいは G₁₆等が挙げられる。本スクリーニング系の Go;_sポリペプチド、 Gc^ポリペプチド及び Go;_qポリペプチドはそれぞれ、自身の GPCRとの結合に関与する領域（RB領域）と任意の Gd のグァニンヌクレオチドとの結合に関与する領域（GB領域）を有することが必要である。 Go!の X線結晶構造解析の結果から、 GPCR結合領域は C末端近傍にあり、一方、 GB領域は、 r a s蛋白質のヌクレオチド結合部位と相同な領域（N末端側から、 Pボックス、 G，ボックス、 Gボックス、 G" ボックスと呼ばれるアミノ酸モチーフ、並びに高度にヘリックス化したドメイン内の α Eヘリックスの先頭及ぴ aFヘリックスなど）であることが明らかになつている。 GPRC 5 Dに対する生理的リガンド又はァゴニストが該受容体に結合すると、該受容体の Ga 活性化ドメインと該受容体に共役する Ga の RB領域とが相互作用して Ga のコンフオメーシヨン変化を生じ、 GB領域から GDP が解離して速やかに GT Pを結合する。 Gひ一 GT Pは効果器に作用してその活性を促進又は抑制する。一方、インバースァゴェストが結合すると、受容体のコンフオメーション変化により G 活性化ドメインが不活性化されるので、活性化型の Ga— GTPレベルが減少し、効果器への作用が阻害される。ここで、 GT Pの代わりに、例えば、 ³⁵S標識した GT P γ S等の G α の GTP a s e活性によつて加水分解を受けない G T Pアナログを系に添加しておけば、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定 ·比較することにより、 Ga における GDP ■ GTP交換反応に及ぼす被験物質の効果を評価することができ、 GPRC 5Dに対するリガンド活性を有する物質をスクリーユングすることができる。即ち、被験物質の存在下で放射活性が増加すれば、該被験物質は G PR C 5 Dに対するァゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有- する。一方、放射活性が減少すれば、該被験物質は GPRC 5Dに対するインバースァゴェスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。

いったん GPRC 5 Dに対するリガンドがスクリーニングされれば、該受容体' と共役する G のブアミリーが明らかになるので、以後のスクリーニングは、当該ファミリーに属する Go; ポリプチペプチドを構成要素として含む系のみを用いて行うことができる.。後述の受容体一 Ga融合蛋白質発現系による GPRC 5 Dの恒常的活性化の結果から、 GPRC 5 Dと共役し得る' G蛋白質 _αサブュ-ットは Go;_sであることが強ぐ示唆される。したがって、本発明はまた、 GPRC 5 Dと共役し得る G蛋白質サブユエット（好ましくは、 Ga_s) と該受容体との共発現系において、該 Go;の GDP · G TP交換反応又は該 Gひと相互作用する効果器の活性を、被験物質の存在下及び非存在下で比較することを特徴とする、該受容体に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。 '

GPRC 5Dに対するリガンドの活性は、 G αポリぺプチドの効果器への作用を指標として測定することもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、 GPRC 5 D蛋白質はその均等物に加えて、さらに効果器を含む脂質二重層膜を構成要素として含む必要がある。また、ポリペプチドは該効果器と相互作用するための領域をさらに含む必要がある。各ファミリーに属する Go;は効果器の種類又は作用の方向が異なるので、それぞれが自身の効果器相互作用領域を有するよりも、共通の効果器相互作用領域をすベての Gひポリぺプチドが有することがより好ましい。従って、本スクリーニング系において、少なくとも 2種の G ポリペプチドは他のファミリーに属する G a の効果器相互作用領域を含むキメラポリぺプチドである。例えば、効果器としてホスホリパーゼ Cを用いる場合、 G α _qポリペプチドはネイティブなものであってよいが、 G a _sポリペプチド及び G a iポリぺプチドは効果器相互作用領域が Gひ _qのもので置換されたキメラボリペプチドであることが必要である。別のフアミリーに属する G o; の効果器相互作用領域を含むキメラポリぺプチドの最も簡便な例としては、別のファミリーに属する Gaの C末端の約 5アミノ酸程度（即ち、 RB領域）を、自身の C末端配列で置換したものが挙げられる。

本スクリーニング系において、 3種の Gひポリペプチドが G a_s又は G c^の効果器相互作用領域を含む場合、効果器としてアデ二ル酸シクラーゼを含む脂質二 '重層膜が用いられる。一方、 G a ポリペプチドが、 Gひ _qの効果器相互作用領域を含む場合は、''効果器としてホスホリパーゼ Cを含む脂質二重層膜を用いる必要がある。

効果器としてアデ二ル酸シクラーゼ（以下、 ACともいう）を含むスクリー- ング系においては、ポリペプチドの効果器への作用は、 AC活性を直接測定することにより評価することができる。 AC活性の測定には公知のいかなる手法 ' を用いてもよく、例えば、 ACを含む膜画分に AT Pを添カ卩し、生成する c AM P量を、抗 c AMP抗体を用いて R I (例えば、 ¹²⁵1)、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼ等）、蛍光物質（例えば、 F I T C、ローダミン等）等で標識した c AM Pとの競合ィムノアッセィにより測定する方法や、 ACを含む膜画分に [a- ³²P] AT Pを添加し、生成する [³²P] c AMPをァルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法等が挙げられるが、これに限定されない。 Gひポリ.ペプチドが G a_sの効果器相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下及び非存在下で AC活性を測定 ·比較し、被験物質存在下で A C活性が増加すれば該被験物質は G PR C 5 Dに対するァゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対に AC活性が減少すれば、該被験物質は G PRC 5 Dに対するインバースァゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。一方、 Ga ポリペプチドが Go: iの効果器相互作用領域を含む場合は、被験物質存在下で A C活性が増加すれば該被験物質は G P RC 5Dに対するインバースァゴ-スト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。反対に A C活性が減少すれば、該被験物質は G PRC 5Dに対するァゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。

スクリーユング系として無傷真核細胞を用いる場合は、 Go;ポリペプチドの A Cへの作用は、細胞内の c AMP量を測定するか、あるいは細胞を [³H] アデ二ンで標識し、生成した H] c AMPの放射活性を測定することによつても評価することができる。細胞内 c AMP量は、被験物質の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間ィンキュベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液について、上記の競合ィムノアッセィを実施するとにより測定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用することができる。

別の態様として、 c AMP量を c AMP応答エレメンド（CRE) の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、概説すると、 CREを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質をコードする DNAを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定■比較することにより、細胞内 cAM P量を評価するというものである。

従って、 Go; ポリペプチドが G(¾_sの効果器相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下で細胞内 cAM Pi (もしくは CR E制御下にあるリポータ一遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質は G PRC 5 Dに対するァゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対に c AMP量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質は G P RC 5 Dに対するインバースァゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。一方、 G a ポリペプチドが G o; iの効果器相互作用領域を含む場合、被験物質の存在下で細胞内 c AM Pi (もしくは CR E制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質は G P R C 5 Dに対するインバースァゴ-スト活性を有し、従って拒食症に.対する治療活性を有する。反対に c AMP量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質は G P R C 5 Dに対するァゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。. —方、効果器としてホスホリパーゼ C (以下、 P L Cともいう）を含むスクリ：一ユング系（即ち、ポリペプチドが G a_qの効果器相互作用領域を含む場合）においては、 G ポリべプチドの効果器への作甩は、 P L C活性を直接測定することにより評価することができる。 P L C活性は、例えば、 ³H標識したホスファチジルイノシトルー 4， 5—二リン酸を P L C含有膜画分に添加し、生成するイノシトールリン酸量を、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる。被験物質の存在下及び非存在下で P L C活性を測定■比較し、被験物質存在下で P L C活性が増加すれば、該被験物質は G P RC 5 Dに対するァゴ- スト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対に P LC活性が減少すれば、該被験物質は G PRC 5 Dに対するィンバースァゴエスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。

スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、 Go;ポリペプチドの P L Cへの作用は、細胞に [³H] イノシトールを添加し、生成した [³H] イノシトールリン酸の放射活性を測定したり、細胞内の C a ²⁺量を測定することによつても評価することができる。細胞内 C a²⁺量は、被験物質の存在下及ぴ非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、蛍光プローブ（fura- 2、 indo_l、 fluor- 3、 Calcium- Green I等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるェクオリン等を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、 FLIPR (Molecular Devices社）システムが挙げられる。

