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WO2003044200A1 - Sequence nucleotidique codant pour une enzyme ayant une activite acetolactate synthase de cichorium - Google Patents

Sequence nucleotidique codant pour une enzyme ayant une activite acetolactate synthase de cichorium Download PDF

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Publication number
WO2003044200A1
WO2003044200A1 PCT/FR2002/003968 FR0203968W WO03044200A1 WO 2003044200 A1 WO2003044200 A1 WO 2003044200A1 FR 0203968 W FR0203968 W FR 0203968W WO 03044200 A1 WO03044200 A1 WO 03044200A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleotide sequence
als
plant
mutation
mutated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/003968
Other languages
English (en)
Inventor
Isabelle Scheer-Senyarich
Marie-Christine Quillet
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HOQUET MICHEL
Original Assignee
HOQUET MICHEL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HOQUET MICHEL filed Critical HOQUET MICHEL
Priority to AU2002361323A priority Critical patent/AU2002361323A1/en
Publication of WO2003044200A1 publication Critical patent/WO2003044200A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8278—Sulfonylurea

Definitions

  • NUCLEOTIDE SEQUENCE ENCODING AN ENZYME HAVING ACETOLACTATE CICHORIUM SYNTHASE ACTIVITY
  • the present invention relates to nucleotide sequences associated with herbicide tolerance in plants, in particular of the genus Cichorium.
  • Chicory (Cichorium intybus) is a plant whose early stages of development are slow. Indeed, it does not take less than two months before covering the ground. Culture then finds itself in direct competition with a large number of weeds, which during this period show very active development. In the absence of an effective and selective chicory herbicide, it is frequent to have to proceed to the elimination of the remaining weeds by mechanical hoeing supplemented by manual weeding which generate a very significant additional cost. 15 If the selectivity of a herbicide in relation to a plant results in its non-toxicity (at least for the dose used) towards the latter, specificity designates the categories of plants liable to be destroyed by this product, in a word, its spectrum of activity.
  • a herbicide is therefore all the more effective as it displays a limited selectivity (at best the cultivated plant), a broad specificity and a low persistence, not penalizing for subsequent crops.
  • the alternative is therefore either to develop a new herbicide having the specificity and selectivity characteristics required for a given plant, or to have a plant modified to be tolerant to a known herbicide.
  • the second solution has a certain advantage because it makes it possible to avoid carrying out all of the toxicity tests necessary for the placing on the market of these products.
  • Acetolactate synthase is the first enzyme in the pathway
  • Chicory is not naturally resistant to ALS inhibitors.
  • An objective of the present invention is to obtain mutants of Cichorium intybus resistant to chlorsulfuron (herbicide belonging to the class of sulfonylureas), in particular by in vitro selection of cell suspension in prolonged contact with the herbicide. It is generally accepted that if resistance is linked to the mutation of a "wild" gene, this occurs naturally with a probability of the order of 10 " to 10 " under in vitro culture conditions. The enzymatic analyzes indicate that the acquisition of tolerance is due to the alteration of the sensitivity of the ALS vis-à-vis these inhibitors.
  • the 50% inhibition of ALS activity requires, in the homozygous tolerant, a dose of chlorsulfuron 570 times greater than that producing the same effect in the sensitive (20-25nM).
  • the sensitivity of ALS from the tolerant line to Pimazamethabenz is 125 times lower (Northern Blot, Figure 1). Furthermore, no overproduction of this target was noted.
  • This alteration of ALS is transmitted from generation to generation, like a Mendelian character encoded by a single nuclear gene. Analysis of the genome of homozygous tolerant chicories confirms this monogenic character.
  • the tolerant allele "T”, indifferently designated resistant in this text, is semi-dominant, the sensitive allele "s” is recessive; a homozygote s / s is therefore sensitive to these herbicides.
  • the specific activity of ALS tolerant to sulfonylureas is reduced compared to that of sensitive plants.
  • ALS The activity of ALS is known to be negatively regulated by the end products, valine and leucine, of the biosynthetic pathway that it initiates.
  • the ALS extracted from tolerant chicories has a reduced sensitivity (10 times for leucine and 3 times for valine) to this feedback.
  • a nucleotide sequence according to the invention codes for a functional ALS in the genus
  • Cichorium and with a reduced affinity for the amino acids leucine and valine.
  • acetolactate synthase is an enzyme of 670 amino acids.
  • Two mutation regions confer tolerance to sulfonylureas in different species, a first ALS region A between positions 121 and 209 and a second ALS region B between positions 560 and 665 (Wright et al., 1998, and Figure 6).
  • Document FR 2 765 240 describes a mutation in ALS conferring tolerance in Cichorium between amino acids 377 and 670 Resistance results in Xanthium from the mutation in position 574 of a Trp in Leu (Banasconi et al., 1995, and figure 6).
  • Cichorium (doctoral thesis, 1997), the need remains to know the nucleotide sequence coding for amino acids 1 to 376 of ALS, and the possible mutation or mutations which confer tolerance to herbicides.
  • the inventors therefore sought to identify the complete sequence of natural functional ALS, and the complete sequence of mutated ALS with respect to natural ALS, this or these mutations conferring resistance to herbicides of the sulfonylurea and / or imidazolinone type. .
  • the subject of the invention is, according to a first aspect, an isolated nucleotide sequence corresponding to SEQ ID No. 1 and coding for an acetolactate synthase (ALS) functional in plants of the genus Cichorium.
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 of the ALS of this species corresponds to SEQ ID No. 2.
  • the invention also relates to a nucleotide sequence chosen from: a) a nucleotide sequence comprising at least 70, in particular at least 80% identity with SEQ ID No. 1; b) a nucleotide sequence complementary to SEQ ID No. 1 or a sequence defined in a) or b) or the RNA sequence; c) a nucleotide sequence comprising a sequence as defined in a), or b); , said sequence defined in a), or b) coding for an ALS of sequence SEQ
  • ALS protein By functionally equivalent ALS protein is meant that the biological properties with respect to herbicides, more particularly to sulfonylureas and imidazolinones, are identical or very close to natural non-mutated ALS, either due to an absence of mutation, either in the possible presence of a mutation but without consequence on the sensitivity to these herbicides.
  • the inventors have succeeded in obtaining the sequence of the non mutated ALS between amino acids 103 and 670.
  • the list of the annexed sequences therefore corresponds to sequences starting from amino acid 103. For example SEQ ID N ° 2 is numbered from 1 to 568, which corresponds to amino acids 103 to 670 respectively.
  • nucleic acid nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which are used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or region of a nucleic acid, which may or may not contain unnatural nucleotides, and which may correspond to both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNAs.
  • the nucleic acid sequences according to the invention also include PNA (Peptid Nucleic Acid), or the like.
  • nucleotide sequences in their natural chromosomal environment that is to say in the natural state.
  • sequences which have been isolated and / or purified that is to say that they have been taken directly or indirectly, for example by copying, their environment having been at least partially modified.
  • This also means the nucleic acids obtained by chemical synthesis.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • the term “best alignment” or “optimal alignment” is intended to denote the alignment for which the percentage of identity determined as below is the highest. Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being performed by segment or by “comparison window” to identify and compare local regions of sequence similarity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out, besides manually, by means of the algorithm of local homology of Smith and Waterman (1981, Ad. App. Math. 2: 482), by means of the algorithm of local homology by Neddleman and Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: 443), using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 ), using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
  • the BLAST program is preferably used with the BLOSUM 62 matrix.
  • the PAM or PAM250 matrices can also be used.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences in which the nucleic acid or amino acid sequence to be compared may include additions or deletions compared to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • nucleic acid sequences having a percentage identity of at least 80%, preferably 85% or 90%, more preferably 95% or even 98%, after optimal alignment with a reference sequence is meant the nucleic acid sequences having , with respect to the reference nucleic acid sequence, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion and / or a substitution, in particular punctual, and whose nucleic sequence has at least 80%, preferably 85 %, 90%, 95% or 98% of identity after optimal alignment with the reference nucleic sequence. They are preferably sequences whose complementary sequences are capable of hybridizing specifically with the reference sequences.
  • hybridization or high stringency conditions will be such that they ensure at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% or 98% of identity after optimal alignment between one of the two sequences and the complementary sequence of the other.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA fragments.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotide fragments described above are advantageously as follows.
  • DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) actual hybridization for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C, for a probe of size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C in 2 x SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes at 20 ° C in 0.1 x SSC + 0.1% SDS.
  • the last washing is carried out in 0.1 ⁇ SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. for a probe of size> 100 nucleotides.
  • the conditions of high stringency hybridization described above for a polynucleotide of defined size can be adapted by the skilled person for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook et al., ( 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2 nd Ed. Cold Spring Harbor).
  • the invention relates to an isolated nucleotide sequence characterized in that it corresponds to SEQ ID No.
  • the invention also relates to a nucleotide sequence isolated from a plant of the genus Cichorium chosen from: a) a nucleotide sequence corresponding to SEQ ID No. 3 b) a nucleotide sequence comprising at least 80% identity with SEQ ID No. 3 c) a nucleotide sequence complementary to SEQ ID No.
  • RNA sequence 3 or of a sequence defined in b) or of the RNA sequence d) a nucleotide sequence comprising a sequence as defined in a), b) or c); and in that it codes for a mutated acetolactate synthase having at least one mutation in the amino acid region 103 to 377 of the ALS, the said mutation or mutations conferring on the plant resistance to a herbicide.
  • mutated nucleotide sequence will denote a nucleotide sequence coding for a mutated ALS, that is to say conferring tolerance (indifferently designated resistance) to these herbicides. Such a mutated sequence is typically at least 80% homologous to the non-mutated sequence.
  • the inventors By sequencing the ALS of several sensitive and tolerant individuals, the inventors have in fact demonstrated that the same point mutation was found in the same position on the polypeptide chain, in position 197, giving the plant resistance or very strongly increasing resistance herbicides tested.
  • the mutation in position 197 is a Proline to Serine mutation.
  • the herbicide is chosen from sulfonylureas, imidazolinones.
  • any functionally equivalent mutation in particular due to the structural modification of the ALS due to the substitution of proline also forms part of the invention.
  • Those skilled in the art knowing such an amino acid modification at position 197 deduces the corresponding modification on the nucleotide sequence.
  • the invention also relates to a nucleotide sequence isolated from a plant of the genus Cichorium comprising at least 80% and typically at least 90.95.98.99% of identity with SEQ ID No. 3, said sequence coding for a mutated ALS exhibiting at least one mutation in the region of amino acids 103 to 670, the said mutation or mutations conferring on the plant resistance to herbicides, more particularly to sulfonylureas and / or imidazolinones.
  • the invention relates to a nucleotide sequence which is a representative fragment of a nucleotide sequence, of the natural ALS described above.
  • the invention relates to a nucleotide sequence which is a representative fragment of a nucleotide sequence of the mutated ALS described above.
  • fragment representative of a mutated ALS nucleotide sequence is meant according to a first embodiment a nucleotide sequence usable as a primer for the identification and / or selection of plants of the genus Cichorium resistant to a sulfonylurea or imidazolinone herbicide, of a length of at least 10 bases, typically at least 20 bases, and capable of amplifying a mutated nucleotide sequence described above.
