WO2003050140A1

WO2003050140A1 - Antigenes tumoraux

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Description

明細書

腫瘍抗原技術分野

本発明は、腫瘍抗原ペプチドとしての作用を有するペプチドに関し、さらに詳しくは H L A- A 2拘束性または H L A— A 2 4拘束性に細胞傷害性 T細胞により認識されるおよぴ Zまたは細胞傷害性 T細胞を誘導するペプチド、該ペプチドに対する抗体、該ペプチドと相互作用を有する化合物、該ペプチドからなる細胞傷害性 T細胞誘導剤、これらの 1つ以上を含んでなる医薬組成物、該ペプチドと相互作用を有する化合物の同定方法、該ペプチドを用いる細胞傷害性 T細胞の誘導方法、該ぺプチドおよぴ該抗体の測定方法、並びに薬キットに関する。背景技術

生体における癌の排除には免疫系、特に細胞性免疫に係る細胞傷害性 T細胞（C y t o t o x i c T L y m p h o c y t e s ) 力 S重要な役割を果たしている。例えば、癌患者の腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示す細胞傷害性 T細胞の浸潤が認められている（非特許文献 1 )。このような腫瘍特異的な細胞傷害性 T細胞の標的分子、いわゆる腫瘍抗原は、メラノーマにおいて初めて発見された。腫瘍細胞内で生成された腫瘍抗原は、細胞内で分解されて 8個乃至 1 1個のアミノ酸からなるペプチド、いわゆる腫瘍抗原ぺプチドになり、主要組織適合性抗原（M a j o r H i s t o c o m p a t i b i l i t y し o m p i e x ; 以下、 MH Cと略称する。）であるヒト白血球抗原（H u m a n L e u k o c y t e A n t i g _e n ；以下、 H L Aと略称する。）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。細胞傷害性 T細胞はこの H L A分子と腫瘍抗原ペプチドとからなる複合体を認識し、可溶性因子等、例えばインターフェロン一 γ等のサイトカインを放出し、さらには腫瘍細胞を溶解する。すなわち、細胞傷害性 Τ細胞は H L Α拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害活性を示す。

H L Aは細胞膜抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。 H L Aはクラス I抗原とクラス Π抗原に大別されるが、細胞傷害性 T細胞により抗原べプチドと共に認識される H L Aはクラス I抗原である。 H L Aクラス I抗原はさらに H L A— A、 H L A— Bおよび H L A 一 C等に分類され、ヒトでは有核細胞がそれぞれ異なった量の H L A— A、 H L A— Bおよび H L A— Cを有している。また、その遺伝子は多型性に富むことが報告されている。例えば、 H L A— Aには A 1、 A 2、 A 2 4、および A 2 6等の、 H L A— Bには B 8、 B 2 7、および B 4 6等の、 H L A— Cには C w 3や C w 6等の多型が存在する。そのため、それぞれの個体が有する H L Aの型は必ずしも同一ではない。 H L A— A亜領域の多型の 1つである H L A _ A 2対立遺伝子（ a l l e l e ) は、日本人の約 4 0 %、中国人の約 5 3 %、北ァメリカ白人の約 4 9 %、南アメリカ白人の約 3 8 %、アフリカ黒人の約 2 3 %でみられる（非特許文献 2 )。また、 HL A— A 2 4対立遺伝子は日本人の人口の約 6 0 %

(多くは、その 9 5 %の遺伝型が A 2 4 0 2である。）、約白人の 2 0 %、アフリカ人の約 1 2 %で見られる。

細胞傷害性 T細胞は H L Aクラス I抗原と腫瘍抗原べプチドとの複合体を認識するとき、 H L Aの型をも認識する。また、 H L A分子と結合する腫瘍抗原ぺプチドのァミノ酸配列には、 H L Aの型により異なるモチーフ（規則的配列）が存在することが知られている。 H L Aの型により結合するぺプチドが異なるため、腫瘍抗原べプチドを用いて抗原特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導するおょぴ Zまたは活性化するためには、各型の H L Aに結合するぺプチドを選択する必要がある。

近年、腫瘍拒絶抗原遺伝子および T細胞抗原受容体（T c e l l r e c e p t o r ) 等の特異免疫に関与する分子が、種々の癌、例えばメラノ一マや食道癌等で同定されてきており、進行癌または転移性癌においてぺプチドによる特異的免疫療法が検討されている（非特許文献 3、 4、 5、 6、 7および 8 )。

現在欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性 T細胞を活性化させる癌ワクチン療法が開発されつつあり、メラノ一マ特異的 *腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。例えば、メラノーマ抗原 g p 1 0 0ペプチドをメラノーマ患者に皮下投与し、ィンターロイキン一 2を静脈内投与することにより、 4 2 %の患者で腫瘍の縮小が認められている（非特許文献 9 )。このように腫瘍抗原は、癌ヮクチンとして利用することにより、有効な癌治療効果を期待できる。

しかしながら、癌の多様性を考えると、一種類の腫瘍抗原からなる癌ワクチンを用いて全ての癌を治療することは不可能である。癌細胞の種類や組織の違いにより、発現している腫瘍抗原の種類や発現量が異なる。実際、複数ペプチドを用いた免疫療法（m u 1 t i — p e p t i d e b a s e d i m m u n o t h e r a p y ) 力 S、癌、冶療において有効であることが報告されている（非特許文献 1 0、 1 1および 1 2 )。

さらに、 H L A遺伝子の多型により各個体において機能する腫瘍抗原ぺプチドの種類が異なることから、それぞれの H L Aに応じた腫瘍抗原ペプチドを同定することは、癌治療において高い効果を得るために重要である。

勿論、単一の腫瘍抗原を用いて細胞傷害性 T細胞を活性化せしめる癌ヮクチン療法によっても、該腫瘍抗原を有する癌の治療効果は得られる。しかし、癌の治療において抗原特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導および /または活性化し、かつ癌の多様性に対応して高い治療効果を得るためには、 H L A拘束性および癌の多様性に応じた数多くの新たな腫瘍抗原を発見し利用することが重要である。以下に、本背景技術の説明に引用した文献を列記する。

非特許文献 1 ：「アーカイブスォブサージエリー（ A r c h i V e s o f S u r g e r y )」、 1 9 9 0年、第 1 2 6卷、 p . 2 0 0—

2 0 5。

非特許文献 2 ：「エイチェルエー 1 9 9 1 (H L A 1 9 9 1 )」、 1 9 9 2年、（英国：オックスフォード）、サイェンティフィックパプリケーシヨンズ (O x f o r d S c i e n t i f i c P u b 1 i c a t i o n s )、第 1卷、 p . 1 0 6 5— 1 2 2 0。

非特許文献 3 ：「サイエンス（ S c i e n c e )」， 1 9 9 1年，第 2 5 4卷， p . 1 6 4 3— 1 6 4 7。

非特許文献 4 ：「ジャーナルォプェクスペリメンタルメデイシン ( J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l M e d i c i n e )」、 1 9 9 6年、第 1 8 3卷、 p . 1 1 8 5— 1 1 9 2。

非特許文献 5 ：ゴミ（G o m i , S . ) ら、「ジャーナルォブィムノロンー ( J o u r n a l o f I mm u n o l o g y)」、 1 9 9 9 年、第 1 6 3卷、 p . 4 9 9 4— 5 0 0 4。

非特許文献 6 ：「プロシーデイングォプザナショナルァカデミ一ォブサイェンシズォブザユナイテッドステイツォブフメリカ ( P r o c e e d i n g s o f t e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f Am e r i c a )」、 1 9 9 5年、第 9 2卷、 p . 4 3 2 — 4 3 6。

非特許文献 7 ：「サイエンス（ S c i e n c e )」、 1 9 9 5年、第 2 6 9卷、 p . 1 2 8 1 — 1 2 8 4。

非特許文献 8 ：「ジャーナルォブェクスペリメンタルメデイシン ( J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l M e d i c i n e )」、 1 9 9 7年、第 1 8 6卷、 P . 7 8 5— 7 9 3。非特許文献 9 ：「ネイチヤーメデイシン（N a t u r e M e d i c i n e )」、 1 9 9 8年、第 4卷、 p . 3 2 1 — 3 2 7。

非特許文献 1 0 : 「クリニカルキャンサーリサーチ（C l i n i c a 1 C a n c e r R e s e a r c h )」、 2 0 0 1年、第 7卷、 p . 3 9 5 0 — 3 9 6 2。

非特許文献 1 1 ：「ジャーナルォブクリニカル才ンコロジー ( J o u r n a l o f C l i n i c a l O n c o l o g y )」、 2 0 0 1年、第 1 9卷、 p . 3 8 3 6 — 3 8 4 7。

非特許文献 1 2 ：「ネイチヤーメデイシン（N a t u r e M e d i c i n e )」、 1 9 9 8年、第 4卷、 p . 3 2 8 — 3 3 2。発明の開示

腫瘍抗原べプチドとして作用する新規なぺプチド、例えば前立腺癌患者の特異的免疫療法に有用な、細胞傷害性 T細胞により認識されるぺプチドを見出すために、本発明者は、前立腺癌のマーカーとして知られている 3つの蛋白質、前立腺特異抗原（p r o s t a t e — s p e c i f i c a n t i g e n)、前立腺特異的膜抗原（ p r o s t a t e _ s p e c i f i c m e m b r a n e a n t i g e nノ、および立腺幹細胞抗 J,?ヽ ( p r o s t a t e s t e m c e l l a n t i g e n ) に着目した。そして、これら蛋白質の部分ペプチドのうち、前立腺癌患者の末梢血単核細胞から H L A _ A 2拘束性または H L A— A 2 4拘束性に細胞傷害性 T細胞を誘導する腫瘍抗原べプチドを同定し、これにより本発明を完成した。

すなわち本発明の一態様は、配列表の配列番号 1から配列番号 7のいずれか 1に記载のァミノ酸配列からなるぺプチドである。

また本発明の一態様は、配列表の配列番号 1カゝら配列番号 7のいずれか 1に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドであって、細胞傷害性 T細胞に認識されるぺプチド、および/または細胞傷害性 T細胞を誘導するぺプチドである。

さらに本発明の一態様は、配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1 に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドであって、 H L A— A 2 4拘束性に細胞傷害性 T細胞に認識されるペプチド、および/または H L A— A 2 4拘束性に細胞傷害性 T細胞を誘導するぺプチドである。

さらにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号 6または配列番号 7 に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドであって、 H L A— A 2拘束性に細胞傷害性 T細胞に認識されるぺプチド、および/または H L A— A 2拘束性に細胞傷害性 T細胞を誘導するぺプチドである。

またさらに本発明の一態様は、配列表の配列番号 1から配列番号 7のいずれか 1に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドの少なくとも 1つからなる医薬である。

また本発明の一態様は、配列表の配列番号 1から配列番号 7のいずれか 1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも 1つからなる癌ワクチンである。

さらに本発明の一態様は、前立腺癌の治療に用いる前記癌ワクチンである。

さらにまた本発明の一態様は、配列表の配列番号 1から配列番号 7のいずれか 1に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドの少なくとも 1つを含有してなる細胞傷害性 T細胞の誘導剤である。

またさらに本発明の一態様は、配列表の配列番号 1から配列番号 7のいずれか 1に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドの少なくとも 1つを使用することを特徴とする細胞傷害性 T細胞の誘導方法である。

また本発明の一態様は、下記工程を含む細胞傷害性 T細胞の誘導方法である；

i ) 配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1 に記載のァミノ酸配列からなるペプチドと、 H LA— A 2 4を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、

および

ϋ ) 配列表の配列番号 6または配列番号 7に記載のアミノ酸配列からなるペプチドと、 H L A— Α 2を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、および

iii) 工程 i ) および工程 ϋ ) で得られた細胞を用いて、細胞傷害性 Τ細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程。

さらに本発明の一態様は、下記工程を含む細胞傷害性 Τ細胞の誘導方法である；

i ) 配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドと、 H L A— A 2 4を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、 '

および

ϋ ) 工程 i ) で得られた細胞を用いて、細胞傷害性 T細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程。

さらにまた本発明の一態様は、下記工程を含む細胞傷害性 T細胞の誘導方法である；

i ) 配列表の配列番号 6または配列番号 7に記载のァミノ酸配列からなるべプチドと、 H L A— A 2を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、および

またさらに本発明の一態様は、前記べプチドを免疫学的に認識する抗体である。

また本発明の一態様は、前記ぺプチドおよびノまたは H L A— A 2 4 分子と相互作用して、少なくとも H L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞による該ぺプチドの認識を増強する化合物の同定方法であって、前記ぺプチドおよび前記抗体からなる群より選ばれる少なくとも 1つを用いることを特徴とする同定方法である。

さらに本発明の一態様は、前記べプチドおよび Zまたは H L A— A 2 分子と相互作用して、少なくとも H L A— 2拘束性細胞傷害性 T細胞による該ぺプチドの認識を增強する化合物の同定方法であって、前記ぺプチドおよび前記抗体からなる群より選ばれる少なくとも 1つを用いることを特徴とする同定方法である。

さらにまた本発明の一態様は、前記同定方法により得られた化合物である。

またさらに本発明の一態様は、前記ぺプチドの少なくとも 1つに対する、 H L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞による認識を増強する化合物である。

また本発明の一態様は、前記ペプチドの少なくとも 1つに対する、 H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞による認識を増強する化合物である < さらに本発明の一態様は、前記ペプチド、前記抗体、および前記化合物からなる群より選ばれる少なくとも 1つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物である。

さらにまた本発明の一態様は、前記ペプチドの、または前記抗体の、定量的あるいは定性的な測定方法である。

またさらに本発明の一態様は、前記べプチドおよび前記抗体からなる群より選ばれる少なくとも 1つを含んでなる試薬キットである。

また本発明の一態様は、前記細胞傷害性 τ細胞の誘導方法、前記同定方法、または前記測定方法に使用する試薬キットであって、前記べプチドおよび前記抗体からなる群より選ばれる少なくとも 1つを含んでなる試薬キットである。図面の簡単な説明

第 1図は、前立腺癌患者例 1について血清中の抗ぺプチド抗体を測定した結果を示す。

第 2図は、前立腺癌患者例 1 について血清中の抗ぺプチド抗体を測定した結果を示す。

第 3図は、前立腺癌患者例 1について血清中の抗ぺプチド抗体を測定した結果を示す。

第 4図は、前立腺癌患者例 2について血清中の抗ぺプチド抗体を測定した結果を示す。

第 5図は、前立腺癌患者例 2について血清中の抗ペプチド抗体を測定した結果を示す。

第 6図は、前立腺癌患者例 2について血清中の抗ぺプチド抗体を測定した結果を示す。

第 7図 Aは、 P S A 1 5 2 - 1 6 0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4 8 - 2 5 7 (配列番号 2 ) がそれぞれ、 H L A— 2 4 +前立腺癌細胞 P C 9 3 — A 2 4に対する反応における H L A— A 2 4 ⁺健常人由来 P B M Cからの I F N— _y産生を促進したことを示す。第 7図 Bは、 P S A 1 5 2 - 1 6 0 (配列番号 1 ) または P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) と共に培養した H L A— A 2 4 +健常人由来 P BMCが、 P C 9 3— A 2 4に対して細胞傷害活性を示したことを示す。図中、 *はスチューデント T検定で有意差が認められたことを示す。

第 8図 Aは、 P S A 1 5 2 - 1 6 0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4

8 - 2 5 7 (配列番号 2 ) がそれぞれ、 H L A— 2 4 +前立腺癌細胞 P C

9 3 - A 2 4に対する反応における H L A— A 2 4 +前立腺癌患者由来 P B M Cからの I F N— ^ 産生を促進したことを示す。第 8図 Bは、 P

S A 1 5 2 - 1 6 0 (配列番号 1 ) または P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) と共に培養した H L A— A 2 4 +前立腺癌患者由来 P B MCが、 P C 9 3— A 2 4に対して細胞傷害活性を示したことを示す。図中、 * はスチューデント T検定で有意差が認められたことを示す。

第 9図 Aは、 H L A— A 2 4 +前立腺癌患者血清中に、 P S A 1 5 2— 1 6 0 (配列番号 1 ) または P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) に対する抗体が検出されたことを示す。第 9図 Bは、 P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 )に対する抗体が検出された H L A— A 2 4 +前立腺癌患者血清を、予め 3 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) で吸着すると、その抗体価が低減したことを示す。図中、 *はスチューデント T検定で有意差が認められたことを示す。

第 1 0図は、 H L A— A 2 4 ⁺健常人血清中に、 P S A 1 5 2— 1 6 0 (配列番号 1 ) または P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) に対する抗体が検出されたことを示す。

第 1 1図 Aは、 P SM 6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 ) が、 H L A— A 2 4 +前立腺癌患者の P BMCから、 H L A— 2 4 +前立腺癌細胞 P C 9 3 - A 2 4を認識する C T Lを誘導したことを示す。第 1 1図 Bは、 H L A - A 2 4 +前立腺癌患者の P BMCから P SM 6 2 4 - 6 3 2 (配歹番号 3 )により誘導された〇丁！^の1"1 八ー 2 4 +前立腺癌細胞 P C 9 3 - A 2 4に対する I F N— γ産生が、抗 C D 8抗体により低減されたことを示す。図中、 *はスチューデント T検定で有意差が認められたことを示す。

第 1 2図 Aは、 H L A— A 2 4 +前立腺癌患者血清中で、 P SM 6 2 4 - 6 3 2 (配列番号 3 ) に対する抗体が検出されたことを示す。第 1 2 図 Bは、 P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) に対する抗体が検出された H L A— A 2 4 +前立腺癌患者血清を、予め P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) を被覆したビーズを用いて吸着すると、その抗体価が低減したことを示す。第 1 2図 Cは、 H L A— A 2 4 ⁺前立腺癌患者血清を吸着させた、 P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) を被覆したビーズの溶出液中に、 P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) に対する抗体が検出されたことを示す。発明を実施するための最良の形態

本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第 2 0 0 1 - 3 7 6 4 1 5号からの優先権を請求するものである。

本発明の理解のために、本明細書において用いる用語についてまず説明する。腫瘍抗原とは腫瘍特異的な細胞傷害性 T細胞（ c y t o t o X i c T 1 y m p h o c y t e ：以下、 C T Lと略称することもある。）に認識されるおよび/または細胞傷害性 T細胞を誘導し得るものであり腫瘍細胞が有する蛋白質またはべプチドを意味する。また腫瘍抗原ぺプチドとは、該腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるぺプチドであり、 H L A分子と結合して細胞表面上に提示されることにより腫瘍特異的な細胞傷害性 τ細胞に認識されるおよび Zまたは細胞傷害性 τ細胞を誘導し得るペプチドを意味する。

ここで、「認識する（ r e c o g n i z e )」とは、認識するものが、認識される対象を他のものと見分けて認知し、例えば認知した対象に結合することを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性 T細胞が腫瘍細胞あるいは腫瘍抗原ぺプチドを認識するとは、細胞傷害性 T細胞が H L A分子により提示された腫瘍抗原べプチドに T細胞抗原受容体を介して結合することを意味する。「活性化する」とは、ある活性若しくは作用を有するものまたは状態を、さらに促進するまたは作動させることを意味する。特に、本明細書において、細胞傷害性 T細胞が活性化するとは、細胞傷害性 T細胞が H L A分子により提示された抗原を認識することにより、例えばインターフェロン一 y (以下、 I F N— γ と略称する）を産生すること、あるいは細胞傷害性 Τ細胞が認識した標的細胞（タ一ゲットともいう。）に対し細胞傷害活性を示すことを意味する。「誘導する」とは、ある活性若しくは作用をほとんど持たないものまたは状態から、該活性若しくは該作用を発生させることを意味する。特に、本明細書において、抗原特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導するとは、インビトロあるいはインビボにおいて、ある抗原を特異的に認識する細胞傷害性 τ細胞を分化およびまたは増殖させることを意味する。また、本明細書において細胞傷害性 τ細胞の誘導剤とは、ある抗原を特異的に認識する C D 8陽性 T細胞が存在しないあるいは非常に低い割合でしか存在しない状態から、該抗原を認識する細胞傷害性 T細胞が非常に多い割合で存在するような状態へと変化させる作用を示す薬剤を意味する。

本明細書においては、ぺプチド結合または修飾されたぺプチド結合により互いに結合している 2個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のぺプチドのうち長鎖ペプチドをポリペプチドという。例えば蛋白質も本明細書においてはポリペプチドに含まれる。また、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを、単にペプチドという。以降、ァミノ酸配列を表記する場合、 1文字にて表記する場合と 3文字にて表記する場合がある。