別の態様として、 C a²⁺によりアップレギュレートされる TPA (12— O—テトラデカノィルホルボール一13—アセテート）応答エレメント（TRE) の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより、 C a²⁺量を評価する方法もある。ここで使用される発現ベクターについては後に詳述するが、'概説すると、 TREを含む口モーターの下流にリポーター蛋白質をコードする DNA を連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、被験物質の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定 ·比較することにより、細胞内 C a ²⁺量を評価するというものである。

従って、被験物質の存在下で細胞内 C a ²⁺量（もしくは TRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該被験物質は G PRC 5 Dに対するァゴニスト活性を有し、従って生活習慣病に対する治療活性を有する。反対に細胞内 C a²⁺量（もしぐはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該被験物質は G PRC 5 Dに対するインバースァゴニスト活性を有し、従って拒食症に対する治療活性を有する。

本発明のスクリーニング法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及ぴ新規化合物であってもよく、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライプラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。

本発明のスクリーニング系の 1構成単位である、 G PRC 5 D蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜及び Gひポリペプチドを必須構成要素として含有する系の好ましい一実施態様は、 G PRC 5 D蛋白質又はその均等物をコードする DN Aを含む発現ベクターと、あるフアミリーに属する Gaの RB領域及び任意の G α の GB領域を少なくとも含むポリぺプチドをコ一ドする DN Aを含む発現ベクターとでトランスフエクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。

「G P RC 5 D蛋白質又はその均等物をコードする DNA」は、配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは該アミノ酸配列において、 1もしくは 2以上（好ましくは 1〜5 0個、より好ましくは 1〜3 0個、.いつそう好ましくは 1〜1 0個、最も好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたァミノ酸配列からなり、 G P RC 5 Dと同等のリガンドー受容体相互作用を示し、且つ G o; と共役して該サブユニットの GD P · GT P交換反応を促進する活性を有するポリペプチド、あるいは配列番号 2 又は 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドのオルソログをコ一ドする D N Aであれば特に制限はない。 G P RC 5 D c DNAのコード領域（配列番号 1記載の塩基配列中塩基番号 1〜1 0 3 5、又は配列番号 3記載の塩基配列中塩- 基番号 1 4 8 ~ 1 0 4 7で示される塩基配列）の他、ゥシ、プタ、サル、ラット等のヒト又はマウス以外の哺乳動物由来の G P R C 5 Dに対応する G P CRをコードする DNA等が例示され、これらは、哺乳動物の視床下部を含む脳神経組織由来の c DN Aライブラリーもしくはゲノミックライブラリーから、 G PRC 5 Dの c DNAをプローブとして単離され得る。また、当該均等物は、 G PRC 5 Dの c DNAを基に、部位特異的変異誘発等の人為的処理により一部に変異を導入したものであってもよい。

3種の G aポリペプチドをコードする DNAは、少なくとも各フアミリーの G a の RB領域をコードする配列と、任意の G o; の GB領域をコードする配列とを有することが必要である。各種 G a遺伝子の配列は公知であり、また、上述の通り、 G _aの X線結晶構造解析の結果から、 RB領域及び GB領域はよく知られている。従って、当業者は、所望により G o;のコード配列の一部を欠失したフラグメントを容易に構築することができる。 Ga ポリペプチドの効果器への作用を指標とするスクリーニング系においては、 Go;ポリペプチドをコードする DNAは、効果器相互作用領域をコードする核酸配列をさらに含む必要がある。上述のように、 3種のポリペプチドは共通の効果器相互作用領域を有するので、少なくとも 2種の Gaポリぺプチドは別のファミリーの効果器相互作用領域を有するキメラである。当該キメラポリぺプチドをコードする DNAの最も簡便な例としては、目的の効果器相互作用領域を有する Gaの c DNAの C末端の約 5アミノ酸をコードする配列を、 PCR等の公知の手法を用いて、他のフアミリーのの C末端配列をコードする DNA配列に置換したものが挙げられる。

G PRC 5 D蛋白質又はその均等物をコードする DN A、及ぴ G a ポリぺプチドをコードする D N Aは、宿主真核細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。使用されるプロモーターは、真核細胞内で機能し得るものであれば特に制限はないが、例えば、 SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウィルス L TR、ラウス肉腫ウィルス L TR、 MoMuLV由来 LTR、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウィルスプ口モーター、並びに —ァクチン遺伝子プロモーター、 PGK遺伝子プロモータ一、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の真核生物由来の構成蛋白質遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。使用される発現ベクターは、上記プロモ^ "タ一に加えて、その下流に転写終結シグナル、すなわちターミネータ一領域を含有することが好ましく、プロモーター領域とターミネータ一領域の間にコーディング D N Aを挿入し得るように、.適当な制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターを 1箇所のみで切断するユニークな制限酵素認識部位を有することが望ましい。さらに、該発現べクタ一は、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤抵抗 1"生遺伝子、栄養要求性変異相補遺伝子等）をさらに含有していてもよい。

本発明のスクリーニング系に使用されるベクターとしては、プラスミドベクタ一や、ヒト等の哺乳動物での使用に好適なレトロウイルス、アデノウイルス、ァデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシェアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンドビスウィルス、センダイウィルス等のウィルスベクター、あるいは昆虫細胞での使用に好適なバキュロウィルスベクター等が挙げられる。

G P R C 5 D蛋白質又はその均等物をコードする D NAと、 G ひポリペプチドをコードする D NAは、 2つの別個の発現ベクター上に担持されて宿主細胞に共十ランスフエタトされてもよいし、あるいは、 1つのベクター上に、ジシストロニックもしくはモノシストロニックに揷入されて、宿主細胞内に導入されてもよい。

宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスタ. 等の哺乳動物細胞ゃ昆虫細胞等の真核細胞であれば特に制限はない。具体的には、 C0P、 L、 C127_s Sp2/0、 NS- NIH3T3、 ST2等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、 BHK、 CH0等のハムスター由来細胞、' C0S1、 COS 3, C0S7、 CV1、 Vero等のサル由来細胞、および HeLa、 293等のヒト由来細胞及び、 Sf9、 Sf21、 High Five等の昆虫由来細胞などが例示される。

宿主細胞への遺伝子導入は、真核細胞の遺伝子導入に使用できる公知のいかなる方法を用いて行ってもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクト口ポレーシヨン法、リボソーム法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。遺伝子を導入された宿主細胞は、例えば、約.5〜 2 0 %のゥシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM)、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM)、 RPMI1640培地、 199 培地等を用いて培養することができる。培地の p Hは約 6〜約 8であるのが好ましく、培養温度は、通常約 2 7〜約 4 0 °Cである。

上記のようにして得られる、 G P R C 5 D蛋白質又はその均等物をコードする D N A及び G ひポリぺプチドをコードする D N Aを導入された真核細胞は、使用するスクリーニング法に応じてそのまま無傷細胞として使用してもよいし、あるいは適当な緩衝液中で該細胞を破砕して得られる細胞ホモジネートゃ、該ホモジネートを適当な条件で遠心分離するなどして（例えば、約 1, O O O X g程度で遠心して上清を回収した後、約 100， 000X g程度で遠心して沈渣を回収する）単離される膜画分の形態であってもよい。

例えば、 GT P γ S結合アツセィや、効果器の活性を直接測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリーニング系は、好 ,ましくは、上記のようにして細胞から調製される膜画分である。一方、細胞内 c AMP量（もしくは c AMP応答性リポーターの発現量）や細胞内 C a²⁺量（もしくは C a ²⁺応答性リポーターの発現量）を測定することにより、被験物質のリガンド特性を評価する場合には、使用するスクリ一ユング系は無傷真核細胞である。

