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WO2002011725A1 - Inflammatory cytokine production inhibitors - Google Patents

Inflammatory cytokine production inhibitors Download PDF

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WO2002011725A1
WO2002011725A1 PCT/JP2001/006814 JP0106814W WO0211725A1 WO 2002011725 A1 WO2002011725 A1 WO 2002011725A1 JP 0106814 W JP0106814 W JP 0106814W WO 0211725 A1 WO0211725 A1 WO 0211725A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pyridone
nicotinic acid
production
methyl
nicotinamide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2001/006814
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hisashi Oku
Ryuji Suzuki
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Shionogi and Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi and Co Ltd filed Critical Shionogi and Co Ltd
Priority to AU2001278699A priority Critical patent/AU2001278699A1/en
Publication of WO2002011725A1 publication Critical patent/WO2002011725A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
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    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to an agent for suppressing the production of inflammatory site force-in, an agent for enhancing the production of interleukin 10, a poly-ADP-ribose-polymerase inhibitor, or an apoptotic inhibitor.
  • cytokine Inflammatory cytokines are a collective term for cytokines that have been shown to particularly cause inflammatory symptoms.
  • IFN interleukin
  • TNF tumor necrosis factor
  • IL-12 is mainly monocyte-macrophage
  • IL-18 is mainly macrophage cupper cells
  • IFN- ⁇ is an inflammatory cytokine produced mainly by T cells and NK cells. It is.
  • IFN-H, IFN- ⁇ TNF- ⁇ sIL- ⁇ , IL-1 ?, IL-5, IL-6, IL-10, and the like are known as inflammatory cytokines. Suppressing the production of these inflammatory cytokines is considered an important tool for achieving control of inflammatory conditions. For example, it has been reported that the use of compounds such as benzamide-nicotinic acid amide to suppress TNF-synthesis production can be used to treat inflammatory conditions (W097 / 32582).
  • apoptosis-inducing activity was confirmed for some of these compounds.
  • Apoptosis-inducing activity has also made it possible to control inflammatory conditions through induction of apoptosis.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • nicotinic acid amide can be applied to the treatment of diseases such as rheumatoid arthritis, asthma, sepsis, ulcerative colitis, psoriasis, and ischemic disorders.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • 3,4,2-phenylsulfonamide compounds W096 / 36595
  • N-substituted nicotinamides Japanese Unexamined Patent Publication No.
  • Fas-L Fas ligand
  • Fas-L Fas ligand
  • Fas-L Fas ligand
  • TNF-hi has been positioned as an apoptosis-inducing factor. Therefore, suppression of inflammatory cytokine production may lead to suppression of apoptosis.
  • suppression of the production of inflammatory cytokines is considered to be useful in controlling the pathology of many diseases related to inflammatory symptoms and apoptosis.
  • Apoptosis is cell death caused by activation of caspases. It is known that apoptosis is involved in many diseases, as well as in programmed cell death observed during development and homeostasis. For example, cancer can be described as a condition resulting from the breakdown of the apoptosis-inducing mechanism of abnormal cells. Conversely, a pathological increase in apoptosis leads to tissue atrophy. As the mechanisms by which apoptosis occurs become apparent, the association of apoptosis with various diseases has been suspected. It is speculated that the control and control of apoptosis will enable treatment and prevention of these diseases.
  • GVHD hepatitis symptoms and graft-versus-host disease
  • a compound capable of inhibiting the action of factors involved in apoptosis and controlling apoptosis it would be useful as a new therapeutic agent for diseases suspected of being involved in apoptosis.
  • various factors that induce apoptosis have been isolated, and their entire contents are being revealed gradually.
  • cytotoxic lymphocytes extracellularly induce apoptosis of target cells.
  • the site force acting at this time is Fas-L. If these factors can be effectively blocked, apoptotic control will be realized.
  • 5-methyl-tophenyl-2- (1H) -pyridone has a therapeutic effect on fibrosis in the lungs, arterial sclerosis and the like (Japanese Patent Publication 5-52814). From the structure shown below, this compound can also be said to be a nicotinic acid-related compound.
  • 5-Methyl-triphenyl-2- (1H) -pyridone was named generically as "pirfenidone”. A similar effect has been reported for its derivatives (Tokuheihei 8-510251).
  • Pirfenidone a compound represented by the following formula, has long been reported as a compound useful for treating inflammatory symptoms in the respiratory tract and skin (USP3974281, USP4042699 USP4052509). Since then, it has been focused on its antifibrotic effect, and is a compound under development as a drug for pulmonary fibrosis (Nicod, LP. Lancet, Vol. 354, July 24, 1999, p268-269).
  • TNF-hi tumor necrosis factor
  • TNF- ⁇ is positioned as an apoptosis inducer. It has also been suggested that the role of TNF-hi in hepatitis-induced liver tissue injury is important (Guidotti L., et a 1., Immunity, 4: 25-36, 1996, Kondo T., et al. , Nature Med., 3: 409-413, 1997, Seino K., et al., Gastroenterology, 113: 1315-1322, 1997) 0 Further, the present inventors have added to pirfenidone an inflammatory site. We found a use for inhibiting the production of force-in and as an inhibitor of apoptosis, and filed a patent application (Japanese Patent Application No. 2000-38048). However, in addition to these reports, no nicotinic acid-related compounds that can be used as inhibitors of inflammatory cytokine production or as inhibitors of apoptosis have not been reported. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel inflammatory cytokine production inhibitor, an interleukin 10 production enhancer, a poly-ADP-ribose-polymerase inhibitor, or an apoptosis inhibitor.
  • the present inventors administer a nicotinic acid-related compound to an artificially caused inflammatory condition, and analyze the effect in detail to obtain a mechanism of action of the nicotinic acid-related compound.
  • a model for artificial inflammation an acute hepatitis model of mouse liver induced by bacterial lipopolysaccharide (hereinafter abbreviated as LPS) was selected. This model is useful as a model for acute hepatitis because severe hepatic inflammation appears rapidly.
  • LPS bacterial lipopolysaccharide
  • the present inventors confirmed that the nicotinic acid-related compound has a therapeutic effect or a preventive effect on LPS-induced hepatitis. Furthermore, the present inventors have searched for the mechanism of action of a nicotinic acid-related compound having such an effect, and have studied its anti-inflammatory action, poly-ADP-ribose-polymerase inhibitory action, and anti-inflammatory action. The present inventors have found a cytokine production promoting action or an anti-apoptotic action, and completed the present invention. Furthermore, the present inventors have paid attention to the fact that all of the nicotinic acid-related compounds that have found these effects are present in vivo. Then, it was clarified that the anti-inflammatory effect can be evaluated using the activity of increasing the amount as an index, and a method for screening a compound useful as an anti-inflammatory agent was established.
