WO2002012867A1

WO2002012867A1 - Fluorescent probe for magnesium ion determination

Info

Publication number: WO2002012867A1
Application number: PCT/JP2001/006401
Authority: WO
Inventors: Koji Suzuki; Yoshio Suzuki; Kotaro Oka
Original assignee: KANAGAWA ACADEMY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY FOUNDATION; Kanagawa Academy of Science and Technology; Keio University; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: KANAGAWA ACADEMY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY FOUNDATION; Kanagawa Academy of Science and Technology; Japan Science and Technology Agency; Keio University
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2001-07-25
Publication date: 2002-02-14
Anticipated expiration: 2003-01-28
Also published as: US7109043B2; AU2002229152A1; US20040044228A1; JP3624214B2

Description

明細書

マグネシゥムイオン測定用蛍光プローブ

技術分野

本発明は、溶液中に存在するマグネシウムイオンを測定するための蛍光プロ一ブに関する。

背景技術

検体中のマグネシウムイオンを定量する方法としてイオン選択性電極、原子吸光光度法が挙げられる。イオン選択性電極は、様々なイオンの含まれた混合溶液中で、目的イオンに対して選択的に応答して電気化学的情報に変換し、その応答電位からイオン活量を導くセンサーである。また、原子吸光光度法は、原子蒸気化させた金属原子に特有の波長の光を照射し、その吸収量から定量を行う方法である。両者の方法とも感度、精度共に良い反面、前処理が必要であり、逐次モニタリングが不可能であることが指摘されている。

一方、先に述べた原子吸光光度法と同様、物質が光を吸収する過程及び発光する過程を利用して検体中の目的試料を定量する方法が、分光学の進歩と共に近年飛躍的に進歩している。中でも、蛍光光度法は、前処理が簡単でありリアルタイム測定が可能であること、高感度、高精度であること、及び蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡を初めとした測定機器の飛躍的な進歩もあり、生体内の金属ィォンの動的挙動を追跡できる手法の一つとして、現在広く汎用されている。中でもカルシウムイオンを測定する蛍光プローブは、本分野で最もシェアを占め、多数のカルシウムイオン選択性蛍光分子プローブが合成され、神経、筋肉、内臓の細胞中におけるカルシウムイオンの動態が蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡を用いることにより画像化され、医学、生物学の分野に大きく貢献している。

マグネシウムイオンは、緩化剤、酵素反応、さらには緑色植物の光合成反応を司る生体内の重要な金属イオンである。先に述べたカルシウムイオンの場合、多種多様な蛍光色素分子が開発され、生体内の挙動が明らかにされているのに対し、マグネシウムイオンの場合、有効な蛍光プローブが未だ開発されていない。その理由として、マグネシウムイオンはカルシウムイオンよりも水和エネルギーが大きく、水中において大きな結合定数を稼ぐことができないこと、及び、カルシゥムイオンとの競走反応が生じ、マグネシウムイオンと選択的に錯形成できないことが挙げられる。

発明の開示

従って、本発明の目的は、水系においてマグネシウムイオンと選択的に錯体を形成することができる、マグネシウムイオン測定用蛍光プローブを提供することである。

本願発明者らは、銳意研究の結果、環式構造上のージケトン構造が水系中のマグネシウムイオンと選択的に錯体を形成することを見出し、該構造を有する蛍光性分子がマグネシウムイオンに対して選択的な蛍光プローブとして用いることができることを実験的に確認し、本願発明を完成した。

すなわち、本発明は、下記一般式 [I]

(但し、式中、 R ¹は水素原子、金属原子又はエステル形成基、 Αは式中の炭素原子 1及び 2と共に環式構造を形成する原子団、 Xは蛍光性原子団であって、 A を含む環と縮合環を形成していてもよい）

で表される構造を有するマグネシウムイオン測定用蛍光プローブを提供する。また、本発明は、上記一般式 [ I ]で示される化合物のマグネシウムイオン測定用蛍光プローブを製造するための使用を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のマグネシウムイオン測定用蛍光プローブを、マグネシウムイオンを含む試料と接触させ、試料中のマグネシウムイオンと結合した該蛍光プローブの蛍光を測定することを含む、試料中のマグネシウムイオンの測定方法を提供する。

本発明により、水系において、カルシウムイオン共存下においても、マグネシゥムイオンと選択的に錯体を形成することができる、選択的なマグネシウムィォン測定用蛍光プローブが初めて提供された。本発明の蛍光プローブは、生体内でのマグネシウムイオンの挙動の解析等に大いに威力を発揮するものと考えられる。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の実施例 1で合成した蛍光プローブ KMG- 20投与後、 FCGPを添加した際の、添加後の時間（分）と、血管内皮細胞の蛍光顕微鏡画像の蛍光強度との関係を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

本発明は、環式構造上の一ジケトン構造が、水系において、カルシウムィォンの共存下であってもマグネシウムイオンと選択的に錯体形成するという、新知見に基づくものである。ここで、一ジケトン構造とは、メチレン基を介して 2 つのカルポニル基が結合されている構造を言う。分子中に、ージケトン構造が存在すれば、一ジケトン構造によって水系中のマグネシウムイオンが選択的にキレート化されるので、該分子が蛍光性を有する場合には、マグネシウムイオン選択的プローブとして用いることができる。従って、分子中に環式構造上のージケトン構造と、任意の蛍光性原子団とを含む分子はいずれも選択的マグネシゥムイオン測定用プローブとして利用可能であり、本発明の範囲内に含まれる。すなわち、本発明の蛍光プローブは、上記一般式 [ I ]で表される。

なお、一般に、蛍光性原子団が発する蛍光は、分子が金属と錯体形成することにより変化（増大又は減少）するので、この変化に基づきマグネシウムイオンを測定することができる。また、金属錯体の形成によって蛍光特性がほとんど変わらない場合でも、検体から未結合のプローブを除去することによりマグネシウムイオンの測定を行うことができる。なお、本明細書において、「測定」とは定量と検出の両者を包含'する。

上記一般式 [ I ]中、 R ¹は水素原子、金属原子又はエステル形成基である。金属原子の場合、水系媒体中で電離して C O O一基をもたらし、この C O O一基がマグネシウムイオンのキレー卜化の一翼を担うので、 R ¹は任意の金属原子であつてよく、例としてナトリウム及びカリウムのようなアルカリ金属等の 1価の金属原子を挙げることができる。また、「エステル形成基」とは、カルボキシル基とエステルを形成して C O O R ¹のエステル構造を構成している R ¹のことを意味する。 C O O R ¹の構造は、生体内でエステラーゼの作用を受けてエステル結合が切断されて c o o—基が生成され、この c o o一基がマグネシゥムイオンのキレート化の一翼を担うので、 R¹は何ら限定されるものではなく、任意の基であってよい。

プローブが一般式 [I]に示される構造を有する場合、一ジケトン構造が環式摴造により堅固に支持されているので、より的確にマグネシウムイオンをキレート化することができる。なお、 Aを含む環式構造は、ージケトン構造を環式構造上に支持するものであればいかなる環式構造であってもよいので、環式構造自体は何ら限定されない。通常、 5員環〜 7員環であり、ベンゼン環のような芳香環であってもよく、二重結合を含むことがあるシクロアルキルのような構造でもよく、複素環であってもよい。また、一般式 [I]の構造では、一方のカルポニル基を、カルボキシル基由来のものとしているため、 R¹を任意に選択することが可能であり、例えば、細胞中のマグネシウムイオンを測定する場合には、 R¹として、細胞膜を通過しやすくさせる構造を採用することができる。細胞膜を通過しゃすくさせる R¹の構造として、一般式 [IX]

— R⁹— OCO— R¹⁰ [IX]

(但し、 R⁹は炭素数 1〜4のアルキレン基、 R^1Qは炭素数 1〜4のアルキル基を表す）

で示される構造を挙げることができる。なお、本明細書において、「アルキル基 J は、特に断りがない限り、直鎖状アルキル基及び分枝状アルキル基の両者を包含する。一般式 [IX]において、 R ⁹及び R^1Qの炭素数が少ない方が好ましく、従つて、 R ⁹はメチレン基、 R^1Qはメチル基が最も好ましい。なお、 R¹についての上記説明は、下記一般式 [M]、 [II I], [IV], [V]、 [VII], [VI II]. [X]、 [XI II], [XIV], [XV]及び [XVI]中の R¹についてもあてはまる。

また、一般式 [I]中の Xで示される蛍光原子団は、任意の蛍光原子団であってよい。例えば、カルシウムイオン測定用の蛍光プローブ自体は、種々のものが公知であり、このような蛍光プローブに用いられている蛍光性原子団はいずれも本発明において採用することができる。このような蛍光性原子団の例として、ローダミン、フルォレセイン、ナフタレン、アントラセン、ピレン、クマリン、キノリン、スチルベン、ベンゾチォゾール、ピラゾリン等を挙げることができるが、本発明において採用される蛍光性原子団はこれらに限定されるものではない。さらに、一般式 [I]で示される構造のうち、下記、一般式 [I I]で示されるものが感度の点から好ましい。