尚、リガンド活性の評価を、 c AMP応答性リポーター（効果器がアデル酸シクラーゼの場合）もしくは C a²⁺応答性リポーター（効果器がホスホリパーゼ. Cの場合）の発現量を指標として行う場合には、宿主真核細胞は、 c AMP応答エレメント（CRE) または TPA応答エレメント（TRE) を含むプロモータ一領域の下流にリポーター蛋白質をコードする D N Aが機能的に連結した発現カセットを含むベクターを導入されたものである必要がある。 CREは cAMP の存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列として TGACGTCA を含む配列が挙げられるが、 c AMP応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、揷入または付加を含む配列であってもよい。一方、 TREは C a ²⁺の存在下に遺伝子の転写を活性化するシスエレメントであり、コンセンサス配列として TGACTCAを含む配列が挙げられるが、 C a ²⁺応答性を保持する限り当該配列の一部に欠失、置換、揷入または付加を含む配列であってもよい。 CRE又は TREを含むプロモーター配列としては、上記のようなウィルスプロモーターや真核生物由来の構成蛋白質遺伝子プロモーターが同様に使用可能であり、制限酵素及び DN Aリガーゼを用いて、あるいは PC R等を利用して、該プロモータ一配列の下流に C R Eまたは T R E'配列を揷入することができる。 C RE又は TREの制御下におかれるリポーター遺伝子としては、迅速且つ簡便に遺伝子発現を検出■定量できる公知のいかなる遺伝子を使用してもよく、例えば、ノレシフェラーゼ、 i3 _ガラクトシダーゼ、 ]3—グルクロニダーゼ、ア^/カリホスファターゼ、ペルォキシダーゼ等のリポーター蛋白質をコードする DNAが挙げられるが、これらに限定されな V、。リポーター遺伝子の下流にはターミネ一ター配列が配置されることがより好ましい。このような CRE (又は TRE) - リポーター発現カセットを担持するベクターとしては、公知のプラスミドベクタ一又はウィルスベクターを使用することができる。

本発明のスクリーユング系の 1構成単位である、 G PRC 5 D蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜及びポリペプチドを必須構成要素として含有する系の別の好ましい実施態様は、 GPRC 5 D蛋白質又はその均等物の C末端側に、あるファミリーに属する G α の RB領域及び任意の G α の GB領域を少な <とも含むポリべプチドが連結した融合蛋白質をコードする DNAを含む発現ベクターでトランスフエクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分である。

GPRC 5 D蛋白質又はその均等物をコードする DNA、並びに各フアミリーの Ga の RB結合領域及び任意の Gひの GB領域を含むポリペプチドをコードする DNAは、上述のようにして取得することができる。当業者は、これらの D N A配列をもとにして、公知の遺伝子工学的手法を適宜組み合わせることにより、 GPRC 5 Dと G a ポリペプチドとの融合蛋白質をコードする D N Aを容易に構築することができる。例えば、 PCR等を用いて GPRC 5 Dをコードする D. NAの終始コドンを除去したものに、ポリペプチドをコードする DNAを読み枠が合うように、 DNAリガーゼを用いてライゲーシヨンする等の方法が挙げられる。この際、 GPRC 5 Dの C末端の一部を欠失させたり、 GPRC 5Dと Ga との間に His - tag等のリンカ一配列を挿入したりすることもできる。

得られた融合蛋白質をコードする D N Aは、上述のような発現ベクター中に揷入され、宿主真核細胞に上記の遺伝子導入技術を用いて導入される。得られた真核細胞の膜上に当該融合蛋白質が発現すると、 GPRC 5Dとが相互作用し得る場合には、受容体の細胞内第 3ループ上の Go; 活性化ドメインと Ga の R B領域とは、該受容体に対する生理的リガンドの非存在下に相互作用して、 Go; における GDP · GTP交換反応を促進し得る。即ち、 Gaは恒常的に活性化された状態となる。一方、 G PR C 5Dと相互作用しない Go;との融合蛋白質では G PRC 5 Dは活性化されず、 G a— GT Pレベルは増大しなレ、。ここで、 GT Ρの代わりに、例えば、 ³⁵S標識した GT Ρ γ S等の G αの GT P a s e活性によつて加水分解を受けない G T Pアナログを系に添加しておけば、 3種の融合蛋白質をそれぞれ含む膜系において、膜に結合した放射活性を測定し、相互に比較することによって、 G PRC 5 Dの活性化の有無を評価することができ、該受容体と相互作用し得る Go;を同定することができる。 ' '

いったん G PRC 5 Dと相互作用し得る Gaが同定されれば、以後のスクリーユングは、 G PRC 5 Dと当該 Gaとを含む膜系、好ましくは G P R C 5 Dと当該 Go;との融合蛋白質を含む膜系のみを用いて行うことができる。すなわち、上記の共役 G αの同定に用いたのと同様に、 00；の0丁？ & s e活性によって加水分解を受けない G T Pアナログを系に添加し、被験物質の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定 '比較することにより、における GDP · GT P交換反応に及ぼす被験物質の効果を評価することができ、 GPCRに対するリガンド活性を有する物質をスクリーニングすることができる。被験物質の存在下で放射活性が増加すれば、該被験物質は G PRC 5Dに対するァゴニスト活性を有し、放射活性が減少すれば、該被験物質は G PR C 5Dに対するィンバースァゴニスト活性を有する。融合蛋白質による受容体の活性化は部分的であるので、 G PRC 5 Dに対する生理的リガンド又はァゴニストが結合すると、該受容体の活性型一不活性型の平衡状態はさらに活性状態側にシフトし、 Go;— GTPレべルはさらに増大するので、本スクリーエング系はァゴニストのスクリ一ユングち可能である。

後記実施例に示される通り、 GP RC 5 Dは G a _sとの融合蛋白質として発現させた場合にのみ恒常的に活性化されることから、該受容体と共役する Gひは G a_sであることが強く示唆される。したがって、本発明はまた、 G o; _sと該受容体との融合蛋白質発現系において、 G a_sの GD P · GT P交換反応を、被験物質の存在下及び非存在下で比較することを特徴とする、該受容体に対するリガンドのスクリーエング方法を提供する。 .

融合蛋白質における G PRC 5 Dの活性化は、 Gひの効果器への作用を指標として評価するこどもできる。この場合、本発明のスクリーニング系は、各融合蛋白質に加えて、各 Gひが相互作用する効果器をさらに含む脂質二重層を包含する膜系である必要がある。すなわち、 G 0i_qとの融合蛋白質を含む膜系はホスホリパーゼ C (P L C) をさらに含有し、および G o; _sとの融合蛋白質を含む膜系はアデ-ル酸シクラーゼ（AC) をさらに含有する。この場合、 GP RC 5Dの活性化の有無は、各 G a'について、 G P RC 5 Dと Gひとを別個に（即ち、融合蛋白質としてではなく）含有する膜系を調製し、それぞれについて効果器の活性を測定 '比較することにより評価することもできる（即ち、 G P RC 5 Dと相互作用し得る G aとの融合蛋白質を含む膜系では、両者を非融合蛋白質として含む膜系よりも効果器の活性が有意に高く（Gひ iの場合は低い）、相互作用しないものでは両系間で効果器の活性に有意差はない)。 '

いったん G PRC 5 Dと相互作用し得る G aが同定されれば、以後のスクリーニングは、該 G aとの融合蛋白質を含む膜系のみを用いて、該 Gひが相互作用し得る効果器の活性を、被験物質の存在下および非存在下で直接的もしくは間接的に測定し、比較することにより行うことができる。したがって、本発明はまた、上記 G P R C 5 Dに対する共役 G o;の同定方法により同定される該受容体と共役し得る G _αと該受容体との融合蛋白質及ぴ該 G aが相互作用し得る効果器を含む膜系において、該効果器の活性を被験物質の存在下および非存在下で測定' 比較することを特徴とする、 G PRC 5 Dに対するリガンドのスクリーエング方法を提供する。

上述のように、 GP RC 5Dは _sとの融合蛋白質として発現させた場合にのみ恒常的に活性化されることから、該受容体と共役する G aは G o; _sであることが強く示唆される。したがって、 GPRC 5.Dと Go;_sとの融合蛋白質おょぴ A.C を含有する膜系における AC活性を、被験物質の存在下および非存在下で測定 - 比較する。 AC活性の測定は上記と同様にして行うことができる。

あるいは、 Gひをコドする DNAの特定の部分に公知の手法により変異を導入して、そのアミノ酸配列を改変することによつても、 Go;が恒常的に活性化された状態となることが知られている。従って、この系もリガンドのスタリーェングに同様に用いることができる。このような技術は、'例えば、 fo/, Pharmacol. , 57, 890-898 i^QWi)や Biochemistry, 37, 8253-8261 (1998)に記載される方法に準じた内容で実施することができる。

