WO2002034041A1

WO2002034041A1 - Senescence marker protein 30-defective nonhuman animal, antibody and method of constructing the same

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Publication number: WO2002034041A1
Application number: PCT/JP2001/009243
Authority: WO
Inventors: Naoki Maruyama; Yasushi Kasahara
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Priority date: 2000-10-23
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2002-05-02
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Description

明細書

セネッセンスマ一カープロテイン 3 0欠損非ヒト動物、抗体およびその作製方法技術分野

本発明はセネヅセンスマ一カープロティン 3 0 (Senescence Marker Protein 30, 以下「S M P 3 0」という）の機能が欠損した新規な系統の動物とその作出法、及び本発明による動物を用いて作製した抗体とその作出法に関する。従来の技術

発生工学的技術の発展と分子生物学の知識の蓄積に伴い、遺伝子を人為的に操作し、動物個体へ導入して、種々の遺伝子改変動物の作製が試みられている。これらはいわゆる遺伝子組換え（トランスジヱニック）動物と呼ばれ、医学 .生物— 学領域で様々な応用が期待され、特に、遺伝子操作により特定の蛋白質を欠損させた動物モデルは、クローニングされた遺伝子の、生体内での生理学的機能や、疾患との関連性の解析において、最も強力な手段のひとつとされている。

例えばマウスでは E S細胞（Embryonic Stem Cell；胚性幹細胞）において、遺伝子の相同的組換えを利用する手法により、遺伝子および遺伝子産物欠損マウス (いわゆるノックアウトマウス）の作製が可能である（Kollerら、 Proc. Natl . Acad. Sci . USA、第 8 6卷、 8 9 2 7〜8 9 3 1頁、 1 9 8 9年）。一般に、特定の遺伝子産物を欠損させる方法としては、 .目的とする蛋白質をコ一ドする遺伝子を破壊することが行われる。具体的には破壊する標的遺伝子のクローニングを行い、その遺伝子内部に挿入する夕一ゲッティングベクタ一を作製する。このべクタ一はマウス E S細胞に導入され、相同的組換えが行われる。組換えが生じた E S細胞を受精卵の 8細胞期胚に吸着させ、あらかじめ偽妊娠させておいた仮親の卵管に移植し、出生させる。その後出生したマウスの尾部より D

N Aを抽出し、 P C R法（Polymerase Chain Reaction)あるいはサザンハイブリダイゼ一シヨンにより標的遺伝子の組換えを確認する。このマウスをさらに退交配し、純系のノックアウトマウス系として確立する。破壊される遺伝子は必ずしも目的とする蛋白質をコードする遺伝子に限定されない。ある特定遺伝子について、その転写から翻訳にいたる一連の過程のいずれか、あるいは、その遺伝子産物（蛋白質）が正常に機能するために、翻訳後のプロセヅシングが必要であるなら、その過程のいずれかを阻害するような遺伝子の改変も、当該蛋白質の欠損となる。この場合どの過程が阻害されるかによって、当該蛋白質がまったく産生されなかったり、あるいは産生されても機能しない等の様々な表現型を示す。こうして作製されたノックアウトマウスには通常生殖細胞を含めた全ての細胞に外来遺伝子により破壊された遺伝子が組み込まれており、メンデルの法則に従つて正確に子孫に伝達される。即ち新規に作成されたノックアウトマウスは、 1 つの新しい系統として樹立することができ、繁殖能力が損なわれない限り、交配を繰り返すことによって同じ遺伝的資質を持った実験動物として供給し続けることが可能である。また導入する遺伝子の上流にプロモー夕一ゃェンハンサーなどの遺伝子制御領域をつなく、ことにより組織特異的に発現を制御することも可能でめる。一方、生物学的分析に欠かすことのできない抗体の作成と利用は歴史も長く、特にモノクローナル抗体の作製法はすでに 1 9 7 5年に報告されている。以来、その方法はモノクロ一ナル抗体の有益性とあいまって研究者に広く伝播し、今日の分子生物学の基礎を築く一翼となったといっても過言ではない。例えば分子生物学の実験教科書として世界で最もひろく読まれている Methods in Enzymology ではすでに 1981年にモノクローナル抗体の作製方法が確立された方法として記載されている。しかしそこではモノクローナル抗体産生ハイプリド一マ細胞の確立は決して簡単ではないことが記され、できれば何種類かの動物を用いることを勧めている（Methods in Enzymology 73卷第 1章 Production of Antibodies 1981 年 Academic Press) ₀ 抗体が時として十分な反応性を持たない場合があることは広く知られている。しかしその原因のひとつが、目的とする抗体の抗原が、免疫される側の同種タンパク質と相同性が高いことはほとんど見逃されてきた。上記の Methods in Enzymolog でも動物によって抗体の性質に差が出ることを認めつつ、抗原となるタンパク質の相同性についての言及は一切ない。このことは、ポリクローナル抗体の作製においても同様で、「実験生物学講座」の「14卷免疫生物学」（丸善、昭和 57年）では「経験から "抗原の種類と動物種の組合せ" が良い抗体を作るために必要である」としているが、目的とする抗体の抗原と、宿主の同種タンパク質との間の相同性には一切触れられていない。しかし一般には、生物にとって重要または必須なタンパク質は進化の過程でもよく保存され、種間の相同性が高いことが知られている。即ち、生物にとって重要なタンパク質であるほど、抗体が作製しにくい傾向にあり、 SMP 30はこの典型的な例である。

SMP 30は加齢に伴い減少するラット肝細胞内の蛋白質として 1992年に報告され（Fujitaら、 Biochim Biophys Acta,第 1 116卷、 122〜 128、 1992年）、そのアミノ酸配列や cDNA配列もヒト（Fujitaら、 Biochim Biophys Acta, 第 1263巻、 249〜 252、 1995年）、ラヅト（Fujita ら、 Biochim Biophys Actaヽ第 1 132卷、 297〜 305、 1992年）、マウス（Fujitaら、 Biochim Biophysヽ第 1308卷、 49〜57、 1996年）や、ラビット、ゥシ、ニヮトリ、ヒキガエル（t 0 ad) (Misawaら、 Int J Mol Med、第 6卷、 19 1〜196、 2000年）においてすでに決定されている。またマウスについてはジエノミヅク DNA配列と構造も報告された（Fujitaら、 Biochim Biophys, 第 1308卷、 49〜57、 1996年）。： Fuj i t a - Ma ruy am aら以外の研究グループも遅れて同一の物質のクロ一ニングを行い r e gu c a 1 c i nと称しているが、以下、 SMP 30という名称で統一する（また、 SMP 30をコードする染色体上の遺伝子を以下 SMP 30遺伝子という）。本願発明者は、先にヒト SMP 30でゥサギを免疫することにより、抗ヒト S MP 30ポリクローナル抗体の作製に成功し、特許出願した（特開平 7-97399号公報）。

加齢に伴い各臓器では多様な病変を発症する。内的あるいは外的刺激により臓器を構成する細胞は障害を受ける。その際に重要な細胞内事象は細胞内カルシゥムの上昇である。細胞内カルシウムは種々の細胞機能に必須なイオンではあるが過剰な上昇は細胞膜障害を始めとして細胞機能を著しく低下させる。従って細胞機能の維持において細胞内カルシウムの恒常性維持は必須である。 '