その他、本明細書中で使用されている技術的および科学的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料は、引用により、本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものと見なす。

以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。本発明においては、前立腺癌のマーカーとして知られている 3つの蛋白質、前立腺特異抗原 ( p r o s t a t e - s p e c i f i c a n t i g e n : 以下、 P S Aと略称する。）、前立腺特異的膜抗原（ p r o s t a t e — s p e c i f i c m e m b r a n e a n t i g e n : 以下、 P S MAと略称する。）、および前立腺幹細胞抗原（ p r o s t a t e s t e m c e l l a n t i g e n :以下、 P S C Aと略称する。）に由来する腫瘍抗原ペプチドを同定した（配列番号 1から配列番号 7 )。すなわち、これら蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、 H L A— A 2結合モチーフまたは H LA— A 2 4結合モチーフに適合するぺプチドを設計して合成し、該ペプチドのうち前立腺癌患者の末梢血単核細胞（P e r i p h e r a l B l o o d M o n o n u c l e a r C e l l : 以下、 P BMCと略称する。）から H L A— A 2拘束性または H L A— A 2 4拘束性に細胞傷害性 T細胞を誘導するぺプチドを同定した。

P S Aは、 G e n B a n kにァクセッション番号： X 0 5 3 3 2 として登録されている遺伝子がコードする蛋白質（ァクセッション番号： C A A 2 8 9 4 7 ) であり、キュン一カリクレインファミリーに属するセリンプロテアーゼの 1つである。 P S Aは大多数の前立腺癌で発現しており、 P S A由来の 2種類のペプチド P S A— 1 (配列番号 8 ) および P S A— 3 (配列番号 9 ) が H L A— A 2分子に結合し、細胞傷害性 T 細胞に認識されること、および H L A- A 2拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導することが報告されている〔コリール（C o r r e a l e， P .) ら、「ジャーナノレォプザナショナノレキャンサーインスティテュート ( J o u r n a l o f T n e N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e )」、 1 9 9 7年、第 8 9卷、 p . 2 9 3— 3 0 0〕。また、 P S A_ 1、 P S A— 3、および H LA— A 3結合モチーフをもつ P S A— 9のァミノ酸配列を含む 3 0 m e r のオリゴぺプチド（配列番号 1 0 ) が、 P S Aを発現している H L A— A 2陽性（以下、 H L A 一 A 2 ⁺と称する。）腫瘍細胞を認識する細胞傷害性 T細胞を健常人由来の P B MCから誘導したことが報告されている〔ピアーパオロ（P i e r p a o l o , C . ) ら、「 J o u r n a l o f I mm u n o 1 o g y」、 1 9 9 8年、第 1 6 1卷、 p . 3 1 8 6 — 3 1 9 4〕。

P S MAは、 G e n B a n kにァクセッション番号： A F 0 0 7 5 4 4 として登録されている遺伝子がコードする蛋白質（ァクセッション番号： AA C 8 3 9 7 2 ) であり、 N—ァセチル化 a結合酸性ジぺプチダーセ、 N— a c e t y l a t e d ひ一 l i n k e d a c i d i c d i p e p t i d a s e ) の薬理学的特性を有し、基質の加水分解活性を示すことが報告されている〔ルース（R u t h , E . C . ) ら、「P r o c e e a i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f Am e r i c a」、 1 9 9 6年、第 9 3卷、 p . 7 4 9 — 7 5 3〕。また、 P S MA由来の H L A— A 2結合モチーフに適合するぺプチド P S M— P 1 (配列番号 1 1 ) および P S M— P 2 (配列番号 1 2 ) を用いて、細胞傷害性 T細胞を誘導することによる免疫療法が前立腺癌の臨床試験で検討されている（パトリシア（P a t r i c i a， A. L . ) ら、 Iキャンサーリサーチ（C a n c e r R e s e a r c h J 2 0 0 0年、第 6 0巻、 p . 8 2 9 — 8 3 3 )。

P S C Aは、 G e n B a n kにァクセッション番号： A F 0 4 3 4 9 8 として登録されている遺伝子がコードする蛋白質（ァクセッション番号： AA C 3 9 6 0 7 ) であり、 T h y — l Z L y — 6細胞表面蛋白質ファミリ一に関連する蛋白質である。 P S C Aの m R N Aは前立腺特異的に発現しており、さらに前立腺癌においては過剰発現していることが知られている〔口パート（R o b e r t , E . R . ) ら、「P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f Am e r i c a」、 1 9 9 8年、第 9 5卷、 p . 1 7 3 5 — 1 7 4 0〕。また、抗 P S C A抗体による前立腺癌の治療効果が、ヒト前立腺癌を移植したマウスで確認されている〔ダグラス（D o u g l a s , C . S . ) 、「 P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f Am e r i c a」、 2 0 0 1年、第 9 8巻、 p . 2 6 5 8— 2 6 6 3〕。 P S CAについては、 H L A— A 2拘束性に細胞傷害性 T細胞に認識されるぺプチド、あるいは HL A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導するぺプチドは報告されていない。

このように、前立腺癌における P S A、 P S MA、および P S CAの発現は公知であり、 P S Aおよび P SMAについてはこれらに由来する H L A— A 2結合モチーフに適合するペプチドが H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞を誘導することが知られていた。しかしながら、本発明において同定された 7種類のペプチド（配列番号 1から配列番号 7 ) のうち、 5種類のペプチド（配列番号 1から配列番号 5 ) は H L A— A 2 4結合モチーフを有し、 H L A— A 2 4拘束性に細胞傷害性 T細胞により認識されるペプチドであり、これらペプチドについての報告は無い。また、残り 2種類のペプチド（配列番号 6または配列番号 7 ) は、 H L A - A 2結合モチーフを有し、 H L A— A 2拘束性に細胞傷害性 T細胞により認識されるぺプチドであるが、 P S C A由来のこれらべプチドについての報告は無い。

具体的には、配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドで、 H L A— A 2 4陽性（以下、 H L A— A 2 4 +と称する。）前立腺癌患者由来または H L A— A 2 4 +健常人由来の P BMCを刺激したとき、刺激に用いたぺプチドと同一のぺプチドをパルスした C 1 R - A 2 4 0 2細胞に対する反応における当該 P BMCからの I F N— γ産生がぺプチド特異的に促進された。

また、配列表の配列番号 1から配列番号 3のいずれか 1に記載のァミノ酸配列からなるペプチドは、 H LA— Α 2 4 +前立腺癌細胞に対する反応における、 H L A— A 2 4 +前立腺癌患者由来または H L A— A 2 4 + 健常人由来の P BMCからの I F N— γ産生を促進した。さらに、これらペプチドで刺激した H L Α— A 2 4 +前立腺癌患者由来 P B M Cは、 Η L A- A 2 4 +前立腺癌細胞を認識し、当該細胞に対して細胞傷害活性を示した。

これらから、配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1に記載のァミノ酸配列からなるペプチドは、 H LA— A 2 4 ⁺前立腺癌患者由来または H LA— A 2 4 +健常人由来の P BMCから、 H L A— A 2 4拘束性に腫瘍細胞を認識し、当該腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示す C T L を誘導することが判明した。

配列表の配列番号 6または配列番号 7に記載のァミノ酸配列からなるペプチドは、これらペプチドのいずれかで H L A— A 2陽性（以下、 H L A— A 2 +と称する。）前立腺癌患者由来または H L A— A 2 +健常人由来の P BMCを刺激したとき、刺激に用いたぺプチドと同一のぺプチドをパルスした T 2細胞に対する反応における当該 P B M Cからの I F N— γ産生をべプチド特異的に促進した。

また、配列番号 6に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、 H L A 一 A 2 +前立腺癌細胞に対する H L A— A 2 ⁺前立腺癌患者由来 P B M Cからの I F N— 産生を促進し、配列番号 7に記載のァミノ酸配列からなるペプチドは、 H L A— A 2 +前立腺癌細胞に対する H L A— A 2 + 健常人由来 P BMCからの I F N— y産生を促進した。さらに、配列番号 7に記載のぺプチドで刺激した前立腺癌患者由来: P BMCは、 H L A 一 A 2 +前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を示した。

これらから、配列表の配列番号 6または配列番号 7に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドは、 H L A— A 2 +前立腺癌患者由来または H LA 一 A 2 +健常人由来の P BMCから、 H L A— A 2拘束性に腫瘍細胞を認識し、当該腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示す C T Lを誘導することが判明した。

また、配列表の配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5および配列番号 7のいずれか 1に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドに対する免疫グロプリン G ( I g G) クラスの抗ペプチド抗体が前立腺癌患者血液中に存在することを見出した。このことから、癌患者血液中には腫瘍抗原べプチドに対する抗体が存在しており、この抗ぺプチド抗体の有無と該ペプチドの C T Lによる認識および Zまたは C T Lの誘導とは相関性があることが判明した。腫瘍抗原べプチドに対する I g G抗体の存在と該ぺプチドの癌ワクチン効果とに関連性があることは、本発明において初めて見出された知見である。今までに、糖蛋白質である多型性上皮ムテン ( p o l y m o r p h i c e p i t h e l i a l m u c i n ) (Mu c 1 ) に対する I g Gクラスの自然抗体が早期乳癌患者血清中に存在しており、その存在と疾病の予後とが関連していることが報告されている〔「ョ一口ビアンジャーナルォプキャンサー（E u r o p i e n J o u r n a l o f C a n c e r )」、 1 9 9 6年、第 3 2卷 p . 1 3 2 5— 1 3 3 1 ;「 J o u r n a l o f C l i n i c a 1 O n c o 1 o g y」， 2 0 0 0年、第 1 8卷、 p . 5 7 4— 5 8 3〕。 Mu c 1は大多数の腺癌で発現しており、血中癌関連抗原として乳癌患者の治療経過の監視と再発の早期発見とに使用されている。また、 Mu c 1は腺癌患者に対する免疫療法のためのワクチンとして検討されてきている。抗 MU C 1抗体が血清中に検出された患者は、検出されなかつた患者と比較して、生存率が有意に増加する。すなわち、 MU C 1に対する液性免疫応答が認められる患者において生存率が高いことが示唆されている。これらから、本発明において見出された腫瘍抗原ペプチドに対する I g G抗体が血液中に存在する患者は、該腫瘍抗原ペプチドに対する免疫応答が高く、検出されない患者と比較してその予後が良好である可能性があると考えられる。かくして、本発明において、 H L A— A 2拘束性または H L A— A 2 4拘束性に C T Lにより認識されるおょぴ Zまたは C T Lを誘導することができる 7種類のペプチドを得た。これらペプチドは、配列表の配列番号 1、配列番号 2、配列番号 3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6または配列番号 7に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである。配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、 H L A— A 2 4拘束性の抗原特異的 C T Lに認識されるので、該 C T Lを誘導および/または活性化する腫瘍抗原ぺプチドとして使用できる。配列表の配列番号 6または配列番号 7に記載のァミノ酸配列からなるペプチドは、 HL A— A 2拘束性の抗原特異的 C T L に認識されるので、該 C T Lを誘導および Zまたは活性化する腫瘍抗原ぺプチドとして使用できる。