  • fragment representative of a mutated ALS nucleotide sequence is meant according to a second embodiment a nucleotide sequence usable as a probe for the identification and / or selection of plants of the genus Cichorium tolerant to a sulfonylurea or imidazolinone herbicide, and capable of hybridize with a mutated nucleotide sequence described above.
  • a probe or primer is defined, within the meaning of the invention, as being a single-stranded nucleic acid fragment or a denatured double-stranded fragment, and having a specificity of hybridization under conditions determined to form a hybridization complex with a target nucleic acid.
  • the probes and primers according to the invention are marked directly or indirectly with a radioactive or non-radioactive compound, in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the labeling of primers or probes according to the invention is typically carried out by radioactive elements or by non-radioactive molecules.
  • radioactive elements or by non-radioactive molecules.
  • Non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, digoxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemoluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • the invention also relates to the nucleic acids capable of being obtained by amplification using primers according to the invention.
  • polynucleotides of the invention can thus be used as a primer and / or probe in methods using in particular the PCR technique (polymerase chain reaction) (Rolfs et al., 1991, Berlin: Springer-Nerlag) .
  • This technique requires the choice of pairs of oligonucleotide primers framing the fragment which must be amplified.
  • the amplified fragments can be identified, for example after agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography, and then sequenced.
  • the specificity of the amplification can be controlled by using, as primer, the nucleotide sequences of polynucleotides of the invention as template, plasmids containing these sequences or else the derived amplification products.
  • the amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to demonstrate the presence, in a biological sample, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
  • Other techniques for amplifying the target nucleic acid can advantageously be used as an alternative to PCR, so-called PCR-like methods using pairs of primers of nucleotide sequences according to the invention.
  • PCR- like is intended to denote all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or else in which the labeling systems have been amplified.
  • SDA Strand Displacement Amplification
  • strand displacement amplification technique Walker et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 1691
  • TAS Transcription-based Amplification System
  • the cDNA obtained will then serve as a target for the primers or probes used in the amplification or detection method according to the invention. It is thus possible to use the techniques of RT-PCR, of quantitative PCR.
  • the probe hybridization technique can be carried out in various ways (Matthews et al, 1988, Anal. Biochem., 169, 1-25).
  • the most general method consists in immobilizing the nucleic acid extracted from cells of different tissues or from cells in culture on a support designated support immobilization (such as nitrocellulose, nylon, polystyrene) and to incubate, under well-defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. After hybridization, the excess probe is eliminated and the hybrid molecules formed are detected by the appropriate method (measurement of radioactivity, fluorescence or enzymatic activity linked to the probe).
  • the nucleic acid probes according to the invention can be used as capture probes.
  • a probe called a “capture probe”
  • a second probe called a “detection probe” marked by an easily detectable element.
  • the invention relates to a support on which the probes or primers mentioned above are immobilized, covalently or non-covalently.
  • the support can be a DNA chip or a high density filter.
  • DNA chip or high density filter is intended to denote a support on which DNA sequences are fixed, each of which can be identified by its geographic location. These chips or filters differ mainly in their size, the material of the support, and possibly the number of DNA sequences attached to them.
  • the probes or primers can be fixed on solid supports, in particular DNA chips, by various manufacturing methods.
  • a synthesis can be carried out in situ by photochemical addressing or by ink jet.
  • Other techniques consist in carrying out an ex situ synthesis and in fixing the probes on the support of the DNA chip by mechanical, electronic or inkjet addressing. These different methods are well known to those skilled in the art.
  • a nucleotide sequence (probe or primer) according to the invention therefore allows the detection and / or amplification of specific nucleic sequences.
  • the detection of these sequences is facilitated when the probe is fixed to a DNA chip, or to a high density filter.
  • the invention relates to a polypeptide with acetolactate synthase activity of sequence SEQ ID No. 4 comprising the mutation in position 197, or a fragment of said polypeptide, and coded by a mutated nucleotide sequence as described above.
  • a polypeptide or fragment is a polypeptide consisting of the sequence SEQ ID No. 4 or of a sequence having at least 80% identity, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% d with SEQ ID N ° 4 after optimal alignment, and having the mutation in position 197.
  • polypeptide whose amino acid sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably at least 85 %, 90%, 95%, 98% and 99% after optimal alignment with a reference sequence, it is intended to denote the polypeptides having certain modifications compared to the reference polypeptide, such as in particular one or more deletions, truncations, an elongation, a chimeric fusion, and / or one or more substitutions.
  • the variant polypeptides encoded by the variant nucleotide sequences as defined above are preferred, in particular the polypeptides whose amino acid sequence has at least one corresponding mutation in particular to a truncation, deletion, substitution and / or addition of at least one amino acid residue with respect to the sequences SEQ ID No. 4 or with one of their fragments.
  • the invention relates to a process for obtaining a Cichorium plant resistant to a sulfonylurea or imidazolinone herbicide comprising the selection of plants comprising at least one mutation in the region 103 to 670, in particular 103 to 377 of l acetolactate synthase, more specifically a mutation in position 197.
  • the invention relates to a method for the qualitative detection of a plant of the genus Cichorium tolerant to a sulfonylurea or imidazolinone herbicide comprising a step of demonstration in a tested plant of a mutated nucleotide sequence (mutation in position 197 of ALS) as described above.
  • this method comprises the following steps: a) optionally, isolation of the DNA from the biological sample to be analyzed, or obtaining a cDNA from the RNA of the biological sample; b) specific amplification of the isolated DNA using at least one primer as described above; c) highlighting of the amplification products.
  • this detection can be carried out using primers, corresponding to fragments located respectively on either side of the identified mutation characteristic of tolerance or resistance.
  • the invention relates to a process for obtaining, within the framework of a conventional selection program, a plant of the genus Cichorium resistant to a sulfonylurea or imidazolinone herbicide comprising the selection of plants comprising at least one mutation in the region. 103 to 670, in particular 103 to 377, of acetolactate synthase, more especially a mutation in position 197.
  • the invention relates to a method for distinguishing a sensitive plant homozygous (s / s), from a plant homozygous (T / T) or heterozygous (T / s) tolerant to herbicides of the sulfonylureas group and imidazolinones.
  • this method of distinction comprises a step in which it is demonstrated, from DNA extracted from a plant which it is desired to test, the presence, on one or two alleles, of a mutated nucleotide sequence ( mutation conferring tolerance / resistance) according to the invention.
  • a mutated nucleotide sequence mutation conferring tolerance / resistance
  • this method of distinction comprises the analysis of the alleles of the ALS gene, making it possible to distinguish the sensitive allele (not mutated in position 197) from the resistant allele (mutated in position 197).
  • an SSCP or similar method is used. Tools of the kit type or the like capable of implementing these methods, in particular with reagents necessary for PCR amplification, also form part of the invention.
  • this method of distinction comprises the determination of the enzymatic activity of ALS in the presence of herbicide and in particular more particularly of sulfonylurea, the level of activity of ALS being directly correlated to the genotype of the individual.
  • the residual enzymatic activity is around 30% for sensitive homozygous individuals, around 60 to 70%> for tolerant heterozygotes, and around 100% for tolerant homozygotes.
  • An enzyme encoded by the mutated sequences according to the invention having a reduced affinity for the attachment of herbicides from the group of sulfonylureas and imidazolinones, called in the following ALS-, is also included in the invention.
  • a plant cell comprising a nucleotide sequence as defined above, with the elements necessary for the expression of said sequence and / or comprising an ALS- enzyme, constitutes another object of the invention.
  • Such a cell has an increased concentration of leucine, isoleucine and valine relative to the concentration of these amino acids in a wild cell; this results from the decrease in sensitivity of ALS- to feedback by these amino acids.
  • This plant cell preferably contains at least part of the genome of the genus Cichorium, in particular of Cichorium intybus.
  • calluses tolerant to chlorsulfuron initiated from cell suspensions, were selected on culture medium containing 28 nM of chlorsulfuron (lethal dose for unselected chicories). The latter have enabled the regeneration of fertile plants capable of withstanding doses of herbicides 1,500 to 2,000 times higher for tolerant individuals homozygous, and 300 times higher for individuals heterozygous. In the absence of herbicide, no cost consecutive to the acquisition of tolerance is measurable, as much on vegetative development, as on the reproductive potential of the tolerant line.
  • the subject of the invention is therefore also a plant which contains a mutated nucleotide sequence as defined above, an ALS- enzyme or a plant cell containing the elements explained above, said plant being tolerant to herbicides from the group of sulfonylureas and imidazolinones .
  • the invention also relates to a process for weeding plants using a herbicide inhibiting the ALS enzyme, in which the plant comprises a mutated nucleotide sequence as defined above coding for an ALS- enzyme, an ALS enzyme - or a cell as defined above.
  • FIG. 1 A: Comparison of the ALS protein contents in wild (S) and tolerant (T) strains. The amount of total protein deposited in each condition is indicated in ⁇ g.
  • Figure 2 Inhibition of the ALS enzyme activity extracted from sensitive, tolerant and heterozygous plants (sensitive female x tolerant male), by chlorsulfuron. The values are expressed as a percentage of the untreated controls, and represent the average of the results obtained in three independent experiments.
  • Figure 3 Effect of increasing concentration of imadazolinone-imazamethabenz on the ALS activity extracted from wild-type chicory and tolerant to chlorsulfuron. The values, expressed as a percentage of the untreated controls, on the average of the results obtained with two different enzymatic preparations.
  • Figure 4 Consequence of the mutation on the feedback of ALS by the branched chain amino acids.
  • the sensitivity of ALS extracted from chicory tolerant to chlorsulfuron and wild type to inhibition by feedback by each of the three branched amino acids was evaluated by measuring the enzymatic activity in the presence of increasing concentrations of isoleucine, leucine and valine. The results, expressed as a percentage of untreated controls, are the means of data obtained in three independent experiments.
  • Figure 5 Intraspecific polymorphism: comparison of sequences between fragments of genes coding for ALS, coming from sensitive and tolerant lines of Cichorium intybus (nt 309 to nt 2015, ie 85% "of the gene coding for ALS).
  • the positioning of the primers ALS-L1 and ALS-R1 corresponds to the nucleotide sequences on a gray background. These primers were used to obtain the 5 'part of the ALS gene.
  • the nucleotide sequences of the primers ALS-L2 and ALS-R2 are boxed. These primers were used to obtain the 3 'part of the ALS gene.
  • nucleotide sequences of the primers ALS-L3 and ALS-R3 used to differentiate sensitive individuals from tolerant individuals homozygous and heterozygous by the SSCP technique are underlined
  • Region A and Region B Mutating regions conferring tolerance to sulfonylureas in different plant species (Wright et al., Weed Sci. 46, 13-23, 1998)
  • Figure 7 Comparison of two methods (assay of the enzymatic activity of ALS and SSCP analysis) which make it possible to distinguish in Cichorium intybus individuals who are sensitive homozygotes (s / s), tolerant homozygotes (T / T) and tolerant heterozygotes ( T / s) to sulfonylureas on 44 F2 plants treated with sulfonylureas and the sensitive parent MS8 of the F2 progeny. 1) Main results obtained from Cichorium intybus L.