SMP 30は新しいタイプのカルシウム結合蛋白質であり、細胞膜カルシウムポンプを活性化することにより細胞内カルシウムの恒常性を保つ生物機能を持つていることが知られている。しかしながら、ヒトを含めた生物種における SMP 30の働きの詳細 ·機序は十分に解明されておらず、特に疾患との関連、各種病態への関与等、解明すべき点が数多く残されている。これらの問題を解決する上で、 SMP 30が欠損した動物モデルの提供が必須である。また、本願発明者は、上記の通り、ヒト SMP 30でゥサギを免疫することにより、抗ヒト SMP 30ポリクローナル抗体を作製した（特開平 7-97399号公報）。しかしながら、この抗ヒト SMP 30ポリクロ一ナル抗体のヒト SMP 30に対する反応性はあまり高くなく、満足できるものではなかった。また、特開平 7-97399 号公報記載の方法に従ってヒト SMP 30で免疫した動物から常法によりモノクローナル抗体を作製しょうとしても、抗ヒト SMP30モノクローナル抗体を得ることはできなかった。従って、本発明の目的は、 SMP 30が欠損した非ヒト動物を提供することである。また、本発明の目的は、従来技術では作製することができなかった反応性が高い抗 SMP 30抗体を提供すること、及びその作製を可能にする手段を提供することである。発明の開示

本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、従来技術において、反応性が高い抗ヒト SMP 30抗体ゃ抗ヒト SMP 30モノクロ一ナル抗体を作製することができなかった原因は、 SMP 30のアミノ酸配列の異種間での相同性の高さにあるのではないかということに想到した。すなわち、健常な動物個体では、自己のタンパク質に対する抗体は産生されない（免疫寛容）。このため、その動物にとっての自己タンパク質と相同性の高い異種動物のタンパク質を免疫しても、免 ¾寛容のために、自己タンパク質と相同な部分に対する抗体は生産されず、異なる領域のみが免疫原として作用し、このため、得られるポリクローナル抗体の反応性が低く、また、モノクローナル抗体が得られる確率が非常に小さくなることが原因ではないかということに想到した。

そして、もしそうならば、動物自身の SMP 30遺伝子を破壊した SMP 30 欠損（ノックアウト）動物を作製し、これにヒト SMP 30を免疫すれば、この欠損動物は自 3SMP 30を持たないので、異種 SMP 30の全体が免疫原として作用し、高い反応性を有する抗 S MP 30抗体や、抗 S MP 30モノクロ一ナル抗体を作出できるのではないかということに想到した。そして、さらに鋭意研究した結果、 SMP 30の機能解析の強力な手段となる SMP 30欠損動物モデルの確立に成功し、この欠損動物に異種 SMP 30を免疫することにより、反応性の高い抗 SMP30ポリクロ一ナル抗体や、抗 SMP30モノクローナル抗体を実際に作出することに初めて成功し、本発明を完成した。即ち、本発明の S MP 30欠損非ヒト動物の第 1の態様は、 SMP30の機能が欠損した非ヒト動物である。本発明の S MP 30欠損非ヒト動物の第 2の態様は、前記 S MP 30の機能の欠損が、染色体 SMP 30遺伝子において、少なくとも一部の DNA配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、若しくは少なくとも一部の DNA配列を他の配列へ置換するか、又はこれらの組み合わせによるものであることを特徴とする、 SMP 30欠損非ヒト動物である。本発明の S MP 30欠損非ヒト動物の第 3の態様は、 SMP 30の機能の欠損が、染色体 S M P 30遺伝子の発現の過程または S M P 30のプロセッシングの過程に関わる遺伝子産物をコードする遺伝子において、少なくとも一部の DNA 配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、若しくは少なくとも一部の DNA 配列を他の配列に置換するか、又はこれらの組み合わせによるものであることを特徴とする、 SMP30欠損非ヒト動物である。本発明の S MP 30欠損非ヒト動物の第 4の態様は、前記他の配列が薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする、 SMP 30欠損非ヒト動物である。本発明の SMP 30欠損非ヒト動物の第 5の態様は、前記薬剤耐性遺伝子が、染色体 S MP 30遺伝子のェキソンに挿入されたネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする、 SMP 30欠損非ヒト動物である。本発明の SMP 30欠損非ヒト動物の第 6の態様は、 SMP 30欠損非ヒト動物が、哺乳類であることを特徴とする、 SMP 30欠損非ヒト動物である。本発明の S MP 30欠損非ヒト動物の第 7の態様は、 SMP 30欠損非ヒト動物がげつ歯類であることを特徴とする、 SMP 30欠損非ヒト動物である。本発明の SMP 30欠損非ヒト動物の第 8の態様は、 SMP 30欠損非ヒト動物がマウス¹であることを特徴とする、 SMP 30欠損非ヒト動物である。本発明においてはさらに SMP 30欠損非ヒト動物を免疫して得られた抗体価の高い抗 SMP30抗体を提供する。即ち本発明の抗体の第 1の態様は、 SMP 30欠損非ヒト動物を SMP 30で免疫して得られた SMP 30又はその一部ぺプチドを抗原とする抗体である。本発明の抗体の第 2の態様は、上記記載の SMP 30欠損非ヒト動物のいずれかを免疫して得られた、 SMP 30又はその一部ペプチドを抗原とする抗体である。本発明の抗体の第 3の態様は、脊椎動物の SMP 30若しくはその一部ぺプチド又は脊椎動物の一部の S MP 30若しくはその一部ペプチドを共通抗原とすることを特徴とする抗体である。本発明の抗体の第 4の態様は、上記脊椎動物が哺乳動物であることを特徴とする抗体である。本発明の抗体の第 5の態様は、マウス、ラヅト、ヒト、ゥサギ、ゥシ、ィヌ、ブ夕、及び力エルのうちいずれか 1種の SMP 30若しくはその一部ぺプチドで免疫して得られた抗体で、マウス、ラット、ヒト、ゥサギ、ゥシ、ィヌ、ブ夕、及び力エルすベての、若しくはこれらのうちの 2種類以上の、 SMP30若しくはその一部べプチドを共通抗原とすることを特徴とする抗体である。本発明の抗体の第 6の態様は、ラット SMP 30を SMP 30欠損マウスに免疫して得られた、マウス、ラット、ヒト、ゥサギ、ゥシ、ィヌ、ブ夕、及びカェルすべての SMP 30若しくはその一部ぺプチドを共通抗原とすることを特徴とする抗体である。本発明の抗体の第 7の態様は、抗 S MP 30抗体が、アミノ酸の付加、置換、欠失、挿入により修飾された S MP 30で免疫して得られたことを特徴とする抗体である。本発明の抗体の第 8の態様は、上記の抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする抗体である。さらに本発明の抗体の第 9の態様は、上記抗体が、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであることを特徴とする、抗体である。また、ここでいう「フラグメント」とは、抗原結合性フラグメントをいい、抗原に非結合性のフラグメント（例えば Fcフラグメント）は含まない。一方本発明においては、 S M P 3 0欠損非ヒト動物作製方法も提供する。即ち本発明の S MP 3 0欠損非ヒト動物作製方法の第 1の態様は、染色体 S MP 3 0 遺伝子の少なくとも一部の D N A配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、若しくは少なくとも一部の D N A配列を他の配列で置換するか、又はこれらの組み合わせによつて機能が欠損した変異型 S M P 3 0遺伝子を作製することを特徴とする、 S M P 3 0欠損動物の作製方法である。本発明の S M P 3 0欠損非ヒト動物作製方法の第 2の態様は、染色体 S M P 3 0遺伝子の発現の過程または S MP 3 0のプロセッシングの過程に関わる遺伝子産物をコードする遺伝子において、少なくとも一部の D N A配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、若しくは少なくとも一部の D N A配列を他の配列で置換するか、又はこれらの組み合わせによる、 S MP 3 0欠損動物の作製方法である。さらに本発明は、種間の相同性か《抗体力できないかあるいは作製しても抗体価の高い抗体力 W导られないの、抗体法を簾する。即ち本発明における抗体作點法の第 1の钃は、 SMP 3 0の欠損非ヒト動を免疫することを霞とする、 SMP 3 0 またはその一部を抗原とする抗 SMP 3 0抗体の作 ¾法である。本発明の抗体作法の第 2の態様は、上言3¾体が、上記の SMP 3 0欠損非ヒト動物のうちのいずれかを用いて上言 ¾ϊ体のいずれかを體する、抗 SMP 3 0抗体の作 ¾法である。本発明の抗体作法の第 3の!^は、上言肪法によって作製された抗体が、ポリクロ一ナル抗体又はモノクロ一ナル抗若しくはそのお原^!生フラグメントであることを^ とする抗 SMP 3 0抗体の作默法である。本発明の抗 ί*0作 »法のそ ©I也の, Jitは、上言 Ξ¾法によってされた抗体が、ヒト S MP 3 0またはそのに SJiT、を示す、モノクローナル抗体又はその ίΐ» ^性フラグメントであることをとする作法である。本発明のハイプリド一マ作 ¾法の第 1の ί縐は、 SMP 3 0欠損非ヒト動物を免疫して SMP 3 0またはその" ¾を挪とする抗 SMP 3 0抗体胜ハイプリドーマを纏する、ハイプリドーマ作製方法である。本発明のハイプリドーマ作 S¾法の第 2の織は、上言ヽィプリドーマの戲する抗 SM P 3 0抗体が、上記に言 B®の抗体のいずれかである、ノ、イブリドーマ ©{乍勤法である。また、本発明は、 SMP 3 0に限らず、種間で高い相同性を示すタンパク質を漏とする抗体の戲の HIS的方法も示す。即ち、本発明の抗体の作!^法 ©ί也の纖は、脊棚物間のァミノ酸の相同性が 4 0 %以上である夕ンパク質をとする抗体又はその繊^ ^'生フラグメント ©{乍不法であって、当 |¾ΐ原の欠損動物を免疫して当に対する抗体又はその枋原^性フラグメントを作製する、抗体 ®ί乍 ^、法である。本発明は脊 β物間のアミノ酸の相同性が 5 0 %以上の:^に特に有効である。さらに、本発明の抗体の作 ¾法の他の J¾は、哺乳動物間のアミノ酸の相同性が 5 0% 以上である夕ンノク質を観とする抗体又はその結合 I '生フラグメントの作點法であつて、当 |¾¾ ^のタ 3員動物を免疫して当^^に対する抗体又はそのお源 1^1'生フラグメントを丫乍製する、抗体の ^法である。本発明は (flL動物間のアミノ酸の相同性が 6 0 %以上のに特に力である。 l ¾動物間の相同性が 6 0 % のは、に用いられるげっ麵そ ( X也では相同性がさらに高《ほとんどの驗が抗体作製瞧となるため、本発明は種間で保存されている夕ンノク質の抗体を作製する方法として極めて有効な手段をするものである。図面の簡単な説明