上記べプチドは、 C T Lを誘導するためにおよび Zまたは C T Lを活性化するために、単独で使用してもよいし、 2種類以上を組み合わせて使用してもよい。 C T Lは種々の抗原を認識する複数種類の細胞集団であることから、好ましくはこれらを 2種類以上組み合わせて用いることが推奨される。

また、このように特定されたペプチドに、 1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または揷入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。好ましくは、このような変異を導入したぺプチドであって、 C T Lにより、例えば少なくとも H L A— A 2拘束性 C T Lまたは H L A— A 2 4拘束性 C T Lにより認識されるぺプチドである。変異を有するべプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（ U 1 m e r ) の技術（「サイェンス（ S c i e n c e )」、 1 9 8 3年、第 2 1 9巻、 p . 6 6 6—）を禾 ϋ 用できる。このような変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性ァミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。

本発明に係るぺプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、「ペプチド合成」（日本国）、丸善株式会社、 1 9 7 5年、および「ぺプチド合成 ( P e p t i d e S y n t h e s i s )」（米国）、インターサイエンス、 1 9 9 6年の聖書に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用可能である。

本発明に係るペプチドの精製 · 回収は、ゲルクロマトグラフィー、ィオンカラムクロマトグラフィーまたはァフィ二テイクロマトグラフィー等を組み合わせるか、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段により精製回収できる。回収しょうとするペプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノク口ーナル抗体を作製し、該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法も使用できる。

本発明に係る抗体は、上記本発明に係るペプチドを認識するまたは結合する抗体である。抗体は免疫学的に該ペプチドを認識するまたは結合するものである限り特に限定されない。抗体は、自然抗体であってよく、また抗原を用いて作製された抗体であってもよい。該抗体を作製するとき、抗原は上記ペプチド自体でもまたはその断片でもよい。該断片は、好ましくは少なくとも 5個、より好ましくは少なくとも 8個乃至 1 0個のアミノ酸で構成される。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により測定できる。

抗体を産生するためには、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、本発明に係るぺプチドを、アジュパントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答おょぴまたは細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害な作用を及ぼさずかつ抗原性を増強せしめるものであればいずれも用いることができる。例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットへモシァニン（ K L H ) 等が例示できるが、これらに限定されない。アジュパントとしては、フロイント完全アジュバント（F CA)、フロイント不完全アジュパント（F I A)、 R i b i (MP L)、： R i b i (TDM)、 R i b i (MP L + TDM)、百日咳ワクチン（B o r d e t e l l a p e r t u s s i s v a c c i n e ), ムラミルジぺプチド (MD P )、アルミニウムアジュバント (A L UM)、およびこれらの組み合わせが例示される。免疫に用いる動物は、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ゥマ等が好適である。

ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物の血清から自体公知の抗体回収法により取得される。好ましい手段として免疫ァフィ二テイクロマ 1、グラフィ一法が挙げられる。

モノクローナル抗体は、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞 (例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、永久増殖性細胞（例えば、 P 3— X 6 3 — A g 8株等のミエローマ株）を用いて自体公知の形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化し、上記ペプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイプリドーマを選別し、該ハイプリドーマの培養液から抗体を回収する。

かくして得られた、上記ペプチドを認識し結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該ペプチドの精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として利用できる。上記ぺプチドまたはこれら各べプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独でまたは複数種類を組み合わせることにより、 C T Lによる該ぺプチドの認識を増強する物質の同定に有効な手段を提供する。同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築可能である。例えば、腫瘍抗原ペプチドをパルスした抗原提示細胞を用いて C T Lを刺激し、該 C T Lによる腫瘍抗原ぺプチドの認識および Zまたは該 C T Lの活性化を測定する実験系を構築し、被検物質を試験することにより、本発明に係るぺプチドの C T Lによる認識を増強する物質を選別できる, 抗原提示細胞としては、 H L A— A 2分子およぴまたは H L A _ A 2 4分子を保持する細胞、例えば H L A— A 2分子および/または H L A 一 A 2 4分子を保持する細胞株、より具体的には T 2細胞（H L A— A 2 +) 等が例示できる。あるいは、 H L A— A 2分子または H L A— A 2 4分子を保持しない細胞であっても、 H L A— A 2 c D NAまたは H L A - A 2 4 c D NAを遺伝子導入して細胞表面上に H L A— A 2分子または H L A_ A 2 4分子を発現させた細胞を用いることもできる。抗原提示細胞への腫瘍抗原のパルスは、抗原提示細胞と腫瘍抗原とを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である。

C T Lとしては、例えば H L A— A 2拘束性 C T L株または H L A— 2拘束性0丁 1^系、例えば、 OK— C T L (非特許文献 5 ) 等を用いる。あるいは、 H L A— A 2 4拘束性 C T L株または H L A— A 2 4拘束性 C T L系、例えば、 KE 4— C T L (「インターナショナルジャーナルォブキャン (. I n t e r n a t i o n a l J o u r n a

1 o f C a n c e r )」、 1 9 9 9年、第 8 1卷、 p . 4 5 9— 4 6 6 ) 等を用いる。該 C T Lによる腫瘍抗原ペプチドの認識および/または該 C T Lの活性化は、簡便には該 C T Lからの I F N— γ産生量を指標にして測定できる。この実験系は同定方法の 1つを説明するものであり、本発明に係る同定方法はこれに限定されない。 K E - 4 C T Lは食道癌患者の腫瘍浸潤リンパ球から樹立された H L A— A 2 4拘束性 C T L培養細胞株である。 KE— 4細胞は食道癌細胞であるが、この細胞には前立腺癌マーカーである P A P ( P r o s t a t e a c i d p h o s p h a t a s e ) が発現していることが確認されている〔「ジャーナルォブゥロロジー（ J o u r n a l o f U r o l o g y)」、 2 0 0 1年、第 1 6 6卷、 p . 1 5 0 8— 1 5 1 3〕。このことから、本発明に係るペプチドが由来した P S A、 P S M A、および P S CAも K E— 4細胞で発現しており、そのため H L A— A 2 4 分子により提示された本発明に係るぺプチドを KE— 4 C T Lが認識できる可能性がある。したがって、当該ペプチドの C T Lによる認識を増強する物質の同定に KE— 4 C T Lを使用できる可能性がある。

本発明は、上記同定方法で得られた化合物も包含する。該化合物は、本発明に係るぺプチド、例えば配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドぉよぴまたは H L A — A 2 4と相互作用して H LA— A 2 4拘束性 C T Lによる該ぺプチドの認識を増強する化合物であり得る。または、例えば配列表の配列番号 6若しくは配列番号 7に記载のァミノ酸配列からなるぺプチドおよび/ または H L A— A 2と相互作用して H L A— A 2拘束性 C T Lによる該ぺプチドの認識を増強する化合物であり得る。かくして選別された化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製可能である。

本発明に係るペプチドは、腫瘍抗原ペプチドとして、 111^ ー 2拘束性または H L A— A 2 4拘束性に抗原特異的 C T Lを誘導するおょぴ Zまたは抗原特異的 C T Lを活性化するために使用できる。すなわち、上記ペプチドから選ばれた 1つ以上のペプチドからなる医薬、上記ぺプチドの 1つ以上を含有する C T Lの誘導剤並びに上記ぺプチドの 1っ以上を使用することを特徴とする C T Lの誘導方法も、本発明の範囲に包含される。

C T Lの誘導方法は、その一態様として、本発明に係るペプチドを抗原提示細胞にパルスする工程、および該工程で得られた抗原提示細胞を用いて C T Lの前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程を含む。抗原提示細胞としては、 H L A— A 2分子および/または H L A— A 2 4分子を保持する細胞、例えば H LA— 2分子ぉょぴ7または11し一八 2 4分子を保持する細胞株を用いる。より具体的には、 H L A— A 2分子を保持する細胞株として T 2細胞等が例示できる。あるいは、 H L A— A 2 c D NAまたは H LA— A 2 4 c D N Aを常法により遺伝子導入して細胞表面上に H L A— A 2分子または H L A - A 2 4分子を発現させた細胞を用いることもできる。抗原提示細胞へのぺプチドのパルスは、抗原提示細胞と腫瘍抗原べプチドとを常法にしたがって共に培養することにより実施可能である。 C T Lの前駆細胞を含む細胞集団は、例えば末梢血細胞、より好ましくは末梢血単核細胞である。当該細胞集団の刺激は、ぺプチドをパルスした H L A— A 2 4 +抗原提示細胞およぴ H L A— A 2 +抗原提示細胞をそれぞれ単独で用いて実施してもよいし、両方を共に用いて行なってもよい。

また、本発明に係るぺプチド、該ぺプチドを免疫学的に認識する抗体、該ぺプチドぉよび Zまたは H L A - A 2分子と相互作用して C T Lによる該ペプチドの認識を増強する化合物、あるいは該ペプチドおよびノまたは H L A— A 2 4分子と相互作用して C T Lによる該ペプチドの認識を増強する化合物を、単独でまたは複数種類組み合わせて利用することにより、これらのうち少なくとも 1つを含有する医薬組成物を提供できる。