このような融合蛋白質（もしくは変異 Ga) 発現細胞についても、使用するスクリーニング法に応じて、無傷細胞、細胞ホモジネート、膜画分のいずれかの形態を適宜選択して用いることができる。

本発明のさらに別の態様においては、 GPRC 5D蛋白質又はその均等物を含む脂質二重層膜、及びポリペプチドを構成要素として含有するスクリーニン, グ系として、精製した G PRC 5 D蛋白質又はその均等物と G a ポリペプチド、あるいは精製した該受容体と G a との融合蛋白質を、人工脂質二重層膜中に再構成させたものを使用することができる。 G PRC 5 D蛋白質又はその均等物は、ヒトもしくはマウス、又は他の哺乳動物の視床下部を含む脳神経組織等から得られる膜画分より、抗 G PRC 5 D抗体を用いたァフィ二ティークロマトグラフィ一等により精製することができる。あるいは、該受容体は、 GPRC 5D蛋白質又はその均等物をコードする DNAを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗 GPRC 5 D抗体や、 His- tag、 GST- tag等を用いたァフィ二ティーク口マトグラフィ一等により精製することもできる。同様に、該受容体と Go; との融合蛋白質も、該融合蛋白質をコードする DNAを含む発現ベクターを導入された組換え細胞から、抗 G PRC 5 D抗体や、 His- tag、 GST- tag等を用いたァフィ二ティークロマトグラフィー等により精製することができる。

人工脂質二重層膜を構成する脂質としては、ホスファチジルコリン (PC)、ホスファチジノレセリン（P'S)、コレステロール（Ch)、ホスファチジルイノシトール（P I )、ホスファチジルエタノールアミン (PE) 等が挙げられ、これら 1種または 2種以上を適当な比率で混合したものが好ましく使用される。例えば、受容体と Go！、又は受容体一 Ga融合蛋白質を組み込んだ人工脂質二重層膜（プロテオリボソーム）は、以下の方法により調製することができる。即ち、まず、 PC : P I : Ch= l,2 : 12 : 1の混合脂質クロ口ホルム溶液を適当量ガラスチューブに分取し、窒素ガス蒸気でクロ口ホルムを蒸発させて脂質をフィルム状に乾燥させた後、適当な緩衝液を加えて懸濁、次いで超音波処理により均一に分散させ、コール酸ナトリゥム等の界面活性剤を含む緩衝液をさらに加えて脂質を完全に懸濁する。ここに、精製した受容体と Ga、又は受容体一 Ga 融合蛋白質を適量添加し、氷中で時々攪拌しながら 20〜30分間程度インキュベートした後、適当な緩衝液に対して透析する。約 100， O O OX gで 30〜 60分間遠心して沈渣を回収することにより、所望のプロテオリボソームを得ることができる。 '

上記のようなスクリーニング系及びスクリーユング方法により選ばれた、拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質は、任意の医薬上許容される担体を配合することにより拒食症又は生活習慣病の治療薬とすることができる。従つて、本発明は、本発明のスクリーユング法により選抜された GPRC 5Dに対するアンタゴニスト又はインバースァゴニストを有効成分とする拒食症治療薬を提供する。本発明はまた、本発明のスクリーニング法により選抜された G PR C 5 Dに対する生理的リガンド又はァゴニストを有効成分とする生活習慣病治療薬を提供する。

医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸力ルシゥム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウムーグリコール一スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、ク.ェン酸カルシウム等の崩壌剤、ステアリン酸マグネシゥム、エアロジ^/、タルク、ラウリル硫酸ナトリゥム等の滑剤、クェン酸、メントール、グリシルリシン 'アンモニゥム塩、グリシン、ォレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビュルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、'生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

経口投与に好適な製剤は、水、生理贪塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤または錠剤、適当な分散媒中に有効量のリガンドを懸濁させた懸濁液剤、有効量のリガンドを溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。

非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。投与方法が視床下部付近への局所注入の場合、有効成分であるリガンドを人工脳髄液に溶解もしくは懸濁させた注射液剤が好ましい。あるいは、コラーゲン等の生体親和性の材料を用いて、徐放性製剤とすることもできる。プル一口ニックゲルは体温でゲル化し、それ以下の低温では液体であることから、リガンドをプル一口ニックゲルとともに局所注入して標的組織周 ¾でゲル化させることにより、長期持続性.とすることができる。当該リガンド製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、リガンドおよび医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。

本発明のリガンド製剤の投与量は、リガンド活性（フルァゴニストか部分ァゴニスト力、あるいはアンタゴエストかィンバースァゴニストか）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人 1日あたりリガンド量として約 0. 0ひ 08〜約 2. 5mg/k g、好ましくは約 0. 008〜約0. 025/k gである。

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。なお、特に明記しない限り、以下の実施例は、 Sambrook, J.ら著、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual^ 2版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 New York、 1989年 ^§if了、 Current Protocols in Protein Science (ed. Coligan, J. E. et. al. ) 、 John Wiley and Sons, Inc.等に記載の方法で行なった。参考例 1 ： RT— PCRによる GPRC 5 D遺伝子の発現分布解析

d b / d bマウス（雄、 S P Fグレード、購入時 1週齢、臓器採取時 10週齢、日本クレア）視床下部を Trizol (Gibco) 中にホモジナイズし、全 RNAを採取した。全 RNA l / gを铸型に、 RNA PCR Kit (AMV) Ver2.1. (Takara) を用いて cDNAを合成した。この視床下部 cDN Aを錄型とし、以下のマウス GPR C 5D (mG p r c 5 d) 特異的プライマーを用いて P C Rを行った。尚、 T a qポリメラーゼはパーキンエルマ一社のものを用いた。

5， -ACC TCT TCT GTG ACA ACG AG- 3，（配列番号 5 )

5' - GGA AGA GGA CAT AGA TCA GG- 3' (配列番号 6)

その結果、 d b/d bマウスの視床下部において GPRC 5 D遺伝子が発現していることが明らかとなった。 _; 参考例 2 ： in situハイブリダイゼーシヨンによる GPRC 5 D遺伝子の発現分布解析

マウス（CD- 1 (ICR)) から、 10%中性緩衝ホルマリンによる.還流固定後に脳を採取し、 10%中性緩衝ホルマリンによる固定後パラフィン包埋してプロックを作製した。このノヽ。ラフィンブロックを冠状断 ( Interaural 2.34mm Bregma - 1.46mm付近） 7μπιの厚さで薄切し、 ISH染色用の切片とした。 '

また Τ3および T7RNAポリメラーゼを用いて、 In vitro transcription法によりジゴキシゲユン標識 RNAプローブを作製した。具体的には DIGRNALabelingMix (Roche)を用い、配列番号： 3の 234位- 624位の領域に相当するアンチセンス R A プローブを作製した。

次に、前記で作製したマウス脳パラフィン切片とプローブとを用いて、常法により ISH染色を実施した。抗体にはアルカリフォスファターゼ標識した抗ジゴキシゲユン抗体を、発色基質には NBT/BCIP を使用し、染色後ケルネヒトロートにより核染色を行った。

G PRC 5 Dアンチセンスプローブを用いた染色の結果、室傍核、視床下部腹内側核において発現が認められた。この室傍核おょぴ視床下部腹内側核は、摂食中枢が存在する領域である。よって GPRC5D は、摂食中枢において摂食 ·ェネルギー代謝に関与する因子であることが示唆された。実施例 1 ：肥満モデルマウスに対する GPRC 5Dクローンアンチセンス DNA の作用

(1) 実験材料

試薬： GPRC 5Dクローンアンチセンス DNAは、当該遺伝子開始コドン付近に対する 25m e rのチオール化アンチセンス DNAを用いた。以下に該アンチセンス DN Aの塩基配列を示す。

5' - TCA TAC ATG GTG ACT TAT AGG TAG A- 3' (配列番号 7 )

コントロール DNAとしては、，下記配列を有するチオール化オリゴ DNAを使用した。

5'- CCT CTT ACC TCA GTT ACA ATT .TAT A- 3，（配列番号 8 )

この配列は、ヘモグロビン異常症サラセミアにおける赤血球 j3-グロビンのプレ. mRNA中、 705位でのスプライシング異常を引き起こす変異により生じた配列に対して相補的である。このオリゴ鎖は、健常細胞では特異的標的部位や生物学的活性を有しておらず、サラセミァの赤血球細胞に作用させたときにのみ該スプライシング異常を訂正し、その結果、正常 -グロビンをコードする mRNA を生じさせるとされている。これらのオリゴ DNAの合成、チオール化及び HP LC精製は、いずれも（株）日本バイオサービスに委託した。

