WO2002031139A1

WO2002031139A1 - Compulsive transporter expression vector for organ infection

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Publication number: WO2002031139A1
Application number: PCT/JP2001/008894
Authority: WO
Inventors: Akira Tsuji; Yoshimichi Sai; Ikumi Tamai
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2000-10-10
Filing date: 2001-10-10
Publication date: 2002-04-18
Anticipated expiration: 2003-04-10
Also published as: JP2002112769A

Description

明細書臓器感染用トランスポーター強制発現べクタ一技術分野

本発明は、トランスポーター遺伝子を含む臓器感染用トランスポ一ター強制発現ベクターやその使用、より詳しくは、トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に、該トランスポ一夕一遺伝子を強制発現させるために用いられる臓器感染用トランスポ一夕一強制発現べクタ一や、かかる臓器感染用トランスポ一ター強制発現ベクターを用いて臓器における物質輸送を促進する方法に関する。背景技術

細胞内外の物質輸送を行う膜タンパク質等はトランスポ一夕一と呼ばれ、脂質二重膜中に埋め込まれているトランスポーターに特定の分子が結合すると、コンフオメ一シヨンが変化して物質が取込みあるいは排出輸送されることが知られている。近年、かかるトランスポーター、例えば有機ァニオン性物質を輸送する O A T 1等の有機ァニオントランスポーター、有機カチオン性物質を輸送する〇C T 1等の有機カチオントランスポ一夕一、ぺプチド性物質を輸送する P E P T 1 等のペプチドトランスポーターなどの遺伝子が相次いで単離 ·同定されている。これらトランスポーター遺伝子は、全身の正常組織 ·臓器に偏在しているものもあるが、腎臓、肝臓、脳などといった特定の組織 ·臓器に局在するものも知られている。例えば、生体'異物や薬物の代謝および体外排出に関して重要な役割を果たしている肝臓や腎臓の肝細胞や尿細管細胞に局在するトランスポ一夕一により、有機ァニオン性物質が側底膜を介して肝臓や腎臓中に取り込まれたり、また細胞内代謝により産生された有機ァニオン性物質が排出される。表 1〜3に、従来報告されているトランスポー夕一の種類、名称、遺伝子バンクにおけるァクセッシ

CO

医薬品の投与形態の中でも、経口投与は簡便さ、苦痛の少なさなどの点から有用であり、経口で効果の得られる医薬品を開発することは重要である。経口で用いられた薬物が効果を発揮するためには、小腸での吸収性は大切な因子のうちの

1つであるが、いくつかの薬物においては小腸から吸収されにくいものがある。そこで難吸収性の薬物の吸収を改善する方法の一つとして、トランスポーターを利用した薬物のドラッグデリバリーシステムが期待できる。例えば、 ]3 -ラクタム抗生物質のうち経口投与可能な薬剤である cephradine, cephalexin, cefixime, ceftibutenなどは、小腸の刷子縁膜においてオリゴペプチドの有効な吸収に関与しているぺプチドトランスポ一ター P E P T 1 (Fei et al., Expression cloning of mammalian proton-coupled oligopeptide transporter. Nature, 368： 563-566 (1994))を介して輸送されることが知られている (Okano et al., H⁺ coupled uphill transport of aminocephalosporins via the dipeptide transport system In rabbit Intestinal brush-border membranes. J. Biol. Chem., 261： 14130-14134ひ 986)、 Tsuji et al., H⁺ gradient-dependent and carrier-mediated transport of cefixime, a new Cephalosporin antibiotics, across brush-border membrane vesicles from rat small Intestine. J. Pharmacol. Exp. Ther., 241： 594-601 (1987)、 Takahashi et al., Interaction of beta-lactam antibiotics with H⁺/ peptide cotrasporters in rat renal brush-border membranes. J. Phamacol. Exp. Ther., 286： 1037-1042 (1998)、 Ganapathy et al., differential recognition of beta-lactam antibiotics by intestinal and renal peptide transporters, PEPT1 and PEPT2. J. Biol. Chem., 270 : 25672-25677 (1995))。しかし、一部の i3 -ラクタム系抗生物質は消化管で吸収されにくいため注射剤として投与されている。例えば、これら難吸収性の i3 - ラクタム系钪生物質を経口投与できるようにするため、トランスポー夕一を小腸に発現させると、消化管吸収の改善をはかることが期待できる。また、発現させたトランスポーターの機能を解析することにより、どの程度吸収過程にトランスポーターが寄与しているかを知ることもできる。 /3 -ラクタム系抗生物質を輸送する代表的なトランスポ一夕一として、腎に発現する有機ァニオントランスポ一夕一（O A T 1 ) が知られている (Tsuji et al., In vivo evidence for carrier-mediatea uptake of beta-lactam antibiotics through organic anion transport systems In rat kidney and liver. J. Phamacol. Exp. Ther., 253： 315-320 (1990)、 Jariyawat et al., The interraction and transport of beta-lactam antibiotics wit the cloned rat renal organic anion transporter 1. J. Phamacol. Exp. Ther., 290： 672-677 (1999))。 O A T lは 1 9 9 7年、ラット腎ょり Sekine らにより単離されている (Sekine et al., Expression cloning and characterization of a novel multispecific Organic Anion Transporter. J. Biol. Chem., 272： 18526-18529 (1997》。 O A T lは外来性遺伝子発現系であるァフリカツメガエル卵母細胞（Xenopus laevis oocytes)に発現させると p- aminonippurate, cyclic AMP, cGMP, prostaglandin E2， urate, - ketoglutarate, methotrexateなどを輸送し、様々な有機ァニオンにより阻害される ι_とカ不 eれている (Sekine et al., Expression cloning and characterization of a novel multispecific Organic Anion Transporter. J. Biol. Chem., 272 ： 18526-18529 (1997))。 O A T 1は腎において近位尿細管の基底膜側に発現しており、基質認識性が広く腎からのァニオンの薬物の排出に中心的役割を果たしていると考んられている（TJwai et a丄.， functional characterization of the rat multispesific organic anion transporter OATl mediating basolateral uptake of anionic drugs in kidney. FEBS Letter, 438 ： 321-324 (1998)、 Tojo et al., Immunohistochemical localization of multispecific renal organic anion transporter 1 In rat kidney. J. Am. Soc. Nephrol., 10： 464-471(1999))。そこで、経口投与可能な i3 -ラクタム系抗生物質の輸送が示唆されている P E P T 1と基質認識性が異なり、本来小腸には発現していない腎トランスポーター〇 A T 1を小腸に発現させることにより、難吸収性の )3 -ラクタム系抗生物質吸収促進が期待できる。また、 O A T 1を小腸に発現させた場合であっても、取込み方向の輸送に作用するか、排出方向の輸送に作用するかが問題となる。トランスポーターが細胞膜上に発現するときの sortingのメカニズムについてはよく分かっていないが、腎において〇 A T 1が基底膜側に発現し有機ァニオン性物質の排出方向の輸送を担つているとすると、小腸においても同様に基底膜側に発現し管腔側に排出するという取込み方向とは逆の輸送を行うという可能性もある。しかし、刷子縁膜側で OA T 1が発現したなら、 O A T 1は有機ァニオンとジカルボン酸の交換輸送体であるため、小腸上皮細胞内 glutarateの濃度が高いと、 glutarateとの交換輸送が起こり有機ァニオン性物質が取込み方向に働く可能性も考えられる。いずれにしても、〇 A T 1遺伝子が本来発現していない小腸に O A T 1を効率よく発現させる O A T 1遺伝子のデリバリ一システムを利用すると、小腸における有機ァニオン性物質の吸収方向あるいは排出方向の輸送活性を付与することが期待できる。脳は血液脳関門を形成する毛細血管内皮細胞を介して、脳内不要代謝産物の体循環中へ排除 ·生体異物の進入遮断を行い脳内と体循環との間の物質交換を厳密に制御しており、このことが中枢に標的部位を持つ薬物の脳送達を非常に困難なものとしている。一方で血液脳関門は、中枢機能の発現 Z維持に必要な物質を積極的に体循環系から摂取する機能も同時に併せ持つ。このような血液脳関門の物質交換におけるダイナツミックインタ一フェース機能は、そこに発現するトランスポ一夕一によって担われていることが近年明らかにされつつある。トランスポ一夕一の中には幅広い基質認識特性を持つものが存在し、本来生体異物である薬物をも誤認識して輸送することが知られていることから、送達したい薬物のトランスポ一ターを血液脳関門に発現させることにより、薬物の脳へのタ一ゲティングが可能となることが期待できる。

