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WO2003050535A2 - Verfahren zur bestimmung von einflüssen unphysiologischer verbindungen, deren derivate und abbauprodukte auf organismen, organe und zellen - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von einflüssen unphysiologischer verbindungen, deren derivate und abbauprodukte auf organismen, organe und zellen Download PDF

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WO2003050535A2
WO2003050535A2 PCT/EP2002/013996 EP0213996W WO03050535A2 WO 2003050535 A2 WO2003050535 A2 WO 2003050535A2 EP 0213996 W EP0213996 W EP 0213996W WO 03050535 A2 WO03050535 A2 WO 03050535A2
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WO
WIPO (PCT)
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cell
cells
patterns
localization
molecules
Prior art date
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PCT/EP2002/013996
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English (en)
French (fr)
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WO2003050535A3 (de
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Karsten Henco
Timm Jessen
Jürgen Kupper
Erich Greiner
Rolf Günther
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evotec OAI AG
Revvity Cellular Technologies GmbH
Original Assignee
Evotec Technologies GmbH
Evotec OAI AG
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Publication date
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Publication of WO2003050535A3 publication Critical patent/WO2003050535A3/de
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    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates

Definitions

  • a method for determining induced effects of unphysiological substances, their derivatives or degradation products, on preferably unknown interaction partners in the form of molecules, molecular complexes or of subcellular structures of a cell, a cell assembly, an organ or organism for detecting the influence of a physiological state of a cell , a cluster of cells, an organ or organism by determining subcellular patterns based on the localization of molecules and the spatial correlation of at least two molecules, referred to as co-localization, and on the molecular concentration.
  • Relevant according to the invention are the non-target-related interactions in comparison to effects which result from interactions with the pharmacologically attackable target molecule, referred to as the target.
  • Food additives, toxins, technically used substances, pesticides, insecticides, pesticides, cosmetics, detergent ingredients etc. must be analyzed in their effects on biological systems.
  • Another problem area in this context has become the focus of attention in recent years, namely the genetic disposition related to the effectiveness of a drug on the individual Organism.
  • the so-called genetic disposition of the individual can influence the incidence and progression of certain diseases (e.g. the
  • metabolism metabolism of the compound in the body
  • SNP analysis single nucleotide polymorphism analysis
  • the PCR method makes it possible to individually adapt such SNP patterns, for example on the basis of chips to register. Of course, it would be a great advantage if, instead of not directly correlated SNP markers, the
  • Mutagenicity tests that is, the influence of non-physiological substances on replication and error correction in genome replication, have been analyzed for a long time. Mutagenic substances are registered macroscopically, for example, via color changes in microbial cell colonies. Toxic effects have recently been measured by changing specific protein concentrations or enzyme activities in tissue homogenates or also in single cells of tissues. mRNA concentration patterns from tissue samples or cell cultures are used to analyze the effects of unphysiological substances on the level of transcription or post-transcriptional mRNA modification. In particular, the effects of unphysiological substances, their derivatives and breakdown products on the enzymes of the liver detoxification system are analyzed (eg P450 isoenzymes).
  • tissue samples generally contain a wide variety of cell types or cells with different states of differentiation or maturation, which react very differently to influences from unphysiological substances can.
  • the methods are not sensitive enough for single cell analysis.
  • the invention relates to the surprising finding that ADMET properties of unphysiological compounds, their derivatives or degradation products are not only reflected in modified measurable functions of proteins such as enzyme activities or concentrations of the proteins or the gene transcripts encoding them.
  • the method according to the invention allows the determination of non-target-related interactions and effects induced by non-target-related interactions if chemical or biological substances, their derivatives or degradation products in their effects on cells, a collection of individual cells of a cell type, of cells of a Cell association or tissue, from cells of an organ or an organism to be tested to study reversible or irreversible toxic side effects or new mechanisms of action.
  • the method described here is preferably used ex corpore, ie outside the human or animal body.
  • cells, tissues and organs isolated from the body, and cells in cell culture are preferably used as samples and examination objects.
  • the method according to the invention for determining reversible or irreversible physiological side effects of a substance comprises the following steps: (a) providing a sample treated with the substance, preferably consisting of one or more cells in a cell cluster or organ, (b) determining cellular and / or subcellular pattern of localization and co-localization and concentration of at least two different molecules, in particular proteins, RNA molecules or DNA segments, in at least one subpopulation of cells, (c) comparing the pattern obtained in step (b) with Samples of an untreated control sample, and (d) determining a physiological side effect of the substance using different patterns for a treated sample compared to an untreated sample.
  • non-target-related interactions The primary target structures of active substances are called targets. These are the molecules that physically interact with the active substance via specific interfaces such as active centers via molecular interactions. For example, enzymes are reversibly or irreversibly inhibited, receptors are activated agonistically or blocked or antagonistically ion channels changed in their electrophysiological characteristics. These interactions of active substances or their metabolites and their target-mediated secondary effects are understood as target-related interactions and are not the subject of this invention. Other interactions and their molecular sequelae with molecules, molecular complexes, cells, or organs of an organism that are not due to the interaction with the pharmacological target are referred to below as non-target-related interactions and are the subject of the patent application. They are decisive for the ADMET profiles of active ingredients. In the present invention, the definition of “non-target-related interactions” is to be equated with “physiological side effects” and “unphysiological interactions”.
  • the at least two different molecules are both one Substance class (eg two different proteins) as well as different substance classes (eg a protein and an RNA molecule) can be assigned.
  • the method according to the invention can be used to determine line-associated localization and co-localization and concentration patterns of at least two different molecules. At least one subpopulation of living cells is pretreated with at least one physiologically active substance at at least one point in time. A determination of said pattern is then carried out on either living or fixed cells.
  • the method preferably analyzes at least unknown direct or indirect interaction partners of the active substances to be analyzed in the form of molecules, molecular complexes or subcellular structures at least a single cell, a collection of single cells of a cell type, of
  • Patterns from concentration and localization and co-localization or their superordinate patterns of at least two proteins or RNA molecules or DNA segments can be determined in at least one sub-population of cells. It is possible that organ-specific side effects or toxic effects only manifest themselves on certain subceline types which would never be detectable with methods which are already known and which have a large number of
  • the method can also identify characteristic patterns that manifest themselves in a small subpopulation with an excess of otherwise immeasurable cells. According to the invention, however, the method is also based on differentiated homogeneous cell populations or functionally differentiated
  • a method for identifying targets and for identifying pathological states of cells or organisms is known, in which the localization or co-localization or concentration of pathologically modified proteins are identified with cellular or subcellular resolution (W. Schubert, US Pat. 6, 150,173; T. Nattkemper, WO 01/36939). Proteins are identified here that have been selectively changed in relation to the subtype of a cell, concentration, localization and co-localization compared to other proteins by a pathological process. The concentration can be determined here by only determining whether a corresponding detection signal is above or below a selected threshold value. It is these targets and their associated signal transducer disks that are specifically influenced by the action of a drug. For this reason, the method is of great importance in the diagnosis of pathological conditions, the identification of pharmacologically vulnerable targets and the analysis of pharmaceuticals for these targets and members of the same target family. We regard these described interactions as target-related interactions.
  • the present invention also relates to the application of the method described in US Pat. No. 6,150,173, the content of which is hereby incorporated, to those molecules which are not associated with a pathological phenotype or target, but with molecules whose pattern changes in localization or co- Localization or concentration is a reliable and early indicator of reversible or irreversible long-term effects of unphysiological compounds. represents their derivatives or degradation products. By this we mean the non-target-related Interactions.
  • nonphysiological compounds refer to synthetic chemical or biochemical
  • the method according to the invention is inexpensive and sensitive long before gross changes can be macroscopically detected using the methods described above.
  • Pathological conditions are associated with targets and the associated target network.
  • Medicaments are intended to reverse this change or to effect the functional reversion by the fact that a drug effects phenotypic compensation at one or more specific locations.
  • the present invention relates precisely to the grouping of proteins of an organism in their entirety or in subsets which are not linked to the target network or the compensation network which neutralizes a pathological phenotype. However, based on localization or co-localization or concentration, these proteins are suitable for indicating the effects of unphysiological compounds, their derivatives or degradation products outside the actual target activity.
  • binding molecules such as antibodies, antibody fragments, peptides which are directly or indirectly coupled to an optical marker, preferably at least one fluorescent marker, can be brought into contact with the fixed substrate in a suitable medium, so that sufficient affine binding molecules can couple to their fixed binding partners. Excess binding molecules are removed from the substrate by a washing process. The optical markers are then detected with a suitable measuring apparatus with high spatial resolution via their optical quality and registered and stored in data form with regard to localization, co-localization and concentration.
  • the concentration can be determined by only determining whether a corresponding detection signal is above or is below a selected threshold value for the respective measuring volume element.
  • the optical marker is deactivated in a subsequent step. This can be done by exposure to radiation or by chemical reaction. This basic sequence of steps can be repeated cyclically by reaction with one or more further types of binding molecules. This method preferably uses the same optical marker or fluorophore again and again in order to keep any optical aberration constant over all cycles.
  • a high specificity of the binding molecules is of secondary importance in the method according to the invention.
  • Several types of binders can also be used simultaneously or in groups. Only the pattern formation from localization, co-localization and concentration is informative according to the invention and indicates a biological deflection from a known physiological reference status. These pattern formations serve as surrogate markers for the phenotype of a non-target-related side effect. It is not necessarily directly related to the non-target-related site of action.
  • the analyzes are preferably carried out on healthy organisms, organs, tissues or cells if the interactions with non-target-associated molecules are to be measured.
  • the sample interpretation is preferably carried out after the at least one or the cyclical measurements.
  • volume elements or groups of volume elements Based on volume elements or groups of volume elements, algorithms recognize specific constellations of colorations that are characteristic of a specific state such as an irreversible toxicity effect or a reversible interaction. They can be sorted on the computer and presented in different constellations so that the effects of substances on a cellular event are emphasized.
  • Minimal patterns are identified as characteristic patterns of specific reversible side effects or irreversible toxic effects and can be assigned to certain cell types or their differentiation stages or age. The appearance of these patterns also confirms the presence of the active molecule to be examined. This allows the presence, concentration and temporal kinetics of concentration shifts to be registered.
  • Characteristic patterns preferably minimal patterns, announce, for example, the beginning of dedifferentiation, apoptosis, different cell morphology or organellmorphology, inflammation, autoimmune reaction or the loss of a specific functional pattern of a differentiated cell type etc.
  • certain molecules in cells or cell groups of, for example, organ sections are quantified with a spatial resolution of ⁇ 20 ⁇ m, preferably less than 10 ⁇ m, preferably less than 2 ⁇ m.
  • This allows co-localized molecular constellations and patterns of co-localized molecular constellations in the sense of molecular patterns to be determined at the individual cell level or at the sub-cellular level.
  • distance coordinates between individual measuring points can also be used for pattern formation. This means that patterns can be digitized and made available for statistical evaluation at the individual cell or subcellular level.
  • CAMP compound associated marker pattern
  • the subcellular patterns are identified in that patterns are generated by optically distinguishable marker-labeled antibodies or optically distinguishable marker-labeled binding molecules or groups of such binding molecules, in that the specific antibodies or binding molecules are sequenced once by at least two optically distinguishable antibodies or binding molecules or in a cyclical sequence can be reacted with the fixed sample containing at least one cell, tissue, organ or organism.
  • the topological distribution and intensity of the optical signals are registered.
  • Respective CAMPs present themselves as a two-dimensional combinatorial pattern of protein localization and co-localization. According to the invention, it is obtained from individual cells, tissues, organs or entire organisms. At least two different proteins are used for a pattern formation, but preferably a number such as 5, 10 or even more, as soon as or until a stable pattern description is obtained.
  • a CAMP is assigned to a cellular or subcellular two-dimensional location coordinate or, in an alternative specific embodiment, to a time coordinate and is typically described with a binary code.
  • Each position of the binary code corresponds to a protein. or the associated detection reagent such as a labeled antibody.
  • a threshold value is defined for each of these proteins using a calibration method. If the associated value in the measuring element lies above the threshold value, a 1 is assigned for the corresponding position in the binary code. If the associated value in the measuring element is below the threshold value, a 0 is assigned for the corresponding position in the binary code.
  • 4 different patterns can result (1 1, 10, 01, 00). With three proteins, 8 different patterns can result (111, 110, 101, 011, 001, 010, 100, 000), etc.
  • Various methods are available for the representation of the patterns, which are described in the exemplary embodiments.
  • a characteristic cellular molecular pattern is formed by assigning at least 2 defined molecules individually with optical resolution of a measuring volume element of the size of a cell or an optically resolved measuring volume element as a partial volume element of a cell to the number 0 or 1, depending on whether the respective concentration is above or under one before determined threshold value, or wherein at least one characteristic subcellular molecular pattern from molecular patterns of the individual subcellular
  • Partial volume elements of a cell or a cell type is formed.
  • the local resolution for determining the cellular localization and co-localization and concentration into a temporal resolution.
  • individual cells in an electrical field cage, as described in DE 197 23 873.4 (method and device for detecting object movements), held and rotated at a specific frequency.
  • the optical detection volume remains stationary, but the cell rotates in the sample, with the scanned volume elements of the cell repeatedly passing through the measurement volume in time with the rotation frequency.
  • the information is initially recorded sequentially in time.
  • a spatially resolved image can be reconstructed from such time series, but this is not absolutely necessary for the described method.