その他試薬は市販の特級試薬を用いた。 ' 実験動物： C 57BL d b/d b (以下、肥満マウスという）（SPF規格）を日本クレア社より購入、予備飼育の後、肥満マウスは 10週齢で実験に使用した。飼育環境：温度が 20 °C以上 26 °C以下、相対湿度が 30 %以上 70 %以下に制御され、照明が 8 : 00〜20 ： 00点灯、 20 : 00〜 8 : 00消灯のサイクルに設定された部屋で飼育した。飼育中は固形飼料（CE— 2，日本クレア）および滅菌蒸留水を自由摂取させた。

(2) 投与液の調製

アンチセンス DN A投与液、コントロール DNA投与液として、 7. 5 μ g/ μ 1のアンチセンス DNAを含む人工脳髄液（0. 166 g/L C a C 1₂、 7. 014 g/L Na C l、 0. 298 g/L KC 1、 0. 203 g/L M g C 1₂ · 6Η₂0、 2. l O g/L NaHC0₃) を調製した。

(3) アンチセンス DNAの脳室内投与

肥満マウスを 2群に分け、ー晚絶食の後、.午前 8 ： 00に照明点灯と同時に、 1群にアンチセンス DNA投与液を 4 1 Zマウス（アンチセンス DNAとして 30 ;u g/マウス）を、もう一群にはコントロール DNA投与液 4 /i 1 /マウスを側脳室内に投与した。

(4) アンチセンス DNA投与によるマウスの摂餌量、血糖値に対する影響投与直後よりマウスへの給餌を再開し、投与後 48時間まで 1 2時間毎に摂餌量を算出した。肥満マウスの摂餌量に対するアンチセンス DN Aの作用を図 1に示す。図 1において、黒色のカラムはコントロール DN.A投与群、白色のカラムはアンチセンス DN A投与群の、.投与後 1 2時間毎の平均摂餌量（エラーバーは標準偏差、コントロール DNA投与群 n = 4、アンチセンス DNA投与群 n = 4) を示す。投与後 1 2時間では摂餌量に大きな変化は認められなかった。し力、し、その後の経過と共に GPRC5Dクローンのアンチセンス DNA投与により、肥満マウスの摂餌量を上昇させる効果が見られた。

また、投与前および投与後 48時間まで 24時間毎に血糖値を測定した。肥満マウスの血糖値に対するアンチセンス DN Aの作用を図 2に示す。図 2において、黒色のカラムはコントロール DNA投与群、白色のカラムはアンチセンス DNA 投与液群の、投与後 24時間毎の平均血糖値（エラーバーは標準偏差、コント口ール DNA投与群 n = 4、アンチセンス DNA投与群 n = 4) を示す。投与後 2 4時間までは大きな変化は認められなかった。しカゝし、投与後 48時間で G PR C 5 Dクローンのアンチセンス DNA投与により、肥満マウスの血糖値を上昇させる効果が見られた。

上記の結果から、 GPRC 5Dクローンは摂食行動および糖代謝に関与する因子である可能性が示唆された。実施例 2 ：飽食 ·絶食状態での視床下部遺伝子発現変動の解析 '

d bノ d bマウス（雄、 S P Fグレード、購入時 7週齢、臓器採取時 1 1週齢、日本クレア；以下、肥満マウスという）および C 57. B L/6Nマウス（雄、 S P Fグレード、購入時 6週齢、臓器採取時 1 1週齢、日本チャールズ ' リバ一；以下、正常マウスという）の視床下部を飽食状態および 24時間絶食状態で採取し、 Trizol (Gibco) 中にてホモジナイズし、全 RNAを採取した。全 RNA 1 μ gを SYBR Green RT-PCR Reagent (Roche) を用いて、逆転写反応を行った。続いて、逆転写反応済みの各サンプルと G PRC 5 Dクローン特異的なプライマー (下記参照）を混合し、 ABI7700 sequence detector (PE biosystems) を用いて PCR反応を実施し、 G PRC 5 Dクローンの遺伝子発現変動を解析した。また GPRC 5 Dクローンの発現は、 GAPDH (グリセルアルデヒド一 3—リン酸デヒドロゲナーゼ）にて補正を行い、相対値として解析した。

· G P R C 5 D

フォーヮードプライマ一：

5' -GGA GTA TCT CAT CCC ATC AGC TAC A- 3' (配列番号 9 )

リバースプライマー：

5， -CAC TCT TCC AGG TTG TCT CTA TGC- 3，（配列番号 10)

■ GAPDH '

フォーヮードプライマ一：

5， -CAA GAG AGG CCC TAT CCC AAC T- 3' (配列番号 1 1)

リバースプライマー：

5， -CTA GGC CCC TCC TGT TAT TAT GG- 3，（配列番号 12)

GPRC 5 D遺伝子の飽食/絶食状態での発現変動を図 3に示す。図 3において、黒色のカラムは飽食状態、白色のカラムは絶食状態の G PRC 5 D遺伝子の平均発現変動（エラーバーは標準偏差、各群 n=3) を示す。正常マウスでは大きな変動は認められなかったが、肥満マウスでは、絶食により GPRC 5Dの発現充進が認められた。肥満マウスの絶食状態で G P R C 5 Dクローン発現が亢進していること、並びにアンチセンス投与が摂食亢進、血糖上昇作用を示すことから、 GPRC 5 Dクローンは摂食抑制作用を有する可能性が示唆された。以上のことより、 GPRC 5 Dクローンは摂餌量および糖代謝の調節に関与.しており、 G P R C 5 Dクローンの作用を亢進することは、より効果的な生活習慣病治療効果が得られることが明らかになった。実施例 3 ： G P R C 5 Dクローン安定発現株の樹立

(1) 導入遺伝子ベクターの構築 ' GPRC 5Dクローンのコード領域を KOD-Plus (T0Y0B0) にて P C R法で増幅する。增幅した遺伝子断片を pcDNA3.1 (I'nvitrogen) に揷入し、 G P R C 5 D発現ベクターを構築する。 '

(2) 細胞株の樹立

以下の 3つのタイプのキメラ G蛋白質（Gq、 Gqi5、 Gqs5) 発現 CHO細胞株（Molecular Devices) を 10 c m²培養皿に播種し、 10% FBS (Gibco) を含む D—MEM培地（Gibco) 中で 60〜 70%コンフルェントになるまで培養する。その後無血清培地に転換し、上記（1) で構築した GPRC 5 D発現べクタ一と Lipoofectamine - Plus (Gibco) と複合体を开成させ培地に添加する。 5 時間インキュベート後 10% F B Sを含む D—MEM培地に転換後さらに 8時間培養する。その後トリプシン一 EDTAで細胞を培養皿から剥離させ、 500 gZm 1の G41 8と 10% F B Sを含む D— MEM培地に懸濁し、 1 0 c m²培養皿に播種する。数日後に形成されたコロニーを単離し、 GPRC 5 D安定発現株（¥q、 ¥qi5、 ¥qS5) とする。実施例 4 ：レセプターァゴニストのスクリーニング

(1) 細胞の調製

GPRC 5D安定発現株（¥q、 ¥qi5、 ¥qS5) を 96穴培養皿に播種し、 10% FBS (Gibco) を含む D— MEM培地（Gibco) 中で 60〜 70 °/。コンフルェントになるまで培養する。これを発現細胞として使用する。

(2) 薬物添加 . '

発現細胞の培地を使用前日に無血清の D—MEM培地に交換する。評価日に各化合物（2. 5mM DM SO溶液）を D— MEM培地で目的の濃度になるように希釈する。培養皿の培地を除去し、希釈した被験化合物と 4 / Mの Fluo3AM (Teflab. ) 及び 2. 5 mMの probenecid を添加し、 37 °Cで 60分培養する。被験化合物を添加しない以外は同様に処理したサンプルを、比較のために用意する。

(3) FLIPR法による細胞内カルシウム濃度測定

上記の処理を施した細胞を氷冷した PB Sで洗浄し、 Thyrode's medium (2. 5mMの probenecid, 1 % ゼラチンを含む）に懸濁する。培養皿の 488 nM、 540 nMでの吸収を FLIPR (Molecular Devices) にて定量する。実施例 5 ： G PRC 5 D— Ga融合蛋白質発現用プラスミドの構築