本発明の課題は、各種臓器が本来有していない物質輸送機能を該臓器に付与し、該臓器への薬剤、栄養物質等の有用物質の取込み輸送を促進したり、あるいは該臓器から排泄物質等の排出輸送を促進するために用いられる臓器感染用トランスポ一ター強制発現ベクターや、かかる臓器感染用トランスポ一夕一強制発現べクターを用いる各種臓器における物質輸送を促進する方法を提供することにある。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、目的とするトランスポ一夕一遺伝子が本来発現していない臓器に、該目的トランスポーター遺伝子を強制的に発現させることにより、該臓器における有用物質の取込み輸送能や排泄物質等の排出輸送能を促進 ·付与することができるのではないかとの知見を得、ィンビトロでヒトゃマウスなどの多くの種の動物に、経口により細胞株を樹立することなく直接的に遺伝子を生体に発現させることができ、高い効率で細胞系や生体の臓器における遺伝子発現が可能で、かつ一過性に発現させることができるァデノウィルスベクターを、トランスポ一夕一 O A T 1遺伝子発現用ベクターとして用い、ヒト大腸癌由来の細胞株を形質転換し、この大腸細胞株を使用して薬剤の輸送実験を行い、薬剤の排出輸送能が促進されることを確認し、本発明を完成するに至った。発明の開示

すなわち本発明は、目的とするトランスポーター遺伝子を含む発現べクタ一であって、該目的トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に、該目的トランスポー夕一遺伝子を強制発現させるために用いられることを特徴とする臓器感染用トランスポーター強制発現べクタ一（請求項 1 ) や、トランスポー夕一遺伝子が有機ァニオントランスポ一夕一遺伝子であることを特徴とする請求項 1記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター（請求項 2 ) や、トランスポ —夕一遺伝子が有機カチオントランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求項 1記載の臓器感染用トランスポ一ター強制発現べクタ一（請求項 3 ) や、トランスポーター遺伝子がぺプチドトランスポー夕一遺伝子であることを特徴とする請求項 1記載の臓器感染用トランスポータ一強制発現べク夕一（請求項 4 )や、トランスポーター遺伝子を含む発現べクタ一が、トランスポーター遺伝子とマ一カー遺伝子を含む発現べクタ一であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現べクタ一（請求項 5 ) や、マーカ一遺伝子が、蛍光性タンパク質をコードする D N Aであることを特徴とする請求項 5記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター（請求項 6 ) や、発現べクタ一が、アデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項 1〜6のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現べクタ一（請求項 7 ) や、トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器が小腸であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の臓器感染用卜ランスポー夕一強制発現ベクター（請求項 8 ) や、トランスポー夕一遺伝子が本来発現していない臓器が大腸であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター（請求項 9 ) や、トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器が血液脳関門であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター（請求項 1 0 ) に関する。

また本発明は、目的とするトランスポーター遺伝子を含む発現べクタ一を、該目的トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現させることを特徴とする臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 1 1 ) や、トランスポーター遺伝子が有機ァニオントランスポ一夕一遺伝子であることを特徴とする請求項 1 1記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 1 2 ) や、トランスポーター遺伝子が有機カチオントランスポー夕一遺伝子であることを特徴とする請求項 1 1記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 1 3 ) や、トランスポーター遺伝子がペプチドトランスポ一夕一遺伝子であることを特徴とする請求項 1 1記載の臓器における物質輸送能を付与 · 促進する方法（請求項 1 4 )や、トランスポーター遺伝子を含む発現べクタ一が、トランスポ一夕一遺伝子とマーカ一遺伝子を含む発現べクタ一であることを特徴とする請求項 1 1〜1 4のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 1 5 ) や、マ一カー遺伝子が、蛍光性タンパク質をコードする D N Aであることを特徴とする請求項 1 5記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 1 6 ) や、発現べクタ一が、アデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項 1 1〜1 6のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 1 7 ) や、トランスポ一夕一遺伝子が本来発現していない臓器が小腸であることを特徴とする請求項 1 1〜1 7のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 1 8 ) や、トランスポ一ター遺伝子が本来発現していない臓器が大腸であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 7のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 1 9 ) や、トランスポ一夕一遺伝子が本来発現していない臓器が血液脳関門であることを特徴とする請求項 1 1〜1 7のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 2 0 ) や、臓器における物質輸送が、該臓器における物質の取込み制御輸送であることを特徴とする請求項 1 1〜 2' 0のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 2 1 ) や、臓器における物質輸送が、該臓器における物質の排出制御輸送であることを特徴とする請求項 1 1〜 2 0のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法（請求項 2 2 ) や、請求項 1〜1 0のいずれか記載の臓器感染用トランスポ一タ一強制発現べクタ一を用いることにより、物質輸送能が付与 ·促進された人工臓器（請求項 2 3 ) に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明における組換えアデノウイルスの構築システムを示す図である。