  • the time series it is sufficient to evaluate the time series according to the temporally common or individual occurrence of the at least two proteins, DNA or RNA or else their absence.
  • the common occurrence of the proteins, DNA or RNA can be quantified via cross-correlation of the two time series, while the individual occurrence can be calculated from the difference between the autocorrelation and cross-correlation.
  • suitable mathematical transformations are Fourier and Laplace transformations as well as wavelet transformations, the arguments of which can be spatial and / or, as already described above, temporal.
  • transformations with variable arguments can be used for certain distances.
  • the cross correlation F (x) * G (x-a) indicates how many proteins are spaced a from each other.
  • the method is also suitable for genotype-associated differences in phenotypic response behavior to non-target-related interactions study of active substances or their metabolites.
  • cells for this, cells,
  • Tissues or organisms of different genotypes are used for the analysis according to the invention.
  • the subcellular patterns are generated by optically distinguishable marker-labeled antibodies or optically distinguishable marker-labeled binding molecules or groups of such binding molecules in that the at least two specific antibodies or binding molecules with the fixed sample, containing at least one cell, cell assembly, Organ or organism are brought to reaction and the topological distribution of the respective antibodies is assigned via distinguishable optical signals.
  • optically distinguishable signals are generated by different excitation wavelengths or emission wavelengths, by different energy transfer effects (FRET), by different intensities, polarization, or lifespan of the excited states or combinations of the aforementioned distinguishable signals.
  • the optically distinguishable markers are fluorescent markers.
  • living cells can also be analyzed according to the invention, in that cells are recombinantly produced in a manner according to standard methods in such a way that at least two proteins are fluorescence-labeled in situ, their localization and co-localization being used for the evaluation according to the invention become.
  • GFP green fluorescent protein
  • its variants or other fluorescent domains can be coupled at the N- or C-terminal to open reading frames of domains of the functional proteins of interest.
  • Protein types can act as surrogate markers.
  • the effect, side effect or toxicity of active substances can also be identified according to the invention via morphological patterns if cells or cell organelles change their shape inside or outside their tissue structure. This results in different, characteristic distribution patterns or spacing patterns that can be identified according to the invention.
  • Proteins that are preferably used include proteins that belong to the group of proteins that are listed in Table 1. Usually, at least 5 proteins from this list are analyzed in addition to other proteins. The proteins are expressed in one or more specific cell types within a tissue or organ. Basically, all occurring proteins, peptides, DNA segments or RNAs can be used as marker candidates.
  • the analyzes can be carried out on cell cultures or tissue cultures, on organ cultures, ex vivo organs or whole organisms. Instead of analyzing toxicological endpoints, initiated ADMEtox effects can be analyzed or reversible effects, the fatal consequences of which are otherwise not yet manifest in the parent organism. This saves time and money. It can be prevented early on to invest further development costs in new chemical compounds that would fail in the long term due to toxicity problems. Of course, larger structures can be identified at an early stage from those hit groups that do not have certain tox profiles if desired, and thus represent suitable candidates for medical-chemical optimization.
  • Toxic effects are not necessarily equally distributed within organs, or concentrations of the respective active substance or its metabolic products show different concentrations and temporal courses after application (pharmacokinetics and pharmacodynamics).
  • copper cells, sinusoidal cells, ito cells, hepatocytes can be Gallbladder epithelial cells, endothelial cells of the hepatic venole and sinusoidal endothelial cells are differentiated with regard to toxic effects.
  • marker proteins are used for the analysis, which serve as indicators for the associated cell subtype.
  • the method according to the invention shows that toxic effects of substances on organs initially concentrate selectively on certain cell subtypes in an affected organ and can be detected selectively here according to the invention.
  • This is the decisive difference from methods in which analyzes of the quantity of certain RNAs or proteins are carried out at the mRNA level (transcriptome) or protein level (proteome) on the basis of a mixture of a large number of cells from an organ or tissue.
  • These methods always start from several cells, usually from 10,000 to 100,000. This almost always contains cells of different subtypes (differentiated / dedifferentiated, muscle cells, endothelial cells, blood cells and more).
  • the method according to the invention identifies characteristic toxicity patterns via statistical measurements on single cells or sub-compartments of single cells. This explains the sensitivity of the method according to the invention to non-single cell based methods.
  • Procedure described so far can quantitatively record individual genes, gene transcripts, processed gene transcripts and proteins in tissue samples or cell cultures and identify groups of characteristic individual genes, gene transcripts, prepared gene transcripts and proteins. This is also a kind of pattern formation, but it is based on mixtures of a large number of cells which, when they are obtained from an organism or an organ, always represent a mixture of different cell types or physiological conditions such as "in cell division” or "dormant” , Such cells can react to substances in very different ways. For example, only certain cells are usually degenerated in a tumor tissue.
  • RNAs are not a reliable marker for the existence of the associated protein in the individual cell, let alone correct protein processing, localization or correct co-localization in the combination of functionally interacting proteins.
  • AH response acute phase stress
  • anti-metabolism anti-apoptosis and apoptosis
  • anti-proliferation depletion of ATP reserves
  • autoimmune reactions cholestasis, de- / differentiation
  • DNA damage DNA replication
  • inflammation inflammatory reactions
  • fatty liver fibrosis
  • Arachidonic acid release early gene responses, general cell stress, glucose withdrawal, heat shock, hypercholesterolemia, hypoxia,
  • Hypersensitivity immunotoxicity, invasion, ion transport, liver toxicity, liver regeneration, mitochondrial function, mitosis induction, multidrug resistance, kidney toxicity, estrogenicity, oxidative stress,
  • Peroxisome proliferation Peroxisome damage, recombination, ribotoxicity or ribotoxic stress, sclerosis, steatosis, stress of the endoplasmic reticulum, teratogenesis, transformation, interruption of translation, transport, tumor suppression, interruption of the cell cycle,
  • pattern identifications which are associated with a phenotype as a result of administration of a toxic substance in which damage occurs at the level of proteins, protein complexes, nucleic acids, organelles, tissues, organs or systems of an individual. This is of particular interest for the breakdown of the activity profiles and side effect profiles of new pharmacological drug candidates. Specific tox effects are described for a number of known marker substances: AH response, acute phase stress, antimetabolism, anti-
  • Such toxicity patterns can thus be assigned to very specific toxicity subtypes. In this way, new patterns can be compared with the previously defined patterns. This allows unknowns
  • mutants are available as testable cells or tissues, the patterns identified as characteristic can be further validated.
  • the method allows the identification and determination of such characteristic protein patterns at the single cell level or subcellular protein pattern (CAMP) as characteristic surrogate markers for defined phenotypes in response to an interaction with at least one chemical or biological substance, its derivatives or degradation products.
  • CAMPs are identified by comparing patterns that correlate with a specific individual phenotype. These phenotypes and are similar in different individuals can be specifically distinguished from corresponding patterns that are obtained from analog tissues from individuals who do not have the corresponding phenotype or which are not brought into contact with the at least one chemical or biological substance.
  • the patterns identified as characteristic can be further validated. Not only changes in cellular or subcellular protein patterns compared to a defined wild type or normal state are indicative of the interaction of a substance with cells or tissues.
  • Specific patterns (CAMPs) for certain phenotypes can also be identified in terms of a specific reaction of a cell to the interaction with a substance.
  • the method can also be used to make statements about the rate of absorption, distribution in the organism, metabolism and discharge of unphysiological compounds, their derivatives or degradation products. Changes in the pattern of non-target-related proteins indicate the presence and concentration of these compounds at a certain time after application.
  • the compounds themselves are not the compounds themselves, as is usually the case when administering radioactive analogs, but their non-target-related effects.
  • undesired physiological effects can only be discovered on subpopulations of cells of a tissue, organ or organism. These can be differentiated cell types or individual cells of an otherwise uniform cell type.
  • indicators for detecting the cellular subtype of the spatially resolved measuring volume element are also preferably recorded.
  • specific side effects can also be associated with specific cell types or also with a specific differentiation status of a cell type, in a preferred embodiment using differentiated stem cells.
  • new mechanisms of action can also be identified, which can also indicate previously unknown positive pharmacological effects in known active substances.
  • Side effects can also mean indicators of alternative activity profiles and new mechanisms of action of known active substances. In this way, new targets can also be detected if there are pharmacologically interesting side effects.
  • the method typically also identifies such events in a complex substrate, such as an organ slice, in which the constellation of different cell types varies with one another, e.g. by rearranging cells in a cluster, e.g. the chemotactic attraction of astrocytes in the brain and their activation or influences on the pattern of the different ones Mobilization stages, differentiation stages or Conversions of stages of differentiation from non-physiological
  • the present invention also solves important questions relating to the effects of unphysiological compounds, their derivatives or degradation products on different individuals, which can ultimately be traced back to different genetic constellations.
  • SNPs gene mutant patterns
  • the non-target-related effects can be analyzed directly via the functions at the protein level. Even if it is thus not possible to determine prospectively due to a genetic fingerprint of the populations that can not be with the tested non-physiological compound whose derivatives' or degradation products to come into contact, so nevertheless determine in the chemical evolution of the substances, if at all and to what extent subpopulations react unfavorably or differently to the compounds.
  • the method also makes it possible to display physiological compensation mechanisms via pattern variations which vary over time, and to detect a biological substance activity which builds up over time with regard to action, side effect or toxicity
  • the method is also particularly important for the analysis of synergistic side effects of various active ingredients.
  • the effect, side effect or toxicity of active substances can be measured depending on the concentration in the presence of at least one further active substance.
  • Reversible side effects can be differentiated from irreversible toxic effects organ-specific or cell-specific quantifying or digitizing by measuring the time course or a reversal of characteristic side-effect patterns after the exposure to chemical or biological active substances has been discontinued. The results obtained are based on statistical results obtained at the single cell level.
  • Enzyme mixtures of the P450 enzymes are pre-incubated, or with the so-called S9 fraction of liver extracts or with a microsome
  • Tissue or cells of the digestive tract are naturally the first and in a comparatively maximum concentration to be confronted with an active substance or mixture of active substances.
  • Tissue or cells of the digestive tract especially the liver, pancreas, stomach, small intestine, large intestine, gall bladder, kidney or bladder are therefore of particular interest for preclinical and clinical research.
  • the kidney as a common excretory organ is another tissue that is particularly confronted with metabolites of active substances, which can occasionally also have a toxic effect.
  • Proteins that are associated with necrosis, glomerulitis, nephritis, tumor formation, hyperplasia, proteinuria, kidney damage or kidney failure are preferably included in the evaluation. But other organs also often react with specific side effects. These include muscle tissue, heart, blood, skin, eyes and nerve tissue. Accordingly, proteins are preferred here whose association with myotoxicity, cardiotoxicity, blood toxicity, skin toxicity, eye toxicity or neurotoxicity has already been described in principle. To those described Phenotypes include muscular dystrophy, tachycardia, arrhythmia,
  • hypotension hypertension, leukemia, neutropenia, agranulocytosis, peripheral neuropathy, dementia, inflammation, irritation, sensitization,
  • Protein markers relate to proteins associated with apoptosis, cell adhesion, autophagocytosis, cell cycle arrest, cyrcadian rhythm, cytokine secretion, de-differentiation, differentiation, damage to mitochondria, migration, mutation, oncose, peroxisome proliferation, recombination, transformation, or senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence, re-association, transformation, senescence,
  • An essential aspect in the assessment of non-target-related interactions of substances is the reversible and irreversible interaction with the specifically functional performance profile of specifically differentiated cells.
  • the method according to the invention makes it possible to identify surrogate markers that indicate largely unaffected functionality or their reversible or irreversible toxic influence without necessarily being linked to the mechanistic causes. Once such surrogate markers have been identified, it is not absolutely necessary for a large-scale screening of large numbers of chemical or biological substances to determine a large number of additional markers in iterative processes.
  • one cycle is sufficient to infer a changed functionality of a cell type from a characteristically changed co-localization of only two surrogate markers.
  • the associated proteins can also be colored in that the proteins carry an optically detectable marker in situ.
  • the staining of individual subcellular compartments is specifically marked, for example the cell nucleus by propidium iodide (prop), mitochondria by the antibody MitochondriaAB2 (mito) and parts of the ER and Golgi network by a lectin (wga, wheat germ agglutinin) Calculate the cytoplasmic area by adding some cytoplasmic stains and subtracting the core stain ren (see Fig. 2). If this method is used with several cell cultures or tissue sections under both control and test conditions, the proportionate distribution of individual molecule types in the different subcellular areas can be statistically quantified (see FIG. 4). Based on the method described in FIG. 1, two different subcellular areas of individually resolved cells were defined in FIG. 2. The cell nucleus, which was marked by the propidium iodide staining, is shown in black. The cytoplasmic area is shown in gray.
  • FIG. 3 shows the distribution of the human retinoic acid receptor (hRAR) in HepG2 cells.
  • the upper panel of four figures shows the distribution of the hRAR under control conditions (without prior exposure to toxic substances).
  • the lower panel shows the distribution of the hRAR under test conditions (after exposure to a toxic substance, (6.25 ⁇ M cis-platinum) for 24 hours).
  • a toxic substance (6.25 ⁇ M cis-platinum) for 24 hours.
  • the hRAR is found almost exclusively in the cell nucleus.
  • the hRAR can be detected both in the cell nucleus and in the cytoplasm. This is intended to serve as an example of a molecule that redistributes within the cell under the action of a toxic substance.
  • the minimal pattern shown here is therefore the co-localization of the hRAR with nuclear DNA labeled with propidium iodide, which varies in concentration (local distribution of the fluorescence intensity).