図 1は、 129ZSvマウスよりクローニングした SMP30遺伝子の概略図である。

図 2は、夕一ゲヅティングベクタ一作製に使用した、プロモーターを含む ne

0耐性遺伝子の概略図である。

図 3は、夕ーゲッティングベクタ一作製の概念図である。

図 4は、相同組換えを検出する P CRシステムの概略図である。

図 5は、 SMP 30遺伝子欠損マウスの第一世代から第三世代までの遺伝子型及び表現型である。発明を実施するための最良の形態

SMP 30遺伝子については、前述のように、ヒト、マウス、ラヅト、ゥサギ、ゥシ、ニヮトリ、力エル等からその cDNAがクロ一ニングされ、 cDNA配列及びコード蛋白質（SMP30) のアミノ酸配列が報告されている（前述 Fuj it aら、または Mi s awaらの論文）。またマウスでは染色体 SMP 30遺伝子の構造も報告されている（Fujitaら、 Biochim Biophys第 1308巻、 49 〜57、 1996年）。これらの S MP 30はすべて 299アミノ酸からなり、約 70%〜92%の高い相同性を示し、特にマウスとヒトでは 89%、マウスとラヅトでは 94%と高値であった（Fujitaら、 Biochim Biophys 第 1308卷、 49〜57、 1996年）。本発明における、 SMP 30またはそれをコードする SMP 30遺伝子は、既報のヒト、マウス、ラヅト、ゥサギ、ゥシ、ニヮトリ等の SMP 30のアミノ酸配列、 S M P 30遺伝子の c D N A配列またはジエノミック D N A配列と相同性を有するものであれば、既報の配列以外のものや、これらの動物由来以外のものも含まれる。このような SMP 30またはそれをコードする SMP 30遺伝子としては、例えば（1)既報の、 NCBIアクセス番号 Q 64374 (Eur op e a n Mo le cular Bio lo y Laborat ory (EMB L) に記載されたマウスのアミノ酸配列（SEQ ID No ： 1) を有する蛋白質またはそれをコードする遺伝子、（2)既報の、 NCBIアクセス番号 Q6 4374 ( E MB L)に記載されたマウスのアミノ酸配列（SEQ ID No： 1) において、 1もしくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸を有する蛋白質またはそれをコードする遺伝子、が挙げられる。ここでアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換は、通常 1〜約 90個、好ましくは 1〜約 60個、より好ましくは 1〜約 30個、さらに好ましくは 1〜約 15個、またさらに好ましくは 1〜数個である。また本発明における SMP 30は、既報の、 NCB Iアクセス番号 Q 6437 4 (EMBL) (SEQ ID No： 1) に記載されたマウスのアミノ酸配列と通常 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上のアミノ酸配列の相同性を有する。なお、アミノ酸配列の相同性は、 FAS TAのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはィン夕一ネットによっても利用に供されている。また本発明における SMP 30遺伝子 cDNAは、 NCB Iアクセス番号 U2 8937 (DDB J) (SEQ ID N o： 2 ) に記載された c D N A配列と通常 60%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90 %以上の塩基配列上の相同性を有する。