  • the present invention provides the following inflammatory site force-in production inhibitor, interleukin-10 production enhancer, poly-ADP-ribose-polymerase inhibitor, or apoptosis inhibitor, and uses thereof. About.
  • a tumor necrosis factor production inhibitor comprising, as a main component, trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a tumor necrosis factor ⁇ production inhibitor comprising nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof and tributophan or a pharmaceutically acceptable salt thereof as a main component.
  • nicotinic acid nicotinamide, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide
  • An interleukin 10 production enhancer containing, as a main component, any compound selected from the group consisting of 1-methyl-2-pyridone and tributophan, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a prophylactic or therapeutic agent for a disease caused by necrosis comprising as an active ingredient the inhibitor of poly-ADP-ribose-polymerase according to [7].
  • a method for screening a compound useful as an anti-inflammatory agent comprising the following steps. a) a step of administering a candidate compound to a test animal
  • An anti-inflammatory agent comprising, as a main component, a compound obtainable by the method according to [11].
  • the compounds utilized as active ingredients in the present invention are all known nicotinic acid Related compounds. The structures of these compounds are shown below.
  • An agent for inhibiting the production of cinnamon-leukin 12 and / or cinnamon-ferrona relates to nicotinic acid, nicotinamide, trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide, and trimethyl-
  • the present invention relates to an interleukin 12 and / or interferona production inhibitor containing, as a main component, any compound selected from the group consisting of 2-pyridones, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the term “pharmaceutically acceptable salt” includes hydrates thereof.
  • alkali metals lithium, sodium, potassium, etc.
  • alkaline earth metals magnesium, calcium, etc.
  • ammonium salts with organic bases and amino acids, or inorganic acids (hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphorus) Acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (acetic acid, citric acid, maleic acid, fumaric acid, benzenesulfonic acid, P-toluene) Sulfonic acid and the like).
  • These salts can be formed by a commonly used method. When forming a hydrate, any number of water molecules may be coordinated.
  • the present invention relates to a method for suppressing the production of interleukin 12 and / or insulin feron ", which comprises a step of administering an effective amount of the above compound.
  • the present invention relates to the use of 12 and / or interferona in the production of a production inhibitor.
  • TNF-spin When LPS is administered to a mammal's peritoneal cavity, first production of TNF-spin occurs. TNF- leads to the production of IL-12 and IL-18, and these two cytokines induce IFN- ⁇ production. IFN-a induces Fas and Fas-L, resulting in rapid induction of hepatocellular apoptosis in the liver and hepatic failure due to congestive necrosis with apoptosis (Tsutsui, H., et al. 1997).
  • IL-18 Accounts for Both TNF -hi-and Fas Ligand- mediated Hepatotoxic Pathways in Endotoxin- Induced Liver Injury in Mice. J.I thigh u nol. 159: 3961.) O It has been reported that it is more important than the elevation of IL-1, IL-6, IL-8, GM-CSF, etc., which are also known to be elevated in acute inflammation (Ozman, L., et al. al. 1994.Interleukin 12, interferon 7, and tumor necrosis factor are the key cyto ines of the generated Sh arzman reaction.J. Exp.Med. 180: 907, Wysocka, M. et al. 1995.Int erleukin 12 is required for interferon r production and lethality in lip opolysaccharide-induced shock in mice.Eur.J. Immunol. 25: 67) 0
  • nicotinic acid-related compounds have already been reported to suppress TNF-hi production. Further, it is also shown in Examples 1 and 7 described later that the production of TNF-hi increases by administration of the anti-niacin compound. This can be explained by the fact that endogenous niacin was competitively inhibited by the anti-niacin compound, and TNF-production was enhanced. In fact, anti-niacin compounds It has long been known that competitive inhibition of causative niacin causes symptoms similar to niacin deficiency. The present inventors have clarified that a specific nicotinic acid-related compound has an inhibitory effect not only on TNF-specific but also on IL-12 and IFN-y.
  • T- is located at the uppermost stream in the sequence of site force-in flow described here.
  • the inflammatory cytokine-suppressing effect of the nicotinic acid-related compound may appear as a result of suppressing the production of TNF-hi.
  • the action of inhibiting the production of inflammatory cytokines by nicotinic acid-related compounds is not indirect.
  • the peak of TNF-spike production by LPS administration was 1.25 hours after LPS administration, and nicotinic acid-related compounds were not detected in blood 3 hours after LPS administration.
  • Administration even after medium TNF-production has passed can protect against lethality.
  • the nicotinic acid-related compound also suppresses apoptosis even when administered 3 hours after LPS administration (Example 13).
  • the nicotinic acid-related compound has a characteristic that it can suppress acute inflammatory shock even after the release of TNF-fiber.
  • the nicotinic acid-related compound suppresses poly-ADP-ribosylation and a decrease in the amount of NAD even after 3 hours from LPS administration (Example 13).
  • These effects of nicotinic acid-related compounds are in contrast to the fact that protection, such as with anti-TNF-antibodies, fails to suppress the response of TNF-antibodies to automatically evolve after they are released into the blood in large quantities. . From the above, it is clear that these effects of nicotinic acid-related compounds are not merely manifested as a result of suppressing the effects of TNF-H.
  • T helper 1 type site potentin All of the cytokines whose production is suppressed by the inflammatory cytokine production inhibitor of the present invention are T helper 1 type site potentin. Therefore, the inflammatory cytokine inhibitory agent of the present invention is a disease caused by enhanced production of T helper 1 type cytokines, and particularly enhances the production of IL-12 and IFN- ⁇ . It is effective for the cause.
  • T helper 1 type site force in is a general term for a group of inflammatory cytokines involved in the induction of T helper 1 type immune response among inflammatory cytokines.
  • the T helper 1 type of site force-in includes a cytokine that induces the differentiation of T helper 1 cells and a cytokine that is produced by T helper 1 cells.
  • T helper 1 cells include IL-12 and the like. These site forces have been implicated in the induction of T helper 1 type immune responses (Xu, B. et al. J. Exp. Med., 188: 1485, 1998, and Takeda, K. et al. al. Immunity., 8: 383-390, 1998).
  • the site force produced by T helper-1 cells specifically includes IFN- ⁇ and the like.
  • T helper 1 / T helper 2 balance An imbalance in the T helper 1 / T helper 2 balance is thought to contribute to the development of immune disease.
  • T helper type 1 immunity When biased toward T helper type 1 immunity, cell-mediated immunity is enhanced and the immune response to cancer and infectious diseases is increased, but at the same time, self-injury is also increased, which is one of the causes of the onset of immune diseases. Therefore, the inhibitor of the production of inflammatory cytokines according to the present invention can be expected to be effective against all diseases which are said to be caused, for example, by an excessive T helper 1 type immune response.