  • FIG. 4 shows so-called box plots of the intensity distributions of two markers from FIG. 3, marker antibodies against the human retinoic acid receptor hRAR and propidium iodide for staining DNA. The data from two experiments carried out on different days are compared. It will be between the
  • the plots each represent the frequency distributions of the respective fluorescence intensities in arbitrary units, the lines in the boxes each encompassing the medians of the distribution of all measured volume elements in the “cytoplasm” or “cell nucleus” category. The upper and lower limits of the box indicate 75% and 25% of the total distribution of the measured volume elements.
  • the quantification results in a statistically significant manner from the reduction in the cytoplasmic localization of the retinoic acid receptor in the cytoplasm caused by cis-platinum.
  • Table 1 List of protein markers used with preference. Usually, at least 5 proteins from this list are analyzed in addition to other proteins. The proteins are expressed in one or more specific cell types within a tissue or organ. Basically, all occurring proteins, peptides, DNA segments or RNAs can be used as marker candidates.
  • UDP-glucuronosyltransferase 1-2 S55985 microsomal UDP-glucuronosyltransferase 1-2 (UDPGT; UGT1.2; UGT1 B; GNT1); HLUGP4
  • NADH Y09501 idiaphorase
  • D13388 heat shock protein DNAJ-like 2 L ⁇ 5628 " [ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR / MRP), member 1

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung von reversiblen oder irreversiblen physiologischen Nebenwirkungen einer Substanz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Bereitstellen einer mit der Substanz behandelten Probe, vorzugsweise bestehend aus einer Zelle oder mehreren Zellen in einem Zellverband oder einem Organ, b) Bestimmen zellulärer und/oder subzellulärer Muster aus örtlicher Lokalisation und Co-Lokalisation und Konzentration von mindestens zwei verschiedenen Molekülen, insbesondere Proteine, RNA-Moleküle oder DNA-Segmente, in mindestens einer Subpopulation von Zellen, c) Vergleichen der im Schritt b) erhaltenen Muster mit Mustern einer unbehandelten Kontrollprobe, d) Ermitteln einer physiologischen Nebenwirkung der Substanz anhand unterschiedlicher Muster für eine behandelte Probe im Vergleich zu einer unbehandelten Probe.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Einflüssen unphysiologischer
Verbindungen, deren Derivate und Abbauprodukte auf Organismen, Organe und Zellen
Zusammenfassung:
Beschrieben wird ein Verfahren zur Bestimmung induzierter Effekte unphysiologischer Substanzen, deren Derivate oder Abbauprodukte, auf vorzugsweise nicht bekannte Wechselwirkungspartner in Form von Molekülen, Molekülkomplexen oder von subzellulären Strukturen einer Zelle, eines Zellverbandes, eines Organs oder Organismus zur Detektion der Beeinflussung eines physiologischen Zustandes einer Zelle, eines Zellverbandes, eines Organs oder Organismus, indem subzelluläre Muster bestimmt werden, die auf der Lokalisation von Molekülen und der räumlichen Korrelation von mindestens zwei Molekülen, die als Co-Lokalisation bezeichnet wird und auf der Molekülkonzentration basieren. Erfindungsgemäß relevant sind spezifisch die nicht-Target-bezogenen Wechselwirkungen im Vergleich zu Effekten, die sich durch Wechselwirkungen mit dem pharmakologisch anzugreifenden Targetmolekül, bezeichnet als Target, ergeben.
Unphysiologische Verbindungen in Form von Pharmaka,
Nahrungsmittelzusätzen, Giftstoffe, technisch verwendete Substanzen, Pflanzenschutzmittel, Insektizide, Pestizide, Kosmetika, Waschmittelingredienzien etc. müssen in ihren Wirkungen auf biologische Systeme analysiert werden. Wir bezeichnen diese Verbindungen im folgenden als Substanzen oder als Compounds. Es gilt, ihre Unbedenklichkeit für mögliche Exposition biologischer Systeme wie Mensch, Tier, Pflanze oder die mikrobielle Umwelt festzustellen. Dies gilt sowohl für die Substanzen selbst als auch für deren mögliche Abbauprodukte, Metabolite oder Derivate.
Viele dieser Substanzen werden dafür entwickelt, daß sie gezielt mit spezifischen Zielmolekülen, sogenannten Targets, in eine beabsichtigte Wechselwirkung treten, um beispielsweise eine pharmakologische oder technische Wechselwirkung zu entfalten. Für die Analyse dieser beabsichtigten Wechselwirkungen werden spezifische Tests, sogenannte Assays, eingesetzt, die diese gewünschten Wechselwirkungen, wie beispielsweise die Inhibition eines Enzyms, die Blockade oder Aktivierung eines Rezeptors, etc. anzeigen. Idealerweise zeigen solche Verbindungen unter den verwendeten Konzentrationsbedingungen keine hochaffinen Wechselwirkungen mit anderen Biomolekülen eines Organismus oder einer Zelle, so daß sogenannte unspezifische Wirkungen nicht auftreten.
Keinerlei Nebenwirkungen hervorzurufen, ist allerdings ein Idealfall, der in der Praxis untypisch ist. Vielmehr haben Substanzen mit Affinität zu einem biologischen Molekül auch mehr oder weniger ausgeprägte Affinitäten zu anderen biologischen Molekülen, insbesondere zu denen, die mit dem eigentlichen Targetmolekül strukturell oder in ihrer Oberflächenstruktur verwandt sind. In der Pharmaforschung werden daher typischerweise Familien von strukturell mit dem Target verwandten Molekülen herangezogen, um eine sogenannte Selektiyitätsprüfung durchzuführen. Dies ist insbesondere deshalb wichtig, da auch strukturell verwandte Moleküle gemeinsamen evolutiven Ursprungs sehr unterschiedliche funktionale Aufgaben innerhalb eines Organismus haben können. Als Resultat können unerwünschte Wirkungen auf den Gesamtorganismus resultieren. Derartige spezifische Assays sind typischerweise noch mit hinreichendem Aufwand zu konstruieren z.B. für die Familie der 7-Transmembran-Rezeptoren oder jeweils gegen Phosphatasen, Proteasen, Kinasen etc., da dem Assay ein gemeinsam nutzbares Bauprinzip zugrundeliegt.
Trotz all dieser Verfahren, die bereits heute in hoher Stückzahl bei frühen Prozessschritten z.B. der Pharmawirkstoffentwicklung eingesetzt werden können, sind komplexe Tiermodelle notwendig geblieben, um Langzeit-Effekte der Toxizität und sonstigen Effekte im Sinne von Nebenwirkungen auf die Physiologie eines Organismus zu studieren. Häufig verlangen die Zulassungsbehörden wie die FDA eine Exposition eines Gesamtorganismus im Sinne von Testpflanzen oder Tierexperimenten, um am Ende Einflüsse von unphysiologischen Verbindungen, deren Derivate oder Abbauprodukte auf Moleküle des Organismus zu studieren, indem makroskopisch meßbare Parameter herangezogen werden, z.B. die Lethalität bei verschiedenen angewandten Konzentrationen (LD 50), die Mutagenizität, die Teratogenizität, Wachstumshemmung, Fertilität etc.. Dazu gehören auch Langzeit-Ratten- Tests von 1 Jahr und länger, um auch scheinbar nicht-toxische, geringe Dosen von Substanzen in ihrer Langzeitauswirkung zu messen. Diese Wirkungen sind nicht mit leicht detektierbarer, akuter Toxizität verbunden oder unmittelbar lethal, aber sie führen zu Langzeitschädigungen des Gesamtorganismus mit beträchtlichen Wirkungen. Solche Experimente sind langwierig, kostspielig, ethisch problematisch, und mit ihren Resultaten nicht immer von molekular interpretierbarer Aussagekraft. Außerdem fallen derartige Ergebnisse häufig zu einem Zeitpunkt an, bei dem die Entwicklung einer neuen chemischen Substanz für einen bestimmten Verwendungszweck bereits hohe Investitionen beansprucht hat. Viele dieser nicht-Target- bezogenen Nebenwirkungen haben kurzfristig oder langfristig irreversiblen Charakter wie Induktion von Apoptose, Nekrose oder den Übergang in den Status ungehemmter Zeilproliferation. Viele Nebenwirkungen haben aber durchaus reversiblen Charakter, wenn eine Medikation beendet oder ausgesetzt wird. Insbesondere solch reversible Änderungen sind mit herkömmlichen Testsystemen schwer oder gar nicht zu erfassen.
Gerade in jüngster Zeit erregte der Fall eines Cholesterinsenkers Aufmerksamkeit. Hier führen offensichtlich erhöhte Dosen des als sicher eingestuften Arzneimittels in Kombination mit einer gleichzeitig applizierten weiteren Wirksubstanz zu letztendlich dramatischen Wirkungen auf das Muskelgewebe mit möglicher Todesfolge. Es bedarf eines Verfahrens, das es erlaubt, im Vorfeld sensitiv, zuverlässig und mit hoher Informationsdichte Einflüsse von unphysiologischen Verbindungen, deren Derivaten oder Abbauprodukten, einzeln oder in Verbindung mit anderen Substanzen auf Zellen, Gewebe und Organismen nachzuweisen.
Ein weiteres Problemfeld ist in diesem Zusammenhang in den letzten Jahren in den Mittelpunkt des Interesses gerückt, nämlich die genetische Disposition bezogen auf die Wirksamkeit eines Medikamentes auf den individuellen Organismus. Die sogenannte genetische Disposition des Individuums kann die Inzidenz und Progredienz bestimmter Erkrankungen beeinflußen (z.B. die
Neigung zum Herzinfarkt oder zu bestimmten Tumoren (Darmkrebs)), die
Ansprechbarkeit auf bestimmte Medikamente (z.B. Herceptin bei Brustkrebs oder die Gewebeabstoßung bei Implantaten) aber auch die begleitenden irreversiblen und reversiblen Nebenwirkungen von Medikamenten, die nicht
Target-bezogen sind und in den hier behandelten Bereich der ADMET-
Analysen (Administration = Art der Verabreichung/Formulierung, Distribution -
Verteilung im Organismus, Metabolism = Metabolismus der Verbindung im
Organismus (Leber etc.), Excretion = Ausscheidungscharakteristik und
Toxicology = unerwünschte toxische Nebenwirkungen) fallen.
Für den Patienten, den behandelnden Arzt, die forschende Pharmaindustrie und auch das private oder staatliche Gesundheits- und Versicherungswesen ist es außerordentlich wichtig, die individuelle genetische Konstellation bezüglich dieser Effekte zu kennen. Das bedeutet frühe und sichere Einschätzung der Wirksamkeit einer Therapie bei unterschiedlichen Genotypen und Populationen. Dazu gehört auch im Vorfeld der Forschung und Entwicklung das Wissen um die gesicherte molekulare Wirksamkeit bei unterschiedlich genotypisierten Modellsystemen mit der Konsequenz geringer Mißerfolgsraten in der Behandlung. Was für die Target-spezifische Wirkung gilt, gilt aber eben auch für den hier relevanten, nicht-Target-bezogenen Bereich der ADMET-Wirkungen.
Die sogenannte SNP-Analytik (single nucleotide polymorphism analysis) hat sich in den letzten Jahren als analytisches Hilfsmittel etabliert. Hierbei wird ausgenutzt, daß ein spezifischer Genotyp, der für Wirksamkeitsprofile oder Nebenwirkungsprofile verantwortlich ist, mit einem spezifischen Mutantenmuster auf Genomebene eines Patienten korreliert. Häufig sind es gar nicht diese Mutationen selbst, die kausal mit den zu messenden Effekten korreliert sind. Es hat sich nur gezeigt, daß bestimmte SNPs mit eben diesen Effekten eng korreliert sind, das heißt, sie co-segregieren bei der Vererbung mit dem interessierenden funktionalen Effekt. Die PCR-Methode macht es möglich, derartige SNP-Muster z.B. auf der Basis von Chips individuell zu registrieren. Ein großer Vorteil wäre es natürlich, wenn mit wirtschaftlich vertretbarem Aufwand anstelle nicht direkt korrelierter SNP-Marker, die
Target-bezogenen sowie die nicht-Target-bezogenen Effekte einer irreversiblen aber auch reversiblen Wirkung einer oder mehrerer Substanzen selbst auf den individuellen Organismus oder das genetisch individuelle
Zellsystem gemessen werden könnten. Die Bedeutung ist um so größer, wenn keine bekannten SNPs als aussagefähige Marker zur Verfügung stehen.
In jüngerer Zeit gibt es vermehrt Bestrebungen, wie bei der beschriebenen SNP-Analytik auch Tierversuche statt im Tier mit Hilfe von in vitro-Systemen zu simulieren und in bestimmten Assay-Formaten durchzuführen. Sie werden häufig als eADMET-Assays (frühe ADMET-Assays) bezeichnet, und basieren auf molekularen oder zellulären Testsystemen mit hoher Durchsatzkapazität bei vertretbarem Kostenaufwand.