第 2図は、本発明におけるシャトルベクター及びアデノウイルスのバックポ一ンベクタ一を示す図である。

第 3図は、大腸菌での相同組換えによる本発明の組換；

ミドの構築を示す図である。

0 第 4図は、本発明の発現ベクター構築の相同組換えに用いる pAd rack-CMV- OAT1の電気泳動の結果を示す図である。

第 5図は、本発明の発現べクタ一構築の相同組換えに用いる pAdTrack-CMV- OAT1の直鎖化 DN Aの電気泳動の結果を示す図である。

第 6図は、ラット OAT 1の pAdEasy-1 ベクタ一への相同組換えの結果を示す図である。

第 7図は、本発明の発現べクタ一 pAd-OATlの電気泳動の結果を示す図である。第 8図は、ラット OAT 1特異的プライマーを用いた PCRの結果を示す図である。

第 9図は、本発明の発現べクタ一 pAd-OATlを HEK293細胞へトランスフェクシヨンした結果を示す図である。

第 10図は、本発明の発現べクタ一 pAd-OATlを C a c o— 2細胞へトランスフエクションした結果を示す図である。

第 11図は、 OAT 1発現 C a c o— 2細胞における [³H] PAHの取込み結果を示す図である。

第 12図は、 OAT 1発現 C a c o— 2細胞における [³H] PAHの透過性の結果を示す図である。

第 13図は、 OAT 1発現 C a c o— 2細胞におけるぺニシリン G存在下における [³H] PAHの透過性の結果を示す図である。

第 14図は、 PEPT 1発現 RBEC 1細胞における [³H] ジペプチドの取込み結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の臓器感染用トランスポー夕一強制発現べクタ一としては、目的とするトランスポーター遺伝子を含む発現べクタ一であって、該目的トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に、該目的トランスポーター遺伝子を強制発現させるために用いられるベクターであれば特に制限されるものではなく、また本発明の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法としては、目的とするトランスポ一ター遺伝子を含む発現べクタ一を、該目的トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現させる方法であれば特に制限されるものではなく、ここで臓器とは体内に存する脳（血液脳関門および脳実質）、腎臓、肝齓心臓、胃、小腸、大腸、肺臓、滕臓、卵巣、子宮、胎盤、骨格筋、甲状腺等の器官 - 組織等を意味する。

本発明において用いられるトランスポータ遺伝子としては、物質輸送能を担うトランスポータータンパク質をコードする遺伝子であれば特に制限されるものではなく、例えば前記表 1に記載されている、 ΟΑΤ 1、 OAT 2、 OAT 3、〇AT4、 OATP— A、〇ATP_B、 OATP— C、 OATP— D、 OAT P— E、 PGT、 OAT— Kl、 Np t l、 MCT1、 AE2等をコードする有機ァニオントランスポーター遺伝子や、 OCT l、 OCT 2, OCT 3, OCT Nl、 OCTN2、 OCTN3等をコードする有機カチオントランスポーター遺伝子や、 PEPT1、 PEPT 2等をコードするペプチドトランスポー夕一遺伝子や、アミノ酸トランスポ一ター、 MDR 1、 MRP 2等をコードする ABCトランスポ一夕一遺伝子を挙げることができる。これらの中でも、化学構造の異なる多くの有機ァニオンを輸送することのできるトランスポー夕一であり、種々のァニオン性薬物の輸送も行っており、その発現が腎特異的で、腎以外では脳に極めてわずかな発現をみるのみである〇 AT 1を好適に例示することができる。これらトランスポーター遺伝子の由来としては特に制限されるものではなく、例えばヒト、ィヌ、ゥシ、ゥマ、ャギ、ヒッジ、サル、ブ夕、ゥサギ、ラット、マウスなどを挙げることができる。

上記本発明におけるトランスポ一夕一遺伝子を含む発現べクタ一には、トランスポーター遺伝子に加えてマーカ一遺伝子を含ませることができ、トランスポー夕一遺伝子とマーカー遺伝子を含む発現べクタ一を用いることにより、各種臓器

2 に本発明の臓器感染用トランスポー夕一強制発現べクタ一が感染したことを簡便に確かめることができる。かかるマ一カー遺伝子としては、各種臓器に上記臓器感染用トランスポーター強制発現べクタ一が感染したことを簡便に確かめることができるものであればどのようなものでもよく、例えば、 j3—ガラクトシダ一ゼ、ペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ゥレアーゼ、力タラ一ゼ、 β一ダルク口ニダーゼ、西洋ヮサビペルォキシダーゼ等の酵素をコードする D Ν Αや、抗体の F c領域をコードする D NAや、 G F P (グリーン蛍光タンパク質）等の蛍光発光タンパク質をコードする D N Aや、ネオマイシン耐性遺伝子、ピュー口マイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ジフテリアトキシン耐性遺伝子、 a 1と n e o ^Rの融合遺伝子（j3— g e o ) 等の選択マ一力一遺伝子などを具体的に挙げることができるが、これらの中でも G F P遺伝子等の蛍光性夕ンパク質をコードする D N Aが感染確認の容易さからして好ましい。かかる G F Pには、 E G F P ( Enhanced GFP )、 E Y F P ( Enhanced Yellow Fluorescent Protein)、 Eし P (enhanced CYAN fluorescent protein) (肓色)、 D s R e d (赤色）等の蛍光波長の異なる誘導体が存在し、多重ラベルを行うこともできる。

本発明に用いられる発現べクタ一としては、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞 (血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991) や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスべクタ一（Microbiology and Immunology, 158， 1-23, 1992) や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウィルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158， 97-129, 1992) や、リポソ一ム等を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの中でも、経口により細胞株を樹立することなく直接的に遺伝子を生体に発現させることができ、高い効率で細胞系や生体の臓器における遺伝子発現が可能なアデノウイルスべクターが特に好ましい。また、これらの発現ベクターへのトランスポーター遺伝子の導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現べクタ一中の適当なプ口モーターの下流にトランスポー夕—遺伝子等を揷入することにより発現べクタ一を構築することができる。