  • organ-specific autoimmune diseases are thought to be caused by a bias toward T helper 1 type immune responses.
  • diabetes hepatic disorder, autoimmune myelitis, ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GV HD), arthritis, thyroiditis, Hashimoto's disease, exocrine glanditis, intracellular infection (Leishmani A. Tuberculosis, mycobacterium tuberculosis, rye bacteria), delayed-type hypersensitivity, scleroderma, or Behcet's disease.
  • the inflammatory cytokine inhibitory agent of the present invention can be used for preventing or treating these diseases.
  • the etiology of the following diseases is not caused solely by TNF- ⁇ alone, and it is difficult to imagine the indication as an indication for a TNF-producing inhibitor. That is, diabetes, hepatic disorder, autoimmune myelitis, graft-versus-host disease (GVHD), arthritis, thyroiditis, Hashimoto's disease, exocrine glanditis, intracellular infection , Mycobacterium tuberculosis, Rye), delayed-type hypersensitivity, Behcet's disease, and the like can be said to be novel indications specific to the inflammatory cytokine inhibitory agent of the present invention.
  • the present invention also relates to a TNF-hi production inhibitor comprising trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof as a main component.
  • the present invention relates to an agent for inhibiting the production of TNF-hi, which comprises nicotinamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof and tributophan or a pharmaceutically acceptable salt thereof as main components.
  • the present invention relates to a method for suppressing the production of TNF-hi, comprising the step of administering an effective amount of the compound.
  • the present invention relates to the use of the above compound in the production of a TNF- production inhibitor.
  • nicotinamide is said to show a protective effect in mice administered with SEB, a superantigen.
  • This report confirms the suppression of production of IL-1, TNF-, IL-2R, IL-2, and IFN-y (Toxicology, 1996, 107/1, 69-81).
  • TNF-hi is located upstream of the inflammatory cytokine signaling pathway. Therefore, Compounds that suppress its production are important in controlling inflammatory conditions.
  • the inhibitor of TNF-hi production is useful for treating the above-mentioned diseases caused by the action of inflammatory cytokines.
  • the interleukin-12, interferona, or TNF-hi production inhibitor may be simply referred to as an inflammatory site force-in production inhibitor.
  • the present invention relates to any compound selected from the group consisting of nicotinic acid, nicotinamide, trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide, and 1-methyl-2-pyridone, Or an inhibitor of poly-ADP-ribose-polymerase (hereinafter abbreviated as PMP) containing a pharmaceutically acceptable salt thereof as a main component.
  • PMP poly-ADP-ribose-polymerase
  • the present invention relates to a method for inhibiting PARP, comprising a step of administering an effective amount of the compound.
  • the invention further relates to the use of said compounds in the manufacture of inhibitors of PMP.
  • PARP is an enzyme that catalyzes the reaction of poly-ADP-ribosylation of proteins near the damaged DNA strand (histone, PARP itself, etc.). This enzyme activity depends on the cleaved DNA, and is activated by caspase-3 cleavage (from 116KD to 85KD) during apoptosis.
  • PMP substrates are receptor-side proteins for NAD and poly-ADP-ribosylation.
  • Another important role of this enzyme is to consume large amounts of intracellular NAD by poly-ADP-ribosylation. That is, it is considered that apoptosis and necrosis of cells and tissues are promoted by rapidly decreasing NAD and ATP of cells and tissues (Ha, HC and Snyder, SH Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 96, No. 24, 13978-13982, 1999).
  • PMP enzyme inhibition is expected to have therapeutic effects on arthritis, type I diabetes, diseases derived from various types of neuronal cell death (cerebral ischemia, reperfusion, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, etc.), retrovirus infection, and the like.
  • the PARP inhibitor of the present invention It is useful as a therapeutic or prophylactic agent for diseases associated with necrosis. It is particularly effective for diseases caused by necrosis caused by rapid apoptosis. Such diseases include acute hepatitis.
  • the present invention relates to any compound selected from the group consisting of nicotinic acid, nicotinamide, trimethyl-2-pyridone-5-potassium lipoxamide, and methyl-2-pyridone, or a pharmaceutically acceptable compound thereof.
  • the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for hepatitis, comprising a salt as a main component.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing hepatitis, comprising administering an effective amount of the compound.
  • the present invention also relates to the use of the compound in the manufacture of a prophylactic or therapeutic agent for hepatitis.
  • the compounds are particularly useful for the prevention and treatment of acute hepatitis and fulminant hepatitis.
  • the present invention provides a compound selected from the group consisting of nicotinic acid, nicotinamide, trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide, and 1-methyl-2-pyridone, or
  • the present invention relates to an inhibitor of apoptosis, containing a pharmaceutically acceptable salt thereof as a main component.
  • the present invention relates to a method for inhibiting apoptosis, comprising a step of administering an effective amount of the compound.
  • the invention further relates to the use of said compounds in the manufacture of inhibitors of apoptosis.
  • a nicotinic acid-related compound has an apoptosis inhibitory action as shown in the Examples. It should be noted that administration of nicotinic acid-related compounds after LPS has a therapeutic effect, especially in acute hepatitis symptoms induced artificially by LPS peritoneal administration. Many known anti-apoptotic active compounds cannot be expected to have a sufficient apoptosis inhibitory effect unless administered prophylactically before apoptosis occurs. That is, although effective as a prophylactic agent, its effectiveness as a therapeutic agent could not be expected. In contrast, the apoptosis inhibitor according to the present invention can inhibit apoptosis that is in progress. That is, therapeutic The effect can be expected.
  • Nicotinic acid-related compounds that have this mechanism of action against apoptosis include, for example, prophylactic agents against internal hemorrhagic necrosis of the liver (with rapid pathological apoptosis) and chronic rejection after transplantation that occur in acute hepatitis. It is suitable for post-onset administration as a therapeutic agent. Accordingly, the apoptosis inhibitor of the present invention relates to a medicament used for treating ongoing apoptosis.
  • apoptosis include glomerulonephritis, acute lung injury, interstitial pneumonia, cardiac hypertrophy, cardiomyopathy, retinal detachment, autoimmune disease, myocardial infarction ischemia, diabetes, inflammatory bowel Disease, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, systemic lupus erythematosus, psoriasis, AIDS, pancytopenia, refractory anemia, aplastic anemia, viral hepatitis, fulminant hepatitis, cirrhosis, cerebral ischemia , Cerebral infarction, Cedaren syndrome, salivary glanditis, severe myeloma, arteriosclerosis, Peyette's disease, multiple sclerosis, glaucoma, cataract, Parkinson's disease, Alzheimer's, amyotrophic lateral sclerosis, radiation injury, sepsis And so on.