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、 Yは、一 O—、一 CH₂—又は一 NH―、 Y' は一 CH=又は一 N=、 X' は蛍光性原子団であって、式中の炭素原子 3及び 4と共に縮合環を形成していてもよく、式 [I I]中の環構造を構成する任意の 1 又は 2以上の炭素原子に結合している各水素原子は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のアルコキシル基、アミノ基、ハロゲン、又はニトロ基で置換されていてもよい）。なお、本明細書において、「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素が好ましい。

一般式 [II]中、 Y' は一 CH=であることが好ましい。また、 Yは一 0—であることが好ましい。また、環を構成する炭素原子に結合している各水素原子は、上記の通り置換されていてもよい。もっとも、このような置換基は特に必要なものではないので、置換されていない構造が単純で好ましい。また、 X' としては、公知の種々の蛍光性原子団を好ましく採用することが可能である。

一般式 [II]で表される構造のうち、感度の観点から、一般式 [III]で示されるクマリン（coumar i n)誘導体が特に好ましい。

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、 X' 'は蛍光性原子団であって、式中に示されるベンゼン環と縮合する環であってもよく、式 [Ml]中の環構造を構成する任意の 1又は 2以上の炭素原子に結合している各水素原子は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜 6のアルコキシル基、アミノ基、各アルキル基の炭素数 1〜6のモノ一又はジアルキルァミノ、ノヽロゲン、又はニトロ基で置換されていてもよい）

一般式 [III]で示される構造において、環を構成する炭素原子に結合している各水素原子は、上記の通り置換されていてもよい。もっとも、このような置換基は特に必要なものではないので、置換されていない構造が単純で好ましい。また、 X' 'としては、公知の種々の蛍光性原子団を好ましく採用することが可能である。

—般式 [III]で表される構造のうち、好ましい例として、クマリン部分の縮合ベンゼン環がさらに縮合して合計 3〜 5個の縮合環構造となっている構造を挙げることができる。このような好ましい構造の例として、下記一般式 [IV]又は [V] で表される構造を有するものを挙げることができる。

但し、一般式 [IV]及び [V]において、 R¹は一般式 [I]と同義、式 [V]中の環構造を構成する任意の 1又は 2以上の炭素原子に結合している各水素原子は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜 6のアルコキシル基、アミノ基、各アルキル基の炭素数 1〜 6のモノー又はジアルキルァミノ、ハロゲン、又はニトロ基で置換されていてもよい。もっとも、上記の通り、これらの置換基は特に必要ではなく、置換基がないものが好ましい。また、一般式 [V]で示される構造は、一般式 [ IV]で示される構造に、共役二重結合を有する、縮合されたベンゼン環が 1つ追加された構造であり、共役二重結合が一般式 [IV]のものよりも増えているので、一般式 [ I V]で示されるものよりも長波長側で励起することが可能となり、波長 48 8nm程度の励起光を用いてレーザー顕微鏡により観察することが可能になる。従つて、細胞中のマグネシウムイオンの動態を観察する等の目的にとって特に有利である。

また、マグネシウムイオンに対する錯形成能力、吸収スぺクトルおよび蛍光スぺクトルといった光学的特性に優れ、さらには細胞内に投与した際、均一に染色でき、さらに、萤光強度が大きい、本発明の好ましい蛍光プローブとして、下記一般式 [XI I I]で表される化合物を挙げることができる。

(但し、式中、 R¹は一般式 [门と同義、 R^{1 3}、 R^{1 4}、 R^{1 5}及び R^{1 6}は、互いに独立に水素原子、炭素数 1〜5のアルキル基又はハロゲンを示す（ただし、 R

13 14

R R ^{1 5}及び R ¹ 1⁶6が同時に水素原子である場合を除く））

13

一般式 [XI I I]で表される化合物のうち、 R R 14

R^{1 5}及び R^{1 6}がいずれも炭素数 1〜5のアルキル基であるものが好ましい。とりわけ、 R¹³、 R¹⁴、 R¹⁵及び R¹⁶がいずれもメチル基である化合物 (KMG-27)は、下記実施例 1で製造した本発明の好ましい化合物である KMG-20の特性（錯形成能力、光学的特性、細胞に投与した場合の均一染色性）を保つことができ、しかもこの化合物の場合、 KMG - 20よりも蛍光強度が大きくなる（明るくなる）ことがわかった。さらに、細胞内に投与しても、 KMG - 20と同様、細胞内に均一に分散し、マグネシウムィオン濃度を増加させるような刺激剤を与えると、蛍光強度の増加が観察された。一般式 [XI M]で表される化合物は、 452 nm Ar レーザーを搭載した共焦点レ一ザ一走査蛍光顕微鏡を行うことにより、被検対象が細胞である場合、該細胞の 3 次元的情報を得ることが出来る。

また、高い水溶性を有する本発明の好ましい蛍光プローブとして、下記一般式 [XIV]で表される化合物を挙げることができる _c

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、 R^{1 7}及び R^{1 8}は互いに独立に水素原子、水酸基、ハロゲン、カルボキシル基又は一 COOR^{1 9} (ただし、 R^{1 9}¾1 価の金属イオン）である（ただし、 R^{1 7}及び R^{1 8}が同時に水素原子である場合を除く））。 1価の金属イオンとしては、ナトリウムやカリウムのようなアル力リ金属が好ましい。 ^{1 7}及ぴ1^^{1 8}は、いずれも水素原子以外の上記基であることが好ましく、特に両者とも水酸基であるものが好ましい。水酸基部位に官能基修飾を行うことは、合成上、簡単である上に、様々な有機合成反応が確立されてし、る。従って、上記化合物は、単に KMG - 20よりも水溶性を増した化合物としてだけでなく、 KMG-20よリも優れた化合物を合成する上での反応中間体としての用途も有する。

なお、一般式 [XIV]で示される化合物は、高い水溶性を有するので、 KMG- 20等とは異なる細胞内での試薬の分散状況が期待できる。

—般式 [XIV]で表される化合物は、 452 nm Ar レーザ一を搭載した共焦点レーザ一走査蛍光顕微鏡を行うことにより、被検対象が細胞である場合、該細胞の 3 次元的情報を得ることが出来る。

さらに、吸収帯が長波長側にある、本発明の好ましい蛍光プローブとして、下記一般式 [XV]で示される化合物を挙げることができる。

(但し、式中、は一般式 [I]と同義、 R²⁰、 R²¹、 R²²、 R²³、 R²⁴及び R²⁵は、それぞれ独立に水素原子、炭素数 1〜5のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示す）

—般式 [XV]で示される化合物は、 R^{2 Q}が結合している炭素原子と R²¹が結合している炭素原子とが二重結合により結合されており、この二重結合の故に吸収帯が KMG- 20よりも長波長側にある。従って、汎用性の高い 488 nm Arレーザ一で励起することができ、かつ、錯形成能力、光学的特性、細胞に投与した場合の均一染色性も良好である。

さらに、一般式 [UI]で示される構造のうちの好ましい例として、一般式 [III] 中の X''が、一般式 [VI]

X" ' -Z- [VI]

(式中、 X'''は、 2〜 4個の環を含む縮合環を有する蛍光性原子団、一 Z—は該蛍光性原子団と一般式 [III]中に示されるベンゼン環とを結合する原子団を表す）

で表されるものを挙げることができる。ここで、 X'''の例としては、ローダミンゃフルォレセインのような種々の公知の蛍光性原子団を採用することができる。また、一 z—は、クマリン構造と蛍光性原子団とを結合しているだけの構造であるので、何ら限定されるものではなく、例えば炭素数 1〜 4の低級アルキレン基を挙げることができる。もっとも、親水性を高めるために、ァミン、カルポニル基、チォカルボニル基、エーテル基等の極性基を含む構造が好ましく、例えば、 — NH— C (=S) — NH—のように、ァミンと（チォ）カルボニル基のみから成る構造や、一 NH— (CH₂) 〜ー。一等を好ましい例として挙げることができるがこれに限定されるものではない。

一般式 [VI]中の X'''としては、下記一般式 [VII]で示されるものを好ましい例として挙げることができ、これらには周知の蛍光性原子団であるローダミンゃフルォレセインが包含される。

(但し、式 [VI I]中、 R ²は水素原子又は力ルポキシル基、 R³及び R⁴は、互いに独立に、水酸基、炭素数 1〜6のアルキル基、又は各アルキル部分の炭素数が 1〜6のジアルキルアミノ基（但し、窒素原子が、環を構成する炭素原子と二重結合して第四級ァミンとなっていてもよい））

一般式 [VII]で示される蛍光性原子団を有する、一般式 [III]で示される構造のうち、特に好ましいものとして、下記一般式 [VIII]で示されるものを挙げることができる。