本発明において、目的とするトランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器としては特に制限されるものではなく、例えば、該目的トランスポーター遺伝子として、〇 A T 1等の腎細胞に局在する有機ァニオントランスポ一夕一遺伝子を用いる場合、小腸、大腸、直腸等を好適に例示することができる。この場合、小腸、大腸、直腸等における薬剤、栄養物質等の有用物質の取込み輸送能の向上や排泄物等の排出輸送能の向上が期待でき、例えば腎不全患者における小腸、大腸、直腸等が腎機能の代替を果たすことが期待できる。また、目的とするトランスポーク一遺伝子が本来発現していない臓器としては、該目的トランスポ一タ一遺伝子として、 P E P T 1等の小腸等に局在するべプチドトランスポーター遺伝子を用いる場合、血液脳関門（脳毛細血管内皮細胞）等を好適に例示することができる。この場合、抗癌剤の脳腫瘍への効率のよい輸送、パーキンソン病治療薬である L—ドーパのジペプチド誘導体の脳への効率のよい輸送が期待できる。また、本発明の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法としては、目的とする前記トランスポーター遺伝子を含む発現べクタ一を、該目的トランスポー夕一遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現させることにより、かかる臓器における有用物質の取込み制御輸送や排泄物質等の排出制御輸送を付与する方法や、それらの物質輸送能を促進する方法などを具体的に挙げることができる。また、目的とする前記トランスポー夕一遺伝子を含む発現べクタ一を、該目的トランスポ一ター遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現させる方法としては特に制限されるものではなく、発現べクタ一を前記特定の臓器に感染させる公知の方法を用いることができ、例えば、発現ベクターが含まれるリボソームを経口投与することにより小腸や大腸に感染させたり、発現べクタ一を含む溶液を浣腸液として用いて大腸に感染させたり、特定の臓器においてのみ発現するプロモータ

4 一の制御下にトランスポー夕一遺伝子を挿入した発現べクタ一を用いることにより感染させることができる。

本発明の物質輸送能が付与 ·促進された人工臓器としては、上記の臓器感染用トランスポー夕一強制発現べクタ一を用いることにより得られる臓器であればその由来や種類は特に制限されるものではなぐ例えばハイプリッド型人工臓器 (病態生理 (1990)，Vol.9，No.ll,p.925-927) や、 E S細胞を用いたィンビトロで誘導した人工臓器や、 E S細胞を用いて膝体内で誘導した人工臓器や、本発明の臓器感染用トランスポー夕一強制発現べクタ一により物質輸送能が付与 ·促進された人ェ臓器を挙げることができる。

以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1 [O A T 1遺伝子のアデノウイルスベクターへのサブクローニング] 目的とするトランスポ一夕一遺伝子として O A T 1遺伝子を用い、〇A T 1の遺伝子を生体の臓器に発現させる方法としてアデノウイルスベクタ一を用いた。用いたアデノウイルスベクタ一は Heらによって開発されたもので (He, T.C. et al., A sim elified system lor generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci., 95： 2509-2514 (1998))、 2段階のサブクローニングを行うことにより作製することができる（図 1及び図 2参照）。このアデノウイルスベクターを用いる方法では、大腸菌中で相同組み換えを行い、 5 . 0 k bまでのインサートを高い効率で導入できる。はじめにシャトルベクタ一に目的とする〇A T 1遺伝子を組み込み、このシャトルベクターのアデノウイルスベクターとの相同部分を利用して、アデノウイルスの大部分の遺伝子を有するベクタ一との相同組み換えを行い、組み換えアデノウイルスベクターを作製した。このシャトルベクターは G F P (green fluorescent protein)遺伝子を持ち、 O A T 1遺伝子と別なプロモ一タ一から G F Pタンパク質を発現させることができる。 G F Pの利点は生細胞のままで簡単に解析できることであり、そのため経時的な観察が容易であり、

5 フエクシヨンやウィルスの感染効率の指標とすることができる。実施例 1一 1 (pAd rack-CMV-OATlの調製）

ラット OAT 1の遺伝子が組み込まれたプラスミド pSPORTl-OATl とシャトルベクター pAdTrack - CMVを、それぞれ 2つの制限酵素 Kpnlと Hind III で 3 7°Cで 2時間インキュベートした（表 4)。次いで、電気泳動にかけ、 QIAQuick Gel Extraction Kitを用い、ァガロースゲルから〇 A T 1の揷入部分とシャトルべクタ一の DN Aを精製し、 30 Lの Buffer PEに抽出した。

表 4

pSPORT-1-OATl (1.9 / μΐ) 1.1 μΐ 2

10 X M Buffer (Takara) 3 μΐ

Kpn I (Takara 10 U / JL/L ) 1 μΐ

Hind III (Takara 12 U / ji/L ) 0.5 μί

d. w. 24. μί

total 30 JL/L pAdTrack - CMV (1.1 μも / μΐ) 1.8 JL/L 2

10 X M Buffer (Takara) 3 μΐ

Kpn I (Takara 10 U / JL/L ) 1 μΐ

Hind III (Takara 12 U / JL/L ) 0.5 JL/L

d.w. 23.1 μΐ

total 30 μ シャトルべクタ一のクローニングサイトに OAT 1を組み込むため、上記精製した: DN Αのリゲ一シヨン反応を行い（表 5)、得られたベクター pAdTrack - CMV-OAT 1を増幅するためにエレクトロポレ一シヨンにより大腸菌にトランスフォーメーションを行った。エレクトロポレーシヨンは、サンプル lmmをキュベットに入れ、 GenepalserII(BIOLAD社製)を用い、 l kV、 200 、 25 Fで行った。表 5

pAdTrack - CMV (Hind III I Kpn I digest) 4.3 5 fmol, 30 ng pSPORT-l-OATl (Hind III / Kpn I digest) 2.2 μί 15 fmol, 22 ng 5 X Ligation Buffer (Gibco) 2 μΐ

T4 DNA Ligase (Gibco) 1 μί

d.w. 0.5 JL/L

total 10 μί 次いで、培養チューブに入った 500 xLの LB培地（ ryptone 10g, Yeast Extract 5g, NaCl lOg, 5N NaOH 0.2M1, Add water to lOOOmL) に移し、 1時間振とう培養した。 LBプレート培地（カナマイシン入り）に 250 /iLずつまきコロニーを作製した。 2mLの LB培地に pAdTrack一 CMV-OAT1のコロニーを攪拌させ 37 °Cでー晚振とう培養し、 QIAprep Spin Miniprep Kitを用いプラスミドを精製し、 50 Lの Buffer EBで抽出した。得られたプラスミド pAdTrack - CMV-OAT1の制限酵素処理（Hind III， Kpn I) を行い、電気泳動により（表 6 ) 大きさを確認した。図 4に、 pAdTrack - CMV-OAT1構築物の結果を示す。予想される断片のサイズは 9. 2及び 2. 2 kbである。

表 6

100V, 30min, 1.0 ^agarose I TAB， Marker ： λ I Hind III

PAdTrack - CMV-0AT1 (100 ng / μΐ) 2 μΐ 200 ng

10 X M Buffer (Takara) 3 JL/L

Kpn I (Takara 10 ϋ / μΐ ) 1 μί

Hind III (Takara 12 U / JL/L ) 一 23 jLL

total 30 μΐ 上記のように、アデノウイルスの遺伝子をもつベクタ一に OAT 1の DNAを導入する方法として 2段階のサブクロ一ニングを行った。図 3に、大腸菌内における相同組換えによる組換えアデノウイルスプラスミドの産生を示す。用いた O AT 1遺伝子は pSPORTlの Sal I, Not I siteに組み込まれており、この〇AT 1遺伝子の両端にある Kpnl, Hind III siteで切断し、電気泳動で分離して OAT 1の遺伝子を精製した。同様に制限酵素 Kpn I， Hind IIIで処理したシャトルべ