  • nicotinic acid-related compounds are effective in inhibiting the production of apoptosis-related factors, IL-12, IFN- ⁇ , PP, or TNF-hi. Since all of these apoptosis-related factors are closely related to apoptosis based on the mechanism described below, nicotinic acid-related compounds are useful as inhibitors of apoptosis.
  • Apoptosis is generally referred to as clean cell death without inflammation.
  • pathological apoptosis such as hepatitis due to intraperitoneal administration of LPS
  • necrosis occurs extensively in liver tissue with rapid apoptosis.
  • Pathological findings in cases have also been observed.
  • One of the causes is thought to be the rapid decrease in NAD in the organization.
  • ADP-ribosylation by PMP proceeds rapidly in apoptotic cells and consumes large amounts of NAD. Therefore, rapid apoptosis is accompanied by massive consumption of NAD in tissues.
  • Necrosis can be explained by a decrease in ATP in tissues and a decrease in tissue turnover associated with a decrease in NAD (Ha, HC and Snyder, SH Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 96, No. 24, 13978-13982, 1999).
  • Nicotinic acid-related compounds are thought to suppress the consumption of NAD, which causes necrosis through inhibition of PMP activity. Therefore, it can be said that nicotinic acid-related compounds can effectively contribute to the suppression of internal hemorrhagic necrosis of the liver (with rapid pathological apoptosis) caused by acute hepatitis through PMP inhibitory action. .
  • Apoptosis is a complex system initiated by a variety of mechanisms, including physical effects. Therefore, it goes without saying that even the diseases caused by the same apoptosis have various causes. Therefore, an apoptosis inhibitor that is effective for a certain disease does not necessarily show the same effect for other apoptosis-causing diseases. In order to effectively utilize an apoptosis inhibitor for treatment or prevention, it is reasonable to clarify its action point and then select an apoptosis inhibitor having an action point at the cause of apoptosis. For these reasons, the utility of the present invention, which has found which apoptosis-related factor is affected by the inhibitory action of a nicotinic acid-related compound, is apparent.
  • Apoptosis inhibitors are caused by apoptosis containing the following diseases: It is effective for the treatment or prevention of diseases that occur. Therefore, it can be used as a therapeutic or prophylactic agent for these diseases.
  • Fulminant hepatitis Viral hepatitis C and B, Primary biliary cirrhosis, Secondary cirrhosis Glomerulonephritis, Tubular and interstitial nephritis, Focal glomerulosclerosis, Renal sclerosis, Peritoneal sclerosis, Nephrosis Syndrome, diabetic nephropathy
  • GVHD graft-versus-host disease
  • Hepatitis including fulminant, chronic, alcoholic, hepatitis C and B viral
  • toxic or metabolic liver damage include Behcet's disease, aplastic anemia, AIDS, pancytopenia, Refractory anemia, cerebral infarction, glaucoma, cataract, salivary glanditis, radioactive disorder, ultraviolet ray injury, sun dermatitis, erythema multiforme, fixed drug eruption, GVHD, TEN, flat warts, herpes simplex, lupus erythematosus, lichen group Tissue reactions, tubular injury, respiratory infections, diabetes, arteriosclerosis, cerebral ischemia, myocardial infarction, dilated and hypertrophic cardiomyopathy, alopecia areata, or drug-induced alopecia are evident in the present invention.
  • the present invention provides a compound selected from the group consisting of nicotinic acid, nicotinamide, trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide, trimethyl-2-pyridone, and tributophan Or a pharmaceutically acceptable salt thereof as a main component.
  • the present invention also relates to a method for promoting the production of IL-10, comprising a step of administering an effective amount of the compound.
  • the present invention relates to the use of the compound in the production of an IL-10 production enhancer.
  • nicotinic acid nicotinamide, trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide, tributofan, and methyl-2-pyridone further enhance IL-; 10 production in LPS-administered mice. It has an effect.
  • an anti-inflammatory drug In order for an anti-inflammatory drug to exert a strong anti-inflammatory effect, it must not only suppress the production of TNF-hi, which is an inflammatory cytokine, but also enhance the production of IL-10, which is an anti-inflammatory cytokine. Has been argued to be extremely effective.
  • the above-mentioned nicotinic acid-related compounds all have an anti-inflammatory drug, which has an action of promoting the production of an anti-inflammatory cytokine, IL-10, in addition to the action of producing inflammatory cytokines and the action of inhibiting PARP. It can be said that this is an ideal compound.
  • IL-10 production enhancer according to the present invention is useful for, for example, treating or preventing the following diseases.
  • TH1-dependent autoimmune disease multiple sclerosis (TH1-dependent autoimmune disease), scleroderma, insulin-dependent diabetes mellitus, inflammatory bowel disease, Crohn's disease, sepsis, septic shock, hepatitis C, severe perforated abdominal smog, deformity Arthritis, rheumatoid arthritis
  • Administer the inflammatory site production inhibitor, PMP inhibitor, apoptosis inhibitor or IL-1.0 production enhancer of the present invention to humans for the treatment or prevention of the above-mentioned diseases.
  • powders, granules, tablets, capsules, pills, liquids, etc. It can be administered orally or parenterally as injections, suppositories, transdermal absorbers, inhalants and the like. It can also be used externally as ointments and creams.
  • Pharmaceutical preparations can be made by mixing, as necessary, pharmaceutical additives such as excipients, binders, wetting agents, disintegrating agents, and lubricants with the effective amount of the compound. .
  • injections In the case of injections, they should be sterilized with a suitable carrier to produce the preparation. Dosage will also vary depending on disease state, route of administration, age or weight of patient, and will ultimately be at the discretion of a physician, but if administered orally to adults, usually 10 to 40 ⁇ ⁇ / 1 g / day Can be administered. It may be administered once or divided into several doses.
  • nicotinic acid-related compounds that have been shown to inhibit the production of inflammatory site power-in, inhibit apoptosis, or enhance the production of IL-10 are all compounds found in the living body.
  • the NAD cycle is known as a biosynthesis system for nicotinic acid-related compounds. That is, quinolinic acid obtained by synthesizing kynurenine from L-tributophan is converted to nicotinic acid mononucleotide.
  • the NAD cycle returns to nicotinic acid mononucleotide via nicotinic acid adenine nucleotide, NAD (nicotinamide adenine dinucleotide), nicotinamide and nicotinic acid.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • nicotinamide nicotinic acid
  • the following products are generated in the NAD cycle. These compounds are all metabolites of nicotinic acid found in urine and the like.