(但し、式中、 R¹は一般式 [ と同義、 R⁵、 R⁶、 R⁷ R⁸は互いに独立に、炭素数 1〜 6のアルキル基を表す）

さらに、一般式 [II で表される蛍光プローブの好ましい例として、クマリン誘導体にアミンを結合した、下記一般式 [X]で示される構造を有するものを挙げることができる。

(但し、式中、 R ¹は一般式 [ I ]と同義、 ^及び！^ ま、互いに独立に、水素、水酸基、ハロゲン、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のハロアルキル基、炭素数 1〜6のアルコキシル基、炭素数 1 ~ 6のハロアルコキシル基、ベンジル基若しくはァセチル基、又は 1個若しくは 2個の単糖構造若しくはそのァシル化物を含む基である）。

式 [X]で表される化合物のうち、前記 1個若しくは 2個の単糖構造若しくはそのァシル化物を含む基が、グリコシル基、グリコシド基、フラクトシル基、フラクトシド基若しくは式 [XI]

で示される基又はこれらの基の中の 1ないし 4個の水酸基が炭素数 1ないし 6のァシル基でァシル化された構造を含む基であるものが好ましい。

また、式 [X]における単糖構造が、炭素数 1〜6のアルキル基又はアルコキシル基を介して式 [X]中の窒素原子に結合しているものが好ましい。

このような化合物の好ましい例として、下記式 [XI I ]に示される化合物を挙げることができる。

また、上記一般式 [I II]中の X''が、上記一般式 [VI]

X'" -Z- [VI]

で表される場合、一般式 [VI]で表される基の好ましい例として、下記一般式 [XVI

]で表されるものを挙げることができる。

(ただし、式中、 R²⁶は存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数 1 ~ 5のアルキレン基； ²⁷は一1\11"1ー、一 N H— CO—又は一 OCO—； R ²⁸は水素原子、カルボキシル基又は一 COOR³³ (ただし、 R³³は 1価の金属原子又は炭素数 1〜 5のアルキル基）； R ²⁹及び R ³⁰はそれぞれ独立に水素原子、炭素数 1 〜5のアルキル基又はハロゲン； R³¹は水酸基、炭素数 1 〜5 のアルキル基、又は各アルキル部分の炭素数が 1 〜 5のジアルキルアミノ基； R ³²と環を結合している ZZZIは単結合又は二重結合を示し、これが単結合を示す場合には、 R³²は水酸基、炭素数 1 〜5のアルキル基、又は各アルキル部分の炭素数が 1 〜 5のジアルキルアミノ基、二重結合を示す場合にはカルボ二ル基又は =N + R³⁴R³⁵ (但し、 R ³⁴及び R ³⁵は互いに独立に炭素数 1〜 5のアルキル基）を示す）。

なお、 R ²フが一 NH— CO—又は一◦ CO—である場合には、その方向（すなわち、一 NH— CO—の場合には、一NH—が一般式 [XVI]において一 CO—よリも上に来るのか下に来るのか、また、一O CO—の場合には、 _0—が一般式 [XVI]において一 CO—よりも上に来るのか下に来る'のか）は限定されず、両者とも包含される。

一般式 [XVI]で表される化合物のうち、 R ²⁸が水素原子又はカルボキシル基、 R ²⁹及び R ³⁰が水素原子、 R³¹がジアルキルアミノ基、 R³²が二重結合によリ環に結合されたジアルキル第四級ァミンであるものが好ましく、特には、 R² ⁶がメチレン基、 R²⁷が一 NH―、 R²⁸、 R²⁹及び R³⁰がいずれも水素原子、 R ³¹が N (CH₃) ₂、 R ³²が二 N+ (CH₃) ₂であるものが好ましい。

一般式 [XVI]で表される、蛍光発色団がローダミン又はフルォレセイン、好ましくはローダミンであるものは、高いモル吸光係数と量子収率を持ち、光安定性が良好で、蛍光強度は pHに依存しないといった特性を持つ。さらにローダミンは、細胞内のミトコンドリアの染色剤として使われている。従って、 KMG- 20およびその類縁体は、細胞質に均一に分散し、しかも核を除いたその周辺に分散していることが明らかとされているが、一般式 [XVI]で示される化合物を用いることにより、さらに細胞の局所部位を染色し、その場所におけるマグネシウムィォンの動態を観察することが可能となる。

本発明の蛍光プローブは、公知の手法に基づいて、容易に製造することができる。とりわけ、力ルポキシル基又はその塩若しくはエステルを有するクマリン誘導体に公知の蛍光性原子団を結合すれば本発明の好ましい蛍光プローブを得ることができるので、本発明の蛍光プローブを合成することは、当業者にとって容易である。下記実施例にも、複数の蛍光プローブの合成方法の例が詳細に記載されている。

本発明の蛍光プローブは、検体に蛍光プローブを作用させ、励起光を当てて蛍光を測定するという、従来の蛍光プローブと全く同様な方法によって使用することができる。例えば、ジメチルスルフォキシド (DMS0)のような、極性有機溶媒に溶解したものを、緩衝液に加え、これを検体に加え（又は検体にこれを加え）てインキュベートし、励起光を当てて蛍光を測定することができる。極性有機溶媒中のプローブ濃度は、特に限定されないが、通常、 0. 1 mMないし 10 mM程度、好ましくは、 0. 5 m ないし 2 mM程度であリ、また、緩衝液に添加した後のプローブ濃度は、特に限定されないが、通常、 1 ； u Mないし 0. 1 mM程度、好ましくは、 5 Mないし 2 Ο Μ程度である。インキュベーションの時間は、特に限定されず、検体に応じて適宜選択できるが、通常、 5分間〜 1時間程度でよい。また、インキュベーションの温度は、特に限定されず、各検体に適した温度が適宜選択できるが、通常、 0 °C〜4 0 °C程度であり、検体が細胞又は組織である場合には、その培養に適した温度（例えば、ヒト由来の細胞又は組織であれば 3 7 °C ) であることが好ましい。また、蛍光の測定は、市販の蛍光計を用いて行うこともできるし、細胞内のマグネシウムイオンの動態を調べる場合には、蛍光顕微鏡や共焦点レーザー.顕微鏡を用いて観察することができる。このような測定方法自体は公知である。また、検体としては、特に限定されず、その中に含まれるマグネシゥムイオンを測定しょうとするいずれのものであってもよく、好ましい例として、各種細胞や組織を挙げることができる。検体が細胞又は組織である場合には、細胞又は組織の培養液を、上記した蛍光プローブ溶液に置換し、上記のようにインキュベートし、蛍光を測定することができる。

実施例

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例 1 蛍光プローブ（13 -ァザ- 3-ォキサ - 4 -才キソ亍トラシクロ [7. 7. 1 . 0く 2， 7>.0<13, 17>]ヘプタデ力- 1 (17)， 2 (7) , 5, 8-テトラエン- 5 -ィルカルポ二口キシ）メチルァセテ一ト（KMG-20)の製造

KMG-0020

(1) 9-ァザトリシク口 [7.3.1.0く 5, 13>]トリデカ -1 (13) , 2, 4-トリエン- 2-オールの合成

2

100 ml二口フラスコに 3-メトキシァニリン 1.0 g (8.13 mmol)、 1-ブロモ- 3- クロ口プロパン 5.0 mlを加え、窒素気流下、 70°Cで 1時間、 100°Cで 2時間撹拌後、 11時間還流した。放冷後、濃塩酸、水をゆっくり加えた。エーテルで抽出後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し目的化合物を得た。

(2) 9-ァザー 2—ヒドロキシトリシクロ [7.3.1.0く 5, 13>] トリデカー 1 (13)， 2, 4—トリェン- 3-カルバルデヒドの合成

2 I

10 ml二口フラスコに化合物 1.0 g (5.29 mo I)を加え窒素置換後、乾燥 DMF 5,

0 mlを加えた。 P0CI₃ 0.65 ml (6.42 mmol)を乾燥 DNIF 5mlに溶解し、ゆっくり滴下した。室温で 30分間撹拌後、水を加えて反応を停止した。析出した沈殿を分取後、へキサンで再結晶し、目的化合物を得た。

(3) メチル 13—ァザ -3-ォキサ -4—ォキソテ卜ラシクロ [7.7.1.0<2, 7>.0<13, 17>] ヘプタデ力- 1 (17)，2 (7), 5， 8-テトラェン- 5-カルポキシレー卜の合成

3 4

100 ml二口フラスコに化合物さ 1.0 g (4.61 mmol)、マロン酸メチルエステル 0. 6 ml (5.50 mmol)、ピぺリジン 0.7 g (7.48 mmol)、ァセトニトリル 10.0 ml、ベンゼン 20.0 mlを加え 3時間還流した。溶媒を減圧留去後、水を加えエーテルで抽出した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、カラムクロマトグラフィーで精製し目的化合物を得た。

(4) 13 -ァザ一 3 -ォキサ—4-ォキソテトラシクロ [7.7.1.0く 2, 7>.0<13, 17>]へプタデカ- 1 (17) , 2(7)， 8-トリエン- 5-カルボン酸の合成