7 クタ一（pAdTrack-CMV) に OAT 1遺伝子を組み込み、 pAd ack-CMV-OATl を作製した。少量の pAd rack-CMV-OATlを再び制限酵素 Kpn I, Hind IIIで切断し、電気泳動で分離した（図 4参照)。予想される DNAの分子サイズは OAT 1のインサート部分の 2. 2 kbと残りの 9. 2 k bの 2本であり、 OAT 1が組み込まれていることを確認した。実施例 1一 2 (相同組み換えによる pAd-OATlの調製）

制限酵素処理（表 7 ) により実施例 1— 1で得られた pAd rack - CMV-OAT1 を制限酵素 Pme Iにより一本鎖にし、電気泳動（100V, 30min, 1.0 %agarose I TAE , Marker： λ /Hind III)により確認した（図 5参照）。次いで、フエノ一ル：クロロフオルム：イソアミルアルコール (25 : 25 : 1) 50 Lを加え vortex し、 2分間遠心し、上層をとりクロ口ホルム 50 xLを加え vortexし、 2分間遠心した。次いで、エタノール沈殿処理（5分間放置、 30分間遠心）を行い、ぺレットを 75 %エタノールで洗浄後、室温でエタノールを除去し、得られたペレットを蒸留水 12 / Lに溶解した。

表 7

PAdTrack - CMV-0AT1 20 μΐ 2 mg

10 X EBuffer 4 (Bio labs) 5 μΐ

10 X BSA (Biolabs) 5 juL

Pme I (Biolabs 10 U / μΐ) 1 μΐ

d. w. 19 μΐ

total 50 μΐ 上記 Pme I消化物とアデノウイルスベクター pAdEasy-1との相同組換えを行つた（表 8 )。サンプル 1 mmをキュべットに入れ、 Genepalser II(BIOLAD社製）でエレクトロボレ一シヨンを 1 kV、 200 Ω、 25 で行った。 LB 400 Lを加え 1 5時間カナマイシン含有プレート培地に培養した。 QIAprep Spin MiniprepKitを用い、プラスミドを精製し、 0. 8 %ァガ口一スゲル上で電気泳

8 動にかけ、ェチジゥムブロマイドで染色した。結果を図 6に示す。移動速度からして、 1〜8、 10及び 1 1列のクローンは潜在的に有効な組換え体と考えられた。

表 8

pAdTrack - CMV-0AT1 Pme I digest 11.5 μΐ 2 ing

p AdEasy-1 (100 ng / ji/L) 2 μΐ 200 ng

E.coli (B J5183) 40 μΐ 上記得られた pAd-OATlの制限酵素処理（BamH I,Pac I，Spe I) を行い電気泳動（表 9) により大きさを確認した。図 7に、代表的な制限酵素を用いた pAdEasy-1と pAd-OATlの電気泳動の結果と予想される断片の大きさを示す。表 9

100V, 30min, 0.8 ¾ agarose I TAB , Marker ： λ I Hind III Ad-OATl (0.65 / JL/L ) 1.3 JL/L 200 ng

10 X K Buffer (Takara) 5 juL

BamH I (Takara 12 U / JLL ) 0.5 μΐ

d.w. 7.2 juL

total 10 μΐ pAd-OATl (0.65 jug / JLL ) 1.3 JL/L 200 ng

10 X NEBufferl (Biolabs) 1 JL/L

100 X BSA (Biolabs) 0.1 μΐ

Pac I (Biolabs 4 U / JL/L ) 0.5 μΐ

d.w. 7.1 μΐ

total 10 μΐ

PAd-OATl (0.65 / μί ) 1.3 μΐ 200 ng

10 X H Bufferl (Boehringer) 1 JL/L

Spe I (Boehringer 10 U / jiL ) 0.5 μΐ

d.w. 7.2 μί

total 10 JL/L 上記のように、閉環状の pAdTrack - CMV- OAT1を制限酵素 Pme Iで処理し、 1力所だけで切断し直鎖状にした。この段階で電気泳動で確認したところべクタ一全長の 1 1 . 4 k bのところにシグナルが現れ、直鎖状になっていることを確認した（図 5参照）。 pAdTrack - CMV-OAT1の Pme I消化物とアデノウイルスベクター pAdEasy-1との相同組換えを行った。相同組み換えは E.coli (B J5183) にトランスフォ一メ一ションすることで行なった。 B J5183は Rec BCD変異体の大腸菌で相同組み換えが起こりやすい。この大腸菌をカナマイシン含有の L B プレート培地にまき、培養した。 pAdTrack-CMVはカナマイシン耐性の遺伝子を持っているので、相同組み換えにより閉環状のプラスミドになると耐性を獲得し、カナマイシン含有培地中でもコロニーを形成する。カナマイシン耐性を持たない pAdEasy-1や、耐性を持っていても直鎖状の pAdTrack - CMV-OAT1はコロニ一を形成しないので、選択的に目的とする pAd-OATlのコロニーが得られた。次レで QIAprep Spin Miniprep Kitを用い、大腸菌からプラスミドを精製した。電気泳動でサイズを確認し、 pAdEasy-1より大きなサイズの pAd-OATl と思われるべクタ一を選択した（図 6参照）。コロニーを選択するとき、より小さいコロニ一を選んだ方が pAd-OATlである確率が高いということがわかった。これは相同組換えが起こると全長が 3 8 k bと非常に大きいことから、大変不安定で成長するのも遅いためと思われる。

次いで、制限酵素処理により pAd- OAT1の確認を行った。 pAd-OATlの制限酵素処理（BamH I,Pac I,Spe I) を行い電気泳動により大きさを確認した（図 7 参照）。 3つの制限酵素でプラスミドを切断すると、制限酵素サイ卜から予想される数のバンドが検出された。予想される断片のサイズは、 BamH Iで切断したとき、大きさもほぼ予想したサイズになった。実施例 1一 3 ( P C Rによる各段階での O AT 1の遺伝子の確認）

サブクローニングのそれぞれの段階で O AT 1の遺伝子が含まれているかを P C R反応後の電気泳動により確認した。 O AT 1の全 D N A配列のうち 6 4 5 b ϋをはさむようにプライマ一を設計した。図 8にァガロースゲルを用いた上記 Ρ C R産物の電気泳動の結果を示す。 pAd rack - CMV-OAT1と pAd-OATlに 64

5 b pのところにバンドが認められた。実施例 2 [アデノウイルスを用いた O A T 1の過剰発現系の作製]