上記医薬、上記医薬組成物、上記 C T Lの誘導剤、および上記 C T L の誘導方法は、例えば癌の治療、例えば前立腺癌の治療において有用である。 H L A— A亜領域の多型の 1つである H L A— A 2対立遺伝子は、日本人の人口の約 4 0 %、中国人の約 5 3 %、北ァメリカ白人の約 4 9 % 南アメリカ白人の約 3 8 %、アフリカ黒人の約 2 3 %でみられる（非特許文献 2 )。 H LA— A 2 4対立遺伝子は日本人の人口の約 6 0 % (多くは、その 9 5 %の遺伝型が A 2 4 0 2である。）、白人の約 2 0 %、ァフリカ人の約 1 2 %で見られる。これらから、本発明に係る医薬、医薬組成物、 C T Lの誘導剤、および C T Lの誘導方法は多数の患者においてその効果を期待できる。

具体的には、例えば本発明に係るペプチドからなる医薬、さらに本発明に係るぺプチドを含有する医薬組成物は、いわゆる癌ワクチンとして使用できる。ここでいう癌ワクチンとは、腫瘍細胞に対する特異的免疫応答の誘導および/または増強により、腫瘍細胞を選択的に傷害する薬物を意味する。その投与量は、 C T Lによる当該ペプチドの認識の程度により適宜変更を加えて決定できるが、一般的には活性本体として 0. 0 1 m g乃至 1 0 0 m g /日 Z成人ヒト、好ましくは 0. 1 m g乃至 1 O m g /日/成人ヒトである。これを数日乃至数月に 1回投与する。投与方法は、公知の医療用ペプチドの投与方法に準じて行えばよく、好適には皮下投与、静脈内投与または筋肉内投与にて行われる。投与に際しては、免疫応答の誘導おょぴ Zまたは増強のために、本発明に係るぺプチドは適当なアジュバントの存在下または非存在下に、単独でまたは担体に結合して用いることができる。担体は、それ自体が人体に対して有害な作用を及ぼさずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。アジュバントは、通常のぺプチドワクチン接種に用いられるものであればよく、フロイント不完全アジュパント (F I A)、アルミニウムアジュノント（A LUM)、百日咳ワクチン（B o r d e t e l l a p e r t u s s i s v a c c i n e ) および鉱物油等が例示される。また、剤形は、ぺプチドを製剤化する自体公知の手段を応用して適宜選択できる。または、患者の末梢血より単核細胞画分を揉取して、本発明に係るぺプチドと共に培養した後に、 C T Lの誘導およびまたは C T Lの活性化が認められた該単核細胞画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な癌ワクチン効果が得られる。培養するときの単核細胞濃度、本発明に係るペプチドの濃度、培養期間等の培養条件は、簡単な繰り返し実験により決定できる。培養時に、インターロイキン一 2等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。

癌ワクチンとして本発明に係るぺプチドを使用する場合、 1種類のぺプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、複数種類のぺプチドを組み合わせて使用することもできる。複数ペプチドに基づく免疫療法が有効であると報告されていること（非特許文献 9、 1 0および 1 1 )、および癌患者の C T Lは複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であることから、 1種類のぺプチドを癌ワクチンとして使用するより複数種類を組み合わせて使用する方が、より高い効果が得られるときがある。特に、 H L A— A 2 4 と H L A— A 2 とを両方有する癌患者においては、 H L A— A 2 4拘束性 C T Lに認識されるぺプチドと、 H L A— A 2拘束性 C T Lに認識されるペプチドとを組み合わせて癌ワクチンとして使用すると、高い効果が得られるときがある。またこのとき、本発明のぺプチドから選ばれるぺプチドを組み合わせて使用してもよいが、これらから選ばれる少なくとも 1種類のペプチドに、公知の腫瘍抗原ペプチドから選ばれる少なくとも 1種類の腫瘍抗原べプチドを組み合わせて使用してもよレ、。公知の腫瘍抗原べプチドとしては、 1 c k遺伝子または s r c 遺伝子由来の腫瘍抗原ぺプチド（国際公開番号第 WO 0 1 / 1 1 0 4 4 号公報）、 S ART— 1遺伝子由来の腫瘍抗原べプチド（「 I n t e r n a t i o n a 1 J o u r n a l o f C a n c e r」、 1 9 9 9年、第 8 1卷、 ρ · 4 5 9— 4 6 6 )、 S AR T— 3遺伝子由来の腫瘍抗原べプチド（「 C a n c e r R e s e a r c h」、 1 9 9 9年、第 5 9卷、 p . 4 0 5 6— 4 0 6 3 )、並びにサイクロフイリン B遺伝子由来の腫瘍抗原べプチド（非特許文献 5 )等が例示されるがこれらに限定されない。本発明に係るぺプチドおよぴ該ぺプチドを免疫学的に認識する抗体はそれ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用可能である。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および Zまたは防腐剤等の物質を含んであってもよい。また本発明は、これらのうちの 1つまたはそれ以上を充填した、 1個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたは抗体それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。これらの試薬おょぴ試薬キットは、上記同定方法、上記 C T Lの誘導方法、または本発明に係るぺプチドの定量的若しくは定性的測定に使用できる。当該測定をするための方法は、当業者に周知の方法を利用して構築できる。このような測定法には、ラジオィムノアツセィ、競合結合アツセィ、ウェスタンブロット分析および酵素免疫固相法（E L I S A ) 等がある。

また、患者由来血液試料について、本発明に係るペプチドに対する抗ぺプチド抗体の定量的若しくは定性的測定が、上記試薬または試薬キットを使用して実施可能である。測定には患者由来血液試料として血清または血漿を使用できる。上述したように、抗ペプチド抗体の癌患者血液中の存在と該抗体が認識するぺプチドの癌ワクチン効果とに関連性があると考えられるため、当該抗ペプチド抗体の測定により、ペプチドの癌ワクチンとしての有効性の判断が可能になると考えられる。実施例

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

( H L A— A 2 4拘束性 C T Lにより認識されるぺプチドの同定） H L A - A 2 4結合モチーフを文献検索により得て、該モチーフに適合する 9 m e rまたは 1 O m e rのペプチドを、前立腺癌マーカーとして知られている 3つの蛋白質、 P S A、 P S MA, および P S C Aのァミノ酸配列に基づいて設計し、自体公知の方法で合成した。合成したぺプチドの純度はいずれも 7 0 %以上であった。

合成したべプチドについて、前立腺癌患者から調製した P B M Cからの、 H L A— A 2 4拘束性 C T L誘導能を検討した。 P B MCは血液から常法により調製し、細胞数 1 X 1 0 ⁵を培養培地〔 4 5 % R P M I — 1 6 4 0培地、 4 5 % A I M_ V®培地（ I n v i t r o g e n社）、 1 0 O U/m l の I L — 2 、 0 . 1 mMの M E Mノンエッセンシャルアミノ酸溶液（ I n V i t r o g e n社）、および 1 0 % F C S力、らなる〕 2 0 0 μ 1 を加えた 9 6 ゥエル U底型マイクロカルチャープレート ( N u n c社製）の各ゥエル中で、ペプチド各 1 0 μ Μと共に、 5 % C〇₂— 9 5 % A i r の条件下で 3 7 °Cにて培養した。培養 4 日目および 7 日目に半量の培地を除き、最初に添加したペプチドと同じペプチドを含む上記組成の培地と交換した。培養 1 0 日目の細胞を回収した後に洗浄してェフエクター細胞（E ) として用いた。

一方、合成した各ぺプチド（ 1 0 / M) を、 C 1 R— A 2 4 0 1細胞 (H L A— A 2 4 + ) と、 5 % 〇 ₂— 9 5 % 1 ]：の条件下で 3 7。0 にて 2時間インキュベーションし、細胞表面上に発現している H L A— A 2 4分子に当該各ぺプチドを結合させた。このように各ぺプチドをパ,ノレスした C 1 R— A 2 4 0 1細胞を標的細胞（T ) として用いた。

エフェクター細胞を均等に分割し、種々の標的細胞と混合し、 5 % C

0 ₂ - 9 5 % A i rの条件下で 3 7 °Cにて 1 8時間インキュベーションした。インキュベーション後の上清 1 0 0 μ 1 を回収して、産生された

1 F N— γ量を E L I S Aにより測定した。このとき、エフェクター細胞を誘導するのに用いたぺプチドと C 1 R— A 2 4 0 1細胞にパルスしたペプチド.とが同じものになるように、エフェクター細胞と標的細胞とを組み合わせた。また、対照としてヒト免疫不全ウィルス（H u m a n I mm u n o d e f i c i e n c y V i r u s : 以下、 H I Vと略称する）由来のペプチドを用い、 H I Vペプチドをパルスした C 1 R— A 2 4 0 1細胞を認識した C T Lの I F N— γ産生量をバックグランドとして各測定値から減算した。算出された各測定値（N E T) はスチューデント t検定で統計処理し、 P値が 0. 0 5以下であるものを有意差があると見なした。また、 I F N— γ産生をNE Tで 5 0 p g /m l 以上かつ有意差をもって促進したぺプチドを陽性と判定した。

その結果、 P S A由来の P S A 1 5 2 - 1 6 0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4 8 - 2 5 7 (配列番号 2 )、 P S M A由来の P SM 6 2 4 - 6 3 2 (配列番号 3 )、並びに P S C A由来の P S C A 7 6— 8 4 (配列番号 4 ) および P S C A 8 2— 9 1 (配列番号 5 ) が、それぞれ 1 4例中 2例、 1 3例中 4例、 1 4例中 5例、 1 2例中 1例、並びに 1 2例中 2 例の前立腺癌患者 P BMCからの I F N— γ産生を促進した。すなわち、これらのペプチドが、前立腺癌患者 P BMCから、 H L A— Α 2 4拘束性 C T Lを誘導することが分かった。なお、ここで、ペプチド名の数字 ΜΜΜ— ΝΝΝは、該ぺプチドが由来した蛋白質のアミノ酸配列中で第 ΜΜΜ番目から第 ΝΝΝ番目のアミノ酸残基からなることを意味する。実施例 2