Seit langer Zeit werden bereits Mutagenitätstests (Arnes Tests), das heißt der Einfluß unphysiologischer Substanzen auf die Replikation und Fehlerkorrektur der Genom-Replikation analysiert. Mutagene Substanzen werden z.B. makroskopisch über Farbänderungen von mikrobiellen Zellkolonien registriert. Toxische Effekte werden neuerdings über die Veränderung von spezifischen Proteinkonzentrationen oder Enzymaktivitäten in Gewebehomogenaten oder auch in Einzelzellen von Geweben gemessen. mRNA-Konzentrationsmuster aus Gewebeproben bzw. Zellkulturen dienen der Analyse der Wirkungen von unphysiologischen Substanzen auf der Ebene der Transkription oder der post- transkriptionalen mRNA Modifikation. Es werden insbesondere die Wirkungen von unphysiologischen Substanzen, deren Derivate und Abbauprodukte auf die Enzyme des Entgiftungssystems der Leber analysiert (z.B. P450 Isoenzyme). Ein gemeinsames Merkmal all dieser genannten Verfahren ist es, dass die Analysen eine minimale Probenmenge beanspruchen, die mindestens 10.000 bis 100.000 Einzelzellen umfaßt. Dies ist nur bei der Analyse homogener Zellkulturen ohne grundsätzlichen Nachteil. Gewebeproben beinhalten jedoch grundsätzlich unterschiedlichste Zelltypen oder Zellen unterschiedlichen Differenzierungs- oder Reifungszustand, die auf Einflüsse unphysiologischer Substanzen ganz unterschiedlich reagieren können. Die Methoden, sind aber für die Einzelzellanalyse nicht sensitiv genug.
Es ist bislang nicht möglich, experimentell alle möglichen Wechselwirkungen von unphysiologischen Verbindungen, deren Derivaten oder Abbauprodukten mit allen möglichen Proteinen zu messen, schon gar nicht, wenn man sie nicht anhand einer veränderten Funktion dieser Proteine messen kann. Es sind aber die Proteine und ihre modifizierten bzw. prozessierten Varianten, die auf molekularer Ebene für den funktionalen Status einer Zelle in einer übergeordneten Gewebestruktur verantwortlich sind. Die Erfindung bezieht sich auf die überraschende Erkenntnis, daß sich ADMET-Eigenschaften von unphysiologischen Verbindungen, deren Derivate oder Abbauprodukte sich nicht nur in veränderten meßbaren Funktionen von Proteinen wie Enzymaktivitäten oder Konzentrationen der Proteine oder der sie kodierenden Gen-Transkripte spiegeln. Vielmehr stellt die Musterbildung von verschiedenen Proteinen in Form ihrer Lokalisation und der räumlichen Korrelation mit anderen Proteinen, die wir als Co-Lokalisation bezeichnen oder ihrer Konzentration einen zuverlässigen, sensiblen Frühindikator für spätere auffällige reversible oder irreversible Effekte dar. Dazu gehören beispielsweise unter anderem AH-Antwort, Akuter Phasenstress, Antimetabolismus, anti-Apoptose und Apoptose, Antiproliferation, Aufbrauch der ATP Reserven, Autoimmunreaktionen, Cholestase, De-/Differenzierung, DNA Schaden, DNA Replikation, Entzündung, Entzündungsreaktionen, Fettleber, Fibröse, Freisetzung von Arachidonsäure, frühe Genantworten, genereller Zellstress, Glucoseentzug, Hitzeschock, Hypercholesterolemie, Hypoxie, Hypersensitivität, Immunotoxizität, Invasion, lonentransport, Lebertoxizität, Leberregeneration, Mitochondrienfunktion, Mitoseinduktion, Multidrugresistenz, Nierentoxizität, Östrogenizität, oxidativer Stress, Peroxisomenproliferation, Peroxisomenschaden, Rekombination, Ribotoxizität oder ribotoxischer Stress, Sclerose, Steatosis, Stress des endoplasmatischen Reticulums, Teratogenese, Transformation, Unterbrechung der Translation, Transport, Tumorsuppression, Unterbrechung des Zellzyklus,
Wachstumsstopp, Zerstörung der zellulären Matrix, Zelladhäsion, Zellmigration, Zeilproliferation, Zellregeneration, Zeil-Zeil Kommunikation. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Bestimmung von nicht-Target - bezogenen Wechselwirkungen und durch nicht-Target-bezogene Wechselwirkungen induzierter Effekte, wenn chemische oder biologische Substanzen, deren Derivate oder Abbauprodukte in ihren Wirkungen auf Zellen, einer Kollektion von Einzelzellen eines Zelltyps, von Zellen eines Zellverbandes oder Gewebes, von Zellen eines Organs oder eines Organismus getestet werden, um reversible oder irreversible toxische Nebenwirkungen oder neue Wirkmechanismen zu studieren. Das hier beschriebene Verfahren wird bevorzugt ex corpore, d.h. außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers angewandt. Es werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt aus dem Körper isolierte Zellen, Gewebe und Organe, sowie Zellen in der Zellkultur als Proben und Untersuchungsobjekte benutzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von reversiblen oder irreversiblen physiologischen Nebenwirkungen einer Substanz umfaßt die folgenden Schritte: (a) Bereitstellen einer mit der Substanz behandelten Probe, vorzugsweise bestehend aus einer Zelle oder mehreren Zellen in einem Zellverband oder einem Organ, (b) Bestimmen zellulärer und/oder subzellulärer Muster aus örtlicher Lokalisation und Co-Lokalisation und Konzentration von mindestens zwei verschiedenen Molekülen, insbesondere Proteine, RNA-Moleküle oder DNA-Segmente, in mindestens einer Subpopulation von Zellen, (c) Vergleichen der im Schritt (b) erhaltenen Muster mit Mustern einer unbehandelten Kontrollprobe, und (d) Ermitteln einer physiologischen Nebenwirkung der Substanz anhand unterschiedlicher Muster für eine behandelte Probe im Vergleich zu einer unbehandelten Probe.
Definition von "nicht-Target-bezogenen Wechselwirkungen": Die primären Zielstrukturen von Wirksubstanzen heißen Targets. Es sind diejenigen Moleküle, die über spezifische Grenzflächen wie aktive Zentren über molekulare Interaktionen mit der Wirksubstanz physikalisch interagieren. So werden beispielsweise Enzyme reversibel oder irreversibel gehemmt, Rezeptoren agonistisch aktiviert oder antagonistisch geblockt oder lonenkanäle in ihrer elektrophysiologischen Charakteristik verändert. Diese Interaktionen von Wirksubstanzen oder ihrer Metaboliten und ihre Targetvermittelten Folgeeffekte werden als Target-bezogene Wechselwirkungen verstanden und sind nicht Gegenstand dieser Erfindung. Anderweitige Wechselwirkungen und ihre molekularen Folgeerscheinungen mit Molekülen, Moiekülkomplexen, Zellen, oder Organen eines Organismus, die nicht auf die Wechselwirkung mit dem pharmakologischen Target zurückzuführen sind, werden im folgenden als nicht-Target-bezogene Wechselwirkungen bezeichnet und sind Gegenstand der Patentanmeldung. Sie sind maßgeblich bestimmend für die ADMET-Profile von Wirkstoffen. In der hier vorliegenden Erfindung ist die Definition von "nicht-Target-bezogenen Wechselwirkungen" gleichzusetzten mit "physiologischen Nebenwirkungen" und "unphysiologischen Wechselwirkungen".
Es sei an dieser Stelle vermerkt, daß bei der Bestimmung zellulärer und/oder subzellulärer Muster aus örtlicher Lokalisation und Co-Lokalisation und Konzentration von mindestens zwei verschiedenen Molekülen, insbesondere Proteine, RNA-Moleküle oder DNA-Segmente, die mindestens zwei verschiedenen Moleküle sowohl einer Substanzklasse (z.B. zwei verschiedene Proteine) als auch unterschiedlichen Substanzklassen (z.B. ein Protein und ein RNA-Molekül) zugeordnet werden können..
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von zeilassoziierten Lokalisations- und Co-Lokalisations- und Konzentrationsmustern von mindestens zwei verschiedenen Molekülen herangezogen werden. Hierbei wird mindestens eine Subpopulation von lebenden Zellen mit mindestens einer physiologisch wirksamen Substanz zu mindestens einem Zeitpunkt vorbehandelt. Anschließend wird eine Bestimmung besagter Muster entweder an lebenden oder fixierten Zellen durchgeführt.
Das Verfahren analysiert vorzugsweise nicht bekannte direkte oder indirekte Wechselwirkungspartner der zu analysierenden Wirkstoffe in Form von Molekülen, Molekülkomplexen oder von subzellulären Strukturen mindestens einer einzelnen Zelle, einer Kollektion Von Einzelzellen eines Zelltyps, von
Zellen eines Zellverbandes, von Zellen eines Organs oder Organismus. Als indirekte Wechselwirkungspartner bezeichnen wir die Molekülstrukturen, die über regulatorische oder molekulare Wechselwirkungen mit dem direkten
Wechselwirkungspartner in Verbindung stehen. Das Verfahren erlaubt -die
Detektion der Beeinflussung eines physiologischen Zustandes mindestens einer Zelle, einer Kollektion von Einzelzellen, von Zellen eines Zellverbandes, von Zellen eines Organs oder Organismus, indem zelluläre oder subzelluläre
Muster aus Konzentration und Lokalisation und Co-Lokalisation oder deren übergeordnete Muster von mindestens zwei Proteinen oder RNA-Molekülen oder DNA-Segmenten in mindestens einer Sub-Population von Zellen bestimmt werden. Es ist möglich, daß sich organspezifische Nebenwirkungen oder toxische Effekte nur an bestimmten Subzelitypen äußern, die mit bereits bekannten Verfahren niemals nachweisbar wären, die über eine Vielzahl von
Zellen mittein, wie die Analyse von Expressionsmustern über mRNAs, die aus mehr als einer einzigen Zelle präpariert werden. Das Verfahren kann auch charakteristische Muster identifizieren, die sich in einer kleinen Subpopulation bei einem Überschuss ansonsten nicht meßbar reagierender Zellen manifestieren. Das Verfahren ist aber erfindungsgemäß auch auf differenzierte homogene Zellpopulationen oder funktional differenzierte
Zelltypen anwendbar, wie sie nach Differenzierung aus embryonalen oder adulten Stammzellen herstellbar sind oder abgeleitet werden können. Hier können in besonders vorteilhafter Weise reversible oder irreversible
Veränderungen an erfindungsgemäß mindestens zwei Molekülen studiert werden, deren Lokalisation, Co-Lokalisation und Konzentration exemplarisch den funktionalen Status einer entsprechend differenzierten Zelle beschreiben.
Überraschenderweise sind es eben nicht nur schwankende Proteinkonzentrationen an sich, wie man es aufgrund der RNA-Muster oder Proteinmuster bereits bestehender Verfahren vermuten könnte, sondern charakteristische Verschiebungen der relativen Konstellationen von Proteinen in den Zellen, die spezifische Effekte auf Transportprozesse oder auf den Energiestoffwechsel hindeuten. Dadurch entstehen charakteristische Musterbildungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene im Sinne von lokalen Verteilungsmustern, die einen bestimmten Funktionszustand im Organ oder
Organismus abbilden können. Unterschiedliche Verteilungsmuster können sich ausbilden, ohne daß notwendigerweise absolute
Ko zentrationsveränderungen der betrachteten Molekülstrukturen bezögen auf die Gesamtzelle oder auf einen Zellverband notwendig sind oder nachweisbar wären.
Bekannt ist ein Verfahren zur Identifikation von Targets und zur Identifikation pathologischer Zustände von Zellen oder Organismen, bei dem die Lokalisation oder Co-Lokalisation oder Konzentration pathologisch veränderter Proteine mit zellulärer oder subzellulärer Auflösung identifiziert werden (W. Schubert, US Pat. 6, 150,173; T. Nattkemper, WO 01/36939). Hier werden diejenigen Proteine identifiziert, die durch einen pathologischen Prozess selektiv bezogen auf Subtyp einer Zelle, Konzentration, Lokalisation und Co-Lokalisation im Vergleich zu anderen Proteinen verändert sind. Die Konzentrationsbestimmung kann hierbei erfolgen, indem nur festgestellt wird, ob ein entsprechendes Detektionssignal oberhalb oder unterhalb eines gewählten Schwellwertes liegt. Diese Targets und ihre zugehörigen Signaltransduktiorisketten sind es, die durch Einwirkung eines Medikamentes spezifisch beeinflußt werden. Aus diesem Grund hat das Verfahren große Bedeutung bei der Diagnose pathologischer Zustände, der Identifikation von pharmakologisch angreifbaren Targets und der Analyse von Pharmaka auf eben diese Targets und Mitglieder derselben Targetfamilie. Diese beschriebenen Wechselwirkungen betrachten wir als Target-bezogene Wechselwirkungen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Anwendung des in US Pat. 6,150,173 beschriebenen Verfahrens, dessen Inhalt hiermit einbezogen wird, auf solche Moleküle, die nicht mit einem pathologischen Phänotyp oder Target assoziiert sind, sondern mit Molekülen, deren veränderte Muster in Lokalisation oder Co-Lokalisation oder Konzentration ein zuverlässiger und früher Indikator für reversible oder irreversible Langzeitwirkungen von unphysiologischen Verbindungen, . deren Derivate oder Abbauprodukte darstellt. Hierunter verstehen wir die nicht-Target-bezogenen Wechselwirkungen. Unphysiologische Verbindungen bezeichnen im Sinne der vorliegenden Erfindung synthetisch chemische oder biochemische
Verbindungen oder Biopolymere, die kein Syntheseprodukt des zu analysierenden Organismus darstellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist kostengünstig und sensitiv, lange bevor mit oben beschriebenen Methoden grobe Veränderungen makroskopisch detektierbar werden. Pathologische Zustände sind mit Targets und dem zugehörigen Targetnetzwerk assoziiert. Medikamente sollen für die Reversion dieser Veränderung sorgen oder die Reversion funktional dadurch bewirken, daß an einer oder mehreren spezifischen Stellen ein Medikament eine phänotypische Kompensation bewirkt. Im Gegensatz hierzu bezieht sich die vorliegende Erfindung gerade auf die Gruppierung von Proteinen eines Organismus in ihrer Gesamtheit oder in Teilmengen, die nicht mit dem Target- Netzwerk bzw. dem Kompensationsnetzwerk verknüpft sind, das einen pathologischen Phänotyp neutralisiert. Diese Proteine sind bezogen auf Lokalisation oder Co-Lokalisation oder Konzentration aber geeignet, Einflüsse von unphysiologischen Verbindungen, deren Derivate oder Abbauprodukte außerhalb der eigentlichen Targetwirkung anzuzeigen.