実施例 1において用いられているアデノウイルスベクターは、 E 1というアデノウィルスの遺伝子発現に必要な部分を欠損させた非増殖型のベクタ一である。 E 1はアデノウイルスの遺伝子発現に必要で、 E 1が欠損しているとウィルスの蛋白は産生されない。そこで E 1遺伝子を持続的に発現する、ヒト胎児腎 HEK 293細胞中で増殖させ、高力価のウィルス液にまで濃縮し、ウィルスの力価を算出した。また、このウィルス液を HEK293細胞以外の培養細胞あるいは動物組織に感染させたとき、感染力によりウィルスのゲノムは高率に核内へ導入されるが最初に発現すべき E 1遺伝子が欠損しているため、ウィルスは複製されることなく目的遺伝子だけが発現することになる。そこで、他のパッケージング細胞ではない細胞においても感染性があるか確認する必要がある。そこでブ夕腎由来の LLC一 PK 1細胞で GF Pが発現するか調べた。実施例 2— 1 (pAd-OATlの調製）

Endo Free Plasmid Maxi kitにより H E K 293にトランスフエクシヨンするためのエンドトキシンのない pAd-OATlを以下のように大量調製した。まず、 5mLの LB培地に pAd-OATlで感染した大腸菌のコロニーをとり、ー晚 37 °C で振とう培養し、増殖した大腸菌をさらに坂口フラスコ 2本に入れた 50 OmL の LB培地中に加え、ー晚 37 °Cで振とう培養した。冷却後、 50 OmL遠心チュ一ブ 2本に分け、.2500 gで 15分間遠心した。 Endo Free Plasmid Maxi kit により pAd-OATlを 1 mLの Beffer TEに抽出し、そのうちを精製水で 100倍希釈し、波長 260 nmにおける吸光度（OD ₂₆₀) を測定し、 OD₂₆ 。== 1を 50 g/mLとして定量した。次いで、制限酵素 Paclを用いる他は実施例 1一 2と同様にして pAd-OATlを一本鎖状の DN Aにした。実施例 2— 2 (ヒト胎児腎由来 HEK2 9 3細胞の培養）

ヒト胎児腎由来 HE K 2 9 3細胞の培養を DM EM培地（ 1 L当たり、 Dulbecco's Modified Eagle Medium 1 3. 5 g、炭酸水素ナトリウム 3. 7 g、ペニシリン Gカリウム 7 0mg、ストレプトマイシン硫酸塩 1 3 9mg) で行つた。培養後、シャーレ上の培地をァスピレ一夕一により取り除き、 PB Sで洗、净後にトリプシン ' EDTA液 5mLを加えて 5〜 1 0分間細胞がシャーレから剥がれるまで放置し、細胞が完全に剥がれたら、 DMEM培地に懸濁し、遠心後に上清をァスピレーターにより除去し、 DMEM培地 1 OmLを加えて懸濁し、この懸濁液中の細胞数を計数板にて計測した。 Φ 1 0 cmシャーレの場合は 1〜2 X 1 0⁶個の割合で、 φ 1 5 cmシャーレの場合は 3〜4 X 1 0⁶個の割合で細胞を播き、シャーレを縦横に揺さぶり、細胞がシャーレ上に均一になるようにした。実施例 2— 3 (pAd-OATlの HEK2 9 3細胞へのトランスフエクシヨン；一次ウィルス液の作製）

実験を行う前日に HEK 2 9 3細胞を 2倍に希釈して 2 5 Tフラスコ 1本にまき、細胞が 5 0〜7 0 %コンフレントに達するまで培養した。組み換えアデノウィルスベクター pAd-OATl4〃 g (2 0 /i L) とリポフエクタミン 2 0 Lにそれぞれ無血清培地（opti-mem-I) 5 0 0 Lを加え、室温で 1 5〜 3 0分間放置した。これら 2つの溶液を混ぜ合わせ 1 5〜40分間室温で放置し、 DNAとリポソームの複合体を作製した。 HEK 2 9 3細胞の培養液を捨て、 4mLの P B S (一）で細胞を洗った。無血清培地 2. 5mLを加え 3 7°Cのインキュベータ —で 1 0分間放置し、リボソーム溶液を細胞の入ったフラスコに加えて 3 7°Cのインキュベーターで 4時間放置した。培地を捨て、 6mLの DMEMを加え、 3 7°Cインキュベーターで 4日間培養した。実施例 2— 4 (ウィルスの回収）

ウィルスを感染させてから 9日後、蛍光顕微鏡で G F Pの発現の様子を観察し (図 9参照）、細胞をラバ一ポリスマン（coster 3010) で剥がし、遠心管に移した後、 1000 r pmで 5分間遠心し、 3mL残して後は捨てた。遠心管をメタノール/ドライアイスにつけ、細胞を急速に凍結させ、 37°C水浴で溶解させた。この操作を 3回くり返し、細胞質内からウィルスを放出させた。 l O O O r pm で 5分間遠心し、上清を新しい遠心管に採り、一次ウィルス液とした。蛍光のみによる観察結果を図 9 Aに、位相差像と蛍光両方をあわせた観察結果を図 9 Bに示す。実施例 2— 5 (アデノウイルスの HEK293細胞への感染；二次ウィルス液の作製）

実験を行う前日に HEK293細胞を 2倍に希釈して 25Tフラスコ 1本にまき、細胞が 50〜70%コンフレントに達するまで培養した。 HEK293細胞に一次ウィルス液を lmLずつ 25 Tフラスコ 2本に加え、ウィルスを細胞に感染させた。 6日後、蛍光顕微鏡で GFPの発現の様子を観察し、同様に細胞をはがし 1本の遠心チューブに集め遠心し、 5〜6mL残して培地を捨てた。以後、実施例 2— 4と同様にして二次ウィルス液を得た。位相差像と蛍光両方をあわせた観察結果を図 9 Cに示す。実施例 2— 6 (アデノウイルスの HE K 293細胞への感染；三次ウィルス液の作製）

HEK293にウィルス液を lmLずつ 25 Tフラスコ 4本（ 75 T 1本、 2 5 T 1本）に加え、二次ウィルスを細胞に感染させた。 2日後、蛍光顕微鏡で G FPの発現の様子を観察した。結果を図 9Dに示す。実施例 2— 4と同じように細胞をはがし遠心し、培地を捨てた。 1 2mLの opti-nenlを加え、以後、実施例 2— 4と同様にして三次ウィルス液を得た。図 9 Dは位相差像と蛍光両方をあわせたものであり、図 9 Dからほぼ 1 0 0 %感染するまでにウィルス液を濃縮できたことがわかった。実施例 2— 7 (三次ウィルスの力価の測定）