  • example 1 obtaining a natural line resistant to chlorsulfuron
  • example 2 a method for characterizing resistance to chlorsulfuron
  • example 3 l of the mutated ALS sequence
  • example 4 a method of distinguishing individuals sensitive and tolerant to sulfonylureas
  • Young seedlings from aseptic germination of achenes were used to obtain this line.
  • the cotyledons are lacerated and deposited on a static liquid medium until calogenic explants are obtained. Then these explants are placed in a liquid medium with stirring. These explants are removed as the subcultures continue until only a heterogeneous suspension remains (cells and minicals). It is only when the cultures are stabilized, with a delay of 10-15 days between transplanting, that the selection can begin.
  • the calluses and the cells are spread on an agar medium containing the herbicide, as well as on a non-selective medium.
  • the non-necrotic cell clusters in the presence of the herbicides are subcultured on a selection medium of the same composition. This operation is repeated until it is possible to select cells capable of multiplying normally in the presence of herbicide. These cultures are then deposited on a selective medium with control cells which have never undergone selection pressure so as to compare the behavior of sensitive strains or those supporting the herbicide.
  • Vitroplants are then produced by holding the calluses on the induction media until they form meristematic nodules and then transplanting onto a bud development medium.
  • the young vitroplants once rooted are removed and transplanted in mini greenhouses.
  • Seeds obtained from chicory of the wild type, homozygous resistant to chlorsurfuron (RI OK) and heterozygote (obtained by pollination of wild type plants with pollen RI OK) were surface sterilized for 15 min in an aqueous chloride solution 0.1% mercuric), rinsed three times with sterile distilled water and germinated on agarized Heller salts (Heller, 1953) containing 20 g / l of sucrose.
  • the seedlings are cultivated at 22 ⁇ 1 ° C, at a rate of 16 hours of day (250 ⁇ E m-2 s-1 density of the photosynthetic fluid) and 8 hours of night. After one month, the plants are harvested and used for RNA extraction and enzyme analysis.
  • ALS activity was extracted and assayed as described by Forlani et al (Plant Growth Regul. 14, 203-209, 1994). Briefly, 5 g of leaves are reduced to powder in liquid nitrogen and resuspended in 5 ml.g-1 of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.5 mM dithiothreitol, 1 mM MgC12, 0.1 mM thiamine pyrophosphate (TPP), 0.01 mM flavin adenine dinucleotide (FAD), 20%) of glycerol and 2% (w / v) of polyvinyl polypyrrolidone.
  • 50 mM phosphate buffer pH 7.5
  • TPP 0.1 mM thiamine pyrophosphate
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • the chicory probe used for the detection of the ALS transcript was generated by PCR, with primers homologous to the gene sequence on tobacco A, comprising positions 1274 to 1295 and 1883 to 1902 (Mazur et al, Plant Physiol. 85, 1110-1117, 1987).
  • the 630 bp fragment obtained was cloned into the PCRTM II vector (Invitrogene) using standard cloning procedures and sequenced by the dideoxy termination procedure (Sanger et al, 1977, Proc Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463- 5467, 1977).
  • the probe was labeled with 32P using the T7-Quick-Prime kit (promega) according to the manufacturer's instructions. Hybridization was performed at 60 ° C. The autoradiograms were analyzed on a Microtek Color / GaryTM densitometer (Biorad) and the data processed with the Cricket GraphTM program.
  • Example 3 Isolation of the sequence of 1 "mutated ALS, and identification of a mutation in position 197 conferring the tolerance - Plant material used
  • a cross was made within Cichorium intybus between an industrial sterile male chicory gene sensitive to sulfonylureas (MS8, Ets FLORIMOND DESPREZ) and an endive chicory of the RI OK line homozygous resistant to sulfonylureas (Ets HOQUET Seeds), the aim being to transfer the trait for resistance to sulfonylureas from the endive cultigroup to that of industrial chicory.
  • An F2 progeny was obtained and treated with sulfonylureas at the rate of 30g / ha of Glean (70% chlorsulfuron, Du Pont).
  • chicory genomic DNA is carried out using the “Dneasy plant mini kit” sold by Qiagen. Fifty mg of leaves are crushed and the elution after passage through a Qiagen column is done in 2 x 100 ⁇ l of buffer. b) Obtaining the 5 ′ part of the gene by PCR.
  • ALS-L1 degenerate sense primer
  • the antisense sequence (ALS-Rl) was determined from the partial chicory ALS sequence obtained by Eric Dewaele, clone DCIALSEB32 (Acquisition of resistance to sulfonylureas in a chicory strain (Cichorium intybus L. var. Witloof) and consequences on the metabolism of branched chain amino acids, Doctoral thesis, University of Sciences and Technologies of Lille, 1997).
  • Antisense primer (ALS-Rl):
  • the PCR was carried out in a final volume of 20 ⁇ l containing 0.2 ⁇ M of each of the 2 primers ALS-Ll and ALS-Rl, 1 mM of MgCl 2 , 0.1 mM of dNTP, 1 ng chicory genomic DNA, 0.6 U of Taq polymerase Appligene (15 U / ⁇ l) and PCR buffer x 1.
  • the reaction mixture was incubated in a thermocycler (PE 9600, Perkin Elmer) for 40 cycles including for each cycle 1 min of denaturation at 94 ° C, 1 min of hybridization at 52 ° C and 1 min of elongation at 72 ° C.
  • sequence reactions were carried out according to the Sanger method using the “ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Core Kit” kit (Perkin Elmer).
  • the primers were labeled with 1TRD-800, a fluorescent compound.
  • c) Obtaining the 3 ′ part of the gene by PCR.
  • ALS-L2 sense (ALS-L2) and antisense (ALS-R2) primers were determined from the partial sequence of chicory ALS obtained by Eric Dewaele, clone DCIALSEB32.
  • Antisense primer (ALS-R2):
  • ALS-L2 and ALS-R2 on DNA from a sensitive chicory (MS8) and 6 F2 tolerant chicories, under the same conditions as above but for 30 cycles and at a hybridization temperature of 55 ° C.
  • the PCR fragments obtained of 850 bp, corresponding to the expected size, were cloned into the vector pGEM-T Easy. Two clones containing MS8 susceptible plant DNA and 4 clones per F2 tolerant plant were sequenced.
  • EXAMPLE 4 Distinction Methods in Cichorium intybus of Sensitive Individuals, Tolerant Homozygotes and Heterozygotes Tolerant to Sulphonylureas a) Colorimetric determination of the residual enzymatic activity of ALS in the presence of chlorsulfuron. The extraction and the assay of the activity of the ALS were carried out according to the method described in Example 2 on fresh leaves one month old, b) Analysis of the polymorphism of the ALS by SSCP. Principle: The SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) method makes it possible to distinguish the alleles of a gene when these present point differences at the nucleotide level.
  • SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
  • Sense primer (ALS-L3) 5'-CTAACCCGGTCAAGCATCAT-3 'Antisense primer (ALS-R3): 5' -CGGAAGAGGCGAGATGAAA-3 'PCR reactions were performed with the two primers ALS-L3 and ALS-
  • the separation time is 3000 Vh for a fragment of 300 bp. After migration, the bands were revealed with silver nitrate according to the method of Bassam et al. (Anal. Biochem. 196, 80-83, 1991). 2. Results and discussion
  • the first elements taken into consideration are the quantity of messenger RNA-ALS and the level of specific activity ALS.
  • Northern blot experiments with both susceptible and resistant plants did not show a substantial difference between the two lines ( Figure 1).
  • the enzymatic analysis revealed a significant difference as regards the specific activity ALS, which is 12.2 +/- 1.1 pkat.mg-1 of total protein in the wild type and 7.9 + / - 0.8 pkat.mg-1 protein in resistant plants.
  • These results exclude the possibility that resistance is derived partially or completely from an increase in ALS levels.
  • resistant plants do not show a reduction or alteration in vegetative or reproductive characteristics. Since the level of mRNA is not changed, a possible explanation for this reduction could be the occurrence of a mutation affecting the stability of the enzyme.
  • the homozygous ALS activity of resistant and sensitive plants was assayed in the presence of increasing concentrations of chlorsulfuron.
  • the results showed that ALS from resistant plants is not inhibited up to herbicide concentrations on the order of micromolar, whereas that from wild plants was already affected by nanomolar levels (Figure 2).
  • the concentration required to inhibit 50% of the ALS activity of resistant plants is 12 ⁇ M, while the ID50 for the enzyme of wild type plants is 0.021 ⁇ M, corresponding to a difference of 570 times.
  • Such markedly different behaviors strongly suggest a decreased sensitivity of ALS to the inhibitory effect of chlorsulfuron as a determinant of the selected tolerance.
  • ALS was also extracted from heterozygous chicory obtained by pollination of sensitive plants with RI OK pollen, and the enzymatic activity was measured in the presence of the herbicide. Results show a biphasic profile intermediate between wild type and homozygous profiles resistant ( Figure 2), indicating the concurrent presence of a resistant form of ALS with a sensitive form, and that the character of resistance to chlorsulfuron is inherited semi-dominantly.
  • the enzyme resistant to chlorsulfuron shows cross tolerance towards the herbicide imidazolinone: imazamethabenz.
  • the ALS activity of wild type and resistant type respectively was measured in the presence of increasing concentrations of imazamethabenz.
  • the ALS activity of resistant plants has not been affected at concentrations of up to 10 ⁇ M, the ID50 being approximately 200 ⁇ M, while that for ALS from plants wild type, activity was inhibited by 50%) at 1.8 ⁇ M.
  • the RI OK line thus appears to have an ALS activity which is also 125 times more resistant to a herbicide belonging to another class of ALS inhibitors.
  • the difference in the level of resistance to chlorsulfuron and imazamethabenz is apparently consistent with the existence of a single mutation site with specific binding domains overlapping.
  • Branched chain amino acids modulate their own synthesis by cooperatively inhibiting the first enzyme in their biosynthetic pathway.
  • ALS activity was thus measured in extracts from wild type plants and RI OK in the presence of increasing concentrations of valine, leucine, or isoleucine.
  • valine and leucine markedly decrease the activity of wild type ALS with similar inhibition rates (ID50 about 1 mM) while isoleucine, which controls the flow of carbon through its pathway at threonine deaminase is substantially ineffective (ID50 greater than 100 mM; Figure 4).
  • the only difference between sensitive and tolerant alleles is located at position 591 where a Cytosine (C) for the sensitive allele is mutated into Thymine (T) for the tolerant allele, which causes a change in amino acid level of a proline (P) into serine (S) at position 197.
  • C Cytosine
  • T Thymine
  • S serine
  • the chicory ALS sequence has been aligned with those of other plants ( Figure 6).
  • the closest ALS sequence to chicory is that of lettuce. This substitution is also found in the same place (position 197) in Lactuca sativa (Eberlein et al., Weed Sci. 47, 383-392, 1999) and L. seriola (Guttieri et al., Weed Sci. 40, 670 -678, 1992) but the proline (P) in the sensitive individual is mutated to histidine (H) in the tolerant homozygous individual.