In an sich bekannter Weise werden Zellen oder Organschnitte auf eine Weise fixiert, daß alle makromolekularen Bestandteile relativ zueinander in der nativen räumlichen Konstellation zueinander erhalten bleiben. Bindemoleküle wie Antikörper, Antikörperfragmente, Peptide die direkt oder indirekt mit einem optischen Marker, vorzugsweise mindestens einem Fluoreszenzmarker gekoppelt sind, können im geeigneten Medium mit dem fixierten Substrat in Kontakt gebracht werden, so daß genügend affine Bindemoleküle an ihre fixierten Bindungspartner koppeln können. Überschüssige Bindemoleküle werden durch einen Waschprozess aus dem Substrat entfernt. Anschließend werden mit einer geeigneten Meßapparatur die optischen Marker mit hoher Ortsauflösung über ihre optische Qualität detektiert und registriert und bezüglich Lokalisation, Co-Lokalisation und Konzentration in Datenform gespeichert. Die Konzentrationsbestimmung kann hierbei erfolgen, indem nur festgestellt wird, ob ein entsprechendes Detektionssignal oberhalb oder unterhalb eines gewählten Schwellwertes für das jeweilige Meßvolumenelement liegt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird in einem Folgeschritt der optische Marker deaktiviert. Dies kann durch Strahlungseinwirkung oder durch chemische Reaktion geschehen. Diese grundsätzliche Schrittfolge kann zyklisch wiederholt werden durch Reaktion mit einem oder mehreren weiteren Bindemolekül-Typen. Bei diesem Verfahren kommt vorzugsweise immer wieder derselbe optische Marker oder Fluorophor zum Einsatz, um jegliche optische Aberration über alle Zyklen hinweg konstant zu halten.
Eine hohe Spezifität der Bindemoleküle ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zweitrangig. Es können auch mehrere Bindemolekültypen gleichzeitig oder in Gruppen eingesetzt werden. Einzig die Musterbildung aus Lokalisation, Co-Lokalisation und Konzentration ist erfindungsgemäß informativ und indiziert eine biologische Auslenkung von einem bekannten physiologischen Referenzstatus. Diese Musterbildungen dienen als Surrogatmarker für den Phänotyp einer nicht-Target bezogenen Nebenwirkung. Sie steht nicht notwendigerweise direkt in Beziehung zum nicht-Target bezogenen Wirkort. Die Analysen werden bevorzugt am gesunden Organismus, an Organen, Gewebe oder Zellen durchgeführt, wenn die Wechselwirkungen mit nicht-Target-assoziierten Molekülen gemessen werden sollen. Die Musterinterpretation- geschieht vorzugsweise im Anschluß an die mindestens eine oder die zyklischen Messungen. Algorithmen erkennen bezogen auf Volumenelemente oder Gruppen von Volumenelementen bestimmte Konstellationen von Färbungen, die für einen spezifischen Zustand wie einen irreversiblen Toxizitätseffekt oder eine reversible Wechselwirkung charakteristisch sind. Sie können im Rechner sortiert werden und in unterschiedlicher Konstellation dargeboten werden, so daß Einflüsse von Substanzen auf ein zelluläres Geschehen hervorgehoben werden. Aus der Art der bestehenden Muster kann unmittelbar auf die Natur der musterbildenden Moleküle zurückgeschlossen werden. Minimale Muster als charakteristische Muster spezifischer reversibler Nebenwirkungen oder irrversibel toxischer Wirkungen werden identifiziert und können bestimmten Zelltypen oder ihren Differenzierungsstadien oder Alter zugeordnet werden. Das Auftreten dieser Muster belegt auch die Anwesenheit des zu untersuchenden Wirkmoleküls. Damit kann die Anwesenheit, Konzentration und zeitliche Kinetik von Konzentrationsverschiebungen registriert werden. Charakteristische Muster, vorzugsweise Minimalmuster, künden beispielsweise von beginnender Dedifferenzierung, Apoptose, unterschiedlicher Zellmorphologie oder Organellmorphologie, Entzündung, Autoimmunreaktion oder dem Verlust eines spezifischen Funktionsmusters eines differenzierten Zelltyps etc.
Bei dem hier vorgestellten Verfahren werden bestimmte Moleküle in Zellen oder Zellverbänden von beispielsweise Organschnitten quantifizierend mit einer Ortsauflösung von < 20μm, vorzugsweise kleiner 10μm, vorzugsweise kleiner 2μm bestimmt. Dadurch lassen sich auf Einzelzellebene bzw. auf subzellulärem Niveau co-lokalisierte Molekülkonstellationen und Muster von co-lokalisierten Molekülkonstellationen im Sinne von Molekülmustern bestimmen. Zusätzlich lassen sich zur Musterbildung auch Entfernungskoordinaten zwischen einzelnen Meßpunkten verwenden. Damit werden Muster digitalisierbar und werden einer statistischen Auswertung auf Einzelzellebene bzw. subzellulärer Ebene zugänglich. Muster, die mit bestimmten Phänotypen korrelieren, nennen wir im folgenden CAMP (compound associated marker pattern).
Die subzellulären Muster werden identifiziert, indem durch optisch unterscheidbare Marker-markierte Antikörper oder optisch unterscheidbare Marker-markierte Bindemoleküle oder Gruppen solcher Bindemoleküle Muster generiert werden, indem einmalig durch mindestens zwei optisch unterscheidbare Antikörper oder Bindemoleküle oder im zyklischen Ablauf sequentiell die jeweils spezifischen Antikörper oder Bindemoleküle mit der fixierten Probet, enthaltend mindestens eine Zelle, Gewebe, Organ oder Organismus zur Reaktion gebracht werden. Es wird die topologische Verteilung und Intensität der optischen Signale registriert.
Dies geschieht im Falle einer zyklischen Vorgehensweise, bevor bei zyklischen Anschlußschritten nach einem Ausbleichschritt der gebundenen optischen Marker zu Beginn des Folgezyklus der nächste Antikörper oder das nächste Bindemolekül zur Reaktion gebracht wird. Hierbei können zwei oder eine Vielzahl von Zyklen durchlaufen werden.
Jeweilige CAMPs stellen sich als ein zweidimensional aufgelöstes kombinatorisches Muster der Proteinlokalisation und Co-Lokalisation dar. Es wird erfindungsgemäß von individuellen Zellen, Gewebe, Organen oder ganzen Organismen erhalten. Für eine Musterbildung werden mindestens zwei verschiedene Proteine herangezogen, vorzugsweise aber eine Anzahl wie 5, 10 oder noch mehr, sobald oder solange, bis eine stabile Musterbeschreibung erhalten wird.
Ein CAMP wird einer zellulären oder subzellulären zweidimensionalen Ortskoordinate oder in einer alternativen spezifischen Ausführungsform einer Zeitkoordinate zugeordnet und wird typischerweise mit einem Binärcode beschrieben. Jede Position des Binärcodes entspricht einem Protein . bzw. dem zugehörigen Nachweisreagenz wie einem markierten Antikörper. Für jedes dieser Proteine wird über ein Kalibrierungsverfahren ein Schwellwert definiert. Liegt der zugehörige Wert im Meßelement oberhalb des Schwellwertes, so wird für die entsprechende Position im Binärcode eine 1 zugeordnet. Liegt der zugehörige Wert im Meßelement unterhalb des Schwellwertes, so wird für die entsprechende Position im Binärcode eine 0 zugeordnet. Mit zwei Proteinen können sich somit 4 unterschiedliche Muster ergeben (1 1 , 10, 01 , 00). Mit drei Proteinen können sich entsprechend 8 unterschiedliche Muster ergeben (111 , 110, 101 , 011 , 001 , 010, 100, 000), usw.. Für die Darstellung der Muster bieten sich verschiedene Verfahren an, die in den Ausführungsbeispielen beschrieben sind.
Erfindungsgemäß wird ein charakteristisches zelluläres Molekülmuster dadurch gebildet wird, daß mindestens 2 definierte Moleküle individuell mit optischer Auflösung eines Meßvolumenelementes von der Dimension einer Zelle oder einem optisch aufgelösten Meßvolumenelement als Teilvolumenelement einer Zelle der Zahl 0 oder 1 zugeordnet werden, je nachdem ob die jeweilige Konzentration über oder unter einem zuvor bestimmten Schwellwert liegt, oder wobei mindestens ein charakteristisches subzelluläres Molekülmuster aus Molekülmustern der einzelnen subzellulären
Teilvolumenelemente einer Zelle oder eines Zelltyps gebildet wird.
-Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die örtliche Auflösung zur Bestimmung der zellulären Lokalisation und Co-Lokalisation und Konzentration in eine zeitliche Auflösung zu transformieren. Hierzu können z.B. einzelne Zellen in einem elektrischen Feldkäfig, wie in DE 197 23 873.4 (Verfahren und Vorrichtung zur Erfassung von Objektbewegungen) beschrieben, gehalten und mit bestimmter Frequenz gedreht werden. Das optische Detektionsvolumen bleibt ortsfest, aber die Zelle rotiert in der Probe, wobei die abgetasteten Volumenelemente der Zelle im Takt der Rotationsfrequenz wiederkehrend das Meßvolumen passieren. Ähnlich wird bei einem Punktscanner, wie es beispielsweise das konfokale Laserscanning-Mikroskop darstellt, die Information zunächst zeitlich sequenziell aufgenommen. In einem zweiten Schritt kann aus solchen Zeitreihen ein ortsaufgelöstes Bild rekonstruiert werden, für das beschriebene Verfahren ist dies aber nicht zwingend notwendig. Es reicht in vielen Fällen, die Zeitreihe nach dem zeitlich gemeinsamen oder jeweils einzelnen Vorkommen der mindestens zwei Proteine, DNA oder RNA oder aber deren Abwesenheit auszuwerten. Zum Beispiel kann, ohne die Methode darauf einzuschränken, das gemeinsame Vorkommen der Proteine, DNA oder RNA über Kreuzkorrelation der beiden Zeitreihen quantifiziert werden, während das einzelne Vorkommen aus Differenz der Autokorrelation und Kreuzkorrelation errechnet werden kann. Ein anderes Beispiel geeigneter mathematischer Transformationen sind Fourier- und Laplacetransformationen wie auch Wavelet-Transformationen, deren Argumente räumliche und/oder, wie vorangehend bereits beschrieben, zeitliche sein können. Insbesondere können dabei Transformationen mit variablen Argumenten für bestimmte Abstände verwendet werden. Beispielsweise gibt die Kreuzkorrelation F(x)*G(x-a) an, wie viele Proteine den Abstand a voneinander aufweisen.
Das . Verfahren ist auch geeignet, Genotyp-assoziierte Unterschiede im phänotypischen Reaktionsverhalten auf nicht-Target-bezogene Interaktionen von Wirksubstanzen oder ihrer Metabolite zu studieren. Hierzu werden Zellen,
Gewebe oder Organismen unterschiedlichen Genotyps für die erfindungsgemäße Analyse herangezogen.
In einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die subzellulären Muster durch optisch unterscheidbare Marker-markierte Antikörper oder optisch unterscheidbare Marker-markierte Bindemoleküle oder Gruppen solcher Bindemoleküle generiert, indem die jeweils mindestens zwei spezifischen Antikörper oder Bindemoleküle mit der fixierten Probe, enthaltend mindestens eine Zelle, Zellverband, Organ oder Organismus, zur Reaktion gebracht werden und die topologische Verteilung der jeweiligen Antikörper über unterscheidbare optische Signale zugeordnet wird. Solche optisch unterscheidbaren Signale werden durch unterschiedliche Excitations- wellenlängen oder Emissionswellenlängen generiert, durch unterschiedliche Energietransfereffekte (FRET), durch unterschiedliche Intensitäten, Polarisation, oder Lebensdauer der angeregten Zustände oder Kombinationen der vorgenannten unterscheidbaren Signale. In einer bevorzugten Ausführungsform der hier beschriebenen Erfindung sind die optisch unterscheidbaren Marker fluoreszierende Marker.
Anstelle der Anfärbung von Proteinen im fixierten Zustand der Zelle lassen sich erfindungsgemäß auch lebende Zellen analysieren, indem Zellen auf eine Weise nach Standardmethoden rekombinant hergestellt werden, daß mindestens zwei Proteine in situ Fluoreszenz-markiert werden, deren Lokalisation und Co-Lokalisation zur erfindungsgemäßen Auswertung herangezogen werden. GFP (green fluorescent protein) und seine Varianten oder andere fluoreszierende Domänen lassen sich N- oder C-terminal an offene Leserahmen von Domänen der interessierenden funktionalen Proteine ankoppeln. Mit automatisierten Systemen wie dem Opera (Evotec Technologies, Germany) lassen sich gleichzeitig verschiedene Parameter von fluoreszierenden Liganden an lebenden oder fixierten Zellen beobachten wie unterschiedliche Excitations- oder Emissionswellenlänge, wie unterschiedliche Fluoreszenzlebensdauer, Energietransfer (FRET) oder Fluoreszenzintensität. Auf diese Weise lassen sich auch in situ an lebenden Zellen unterschiedlich markierte Proteintypen unterschiedlichen
Lokalisationen und Co-Lokalisationen zuordnen. Mindestens zwei dieser
Proteintypen können dabei als Surrogatmarker fungieren.