HEK2 9 3細胞を 6ゥエルのディッシュ 2枚にまいた。細胞がコンフルェントになった段階で三次ウィルスを段階希釈して細胞にかけた。 2日後、培地を交換し、ウィルス液を取り除いた。 2日後と 5日後に蛍光顕微鏡で GF Pの発現を確認し、単位面積当たりの蛍光を発している細胞数の割合を求め、三次ウィルスの力価を次の計算により求めた。三次ウィルスを HEK2 9 3細胞に感染させたときの感染した細胞の割合を、 GF Pの蛍光がみえる細胞の数をもとに計算した。 1 (i L/ 9. 5 cm²でインフエクションしたときコンフルェントになった HE K2 9 3の細胞数を 1. 2 X 1 0⁷ cells/ 7 5 cm²と仮定すると、全細胞に占める GF Pの発現細胞の割合は 7. 5 %であった。 HEK2 9 3細胞での三次ウイルスの力価を、 1. 1 X 1 0⁸P FU (Plaque-forming unit per cell) ZmLと見積もった。実施例 3 [〇八丁1発現じ &じ o— 2細胞における物質輸送]

小腸のモデル細胞である C a c o— 2細胞に組換えアデノウイルスを感染させ、 0 AT Iの輸送機能、すなわち 0 AT 1が取込み方向の輸送に作用するか、排出方向の輸送に作用するかを調べた。かかるヒト大腸癌由来の C a c o— 2細胞を用いて発現させた〇 AT Iの機能や輸送活性を調べるため、まず、実際に組み換えアデノウイルスが C a c 0 - 2に感染し OAT 1を発現するかどうかを調べた。本実施例で用いたアデノウイルスベクターは GFP遺伝子を持っているため、トランスフエクシヨンや感染の効率の指標となることから、 C a c 0— 2に組み換えアデノウイルスを感染させ、 GFPの発現効率を調べた結果、 GFPの発現から O AT 1の発現がほぼ予測することができた。次いで、ディッシュ法により 0 AT 1発現 C a c o— 2細胞における [³H] パラアミノ馬尿酸（PAH) の取込みについて調べた。次に、カップ法により O AT 1発現 C a c o_ 2細胞における物質輸送の方向、すなわち管腔側（AP) から側底膜側（BP) 方向か、あるいは側底膜側（BP) から管腔側（AP) 方向かを、 [³H] PAHの透過量により調べた。これらの実験により、本発明の臓器感染用トランスポー夕一強制発現べクタ一の有効性を確認した。実施例 3_ 1 (ヒ卜大腸癌由来 C a c o— 2細胞の培養）

液体窒素タンクから取り出した C a c o— 2細胞を、 37 で解凍し、改変 D M E M培地（ 1 L当たり、 Dulbecco's Modified Eagle Medium 27 g、炭酸水素ナトリウム 44mM、ペニシリン Gカリウム 100UZmL、ストレプトマイシン硫酸塩 100 g/mL、； L—グルタミン 2mM、Neaa lmM、 FBS 10%) で懸濁し遠心する洗浄操作を 2回行った後、 5%炭酸ガス下 37°Cで 4〜7日間培養した。培養後に培地を捨て 0. 25%HBS S (Ca²⁺、 Mg^{2 +}フリー）で細胞単層を 2回洗浄し、トリプシン · EDTA溶液を用いて剥離処理を行い、.細胞懸濁液を調製し、細胞計数板で細胞数を計測し、ディッシュには rat tail collagenでコーティングした上に 1. 26 X 10⁵cells/mL (1. OmLZゥエル）、カップには 1. 26 X 10⁵cells/mL (0. 5mLZカップ）の細胞を用いた。培養 4日目から培地を交換し、以後 1日おきに交換して培養した。実施例 3— 2 (Ca c o— 2における GFPの発現）

C a c o— 2細胞へのウィルスの感染を次のようにして調べた。 C a c o— 2 細胞を 4ゥエルのディッシュ 2枚にまいた。ディッシュはあらかじめコラーゲンコートしたものを使用した。細胞がコンフルェントになった段階で、三次ウィルスを MOI (multiplicity of Infection) 75, 15, 4に段階希釈した。コンフルェントな C a c o— 2細胞の密度を 1 X 10⁷ cells/ 75 cm²と仮定して、表 10 に示す量の三次ウィルスを細胞にかけて感染させた。感染 2日後に培地を除去し、ウィルスを取り除いた。 2日後と 5日後に蛍光顕微鏡で GFPの発現を観察した。図 10は GFP発現の様子を示す図である。 MOI 75では十分な発現が見られたが、 MOI 1 5、 4とウィルス量が少なくなるに従って GF Pの発現も減少した。 2日目と 5日目では感染効率はほとんど変わらず、 GFPの発現は少なくとも 5日持続することがわかった。十分な感染を得るためには MOI 75の濃度のウイルスを使う必要があることがわかった。

表 10

M0I 75 182 jL/L I well

15 36.4 μΐ / well

4 9.7 jL/L / well

0 0 実施例 3— 3 (ディッシュ法による OAT 1発現 C a c o— 2細胞における [³ H] PAHの取込み）

実施例 3— 1で調製したディッシュ内のゥヱル中の培養液を真空ポンプで吸引し、細胞を傷つけないようにして、細胞表面を 37°Cに温めた培地 lm 1で 3回洗い、最後に加えた培地をできるだけきれいに取り除いた。 OAT 1発現 C a c o— 2細胞（AdOATl) の対照として正常 C a c o— 2細胞（Normal) も同様にディッシュ内に調製した。各細胞をそれぞれ 2組用意し、一方のグループは予め ImMのダルタール酸溶液で 37°C、 30分プレインキュペートした。ディッシュ内を 37°Cとし、ゥエル内に 0. 16 Mの [³H] PAH溶液 210 Lを加え、インキュベートし、経時的にサンプリングした。細胞を可溶化するために、 5?^の &0«[500〃Lを加え振とうし、 5Nの HC 1 500〃Lで中和し、その溶液を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。結果を図 1 1に示す。図 1 1に示されるように、 OAT 1発現 C a c o_ 2細胞（AdOATl) においては、対照の正常 C a c o— 2細胞（Normal) に比べ、有意に [³H] PAHの取込み量が増加していた。また、ダル夕一ル酸溶液で予めプレインキュべ一卜した場合は取り込みの促進がみられた。このように、 OAT 1を発現させた C a c 0 一 2細胞で [³H] PAHの取込み量が増加したことから、管腔側で OAT 1が機能的に発現していると考えられる。実施例 3— 4 (力ップ法による 0 AT 1発現 C a c 0-2細胞における物質輸送方向）