I 本発明にお ('、て「SMP 30の機能が欠損した非ヒト動物」（以下、 SMP3

0欠損動物と禾 |Γ、する。）とは、染色体上に導入された変異により、 SMP 30が産生されないか、あるいは機能が欠損した変異型 SMP30を産生する非ヒト動物を意味する。 SMP30の欠損は、機能が欠損した変異型 SMP 30遺伝子を有することに起因するのが最も一般的であり、遺伝子工学的にも手法が確立している。本発明においても、他の配列（遺伝子本来の配列と異なる配列）の挿入による変異型 SMP 30遺伝子を有する SMP 30欠損動物を、その実施の一例としてあげている。ただし SMP 30の欠損は必ずしも染色体 SMP 30遺伝子における変異に限定されるものではない。タンパク質が正常に機能しない原因は必ずしもそのタンパク質をコ一ドする遺伝子に限らず、転写と翻訳を含めた一連の合成過程に欠陥がある場合も想定できるからである。特に異種配列導入後のスクリーニングを抗 SMP30抗体等を用いて、 SMP 30の産生あるなしで行えば、目的とする夕ンパク質の遺伝子とはまったく異なる遺伝子を改変することによって SMP 30 欠損の表現型が得られる可能性がある。機能が欠損した変異型 SMP 30遺伝子としては、変異のない正常遺伝子と比較して、遺伝子発現が抑制されるか、または遺伝子産物の活性が少なくとも一部失われた遺伝子が挙げられる。典型例としては、遺伝子発現が完全に抑制されるか、または遺伝子産物の活性が完全に消失した遺伝子が挙げられる。本発明の動物としては、その構成細胞のすべてにおいて、変異型 SMP30遺伝子が染色体上で、ホモの状態で存在しているもの（ホモ欠損動物）、またはへテロの状態で存在しているもの（ヘテロ欠損動物）が挙げられる。また、その構成細胞の一部のみにおいて変異型 SMP 30遺伝子がホモまたはへテロの状態で存在する、キメラ動物も挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ブ夕などの哺乳動物、ニヮトリなどの鳥類、力エルなどの両生類、などが挙げられる。これらのうちマウスゃラットなどのげつ歯類動物は、ライフサイクルが短く繁殖が容易であり、遺伝的欠損動物の作製技術も確立していることなどの点で有利であるため、好ましい。本発明の S MP 30欠損動物は、最も一般的な方法として、染色体の SMP 3 0遺伝子に人為的に変異を導入し、その機能を欠損させることにより作製できる。具体的には、染色体上の S MP 30遺伝子の少なくとも一部の DN A配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、あるいは他の配列に置換することにより、 S MP 30遺伝子の機能を欠損させることができる。欠失または他の配列を揷入 '置換させる部位（ターゲット部位）は、 SMP3 0遺伝子内のプロモーター領域、非翻訳領域、翻訳領域などのいずれであってもよい。これらのどの部分をターゲットとするかによつて、 SMP30遺伝子の転写産物（mRNA) が産生されなくなったり、転写産物を不安定化したりすることが可能である。また活性の失った SMP 30 (蛋白質）やその断片を産生させることもできる。遺伝子の機能を完全に欠損させるには、プロモーター領域または翻訳領域を夕ーゲットとすることが好ましい。前記のような染色体上の S MP 30遺伝子への変異導入は、遺伝子相同組換えにより実施できる。具体的には、例えば以下のように実施できる。

まず相同組換えに使用する夕一ゲッティングベクターを作製する。夕一ゲッティングベクターには相同組換えによって置き換える、染色体由来の SMP 30遺伝子の全部または一部と、マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子の上流と下流は、 SMP30遺伝子の、挿入しょうとする部分と相同な塩基配列部位によって囲まれる。前記 SMP 30遺伝子の全部または一部は、 SMP 30遺伝子を欠損させようとする動物種の染色体 DNAから SMP30遺伝子領域を単離して得られる。例えば定法によりその動物種の染色体 DN A (ジエノミック DNA) ライブラリーから、 PCR法（Polymerase Chain Reaction)、コロニ一ハイブリダィゼ一ション法、プラークハイブリダィゼーシヨン法、あるいはこれらの組み合わせにより、 SMP 30遺伝子のクローンを得ることができる。夕ーゲッティングベクタ—には、マーカ一遺伝子を揷入する。これは、ベクタ —を細胞内に導入する際に、導入した細胞のみを選択するためのものである。このようなマーカ一遺伝子としては、例えばネオマイシン耐性遺伝子（neo)、ジフテリアトキシン Aフラグメント遺伝子 (DT-A) 、ィグロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ヘルぺスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-tk)等、通常の薬剤耐性選択に用いる遺伝子を用いることができる。例えばネオマイシン耐性遺伝子が導入された細胞は、 G 418などのネオマイシンに耐性を示すので、細胞の培養の際にネオマイシンを加える事によって、ベクタ一を含む細胞のみを選択できる。また、 SMP 30遺伝子にレポ一夕一遺伝子を挿入してもよい。これは夕一ゲヅティングべク夕一を導入した細胞内や、目的とする SMP30欠損動物の細胞内での SMP 30遺伝子の転写活性をモニタ一するためのものである。この場合、挿入する非相同的配列部分に S MP 30遺伝子とレポ一夕一遺伝子の翻訳フレームが一致するように設計する。レポ一夕一遺伝子は一般に用いられるものでよく、例えば lacZ (大腸菌一ガラクトシダ一ゼ）遺伝子、 CAT (クロラムフエ二コールァセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、 GUS ( ?—グルコニダーゼ）遺伝子、ルシフヱラーゼ遺伝子、ェクオリン遺伝子、タウマリン遺伝子等を用いることができる。さらにベクターが細胞内で非相同的組換えを起こした場合に細胞が死滅するような DT— Aカセットを加えることも可能である。これによつて夕ーゲヅティングベクタ—が目的の染色体領域に組み込まれた細胞を、通常より高い割合で選択することができる。

相同組換え用夕ーゲッティングベクタ一は以下のように構築する。即ち、前述のようにして単離した染色体由来 S M P 30を適当な制限酵素で切断して得られた断片を、マ一力一遺伝子、レポーター遺伝子、 DT— Aカセット等と適当な順序で連結させる。この時に必要ならば合成したリンカー： DNAを用いてもよい。また、単離した染色体由来 S MP 30遺伝子は、必要に応じて PCI 去等により断片の一部を増幅することも可能である。相同組換え用ターゲッティングベクタ —は、通常の D N A組換え技術により容易に作製することができる。次に、相同組換え用夕一ゲッティングベクタ一を、直線化して、適当な細胞へ導入する。細胞は、潜在的に全ての細胞に分化し得るものを用いる。例えばマウスの場合、受精卵や初期胚、あるいは E S細胞（胚性幹細胞）のような培養細胞. であるが、このうち E S細胞は技術的にも確立していることから最も好ましい。導入する方法は、通常の方法、例えばエレクトロボレ一シヨン法、マイクロインジェクシヨン法等が用いられる。，