(ぺプチドにより誘導された C T Lの細胞傷害活性）

P SM 6 2 4 - 6 3 2 (配列番号 3 ) により H L A— Α 2 4 +前立腺癌患者由来 P BMCから誘導された C T Lの細胞傷害活性を、前立腺癌細胞を用いて^{5 1} C r遊離試験で検討した。まず、 2例の前立腺癌患者由来 P B MCを、実施例 1 と同様に 1 0 日間培養して刺激し、さらに 1 0 日間培養した後にエフエタター細胞として用いた。このエフェクター細胞の HL A— A 2 4 +標的細胞に対する細胞傷害活性を、 E/T比 1 0または 2 0で、標準的な 6時間の ^{5 1} C r遊離試験で測定し、得られた結果を％特異的溶解で表した。標的細胞としては、 H L A— A 2 4—前立腺癌細胞 P C 9 3に H L A— A 2 4遺伝子を常法により導入して発現させた細胞 P C 9 3—A 2 4を用いた。また対照として、当該 H LA— A 2 4一前立腺癌細胞を用いた。

その結果、 P SM6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 ) で刺激した前立腺癌患者由来 P BMCは、 2例ともに H L A— A 2 4を発現させた前立腺癌細胞を特異的に溶解した（表 1 )。このことから、 P SM 6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 ) は癌患者の P BMCから H L A— A 2 4拘束性の腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞を誘導することが明らかになつた。表 1

実施例 3

(前立腺癌患者血清中の抗ぺプチド抗体の測定）

前立腺癌患者血清中の免疫グロブリン G ( I g G) クラスの抗ぺプチド抗体を後述のように E L I S Aにより測定した。その結果、前立腺癌患者由来 P 8^1〇から11し八ー 2 4拘束性 C T Lを誘導したぺプチドである、 P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 )、？ 3]\ 6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 )、 P S C A 7 6— 8 4 (配列番号 4)、および P S C A 8 2— 9 1 (配列番号 5 ) に対する抗体が、患者 1 0例中、それぞれ 5例、 1 例、 4例、および 2例で検出された。しかし、 P S A 1 5 2 — 1 6 0 (配列番号 1 ) に対する抗体は検出されなかった。一方、前立腺癌患者由来 P B M Cから H L A— A 2 4拘束性 C T Lを誘導しなかったペプチドである、 P S A由来の P S A 1 — 1 0およぴ P S A 2 — 1 0、 P S MA由来の P S M 2 9 8 — 3 0 6、 P S M 2 2 7 — 2 3 5、 P S M 6 0 6 — 6 1 4、 P S M 1 7 8 — 1 8 6、 P S M 4 4 8 — 4 5 6、 P S M 5 2 0 — 5 2 8、 P S M 7 0 4 _ 7 1 2、 P S M 7 4 — 8 3、 P S M 5 6 5 - 5 7 4、 P S M 6 9 9 — 7 0 8、 P S M 6 2 4 — 6 3 3、および P S M 5 8 4 — 5 9 3、並びに P S C A 2 7 — 3 6に対する抗体は検出されなかつた。代表的な結果を図 1から図 6に示す。図 1から図 3は患者例 1についての結果を、図 4から図 6は患者例 2 についての結果を示す。患者例 1においては、血清中に？ 3 2 4 8 — 2 5 7 (配列番号 2 )、 P S M 6 2 4 - 6 3 2 (配列番号 3 )、および P S C A 7 6 — 8 4 (配列番号 4 ) のそれぞれに対する抗体が検出された（図 1およぴ図 3 )。また、患者例 2においては、 P S A 2 4 8 — 2 5 7 (配列番号 2 ) および P S C A 7 6 - 8 4 (配列番号 4 ) のそれぞれに対する抗体が認められた（図 4および図 6 )。

このことから、癌患者血液中には腫瘍抗原べプチドに対する抗体が存在しており、この抗ペプチド抗体の有無と該ペプチドの C T Lによる認識および Zまたは C T Lの誘導には相関性があることが判明した。

抗ぺプチド抗体（ I g Gクラス）は E L I S Aにより測定した。各ぺプチド ( 2 0 μ _g /ゥエル) を 9 6 ゥヱルヌンクコバリンク ( N u n c し o v a l i n k ) 平 i&プート、 F i s h e r S c i e n t i f i c社）にジスクシンイミジノレスべレート（ d i s u c c i n i m i d y 1 s u b e r a t e ) ( P I E R C E社）で製品指示書にしたがつて固相化（ I m m o b i 1 i z e ) した。このとき、パックグランドとしてペプチドを固相化しないゥエルをプレート中に設けた。このように処理したプレートをプロックエース（B 1 o c k a c e ；雪印社）でブロックして 0. 0 5 % Tw e e n 2 0— P B Sで洗浄し、血清または血漿サンプルを 0. 0 5 % Tw e e n 2 0— B l o c k a c eで希釈して、 Ι Ο Ο μ Ι /ゥエルの容量をプレートに加えた。 3 7 °Cで 2 時間インキュベーション後、プレートを Tw e e n 2 0— P B Sで洗浄し、 1 : 1 0 0 0倍希釈したゥサギ抗ヒト I g G抗体（y鎮特異的抗体； D A K O社）と共にさらに 3 7 °Cで 2時間インキュベーションした。このプレートを 9回洗浄し、 1 : 1 0 0倍希釈したャギ抗ゥサギ I g抗体を結合させたホースラディッシュパーォキシダーゼーデキストランポリマー（E n V i s i o n ； DAKO) を 1 0 0 μ 1ずつ各ゥエルに加えて室温で 4 0分間ィンキュベーションした。洗浄後にテトラメチルべンジジン基質溶液（K P L社） 1 0 0 μ 1 を加え、その後に反応を 1 Μ のリン酸を添加して停止し、 4 5 0 n mの波長における吸光度（OD) を測定した。各ペプチドを固相化したゥエルの吸光度から、ペプチドを固相化しなかったゥエルの吸光度を減算して得られた値を、各抗ぺプチド抗体の量として図示した。実施例 4

(P S A 1 5 2 - 1 6 0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) の細胞傷害性 T細胞誘導能の検討）

H L A - A 2 4 ⁺健常人および H L A— A 2 4 +前立腺癌患者から P B MCを調製し、 P S A 1 5 2— 1 6 0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4 8 - 2 5 7 (配列番号 2 ) による前立腺癌に反応する C T Lの誘導について検討した。 P B MCは、実施例 1 と同様の方法で P S A 1 5 2— 1 6 0 (配列番号 1 ) または P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) 各 1 0 g /m 1 と共に 1 2 日間培養したものを用いた。標的細胞は、各ぺプチド（ 1 0 μ g /m l ) を C 1 R— Α 2 4 0 1細胞（H L A— A 2 4 +) に実施例 1 と同様の方法でパルスしたものを用いた。 P B MCと標的細胞とを混合し、実施例 1 と同様にインキュベーションして、培養上清中の I F N— γ量を測定した。

その結果、 P S A 1 5 2 — 1 6 0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4 8 - 2 5 7 (配列番号 2 ) と共に培養した P B MCは、それぞれ前立腺癌患者 6例中 3例および 7例中 4例で、 I F Ν— y産生を促進した。実施例 1で行なった別症例についての結果と併せると、 P S A 1 5 2 — 1 6

0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4 8 — 2 5 7 (配列番号 2 ) は、 2 0 例中 5例および 2 0例中 8例で、 I F N— γ産生を促進した。また、これらペプチドとともに培養した、健常人 5例中 1例の、 P B MCは対応するペプチドをパルスした C 1 R - A 2 4 0 1細胞を認識し、 I F N— 7を産生した。

次に、 P S A 1 5 2 — 1 6 0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4 8 — 2 5 7 (配列番号 2 ) を用いて、前立腺癌細胞を認識して細胞傷害活性を示す C T Lの誘導を、健常人由来 P B MCについて検討した。健常人由来 P B MCは、本実施例において P S A 1 5 2 — 1 6 0 (配列番号 1 ) または？ 3 2 4 8 — 2 5 7 (配列番号 2 ) により、ぺプチド特異的な

1 F N— γ産生が観察された健常人由来 P B MC各 1例由来のものを用レ、た。 P B MCは、上記同様に P S A 1 5 2 — 1 6 0 (配列番号 1 ) または？ 3 2 4 8 — 2 5 7 (配列番号 2 ) 各 1 0 g / τα 1 と共に 1 2 日間培養した。標的細胞として実施例 2で作成した前立腺癌細胞 P C 9 3 — Α 2 4を用い、上記培養した P B MCと共にィンキュベーシヨンして、培養上清中の I F N— T 量を測定した（実施例 1参照）。さらに、上記培養した細胞を、さらに 1 4 日間培養して、 P C 9 3 — A 2 4細胞に対する細胞傷害活性を、 ^{5 1} C r遊離試験により測定した（実施例 2参照） _c その結果を図 7 Aおよび図 7 Bに示す。 P S A 1 5 2 — 1 6 0 (配列番号 1 ) または P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) で刺激された健常人由来 P BMCは、 P C 9 3— A 2 4細胞に対し、それぞれ有意差をもつて高い I F N— γを産生した（図 7 Α)。また、 P S A 1 5 2— 1 6 0 (配列番号 1 ) または P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) で刺激された健常人由来 P BMCは、 P C 9 3— A 2 4細胞に対して細胞傷害活性を示し、当該細胞を溶解した。これらの細胞傷害活性は、 P C 9 3細胞に対する活性と比較して有意差が認められた（図 7 B )。

さらに、 4例の前立腺癌患者由来 P BMCについて同様の検討を行なつた。その結果を図 8 Aおよぴ図 8 Bに示した。 P S A 1 5 2— 1 6 0 (配列番号 1 ) ぉょび 3 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) のいずれかで刺激された P B M Cは、それぞれ前立腺癌患者 4例中 '2例および 4例中 3例において、 P C 9 3— A 2 4細胞に対し有意差をもって高い I F N— γを産生した（図 8 Α；)。また、 P S A 1 5 2— 1 6 0 (配列番号 1 ) または P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) で刺激した前立腺癌由来 Ρ BMCは、 P C 9 3— A 2 4細胞に対して細胞傷害活性を示し、当該細胞を溶解した。これらの細胞傷害活性は、 P C 9 3細胞に対する活性と比較して有意差が認められた（図 8 B)。

さらに、 P S A 1 5 2 — 1 6 0 (配列番号 1 ) または P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) に対する抗体を、前立腺癌患者血清について測定した（実施例 3参照）。 P S A 2 4 8 - 2 5 7 (配列番号 2 ) に対する抗体は、 5例で検出された（図 9 A)。このうち 1例においては、 P S A 1 5 2 - 1 6 0 (配列番号 1 ) に対する抗体も検出された。患者血清中の P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) に対する抗体は、 P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) を固相化したプレートでインキュベーションすることにより吸着されたが（図 9 B)、 P S A 1 5 2— 1 6 0 (配列番号 1 ) を固相化したプレートでは吸着されなかった。このことから、検出された抗体は P S A 2 4 8— 2 5 7 (配列番号 2 ) に特異的であることが判明した。