Wirkung, Nebenwirkung oder Toxizität von Wirksubstanzen lassen sich erfindungsgemäß auch über morphologische Muster identifizieren, wenn Zellen oder auch Zellorganellen innerhalb oder außerhalb ihres Gewebeverbandes ihre Form verändern. Daraus ergeben sich unterschiedliche, charakteristische Verteilungsmuster bzw. Abstandsmuster, die erfindungsgemäß identifiziert werden können.
Als bevorzugt eingesetzte Proteinmarker werden unter anderem Proteine gewählt, die zu der Gruppe von Proteinen gehören, die in der Tabelle 1 gelistet sind. Meist werden neben anderen Proteine mindestens 5 Proteine aus dieser Liste analysiert. Die Proteine werden in einem oder mehreren spezifischen Zelltypen innerhalb eines Gewebes oder Organs exprimiert. Grundsätzlich kommen alle vorkommenden Proteine, Peptide, DNA-Segmente oder RNAs als Markerkandidaten infrage.
Die Analysen können an Zellkulturen oder Gewebekulturen, an Organkulturen, ex vivo-Organen oder ganzen Organismen durchgeführt werden. Anstelle der Analyse toxikologischer Endpunkte, lassen sich initiierte ADMEtox Wirkungen analysieren bzw. reversible Wirkungen, deren fatale Folgen ansonsten im übergeordneten Organismus noch nicht manifest werden. Auf diese Weise werden Zeit und Kosten gespart. Es kann frühzeitig verhindert werden, weitere Entwicklungskosten in neue chemische Verbindungen zu investieren, die langfristig an Toxizitätsproblemen scheitern würden. Es lassen sich natürlich frühzeitig aus größeren Hit-Kollektiven auch solche Strukturen identifizieren, die bei gewünschter Wirkung bestimmte Tox-Profile nicht aufweisen und somit geeignete Kandidaten für die medizinisch chemische Optimierung darstellen.
Bei Tierexperimenten oder auch humanpathologischen Proben werden als Gewebe oder Organe meist Leber, Niere, Lunge, Herz, Bauchspeicheldrüse, Muskeln, Gehirn, Hoden, Eierstöcke, Milz, Magen, Dünndarm, Dickdarm,
Rektum, Augen und Knochen analysiert. In der Zukunft werden aber vermehrt differenzierte Stammzellen als gut reproduzierbare biologische Testsysteme zum Einsatz kommen.
Innerhalb von Organen sind toxische Effekte nicht notwendigerweise gleich verteilt, bzw. Konzentrationen des jeweiligen Wirkstoffes oder seiner Stoffwechselprodukte zeigen differierende Konzentrationen und zeitliche Verläufe nach Applikation (Pharmacokinetik und Pharmacodynamik)So können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in der Leber Kupferzellen, Sinusoidalzellen, Itozellen, Hepatocyten, Gallenblasenepithelzellen, Endothelzellen der hepatischen Venole und sinusoidale Endothelzellen bezüglich toxischer Effekte differenziert werden. Hierzu werden zusätzlich zu Indikatorproteinen für die toxischen Effekte Markerproteine für die Analyse herangezogen, die als Indikator für den zugehörigen Zellsubtyp dienen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt, daß sich toxische Effekte von Substanzen auf Organe zunächst selektiv auf bestimmte Zeilsubtypen in einem betroffenen Organ konzentrieren und hier erfindungsgemäß selektiv nachgewiesen werden können. Hier besteht der entscheidende Unterschied zu Verfahren, bei denen auf mRNA-Ebene (Transkriptom) oder Protein-Ebene (Proteom) Analysen der Quantität bestimmter RNAs oder Proteinen auf der Basis eines Gemisches aus einer Vielzahl von Zellen aus einem Organ oder Gewebe erfolgen. Bei diesen Verfahren geht man immer von mehreren Zellen aus, meist von 10.000 bis 100.000. Hierin befinden sich fast immer Zellen unterschiedlichen Subtyps (differenziert/dedifferenziert, Muskelzellen, Endothelzellen, Blutzellen und mehr). Die erfindungsgemäße Methode identifiziert charakteristische Toxizitätsmuster über statistische Messungen an Einzelzellen, bzw. Unterkompartimenten von Einzelzellen. Dies erklärt die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Methode gegenüber nicht-Einzelzell- basierten Verfahren.
Im Vergleich zu bestehenden Verfahren auf Gen-, Gen-Transkriptions- und Proteinebene läßt sich folgendes feststellen. Bisher beschriebene Verfahren können in Gewebeproben oder Zellkulturen individuelle Gene, Gen- Transkripte, prozessierte Gentranskripte und Proteine quantitativ erfassen und Gruppen charakteristischer individueller Gene, Gen-Transkripte, prpzessierter Gentranskripte und Proteine identifizieren. Dies ist auch eine Art Musterbildung, aber sie basiert auf Gemischen von einer Vielzahl von Zellen, die, wenn sie aus einem Organismus oder einem Organ gewonnen werden, immer eine Mischung unterschiedlicher Zelltypen oder physiologischer Zustände wie „in Zellteilung befindlich" oder „ruhend" darstellen. Solche Zellen können aber in ganz unterschiedlicher Weise auf Substanzen reagieren. So sind in einem Tumorgewebe meistens auch nur bestimmte Zellen degeneriert. Bei bereits bekannten Verfahren wird vorgeschlagen, in einer aufwendigen Prozedur aus Gewebe oder Organproben Einzelzellen zu entnehmen, in Kultur aufzunehmen, um anschließend genügend Material einer spezifischen Zellinie zu generieren und dann ein .zellspezifisches Proteinmuster zu generieren. Mit diesem Verfahren soll dem bei anderen Verfahren zugrundeliegenden Problem der zellulären Inhomogenität von Gewebeproben begegnet werden, die bei dem hier vorliegenden Verfahren keine Rolle spielen. Bei der vorliegenden Erfindungsmeldung wird auf die Analyse von Einzelzellen in Geweben abgehoben, die es erlauben, nebeneinander unterschiedliche CAMPs zu identifizieren.
Mit Verfahren, deren Signale über eine Mehrzahl von Zellen gemittelt werden, könnten derartige Signale leicht verdeckt werden bzw. im Rauschen untergehen. Zudem sind natürlich Muster von RNAs bekannterweise kein zuverlässiger Marker für die Existenz des zugehörigen Proteins in der einzelnen Zelle, geschweige einer korrekten Protein-Prozessierung, Lokalisation oder korrekten Co-Lokalisation im Verbund funktional interagierender Proteine.
Der Quantifizierbarkeit und Digitalisierbarkeit wird für die toxikologische und pharmakokinetische Beurteilung von Wirkungen unphysiologischer Substanzen große Bedeutung beigemessen. Die Erfahrung hat gezeigt, daß sich bei der subjektiven Beurteilung pathologischer Präparate wie Zellen oder Geweben häufig sehr unterschiedliche Resultate hervorgehen, abhängig vom
Erfahrungshorizont der beteiligten Fachleute und ihrer jeweiligen
Priorisierung.
Viele, nicht-Target-bezogene Phänotypen sind beschrieben worden. Sie stehen nicht alle gleichberechtigt nebeneinander. Vielmehr treten sie oft in Gruppen gemeinsam auf oder sind zeitlich hierarchisch geordnet, häufig im gemeinsamen Endpunkt Apoptose oder Nekrose einmündend. Sie betreffen molekulare Ereignisse, eine Einzelzelle, ein Gewebeareal oder Gewebetypus, oder den gesamten Organismus. Spezifische Phänotypen sind beschrieben als AH-Antwort, Akuter Phasenstress, Antimetabolismus, anti-Apoptose und Apoptose, Antiproliferation, Aufbrauch der ATP Reserven, Autoimmunreaktionen, Cholestase, De-/Differenzierung, DNA Schaden, DNA Replikation, Entzündung, Entzündungsreaktionen, Fettleber, Fibröse, Freisetzung von Arachidonsäure, frühe Genantworten, genereller Zellstress, Glucoseentzug, Hitzeschock, Hypercholesterolemie, Hypoxie,
Hypersensitivität, Immunotoxizität, Invasion, lonentransport, Lebertoxizität, Leberregeneration, Mitochondrienfunktion, Mitoseinduktion, Multidrug- resistenz, Nierentoxizität, Östrogenizität, oxidativer Stress,
Peroxisomenproliferation, Peroxisomenschaden, Rekombination, Ribotoxizität oder ribotoxischer Stress, Sclerose, Steatosis, Stress des endoplasmatischen Reticulums, Teratogenese, Transformation, Unterbrechung der Translation, Transport, Tumorsuppression, Unterbrechung des Zellzyklus,
Wachstumsstopp, Zerstörung der zellulären Matrix, Zelladhäsion, Zellmigration, Zellproliferation, Zellregeneration, Zeil-Zeil Kommunikation. .
Von besonderem Anwendungsinteresse sind Musteridentifikationen, die mit einem Phänotyp als Folgeerscheinung einer Verabreichung einer toxisch wirkenden Substanz assoziiert sind, bei der eine Schädigung auf dem Niveau von Proteinen, Proteinkomplexen, Nukleinsäuren, Organellen, Gewebe, Organen oder Systemen eines Individuums erfolgt. Dies ist für die Aufschlüsselung der Wirkprofile und Nebenwirkungsprofile neuer pharmakologischer Wirkstoffkandidaten von besonderem Interesse. Für eine Reihe bekannter Marker-Substanzen sind spezifische Tox-Effekte beschrieben: AH-Antwort, Akuter Phasenstress, Antimetabolismus, anti-
Apoptose und Apoptose, Antiproliferation, Aufbrauch der ATP Reserven,
Autoimmunreaktionen, Cholestase, De-/Differenzierung, DNA Schaden, DNA
Replikation, Entzündung, Entzündungsreaktionen, Fettleber, Fibröse,
Freisetzung von Arachidonsäure, frühe Genantworten, genereller Zellstress,
Glucoseentzug, Hitzeschock, Hypercholesterolemie, Hypoxie,
Hypersensitivität, Immunotoxizität, Invasion, lonentransport, Lebertoxizität,
Leberregeneration, Mitochondrienfunktion, Mitoseinduktion, Multidrug- resistenz, Nierentoxizität, Östrogenizität, oxidativer Stress,
Peroxisomenproliferation, Peroxisomenschaden, Rekombination, Ribotoxizität oder ribotoxischer Stress, Sclerose, Steatosis, Stress des endoplasmatischen
Reticulums, Teratogenese, Transformation, Unterbrechung der Translation,
Transport, Tumorsuppression, Unterbrechung des Zellzyklus,
Wachstumsstopp, Zerstörung der zellulären Matrix, Zelladhäsion,
Zellmigration, Zellproliferation, Zellregeneration, Zeil-Zeil Kommunikation.
Diese Marker-Substanzen dienen bei Anwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens dazu, identifizierte CAMPs Toxizitätsmustern zuzuordnen.
Derartige Toxizitätsmuster können somit ganz bestimmten Toxizitätssubtypen zugeordnet werden. Auf diese Weise können neue Muster mit den so zuvor festgelegten Mustern verglichen werden. Dadurch lassen sich unbekannte
Substanzwirkungen bereits bekannten Toxizitätssubtypen zuordnen. Wenn für bestimmte Tox-Phänotypen wie beispielsweise Hypersensitivität Wildtyp und
Mutante als testbare Zellen oder Gewebe zur Verfügung stehen, können die als charakteristisch identifizierten Muster weiter abgesichert werden.
Das Verfahren erlaubt die Identifikation und Festlegung derart charakteristischer Proteinmuster auf Einzelzellebene oder subzellulärer Proteinmuster (CAMP) als charakteristische Surrogatmarker für definierte Phänotypen als Reaktion auf eine Interaktion mit mindestens einer chemischen oder biologischen Substanz, deren Derivate oder Abbauprodukte. Es werden CAMPs identifiziert, indem Vergleiche von Mustern durchgeführt werden, die mit einem spezifischen individuellen Phänotyp korrelieren. Hierbei gleichen sich bei unterschiedlichen Individuen diese Phänotypen und lassen sich spezifisch von entsprechenden Mustern abgrenzen, die man von analogen Geweben aus Individuen erhält, die den entsprechenden Phänotyp nicht aufweisen oder die nicht mit der mindestens einen chemischen oder biologischen Substanz in Kontakt gebracht werden.
Wenn für bestimmte Tox-Phänotypen wie beispielsweise Hypersensitivität sowohl Wildtyp als auch Mutante als testbare Zellen oder Gewebe zur Verfügung stehen, können die als charakteristisch identifizierten Muster weiter abgesichert werden. Nicht nur Veränderungen von zellulären oder subzellulären Proteinmustern gegenüber einem definierten Wildtyp oder Normalzustand sind ein Indikativ für Wechselwirkungen einer Substanz mit Zellen oder Geweben. Es lassen sich auch spezifische Muster (CAMPs) für bestimmte Phänotypen im Sinne einer spezifischen Reaktion einer Zelle auf die Interaktion mit einer Substanz identifizieren.