4

100 mlなす型フラスコに化合物 41.0 g (3.48 mttiol), 5 %水酸化ナトリウム水溶液 5.0 mしエタノール 50.0 mlを加え、 12時間還流した。放冷後、 1. O N塩酸を加え酸性にした後、エーテルで抽出した。水で有機層を洗浄後、無水硫酸ナトリゥ厶で乾燥した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。

上記のようにして得られたクマリン 343から、次の反応式に従って（13-ァザ- 3 -ォキサ- 4-ォキソテトラシクロ [7.7· 1.0く 2, 7>.0<13， 17>]へプタデカ- 1 (17), 2 (7) , 5， 8-テトラェン- 5-ィルカルポ二口キシ）メチルァセテ一ト（KMG- 20)を合成した。

KMG-20

すなわち、 50 ml二口フラスコに上記の方法で得られたクマリン 343 0.10 g (0. 35 mmol)を加え脱気窒素置換後、ジメチルホルムアミド（DMF) 10.0 ml、テトラヒドロフラン（THF)10.0 mし卜リエチルァミン（TEA)0.07 g (0· 70 mmol)を加え、室温で 1時間撹抻した。ァセトキシメチルブロミドを 0· 10 g (0.70 mmol)加え、室温で 12時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、 0.1 N塩酸 50 mlで 1回、飽和食塩水 5 0 mlで 3回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（Si0₂; CHCI3 ： MeOH = 20 ： 1)で精製し、黄色固体を得た。同定は、 ¹H- NMR、 ES卜 T0F質量分析を用いて行った。

収率 52 %

1H -剛 R (300 MHz,GDCl3, TMS, r. t. , δ / ppm) 1.90〜2·05 (m, 4Η), 2.13 (s, 3Η), 2.77 (t, 2H), 2.88 (t, 2H), 3.36 (q, 4H), 5.94 (s, 2H), 6.93 (s, 1H )， 8.35 (s， 1H)

ESI-T0F [M + Na]+ = 380

実施例 2 蛍光プローブ（ (17 -ァザ- 5-ォキサ -6 -ォキソペンタシクロ [11 · 7.1.0 く 2， 11 >· 0く 4， 9>.0く17， 21 >]へニコサ- 1 (21 )， 2 (11 )， 3， 7， 9 (10)， 12-へキサェン- 7 -ィルカルポニルォキシ）メチルァセテ一ト）の合成

下記の反応式に従って、（17 -ァザ- 5-ォキサ -6 -ォキソペンタシク口 [11, 7.1.0く 2,11 >.0く 4, 9>.0く 17, 21 >]へニコサ- 1 (21) , 2 (11) , 3, 7, 9 (10) , 12-へキサェン- 7—ィルカルボニルォキシ）メチルアセテート（化合物旦）を合成した。

(1) 6 -メトキシ- 2-ナフチルァミンの合成

1 2

50 ml二口フラスコに 6-メトキシナフタレン- 2-カルボン酸（化合物 1) 1.0 g (3. 5 mmol)、アジ化ナトリウム 2.28 g (35.0 mmol)、ポリリン酸（PPA) 15.0 gを加え、 40 °Gで 12時間撹拌した。酢酸ェチル 1 00 gを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。

(2) 13 -ァザ- 4-ヒドロキシテ卜ラシクロ [7.7.1.0<2,7>.0<13， 17>]へプタデカ-1 (17), 2 (7) , 3， 5, 8-ペンタェン- 4-ォ一ルの合成

100 ml二口フラスコに化合物 1.0 g (5.78 議 ol)、 1-ブロモ -3-クロ口プロパン 1.0gを加え、窒素気流下、 70 °Gで 1時間、 100 °Gで 2時間撹袢後、 11時間還流した。放冷後、濃塩酸、水をゆっくり加えた。エーテルで抽出後、無水硫酸マグネシゥムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィーで精製し目的化合物を得た。

(3) 13-ァザ- 4 -ヒドロキシテ卜ラシクロ [7.7.1.0く 2, 7>·0く 13, 17>]ヘプタデカ- 1 (17), 2 (7) , 3, 5, 8 -ペンタェン- 5-カルバルデヒドの合成

10 ml二口フラスコに化合物 1.0 g (4.18 mo I)を加え窒素置換後、乾燥 DMF 5. 0 mlを加えた。 P0CI₃ 0.65 ml (6.42 mmol)を乾燥 DMF 5mlに溶解し、ゆつくリ滴下した。室温で 30分間撹拌後、水を加えて反応を停止した。析出した沈殿を分取後、へキサンで再結晶し、目的化合物を得た。 (4) メチル 17-ァザー 5 -ォキサ -6-ォキソペンタシクロ [11.7.1.0<2, 11>.0く 4, 9>. 0く 17，21>]へニコサ- 1 (21 ),2 (11 ),3， 7, 9(10)， 12-へキサェン- 7-カルボキシレートの合成

100 ml二口フラスコに化合物 41-0 g (3.74 國 ol)、マロン酸メチルエステル 0.6 ml (5.50 mrnol), ピぺリジン 0.7 g (7.48 國 ol)、ァセトニトリル 10.0 ml、ベンゼン 20.0 ml を加え 3時間還流した。溶媒を減圧留去後、水を加えエーテルで抽出した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、カラムクロマトグラフィーで精製し目的化合物を得た。

(5) (17-ァザ— 5-ォキサ -6—ォキソペンタシクロ [11 · 7.1 · 0<2， 11 >■ 0く 4, 9>.0く 17, 2 1〉]へニコサ- 1 (21 ) , 2 (11 ) , 3, 7, 9 (10)， 12-へキサェリ-トイルカルボニルォキシ）メチルァセテ一卜の合成

100 mlなす型フラスコに化合物 1.0 g (2.86 mmol)、 5 %水酸化ナトリウム水溶液 5.0 mしエタノール 50.0 mlを加え、 12時間還流した。放冷後、 1.0 N塩酸を加え酸性にした後、エーテルで抽出した。水で有機層を洗浄後、無水硫酸ナトリゥムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。

得られた化合物に、 DMF 10.0 mし卜リエチルァミン 0· 29 ml (2.86 mmol)を加え、窒素気流下、氷浴につけた。ァセトキシメチルブロミド（4.29 mmol)を加え、氷浴下で 30分間、室温に戻して 12時間撹袢した。溶媒を減圧留去後、得られた化合物に塩化メチレンを加え、 0.1 N塩酸、飽和食塩水の順に洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。

実施例 3 蛍光プローブ（5-((((3- ((ァセチルォキシメチル)ォキシ力ルポ二ル) -2 -ォキソ（2H-ク口メン- 7 -ィル)）ァミノ）チォキソメチル）ァミノ）- 2 - (6 -（ジェチルァミノ）- 3- (ジェチルイリデン）キサンテン- 9-ィル）ベンゾイツクァシド）の合成

下記の反応式に従つて、 5- ( ( ( (3- ( (ァセチルォキシメチル）ォキシ力ルポニル） - 2 -ォキソ（2H -ク口メン- 7-ィル)）ァミノ）チォキソメチル）ァミノ）- 2- (6- (ジェチルァミノ）- 3- (ジェチルイリデン）キサンテン- 9 -ィル）ベンゾイツクァシド（化合物 5) を合成した。

100 ml 二口フラスコに 3-ァミノフエノール（化合物 1)1.0 g (9.17 mmol)を加え窒素置換後、ジェチルエーテル 50 mしトリェチルァミン 0.92 ml (9.17 mmol) を加え氷浴につけた。ジ- tert -プチルジカーボネート 1.99 g (9.17 酬 ol)を加え、室温に戻してから 2時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィ一 (Si0₂, 酢酸ェチル： n -へキサン = 1 ： 1)で精製し、目的化合物を得た。

(2) (tert-ブトキシ） -N-(4-フオルミル- 3-ヒドロキシフ ιニル）フオルムアミドの合成

50 mlなす型フラスコに化合物 1.0 g (4.78 mmol), クロ口ホルム 10.0 mし 5

% NaOH水溶液 10· 0 mlを加え、 60 °Cで 2時間撹拌した。溶媒の大部分を溶留去後、エーテルで抽出し無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、目的化合物を得た。

(3) メチル 7 -（(tert-ブトキシ）力ルポニルァミノ） -2-ォキソ -2H-クロメネ- 3- カルポキシレー卜の合成

3 4

100 mlなす型フラスコに化合物 1.0 g (4.22 画 ol)、ベンゼン 30 ml、ァセト二トリル 20 mしマロン酸メチルエステル 0.83 g (6.33 mmol), ピぺリジン 1.08 g(12.65 睡 ol)を加え、 3時間還流した。溶媒を減圧留去後水を加え、ベンゼンで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物を得た。