G P C Rのシグナリングをほぼ網羅できると考えられる代表格 3種の αサブユニットとして、 Gqファミリーから G α 16、 Giファミリーから Gai2、 Gsフアミリーから G(¾S2 を選択した。これらの全コーディング領域を発現ベクター pcDNA3.1(+)に PCR クローニングした。さらに、 P C Rにより各 G aコーディング領域の直前に制限酵素 EcoRV切断部位と、 6 XHisタグを含む配列を付加し、各 Gひ蛋白質の 5 ' 側に G PC Rの遺伝子を容易に融合することが出来るようなプラスミド pcHISGal6、 pcHISGai2_s pcHISG CK S2を作製した。

即ち、ヒト脾臓 cDNA (Clonthech) を 20倍希釈し、うち 1 " 1を増幅の鎵型とした。酵素は、 KODplus (T0Y0B0) を使用した。ただし、 Mg²⁺濃度は lm Mとした。増幅反応は、 20 μ 1の反応液で KODplusに添付の反応バッファーを使用した。 Go:16 c DNAを増幅するためにはプライマー GNA15F1 (配列番号 1 3) と GNA15R1 (配列番号 14 ) を、 Gai2 c DNAを増幅するためにはプライマー GNAi2Fl (配列番号 1 5) と GNAi2Rl (配列番号 16 ) を、また GaS2 c D NAを増幅するためにはプライマー GS2F1 (配列番号 17) と GS2R1 (配列番号 1 8 ) をそれぞれ使用した。増幅は、 GeneAmp PCR System 9600 (Applied Biosystems) を用い、 94°C、 2分→ (94°C、 1 5秒→68°〇、 120秒） X 40サイクルの条件で実施し、目的の大きさの PC R産物を得た。各 PC R産物の末端をリン酸化し、 0. 8 %ァガロースゲル電気泳動により分離精製後、制限酵素 EcoRVで切断し C I A P処理したプラスミド pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) とライゲーションし、大腸菌 DH 5 αを形質転換した。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵素消化パターンおよぴ挿入塩基配列が目的のものであることを確認し、得られた各 G蛋白質発現プラスミドをそれぞれ、 pcGal6 、 pcGai2 および' pcGo;S2 と命名した。

次に、各 G蛋白質の N末側に HISタグを介して GPRC 5 Dを融合することが出来るように、各 G蛋白質の開始コドン ATGの直前に HIS タグ配列を連結し、さらに制限酵素 EcoRVの認識部位を付加した。即ち、先ず、 pcG«16、 pcGo;i2および pcGひ S2それぞれ 10 n gを鎊型として、プライマー（GNA15ATG：配列番号 1 9、 GNAi2ATG：配列番号 20または GS2ATG：配列番号 21) とべクタ一部分のプライマー（pcDNARV：配列番号 22 )で P C Rを行った。増幅は、 94 °C、 2分 → (94°C、 1 5秒→58°〇、 30秒→68¾、 60秒） X 20サイクルの条件で実施し、目的の大きさの PC R産物を得た。次に、 HIS21inker (配列番号 23) と HIS21inker(R) (配列番号 24 ) をアニーリングし、末端をリン酸化後、各 P C R産物とライゲーシヨンした。これらを制限酵素 EcoRV、 Xholで切断後、目的 DNA断片を0. 8%ァガロースゲル電気泳動により分離、精製した。回収した DNA断片を、 EcoRVおよび Xholで切断した発現プラスミド pcDNA3.1 (+)とライゲーシヨンし、大腸菌 DH 5 αを形質転換した。形質転換株からプラスミドを精製し、制限酵素消化パターンおよび挿入塩基配列が目的のものであることを確認し、得られたプラスミドをそれぞれ pcHISGal6、 pcHISGひ i2および pcHISG a S2 と命名した。実施例 6 ： G PRC 5 D— Gひ融合蛋白質発現プラスミドの構築

(1) GPRC 5Dのクローニング

ヒト Testis由来 cDMライプラリー（クローンテック社）を用いて以下のプライマ一を用いて G PRC 5 D遺伝子の PC Rクローニングを行 όた。

5' -GGAGAAGGGCATCAGAAAAC-3 ' (配列番号 25 )

5， -TTATACTCCTCCTGCATCTTGC-3 ' (配列番号 26 )

得られた断片を pT7Blueベクター（ノバジェン社) に TA-クローエングした。得られたクローンからプラスミドを調製し、塩基配列の解析を行った。その結果、既報の文献と一致する配列の G PRC 5 D遺伝子が得られた。得られたプラスミドを pT7GPRC5Dと命名した。

(2) GPRC 5D発現ベクターの構築

発現ベクターの構築は、'基本的にインビトロジェン社の GATEWAYシステムを利用し、メーカーの取扱説明書に従って実施した。まず、発現ベクターのデスティネーシヨン .ベクター化を行った。実施例 5で作製した _PCHISGCKS2、 pcHISG a i2、 pcHISGo; 16それぞれを EcoRV消化後、 GATEWAY frame B (インビトロジェン社）を揷入し、 DB3.1 コンビテントセル（インビトロジェン社）を形質転換後ク口ラムフエ二コールにて選抜し、得られたクローンをさらに制限酵素消化にて選択することにより、 GATEWAY frame B が正しい方向に揷入された目的とするクローンを得た。これらをそれぞれ pcHisGaS2-DEST_s pcHisGひ i2 - DEST、 pcHisGa 16 - DEST と名づけた。また、対照として非融合遺伝子発現用ベクターとしては同じ CMVプロモーターと bGHターミネータ一を持つデスティネーション ·ベクターを利用した。すなわち、 pcDNA3. ltnycHisA を Hindlll-Xbal で消化後平滑化し、 GATEWAY frame C. 1 (インビトロジェン社）を揷入後、 DB³. 1コンビテントセルを形質転換後クロラムフエニコールにて選抜し、得られたクローンをさらに制限酵素消化にて選択することにより GATEWAY frame C. 1が正しい方向に揷入されたクローンを得、これを pcDNA3. 1 - DESTと命名した。

次に、 pT7GPRC5D をテンプレートとして、以下に示すプライマーを用いて PCR を行うことによりインタタトな終始コドンまでを持つ ORF (R型）およびインタクトな終始コドンのみを除いた ORF (F型）を増幅し、これらを電気泳動してゲル切り出しにより精製した後、 BPクロナーゼ（ィンビトロジェン社）の反応によりドナーベクター pD0NR201 (インビトロジェン社）に乗せ換えた。

atGPRC5DM (フォワード 'プライマー）：

5， -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCatgtacaaggactgcatcgagtcc-3 ' (酉 S歹 [J 番号 2 7 )

atGPRC5DR (R型用リバース ' プライマー）：

5' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAttatactcctcctgcatcttgctg-3 ' (配列番号 2 8 )

atGPRC5DF (F型用リバース .プライマー）：

5， -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCtactcctcctgcatcttgctg-3 ' (酉 S列番号 2 9 )

得られたクローンについて塩基配列の解析を行い、それぞれ目的とするクローンが取得できたことを確認した。得られたク口ーンはそれぞれ pENTR/GPRC5D/R (R型エントリー .クローン）、 pENTR/GPRC5D/F (F型エントリー 'クローン）と命名した。

これらについて LRクロナーゼ反応により pENTR/GPRC5D/Fは 3種の G a融合デスティネーシヨン 'ベクター (pcHisG c¾ S2_DEST、 pcHisG i2- DEST、 pcHisG a 16-DEST) へ、 pENTR/GPRC5D/Rは pcDNA3.1-DESTへ載せ換えた。得られたクローンについて、小スケールにてプラスミド調製し、制限酵素処理によって目的のクローンを選択した。このようにして得られたプラスミドをそれぞれ、 _PcC5D/His/G Q;S2、 pcC5D/His/Gひ i2、 pcC5D/His/Ga I⁶および pcCOTと命名した。さらに、細胞株への導入を目的として、 100ml培養液からキアゲン ·マキシ 'キ,ット（キアゲン社) を用いてプラスミドの大量調製、精製を行った。実施例 7 ： GP RC 5 D— 融合蛋白質発現による恒常的活性化の確認 . G P R C 5 Dの C末端に G _α蛋白質を融合させた蛋白質を細胞に発現させる：ことにより、恒常的活性化するかどうか検討するために、以下の実験を行った。