P S A 1 5 2 - 1 6 0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4 8 — 2 5 7 (配列番号 2 ) に対する抗体は、健常人血清でも検出された。代表的な 8例を図 1 0に示す。

これらの結果から、 P S A 1 5 2 — 1 6 0 (配列番号 1 ) および P S A 2 4 8 - 2 5 7 (配列番号 2 ) 力 S、 H L A— A 2 4 +健常人由来おょぴ H L A - A 2 4 +前立腺癌患者由来の P BMCから、 H L A— A 2 4 +前立腺癌細胞を認識して、当該細胞に対して細胞傷害性を示す C T Lを誘導することが明らかになった。さらに、これらペプチドに対する特異抗体が、前立腺癌患者血清中に存在することが判明した。実施例 5

( P S M 6 2 4 - 6 3 2 (配列番号 3 ) の細胞傷害性 T細胞誘導能の検討）

H L A - A 2 4 +健常人および H L A— A 2 4 +前立腺癌患者から調製した P B M Cを P S M 6 2 4 — 6 3 2 (配列番号 3 ) と共にインキュベーションし、標的細胞の認識による I F N— γ産生を検討した。 Ρ Β M Cは、実施例 1 と同様の方法で P S M 6 2 4 — 6 3 2 (配列番号 3 ) 1 0 μ g / 1 と共に 1 2 日間または 1 0 S間培養したものを用いた。標的細胞は、ペプチド（ 1 0 μ g /m 1 ) を C 1 R— A 2 4 0 1細胞（ H L A - A 2 4 ⁺) に実施例 1 と同様の方法でパルスしたものを用いた。 P B MCと標的細胞とを混合し、実施例 1 と同様にインキュベーションして、培養上清中の I F N— γ量を測定した。

その結果、 P S M 6 2 4 — 6 3 2 (配列番号 3 ) は、前立腺癌患者 2 例中 1例で、 P B MCからの I F Ν— y産生を促進した。実施例 1で行なった別症例についての結果と併せると、 P S M 6 2 4 — 6 3 2 (配列番号 3 ) は、 1 6例中 6例で、 P B MCからの I F N—！産生を促進した。また、このペプチドは、健常人 5例中 3例で、 P B M Cからの I F

N - 産生を促進した。

次に、 P SM 6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 ) を用いて、前立腺癌細胞を認識して細胞傷害活性を示す C T Lの誘導を、上記検討に用いた症例とは別の 7例の前立腺癌患者由来 P BMCについて検討した。 P BMC は、上記同様に P S M 6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 ) 1 0 g /m 1 と共に 1 2 日間培養した。標的細胞として実施例 2で作成した前立腺癌細胞 P C 9 3 - A 2 4を用レ、、上記培養した P BMCと共にインキュベーシヨンして、培養上清中の I F N— γ量を測定した（実施例 1参照）。その結果を図 1 1 Aおよび図 1 1 Bに示す。 P SM 6 2 4 - 6 3 2 (配列番号 3 ) は、 7例中 5例において、前立腺癌患者由来 P BMCの P C 9 3— A 2 4細胞に対する反応における I F N— γ産生を、有意差をもつて促進した（図 1 1 A)。 P SM 6 2 4 - 6 3 2 (配列番号 3 ) により刺激された C T L誘導による I F N— γ産生は、抗 C D 8抗体によって阻害されたが、抗 C D 4抗体および抗 C D 1 4抗体では阻害されなかつた（図 1 1 B)。これら力ら、 P SM 6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 ) が、 HL A— A 2 4 +前立腺癌患者由来の P BMCから、 H LA— A 2 4 +前立腺癌細胞'を認識する C T Lを誘導することが明らかになった。

また、 P SM 6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 ) に対する抗体を、前立腺癌患者血清について測定した（実施例 3参照）。抗体が検出された代表的な 3例を図 1 2 Aに示した。患者血清中の当該抗体は、 P SM 6 2 4 - 6 3 2 (配列番号 3 ) で被覆したセルロースビーズと予めインキュベーシヨンすることにより吸着された（図 1 2 B )。このことから、患者血清中に検出された抗体は P SM 6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 ) に特異的であることが判明した。さらに、 P SM 6 2 4— 6 3 2 (配列番号 3 ) を被覆したビーズに結合した抗体を 0. 5 M N a C l および 0. 2M クェン酸緩衝液で溶出したところ、得られた溶出液中に P S M 6 2 4 - 6 3 2 (配列番号 3 ) に対する特異抗体が検出された（図 1 2 C)。

これらの結果から、 P S M 6 2 4 — 6 3 2 (配列番号 3 ) が、 H L A 一 A 2 4 +健常人由来おょぴ H L A— A 2 4 +前立腺癌患者由来の P B MCから、 H L A— A 2 4 +前立腺癌細胞を認識して、当該細胞に対して細胞傷害性を示す C T Lを誘導することが明らかになった。さらに、このぺプチドに対する特異抗体が、健常人および前立腺癌患者血清中に存在することが判明した。実施例 6

(H L A- A 2拘束性 C T Lにより認識されるぺプチドの同定）

H L A- A 2分子に結合するぺプチドを得るために、まず H L A— A 2結合モチーフを有するペプチドについて、インターネットホームぺー V < h t t p D i m a s . d c r t . n i h . g o v / / va. o 1 b i o / h 1 a _ b i n d Z〉を用いて検索した。そして、該モチーフに適合する 9 m e rまたは l O m e rのペプチドを、 P S C Aのァミノ酸配列に基づいて設計し、自体公知の方法で合成した。合成したぺプチドの純度はいずれも 9 0 %以上であった。

合成したぺプチドについて、 H L A— A 2 +健常人または H L A— 2 + 前立腺癌患者から調製した P B MCからの、 H L A— A 2拘束性 C T L 誘導能を検討した。 P B MCは血液から常法により調製し、細胞数 1 X 1 0 ⁵を、実施例 1 に記載の培養培地と同一のものを用いて 9 6 ゥエル U 底型マイクロ力ノレチヤ一プレート（N u n c社製）の各ゥエル中で、ぺプチド各 1 0 μ g /m 1 と共に、 5 % C O ₂— 9 5 % A i rの条件下で 3 7 °Cにて培養した。培養 5 日目および 1 0 日目に半量の培地を除き、最初に添加したペプチドと同じペプチドを含む新鮮培地と交換した。培養 1 5 日目の細胞を回収した後に洗浄してエフヱクタ一細胞として用いた _c —方、合成した各ぺプチド（ l O g /m l ) を、 T 2細胞（H L A — A 2 + ) と、 5 % C O ₂ _ 9 5 % A i r の条件下で 3 7 °Cにて 2時間ィンキュベーシヨンし、細胞表面上に発現している H L A— A 2分子に当該各ぺプチドを結合させた。このように各ぺプチドをパルスした T 2細胞を標的細胞として用いた。

エフェクター細胞と細胞数 1 X 1 0⁴の標的細胞とを、様々な混合比で. 5 % C O ₂ - 9 5 % A i r の条件下で 3 7 °Cにて 1 8時間インキュベーシヨンした。ィンキュベーション後の上清 1 0 0 I を回収して、産生された I F N— γ量を E L I S Aにより測定した。このとき、エフエタター細胞を誘導するのに用いたぺプチドと T 2細胞にパルスしたべプチドとが同じものになるように、エフエタター細胞と標的細胞とを組み合わせた。また、対照として H I Vペプチドを用い、 H I Vペプチドをパルスした T 2細胞を認識した C T Lの I F N— γ産生量をバックグランドとして各測定値から減算した。算出された各測定値（N E T) はスチユーデント t検定で統計処理し、 P値が 0. 0 5以下であるものを有意差があると見なした。また、 I F N— γ産生をN E Tで 8 0 p g Zm l 以上かつ有意差をもって促進したぺプチドを陽性と判定した。

その結果、 P S CA 2 1 — 3 0 (配列番号 7 ) 力 5例中 3例の H L A— A 2 +健常人由来 P BMCから I F N— γ産生を促進した。また、 Ρ S C A 7— 1 5 (配列番号 6 ) および P S CA 2 1 — 3 0 (配列番号 7 ) が、それぞれ 1 2例中 5例および 6例の H L A— A 2 +前立腺癌患者由来 P BMCから I F N— o 産生を促進した。すなわち、これらペプチドが、 H L A— A 2 +健常人由来および Zまたは H L A— A 2 ⁺前立腺癌患者由来の P BMCから、 H L A— A 2拘束性 C T Lを誘導することが分かつた。実施例 7

(ぺプチドにより誘導された C T Lの細胞傷害活性） P S C A 7 - 1 5 (配列番号 6 ) および P S CA 2 1 — 3 0 (配列番号 7) により H L A— A 2 ⁺健常人由来または H L A— A 2 +前立腺癌患者由来の P BMCから誘導された C T Lの細胞傷害活性を、前立腺癌細胞を用いて、 I F N— γ産生試験および^{5 1} C r遊離試験で検討した。

まず、 2例の健常人由来または 1例の前立腺癌患者由来の P BMCを、実施例 6 と同様にべプチドで刺激し、エフェクター細胞として用いた。標的細胞には、 H L A— A 2—前立腺癌細胞株 P C 9 3に H L A— A 2遺伝子を常法により導入して発現させた細胞 P C 9 3— A 2を用いた。また対照として、当該 HLA— A 2—前立腺癌細胞を用いた。エフェクター細胞の一部を用いて標的細胞と混合培養した。培養は、 5 % C 0₂— 9 5 % A i r の条件下で 3 7 °Cにて 1 8時間行なった。ィンキュベーション後の上清 1 0 0 a 1 を回収して、産生された I F N— y量を E L I S Aにより測定した。

その結果を表 2に示す。 P S CA 2 1 — 3 0 (配列番号 7 ) と H L A 一 A 2 +健常人由来 P BMCとの培養により、該 P BMC力、らの、 H L A 一 A 2 ⁺前立腺癌細胞に対する I F N— γ産生が促進された。また、 P S C A 7 - 1 5 (配列番号 6 ) と H L A— A 2 +前立腺癌患者由来 P BMC との培養により、該 P BMCからの、 H LA— A 2 +前立腺癌細胞に対する I F N— y産生が促進された。これらの結果は、いずれもスチューデント t検定で統計学的に有意差が認められた。