(4) 2- (6- (ジェチルァミノ）- 3- (ジェチリデン）キサンテン- 9-ィル) -5-((( (3 -（メトキシカルボニル) - 2-ォキソ（2H-ク口メン -7-ィル））ァミノ）チォキソメチル）ァミノ）ベンゾイツクァシドの合成

BocHN

4

50 ml二口フラスコに化合物 41.0 g (3.13 隱 ol)、塩化メチレン 20.0 ml、トリフルォロ酢酸 5.0 ml を加え、室温で 1時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、ポンプで減圧乾燥した。

得られた化合物にクロ口ホルム 10.0 ml、ローダミンイソチオシァネート 1.67 g (3.13 mmol)を加え、 1時間還流した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィ一で精製し目的化合物を得た。

(5) 5 -（（（（3- ( (ァセチルォキシメチル）ォキシ力ルポニル) - 2-ォキソ（2H-ク口メン -7-ィル)）ァミノ）チォキソメチル）ァミノ） 2 - (6- (ジェチルァミノ） -3- (ジェチルイリデン）キサンテン- 9-ィル）ベンゾィックァシドの合成

100 mlなす型フラスコに化合物 1.0 g (1.27 mmol)、 5 %水酸化ナトリウム水溶液 5.0 mしエタノール 40 mlを加え、 10時間還流した。放冷後、溶媒の大部分を減圧留去し、 1 N塩酸を加え酸性にした。溶媒を減圧留去後、アセトンを加え、析出した沈殿を濾別した。得られた沈殿を減圧乾燥し目的化合物を得た。

得られた化合物に DMF 40 mし卜リエチルァミン 0.28 ml (2.80 mmol)を加え氷浴につけた。ァセトキシメチルブロミド 0.40 ml (2.80 mmol)を加え、氷浴下で 30分間、室温に戻して 24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、アセトン -塩化メチレンで再沈殿操作を行い、目的化合物を得た。

実施例 4 蛍光プローブ（メチル- 13 -ァザ- 10， 10, 16, 16-テトラメチル -3 -ォキサー 4-ォキソーテトラシクロ [₇， 7，■)， ₀<2, 7>. 0く 13, 17>]へプタデカ— 1 (17) , 2 (7) , 5, 8 -テトラェン- 5-カルボキシレー卜）（KMG-27)の合成

下記の反応式に従って、メチル -13-ァザ -10, 10, 16， 16 -亍トラメチル -3-ォキサ - 4 -才キソ-テトラシクロ [7, 7, 1 , 0く 2， 7>. 0<13, 17>]へプタデカ- 1 (17) , 2 (7) ' 5, 8- テトラェン- 5 -カルボキシレート（4.) を合成した。

寸 I

(1 ) メチル- 13-ァザ -10, 10, 16， 16 -テトラメチル- 3 -ォキサ - 4-ォキソテトラシク口 [7· 7· 1 . 0く 2， 7〉. 0く 13, 17>]ヘプタ -1 (17) , 2 (7) , 5, 8 -テトラエンー 5—力ルポキシレ一ト（化合物）の合成

100 ml二口フラスコに、 8-ヒドロキシ- 1, 1,7， 7 -テトラメチルジュロリジン - 9 -カルボキシアルデヒド（1) 0.70 g (2.56 圆 ol)、ジメチルマロネート 0.51 g (3.84 mmol)、ベンゼン 35.0 mlおよびァセトニトリル 15.0ml を加え、窒素気流下、 4時間還流した。溶媒を減圧留去後、残査を酢酸ェチルに溶解し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィ一（Si0₂, CH₂GI₂→CH₂CI₂ ： AcOEt = 1 : 1 _v/v)で精製し、黄色固体を得た。

収率： 78 %.

¹H NMR (300 MHz, CDCI₃, r. t. , TMS, δ/ppm) 1.29 (s， 6H) , 1.54 (s, 6H) , 1. 72Ί.81 (m, 4H), 3.28 (t, 2H) , 3.38 (t, 2H) , 3.89 (s, 3H) , 7.15 (s, 1H),

8.37(s， 1H).

ESI-TOFMS (+) ： 378.18 [ +Na] ⁺

元素分析. C₂₁H₂₅N0_4:

計算値： C, 70.96; H, 7.09; N. 3.94.

実測値： C, 71.03; H, 7.12; N, 4.01.

(2) 13-ァザ -10, 10, 16, 16-テトラメチル -3-ォキサ -4-ォキソテトラシクロ [7.7, 1.0く 2, 7>.0く 13， 17〉]ヘプタデ力- 1 (17)， 2 (7) , 5, 8-テトラェン- 5-力'ルボン酸 (さ）の合成

10 mlナス型フラスコに化合物および濃塩酸 5.0 ml を加え、 24時間室温で撹拌した。反応溶液を氷水にあけ、塩化メチレンで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、オレンジ色の固体を得た。

収率： 95 %·

¹H 剛 R (300 MHz, CDCI₃, r.t. , TMS, δ/ppm) 1.30 (s, 6H) , 1.55 (s, 6H)， 1. 74-1.85 (m, 4H), 3.36 (t, 2H), 3.44 (t, 2H) , 3.89 (s, 3H) , 7.23 (s， 1H), 8.55 (s, 1H).

ESI-TOFMS (+) ： 364.16 [M+Na] ⁺

元素分析. C₂。H₂₃N0_4:

計算値： C, 70.36; H， 6.79; N. 4.10.

実測値： G, 70.54; H, 6.90; , 4.15.

(3) メチル- 13 -ァザ- 10， 10, 16, 16-テトラメチル- 3 -ォキサ -4-ォキソ -テトラシクロ [7， 7， 1 , 0く 2, 7>.0<13， 17>]へプタデカ- 1 (17), 2 (7) , 5, 8-テトラエン- 5-力ルポキシレートの合成

窒素気流下、 30 ml二口フラスコに化合物 3 0· 10 g (0.29 隱 ol)、トリェチルァミン 0.04 g (0.35 國 ol)、乾燥 THF 5.0 ml を加え、氷浴につけた。ブロモメチルアセテート（AM- Br) 0.05 g (0.35 mmol)を加え、室温で 24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を塩化メチレンに溶解し、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。大型薄層クロマトグラフィー（Si 02， n-へキサン：酢酸ェチル = 10 ： 7 vA/)で精製し、オレンジ色固体を得た。収率： 75 %.

¹H 刚 R (300 MHz, CDCI₃, r.t. , TMS, δ/ppm) 1.30 (s， 6H)， 1.55 (s, 6H)， 1. 72-1.85 (m, 4H) , 2.12 (s, 3H) , 3.36 (t, 2H) , 3.44 (t, 2H) , 3.89 (s, 3H) , 5.95 (s, 2H), 7, 16 (s， 1H), 8.38 (s, 1H).

ESI-TOFMS (+) ： 436.15 [M+Na] ⁺

元素分析. G₂₃H₂₇N0₆:

計算値： C, 66.81; H, 6.58; N. 3.39.

実測値： C, 66.97; H， 6.51; N, 3.24.

実施例 5 (13-ァザ- 10， 16-ジヒドロキシ- 3 -ォキサ -4-ォキソテ卜ラシクロ [7. 7.1 · 0<2, 7>.0く 13， 17>]へプタデカ- 1 (17) ,2 (7)， 5, 8 -亍トラエン- 5-ィルカルボニ口キシ）メチルアセテート )の合成

下記の反応式に従って、（13-ァザ- 10, 16-ジヒドロキシ- 3-ォキサ -4-ォキソテトラシクロ [7.7.1.0<2, 7>.0<13, 17>]へプタデカ- 1 (17), 2 (7) , 5， 8-テトラェンー 5- ィルカルポ二口キシ）メチルァセテー卜（7)を合成した。

オール（2

)の合成、κに OCH,

1 2

50 mlナス型フラスコに、 7-メトキシ- 2， 3, 4, 5, 3a-ペンタヒドロ- 3a-ァザフエナレン- 1, 6-ジオン） 3.0 g (12.98 画 ol)、水素化ホウ素ナトリウム 0.48 g ( 12.98 國 ol)、エタノール 20 ml を加え、室温で 6時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を酢酸ェチルに溶解し、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー（Si0₂, GH₂GI₂)で精製し、目的化合物を得た。

(2) 9—ァザ卜リシクロ [7.3.1.0く 5， 13>トリデカー 1 (13)， 2, 4-トリエン— 2， 6, 12-トリオール (さ)の合成

2 3

50 mlナス型フラスコに化合物 2 2.0 g (8.51 圃 ol)、臭化水素酸 2.0 ml、酢酸 10.0 ml を加え、 24時間還流した。反応溶液を冷水にあけ、塩化メチレンで抽出した。有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（Si0₂, CH₂CI₂ ：酢酸ェチル = 3 ： 1 vA/)で精製し、目的化合物を得た。

(3) 9一ァザー 2， 6, 12 -トリヒドロキシトリシクロ [7.3.1.0く 5, 13>] トリデカ— 1 (13)， 2, 4-トリェン- 3-力ルポアルデヒド（4)の合成