(OAT1発現 C a c o— 2細胞における管腔側から側底膜側への透過実験）実施例 3— 1で調製したカップ内の培養液を捨てた後、培養液で 3回洗浄し、最後に加えた培地をできるだけきれいに取り除いた。 OAT 1発現 C a c 0 - 2 細胞（Caco-2/AdOATl) の対照として正常 C a c o一 2細胞（Caco-2/Normal) も同様に調製した。カップ内を 37°Cとし、側底膜側（basolateralside) に培地 1. 5mLを加え、直ちに、管腔側（Apical side) に 0. 16 Mの [³H] P AH溶液 510 Lを加え、ィンキュベートし、経時的に側底膜側からサンプリングした。各サンプリング時に 500 Lをサンプリングし、新たに 500 L の培地を側底膜側に加えた。各サンプルは、実施例 3— 3と同様にして液体シンチレーションカウンターで測定した。

(OAT 1発現 C a c o_ 2細胞における側底膜側から管腔側への透過実験）上記と同様に調製したカップ内の側底膜側（basolateralside) に 0. 16 ^M の [³H] ?八^1溶液1. 5mLを加え、直ちに、管腔側（Apical side) に培地 500 Lを加え、インキュベートし、経時的に管腔側からサンプリングした。各サンプリング時に 200 Lをサンプリングし、新たに 200 Lの培地を管腔側に加えた。各サンプルは、実施例 3— 3と同様にして液体シンチレ一シヨンカウンターで測定した。

これら透過実験の結果を図 12に示す。図 12に示されるように、カップ法により OAT 1を発現させた C a c o— 2細胞における側底膜側（BL) から管腔側（AP) 方向への [³H] PAHの透過量が有意に増加し、その比は約 1. 6 倍となった。また、その速度も細胞間隙マ一カーであるマンニ] ルの透過速度より 4. 5倍速いものであった。これらの結果から、〇八丁1発現〇&。 0— 2 細胞における輸送方向は、管腔側（AP) から側底膜側（BL) 方向ではなく、側底膜側 (BL) から管腔側（AP) 方向であり、 OAT 1は排出方向に輸送作用を有することがわかった。 OAT 1発現 C a c o— 2細胞における輸送方向が側底膜側（BL) から管腔側（AP) 方向であることを確認するために、上記透過実験における 0. 16 Mの [³H] PAH溶液に代えて、 1 OmMのぺニシリン G (PCG) 含有 0. 16 zM [³H] P AH溶液を用いて同様な透過実験を行った。結果を図 13に示す。図 13に示されるように、阻害剤 PCGによつて 0 AT Iを発現させた C a c o— 2細胞における側底膜側 (BL) から管腔側 (AP) 方向への [³H] PAHの透過量が、マンニトールレベルまで下がったことから、〇 AT 1の発現による分泌指向性を確認することができた。実施例 4 [PEPT 1発現 RBEC 1細胞における [³H] ジペプチドの取込み] 上記実施例 1と同様にして、トランスポ一夕 PEPT 1遺伝子を組み込んだ発現アデノウイルスベクター (AdhPEPTl-EYFP) を構築し、培養株化ラット脳毛細血管内皮細胞（RBEC 1) に感染させた。次に、上記実施例 3— 3に準じて、ディッシュ法による PEPT 1発現 RBEC 1細胞における [³H] G l y S a rの取込みについて調べた。結果を図 14に示す。図 14に示されるように、発現べクタ一（AdhPEPTl-EYFP) で感染された P E P T 1発現 R B E C 1細胞は、対照である感染されていない RB E C 1細胞に比べ、ジぺプチドの取込み量が有意に増加した。産業上の利用可能性

Claims

請求の範囲

1 . 目的とするトランスポーター遺伝子を含む発現ベクターであって、該目的トランスポ一夕一遺伝子が本来発現していない臓器に、該目的トランスポーター遺伝子を強制発現させるために用いられることを特徴とする臓器感染用トランスポ —タ一強制発現ベクター。

2 . 卜ランスポーター遺伝子が有機ァニオントランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求項 1記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター。

3 . トランスポ一タ一遺伝子が有機力チオントランスポータ一遺伝子であることを特徴とする請求項 1記載の臓器感染用トランスポータ一強制発現べクタ一。

4. トランスポーター遺伝子がペプチドトランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求項 1記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター。

5 . トランスポーター遺伝子を含む発現ベクターが、トランスポーター遺伝子とマーカー遺伝子を含む発現ベクターであることを特徴とする請求項 1〜 4のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター。

6 . マーカー遺伝子が、蛍光性タンパク質をコードする D N Aであることを特徴とする請求項 5記載の臓器感染用トランスポ一夕一強制発現べクタ一。

7 . 発現ベクターが、アデノウイルスベクタ一であることを特徴とする請求項 1 〜 6のいずれか記載の臓器感染用トランスポ一夕一強制発現べクタ一。

8 . トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器が小腸であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現べクター。

9 . トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器が大腸であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現べクター。

1 0 . トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器が血液脳関門であることを特徴とする請求項 1〜 7のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現ベクター。 .

1 1 . 目的とするトランスポ一夕一遺伝子を含む発現ベクターを、該目的卜ランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器に強制発現させることを特徴とする臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。

1 2 . トランスポ一夕一遺伝子が有機ァニオントランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求項 1 1記載の臓器における物質輸送能を付与'促進する方法。

1 3 . トランスポー夕一遺伝子が有機カチオントランスポーター遺伝子であることを特徴とする請求項 1 1記載の臓器における物質輸送能を付与 '促進する方法。

1 4 . トランスポー夕一遺伝子がペプチドトランスポ一夕一遺伝子であることを特徴とする請求項 1 1記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。

1 5 . トランスポー夕一遺伝子を含む発現べクタ一が、トランスポーター遺伝子とマーカ一遺伝子を含む発現ベクターであることを特徴とする請求項 1 1〜1 4 のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。

1 6 . マーカー遺伝子が、蛍光性タンパク質をコードする D NAであることを特徴とする請求項 1 5記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。

1 7 . 発現ベクターが、アデノウイルスベクタ一であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 6のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。

1 8 . トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器が小腸であることを特徴とする請求項 1 1〜 1 7のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。

1 9 . トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器が大腸であることを特徵とする請求項 1 1〜 1 7のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。

2 0 . トランスポーター遺伝子が本来発現していない臓器が血液脳関門であることを特徴とする請求項 1 1〜1 7のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。

2 1 . 臓器における物質輸送が、該臓器における物質の取込み制御輸送であることを特徴とする請求項 1 1〜2 0のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。，

2 2 . 臓器における物質輸送が、該臓器における物質の排出制御輸送であることを特徴とする請求項 1 1〜2 0のいずれか記載の臓器における物質輸送能を付与 ·促進する方法。

2 3 . 請求項 1〜1 0のいずれか記載の臓器感染用トランスポーター強制発現べクタ一を用いることにより、物質輸送能が付与 ·促進された人工臓器。