実施例 6で構築した 4種類のプラスミドベクター（_pcC5D、 pcC5D/His/GaS2、 pcC5D/His/G a i2、 pcC5D/His/G a 16) 及び pcDNA3.1 (+) (インビトロジェン社： Cat. No. V790-20) の DNA 1 gを 125 μ 1の OPTI- MEM I培地（インビト口ジェン社： Cat. No. 31985-062) で希釈した（A液）。トランスフエクシヨン試薬のリポフエクトァミン 2000 (インビトロジェン社： Cat. No. 11668-027) 2.5 /i 1を 125 μ 1の 0ΡΊΊ-ΜΕΜ培地で希釈して 5分間静置した（Β液)。 Α液と Β液を混合し 20分間静置した後、前 Bに 96ゥエルプレートに 3X 10⁴ 細胞ノゥエルで植込んだチャイニーズハムスター卵巣細胞（CH0-K1細胞、 ATCC No. CCL - 61) に 50/i l/ゥエルで添加した（triplicate)。 37°C、 5°/。C0₂条件下で 4時間培養した後、 10%FCS を含む F12培地（インビトロジェン社： Cat. No. 11765-054) lOO^ulZゥエルで培地交換し、更に約 12 時間培養した。これらの細胞を、 cAMP測定キットの HitHunter™ EFC Cyclic AMP Chemi luminescence Assay Kit (Applied Biosystems： Cat. No. DRX-0027) を用いて添付プロトコールに従い、細胞内 cAMP量を測定した（図 4)。その結果、 GP RC 5 Dと G o;S2との融合で特異的に cAMP量の増加が認められたので、 G P R C 5 Dは G aS2との融合により恒常的活性化ができることが示された。従って、 GPRC 5 Dは、 G as と共役する G P C Rであることが強く示唆された。配列表フリーテキスト

配列番号 5 ： GPRC 5D mRNAを増幅するためのプライマーとして機能すベくデザインされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 6 ： GPRC 5D mRNAを増幅するためのプライマーとして機能すベくデザインされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 7 ： G P C 5 Dの発現を阻害するアンチセンス DN Aとして機能すベ ■ くデザィンされたォリゴヌクレオチド。 ' · · 配列番号 8：サラセミアにおける ]3-グロビンプレ mRNAの 705位でのスプライシング異常を引き起こす変異により生じた配列に対するアンチセンス DN Aとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 ' 配列番号 9 ： GPRC 5D' mRN Aを增幅するためのプライマーとして機能すベくデザインされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 10 ： GPRC 5D mRN Aを増幅するためのプライマーとして機能すべくデザィンされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 1 1 ： GAPDH mRNAを増幅するためのプライマーとして機能すベくデザインされたオリゴヌクレオチド。 - · 配列番号 1 2 ： GAPDH mRNAを増幅するためのプライマーとして機能すベくデザインされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 1 3 ：全長 OR Fを含むヒト G蛋白質 G ¾16 c DNAフラグメントを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザィンされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 14 ：全長 OR Fを含むヒト G蛋白質 Go; 16 c DNAフラグメントを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。配列番号 1 5 ：全長 OR Fを含むヒト G蛋白質 Gai2 c DNAフラグメントを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザィンされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 16 ：全長 OR Fを含むヒト G蛋白質 Ga;i2 c DNAフラグメントを増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 · ，

配列番号 1 7 ：全長 OR Fを含むヒト G蛋白質 G«S2 c DNAフラグメントを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 '

配列番号 18 ：全長 ORFを含むヒト G蛋白質 GaS2 cDNAフラグメントを. 增幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 1 9 ：ヒト G蛋白質 Gal6 c D N Aフラグメントを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレォチド。

配列.番号 20 ：ヒト G蛋白質 Gai2 c D N Aフラグメントを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレォチド。

配列番号 21 ：ヒト G蛋白質 Go;S2 c DNAフラグメントを開始コドンから増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌタレォチド。

配列番号 22 ：プラスミド pcDNA3.1(+)のマルチクローニング部位を増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。 ·

配列番号 23 ： 6xHisタグぺプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザインされたセンス鎖オリゴヌクレオチド。配列番号 24 ： 6xHisタグぺプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含むリンカーを構築すべくデザィンされたアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド。

配列番号 25 ： GP RC 5 D c DNAを增幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 26 ： GPRC 5D c DNAを増幅するためのアンチセンスプライマ一として機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。，

配列番号 27 ： GPRC 5D c D N Aの O R Fを増幅するためのセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 28 ： GP RC 5 D c D N Aの O R F ' (R型）を増幅するためのアンチセンスプライマー.として機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。

配列番号 29 ： GPRC 5D c DNAの ORF (F型）を増幅するためのアンチセンスプライマーとして機能すべくデザインされたオリゴヌクレオチド。産業上の利用可能性

GPRC 5 Dは摂食行動に関与する GPCRであることから、 GPRC 5 Dの発現もしくは機能を増強もしくは抑制する物質を有効成分とする本発明の医薬組成物は、摂食量を所望の値に調節することが可能であり、それによつて糖尿病、肥満症、高脂血症等の過食に起因する生活習慣病、あるいは拒食症の治療に効果を発揮することが期待される。また、本発明のスクリーニング系及びスクリー二ング方法によれば、 GPRC 5 Dのリガンドを容易に且つ迅速にスクリーニングすることができ、 GPRC 5Dをターゲットとした新薬の開発、さらには疾患マ一力一の探索や、当該疾患マーカーを用いた診断方法の確立に有用である。本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神おょぴ範囲に包含されるすべての変更を含むものである。

本出願は、日本国で出願された特願 2001- 39 7523を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。 .

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 2又は 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドの発現もしくは機能を抑制する物質を有効成分とする拒食症治療薬。

2 . 以下の（a ) 又は（b ) の核酸：

( a ) 配列番号 1又は 3記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸 ( b ) 配列番号 1又は 3記載の塩基配列からなる核酸もしくは転写後プロセッシングにより該塩基配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の視床下部の生理的条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該配列番号 1又は 3記載の塩基配列にコードされるポリぺプチドの翻訳を阻害し得る核酸

を有効成分とする拒食症治療薬。

3 . 配列番号 2又は 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドに特異的親和性を示し、該ポリペプチドの機能的発現を阻害する物質を有効成分とする拒食症治療薬。

4 . 該物質が核酸である請求項 3記載の拒食症治療薬。

5 . 該物質が抗体である請求項 3記載の拒食症治療薬。

6 . 請求項 2又は 4記載の核酸をコードする発現ベクターを有効成分とする拒食症治療薬。

7 . 請求項 6記載の発現ベクターでトランスフエタトされた宿主細胞を有効成分とする拒食症治療薬。

8 . 配列番号 2又は 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドの発現もしくは機能を増強する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬。

9 . 以下の（a ) 〜（c ) のいずれかのポリペプチド：

( a ) 配列番号 2又は 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド

( b ) 配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列において、 1もしくは 2以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（a) のポリペプチドと同等のリガンドー受容体相互作用を示し、且つ G蛋白質 α サブュニットと共役して該サブュニットの GDP ■ G TP交換反応を促進する活性を有するポリペプチド - (c) (a) のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド

を有効成分とする生活習慣病治療薬。 . .

10. 請求項 9記載のポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを有効成分とする生活習慣病治療薬。

1 1. 請求項 10記載の発現ベクターでトランスフエクトされた宿主細胞を有効成分とする生活習慣病治療薬。

1 2. 摂食抑制剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤又は抗高脂血症剤である請求項 8〜1 1のいずれかに記載の生活習慣病治療薬。

1 3. 拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質のスクリーニング系であって、以下の（a) 〜（c) のいずれかのポリペプチド：

(a) 配列番号 2又は 4記載のァミノ酸配列からなるポリペプチド

(b) 配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列において、 1もしくは 2以上のアミノ酸が置換、欠失、揷入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（a) のポリペプチドと同等のリガンドー受容体相互作用を示し、且つ G蛋白質 α サプュニットと共役して該サブュニットの GDP ■ G TP交換反応を促進する活性を有するポリペプチド

(c) (a) のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド

を含む脂質二重層膜、並びにあるファミリーに属する G蛋白質 _α サブユニットの受容体結合領域及び任意の G蛋白質ひサブユニットのグァニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリぺプチドを構成要素として含む系を 1構成単位とし、該構成単位を G蛋白質 α サブュニットの各ファミリーの受容体結合領域について有することを特徴とするスクリーエング系。

1 4 . 該構成単位が、該（a ) 〜（c ) のいずれかのポリペプチドをコードする D N Aを含む発現ベクターと、あるファミリーに属する G蛋白質ひサブュニットの受容体結合領域及び任意の G蛋白質 a サブユニットのグァニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドをコードする D N Aを含む発現べクターとでトランスフエクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項 1 3記載のスクリーニング系。.