  • chicory ALS gene does not contain an intron like the ALS genes of Arabidopsis thaliana, Bassia scoparia, beetroot, Brassica napus, cotton, lettuce and tobacco. This would appear to be the case for all ALS genes.
  • plant F2 No. 11 although having survived the sulfonylurea treatment, appears from this sensitive homozygous test (s / s) because it has the two alleles bb.
  • plant F2 n ° l 1 has a sensitive homozygous genotype (s / s) whatever the detection method used. She "escaped" Glean treatment, possibly due to a poor distribution of the herbicide.
  • the molecular method has a number of advantages over the enzymatic method: it is safe, faster, can be performed on elderly individuals and DNA can be extracted from dried leaves. This molecular test can be performed routinely on a large number of individuals.

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Abstract

La présente invention concerne une séquence nucléotidique codant pour une enzyme ayant une activité acétolactate synthase (ALS), fonctionnelle dans le genre Cichorium, caractérisée en ce que ladite enzyme présente une affinité réduite pour les composés du type sulfonylurée ou imidazolinone. Elle concerne également une enzyme codée par cette séquence, une cellule végétale ou une plante les contenant. L'invention a aussi pour objet une méthode de détection d'une plante tolérante aux herbicides, ainsi qu'un procédé de désherbage de plantes.

Description

(54) Titre : SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE CODANT POUR UNE ENZYME AYANT UNE ACTIVITE ACETOLACTATE SYNTHASE DE CICHORIUM
SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE CODANT POUR UNE ENZYME AYANT UNE ACTIVITE ACETOLACTATE SYNTHASE DE CICHORIUM
5 La présente invention se rapporte à des séquences nucléotidiques associées à une tolérance aux herbicides chez des plantes, en particulier du genre Cichorium.
La chicorée (Cichorium intybus) est une plante dont les premiers stades de développement sont lents. En effet, il ne lui faut pas moins de deux mois avant de couvrir le sol. La culture se trouve, alors, en compétition directe avec un 10 nombre important d'adventices, qui, durant cette période, présentent un développement très actif. En l'absence d'un herbicide efficace et sélectif de la chicorée, il est fréquent de devoir procéder à l'élimination des adventices restants par binage mécanique complété par un sarclage manuel qui engendrent un surcoût très important. 15 Si la sélectivité d'un herbicide par rapport à une plante se traduit par sa non toxicité (au moins pour la dose utilisée) envers cette dernière, la spécificité désigne, elle, les catégories de plantes susceptibles d'être détruites par ce produit, en un mot son spectre d'activité.
Un herbicide est donc d'autant plus efficace qu'il affiche une 20 sélectivité restreinte (au mieux la plante cultivée), une spécificité large et une persistance faible, non pénalisante pour les cultures ultérieures.
L'alternative est donc soit de mettre au point un herbicide nouveau, possédant les caractéristiques de spécificité et de sélectivité requises pour une plante donnée, soit de disposer d'une plante modifiée pour être tolérante à un herbicide 25 connu.
La seconde solution présente un avantage certain car elle permet d'éviter de mener l'ensemble des tests de toxicité nécessaires pour la mise sur le marché de ces produits.
L' acétolactate synthase (ALS) est la première enzyme de la voie de
30 biosynthèse des acides aminés branchés Val, Leu et Ile. Quatre classes d'herbicides inhibent cette enzyme, comprenant les imidazolinones, les triazolopyrimidine sulfoanilides, les pyrimidinylthiobenzoates et les sulfonylurées. Ces herbicides sont largement utilisés car ils ont une efficacité importante (quelques grammes à l'hectare suffisent), un large spectre d'activité et une faible toxicité vis-à-vis des mammifères.
La chicorée n'est pas naturellement résistante aux inhibiteurs de l'ALS. Un objectif de la présente invention est d'obtenir des mutants de Cichorium intybus résistants au chlorsulfuron (herbicide appartenant à la classe des sulfonylurées), notamment par sélection in vitro de suspension cellulaire en contact prolongé avec l'herbicide. Il est généralement admis que si une résistance est liée à la mutation d'un gène « sauvage », celle-ci se réalise naturellement avec une probabilité de l'ordre de 10" à 10" dans des conditions de culture in vitro. Les analyses enzymatiques indiquent que l'acquisition de la tolérance est due à l'altération de la sensibilité de l'ALS vis-à-vis de ces inhibiteurs. L'inhibition de 50 % de l'activité ALS nécessite, chez le tolérant homozygote une dose de chlorsulfuron 570 fois supérieure à celle produisant le même effet chez le sensible (20-25nM). La sensibilité de l'ALS issue de la lignée tolérante vis-à-vis de Pimazaméthabenz est 125 fois plus faible (Northern Blot, figure 1). Par ailleurs, aucune surproduction de cette cible n'a été constatée. Cette altération de l'ALS se transmet de génération en génération, comme un caractère mendélien codé par un gène nucléaire unique. L'analyse du génome des chicorées tolérantes homozygotes confirme ce caractère monogénique. L'allèle tolérant « T », indifféremment désigné résistant dans ce texte, est semi-dominant, l'allèle sensible « s » est récessif ; un homozygote s/s est donc sensible à ces herbicides. L'activité spécifique de l'ALS tolérante aux sulfonylurées est diminuée par rapport à celle de plantes sensibles.
L'activité de l'ALS est connue pour être régulée négativement par les produits finaux, valine et leucine, de la voie de biosynthèse qu'elle initie. L'ALS extraite des chicorées tolérantes présente une diminution de la sensibilité (10 fois pour la leucine et 3 fois pour la valine) à ce rétrocontrôle. Ainsi une séquence nucléotidique selon l'invention code pour une ALS fonctionnelle dans le genre
Cichorium et présentant une affinité réduite pour les acides aminés leucine et valine.
Des travaux antérieurs ont montré que l' acétolactate synthase est une enzyme de 670 acides aminés. Deux régions de mutation confèrent une tolérance aux sulfonylurées chez différentes espèces, une première région A de l'ALS entre les positions 121 et 209 et une deuxième région B de l'ALS entre les positions 560 et 665 (Wright et al., 1998, et figure 6). Le document FR 2 765 240 décrit une mutation de l'ALS conférant une tolérance chez Cichorium entre les acides aminés 377 et 670 La résistance résulte chez Xanthium de la mutation en position 574 d'un Trp en Leu (Banasconi et al., 1995, et figure 6). En outre, au vu des travaux déjà réalisés par Dewaele sur l'ALS de
Cichorium (thèse de doctorat, 1997), le besoin demeure de connaître la séquence nucléotidique codant pour les acides aminés 1 à 376 de l'ALS, et la ou les mutations éventuelles qui confèrent la tolérance aux herbicides. Les inventeurs ont donc cherché à identifier la séquence complète de l'ALS fonctionnelle naturelle, et la séquence complète de l'ALS mutée par rapport à l'ALS naturelle, cette ou ces mutations conférant la résistance aux herbicides du type sulfonylurée et/ou imidazolinone.
A cet effet l'invention a pour objet selon un premier aspect une séquence nucléotidique isolée correspondant à SEQ ID N°l et codant pour une acétolactate synthase (ALS) fonctionnelle dans les plantes du genre Cichorium. La séquence en acides aminés déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID N°l de l'ALS de cette espèce correspond à SEQ ID N°2.
L'invention concerne aussi une séquence nucléotidique choisie parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 70, notamment au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l ; b) une séquence nucléotidique complémentaire de la SEQ ID N°l ou d'une séquence définie en a) ou b) ou de la séquence ARN ; c) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), ou b) ; , ladite séquence définie en a), ou b) codant pour une ALS de séquence SEQ
ID N°2 ou une séquence polypeptidique fonctionnellement équivalente.
Par protéine ALS fonctionnellement équivalente on entend que les propriétés biologiques vis-à-vis des herbicides, plus spécialement aux sulfonylurées et aux imidazolinones, sont identiques ou très proches de l'ALS naturelle non mutée, soit en raison d'une absence de mutation, soit en présence éventuelle d'une mutation mais sans conséquence sur la sensibilité à ces herbicides. Les inventeurs ont réussi à obtenir la séquence de l'ALS non mutée entre les acides aminés 103 et 670. La liste des séquences annexées correspond donc à des séquences à partir de l'acide aminé 103. Par exemple SEQ ID N°2 est numérotée de 1 à 568, ce qui correspond aux acides aminés 103 à 670 respectivement. Le décalage est donc de 102 acides aminés, ainsi la mutation en position 197 de l'ALS mutée citée par la suite se retrouve en position (197-102=95) sur SEQ ID N°2 (c'est à dire Pro pour l'ALS non mutée et Ser sur l'ALS mutée référencée SEQ ID N°4).
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui sont employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues.
Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci- après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: 443), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 % ou 90 %, de façon plus préférée 95 % voire 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences de référence. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre. Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation ADN- ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).
Grâce aux techniques décrites plus loin dans la demande qui permettent de mesurer l'activité ALS, l'homme du métier dispose des données appropriées pour identifier directement sans effort excessif les acides nucléiques correspondant aux homologies mentionnées ci-dessus. Par ailleurs, les inventeurs effectuant le clonage de 85% du gène de l'ALS à partir de l'acide aminé 103 ont identifié une mutation ponctuelle conférant la résistance aux sulfonylurées de la lignée étudiée. Jusqu'à présent la séquence du gène de l'ALS chez la chicorée entre les acides aminés 103 et 377 n 'était pas connue. Ainsi, selon un deuxième aspect l'invention concerne une séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle correspond à SEQ ID N°3 et code pour une acétolactate synthase (ALS) mutée présentant au moins une mutation dans la région des acides aminés 103 à 377 de l'ALS, la ou lesdites mutations conférant à la plante une résistance à un herbicide. Aucune mutation conférant ladite résistance chez la chicorée n'avait pour l'heure été identifiée et ce résultat très utile a été obtenu par les inventeurs grâce aux travaux non évidents pour l'homme du métier décrits plus loin. L'invention concerne aussi une séquence nucléotidique isolée d'une plante du genre Cichorium choisie parmi : a) une séquence nucléotidique correspondant à SEQ ID N°3 b) une séquence nucléotidique comportant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°3 c) une séquence nucléotidique complémentaire de la SEQ ID N°3 ou d'une séquence définie en b) ou de la séquence ARN d) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b) ou c) ; et en ce qu'elle code pour une acétolactate synthase mutée présentant au moins une mutation dans la région des acides aminés 103 à 377 de l'ALS, la ou lesdites mutations conférant à la plante une résistance à un herbicide.
Dans la suite de la description on désignera par le terme séquence nucléotidique mutée une séquence nucléotidique codant pour une ALS mutée c'est à dire conférant la tolérance (indifféremment désignée résistance) à ces herbicides. Une telle séquence mutée est typiquement homologue d'au moins 80% à la séquence non mutée.
En séquençant l'ALS de plusieurs individus sensibles et tolérants, les inventeurs ont en effet démontré qu'une même mutation ponctuelle était retrouvée en même position sur la chaîne polypeptidique, en position 197, conférant à la plante une résistance ou augmentant très fortement la résistance aux herbicides testés. Selon un mode de réalisation préféré, la mutation en position 197 est une mutation Proline vers Serine. L'herbicide est choisi parmi les sulfonylurées, les imidazolinones.