3 4

50 ml三口フラスコに化合物 1.0 g (4.52 睡 ol)、乾燥 DMF 20.0 ml および P0GI₃0,69 g(4.52 睡 ol)を加え、窒素気流下、 12時間室温で撹拌した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を塩化メチレンに溶解し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、カラムクロマトグラフィー (Si0₂, GH₂GI_2:酢酸ェチル = 5 _: 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。

(4) メチル -13-ァザ- 10， 16-ジヒドロキシ -3-ォキサ -4-ォキソテトラシクロ [7.7. 1.0く 2, 7>.0く 13， 17〉]ヘプタデ力- 1 (17), 2(7), 5, 8 -テトラェン- 5 -力ルポキシレ一ト（ )の合成

4 5

100 mlナス型フラスコに化合物 41.0 g (4.01 mmol)、ジメチルマロネート 0.53 g (4.01 mmol)、ベンゼン 35.0 mしァセトニトリル 15· 0 mしピぺリジン 0.34 g (4.01 mmol)を加え、窒素気流下、 4時間還流した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を塩化メチレンに溶解し、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂, CH₂CI₂ ：酢酸ェチル = 2 ： 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。

(5) 13-ァザ- 10, 16-ジヒドロキシ- 3-ォキサ -4-ォキソテトラシクロ [7.7.1.0く 2, 7>.0く 13， 17>]ヘプタデカ- 1 (17), 2(7), 5， 8—テトラェン -5 -力ルボン酸 (6)の合成

さ 6 50 mlナス型フラスコに化合物 1.0 g (3.02 ol)および濃塩酸 10· 0 ml を加え、室温で 24時間撹拌した。反応溶液を冷水にあけ、塩化メチレンで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー (Si0₂ CH₂GI₂)で精製し、目的化合物を得た。

(6) (13 -ァザ- 10, 16-ジヒドロキシ- 3-ォキサ -4-ォキソテトラシク口 [7.7.1.0<2,

7>.0<13, 17>]ヘプタデカ- 1 (17) ,2 (7) , 5 8-テトラエン- 5 -ィルカルポ二口キシ）メチルアセテート（7)の合成

6 1

50 ml二口フラスコに化合物 0.50 g (1,58 mmol)、乾燥 THF 20 mしトリェチルァミン 0.16 g (1.58 ol)を加え氷浴につけた。ァセトキシメチルブロミド 0.29 g (1.58 mmol)を加え、氷浴下で 30分間、室温に戻して 24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を塩化メチレンに溶解し、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。大型薄層クロマトグラフィー

(Si0₂, CH₂CI₂)で精製し、目的化合物を得た。

実施例 6 5 -ェチル- 6 6 8-トリメチル -3-ォキソ -4 5 6-トリヒドロ- 5-ァザ -4 -ォキサアントラセン- 2-カルボン酸 (2)の合成

下記の反応式に従って、 5-ェチル -6, 6 8-トリメチル -3-ォキソ -4, 5 6-トリヒドロ- 5-ァザ- 4-ォキサアントラセン- 2-カルボン酸 (7)を合成した。

(1) 7 -メトキシ- 2, 2,4-トリメチル- 1,2-ジヒドロキノリン（2)の合成 Acetone, ¾

Hゥ N OCH'

200ml二口フラスコに 3 -メトキシァニリン（1) 5.0 g (40.63 國 ol)、ヨウ素 0.

1 g、アセトン 100.0 ml を加え、窒素気流下、 2日間還流した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を塩化メチレンに溶解し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで洗浄後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂, へキサン：酢酸ェチル = 1 : 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。

(2) 9-ァザ卜リシクロ [7.3.1.0〈5, 13>トリデカ- 1 (13) , 2, 4—トリエン -2, 6， 12-卜リオール (3)の合成

200 ml二口フラスコに化合物 2.0 g (9.85 mmol)、ァセトニトリル 100· 0 m しヨウ化工チル 1.56 g (10.0 讓 ol)、炭酸ナトリウム 1.06 g (10.0 画 ol)を加え、 2日間還流した。炭酸ナトリウムを濾別後、濾液を減圧濃縮した。反応混合物に酢酸ェチルを加え、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂， /7 "へキサン：酢酸ェチル = 5 ： 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。

(3) 1-ェチル -2， 2,4-トリメチル- 1,2 -ジヒドロキノリン- 7 -オール（4)の合成 3フ

100 mlナス型フラスコに、化合物さ 1.0 g (4.32 mmol)、臭化水素酸 2· 0 mし酢酸 20 ml を加え、 24時間還流した。反応溶液を冷水にあけ、水酸化ナトリウムで中性にした後、塩化メチレンで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー (Si0₂， n- へキサン：酢酸ェチル = 2 ： 1)で精製し、目的化合物を得た。

(4) 1-ェチル- 7-ヒドロキシ- 2, 2，4 -トリメチル -1,2-ジヒドロキノリン- 6-カルポアルデヒド（5)の合成

4 5

100 ml三口フラスコに、化合物 1.0 g (4.60 國 ol)、乾燥 DMF 30.0 mし P0C l₃ 0.76 g (5.00 mmol)を加え、窒素気流下、 24時間室温で撹拌した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を酢酸ェチルに溶解後、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、カラムクロマトグラフィー (Si0₂, n~へキサン：酢酸ェチル = 1 ： 1) で精製し、目的化合物を得た。

(5) メチル— 5 -ェチルー 6， 6, 8 -卜リメチル -3 -ォキソ—4, 5, 6—トリヒドロ- 5 -ァザ一 4 -ォキサアントラセン- 2-カルボキシレート（6)の合成

100ml二口フラスコに化合物 1.0 g (4.08 mmol)、ジメチルマロネート 0.5 4 g (4.08 mmol)、ピぺリジン 0.35 g (4.08 隱 ol)、ベンゼン 35.0 ml、ァセト二トリル 15.0 ml を加え、窒素気流下、 4時間還流した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を酢酸ェチルに溶解し、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー（Si0₂， AT"へキサン：酢酸ェチル = 5 ： 1 v/v)で精製し、目的化合物を得た。

(6) 5—ェチル—6， 6, 8—卜リメチルー 3 -ォキソ—4， 5, 6—トリヒドロ— 5 -ァザ—4—ォキサアントラセン- 2-カルボン酸 )の合成

6

20 ml二口フラスコに、化合物 6 1.0 g (3.06 睡 1)、濃塩酸 10.0 mlを加え、室温で 24時間撹拌した。反応溶液を冷水にあけ、塩化メチレンで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラ厶ク口マトグラフィー（Si0₂， n -へキサン：酢酸ェチル = 2 ： 1)で精製し目的化合物を得た。

実施例 7 化合物の合成

下記の反応式に従って、反応式中に示される化合物 9を合成した。

0.10 gを加え、水素雰囲気下、室温で 2時間撹拌した。 Pd/Gを濾別後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー（Si0₂, GH₂GI₂ ： MeOH = 10 ： 1 v/v)で

アルデヒド 0.40 g (11.56画 ol)を加え、 100 °Cで 12時間撹拌した。反応溶液を冷水にあけ、 1 N HGIで酸性にした後、エーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマ卜グラフィー（Si0₂, /7~へキサン：酢酸ェチル = 10 ： 1 _v/_v)で精製し、目的化合物を得た。

(4) 化合物の合成

5 6

100 mlナス型フラスコに化合物 1.0 g (5.38画 ol)、ジメチルマロネート 0.

71 g (5.38 mmol)、ピぺリジン 0.46 g (5.38議 ol)、ベンゼン 35.0 ml、ァセト二トリル 15.0 mlを加え、窒素気流下、 4時間還流した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を塩化メチレンに溶解し、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。カラムクロマトグラフィー (Si0₂ CH₂CI₂ ： AcOEt = 2 : 1 )で精製し、目的化合物を得た。

(5) 化合物 7の合成

100 ml三口フラスコに、化合物 0.50 g (1.39 mmol)、化合物旦 0.41 g (1.3 9 mmol), 炭酸カリウム 0.69 g (5.00 mmol)、ァセトニトリル 50.0 mlを加え、窒素気流下、 24時間還流した。炭酸カリウムを濾別後、溶媒を減圧留去した。反応混合物を酢酸ェチルで溶解後、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（Si0₂, CH₂CI₂ ： MeOH = 10 ： 1 v /v)で精製し、目的化合物を得た。

(6) 化合物 8の合成

7 8

50 mlナス型フラスコに化合物 20.50 g (0.89 國 ol)および濃塩酸 20.0 ml を加え、 24時間室温で撹拌した。反応溶液を冷水にあけ、塩化メチレンで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去後、カラムクロマトグラフィー（Si0₂, CH₂CI₂ ： MeOH = 50 ： 1 _v/_v)で精製し、目的化合物を得た。