夕ーゲッティングベクタ一が取り込まれた細胞は、ベクタ一内のマ一力一遺伝子の発現によって選択できる。例えばマーカーが薬剤耐性遺伝子であれば、適当な期間、薬剤存在下で培養することにより選択できる。選択された細胞内の相同的組換えは P C R法やサザンハイブリダイゼ一シヨンによって確認できる。 D T 一 Aカセットを挿入した場合は、通常よりも相同的組換えの割合が上昇するが、いずれにしても挿入確認の際に組換えの部位を確認する必要がある。組換えによって目的 D N Aが挿入した細胞（例えば E S細胞）を 8細胞期の宿主胚に凝集法により注入し、胚盤胞期まで発生させた後、これを偽妊娠動物の子宮に移植してキメラの産仔を得る。

これらのキメラ動物の産仔で生殖細胞が E S細胞に由来するものを野生型と退交配して S M P 3 0遺伝子へテロ欠損動物を得ることができる。また得られた S M P 3 0ヘテロ欠損動物同士を交配してホモ欠損とすることも可能である。これらの動物の遺伝子型は、その動物の体の一部（例えば尾部先端）から得た染色体 D NAについて、 P C R法やサザンハイブリダィゼ一シヨン法等により、解析し確認できる。本発明の動物は、正常な動物と同様な方法により飼育することができる

S MP 3 0欠損非ヒト動物は、 S MP 3 0欠損による疾病とその治療法の解明に用いることができる。

また、本発明の S M P 3 0欠損非ヒト動物を用いることにより、従来は不可能であつた抗原提供動物と抗体産生動物を組み合わせることや、あらゆる種に有効な、反応性の高い抗 SMP 30抗体またはそのフラグメントを作製することが可能となる（ここでいう「フラグメント」とは、抗原結合性フラグメントをいい、抗原に非結合性のフラグメント（例えば Fcフラグメント）は含まない）。例えば、抗体の作製にはマウスゃラット等のげつ歯類を用いるのが一般的であるが、前述のように、 SMP 30のアミノ酸配列はヒト、マウス、ラヅト、ゥサギにおいて、非常に高い相同性を維持しており（Fuj i t a ¾,Mech Ageing Dev. 第 107卷、 271— 280、 1999年）（M i s a w aら、 Int J Mol Med_N 第 6巻、 191〜196、 2000年）、これらのげつ歯類に異種 SMP 30を注入しても、異種タンパク質とは認識しないので、反応性の高い抗 SMP 30抗体、特にモノクロ一ナル抗体を作製するのは困難であった。しかしこの問題は本発明である SMP30欠損動物を用いることで解決できる c 例えば S MP 30欠損マウスに任意の動物種の SMP 30を免疫することによつて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれも作成可能となる。さらに従来ではほとんど不可能であったような相同性の高い抗原提供動物と抗体産生動物の組み合わせ、例えばマウスに抗ラット SMP30を産生させることも可能となり、相同性の割合にかかわらず自由に組み合わせて抗体を作成することができる。抗体が複数の抗原を共通抗原として認識しているかどうかは、種の異なる

2種類以上の SMP 30と反応するかどうかを確認することで簡単に判断できる c 抗原として角いる SMP 30は、既報のヒト、マウス、ラヅト、ゥサギ、ゥシ、ニヮトリ等の SMP30のアミノ酸配列と相同性を有するものであれば、既報の配列以外のものや、これらの動物由来以外のもの、さらにァミノ酸が付加、置換、欠失、挿入により修飾されたものも含まれる。このような SMP30は、例えば

(1)既報の、 NCB Iアクセス番号 D 31662に記載されたラットのァミノ酸配列、（2)既報の、 NCB Iアクセス番号 D 31662に記載されたラットのアミノ酸配列において、 1もしくは数個のアミノ酸残基が付加、置換、欠失もしくは挿入されたアミノ酸を有する蛋白質が挙げられる。ここでアミノ酸の付加、置換、欠失、もしくは挿入は、通常 1〜約 90個、好ましくは 1〜約 60個、より好ましくは 1〜約 30個、さらに好ましくは 1〜約 15個、またさらに好ましくは 1〜数個である。また本発明において抗原として用いる SMP 30は、既報の配列、例えば上記のラヅトの配列や、力エル（NCB Iアクセス番号 AB 033368) 、マウス (Q 64374又は D 86217) 、ゥシ（AB 035446) 、ヒト（D31 815)等のアミノ酸配列と通常 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上のアミノ酸配列の相同性を有する。いわゆる「相同性が高い」とはどのくらいの割合を指すのかは多分に研究者の主観に委ねられているが、一般にはアミノ酸レベルで 70%以上相同なタンパク質同士は「進化的に非常によく保存されている」、即ち相同性が高いと表現される（Shcherban ABら、 Genet ica、第 110卷、 43— 53、 2000年、 Swidz inski JAら、 Genome, 第 44卷、 394 — 400、 2001年）。また、実際の抗体作成において現在最も頻繁に使用されているげつ歯類は、例えば SMP 30については、力エルとラヅトの相同性は 60. 1%であるが、ラヅトとマウスの間では相同性 93. 8%であるように（N CBIデ一夕））、互いに進化的に近いので、一般にさらに高い相同性を示すことが予想される。したがって、現実の実験工程においては、哺乳動物間では 50%以上、脊椎動物としては 40%以上の相同性を示すタンパク質において、抗体作製が困難になると考えられる。相同性が哺乳動物間で 60%以上、脊椎動物間で 50%以上となると、確率的に抗体の作製はかなり難しく、実験ではもっぱらポリクロ一ナル抗体で、しかも感度の低いものを使わざるを得ない。そこで SMP 3 0に限らず、相同性の高いタンパク質の抗体作製において、欠損膽を作成し、抗体丫懐に用いること asめて敲カである。欠損膽にとつて当歉損タンパク質は完全に難タンパク質であるので、タンパク酉綱相同性のある部分もェビト一プとすることができるからである。本発明は雄馳間のアミノ酸の相同性が 4 0 %以上の i給にカである。また、本発明は脊椎垂間のアミノ酸の相性が 5 0 %W_hのはより機で、さらに相同' I、生が 6 0 % 以上の i は特に被力である。また、本発明は噼睡間のアミノ酸の相同性が 5 0 %&± のに様力で、アミノ酸の相同性が 6 0 %^±のはより様力である。さらに哺乳動物間のァミノ酸の相同性が 7 0 %以上の ί は特に核力である。即ち物間の相同性が 4 0 %以上の ί あるいは哺乳動物間の相同性が 5 0 %以上の^は、実に用いられるげつ歯類そ也では相同性がさらに高ほとんどの齢が抗体作製困難となるた本発明は種間で保存されているタンパク質の抗体を作製する方法として極めて有効な手段をするものである。またこの抗体は従来のものより高い汎用性を持つことが予想される。即ち作成した抗体が、異種間で保存されているアミノ酸配列部分をェピト一プとする抗体であれば、この抗体 1種類のみで、あらゆる種の同種タンパク質に反応することになる。このことは、複数のェビトープに反応するポリクロ一ナル抗体の場合にも、もちろん該当するが、モノクローナル抗体の作成においても、このような広い反応性を持つ抗体産生細胞を選択することが可能である。また免疫される動物にとって、その抗原がまったくの異物であることから、非常に感度の高いポリクローナル抗体が産生されることが予想される。即ち抗原として体内に導入されたタンパク質のあらゆる部分がェピトープとして有効であり、それらに反応する無数の抗体の組合せがより強い反応を示すからである。さらにこのことはモノクローナル抗体の作製においても、有利に作用する。ポリクローナル抗体が十分に反応性を示さない場合は、有効なハイプリド一マを作製することが困難であることは研究者には広く知られているが、逆に反応性の高い場合は、様々なェピトープに基づいた多様なハイプリドーマが効率よく作製されることが期待できる。一般に遺伝子欠損動物では、反応性の高い抗体は、遺伝子を欠損させた E S細胞から得られた第 1世代の次々世代（第 3世代）で作製が可能となる（図 5 ) 。例えばマウスでは S M P 3 0遺伝子は X染色体上に位置するので、第 1世代の S M P 3 0欠損マウスの雄は遺伝子型（Y/—）、雌の遺伝子型はほとんどの場合ヘテロ（+/— ) となる。この第 1世代の（Y/—）の雄は S MP 3 0欠損表現型を示すが、母親の胎内で免疫寛容性を獲得しているので、外部からの S MP 3 0を異種タンパク質と認識しない。また次世代のマウスは雄（Y/—）、ホモ欠損の雌（一/—) のいずれもが、母親がヘテロ（+Z— ) であることから、やはり母親の胎内で免疫寛容性を獲得してしまい、実際に有効性の高い抗体をつくるのは、 S MP 3 0について自己生産能を失った、これら第 2世代マウスを親として生まれた第 3世代であることが予想される。このようにして得られた抗体は、例えば体液 ·組織中の S M P 3 0量の測定に用いられる。血液、尿、臈液、胃液、胆汁、髄液等、のあらゆる体液や組織には S M P 3 0が存在しており、各種の臓器障害により量が増減する。これらは抗 S M P 3 0抗体を用いて測定することができる。測定方法としては、 E L I S Aやサンドイッチ法等、一般的測定方法のいずれを用いてもよい。開発された測定方法は、前述のとおり種を超えて有効であり、例えばヒトのみならず、家畜、ぺット、実験動物等に用いることも可能である。また前述の抗体は、定法により、病理学的組織診断において免疫組織学的に利用することが可能である。