  • NADP NAD
  • Nicotinic acid produces trigonelline
  • Nicotinamide 1-methylnicotinamide ⁇ Generates 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide
  • the present inventors have clarified that a compound useful as an anti-inflammatory agent can be found in vivo by using the action of inducing the production of these nicotinic acid-related compounds as an index. did. That is, the present invention relates to a method for screening a compound useful as an anti-inflammatory agent, comprising the following steps.
  • the screening of the present invention has a metabolic pathway similar to that of humans, and in the If process for nicotinic acid-related compounds, nicotinic acid, nicotinamide, 1-methyl-2-pyridone-5-potency lipoxamide, or 1
  • Use animals that produce -methyl-2-pyridone, etc. as test animals For example, mice and rats are common experimental animals. You can also use egrets, dogs, dogs, bush, goats, goats, or sea lions. These test animals are given candidate compounds.
  • Candidate compounds can be taken orally or parenterally, based on their absorption characteristics and the like.
  • Parenteral administration includes intradermal injection and intraperitoneal administration.
  • a suspension (or aqueous solution) of a candidate compound is prepared using a 0.5% aqueous solution of methylcellulose as a carrier (vehicle), and the suspension is orally administered to animals at the same dose.
  • the dose of the candidate compound can be appropriately set, for example, in the range of generally 10 to 1000 mg, usually 50 to 500 mg per kg of body weight.
  • a control a group to which only the carrier is administered is provided.
  • the target tissue means a tissue expected to have an anti-inflammatory action by the candidate compound.
  • body fluids such as serum and urine also contain the nicotinic acid-related compound. It is important as an object to be measured.
  • Candidate compounds that effect changes in individual tissues are useful as compounds with specific anti-inflammatory activity in each tissue.
  • compounds that increase the content of nicotinic acid-related compounds in body fluids can be expected to have systemic anti-inflammatory effects.
  • the measurement interval of the nicotinic acid-related compound after administration of the candidate compound can be appropriately set. For example, if rapid effects are expected, measurements should be taken at short time intervals immediately after administration. Conversely, if you want to confirm long-term effects, you should continue to observe changes in the levels of nicotinic acid-related compounds over time.
  • Samples for which nicotinic acid-related compounds are to be measured can be stored frozen. Therefore, samples collected over time can be frozen and stored, and after the collection is completed, the measurement of the nicotinic acid-related conjugate can be performed simultaneously.
  • NAD content is determined by the method of Nisselbaum (Nisselbaum, JS., And S. Green.As imle ultramicro method for determination of pyridine nucleotide in tissues.Anal.Biochem. 27, 212-217, 1969). can do.
  • Measurement methods for other nicotinic acid-related compounds are also known (TA Tyler RR Shrago J. Liq.
  • Candidate compounds that have significantly increased nicotinic acid-related compound concentrations compared to the respective nicotinic acid-related compound concentrations in each organ of the control group of mice without drug administration have anti-inflammatory effects
  • Is selected as a compound having The selected candidate compounds are evaluated for their anti-inflammatory effect level and safety.
  • the level of the anti-inflammatory effect can be evaluated by comparing the anti-inflammatory effect in the acute inflammatory model of LPS-sensitized mice shown in the Examples.
  • the following compound groups are used as candidate compounds for the screening of the present invention.
  • compounds derived from the NAD cycle and compounds obtained by modifying a nicotinic acid-related compound by a synthetic method include many compounds capable of increasing the measured value of a nicotinic acid-related compound.
  • a compound showing the same anti-inflammatory effect as a large dose of nicotinic acid can be obtained by a small dose. If such a compound is used as an anti-inflammatory drug, it can be replaced with a large dose of a nicotinic acid-related compound. Some nicotinic acid-related compounds may cause minor side effects, such as flushing of the face and pruritus, with large doses.
  • the use of the compound of the present invention which can be obtained by screening makes it possible to avoid such side effects.
  • FIG. 1 is a graph showing the inhibitory effect of various nicotinic acid-related compounds on TNF- production in blood of mice administered with LPS in vivo. Significant differences were tested by Student's t-test. p * 0.05 *, p * 0.01 **, p * 0.005 ***.
  • FIG. 2 is a graph showing the inhibitory effect of nicotinic acid on the production of TNF-, Mr and IL-12 in blood of LPS-administered mice.
  • FIG. 3 shows the effect of nicotinic acid and its derivatives on serum TNF- ⁇ levels in LPS shock mice.
  • FIG. 4 is a graph showing the inhibitory effect of trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide on the production of TNF-spi in blood of LPS-inoculated mice.
  • FIG. 5 is a graph showing the inhibitory effect of 1-methyl-2-pyridone-5-potorupoxamide on blood IL-12 production in LPS-inoculated mice.
  • the column labeled 1M2P5C shows the results for trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide.
  • FIG. 6 is a graph showing the inhibitory effect of methyl-2-pyridone-5-potassium lipoxamide on the production of IFN ⁇ in blood of LPS-inoculated mice.
  • the column labeled 1M2P5C shows the results for 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide.
  • FIG. 7 is a graph showing the effect of 3-pyridinesulfonic acid on the production of TNF-spi in blood of LPS-inoculated mice.
  • FIG. 8 shows the effect of nicotinamide on the survival of LPS shock model mice.
  • FIG. 9 is a diagram showing the effects of nicotinamide and tritophan on survival of LPS shock model mice.
  • FIG. 10 is a graph showing the effect of post-treatment of nicotinamide on the survival of LPS shock model mice.
  • the plot labeled NM shows the results for nicotinamide.
  • FIG. 11 shows the effect of pretreatment with trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide on the survival of LPS shock model mice.
  • the plot labeled 1M2P5C shows the results for 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide.
  • FIG. 12 is a diagram showing the therapeutic effect of trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide on the survival of LPS shock model mice.
  • the plot described as 1M2P5C shows the results for trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide.
  • FIG. 13 is a photograph showing a hematoxylin-eosin-stained image of a tissue section in which the effect of nicotinamide or 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide administration on the liver of an LPS shock model mouse was examined.
  • A control without LPS inoculation
  • B mouse administered with carrier only 3 hours after LPS inoculation
  • C nicotinamide administration 3 hours after LPS inoculation
  • D methyl-2-pyridone- 3 hours after LPS inoculation.
  • Administration of 5-carboxamide is administered to determine the effect of 5-carboxamide.
  • FIG. 14 is a photograph showing an ssDNA-stained image of a tissue section in which the effect of nicotinamide or methyl-2-bilidon-5-carboxamide administration on the S pancreas of an LPS shock model mouse was examined.
  • a ⁇ ! Is similar to Fig. 13.
  • Figure 15 shows the effects of nicotinamide and methyl-2-pyridone-5-carboxamide on DNA ladder formation, poly-ADP-ribosylation, and NAD levels in LPS shock model mice. It is.