(7) 化合物 9の合成

8 9

100 ml三口フラスコに化合物 8 0.50 g (0.89 麵 ol)、 THF 20.0 tnしトリェチルァミン 0.10 g (0.90 mmol)を加え、氷浴につけた。ァセトキシメチルブロミド 0.16 g (0.90 mmol)を加え、氷浴下で 30分間、室温に戻して 24時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、反応混合物を塩化メチレンで溶解し、水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。大型薄層クロマトグラフィー (Si0₂, CH₂GI₂ ： MeOH = 20 ： 1 vA/)で精製し、目的化合物を得た。

実施例 8 蛍光プローブを用いた細胞内マグネシウムイオンの測定（その 1 ) 実施例 1で合成した蛍光プローブ KNIG- 20を用いて細胞内マグネシウムイオンを測定した。蛍光プローブ KMG - 20は、ァセトキシメチル基を有しているため、脂溶性が高く細胞の培養液から細胞膜への移行が容易であり、細胞膜近傍で細胞内のエステル加水分解酵素によって、ァセ卜キシメチル基が外れ、再びカルポキシル基を有する水溶性化合物となり、細胞質内へ拡散する。また、 KMG-20は、マグネシウムイオンと錯結合することにより、その蛍光が増大する。

蛍光プローブ KMG-20の DNIS0溶液（1,0 mM)を、終濃度が 10.0 Mになるように Hanks- HEPES緩衝液に加え、超音波処理した。培養液中で 37 °Cでシャーレ上に培養されていたゥシ血管内皮細胞の培養液を上記 KMG- 20溶液に置き換え、 3 7 °Cで 3 0分間インキュベートした。次いで、新しい緩衝液と交換し、蛍光顕微鏡 Ax i overtS 100で細胞を 2 0倍の倍率で観察した。励起波長は 440 nm、検出波長は 500〜530 nmであった。また、比較のため、蛍光プローブを投与する前の細胞も同様に蛍光顕微鏡で観察した。

その結果、蛍光プローブ投与前には、蛍光は観察されなかったが、蛍光プロ一ブ投与後の細胞では、蛍光プローブが細胞質中に均一に分散し、染色していることが観察された。また、全ての細胞において、蛍光強度が低い部分が観察された。この部分は、細胞の核の部分に相当し、蛍光プローブは細胞の核を抜かしたその周辺に存在することがわかつた。

次に細胞内の遊離マグネシウムイオンの動態を明らかにするため、 5 μ Μの力ルボニルシアノィド ρ - (トリフルォロメトキシ）フエニルヒドラゾン（FGGP)を添加した。その結果、細胞全体が明るくなつた。また、 FGGPを添加してからの蛍光強度の時間変化を観察したところ、添加後 1分間は蛍光強度の増加が観察され、その後蛍光強度はほぼ一定となった。この際の時間（分）と蛍光強度との関係を図 1に示す。通常、マグネシウムイオンは、 ATP、 ADP、糖リン酸、核酸、その他のリン酸化基質のリン酸エステル部分の酸素原子と結合し電荷を中和するとともに、酸触媒として働き、リン酸エステル化合物を基質とする酵素はマグネシウムイオンを補因子として必要とすることが知られている。 FGGPは細胞内のミトコンドリァの呼吸阻害剤として働くため、細胞内の ATP活性が落ち、遊離マグネシゥ厶ィォン濃度が増加し、 KMG - 20がマグネシウムイオンと複合体を形成したため、蛍光強度が増加したと考えられる。

さらに、細胞に 1 0 u Mのアセチルコリンを添加し、細胞内のカルシウム濃度を強制的に増加させた。その結果、蛍光強度の増加は観察されなかった。このことから、 KMG- 20はカルシウムイオン共存下でも、十分選択的にマグネシウムィォンを測定できることが明らかになつた。

実施例 9 蛍光プローブを用いた細胞内マグネシウムイオンの測定（その 2 ) 実施例 4で合成した KMG - 27を蛍光プローブとして用いて細胞内マグネシウムィオンの動態について測定した。

この蛍光プローブは、ァセトキシメチル基を有しているため、脂溶性が高く、細胞培養液から細胞膜への移行が容易であり、細胞膜近傍で細胞内のエステル加水分解酵素によって、ァセトキシメチル基が外れ、再び力ルポキシル基を有する水溶性化合物となり、細胞内へ拡散する。

蛍光プローブの DMS0溶液（1 · 0 mM)を、終濃度が 10. 0 μΜとなるように Hanks- HEPES緩衝溶液に加え、超音波処理した。培養液中で 3 7 °Cでシャーレ上で培養されていた PC - 12細胞（ラッ卜副腎髄質クロム親和性細胞種より単離された神経系クローン細胞）の培養液を、蛍光プローブ溶液に置き換え、 37 °Gで 30分間インキュベートした。次に新しい緩衝溶液と交換し、蛍光顕微鏡 Ax i overt S100 で細胞を観察した。励起波長は 440 nm、検出波長は 500〜530 nmに設定した。また、比較のため、蛍光プローブを投与する前の細胞も同様に蛍光顕微鏡で観察した。

その結果、蛍光プローブ投与前は、蛍光は観察されなかったが、蛍光プローブ投与後の細胞は、蛍光プローブが細胞内に均一に分散し、染色されていることが観察された。また、核の部分は蛍光強度が低く、蛍光プローブは細胞の核を抜かしたその周辺に存在することが明らかとなった。

次に細胞内の遊離しているマグネシウムイオンの動態を明らかにするため、 5. 0 μΜのカルボ二ルシアノイド p -（トリフルォロメトキシ）フエニルヒドラゾン（F GGP)を添加した。その結果、細胞全体が明るくなリ、 FGGPを添加してからの蛍光強度の時間変化を観察したところ、添加後 1分間は蛍光強度の増加し、その後蛍光強度は一定となった。通常、マグネシウムイオンは、 ATP、 ADP、核酸などのリン酸化基質のリン酸エステル部分の酸素原子と結合し、電荷を中和するとともに、酸触媒として働くことが知られている。 FGGPは細胞内のミトコンドリアの呼吸阻害剤として働くため、細胞内の ATP活性が落ち、遊離したマグネシウムィオン濃度が増加する。従って、蛍光プローブとマグネシウムイオンが複合体を形成し、蛍光強度が増加したと考えられる。さらに、 10.0 μΜのアセチルコリンを添加し、細胞内のカルシウムイオン濃度を強制的に増加させた。その結果、蛍光強度の増加は観察されなかった。このことから、新たに開発した蛍光プローブはカルシウムイオン共存下でも、十分選択的にマグネシウムイオン濃度を測定出来ることが明らかとなった。

実施例 1 0 蛍光プローブのマグネシウムイオン選択性

実施例 1で合成した KMG-20及び実施例 4で合成した KMG-27のマグネシゥ厶ィォンに対する選択性（すなわち、マグネシウムイオンに対する結合定数とカルシゥムイオンに対する結合定数との比）を測定した。この測定は具体的には次のようにして行った。

蛍光指示薬を、濃度が 10 μΜとなるように溶媒（HEPES 10.0 mM, KC1 120.0 m

M， NaCl 20.0 mM, EGTA 2.0 mM, pH 7.20)となるように溶解した。ここに金属塩 (MgCl₂， CaCl₂)を上記溶媒に溶かした溶液を、濃度が 0 ~ 500 となるように加え、蛍光スぺクトルを測定した。

この時の蛍光光度計（日立 F4500)の条件は、励起波長： 448 nm, スリツ卜幅：励起側 2.5 nm, 蛍光側 2.5 nm, ホトマル電圧： 700 V, スキャン速度： 240 nm / mi nとし 7二。

金属イオン濃度を変化させた時の極大蛍光波長 (505 nm)における蛍光強度を観測し、 Benesi - Hi Idebrandプロット法（丄 Am. Chem. Soc. 71, 2703 (1949)) を用いて、 Mg²⁺および Ga²⁺との結合定数を算出した。結果を下記表 1に示す。比較のため、 Molecular Probes社より市販されている公知のマグネシウムィォンプローブである mag-fur a- 2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2981 (1989) ) 、 mag-indo-1 (J. Physiol, 475, 319 (1994)) 、 mag-fur a-5 (J. Physiol, 4 75， 319 (1994)) 及びマグネシウムグリーン（丄 Biol. Chem. 270， 18975 (199 5)) の結合定数も併せて下記表 1に示す。 . 4

表 1から明らかな通り、本発明の蛍光プローブのマグネシウムイオンに対する選択性（K_Mg/K_Ca) は、従来のマグネシウムイオンプローブの選択性の 2 0 0倍以上も高かった。

産業上の利用可能性

本発明の蛍光プローブは、水系において、カルシウムイオン共存下においても、マグネシウムイオンと選択的に錯体を形成することができる、選択的なマグネシゥムイオン測定用蛍光プローブである。本発明の蛍光プローブは、生体内でのマグネシゥムイオンの挙動の解析等に大いに威力を発揮するものと考えられる。