S MP 3 0は、ほぼ全身の臓器に発現しているが、特に薬剤障害の主要な標的臓器である肝細胞及び腎尿細管上皮細胞には強い発現がある。 S M P欠損動物においてはこれらの標的細胞が薬物障害に対して脆弱となるので、医薬品のこれらの臓器に対する副作用を高感度で検出することが可能である。 SMP30が欠損した動物は、医薬品開発における副作用の高感度検出モデルとして有効である。動物実験において、酸化ストレスによって S M P 30の発現が低下することが知られている。また S MP 30の発現は加齢に伴い減少し、その結果血中 S MP 30蛋白質量も低下することから（Fuj i t aら、 Biochim Biophys Acta, 第 1308卷、 49〜57、 1996年）、酸化ストレスによって細胞の老化が亢進していることが推定される。このことから、例えば血中 SMP 30蛋白質量を測定することにより、 SMP 30の発現の低下を、老化度のパラメ一夕一として用いることができる。

SMP 30欠損動物の表皮細胞ではフイラグリンの分解が低下し、保水性が大きい遊離ァミノ酸量が減少する。 S M P 30測定法や S M P 30欠損動物等を組合せて、皮膚の保水性を亢進させる医薬品や化粧品の開発が可能である。肝癌細胞に S MP 30 cDNAを移入することによって癌細胞の分化が生じる。 S MP 30欠損動物及び抗 S MP 30抗体を用いて、 SMP30抑制による癌細胞の分化 ·誘導の制御、即ち、癌細胞の保存的療法に応用が可能となる。以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例実施例 1 SMP 30遺伝子欠損動物作製用 DN A断片の調製

ラヅトの SMP30の cDNAである入 SMP 8 (NCB Iアクセス番号； X

69021 (DDBJ) ) ( F u j i t aら、 Biochim Biophys Acta、第 11

32卷、 297〜305、 1992年）を E c o R I /P s t Iによって制限酵素処理して得られた、ラヅト SMP 30 cDNAの全コ一ディング領域を含む、約 1 Kbpの DNA断片をプロ一プして、 129/SV系統マウス由来のゲノムライブラリ一（Stratagene社製、えファージ）についてプラークハイブリダィゼ —シヨンにより、マウス SMP 30遺伝子（約 14Kbp) をクローニングした (図 1) 。これを制限酵素 C la Iで消化し、第 1ェクソンと第 2ェクソンを含む約 6 Kb pの断片を含む約 14 Kbpの C la I断片（長腕）を得た。さらに C 57 B L/ 6マウス由来ジエノミヅク DNAの pGM6 SMP 30 (NCBIアクセス番号； U 32170 (DDB J)) ( F u j i t aら、 Biochim Biophys第 1308卷、 49〜57、 1996年）を鏡型として、センスプライマー（SEQ ID No： 3) を第 3ェクソンの C 1 a Iから 3，方向に、その下流約 2 Kbp部位にアンチセンスプライマー（SEQ ID No : 4)を 5，方向に設定し、約 2Kbp断片（短腕）を PCI 去により調製した（図 1) 。なお上記錡型に用いた D N A断片の配列は決定されていないので、その対応する部分を含む領域のみ DNA配列を決定し、さらにその 5，端を S a 1 I断端となるように配列を加えて、アンチセンスプライマーを設計した。次に 3804bpのpMC 1 ne oプラスミド（Stratagene社製）を、 Xhol と S a 1 Iで消化し、 N e o耐性遺伝子とプロモー夕一を含む、 1083 b pの断片を得た（図 2)。この断片の 5，端をアダプタ一により Sal I断端に改変しノ ο 以上 3つの DN A断片、即ち、 S MP 30の長腕と短腕、 Neo耐性遺伝子をプラスミド pBluescript S K +内のマルチクローニングサイ卜の C 1 a Iと S a 1 Iの間に長腕、 n e o、短腕の順に組み込んだ（図 3 A、 B) 。次に、このプラスミドから制限酵素 No t Iと Xho Iにより得られる約 8.