  • NA indicates nicotinamide
  • MPC indicates trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide.
  • FIG. 16 shows the effect of nicotinic acid and its derivatives on serum IL-10 levels in LPS-administered mice. It shows the action of nicotinic acid, nicotinamide, trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide and tributofan to enhance IL-10 production.
  • FIG. 17 shows the effect of nicotinic acid and its derivatives on serum IL-10 levels in LPS-administered mice.
  • the results for trimethyl-2-pyridone, whose action was strong, are shown.
  • LPS (dO / g / g) + D-gal (250 mg / kg) was intraperitoneally administered, and after 75 minutes, the mice were sacrificed and the serum was collected. TNF-serum in serum was assayed by ELISA. As a result, it was found that nicotinic acid, nicotinamide, 1-methyl-2-pyridone, and trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide suppressed the production of TNF-hi (FIG. 1). In mice that were orally administered pyridine-3-sulfonic acid, an anti-niacin active compound, LPS administration increased the production of TNF- spleen. This can be regarded as a pseudo niacin-deficient animal model.
  • THP-1 cells were washed twice in a medium (deficient medium) containing 10% of dialyzed FCS (Gibco BRL) in RPMI1640 (Niken) excluding both nicotinamide and tributophan, and cultured in the same medium as it was did. Comparison of the amount of TNF- production in the culture supernatant 3.5 hours after the addition of 10 g / mL LPS gave the following results. Conversely, TNF-spleen production showed significantly higher secretion when cultured in a deficient medium.
  • Defective medium (without LPS) 9 3 ⁇ 2.9 pg / mL.
  • Defective medium (with LPS) 7 2 7 ⁇ 31 pg / mL
  • nicotinamide and tributophan may have the effect of potentially suppressing cells from producing excessive TNF-spin in response to LPS stimulation.
  • nicotinic acid-related compounds control site force-in production in acute inflammation and exert an anti-inflammatory effect. It is suggested that there is a mechanism in vivo that regulates the cytokine production response in acute inflammation by nicotinic acid-related compounds.
  • nicotinic acid The inhibitory effect of nicotinic acid on the blood TF-, IFN-, and IL-12 production in LPS-shock mice in vivo was examined.
  • a carrier PBS
  • P-aggressive control P-aggressive control
  • nicotinic acid was orally administered 5 minutes before LPS inoculation.
  • LPS 50 g / kg + D-gal (250 mg / kg) was intraperitoneally administered, the mice were sacrificed 75 minutes after TNF, and 5 hours after IL-12 and INF, and serum was collected. TNF, IL-12, and IFN in serum were assayed by ELISA.
  • ELISA has the following The sales kit was used.
  • nicotinic acid was found to suppress the production of a series of inflammatory cytokines, TNF-, IL-12, and IFNa, which appear in serum during LPS shock in in vivo mice ( Figure 2 ) .
  • mice C57BL / 6, 9-week-old female
  • LPS (10 mg / kg) and D-gal (250 mg / kg) were intraperitoneally administered, and the mice were sacrificed 75 minutes later, and the serum was collected.
  • TNF-serum in serum was assayed by ELISA. Nicotinic acid, nicotine amide, and trimethyl-2-pyridone suppressed the production of TNF-hi ( Figure 3).
  • mice C57BL / 6, 9-week-old female
  • carrier 0.5% CMC
  • methyl-2-pyridone-5-carboxami was orally administered.
  • LPS 50 g / kg + D-gal (250 mg / kg) was intraperitoneally administered, and the mice were sacrificed 75 minutes later, and the serum was collected.
  • TNF- ⁇ in serum was analyzed by ELISA (R & D, Quantikine). As a result, it was found that trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide suppressed the production of sperm expressed in serum upon LPS shock in in vivo mice (FIG. 4).
  • mice C57BL / 6, 9-week-old female
  • vehicle 0.5% CMC
  • 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide was orally administered.
  • LPS 50 zg / kg + D-gal (250 mg / kg) was intraperitoneally administered, and 5 hours later, the mice were sacrificed and serum was collected. IFN in serum was analyzed by ELISA. As a result, it was found that methyl-2-pyridone-5-carboxamide suppressed the production of IFNy appearing in the serum upon LPS shock in in vivo mice (FIG. 6).
  • mice C57BL / 6, 7-week-old female
  • LPS 50 ⁇ g / kg + D-gal (250 mg / kg) was intraperitoneally administered, and after 75 minutes, the mice were sacrificed and serum was collected. Serum in serum was assayed by ELISA.
  • 3-pyridinesulfonic acid enhanced the production of TNF o: expressed in serum during LPS shock in in vivo mice (FIG. 7).
  • nicotinamide (NM) after LPS inoculation on the survival of LPS shock model mice was examined.
  • Example 13 Effect of nicotinic acid-related compound administration on congestive necrosis and apoptosis in liver of mice treated with LPS
  • mice C57BL / 6 about 10-week-old female
  • healthy mice control
  • LPS-administered mice E. coli ⁇ 0 ⁇ g / g + D-galactosamine 250 mg / kg, ip (volume 200 ⁇ 1)
  • nicotinamide and methyl-2-pyridone-5-carboxamide were selected as nicotinic acid-related compounds, and nicotinamide lg / kg and 1-methyl, respectively.
  • nicotinamide lg / kg 3 hours after LPS inoculation
  • the cells were fixed with a formalin buffer (for histopathological examination), a portion was immediately frozen on dry ice, and then stored frozen at -80 ° C (for biochemical examination). Liver was cut out for histopathological examination (outside After (left lobe), tissue sections were prepared, and then hematoxylin and eosin (HE) staining and ssDNA staining were performed.
  • HE hematoxylin and eosin
  • ssDNA anti-Single Stranded DNA
  • DAK0 product code A4506 egret polyclonal antibody
  • detection was performed using the DAK0 LSAB2 kit / HRP-Universal (catalog NO.K0677). used.
  • the protocol using the primary antibody was performed in the same manner as in the following literature.
  • nicotinamide-administered group M in the table
  • eosinophils and vitreous droplets were found in only a few places, and microvesicles and porosity were also found in some places, but almost all were “normal” (control) ) And the same.
  • ssDNA staining a very small number of positive cells were observed by ssDNA staining, they were significantly suppressed compared to the Vehicle group.
  • the trimethyl-2-pyridone-5-carboxamide-administered group MPC in the table
  • liver MA ladder formation was detected by preparing genomic DNA from the moon spleen of each mouse and following the Apoptosis Ladder Detection Kit Wako of the mouse.
  • Poly-ADP-ribosylation was detected by Western blot using an Anti-poly (ADP-Ribose) polyclonal antibody (rabMt, polyclonal).