Toutefois, toute mutation fonctionnellement équivalente (en particulier du fait de la modification de structure de l'ALS due à la substitution de la proline) fait également partie de l'invention. L'homme du métier connaissant une telle modification d'acide aminé en position 197 en déduit la modification correspondante sur la séquence nucléotidique.
En outre, l'invention concerne aussi une séquence nucléotidique isolée d'une plante du genre Cichorium comportant au moins 80% et typiquement au moins 90,95,98,99 % d'identité avec SEQ ID N°3, ladite séquence codant pour une ALS mutée présentant au moins une mutation dans la région des acides aminés 103 à 670, la ou lesdites mutations conférant à la plante une résistance aux herbicides, plus spécialement aux sulfonylurées et/ou aux imidazolinones. Selon un autre aspect l'invention concerne une séquence nucléotidique qui est un fragment représentatif d'une séquence nucléotidique, de l'ALS naturelle décrite précédemment.
Selon un autre aspect l'invention concerne une séquence nucléotidique qui est un fragment représentatif d'une séquence nucléotidique de l'ALS mutée décrite précédemment. Par fragment représentatif d'une séquence nucléotidique de l'ALS mutée on entend selon une première réalisation une séquence nucléotidique utilisable comme amorce pour l'identification et/ou la sélection de plantes du genre Cichorium résistantes à un herbicide sulfonylurée ou imidazolinone, d'une longueur d'au moins 10 bases, typiquement d'au moins 20 bases, et apte à amplifier une séquence nucléotidique mutée décrite précédemment.
Par fragment représentatif d'une séquence nucléotidique de l'ALS mutée on entend selon une deuxième réalisation une séquence nucléotidique utilisable comme sonde pour l'identification et/ou la sélection de plantes du genre Cichorium tolérantes à un herbicide sulfonylurée ou imidazolinone, et apte à s'hybrider avec une séquence nucléotidique mutée décrite précédemment.
Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acide nucléique simple brin ou un fragment double brin dénaturé, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible.
Selon une réalisation, les sondes et amorces selon l'invention sont marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé typiquement par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le P, le P, le S, le H ou le I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention.
Les polynucléotides de l'invention mentionnés précédemment peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (Rolfs et al., 1991, Berlin : Springer-Nerlag) . Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. Ν° 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtra-ion sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorce les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention comme matrice, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR, méthodes dites PCR-like à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR- like on entend désigner toutes les méthodes mettant en œuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20 : 1691), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1173), la technique 3SR (Self- Sustained Séquence Replication) décrite par Guatelli et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991, J. Virol. Methods, 35, 273), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. (1988, Science 241, 1077), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992, Kessler C. Springer Nerlag, Berlin, New- York, 197-205), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. (1990, Biotechniques, 9, 142), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. (1983, J. Mol. Biol., 171, 281). Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées. Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en œuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. Il s'agit en l'occurrence de l'ARNm de l'ALS de l'échantillon de plante analysé. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention. On peut ainsi utiliser les techniques de RT-PCR, de PCR quantitative.
Concernant l'utilisation de sondes, la technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al, 1988, Anal. Biochem., 169, 1- 25). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support désigné support d'immobilisation (tel que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Selon une réalisation particulière, les sondes nucléiques selon l'invention peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable.
Selon un autre aspect l'invention concerne un support sur lequel sont immobilisées les sondes ou amorces mentionnées précédemment, de manière covalente ou non covalente. En particulier, le support peut être une puce à ADN ou un filtre à haute densité.
On entend désigner par puce à ADN ou filtre haute densité, un support sur lequel sont fixées des séquences d'ADN, chacune d'entre elles pouvant être repérée par sa localisation géographique. Ces puces ou filtres diffèrent principalement par leur taille, le matériau du support, et éventuellement le nombre de séquences d'ADN qui y sont fixées.
On peut fixer les sondes ou amorces sur des supports solides, en particulier les puces à ADN, par différents procédés de fabrication. En particulier, on peut effectuer une synthèse in situ par adressage photochimique ou par jet d'encre. D'autres techniques consistent à effectuer une synthèse ex situ et à fixer les sondes sur le support de la puce à ADN par adressage mécanique, électronique ou par jet d'encre. Ces différents procédés sont bien connus de l'homme du métier.
Une séquence nucléotidique (sonde ou amorce) selon l'invention permet donc la détection et/ou l'amplification de séquences nucléiques spécifiques. En particulier, la détection de ces séquences est facilitée lorsque la sonde est fixée sur une puce à ADN, ou à un filtre haute densité.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un polypeptide à activité acétolactate synthase de séquence SEQ ID N°4 comprenant la mutation en position 197, ou un fragment dudit polypeptide, et codé par une séquence nucléotidique mutée telle que décrite précédemment. Un tel polypeptide ou fragment est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N° 4 ou d'une séquence possédant au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité avec la SEQ ID N° 4 après alignement optimal, et possédant la mutation en position 197. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions. Parmi les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec les séquences SEQ ID N° 4 ou avec l'un de leurs fragments selon l'invention, on préfère les polypeptides variants codés par les séquences nucléotidiques variantes telles que précédemment définies, en particulier les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, délétion, substitution et/ou addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport aux séquences SEQ ID N°4 ou avec l'un de leurs fragments.
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un procédé d'obtention d'une plante Cichorium résistante à un herbicide sulfonylurée ou imidazolinone comprenant la sélection de plantes comprenant au moins une mutation dans la région 103 à 670, notamment 103 à 377 de l' acétolactate synthase, plus spécialement une mutation en position 197.
L'invention concerne selon un autre aspect un procédé de détection qualitative d'une plante du genre Cichorium tolérante à un herbicide sulfonylurée ou imidazolinone comprenant une étape de mise en évidence dans une plante testée d'une séquence nucléotidique mutée (mutation en position 197 de l'ALS) telle que décrite précédemment.
Selon une réalisation ce procédé comprend les étapes suivantes: a) éventuellement, isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l' ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique de l'ADN isolé à l'aide d'au moins une amorce telle que décrite précédemment ; c) mise en évidence des produits d'amplification.
Selon un mode de réalisation, cette détection peut être effectuée à l'aide d'amorces, correspondant à des fragments situés respectivement de part et d'autre de la mutation identifiée caractéristique de la tolérance ou résistance.
L'invention concerne selon un autre aspect un procédé d'obtention dans le cadre d'un programme de sélection classique d'une plante du genre Cichorium résistante à un herbicide sulfonylurée ou imidazolinone comprenant la sélection de plantes comprenant au moins une mutation dans la région 103 à 670, notamment 103 à 377, de F acétolactate synthase, plus spécialement une mutation en position 197.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de distinction d'une plante sensible homozygote (s/s), d'une plante homozygote (T/T) ou hétérozygote (T/s) tolérante aux herbicides du groupe des sulfonylurées et des imidazolinones. Selon une réalisation, ce procédé de distinction comprend une étape dans laquelle on met en évidence à partir d'ADN extrait d'une plante que l'on veut tester, la présence, sur un ou deux allèles, d'une séquence nucléotidique mutée (mutation conférant la tolérance/résistance) selon l'invention. La distinction entre ces individus permet aux sélectionneurs d'améliorer de manière très avantageuse les schémas de sélection en aval.
Selon une variante ce procédé de distinction comprend l'analyse des allèles du gène de l'ALS, permettant de distinguer l'allèle sensible (non muté en position 197), de l'allèle résistant (muté en position 197). Selon une réalisation on utilise une méthode SSCP ou analogue. Les outils de type kit ou analogue capables de mettre en œuvre ces méthodes, notamment avec des réactifs nécessaires à une amplification PCR, font également partie de l'invention.
Selon une variante ce procédé de distinction comprend le dosage de l'activité enzymatique de l'ALS en présence d'herbicide et notamment plus particulièrement de sulfonylurée, le niveau d'activité de l'ALS étant directement corrélé au génotype de l'individu. Selon une réalisation en présence de 26,6 nM de chlorsulfuron, l'activité enzymatique résiduelle est de l'ordre de 30% pour les individus homozygotes sensibles, de l'ordre de 60 à 70%> pour les hétérozygotes tolérants, et de l'ordre de 100% pour les homozygotes tolérants.
Une enzyme codée par les séquences mutées selon l'invention, possédant une affinité diminuée pour la fixation d'herbicides du groupe des sulfonylurées et des imidazolinones, appelée dans ce qui suit ALS-, est également comprise dans l'invention.
Une cellule végétale comprenant une séquence nucléotidique telle que définie précédemment, avec les éléments nécessaires à l'expression de ladite séquence et/ou comprenant une enzyme ALS-, constitue un autre objet de l'invention.
Une telle cellule a une concentration en leucine, isoleucine et valine augmentée par rapport à la concentration de ces acides aminés dans une cellule sauvage ; ceci résulte de la diminution de sensibilité de l'ALS- au rétrocontrôle par ces acides aminés. Cette cellule végétale de préférence contient au moins une partie du génome du genre Cichorium, en particulier de Cichorium intybus.
Une souche de chicorée Witloof (Cichorium intybus L. var Witloof) tolérante aux sulfonylurées et/ou aux imidazolinones a pu être obtenue.
En l'absence de tout agent mutagène, des cals tolérants au chlorsulfuron, initiés à partir de suspensions cellulaires, ont été sélectionnés sur milieu de culture renfermant 28 nM de chlorsulfuron (dose létale pour les chicorées non-sélectionnées). Ces derniers ont permis la régénération de plantes fertiles capables de supporter des doses d'herbicides 1500 à 2000 fois supérieures pour les individus tolérants homozygotes, et 300 fois supérieures pour les individus hétérozygotes. En l'absence d'herbicide, aucun coût consécutif à l'acquisition de la tolérance n'est mesurable, tant sur le développement végétatif, que sur les potentialités reproductrices de la lignée tolérante.
L'invention a donc également pour objet une plante qui contient une séquence nucléotidique mutée telle que définie ci-dessus, une enzyme ALS- ou une cellule végétale contenant les éléments explicités précédemment, ladite plante étant tolérante aux herbicides du groupe des sulfonylurées et des imidazolinones. L'invention a également pour objet un procédé de désherbage de plantes à l'aide d'un herbicide inhibant l'enzyme ALS, dans lequel la plante comporte une séquence nucléotidique mutée telle que définie précédemment codant pour une enzyme ALS-, une enzyme ALS- ou une cellule telle que définie ci-dessus.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention. Dans ces exemples on se référera aux figures suivantes : Figure 1 : A : Comparaison des teneurs en protéine ALS chez les souches sauvages (S) et tolérante (T). La quantité de protéines totales déposées dans chaque condition est indiquée en μg.
B : Comparaison de l'activité transcriptionnelle chez les souches sauvages (S) et tolérante (R).
Analyse en Northern blot de l'expression de l'ARN messager correspondant à l'ALS de lignée de chicorées sensibles et tolérantes. L'ARN total a été extrait et 10 μg de chaque échantillon ont été soumis à électrophorèse, transférés sur une membrane nylon et révélés par un fragment d'ALS de chicorée marqué au
32P.