Claims

請求の範囲

下記一般式 [I]

(但し、式中、 R¹は水素原子、金属原子又はエス亍ル形成基、 Aは式中の炭素原子 1及び 2と共に環式構造を形成する原子団、 Xは蛍光性原子団であって、 A を含む環と縮合環を形成していてもよい）

で表される構造を有するマグネシウムイオン測定用蛍光プローブ。

2. 下記一般式 [II]

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、 Yは、一 O—、一 CH₂—又は一 NH—、 Y' は一 CH=又は一 N=、 X' は蛍光性原子団であって、式中の炭素原子 3及び 4と共.に縮合環を形成していてもよく、式 [II]中の環構造を構成する任意の 1 又は 2以上の炭素原子に結合している各水素原子は、炭素数 1〜 6のアルキル基、炭素数 1〜 6のアルコキシル基、アミノ基、ハロゲン、又はニトロ基で置換されていてもよい）

で表される構造を有する請求項 1記載の蛍光プローブ。

3. 一般式中の Y' は一 CH=である請求項 2記載の蛍光プローブ。

4. 一般式 [II]中の Yは一 O—である請求項 3記載の蛍光プローブ。

5. —般式 [III]

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、 X''は蛍光性原子団であって、式中に示されるベンゼン環と縮合する環であってもよく、式 [111]中の環構造を構成する任意の 1又は 2以上の炭素原子に結合している各水素原子は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のアルコキシル基、アミノ基、各アルキル基の炭素数 "！〜 6のモノ一又はジアルキルァミノ、ハロゲン、又はニトロ基で置換されていてもよい）

で表される構造を有する請求項 4記載の蛍光プローブ。

6. 上記一般式 [III]

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、 X''は蛍光性原子団であって、式中に示されるベンゼン環と縮合する環であってもよい）

で表される構造を有する請求項 5記載の蛍光プローブ。

7. 一般式 [IV]

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、式 [IV]中の環構造を構成する任意の 1 又は 2以上の炭素原子に結合している各水素原子は、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜 6のアルコキシル基、アミノ基、各アルキル基の炭素数 1〜6のモノ —又はジアルキルァミノ、ハロゲン、又はニトロ基で置換されていてもよい）又は一般式 [V]

(但し、式中、 R，は一般式 [I]と同義、式 [V]中の環構造を構成する任意の 1又は 2以上の炭素原子に結合している各水素原子は、炭素数 1〜 6のアルキル基、炭素数 1〜6のアルコキシル基、アミノ基、各アルキル基の炭素数 1〜 6のモノ —又はジアルキルァミノ、ハロゲン、又はニトロ基で置換されていてもよい）で表される構造を有する請求項 5記載の蛍光プローブ。

8. 上記一般式 [IV]又は [V] (但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義）で表される構造を有する請求項 7記載の蛍光プローブ。

9. 一般式 [III]中の X''が、一般式 [VI]

X" ' -Z- [VI]

で示される請求項 5又は 6記載の蛍光プローブ。

1 0. X'''—が

一般式 [VII]

R3

(但し、 R ²は水素原子又はカルボキシル基、 R³及び R⁴は、互いに独立に、水酸基、炭素数 1〜6のアルキル基、又は各アルキル部分の炭素数が 1〜 6のジアルキルアミノ基（但し、窒素原子が、環を構成する炭素原子と二重結合して第四級ァミンとなっていてもよい））

で表される請求項 9記載の蛍光プローブ。

1 1. 一般式 [X]

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、 ^{1 1}及び ^{1 2}は、互いに独立に、水素、水酸基、ハロゲン、炭素数 1〜6のアルキル基、炭素数 1〜6のハロアルキル基、炭素数 1〜6のアルコキシル基、炭素数 1〜6のハロアルコキシル基、ベンジル基若しくはァセチル基、又は 1個若しくは 2個の単糖構造若しくはそのァシル化物を含む基である）

で表される請求項 5記載の蛍光プローブ。

1 2. 前記 1個若しくは 2個の単糖構造若しくはそのァシル化物を含む基は、グリコシル基、グリコシド基、フラクトシル基、フラクトシド基若しくは式 [XI]

で示される基又はこれらの基の中の 1ないし 4個の水酸基が炭素数 1ないし 6のァシル基でァシル化された構造を含む基である請求項 1 1記載の蛍光プローブ。

1 3. 前記単糖構造が、炭素数 1〜 6のアルキル基又はアルコキシル基を介して式 [X]中の窒素原子に結合している請求項 1 1又は 1 2記載の蛍光プローブ。

1 4. 前記一般式 [l]、 [ll]、 [Ml], [IV]、 [V]、 [VI I]又は [X]中の R¹が一般式 [IX]

— R⁹— OCO— R¹⁰ [IX]

(但し、 R ⁹は炭素数 1 ~ 4のアルキレン基、 R^1Qは炭素数 1〜4のアルキル基を表す）

で表される請求項 1ないし 1 3のいずれか 1項に記載の蛍光プローブ。

5. 前記一般式 [IX]中の R⁹がメチレン基、 R¹⁰がメチル基である請求項 4記載の蛍光プローブ。

1 6. 一般式 [XI II]

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、 R^{1 3}、 R^{1 4}、 R^{1 5}及び R^{1 6}は、互いに独立に水素原子、炭素数 1〜 5のアルキル基又はハロゲンを示す（ただし、 R

^{1 3}、 R^{1 4}、 R¹⁵及び R¹⁶が同時に水素原子である場合を除く））

で表される請求項 7記載の蛍光プローブ。

1 7. 一般式 [XIV]

(但し、式中、 R¹は一般式 [1〗と同義、 R ¹⁷及び R ¹⁸は互いに独立に水素原子、水酸基、ハロゲン、カルボキシル基又は一 COOR¹⁹ (ただし、 R^{1 9}tt1 価の金属イオン）である（ただし、 R ¹⁷及び R ¹⁸が同時に水素原子である場合を除く））で表される請求項 7記載の蛍光プローブ。

1 8. —般式 [XV]

(但し、式中、 R¹は一般式 [I]と同義、 R²⁰、 R²¹、 R²²、 R²³、 R²⁴及び R²⁵は、それぞれ独立に水素原子、炭素数 1 5のアルキル基、ハロゲン又は水酸基を示す）

で表される請求項 5記載の蛍光プローブ。

1 9. 上記一般式 [VI]

X… 一 Z— [VI]

が、一般式 [XVI]

(ただし、式中、 R²⁶は存在してもしなくてもよく、存在する場合には炭素数 1〜 5のアルキレン基； ²フは一1\11~1—、 _N H— CO—又は一 OCO—； R ²⁸は水素原子、カルボキシル基又は一 COOR³³ (ただし、 R³³は 1価の金属原子又は炭素数 1〜 5のアルキル基）； R²⁹及び R^3Qはそれぞれ独立に水素原子、炭素数 1〜 5のアルキル基又はハロゲン； R³¹は水酸基、炭素数 1 ~5 のアルキル基、又は各アルキル部分の炭素数が 1 ~ 5のジアルキルアミノ基； R

³²と環を結合している二 =zは単結合又は二重結合を示し、これが単結合を示す場合には、 R³²は水酸基、炭素数 1〜5のアルキル基、又は各アルキル部分の炭素数が 1〜5のジアルキルアミノ基、二重結合を示す場合には力ルポ二ル基又は- N + R³⁴R³⁵ (但し、 R³⁴及び R³⁵は互いに独立に炭素数"!〜 5のアルキル基）を示す）

で表される請求項 9記載の蛍光プローブ。

20. 上記一般式 [XVI]中、 R²⁶がメチレン基、 R²⁷が一 NH—、 R²⁸、 R ²⁹及び R ³⁰がいずれも水素原子、 R³¹が N(CH ク、 R³²が =N+(GH_q)_?である請求項 1 9記載の蛍光プローブ。

21. 前記一般式 [Xlll]、 [XIV], [XV]又は [XVI]中の R¹が一般式 [IX] — R⁹— OCO— R¹⁰ [IX]

(但し、 R ⁹は炭素数 1〜 4のアルキレン基、 R^1Qは炭素数 1〜4のアルキル基を表す）

で表される請求項 1 6ないし 20のいずれか 1項に記載の蛍光プローブ。

22. 前記一般式 [IX]中の R⁹がメチレン基、 R ¹⁰がメチル基である請求項

21記載の蛍光プローブ。

23. 請求項 1ないし 22のいずれか 1項に記載の化合物のマグネシウムィォン測定用蛍光プローブを製造するための使用。

24. 請求項 1ないし 22のいずれか 1項に記載のマグネシウムイオン測定用蛍光プローブを、マグネシウムイオンを含む試料と接触させ、試料中のマグネシゥムイオンと結合した該蛍光プローブの蛍光を測定することを含む、試料中のマグネシゥ厶イオンの測定方法。

25. 前記試料は細胞を含み、前記マグネシウムイオンは、該細胞中に含まれる請求項 24記載の方法。