  • the NAD amount was determined by the method of Nisselbaum. (Nisselbaum, J.S., and S. Green. A simple ultramicro method for determination of pyridine nucleotides in tissues. Anal. Biochem. 27, 212-217 (1969)).
  • Figure 15 summarizes the results of the biochemical studies.
  • nicotinamide is a precursor of NAD, This may be due to the large amount of NAD biosynthesized in the liver due to the administration of NAD ( considering that the drug was administered 3 hours after LPS inoculation, the above results indicate that nicotinamide and trimethyl-2 Nicotinic acid-related compounds, such as -pyridone-5-carboxamide, have an anti-apoptotic action in addition to an anti-inflammatory action, and are presumed to have a protective action against tissue damage by their combined actions.
  • Example 14 Enhancing effects of various nicotinic acid-related compounds on IL-10 production
  • the enhancing effects of various nicotinic acid-related compounds on blood IL-10 production were examined.
  • the inhibitory effect of a nicotinic acid-related compound on the production of inflammatory cytokines associated with apoptosis associated with IL-12, IFN- ⁇ , or TNF-like activity was revealed. Also, the inhibitory effect of nicotinic acid-related compounds on PARP was clarified. Furthermore, it has been found that a nicotinic acid-related compound has an activity of enhancing the production of an anti-inflammatory cytokine, IL-10.
  • apoptosis-related factors are closely related to each other and play important roles in the apoptotic execution cascade. Therefore, by inhibiting these factors, apoptosis can be effectively inhibited.
  • Apoptosis is presumed to be responsible for various disease states Have been. For example, fulminant hepatitis is caused by hepatocyte apoptosis. Therefore, inhibitors of apoptosis-related factors are useful for treating these conditions.
  • Apoptosis is a phenomenon that occurs as a result of the collective action of complex cellular regulatory mechanisms.
  • the causes of apoptosis that cause disease are diverse. Therefore, in the future, efforts will be required to determine what is causing apoptosis and to select drugs that act directly on the cause to increase the therapeutic effect. Since the target factor is clear, it is possible to carry out an effective treatment after identifying such a target factor.
  • the apoptosis-related factor inhibitor of the present invention is not only useful as an apoptosis inhibitor, but is also expected to have new utility by clarifying its mechanism of action. That is, for example, the inflammatory site force-in (IL-12, IFN- ⁇ , and TNF-H) in the present invention is an apoptosis-related factor and also plays an important role in various inflammatory conditions. I have. Therefore, the inflammatory site force production inhibitor of the present invention can also be used for alleviating inflammatory symptoms associated with these cytokines. In addition, since PMP has an action of inducing tissue necrosis, for example, by consuming NAD, an inhibitor of PMP may be used as a necrosis inhibitor.
  • nicotinic acid-related compounds have an activity of enhancing the production of an anti-inflammatory cytokine, IL-10. This further enhances the significance of controlling inflammatory symptoms using nicotinic acid-related compounds. Therefore, these drugs include anti-inflammatory drugs, therapeutic drugs for immunological disorders, Abdominal cavity inflammation (peritonitis etc.), rheumatoid arthritis, arthritis, Crohn's disease, cancer cachexia, diabetic retinopathy, psoriasis, ischemic disease, It is also useful as a drug for prevention and treatment of Alzheimer's and the like.
  • the target factor of the inhibitor of the production of inflammatory cytokines, the promoter of the production of anti-inflammatory cytokines, or the inhibitor of apoptosis according to the present invention is clear. Therefore, it provides a more rational and effective treatment or prevention for apoptosis-related diseases.

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Description

明細書 炎症性サイ トカインの産生抑制剤 技術分野
本発明は、 炎症性サイ ト力インの産生抑制剤、 インターロイキン 1 0の産生亢 進剤、 ポリ- ADP-リボース—ポリメラーゼの阻害剤、 あるいはアポト一シス阻害 剤に関する。