Figure 2 : Inhibition de l'activité enzymatique ALS extraite de plantes sensibles, tolérantes et hétérozygotes (femelle sensible x mâle tolérant), par le chlorsulfuron. Les valeurs sont exprimées comme en pourcentage des contrôles non traités, et représentent la moyenne des résultats obtenus dans trois expériences indépendantes.
Figure 3 : Effet de concentration croissante d'imadazolinone- imazaméthabenz sur l'activité ALS extraite de chicorées de type sauvage et tolérantes au chlorsulfuron. Les valeurs, exprimées en pourcentage des contrôles non traités, sur la moyenne des résultats obtenus avec deux préparations enzymatiques différentes.
Figure 4 : Conséquence de la mutation sur le rétrocontrôle de l'ALS par les acides aminés branchés. La sensibilité d'ALS extraite de chicorées tolérantes au chlorsulfuron et de type sauvage à l'inhibition par rétrocontrôle par chacun des trois amino acides branchés a été évaluée en mesurant l'activité enzymatique en présence de concentration croissante d'isoleucine, de leucine et de valine. Les résultats, exprimés comme pourcentage de contrôles non traités, sont les moyennes de données obtenues dans trois expériences indépendantes.
Figure 5 : Polymorphisme intraspécifique : comparaison de séquences entre fragments de gènes codant pour l'ALS, issues de lignées sensibles et tolérantes de Cichorium intybus (nt 309 à nt 2015, soit 85%» du gène codant pour l'ALS).
Séquence nucléotidique et prédiction de la séquence en acides aminés de l'acétolactate synthase de Cichorium intybus issue de génotypes sensibles (S) et tolérants (T) aux sulfonylurées. Les nucléotides identiques sont indiqués par un tiret.
Le positionnement des amorces ALS-L1 et ALS-R1 correspond aux séquences nucléotidiques sur fond gris. Ces amorces ont servi à obtenir la partie 5' du gène de l'ALS.
Les séquences nucléotidiques des amorces ALS-L2 et ALS-R2 sont encadrées. Ces amorces ont servi à obtenir la partie 3' du gène de l'ALS.
Les séquences nucléotidiques des amorces ALS-L3 et ALS-R3 utilisées pour différencier les individus sensibles des individus tolérants homozygotes et hétérozygotes par la technique SSCP sont soulignées
Figure 6 : Polymorphisme interspécifique.
Alignement portant sur 85% de la séquence en acides aminés déduite de la séquence nucléotidique de l'ALS de Cichorium intybus avec les 11 séquences protéiques d'ALS les plus proches issues de différentes espèces végétales. L'alignement des séquences est réalisé à l'aide du logiciel d'alignement de séquences CLUSTALW Network Protein Séquence @nalysis (IBCP, France), disponible sur Internet.
Région A et Région B : Régions à mutations conférant une tolérance aux sulfonylurées chez différentes espèces végétales (Wright et al., Weed Sci. 46, 13-23, 1998)
Figure 7 : Comparaison de deux méthodes (dosage de l'activité enzymatique de l'ALS et analyse SSCP) qui permettent de distinguer chez Cichorium intybus des individus homozygotes sensibles (s/s), homozygotes tolérants (T/T) et hétérozygotes tolérants (T/s) aux sulfonylurées sur 44 plantes F2 traitées aux sulfonylurées et le parent sensible MS8 de la descendance F2. 1) Principaux résultats obtenus chez Cichorium intybus L. var Witloof On décrit successivement tout d'abord : exemple 1 : l'obtention d'une lignée naturelle résistante au chlorsulfuron exemple 2 : une méthode de caractérisation de la résistance au chlorsulfuron exemple 3 : l'isolement de la séquence de l'ALS mutée exemple 4 : une méthode de distinction des individus sensibles et tolérants aux sulfonylurées
Exemple 1 : Obtention d'une lignée résistante au chlorsulfuron
De jeunes plantules issues de germination aseptique d'akènes ont été utilisées pour obtenir cette lignée. Les cotylédons sont lacérés et déposés sur milieu liquide statique jusqu'à obtention d'expiants calogènes. Puis ces explants sont placés en milieu liquide sous agitation. Ces explants sont retirés au fur et à mesure des repiquages jusqu'à ce qu'il ne reste qu'une suspension hétérogène (cellules et minicals). Ce n'est que lorsque les cultures sont stabilisées, avec un délai de 10-15 jours entre les repiquages, que la sélection peut commencer. Les cals et les cellules sont étalés sur un milieu gélose contenant l'herbicide, ainsi que sur un milieu non sélectif.
Après 30 à 40 jours de culture, les amas cellulaires non nécrosés en présence des herbicides sont repiqués sur un milieu de sélection de même composition. Cette opération est répétée jusqu'à ce qu'il soit possible de sélectionner des cellules capables de se multiplier normalement en présence d'herbicide. Ces cultures sont alors déposées sur un milieu sélectif avec des cellules témoins n'ayant jamais subi de pression de sélection de façon à comparer le comportement de souches sensibles ou supportant l'herbicide.
On produit ensuite des vitroplants en maintenant les cals sur les milieux d'induction jusqu'à ce qu'ils forment des nodules méristématiques puis en repiquant sur un milieu de développement des bourgeons. Les jeunes vitroplants une fois enracinés sont prélevés et repiqués en mini serres. On isole ainsi une souche RI OK qui se développe normalement en présence de chlorsulfuron et de sulfométuron (herbicides de la famille des sulfonylurées)..
Exemple 2 : caractérisation de la résistance au chlorsulfuron 1. Matériels et Méthodes
- Matériel végétal RI OK
Des graines obtenues à partir de chicorée du type sauvage, homozygote résistant au chlorsurfuron (RI OK) et hétérozygote (obtenues par pollinisation de plantes de type sauvage avec du pollen RI OK) ont été stérilisées en surface pendant 15 min dans une solution aqueuse de chlorure mercurique à 0,1%), rincées trois fois à l'eau distillée stérile et mises à germer sur des sels de Heller agarisés (Heller, 1953) contenant 20 g/1 de saccharose. Les plantules sont cultivées à 22 ± 1°C, sous un rythme de 16 heures de jour (250 μE m-2 s-1 densité du fluide photo photosynthétique) et 8 heures de nuit. Après un mois, les plantes sont récoltées et utilisées pour l'extraction d' ARN et l'analyse enzymatique.
- Extraction d' acétolactate synthase et dosage
L'activité ALS a été extraite et dosée comme décrit par Forlani et al (Plant Growth Regul. 14, 203-209, 1994). En bref, 5 g de feuilles sont réduites en poudre dans de l'azote liquide et remises en suspension dans 5 ml.g-1 du tampon phosphate 50 mM (pH 7,5) contenant 0,5 mM dithiothréitol, 1 mM MgC12, 0,1 mM pyrophosphate de thiamine (TPP), 0,01 mM de dinucléotide flavine adénine (FAD), 20%) de glycérol et 2% (p/v) de polyvinyl polypyrrolidone. Après centrifugation pendant 20 minutes à 18 000 g, le surnageant est additionné de sulfate d'ammonium solide (70%) de la saturation) et centrifugé. Les culots sont dissous dans du tampon d'extraction à demi force et dessalés par passage à travers une colonne de Sephadex G25 (Pharmacia). L'activité enzymatique est mesurée comme la quantité d' acétolactate produite. Les aliquots correspondant à environ 5 pkat d'activité ALS sont mis à incuber jusqu'à 90 min à 35°C en présence de tampon phosphate potassium 20 mM (pH 7,5) pyruvate de sodium 40 mM, MgC12 1 mM, TPP 0,1 mM et FAD 0,01 mM. Après décarboxylation, catalysée à l'acide, de l'acétolactate en acétoïne, cette dernière est déterminée par colorimétrie. Des témoins sont effectués pour quantifier le bruit de fond. Les moyennes des activités spécifiques de l'ALS sont calculées sur au moins cinq déterminations indépendantes sur des semis ayant une croissance uniforme, récoltés au même stade de développement. L'inhibition enzymatique a été estimée par addition de concentration croissante de chlorsulfuron, d'imazaméthabenz, d'isoleucine, leucine et valine au milieu de réaction ; trois mesures ont été effectuées pour chaque dosage. Chaque expérience a été répétée deux fois sur différentes préparations enzymatiques ; les moyennes des deux répétitions sont présentées, exprimées par un pourcentage des contrôles non traités. - Analyse par Northern blot
L'ARN total a été extrait et des aliquots de 10 μg ont été dénaturés et soumis à électrophorèse sur des gels d'agarose 1,5%, contenant 3% de formaldéhyde. Les gels sont transférés sur des membranes Hybond-N dans le tampon 20 X SSC. La sonde chicorée utilisée pour la détection du transcrit d'ALS a été générée par PCR, avec des amorces homologues à la séquence du gène sur A du tabac, comprenant les positions 1274 à 1295 et 1883 à 1902 (Mazur et al, Plant Physiol. 85, 1110-1117, 1987). Le fragment de 630 pb obtenu a été clone dans le vecteur PCRTM II (Invitrogene) utilisant des procédures de clonage classiques et séquence par la procédure de terminaison didéoxy (Sanger et al, 1977, Proc Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977). La sonde a été marquée au 32P en utilisant le kit T7-Quick-Prime (promega) selon les indications du fabricant. L'hybridation a été effectuée à 60°C. Les autoradiogrammes ont été analysés sur un densitomètre Microtek Color/GaryTM (Biorad) et les données traitées avec le programme Cricket GraphTM.
Exemple 3 : isolement de la séquence de 1 "ALS mutée, et identification d'une mutation en position 197 conférant la tolérance -Matériel végétal utilisé
Un croisement a été réalisé au sein de Cichorium intybus entre une chicorée industrielle mâle stérile génique sensible aux sulfonylurées (MS8, Ets FLORIMOND DESPREZ) et une chicorée endive de la lignée RI OK homozygote résistante aux sulfonylurées (Ets HOQUET Graines), le but étant de transférer le caractère pour la résistance aux sulfonylurées du cultigroupe endive vers celui des chicorées industrielles. Une descendance F2 a été obtenue et traitée aux sulfonylurées à raison de 30g/ha de Glean (70% de chlorsulfuron, Du Pont). A cette dose, théoriquement, seules les plantes résistantes aux sulfonylurées survivent, qu'elles soient homozygotes ou hétérozygotes. Le matériel utilisé pour l'étude correspond aux plantes F2 ayant survécu au traitement. Comme contrôle, on utilise le génotype sensible MS8 parent de la descendance F2. -Isolement du gène codant pour l'ALS de Cichorium intybus a) Extraction de l'ADN génomique.
L'extraction d'ADN génomique de chicorée est réalisée à l'aide du « Dneasy plant mini kit » commercialisé par Qiagen. Cinquante mg de feuilles sont broyées et l'élution après passage sur colonne Qiagen se fait dans 2 x 100 μl de tampon. b) Obtention de la partie en 5' du gène par PCR.
La comparaison de séquences de gènes d'acétolactate synthase de différentes espèces végétales a permis de définir l'amorce dégénérée sens (ALS-Ll) dans une région conservée du gène.