Das Verfahren läßt, sich auch einsetzen, um Aussagen über Aufnahmegeschwindigkeit, Verteilung im Organismus, Metabolismus und Ausschleusung von unphysiologischen Verbindungen, deren Derivate oder Abbauprodukte zu machen. Veränderungen im Muster von nicht-Target- bezogenen Proteinen indizieren Anwesenheit und Konzentration dieser Verbindungen zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Applikation. Nicht die Verbindungen selbst, wie sonst bei Verabreichung radioaktiver Analoga, sondern ihre nicht-targetbezogenen Wirkungen sind erfindungsgemäß Gegenstand der Analytik.
Es lassen sich darüber hinaus auch Aussagen zur Bioverfügbarkeit von applizierten Substanzen in Geweben erheben. Unphysiologische Verbindungen, deren Derivate oder Abbauprodukte verteilen sich niemals homogen über einen Organismus. Sie können mitunter die Blut-Hirnschranke nicht überwinden, sie überstehen die Leberpassage nicht, sie bleiben an bestimmten Proteinen wie Transportproteinen langfristig gebunden, sie reichern sich in bestimmten Organen oder Organellen an, sie verhalten sich unterschiedlich im unterschiedlichen genetischen Kontext der Individuen. Handelt es sich bei den zu untersuchenden Molekülen nicht um kleine synthetische Moleküle, sondern um Moleküle wie monoklonale Antikörper, Pharmaproteine oder Nukleinsäuren oder ihre Derivate lassen sich an diesen Molekülen Fluoreszenzmarker ankoppeln, die das physiologische Verhalten nicht maßgeblich beeinflussen. Diese Moleküle lassen sich direkt in ihrem Weg und in der jeweiligen Konzentrationsverteilung mit zellulärer oder subzellulärer Auflösung quantifizierend verfolgen und mit der Kinetik sich einstellender Nebenwirkungen oder toxischer Effekte verknüpfen.
Mitunter lassen sich unerwünschte physiologische Effekte erfindungsgemäß nur an Subpopulationen von Zellen eines Gewebes, Organs oder Organismus aufdecken. Hierbei kann es sich um unterschiedlich differenzierte Zelltypen oder einzelne Zellen eines ansonsten einheitlichen Zelltyps handeln.
Neben der Erfassung der Toxizitätswirkungs- oder Nebenwirkungsspezifischen Muster werden bevorzugt auch Indikatoren zur Erfassung des zellulären Subtyps des ortsaufgelösten Meßvolumenelementes erfaßt. So können spezifische Nebenwirkungen auch mit spezifischen Zelltypen assoziiert werden oder auch einem spezifischen Differenzierungsstatus eines Zelltyps, in einer bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung von differenzierten Stammzellen. Es lassen sich so auch neue Wirkmechanismen identifizieren, die auch bislang unbekannte positive pharmakologische Effekte an sich bereits bekannter Wirkstoffe anzeigen können. Nebenwirkungen können auch Indikatoren für alternative Wirkprofile und neue Wirkungsmechanismen an sich bekannter Wirkstoffe bedeuten. Auf diese Weise lassen sich somit auch neue Targets detektieren, wenn sich pharmakologisch interessante Nebenwirkungen ergeben.
Die Methode identifiziert typischerweise auch solche Ereignisse in einem komplexen Substrat wie einem Organschnitt, bei dem die Konstellation unterschiedlicher Zelltypen untereinander variiert, z.B. indem Zellen im Verband rearrangiert werden, z.B. die chemotaktische Attraktion von Astrozyten im Gehirn und ihre Aktivierung oder Einflüsse auf das Muster der unterschiedlichen Mobilisierungsstadien, Differenzierungsstadien oder Umwandlungen von Differenzierungsstadien, die von nicht-physiologischen
Substanzen induziert werden.
Viele Nebenwirkungen sind abhängig vom getesteten Individuum bzw. seines sogenannten Genotyps. Deshalb ist es wichtig, über ein Verfahren zu verfügen, das es erlaubt, zu Beginn der pharmazeutischen Wirkstoffoptimierung zu testen, ob bei Kollektiven unterschiedlicher Genotypen und spezifischer Populationen unterschiedlicher ethnischer Zugehörigkeit gleiche oder unterschiedliche Muster von Nebenwirkungen oder Toxizitätseffekte in Zellen, Geweben oder Organen identifiziert werden können. Gesucht sind nebenwirkungsarme Wirksubstanzen für eine Mehrzahl oder gar alle Genotypen einer Spezies.
Aus diesem Grunde löst die vorliegende Erfindung auch wichtige Fragestellungen in Bezug auf Wirkungen von unphysiologischen Verbindungen, deren Derivate oder Abbauprodukte bei unterschiedlichen Individuen, die sich letztlich auf differierende genetische Konstellationen zurückführen lassen. Anstatt diese Wirkungen indirekt mit Gen- Mutantenmustern (SNPs; Single nucleotide polymorphisms) zu korrelieren, lassen sich die nicht-Target-bezogenen Wirkungen direkt über die Funktionen auf Proteinebene analysieren. Selbst wenn es damit nicht möglich ist, prospektiv aufgrund eines genetischen Fingerprints die Populationen zu ermitteln, die nicht mit der getesteten unphysiologischen Verbindung, deren Derivaten' oder Abbauprodukten in Berührung kommen sollten, so läßt sich doch bei der chemischen Entwicklung der Substanzen ermitteln, ob überhaupt und in welchem Maßstab Teilpopulationen ungünstig oder unterschiedlich auf die Verbindungen reagieren.
Interessant sind insbesondere auch toxische Phänotypen, die mit einer spezifischen ethnischen Gruppe, Geschlecht oder Altersgruppe assoziiert sind.
Nicht alle Organismen oder Individuen reagieren mit derselben Empfindlichkeit auf den Kontakt mit neuen Substanzen. Auf die genotypischen Unterschiede und die Bedeutung im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde bereits hingewiesen. Es gibt aber auch klassifizierte Mutanten oder bestimmte Genotypen, die für ihre generelle
Empfindlichkeit gegenüber neuen Substanzen bekannt sind und die man als hypersensitive Mutanten bezeichnen kann. Patienten mit entsprechendem
Profil oder Prädisposition neigen zur allgemeinen starken Überreaktionen gegenüber neuen Substanzen. Sie reagieren hypersensitiv. Entsprechende
Mutanten gibt es als Testorganismen oder Testgewebe. Erfindungsgemäß lassen sich derartige Hypersensitivitäts-Testorganismen im Vergleich zu
Normal-Organismen einsetzen, um charakteristische Vergleichsmuster zu generieren.
Das Verfahren erlaubt es auch, über zeitlich variierende Musterbildungen physiologische Kompensationsmechanismen anzuzeigen sowie eine sich über Zeit aufbauende biologische Substanzaktivität bezüglich Wirkung, Nebenwirkung oder Toxizität zu detektieren
Besondere Bedeutung hat das Verfahren auch für die Analyse synergistischer Nebenwirkungen verschiedener Wirkstoffe. Wirkung, Nebenwirkung oder Toxizität von Wirksubstanzen lassen sich konzentrationsabhängig in Gegenwart mindestens einer weiteren Wirksubstanz messen.
Reversible Nebenwirkungen lassen sich von irreversiblen toxischen Effekten organspezifisch oder zellspezifisch quantifizierend oder digitalisierend differenzieren, indem der zeitliche Verlauf oder eine Reversion charakteristischer Nebenwirkungsmuster nach Absetzen der Einwirkung chemischer oder biologischer Wirksubstanzen gemessen wird. Die dabei erzielten Ergebnisse basieren auf statistischen Resultaten, die auf Einzelzellebene erhalten werden.
Neben den verabreichten Verbindungen sind für toxikologische Untersuchungen auch deren Stoffwechselprodukte von Bedeutung, die jeweils für sich oder als Gruppe von Substanzen spezifische Toxizitätsprofile aufweisen könnten. Dies läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verbinden, indem die Ausgangsverbindung mit Enzymen oder
Enzymgemischen der P450-Enzyme vorinkubiert werden, oder mit der sogenannten S9 Fraktion von Leberextrakten oder mit einer Mikrosomen-
Fraktion vorinkubiert werden.
Die Gewebe und Zellen von Organen des Verdauungstraktes sind naturgemäß als erste und in vergleichsweise maximaler Konzentration mit einem Wirkstoff oder Wirkstoffgemisch konfrontiert. Gewebe oder Zellen des Verdauungstraktes, insbesondere die Leber, Bauchspeicheldrüse, Magen, Dünndarm, Dickdarm, Gallenblase, Niere oder Blase sind demnach von besonderem Interesse für die präklinische und klinische Forschung. Ähnliches gilt für die Leber als dem Organ, in dem sich viele pharmakologische, insbesondere amphiphile Substanzen aufkonzentrieren und durch die P450 iso-Enzyme metabolisiert werden. Deshalb ergeben sich häufig in der Leber durch Pharmaka und deren Abbauprodukte toxische Effekte, insbesondere bezüglich Fettstoffwechsel, Fettleber, Cholestase, Gelbsucht, Hepatitis, Steatose, Nekrose, Hyperplasie, Mutagenese, Tumorbildung oder Peroxisomproliferation innerhalb der Hepatozyten. Hier werden insbesondere die Proteine zur Musterbildung herangezogen, die mit Tumorbildung, Teratogenese, Immunsuppression, Pankreatitis oder Agranulozytose assoziiert sind. Aber auch die Morphologie einer beeinflußten Zelle selbst kann erfindungsgemäß zu charakteristischen CAMPs führen.
Die Niere als häufiges Ausscheidungsorgan ist ein weiteres Gewebe, das insbesondere mit Metaboliten von Wirksubstanzen konfrontiert ist, denen gelegentlich ebenfalls eine toxische Wirkung zukommen kann. Hier werden bevorzugt Proteine in die Evaluation mit einbezogen, die mit Nekrose, Glomerulitis, Nephritis, Tumorbildung, Hyperplasie, Proteinurie, Nierenschaden oder Nierenversagen assoziiert sind. Aber auch andere Organe reagieren häufig mit spezifischen Nebenwirkungsreaktionen. Dazu gehören Muskelgewebe, Herz, Blut, Haut, Augen und Nervengewebe. Entsprechend werden hier Proteine bevorzugt, deren Assoziation mit Myotoxizität, Cardiotoxizität, Bluttoxizität, Hauttoxizität, Augentoxizität oder Neurotoxizität bereits grundsätzlich beschrieben sind. Zu den beschriebenen Phänotypen gehören Muskeldystrophien, Tachycardie, Arrhythmie,
Hypotension, Hypertension, Leukämie, Neutropenie, Agranulozytose, reripherer Neuropathie, Demenz, Entzündung, Irritation, Sensitisierung,
Myelosuppression oder Retinopathie.
Weitere Proteinmarker beziehen sich auf Proteine, die mit Apoptose, Zelladhäsion, Autophagozytose, Zellzyklusstillstand, Zyrkadischem Rhythmus, Zytokinsezernierung, De-differenzierung, Differenzierung, Schädigung der Mitochondrien, Migration, Mutation, Oncose, Peroxisomproliferation, Rekombination, Seneszenz, Signalrefraktivität, Ausbreitung oder Transformation assoziiert sind.
Mit dem hier beschriebenen Verfahren hat sich überraschend gezeigt, daß mit dem Vorteil der Signalauflösung auf Einzelzellebene toxische und pharmakokinetische Effekte einzelnen Zellen und sogar einzelnen Zellkompartimenten zugeordnet werden können. Nicht nur pathologische Zustände können sich über veränderte Verteilungsmuster von Proteinen in einzelnen Zellen äußern, sondern es können sich auch pharmakokinetische Effekte ebenfalls über Veränderungen im subzellulären Verteilungsmuster äußern.
Überraschend ist die Tatsache, daß die Muster charakteristisch sind und frühzeitige Marker einer physiologischen Veränderung darstellen, nicht die relativen zellulären Konzentrationen von Proteinen selbst.
Ein wesentlicher Aspekt bei der Beurteilung von nicht-Target-bezogenen Interaktionen von Substanzen ist die reversible und irreversible Interaktion mit dem spezifisch funktionalen Leistungsprofil spezifisch differenzierter Zellen. Es hat sich in der Vergangenheit immer wieder herausgestellt, daß es eben diese funktionalen Eigenschaftsprofile sind, die durch inakzeptable Nebenwirkungen gestört werden. Beispiele sind Einflüsse auf die kontraktilen Elemente von Muskelzellen oder die Veränderung von Reizleitungsprofilen bei Herzmuskelzellen, die zu einer verlängerten QT-Phase führen. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, Surrogat-Marker zu identifizieren, die eine weitgehend unbeeinflußte Funktionalität anzeigen bzw. ihre reversible oder irreversible toxische Beeinflussung ohne notwendigerweise mit den mechanistischen Ursachen verknüpft zu sein. Sind derartige Surrogat-Marker einmal identifiziert, ist es für ein breit angelegtes Screening von großen Zahlen von chemischen oder biologischen Substanzen nicht unbedingt notwendig, eine Vielzahl zusätzlicher Marker in iterativen Prozessen zu bestimmen. Im erfindungsgemäßen Grenzfall reicht ein Zyklus aus, um aus einer charakteristisch veränderten Co-Lokalisation von nur zwei Surrogatmarkern auf eine veränderte Funktionalität eines Zelltyps zu schließen. Dabei kann die Färbung der zugehörigen Proteine auch dadurch erfolgen, daß die Proteine in situ einen optisch nachweisbaren Marker tragen.