(以下余白）表 2

次に、前立腺癌患者由来 P BMCを P S C A 7— 1 5 (配列番号 6 ) と共に 1 5 日間培養して刺激し、さらに 1 0 日間培養してェフエクタ一細胞として用い、前立腺癌細胞に対する細胞傷害活性を試験した。前立腺癌細胞は、 P C 9 3— A 2を用いた。対照として P C 9 3を用いた。細胞傷害活性は、標準的な 6時間の^{5 1} C r遊離試験で E/T比 2 0または 4 0で測定し、得られた結果を％特異的溶解で表した。

その結果、 P S C A 7— 1 5 (配列番号 6 ) で刺激した前立腺癌患者由来 P BMCは、 H L A— A 2を発現させた前立腺癌細胞 P C 9 3— A 2を特異的に溶解した（表 3 )。

(以下余白）表 3

これら力ら、 P S CA 7— 1 5 (配列番号 6 ) は、癌患者の P B MC から、 H LA— A 2拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害活性を示す腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞を誘導することが明らかになった。また、 P S C A 2 1 - 3 0 (配列番号 7 ) により、腫瘍細胞に対する癌患者の P BMCからの I F N— 産生が促進されること力、ら、 P S C A 2 1 — 3 0 (配列番号 7 ) も同様に H LA— A 2拘束性に腫瘍細胞を認識して細胞傷害活性を示す腫瘍特異的細胞傷害性 T細胞を誘導すると推定できる ₍ 実施例 8

P S C A由来の H L A— A 2結合モチーフを有するぺプチドについて. これらに対する I g Gクラスの抗ペプチド抗体の、 H LA— A 2 +健常人血清および H L A— A 2 ⁺前立腺癌患者血清中の存在を、実施例 3 と同様に E L I S Aにより測定した。その結果、前立腺癌患者由来 P BMCから H LA— A 2拘束性 C T Lを誘導したペプチドである、 P S C A 2 1 一 3 0 (配列番号 7 ) に対する抗体が、健常人 5例中 5例および前立腺癌患者 1 2例中 9例で検出された（表 4 )。 P S C A 7 - 1 5 (配列番号 6 ) に対する抗体は、健常人 5例おょぴ前立腺癌患者 1 2例のいずれにおいても検出されなかった。産業上の利用可能性

本発明においては、前立腺癌マーカーとして知られている P S A、 P S M A、および P S C Aのアミノ酸配列に基づいてぺプチドを設計して合成し、該ぺプチドのうち前立腺癌患者由来の P B M Cから H L A— A 2拘束性または H L A - A 2 4拘束性の C T Lを誘導するものを同定した。 H L A— A 2対立遺伝子は、日本人の人口の約 4 0 %、中国人の約 5 3 %、北アメリカ白人の約 4 9 %、南アメリカ白人の約 3 8 %、およびアフリカ黒人の約 2 3 %でみられる。 H L A— A 2 4対立遺伝子は日本人の人口の約 6 0 % (多くは、その 9 5 %の遺伝型が A 2 4 0 2である）、白人の約 2 0 %、およびアフリカ人の約 1 2 %で見られる。したがつて、本発明に係るぺプチドは比較的多数の癌患者における特異的免疫治療に適用できる。かくして本発明で提供されるペプチドは、癌の、例えば前立腺癌の治療において極めて有用な手段を提供する。また、本発明に係るぺプチドは、既に報告されている腫瘍抗原ぺプチドと組み合わせて使用することにより、複数種類の腫瘍抗原を認識する細胞集団である C T Lの誘導および/または活性化、並びに癌の多様性に対応できるため、その有用性は高い。配列表フリーテキスト

配列表の配列番号 1 ： H L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S Aのアミノ酸配列から設計されたぺプチド。

配列表の配列番号 2 ： H L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S Aのアミノ酸配列から設計されたぺプチド。

配列表の配列番号 3 ： H L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S M Aのアミノ酸配列から設計されたペプチド。

配列表の配列番号 4 ： H L A— A 2 4拘束性細胞'傷害性 T細胞により認識される、 P S C Aのアミノ酸配列から設計されたぺプチド。配列表の配列番号 5 ： H L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S CAのアミノ酸配列から設計されたペプチド。

配列表の配列番号 6 ： H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S C Aのアミノ酸配列から設計されたぺプチド。

配列表の配列番号 7 ： H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S C Aのアミノ酸配列から設計されたペプチド。

配列表の配列番号 8 ： H L A _ A 2拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S Aのァミノ酸配列から設計されたぺプチド。

配列表の配列番号 9 ： H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S Aのァミノ酸配列から設計されたぺプチド。

配列表の配列番号 1 0 ： H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S Aのァミノ酸配列から設計されたオリゴぺプチド。

配列表の配列番号 1 1 ： H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S M Aのアミノ酸配列から設計されたペプチド。

配列表の配列番号 1 2 ： H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞により認識される、 P S MAのァミノ酸配列から設計されたぺプチド。

Claims

請求の範囲

1 . 配列表の配列番号 1から配列番号 7のいずれか 1 に記載のァミノ酸配列からなるぺプチド。

2 . 配列表の配列番号 1 から配列番号 7のいずれか 1 に記載のァミノ酸配列からなるペプチドであって、細胞傷害性 T細胞に認識されるぺプチド、.およびノまたは細胞傷害性 T細胞を誘導するぺプチド。

3 . 配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1 に記載のァミノ酸配列からなるペプチドであって、 H L A— A 2 4拘束性に細胞傷害性 T細胞に認識されるペプチド、およぴノまたは H L A— A 2 4拘束性に細胞傷害性 T細胞を誘導するぺプチド。

4 . 配列表の配列番号 6または配列番号 7に記载のァミノ酸配列からなるぺプチドであって、 H L A— A 2拘束性に細胞傷害性 T細胞に認識されるペプチド、および/または H L A _ A 2拘束性に細胞傷害性 T細胞を誘導するぺプチド。

5 . 配列表の配列番号 1から配列番号 7のいずれか 1 に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドの少なくとも 1つからなる医薬。

6 . 配列表の配列番号 1 から配列番号 7のいずれか 1 に記載のァミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも 1つからなる癌ワクチン。

7 . 前立腺癌の治療に用いる請求の範囲第 6項に記載の癌ワクチン。

8 . 配列表の配列番号 1から配列番号 7のいずれか 1 に記載のアミノ酸配列からなるぺプチドの少なくとも 1つを含有してなる細胞傷害性

T細胞の誘導剤。

9 . 配列表の配列番号 1 から配列番号 7のいずれか 1 に記載のァミノ酸配列からなるペプチドの少なくとも 1つを使用することを特徴とする細胞傷害性 T細胞の誘導方法。

1 0 . 下記工程を含む細胞傷害性 T細胞の誘導方法；

i ) 配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1 に記載のァミノ酸配列からなるぺプチドと、 H L A— A 2 4を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、

および

ii ) 配列表の配列番号 6または配列番号 7に記載のァミノ酸配列からなるペプチドと、 H L A— A 2を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、

および

iii) 工程 i ) および工程 ii ) で得られた細胞を用いて、細胞傷害性 T細胞の前駆細胞を含む細胞集団を刺激する工程。

1 1. 下記工程を含む細胞傷害性 T細胞の誘導方法；

i ) 配列表の配列番号 1から配列番号 5のいずれか 1 に記载のァミノ酸配列からなるぺプチドと、 H L A— A 2 4を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、

および

1 2. 下記工程を含む細胞傷害性 T細胞の誘導方法；

i ) 配列表の配列番号 6または配列番号 7に記載のァミノ酸配列からなるペプチドと、 H LA— A 2を保持する抗原提示細胞とを培養する工程、

および

1 3. 請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか 1項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。

4. 請求の範囲第 3項に記載のぺプチドおよびまたは H L A— A 2 4分子と相互作用して、少なくとも H L A— A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞による該ぺプチドの認識を増強する化合物の同定方法であつて、請求の範囲第 3項に記載のペプチドおよび請求の範囲第 1 3 項に記載の抗体からなる群より選ばれる少なくとも 1つを用いることを特徴とする同定方法。

1 5. 請求の範囲第 4項に記載のペプチドおよび Ζまたは H LA— Α 2 分子と相互作用して、少なくとも H L Α— Α 2拘束性細胞傷害性 Τ 細胞による該ペプチドの認識を増強する化合物の同定方法であって. 請求の範囲第 4項に記載のぺプチドぉよぴ請求の範囲第 1 3項に記載の抗体からなる群より選ばれる少なくとも 1つを用いることを特徴とする同定方法。

1 6. 請求の範囲第 1 4項または第 1 5項に記載の同定方法により得られた化合物。

1 7. 請求の範囲第 3項に記載のぺプチドの少なくとも 1つに対する、 H L A- A 2 4拘束性細胞傷害性 T細胞よる認識を増強する化合物 _c 1 8. 請求の範囲第 4項に記載のペプチドの少なくとも 1つに対する、 H L A— A 2拘束性細胞傷害性 T細胞よる認識を増強する化合物。

1 9. 請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか 1項に記載のぺプチド、請求の範囲第 1 3項に記載の抗体、および請求の範囲第 1 6項から第 1 8項のいずれか 1項に記載の化合物からなる群より選ばれる少なくとも 1つを含有することを特徴とする癌治療に用いる医薬組成物。

2 0.請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか 1項に記載のペプチドの、または請求の範囲第 1 3項に記載の抗体の、定量的あるいは定性的な測定方法。

2 1. 請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか 1項に記載のペプチドおよび請求の範囲第 1 3項に記載の抗体からなる群より選ばれる少なくとも 1つを含んでなる試薬キット。

. 請求の範囲第 9項から第 1 2項のいずれか 1項に記載の細胞傷害性 T細胞の誘導方法、請求の範囲第 1 4項または第 1 5項に記載の同定方法、または請求の範囲第 2 0項に記載の測定方法に使用する試薬キットであって、請求の範囲第 1項から第 4項のいずれか 1項に記載のぺプチドおよび請求の範囲第 1 3項に記載の抗体からなる群より選ばれる少なくとも 1つを含んでなる試薬キット。