5Kbpの DNA断片を、プラスミド pMCDT— A (A + T/p au) (ライフテックオリエント社製、 Yag iら、 AnalBiochem、第 214卷、 77〜86、

1993年）の No t I/Xho Iの間に挿入した（図 3 C) 。その結果図 3D に示す夕ーゲッティングベクターが得られた。これを通常の方法により大量に調製し、 No t Iで切断して、 SMP 30の相同組換えに用いる、直線化した DN Aを得た（図 3E) 。実施例 2 E S細胞を用いた SMP 30遺伝子の相同組換え

マウス胚性幹細胞（E S細胞）（1[丁 2細胞株、 ¥染色体）（Yag iら、 Anal Biochem、第 2 14卷、 Ί 0〜76, 19 93年）を定法により培養し、ェレクトロポレーシヨン法により上記の No t I処理により直線化した夕一ゲッテイングべクタ一を E S細胞に導入した。エレクトロポレーシヨン実施後 G 418 を含有する培地中で選別的に培養し、 502個のネオマイシン耐性クロ一ン（夕 —ゲヅティングベクターが導入された E S細胞）を取得した。これら 502個のクローンについて、サザンハイプリダイゼーシヨン法により、相同組換えの有無を確認した。即ち、抽出した細胞 DNAを、 E c oR Iにより切断し、電気泳動の後メンプレンに移した D N A断片について³² P標識 Fプロ一ブでハイプリダイゼーシヨンを行った。野生型（WT)では 7.5 Kb pのバンドが検出されるのに対して相同組換えが生じた細胞（K〇）では 7Kbpであった (図 4)。これは第 3ェクソン内に挿入された N e 0耐性遺伝子内に E c oRェ切断部位が存在するためである。またこのときに使用した Fプロ一ブは、マウス S MP 3◦遺伝子の第 3ェクソンと第 4ェクソン間から抽出した 0.52 Kb pの断片である（図 1)。 502個のネオマイシン耐性クローンを解析した結果、 3個（# 41、 # 60、 # 16 9) の相同組換えを生じた細胞を検出した。実施例 3 S MP 30欠損マウスの樹立

妊娠マウスから 8細胞期胚を採取するために雌雄の I CRマウスを交配させ、プラグを確認し、妊娠したと思われる雌マウスの子宮から杯盤胞を摘出し、 8細胞期胚を得て、 SMP 30遺伝子の相同組換えが生じた E S細胞（#4 1) を凝集法により胚表面に吸着させた。その後さらに 1日培養して杯盤胞に発生したものを仮親の子宮に移植した。出生したキメラマウスの遺伝子型をサザンハイプリダイゼーシヨン、 PCR法により確認した。具体的には前述のクローンの確認と同様、マウス肝臓から抽出した DNAを制限酵素 Ec oRIで切断し、 7Kbp の断片を確認した。また PCR法による解析では、図 4に示すように、野生型マウスでは TS3 (SEQ ID No： 5) と T A4 (SEQ ID No： 6) を一組のプライマ一として 280 bpのバンドが、欠損マウスでは NE 01 (S E Q ID No： 7) と TA4の組み合わせによる 323bpのバンド及び T S 3と TA4の組み合わせによる 1363 bpのバンドが認められた。

SMP 30遺伝子において相同組換えが生じたマウスと生じていないマウスそれそれの肝臓における S M P 30遺伝子の発現をウエスタンプロット法により解析した。ラヅト SMP 30を家兎に免疫して作製したポリクロ一ナル抗体を用いてウエスタンプロットを行うと、野生型マウスでは SMP30の分子量に該当する約 30 KD aの部位にバンドが認められたが、欠損マウスでは認められなかつた。この結果から、 SMP 30遺伝子の相同組換えにより、 SMP30欠損マウスが樹立したことを確認した。実施例 4 SMP 30欠損マウスにおける抗 SMP 30抗体産生の有効性の確得られた SMP 30欠損マウスを用いて、反応性の高い抗 S MP 30ポリクローナル抗体が得られるかどうかの確認を行った。ポリクロ一ナル抗体作製法は生物学の分野では広く一般的に知られた技術である。用いたマウスは、第 1世代の Ml、； F 1とこれらを両親して生まれた M2と F 2、さらにこれらを両親とした M 3の 5種類のマウスで、遺伝子型は、 Ml (Y/— )、 F 1 (+/-)、 M2 (Y/—）、 F 2 (一/一）、 M3 (Y/—）である（SMP 30は X染色体上に位置するので、ォスの欠損マウスの遺伝子型は Y/—となる）。これらの表現型はへテロの F 1のみが SMP 30を発現し、その他はすべて SMP 30欠損で、遺伝子型と一致した。これらのマウスに精製ラヅト S M P 30で作製した免疫用抗原ェマルジョンを皮下注射し、その後 2週間おきに 3回追加免疫した。その後得られた血清をマウス S MP 30を用いてウエスタンブロットを行ったところ M 3に強いバンドが検出された。これらの相対的強度は以下の表のとおりであり、当初より予想された理論値と完全に一致した。

実施例 5 モノク口一ナル抗体の作製とセルラインの確立

(1) ミエ口一マ細胞の調整

ミエローマ細胞 PX 63 Ag 8. 653を American Type Cu 1 t u r e Co l lect ion (Rockvi l le、 MD、米国) より入手し、当日 5—1 Ox 10⁷個の細胞が得られるように融合の 1週間前に培養を開始した。当日細胞を 4°C 1200 rpmで 5分間遠心し、沈殿にイーグル ME Mを加え再度懸濁と遠心を行い、イーグル MEM 20mlを加え懸濁させ細胞数を数えた。

( 2 ) 脾細胞の調整

免疫したマウスから取り出した脾臓をステンレスメッシュ上において細胞をかき出し、イーグル MEM (Nissui) でステンレスメッシュを洗って細胞を培養皿に落とした。グラスウールで細胞懸濁液を濾過し、濾液を 4°C 1000 rp mで 5分間遠心して細胞を回収し、そこに 40 mlのイーグル MEMを加え細胞数を数えた。

(3) 細胞融合

ミエ口一マ細胞と脾細胞が 1対 2になるように混ぜ、 4°C 1000 rpmで 5分間遠心した。上清を除き P E G—イーグル M E M 1 m 1を徐々に加え細胞をほぐし、その後 37 °Cのイーグル MEM 3 Omlを徐々に添加した。遠心（800 r pm、室温、 5分）後上清を除き、 37°Cの 10%F CS+RPMI— 1640 を 1 Oml加え、 37 °Cで 60分放置後蓋をしめて天地にゆつくりと振って沈殿をほぐした。 10%FCS+RPMI— 1640を 4 Oml加え、 25mlづっ分注し、 10%FCS+RPMI— 1640を加え 5 Omlとした。

先端をカツトしたクリスタルチヅプで 96穴プレートに 10 O lずつまき、 3 7 °Cで一晩培養した。

(4) HAT選択

融合の翌日、 10%FCS+RPMI— 164(H;:50xHAT (SI GMA社）を加え 2xHATを作製し、各ゥエルに 10 O lずつ加えた。その後 2、 3日おきに 100〃1ずつ倍地を交換し、融合 10日後からは 2xHT/l 0%FC S+RPMI - 1640で培養した。

(5) スクリーニング及びクローニング

融合 10日後からマウス肝臓 S MP 30を抗原とした EL I S A法によりスクリ —ニングを開始した。得られた陽性コロニーを限外希釈法によりクローニングした。即ち、ゥエル当たり 0. 3細胞になるようにハイプリドーマを希釈して 10 日間培養し、再度 ELI SA法で陽性コロニーをスクリーニングした。この操作を再度行い、 20個の抗 SMP 30抗体産生クローンを得た。実施例 6 モノクロ一ナル抗体の反応性の確認