1 5 . 該構成単位が、該（ a ) 〜（ c ) のいずれかのポリぺプチドの C末端側に、あるファミリーに属する G蛋白質 a サブユニットの受容体結合領域及び任意の G,蛋白質 α サブユニットのグァニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリぺプチドが融合したポリべプチドをコ一ドする D N Aを含む発現ベクターでトランスフエクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項 1 3記載のスクリーニング系。 '

1 6 . 各構成単位の、 G蛋白質 α サブユニットの受容体結合領域及び任意の G 蛋白質 αサブュ-ットのグァニンヌクレオチド結合領域を含むポリべプチドが、同一の効果器相互作用領域をさらに含み、且つ該脂質二重層膜が該領域と相互作用する効果器をさらに含むものである、請求項 1 3〜1 5のいずれかに記載のスクリ一ユング系。

1 7 . 生活習慣病に対する治療活性が、摂食抑制活性、抗肥満活性、抗糖尿病活性又は抗高脂血症活性である請求項 1 3〜 1 6のいずれかに記載のスクリ一二ング系。

1 8 . 請求項 1 3〜1 5のいずれかに記載のスクリーニング系の各構成単位において、被験物質の存在下及び非存在下で、標識した G T Pアナログを添加し、グァニンヌクレオチド結合領域に結合した標識量を両条件下で比較することを特徴とする、拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質のスクリーニング方法。

1 9 . 請求項 1 6記載のスクリーニング系の各構成単位における効果器の活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質のスクリ一二ング方法。

2 0 . 請求項 1 3〜1 5のいずれかに記載のスクリーエング系の各構成単位において、配列番号 2又は 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドに対するリガンドの存在下又は非存在下で、標識した G T Pアナログを添加し、グァェンヌクレオチド結合領域に結合した標識量を各構成単位間で比較することを特徴とする、該ポリペプチドと共役し得る G蛋白質ひサブュニットの同定方法。

2 1 . 請求項 1 6記載のスクリーニング系の各構成単位における効果器の活性を、配列番号 2又は 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドに対するリガンドの存在下又は非存在下で比較することを特徴とする、該ポリペプチドと共役し得る G蛋白質 αサブユニットの同定方法。

2 2 . 請求項 1 8又は 1 9記載の方法を、請求項 2 0または 2 1記載の方法により同定された G蛋白質 αサプュ二ットの受容体結合領域を含むポ-リぺプチドを構成要素として含む系についてのみ実施することを特徴とする、拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質のスクリ一二ング方法。

2 3 . 該 G蛋白質 αサブユニットが Gs ファミリーに属するものである、請求項 2 2記載の方法。

2 4 . 以下の（a ) 〜（c ) のいずれかのポリペプチド：'

( a ) 配列番号 2又は 4記載のァミノ酸配列からなるポリペプチド

( b ) 配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列において、 1'もしくは 2以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（a ) のポリペプチドと同等のリガンドー受容体相互作用を示し、且つ Gs ファミリーに属する G蛋白質 αサブュエツトと共役して該サブュュットの G D P · G T P交換反応を促進する活性を有するポリペプチド

( c ) ( a ) のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド

に対するリガンドのスクリーユング系であって、該ポリペプチドを含む脂質二重層膜、並びに Gs ファミリーに属する G蛋白質 aサプュ -ットの受容体結合領域及ぴ任意の G蛋白質ひサブュニットのグァユンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドを構成要素として含むことを特徴とするスクリーニング系。

2 5 . 該（a ) 〜（ c ) のいずれかのポリペプチドをコードする D N Aを含む発現ベクターと、 Gs ファミリーに属する G蛋白質 αサブュットの受容体結合領域及び任意の G蛋白質サブユニットのグァニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリぺプチドをコードする D Ν Αを含む発現べクターとでトランスフユクトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む、請求項 2 4記載のスクリーニング系。

2 6 . 該（a ) 〜（c ) のいずれかのポリペプチドの C末端側に、 Gs ファミリ一に属する G蛋白質 αサブユニットの受容体結合領域及び任意の G蛋白質 αサプュエツトのグァニンヌクレオチド結合領域を少なくとも含むポリペプチドが融合したポリぺプチドをコ一ドする D N Aを含む発現ベクターでトランスフエタトした宿主真核細胞、該細胞のホモジネートまたは該細胞由来の膜画分を含む請求項 2 4記載のスクリーエング系。

2 7 . Gs ファミリーに属する G蛋白質ひサブユニットの受容体結合領域及び任意の G蛋白質 αサブユエットのグァェンヌクレオチド結合領域を含むポリぺプチドが、任意の効果器相互作用領域をさらに含み、且つ該脂質二重層膜が該領域と相互作用する効果器をさらに含む、請求項 2 4〜 2 6のいずれかに記載のスクリーニング系。

2 8 . 該効果器がアデ-ル酸シクラーゼである請求項 2 7記載のスクリーニング系。

2 9 . 拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質を探索するための系である請求項 2 4〜 2 8のいずれかに記載のスクリーニング系。

3 0 . 生活習慣病に対する治療活性が、摂食抑制活性、抗肥満活性、抗糖尿病活性又は抗高脂血症活性である請求項 29記載のスクリ一ユング系。

31. 以下の（a) 〜（c) のいずれかのポリペプチド：

(b) 配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列において、 1もしくは 2以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（a) のポリペプチドと同等のリガンドー受容体相互作用を示し、且つ Gs ファミリーに属する G蛋白質ひサブュニットと共役して該サプュニッ 'トの GDP · GTP交换反応を促進する活性を有するポリぺプチド

(c) (a.) のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド

に対するリガンドのスクリーニング方法であって、請求項 24〜 26のいずれかに記載のスクリーニング系において、被験物質の存在下及び非存在下で、標識した G TPアナログを添加し、グァニンヌクレオチド結合領域に結合した標識量を両条件下で比較することを特徴'とするスクリーニング方法。 '

32. 以下の（a) 〜（c) のいずれかのポリペプチド：

(a) 配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド

(b) 配列番号 2又は 4記載のアミノ酸配列において、 1もしくは 2以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加または修飾されたアミノ酸配列からなり、（a) のポリペプチドと同等のリガンドー受容体相互作用を示し、且つ Gs ファミリーに属する G蛋白質 αサブュニットと共役して該サブュニットの GDP ■ GTP交換反応を促進する活性を有するポリペプチド '

(c) (a) のポリペプチドのオルソログであるポリペプチド '

に対するリガンドのスクリ一エング方法であって、請求項 2.7記載のスクリ一二ング系における効果器の活性を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とするスクリーニング方法。

33. 宿主真核細胞内の c AMP量を被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、請求項 32記載のスクリーユング方法。

34. 拒食症又は生活習慣病に対する治療活性を有する物質を探索するための系である請求項 3 1〜33のいずれかに記載のスクリーエング方法。

35. 生活習慣病に対する治療活性が、摂食抑制活性、抗肥満活性、抗糖尿病活性又は抗高脂血症活性である請求項 18、 1 9、 22、 2.3及び 34のいずれかに記載のスクリ一二ング方法。

36. 請求項 1 3〜： L 6、 18、 1 9、 22、 23、 .29及び 34のいずれ力に記載のスクリーニング方法により得られる、拒食症に対する治療活性を有する物質を有効成分とする拒食症治療剤。

37. 請求項 1 3~16、 18、 1 9、 22、 23、 29及び 34のいずれかに記載のスクリ'一-ング方法により得られる、.生活習慣病に対する治療活性を有する物質を有効成分とする生活習慣病治療薬。