Die Fig. 1 ) zeigt subzelluläre Verteilungsmuster einzelner Molekültypen (Proteine und DNA Moleküle). Die hier dargestellten Bilder wurden durch das sequentiell wiederholte Anfärben einer Zellkultur von HepG2-Zellen nach chemischer Fixierung mit fluoreszierenden Binde- bzw. Markermolekülen (im einzelnen cfos, p53, GSTalpha, Keratin, hsp 70, p170, hrar, Cytochrom C, Caspase 3, nf/cappab, mito, wga, Propidiumiodid (und Phasen- kontrastaufnahme), Aufnehmen einzelner Fluoreszenzbilder und anschließendem Bleichen generiert. Im wesentlichen wurde das bereits bekannte Verfahren (US Pat 6.150.173 und WO 01/36939) eingesetzt. In einigen Bildern wurden durch das Anfärben einzelne subzelluläre Kompartimente spezifisch markiert. Beispiele hierfür sind der Zellkern durch Propidiumiodid (prop), Mitochondrien durch den Antikörper MitochondriaAB2 (mito) und Teile des ER und Golgi Netzwerkes durch ein Lectin (wga, wheat germ agglutinin). Des weiteren lässt sich der zytoplasmatische Bereich durch Addition einiger zytoplasmatischer Anfärbungen und Subtraktion der Kernfärbung rechnerisch definieren (siehe Fig. 2). Wenn dieses Verfahren mit mehreren Zellkulturen oder Gewebeschnitten sowohl unter Kontroll- als auch unter Testbedingungen eingesetzt wird, lässt sich die anteilmässige Verteilung einzelner Molekültypen in den unterschiedlichen subzellulären Bereichen statistisch quantifizierend bestimmen (siehe Fig. 4). Basierend auf dem in Fig. 1 beschriebenen Verfahren wurden in Fig. 2 zwei unterschiedliche subzelluläre Bereiche einzeln aufgelöster Zellen definiert. Dargestellt in schwarz ist der Zellkern, der durch die Propidiumiodid-Färbung markiert wurde. Der zytoplasmatische Bereich ist grau dargestellt.
In Fig. 3 ist die Verteilung des menschlichen Retinsäure-Rezeptors (hRAR) in HepG2 Zellen dargestellt. Das obere Panel von vier Figuren zeigt die Verteilung des hRAR unter Kontrollbedingungen (ohne vorherige Exposition toxischer Substanzen). In dem unteren Panel ist die Verteilung des hRAR unter Testbedingungen (nach Exposition einer toxischen Substanz, (6,25 μM cis-Platin) für 24 Stunden) dargestellt. In der Testsituation findet man den hRAR so gut wie ausschließlich im Zellkern. Unter Kontrollbedingungen läßt sich der hRAR sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma detektieren. Dies soll als Beispiel für ein Molekül dienen, das sich unter der Einwirkung einer toxischen Substanz innerhalb der Zelle neu verteilt. Das hier dargestellte Minimalmuster ist also die in der Konzentration (lokale Verteilung der Fluoreszenzintensität) variierende Co-Lokalisation des hRAR mit durch Propidumiodid markierter nuklearer DNA.
Die Fig. 4 zeigt sogenannte Box-Plots der Intensitätsverteilungen von zwei Markern der Fig. 3, Marker-Antikörper gegen den humanen Retinsäure- Rezeptor hRAR und Propidiumjodid zur Anfärbung von DNA. Es werden die Daten von jeweils zwei an unterschiedlichen Tagen durchgeführten Experimenten gegenübergestellt. Es wird zwischen den
Intensitätsverteilungen der örtlich aufgelösten Volumenelemente im Bereich der errechneten Zytoplasma-Bereiche (siehe Fig. 3, rechte TeilFig.en (grau definierte Bereiche)) der vermessenen Hepatozyten unterschieden im Vergleich zu den Intensitätsverteilungen der örtlich aufgelösten Volumenelemente in den Bereichen der Zellkerne (schwarz). Die Plots stellen jeweils die Häufigkeitsverteilungen der jeweiligen Fluoreszenzintensitäten in arbiträren Einheiten dar, wobei die Linien in den Boxen jeweils die Mediane der Verteilung aller ausgemessenen Volumenelemente der Kategorie „Zytoplasma" bzw. „Zellkern" umfaßt. Ober- und Untergrenze der Box kennzeichnen jeweils 75% bzw. 25% der Gesamtverteilung der ausgemessenen Volumenelemente. Die einge-zeichneten kurzen Querbalken markieren Einzelereignisse für einen optischen Eindruck der Intensitätsverteilungen fernab vom Mediän. Aus der quantifizierenden Auswertung ergibt sich in statistisch signifikanter Weise die durch cis-Platin verursachte Verringerung der zytoplasmatischen Lokalisation des Retinsäure- Rezeptors im Zytoplasma.
Tabelle 1 : Liste von bevorzugt eingesetzten Proteinmarker. Meist werden neben anderen Proteine mindestens 5 Proteine aus dieser Liste analysiert. Die Proteine werden in einem oder mehreren spezifischen Zelltypen innerhalb eines Gewebes oder Organs exprimiert. Grundsätzlich kommen alle vorkommenden Proteine, Peptide, DNA-Segmente oder RNAs als Markerkandidaten infrage.
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Figure imgf000036_0001
K03191 cytochrome P450, subfamily I (aromatic compound-inducible), polypeptide 1
L07765 jcarboxylesterase 1 (monocyte/macrophage serine esterase 1)
L48516 paraoxonase 3
M 12792 cytochrome P450, subfamily XXIA (steroid 21-hydroxylase, congenital« j adrenal hyperplasia), polypeptide 2 '
JM20403 cytochrome P450, subfamily HD (debrisoquine, sparteine, etc., 'metabolizing), polypeptide 6 äM57899 'UDP glycosyltransferase 1 family, polypeptide A1
JM57951 |UDP glycosyltransferase 2 family, polypeptide B
M69177 smonoamine oxidäse B
M84127 UDP glycosyltransferase 1 family, polypeptide A3
S55985 microsomal UDP-glucuronosyltransferase 1-2 (UDPGT; UGT1.2; UGT1 B; GNT1); HLUGP4
S62904 «thiopurine S-methyltransferase
;U12778 jacyl-Coenzyme A dehydrogenase, short/branched chain SX55764" icytochrome P450, subfamily XIB (steroid 11-beta-hydroxylase), polypeptide 1
X71480 icytochrome P450 IVA1 1 (CYP4A1 1)
Y09501 idiaphorase (NADH) (cytochrome b-5 reductase) 'D869567 heat shock 105kD
J02947 Superoxide dismutase 3, extracellular
D13388 heat shock proteiη, DNAJ-like 2 LÖ5628" [ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 1
(L12723 ;heat shock 70kD protein 4
L15189 heat shock 70kD protein 9B (mortalin-2)
M86752 stress-induced-phosphoprotein 1 (Hsp70/Hsp90-organizing protein)
S45630 crystallin, alpha B
S67070 heat shock 27kD protein 2 ÖÖ5569 crystallin, alpha A
U08021 nicotinamide N-methyltransferase
U09031 sulfotransferase family, cytosolic, 1A, phenol-preferring, member 1
D16581 nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)-type motif 1 U65785 oxygen regulated protein (150kD)
X04076 catalase
X07834 Superoxide dismutase 2, mitochondrial X 15187 tumor rejection antigen (gp96) 1
X52882 |t-complex 1
L37080 jflavin containing monooxygenase 5
M23234 [ÄTP-bTnding cassette, sub-family B~ (MDR/TAP), member 4
U40992 |DnaJ-like heat shock protein 40
M26880 "ubiquitin C

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung von reversiblen oder irreversiblen physiologischen Nebenwirkungen einer Substanz, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
a) Bereitstellen einer mit der Substanz behandelten Probe, vorzugsweise bestehend aus einer Zelle oder mehreren Zellen in einem Zellverband oder einem Organ, b) Bestimmen zellulärer und/oder subzellulärer Muster aus örtlicher Lokalisation und Co-Lokalisation und Konzentration von mindestens zwei verschiedenen Molekülen, insbesondere Proteine, RNA-Moleküle oder DNA-Segmente, in mindestens einer Subpopulation von Zellen, c) Vergleichen der im Schritt b) erhaltenen Muster mit Mustern einer unbehandelten Kontrollprobe, d) Ermitteln einer physiologischen Nebenwirkung der Substanz anhand unterschiedlicher Muster für eine behandelte Probe im Vergleich zu einer unbehandelten Probe.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Bestimmung von zeilassoziierten Lokalisations- und Co-Lokalisations- und Konzentrationsmustern von mindestens zwei verschiedenen Molekülen, wobei mindestens eine Subpopulation von lebenden Zellen mit mindestens einer physiologisch wirksamen Substanz zu mindestens einem Zeitpunkt vorbehandelt wird und die anschließende Bestimmung entweder an lebenden oder fixierten Zellen durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung der zellulären Lokalisation und Co- Lokalisation und Konzentration mit einer örtlichen Auflösung von kleiner 20μm, vorzugsweise kleiner 10μm, vorzugsweise kleiner 2μm betrieben wird.
4. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß physiologische Nebenwirkungen als reversible Nebenwirkungen oder irreversible toxische Effekte organspezifisch oder zellspezifisch quantifizierend oder digitalisierend bestimmt werden.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die quantifizierende oder digitalisierende Bestimmung auf statistischen Resultaten basiert, die auf Einzelzellebene erhalten werden.
6. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei ein charakteristisches zelluläres Molekülmuster dadurch gebildet wird, daß mindestens 2 definierte Moleküle individuell mit optischer Auflösung eines Meßvolumenelementes von der Dimension einer Zelle oder einem optisch aufgelösten Meßvolumenelement als Teilvolumenelement einer Zelle der Zahl 0 oder 1 zugeordnet werden, je nachdem ob die jeweilige Konzentration über oder unter einem zuvor bestimmten Schwellwert liegt, oder wobei mindestens ein charakteristisches subzelluläres Molekülmuster aus Molekülmustern der einzelnen subzellulären Teilvolumenelemente einer Zelle oder eines Zelltyps gebildet wird.
7. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die örtliche Auflösung zur Bestimmung der zellulären Lokalisation und Co-Lokalisation und Konzentration in eine zeitliche Auflösung transformiert wird.
8. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Lokalisation und Co-Lokalisation mathematische Transformationen des gemessenen Signals verwendet werden, insbesondere Kreuzkorrelation und/oder Fouriertransformationen und/oder Laplacetransformationen und/oder Wavelet-Transformationen mit variablen Argumenten.
9. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß neben der Erfassung der Toxizitätswirkungs- oder Nebenwirkungs-spezifischen Muster auch Indikatoren zur Bestimmung des zellulären Subtyps des ortsaufgelösten Meßelementes erfaßt werden.
10. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die subzellulären Muster durch mindestens zwei optisch unterscheidbare Marker-markierte Antikörper oder optisch unterscheidbare Marker-markierte Bindemoleküle oder Gruppen solcher Bindemoleküle generiert werden, indem die jeweils spezifischen Antikörper oder Bindemoleküle mit der fixierten Probe, enthaltend mindestens eine Zelle, Zellverband, Organ oder Organismus, zur Reaktion gebracht werden und die topologische oder zeitliche Verteilung der optisch unterscheidbaren Signale registriert wird.
11. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die subzellulären Muster durch optisch unterscheidbare Marker-markierte Antikörper oder optisch unterscheidbare Marker-markierte Bindemoleküle oder Gruppen solcher Bindemoleküle generiert werden, indem im zyklischen Ablauf sequentiell die jeweils spezifischen Antikörper oder Bindemoleküle mit der fixierten Probe, enthaltend mindestens eine Zelle, Zellverband, Organ oder Organismus, zur Reaktion gebracht werden, die Topologie und Intensität der optischen Signale registriert werden, bevor nach einem Ausbleichschritt der gebundenen optischen Marker zu Beginn des Folgezyklus der nächste Antikörper oder das nächste Bindemolekül zur Reaktion gebracht wird und wobei mindestens zwei Zyklen durchlaufen werden.
12. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 10 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die optisch unterscheidbareη Marker fluoreszierende Marker sind.
13. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß optisch unterscheidbare Signale über unterschiedliche Excitationswellenlängen, unterschiedliche Emissionswellenlängen, unterschiedliche Lebenszeiten der angeregten Zustände, unterschiedliche Intensitäten, unterschiedliche Energietransfereffizienzen oder unterschiedliche Polarisationseigenschaften oder definierte Kombinationen davon gemessen werden.
14. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die subzellulären Muster durch optische Marker von in situ markierten Molekülen generiert werden, indem mindestens zwei Molekültypen als Surrogatmarker fungieren, die optisch unterscheidbare Marker tragen.
15. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß Wirkung, Nebenwirkung oder Toxizität von Wirksubstanzen über veränderte morphologische Muster von Zellen oder Zellorganellen identifiziert werden.
16. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen embryonale oder adulte Stammzellen sind oder davon abgeleitete funktional differenzierte Zelltypen.
17. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung genotypischer Nebenwirkungen oder Toxizitätseffekte Zelle, Zellverband, Organ oder Organismus unterschiedliche Genotypen und damit assoziierte Phänotypen repräsentieren.
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