約 2 X 10⁷細胞/ m 1の前述のモノク口一ナル抗体産生細胞を S C I Dマウス

(重度免疫不全マウス）の腹腔内に投与した。 2週間後腹水を採取し、 30%硫安沈殿及び PBSによる透析を行い、マウス、ラット、ヒト、ゥサギ、力エルの肝臓細胞内 S MP 30との反応性をウエスタンプロッティングで確認したところ、これらすベての SMP 30に反応することが示され、種間で高度に保存されている部位に対しても反応していることが示唆された。通常のマウスを用いた場合に得られる抗体は、一般に自己の SMP30ァミノ酸配列と異なつた部位をェピト —プとするものであることから、上記モノクローナル抗体は S MP 30欠損マウスを用いたが故に得られた抗体であることが推定された。本発明の S MP 30の機能が欠損した動物は、 SMP 30の生物学的機能の解析、疾病との関連、治療方法の探索に有用である。 SMP 30は加齢に伴い全身の臓器で減少することから、加齢に伴う疾患の発生機序の解明にも有用である。また肝細胞等が脆弱なため、新薬の副作用スクリーニングとして使用できる。さらに SMP 30欠損動物を用いて製作した抗 SMP 30抗体は、野生型を用いた場合より反応性が高く、種を超えて有効であり、 S MP 3◦の測定法の開発その他に広く応用できる。

Claims

請求の範囲

I . SMP 30の機能が欠損した SMP 30欠損非ヒト動物。

2. 前記 SMP 30の機能の欠損が、染色体 SMP 30遺伝子において、少なくとも一部の DNA配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、若しくは少なくとも一部の DN A配列を他の配列へ置換するか、又はこれらの組み合わせによるものであることを特徴とする、請求項 1に記載の S M P 30欠損非ヒト動物。 3. 前記 SMP 30の機能の欠損が、染色体 SMP 30遺伝子の発現の過程または S M P 30のプロセッシングの過程に関わる遺伝子産物をコードする遺伝子において、少なくとも一部の D N A配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、若しくは少なくとも一部の DNA配列を他の配列に置換するか、又はこれらの組み合わせによるものであることを特徴とする、請求項 1に記載の SMP 30欠損非ヒト動物。

4. 前記他の配列が薬剤耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項 2または 3に記載の S MP 30欠損非ヒト動物。

5. 前記薬剤耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子で、かつ挿入部位が染色体 SMP 30遺伝子のェキソンであることを特徴とする、請求項 4に記載の SM P 30欠損非ヒト動物。

6. 前記 S M P 30欠損非ヒト動物が哺乳類であることを特徴とする請求項 1 から 5のいずれか 1項に記載の SMP 30欠損非ヒト動物。

7. 前記 SMP 30欠損非ヒト動物がげつ歯類であることを特徴とする、請求項 1から 6のいずれか 1項に記載の S MP 30欠損非ヒト動物。

8. 前記 SMP 30欠損非ヒト動物がマウスであることを特徴とする、請求項 1から 7のいずれか 1項に記載の SMP30欠損非ヒト動物。

9. SMP 30欠損非ヒト動物を SMP 30で免疫して得られた、 SMP30 又はその一部ペプチドを抗原とする抗体。

10. 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載の S MP 30欠損非ヒト動物を免疫して得られた、 SMP 30又はその一部ぺプチドを抗原とする抗体。

I I. 脊椎動物の SMP 30若しくはその一部ペプチド又は脊椎動物の一部の

SMP30若しくはその一部べプチドを共通抗原とする抗体。

12. 前記脊椎動物が、哺乳動物であることを特徴とする、請求項 11に記載の抗体。

13. マウス、ラット、ヒト、ゥサギ、ゥシ、ィヌ、ブ夕、及び力エルのうちいずれか 1種の SMP 30若しくはその一部ペプチドで免疫して得られた抗体で、マウス、ラット、ヒト、ゥサギ、ゥシ、ィヌ、ブ夕、及び力エルすベての、若しくはこれらのうちの 2種類以上の、 SMP30若しくはその一部ペプチドを共通抗原とすることを特徴とする抗体。

14. ラヅト SMP 30を SMP 30^損マウスに免疫して得られた、マウス、ラヅト、ヒト、ゥサギ、ゥシ、ィヌ、ブ夕、及び力エルすベての SMP 30若しくはその一部ペプチドを共通抗原とすることを特徴とする抗体。

15. 前記抗体が、アミノ酸の付加、置換、欠失、挿入により修飾された SMP 30で免疫して得られたことを特徴とする、請求項 9から 14のいずれか 1項に記載の抗体。

16. 前記抗体が、ポリクローナル抗体であることを特徴とする、請求項 9から 15のいずれか 1項に記載の抗体。

17. 前記抗体が、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであることを特徴とする、請求項 9から 15のいずれか 1項に記載の抗体。

18. 染色体 S MP 30遺伝子において、少なくとも一部の DNA配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、若しくは少なくとも一部の DNA配列を他の配列で置換するか、又はこれらの組み合わせによつて機能が欠損した変異型 S M P 30遺伝子を作製することを特徴とする、 SMP30欠損非ヒト動物の作製方法。

19. 染色体 SMP 30遺伝子の発現の過程または S MP 30のプロセッシングの過程に関わる遺伝子産物をコ一ドする遺伝子において、少なくとも一部の D NA配列を欠失させるか、他の配列を挿入するか、若しくは少なくとも一部の D NA配列を他の配列で置換するか、又はこれらの組み合わせによる、 SMP30 欠損非ヒト動物の作製方法。

20. SMP 30欠損非ヒト動物を免疫して、 SMP 30またはそのを抗原とする抗

SMP 30抗体を作製する、抗体の法。

2 1. 請雜 2 0に言適の方法において作製する抗 SMP 3 0抗体が、請頁 1 0から 1 5のいずれか 1項に言藤の抗ある、抗体の i i^法。

2 2. 言青求項 2 0に言 Bttの方法において乍製する抗 S MP 3 0抗体が、言青求項 1 6または請お頁 1 7に言 3«の抗体:であることを»とする、抗体乍^法。

2 3. SMP 3 0欠損非ヒト動物を免疫して、 SMP 3 0またはその ~¾を擺とする抗 SMP 3 0抗体を; βするハイプリドーマを作製する、ハイプリドーマ作 S¾¾。

2 4. t ¾¾SMP抗体が、請棚 9から 1 5のいずれか 1項に謹の抗体である、請求項 2 3に ΐ のハイプリドーマ作 ¾法。

2 5. 脊棚物間のアミノ酸の相同性が 4 0%miであるタンパク質を願とする抗体又はそのお源^性フラグメントの作不法であって、当^^の欠損動物を免疫して当! 原に対する抗体又はその½ ^^性フラグメントを作製する、抗体の法。

2 6. 哺季瞧間のアミノ酸の相同性が 5 0 % であるタンパク質を観とする抗体又はそのお源 1^1、生フラグメントの作^法であって、当 |¾¾ ^の欠損動物を免疫して当 |¾¾ 原に対する抗体又はその ¾¾ 性フラグメントを作製する、抗体の im^法。