Amorce sens (ALS-Ll) : 5'-CTCGTCGAAGCYCTKGARCG-3' où Y=C/T, K=G/T et R=G/A
La séquence antisens (ALS-Rl) a été déterminée à partir de la séquence partielle d'ALS de chicorée obtenue par Eric Dewaele, clone DCIALSEB32 (Acquisition de la résistance aux sulfonylurées chez une souche de chicorée (Cichorium intybus L. var. Witloof) et conséquences sur le métabolisme des acides aminés branchés, Thèse de Doctorat, Université des Sciences et Technologies de Lille, 1997).
Amorce antisens (ALS-Rl) :
5'-AAGCTTCAGCAAACTTCA-3' La PCR a été réalisée dans un volume final de 20 μl contenant 0,2 μM de chacune des 2 amorces ALS-Ll et ALS-Rl, 1 mM de MgCl2, 0,1 mM de dNTP, 1 ng d'ADN génomique de chicorée, 0,6 U de Taq polymérase Appligène (15 U/μl) et le tampon PCR x 1. Le mélange réactionnel a été incubé dans un thermocycler (PE 9600, Perkin Elmer) pendant 40 cycles comprenant pour chaque cycle 1 min de dénaturation à 94°C, 1 min d'hybridation à 52°C et 1 min d'élongation à 72°C. Deux PCR indépendantes ont été réalisées, l'une avec de l'ADN provenant d'une chicorée sensible (MS8) et l'autre avec de l'ADN provenant d'une chicorée tolérante aux sulfonylurées de la descendance F2. L'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de PCR a révélé une bande de 1,5 kb, correspondant à la taille attendue selon les alignements de séquence d'ALS de différentes espèces végétales. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide de colonnes Qiaquick et clones dans le vecteur pGEM-T Easy (Promega). Les bactéries E. coli JM109 (Promega) ont été transformées avec cette construction. Trois clones contenant de l'ADN de plante sensible et 8 clones contenant de l'ADN de la plante tolérante ont été séquences avec un séquenceur automatique d'ADN Licor (Lincoln, USA). Les réactions de séquence ont été réalisées selon la méthode de Sanger à l'aide du kit « ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Core Kit » (Perkin Elmer). Les amorces ont été marquées à 1TRD-800, composé fluorescent. c) Obtention de la partie en 3 ' du gène par PCR.
Les séquences des amorces sens (ALS-L2) et antisens (ALS-R2) ont été déterminées à partir de la séquence partielle d'ALS de chicorée obtenue par Eric Dewaele, clone DCIALSEB32.
Amorce sens (ALS-L2) :
5 '-CAGAGCCAAAATCGTTCACA-3 '
Amorce antisens (ALS-R2) :
5'-TTCATTCTGCCATCACCATC-3' Des réactions PCR indépendantes ont été réalisées avec les deux amorces
ALS-L2 et ALS-R2 sur de l'ADN provenant d'une chicorée sensible (MS8) et de 6 chicorées tolérantes F2, dans les mêmes conditions que précédemment mais pendant 30 cycles et à une température d'hybridation de 55°C. Les fragments de PCR obtenus de 850 pb, correspondants à la taille attendue, ont été clones dans le vecteur pGEM-T Easy. Deux clones contenant de l'ADN de plante sensible MS8 et 4 clones par plante tolérante F2 ont été séquences.
Exemple 4 : Méthodes de distinction chez Cichorium intybus des individus sensibles, homozygotes tolérants et hétérozygotes tolérants aux sulfonylurées a) Dosage colorimétrique de l'activité enzymatique résiduelle de l'ALS en présence de chlorsulfuron. L'extraction et le dosage de l'activité de l'ALS ont été réalisés selon la méthode décrite dans l'exemple 2 sur des feuilles fraîches âgées d'un mois, b) Analyse du polymorphisme de l'ALS par SSCP. Principe : La méthode SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) permet de distinguer les allèles d'un gène lorsque ceux-ci présentent des différences ponctuelles au niveau nucléotidique. Elle implique l'amplification par PCR de fragments d'ADN et l'analyse des fragments d'ADN dénaturés sur un gel de polyacrylamide non dénaturant. Chaque séquence primaire a une structure tridimensionnelle unique et va migrer à une vitesse qui lui est propre. La sensibilité de la détection de la mutation est élevée car un changement d'une base suffit à altérer la mobilité du brin d'ADN.
Les séquences des amorces sens (ALS-L3) et antisens (ALS-R3) ont été déterminées à partir de la séquence nucléotidique présentée Figure 5. Elles permettent l'amplification théorique d'un fragment de 310 pb comprenant le site muté chez les individus tolérants. Amorce sens (ALS-L3) : 5'-CTAACCCGGTCAAGCATCAT-3' Amorce antisens (ALS-R3) : 5 ' -CGGAAGAGGCGAGATGAAA-3 ' Des réactions PCR ont été réalisées avec les deux amorces ALS-L3 et ALS-
R3 et l'ADN des plantes sur lesquelles le test biochimique a été fait, dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3 b) « Obtention de la partie en 5' du gène par PCR » mais avec une température d'hybridation de 55°C. Les fragments d'ADN amplifiés ont ensuite été dénaturés pendant 5 min à 94°C en présence de formamide. Environ 1/10e de la réaction PCR a été déposé sur gel de polyacrylamide non dénaturant -gel de 0,75 mm d'épaisseur et de 20 cm de long, MDE x0,5 (TEBU)-. L'électrophorèse a été réalisée à une température de 10°C dans des cuves Protean Ilxi (Biorad) avec du tampon TBE x0,6 (Tris-borate-EDTA). Le temps de séparation est de 3000 Vh pour un fragment de 300 pb. Après migration, les bandes ont été révélées au nitrate d'argent selon la méthode de Bassam et al. (Anal. Biochem. 196, 80-83, 1991). 2. Résultats et discussion
- Tolérance à l'herbicide :
Les premiers éléments pris en considération sont la quantité d'ARN messager- ALS et le niveau d'activité spécifique ALS. Les expériences de Northern blot effectuées avec aussi bien des plantes sensibles que résistantes n'ont pas montré de différence substantielle entre les deux lignées (figure 1). Au contraire, l'analyse enzymatique a révélé une différence significative quant à l'activité spécifique ALS, qui est de 12,2 +/- 1,1 pkat.mg-1 de protéine totale dans le type sauvage et 7,9 +/- 0,8 pkat.mg-1 de protéine dans les plantes résistantes. Ces résultats excluent la possibilité que la résistance soit dérivée partiellement ou complètement d'une augmentation du taux d'ALS. On peut noter que malgré une diminution de 35% de l'activité enzymatique spécifique, les plantes résistantes ne montrent pas de réduction ou d'altération de caractéristiques végétatives ou reproductives. Etant donné que le niveau d'ARNm n'est pas modifié, une explication possible pour cette réduction pourrait être la survenue d'une mutation affectant la stabilité de l'enzyme.
- Comparaison de la sensibilité in vitro au chlorsulfuron entre des ALS provenant de chicorées résistantes aux herbicides et sensibles :
L'activité ALS homozygotes de plantes résistantes et sensibles a été dosée en présence de concentrations croissantes de chlorsulfuron. Les résultats ont montré que l'ALS de plantes résistantes n'est pas inhibée jusqu'à des concentrations en herbicide de l'ordre du micromolaire, alors que celle provenant de plantes sauvages était déjà affectée par des taux nanomolaires (figure 2). La concentration requise pour inhiber 50% de l'activité ALS de plantes résistantes est de 12 μM, alors que la DI50 pour l'enzyme de plantes du type sauvage est de 0,021 μM, correspondant à une différence de 570 fois. Des comportements différents de façon si marquée suggèrent fortement une sensibilité diminuée de l'ALS à l'effet inhibiteur du chlorsulfuron comme déterminant de la tolérance sélectionnée.
L'ALS a également été extraite de chicorée hétérozygote obtenue par pollinisation de plantes de type sensible avec du pollen RI OK, et l'activité enzymatique a été mesurée en présence de l'herbicide. Les résultats montrent un profil biphasique intermédiaire entre les profils de type sauvage et homozygote résistant (figure 2), indiquant la présence concurrente d'une forme d'ALS résistante avec une forme sensible, et que le caractère de résistance au chlorsulfuron est hérité de manière semi-dominante.
L'enzyme résistant au chlorsulfuron montre une tolérance croisée envers l'herbicide imidazolinone : imazaméthabenz.
L'activité ALS respectivement des types sauvage et résistant a été mesurée en présence de concentrations croissantes d'imazaméthabenz. Comme on le voit sur la figure 3, l'activité ALS de plantes résistantes n'a pas été affectée à des concentrations allant jusqu'à 10 μM, la DI50 étant d'environ 200 μM, alors que pour l'ALS provenant de plantes de type sauvage, l'activité a été inhibée à 50%) à 1,8 μM. Sélectionnée initialement pour sa résistance au chlorsulfuron, la lignée RI OK apparaît ainsi dotée d'une activité ALS qui est aussi 125 fois plus résistante à un herbicide appartenant à une autre classe d'inhibiteurs d'ALS. Dans le mutant de chicorée, la différence dans le niveau de résistance au chlorsulfuron et à l'imazaméthabenz est apparemment en accord avec l'existence d'un site unique de mutation avec des domaines de fixation spécifiques se recouvrant.
- Sensibilité au rétrocontrôle de l'ALS par la leucine et la valine.
Les acides aminés à chaîne ramifiée modulent leur propre synthèse en inhibant de façon coopérative la première enzyme de leur voie de biosynthèse. L'activité ALS a ainsi été mesurée dans des extraits provenant de plantes de type sauvage et RI OK en présence de concentrations croissantes de valine, leucine, ou isoleucine. Comme on s'y attendait, la valine et la leucine diminuent de façon marquée l'activité de l'ALS provenant du type sauvage avec des taux d'inhibition similaires (DI50 environ 1 mM) alors que l'isoleucine, qui contrôle le flux de carbone à travers sa voie au niveau de la thréonine désaminase est substantiellement inefficace (DI50 supérieure à 100 mM ; figure 4). Quand l'activité résistante au chlorsulfuron extraite de chicorée RI OK a été examinée, elle a été trouvée significativement moins sensible à l'effet inhibiteur de la valine (DI50 = 3 mM), ou encore plus de la leucine (DI50 aux environs de 10 mM ; figure 4). Il est donc probable que la forme résistante de l'ALS de la lignée RI OK résulte d'un ou plusieurs événements mutationnels qui concernent à la fois le site de fixation aux herbicides et le domaine impliqué dans le rétrocontrôle par la valine et la leucine.
Cette diminution de sensibilité au rétrocontrôle (10 fois pour la leucine, et 3 fois pour la valine) se traduit par une augmentation des teneurs en valine (+140%>) et leucine (+80%>) libres dans ces plantes, comme cela apparaît sur le tableau suivant :
Teneur exprimée en nmol.g-1 de matière fraîche
Acide aminé Sensible Tolérant
Valine 10,1 ± 1,4 24,3 ± 1,8
Leucine 9,0 ± 1,9 16,0 ± 1,6
Isoleucine 6,9 ± 1,1 8,2 ± 1,2
Total (20 aa) 1502 1600
- Isolement du gène codant pour l'ALS
Les séquences nucléotidiques globales obtenues (partie 5' et 3' du gène) et les séquences en acides aminés déduites, de l'ALS de chicorée sensible et tolérante aux sulfonylurées, sont présentées Figure 5. Seul 85% du gène est représenté, du nucléotide 309 au nucléotide 2015. Il manque les 308 premiers nucléotides en 5', la partie du gène de l'ALS en 3' est complète et va jusqu'au codon STOP. La séquence d'ALS de chicorée contient cependant les deux régions A et B en entier (Figure 6) où ont été répertoriées les mutations conférant une tolérance aux sulfonylurées chez d'autres espèces végétales (Wright et al., Weed Sci. 46, 13-23, 1998). Au niveau nucléotidique, la seule différence entre allèles sensibles et tolérants se situe en position 591 où une Cytosine (C) pour l'allèle sensible est mutée en Thymine (T) pour l'allèle tolérant, ce qui entraîne au niveau acide aminé un changement d'une proline (P) en serine (S) en position 197. Cette mutation obtenue chez la chicorée est localisée dans le domaine A contenant les sites de mutations connus conférant la tolérance aux sulfonylurées chez d'autres espèces végétales.
Au niveau protéique, la séquence d'ALS de chicorée a été alignée avec celles d'autres plantes (Figure 6). La séquence d'ALS la plus proche de la chicorée est celle de laitue. On retrouve d'ailleurs cette substitution au même endroit (position 197) chez Lactuca sativa (Eberlein et al., Weed Sci. 47, 383-392, 1999) et L. seriola (Guttieri et al., Weed Sci. 40, 670-678, 1992) mais la proline (P) chez l'individu sensible est mutée en histidine (H) chez l'individu tolérant homozygote. Par contre, on retrouve exactement la même mutation d'une (P) en (S) conférant la tolérance aux sulfonylurées au même endroit (position 197) chez le tabac (Harms et al., 1992) et chez A. thaliana (Haughn et al., 1988) qui sont cependant plus éloignés d'un point de vue botanique de la chicorée que la laitue.
Par ailleurs, on peut noter que le gène de l'ALS de chicorée ne contient pas d'intron tout comme les gènes d'ALS d'Arabidopsis thaliana, de Bassia scoparia, de betterave, de Brassica napus, du coton, de la laitue et du tabac. Il semblerait que ce soit le cas pour tous les gènes d'ALS.
- Dosage colorimétrique de l'activité enzymatique résiduelle de l'ALS en présence de chlorsulfuron.
Le dosage de l'activité enzymatique résiduelle de l'ALS en présence de 26,6 nM de chlorsulfuron permet de déterminer le génotype des individus. En effet, sur 44 plantes F2 traitées aux sulfonylurées et le parent MS8 sensible dont l'activité enzymatique résiduelle de l'ALS a été dosée, un individu homozygote sensible (s/s) présente en moyenne 29,5% ± 0,71 d'activité enzymatique résiduelle de l'ALS, un individu hétérozygote tolérant (T/s) 63% ± 4 et un individu homozygote tolérant (T/T) 103%) ± 3,6 (Figure 7). Il est à noter que la plante F2 n°ll bien qu'ayant survécue au traitement aux sulfonylurées apparaît d'après ce test homozygote sensible (s/s) avec une activité résiduelle de l'ALS de 30%.
- Analyse du polymorphisme de l'ALS par SSCP L'analyse sur gel SSCP des fragments provenant de 44 plantes F2 traitées aux sulfonylurées et du parent sensible MS8 (mêmes plantes analysées que dans l'exemple 4 a) « Dosage colorimétrique de l'activité enzymatique résiduelle de l'ALS en présence de chlorsulfuron ») montre qu'un individu sensible (s/s) présente toujours une bande unique (correspondant aux allèles sauvages bb), l'individu tolérant homozygote (T/T) montre également une bande unique (correspondant aux allèles mutés aa) mais à un niveau de migration différent de la première et l'individu tolérant hétérozygote (T/s) montre deux bandes correspondant à celle de la plante sensible et de la plante tolérante homozygote (correspondant aux allèles ab) (Figure 7). Il est à noter que la plante F2 n°l l bien qu'ayant survécue au traitement aux sulfonylurées apparaît d'après ce test homozygote sensible (s/s) car elle a les deux allèles bb. Remarque : la plante F2 n°l 1 a un génotype homozygote sensible (s/s) quelle que soit la méthode de détection utilisée. Elle a « échappé » au traitement au Glean, ceci peut-être dû à une mauvaise répartition de l'herbicide.
Les expériences biochimiques (dosage colorimétrique de l'activité résiduelle de l'ALS) et moléculaires (analyse SSCP) sont parfaitement corrélées et permettent de déterminer sans ambiguïté le génotype au locus ALS. La substitution nucléotidique d'un C en T en position 591 de la séquence présentée Figure V est donc responsable de la résistance aux sulfonylurées de la lignée RI OK.
La méthode moléculaire présente un certain nombre d'avantages par rapport à la méthode enzymatique : elle est sûre, plus rapide, peut être réalisée sur des individus âgés et l'ADN peut être extrait à partir de feuilles séchées. Ce test moléculaire peut être réalisé en routine sur un grand nombre d'individus.
BIBLIOGRAPHIE
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Eberlein, C.V. et al.: "Physiological conséquences of mutation for ALS-inhibitor résistance" Weed Sci., Vol. 47, 1999, Pages 383-392.
Guttieri, M.J. et al.:"DNA séquence variation in Domain A of the acétolactate synthase gènes of herbicide-résistant and -susceptible weed biotypes" Weed Sci., Vol. 40, 1992, Pages 670-678.
Harms, C.T. et al.: "Herbicide résistance due to amplification of a mutant acetohydroxyacid synthase gène" Mol. Gen. Genêt., Vol. 233, 1992, Pages 427-435.
Haughn, G.W. et al.:"Transformation with a mutant Arabidopsis acétolactate synthase gène renders tobacco résistant to sulfonylurea herbicides" Mol. Gen. Genêt, Vol. 211, 1988, Pages 266-271.
Wright, T.R. et al. : "Biochemical mechanism and molecular basis for ALS- inhibiting herbicide résistance in sugarbeet (Beta vulgaris) somatic cell sélections" Weed Sci., Vol. 46, 1998, Pages 13-23.

Claims

REVENDICATIONS
1) Séquence nucléotidique isolée d'une plante du genre Cichorium caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique correspondant à SEQ ID N°3 b) une séquence nucléotidique comportant au moins 80%> d'identité avec SEQ ID N°3 c) une séquence nucléotidique complémentaire de la SEQ ID N°3 ou d'une séquence définie en b) ou de la séquence ARN d) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b) ou c) ; et en ce qu'elle code pour une acétolactate synthase mutée présentant au moins une mutation dans la région des acides aminés 103 à 377 de l'ALS, la ou lesdites mutations conférant à la plante une résistance à un herbicide.
2) Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 80% et typiquement au moins 90,95,98 % d'identité avec SEQ ID N°3, ladite séquence codant pour une ALS mutée présentant au moins une mutation dans la région des acides aminés 103 à 670, la ou lesdites mutations conférant à la plante une résistance à un herbicide.
3) Séquence nucléotidique selon la revendication 2 caractérisée en ce qu'elle code pour une acétolactate synthase mutée en position 197.
4) Séquence nucléotidique selon la revendication 3 caractérisée en ce que la mutation est une mutation d'une Proline vers une Serine, ou toute mutation fonctionnellement équivalente.
5) Séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que l'herbicide est choisi parmi les sulfonylurées, les imidazolinones. 6) Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est un fragment représentatif d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
7) Séquence nucléotidique selon la revendication 6, utilisable comme amorce pour l'identification et/ou la sélection de plantes du genre Cichorium tolérantes à un herbicide sulfonylurée ou imidazolinone caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 10 bases et est apte à amplifier une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
8) Séquence nucléotidique utilisable comme sonde pour l'identification et/ou la sélection de plantes du genre Cichorium résistantes à un herbicide sulfonylurée ou imidazolinone caractérisée en ce qu'elle est apte à s'hybrider avec une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
9) Séquence selon la revendication 7 ou 8 caractérisée en ce qu'elle est marquée par radioactivité, fluorescence ou réactif colorimétrique.
10) Polypeptide à activité acétolactate synthase modifiée par rapport au polypeptide non muté, ou fragment dudit polypeptide, caractérisé en ce qu'il est de séquence SEQ ID N°4 ou comprend au moins 80%> d'identité avec SEQ ID N°4.
11) Procédé d'obtention d'une plante du genre Cichorium résistante à un herbicide sulfonylurée ou imidazolinone caractérisé en ce qu'il comprend la sélection de plantes comprenant au moins une mutation dans la région 103 à 670 de l'acétolactate synthase, plus spécialement une mutation en position 197.
12) Procédé de détection qualitative d'une plante du genre Cichorium résistante à un herbicide sulfonylurée ou imidazolinone caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en évidence dans une plante testée d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4. 13) Procédé de distinction d'une plante du genre Cichorium homozygote (s/s) sensible, d'une plante homozygote (T/T) ou hétérozygote (T/s) tolérante aux herbicides du groupe des sulfonylurées et des imidazolinones comprenant une étape dans laquelle on met en évidence à partir d'ADN extrait d'une plante que l'on veut tester, la présence, sur un ou deux allèles, d'une séquence nucléotidique mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
14) Procédé de distinction selon la revendication 13 d'une plante du genre Cichorium sensible homozygote (s/s), d'une plante homozygote (T/T) ou hétérozygote (T/s) tolérante aux herbicides du groupe des sulfonylurées et des imidazolinones, comprenant une étape de mesure de l'activité enzymatique de l'ALS et la déduction de son génotype.
15) Procédé selon la revendication 13 ou 14 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) éventuellement, isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique de l'ADN isolé à l'aide d'au moins une amorce selon la revendication 7; c) mise en évidence des produits d'amplification.
16) Kit ou nécessaire pour la détection de plantes du genre Cichorium résistantes aux herbicides sulfonylurées caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique amorce selon la revendication 7 et des réactifs nécessaires pour l'amplification de cette séquence, et/ou une séquence nucléotidique sonde selon la revendication 10, et des réactifs nécessaires pour l'hybridation de cette séquence.
17) Cellule de plante caractérisée en ce qu'elle est modifiée de manière à comprendre une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un polypeptide selon la revendication 10. 18) Utilisation d'un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour l'obtention d'une plante résistante aux herbicides sulfonylurées ou imidazolinones.
19) Procédé de désherbage de plantes à l'aide d'un herbicide inhibant l'enzyme ALS, dans lequel la plante comporte une séquence nucléotidique mutée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
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DEWAELE ET AL: "Biochemical characterization of chlorosulfuron resistance in Chicorium intybus L. var. Witloof", JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, FISCHER, STUTTGART, DE, vol. 151, no. 1, 1997, pages 109 - 114, XP002081330, ISSN: 0176-1617 *

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