免疫機構や造血機構において、 これらの機構をまえる細胞の間の情報伝達を担' う液性因子をサイ トカインと呼んでいる。 炎症性サイ トカインとは、 サイ トカイ ンのうち、 特に炎症症状をもたらすことが明らかにされているものの総称である c たとえばインターロイキン （以下 ILと省略する） -12、 IL- 18、 イン夕一フエ口 ン （以下 IFNと省略する） -ァ、 腫瘍壊死因子 （以下 TNFと省略する） -ひなどは、 炎症症状と密接に関連する炎症性サイ トカインである。 IL- 12は主に単球ゃマク 口ファージで、 IL- 18は主にマクロファ一ジゃクヅパ一細胞で、 また IFN-ァは主 に T細胞や N K細胞で産生される炎症性のサイ トカインである。 この他にも IFN -ひ、 IFN- ?ヽ TNF-^ s IL-Ι α, IL- 1 ?、 IL- 5、 IL- 6、 あるいは IL- 10等が炎症 性サイ トカインとして知られている。 これらの炎症性サイ トカインの産生の抑制 は、 炎症症状のコントロールを達成するための重要な手段と考えられている。 たとえば、 ベンズアミ ドゃニコチン酸アミ ド等の化合物が持つ TNF-ひ産生抑 制作用を利用して炎症症状の治療が可能となることが報告されている （W097/325 82) 。 特にこれらの化合物のうちの一部のものには、 アポト一シス誘導活性が確 認された。 アポトーシス誘導活性によって、 アポトーシスの誘導を通じた炎症症 状の制御も可能とされている。 この報告は、 具体的には、 全身性エリテマトーデ ス （以下 SLEと省略する） 、 リウマチ性関節炎、 喘息、 敗血症、 潰瘍性大腸炎、 乾癬、 あるいは虚血性障害等の疾患の治療にニコチン酸アミ ドを応用できるとし ている。 この他、 3, 4, 2-フエニルスルホンアミ ド化合物類 （W096/36595) や、 N- 置換ニコチンアミ ド類 （特開平 9- 291032) にも、 TNF-ひの産生抑制作用を持つ 物質が報告されている。 また、 ニコチン酸には、 ハムスターの肺繊維症モデルに おいて治療効果が観察されたことが報告されている （Q. Wang et al.， J. Bioch em. Toxicology, 1990, Vol .5, No. l, pl3-22. , Niacin Attenuates Bleomycin- Induced Lung Fibrosis in the Hamster. ) 。 しかし、 急性炎症についての有効 性は未知である。
炎症性サイ トカインは、 Fas、 および Fas リガンド （以下、 Fas- Lと省略す る） の産生を刺激し、 その結果としてアポトーシスを誘導する。 実際に TNF-ひ はアポトーシス誘導因子に位置付けられている。 したがって、 炎症性サイ トカイ ンの産生抑制は、 アポト一シスの抑制につながる可能性もある。 このように、 炎 症サイ トカインの産生抑制は、 炎症症状やアポト一シスに関連する多くの疾患の 病態制御において、 有用と考えられている。
アポト一シスは、 カスパーゼの活性化によってもたらされる細胞死である。 発 生やホメォス夕シスの過程で認められるプログラム細胞死だけでなく、 多くの疾 患にアポト一シスの関与していることが知られている。 たとえば癌は、 異常をき たした細胞のアポトーシス誘導機構が破綻した結果として生じた状態であると説 明することができる。 逆にアポトーシスの病的な亢進は、 組織の萎縮をもたらす。 アポトーシスの起きる仕組みが明らかになるにつれて、 様々な疾患とアポトー シスの関連性が疑われるようになった。 そして、 アポトーシスの制御によって、 これらの疾患の治療や予防が可能となることが推測されている。 たとえば、，肝炎 症状や移植片対宿主病 （GVHD) では、 パ一フォリンや Fas- Lの病態への関与が示 唆されている。 すなわち、 Fasと Fas- Lとの結合の阻害が、 炎症状の軽減につ ながるという報告がある。 また GVHDモデル動物の生存率が、 抗 Fas- L抗体の投 与によって改善された （実験医学 vol .17, No.13, pp.1635-1641, 1999) 。
このように、 アポトーシスに関与する因子の働きを阻害し、 アポト一シスを制 御することができる化合物が提供されれば、 アポトーシスの関与が疑われる疾患 の新しい治療剤として有用である。 アポトーシスを誘導する様々な因子が単離さ れ、 その全容は少しづつ明らかにされつつあると言って良い。 たとえば細胞障害 性リンパ球は細胞外から標的細胞のアポト一シスを誘導する。 このとき作用する サイ ト力インが、 Fas- Lである。 これらの因子を効果的にブロックすることがで きれば、 アポト一シスの制御が実現する。 しかしながら、 アポトーシス関連因子 を作用点とする医薬品の候補化合物は多くは報告されていない。
一方、 肺や動脈硬ィ匕巣などにおける線維化に対して 5-メチル -卜フエニル- 2- (1H)-ピリ ドンが治療効果を示すことが知られている （特公平 5-52814) 。 以下 に示す構造から、 この化合物もニコチン酸関連化合物と言える。 5-メチル -卜フ ェニル -2- ( 1H)-ピリ ドンは、 一般名を 「ピルフエ二ドン」 （pirfenidone)と名付 けられた。 またその誘導体についても、 同様の作用が報告されている （特表平 8 -510251) 。 下記式で示される化合物であるピルフエ二ドンは、 古くは呼吸器や 皮膚における炎症症状の治療に有用な化合物として報告された （USP3974281、 US P4042699 USP4052509) 。 その後、 抗線維化作用に着目され、 肺線維症を適用と する医薬品として開発途上にある化合物である （Nicod, LP. Lancet, Vol.354, July 24, 1999， p268 - 269) 。
ピルフエ二ドン
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ピルフエ二ドンによる抗線維化作用については、 これまでに以下のような知見 が得られている。 •線維化を亢進するサイトカインの作用を抑制 （Lurton JM et al .， Am J Respi r Crit Care Med. 153 :A403.1996)、
•シクロフォスフアミドにより誘導されるマウス肺の線維化を低減する作用や、 ブレオマイシンによるハムスターの肺変化を抑制 （Kehrer and Margolin ( 199
7) Toxicol. Lett. 90 125; Schelegle et al (.1997) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 216 392)、 .
•コラーゲンの過剰産生を抑制 ( Iyer et al ( 1999) J. Pharmacol . Exp. Ther. 2
89 211)、
•腫瘍壊死因子ひ （TNF-ひ） の合成および放出を抑制 （特表平 11- 512699)、 このような作用を基に、 現在、 ピルフエ二ドンは肺線維症、 硬化性腹膜炎、 強 皮症、 子宮平滑筋腫の治療薬として開発が進められている。
TNF- αは、 アポトーシス誘導因子に位置付けられる。 また肝炎による肝組織障 害に果たす TNF-ひの役割が重要であることも示唆されている（Guidotti L.，et a 1. , Immunity, 4:25-36, 1996, Kondo T. , et al . , Nature Med. , 3 :409-413, 1997, S eino K. , et al . , Gastroenterology, 113： 1315-1322, 1997)0 更に本発明者らは、 ピルフエ二ドンに、 炎症性サイ ト力インの産生抑制や、 アポトーシスの阻害剤と しての用途を見出し特許出願した （特願 2000-38048) 。 しかし、 これらの報告 の他に炎症性サイトカインの産生抑制や、 アポトーシスの阻害剤として利用する ことができるニコチン酸関連化合物は報告されていない。 発明の開示
本発明は、 新規な炎症性サイトカイン産生抑制剤、 インターロイキン 10の産 生亢進剤、 ポリ - ADP-リボース—ポリメラ一ゼの阻害剤、 あるいはアポト一シス 阻害剤の提供を課題とする。
本発明者らは、 人為的に起こした炎症状態に対して、 ニコチン酸関連化合物を 投与し、 その影響を詳細に解析することにより、 ニコチン酸関連化合物の作用機 構をより詳細に解析することができると考えた。 人為的な炎症のモデルとしては、 細菌性のリポ多糖 （以下 LPSと省略する） によって誘導される、 マウス肝の急性 肝炎モデルを選択した。 このモデルは、 激しい肝炎症状が急激に表れることから、 急性肝炎のモデルとして有用である。
このような解析を通じ、 本発明者らは、 ニコチン酸関連化合物に、 LPS誘導肝 炎の治療効果や予防効果を確認した。 更に本発明者らは、 このような効果をもた らしているニコチン酸関連化合物の作用機構を探索し、 その抗炎症作用、 ポリ- A DP-リボース—ポリメラ一ゼの阻害作用、 抗炎症性サイ トカインの産生促進作用、 あるいは抗アポトーシス作用を見出し、 本発明を完成した。 更に本発明者らは、 これらの作用を見出したニコチン酸関連化合物がいずれも生体内に存在している 事実に着目した。 そしてその量を上昇させる活性を指標として抗炎症作用を評価 できることを明らかにし、 抗炎症剤として有用な化合物のスクリ一ニング方法を 確立した。
すなわち本発明は、 以下の炎症性サイ ト力イン産生抑制剤、 インターロイキン 10の産生亢進剤、 ポリ -ADP-リボース一ポリメラ一ゼの阻害剤、 あるいはアポト —シスの阻害剤、 並びにそれらの用途に関する。
〔1〕 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 および卜メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物、 また はその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 ィン夕一ロイキン 12およ び/またはインターフェロンァの産生抑制剤。
〔2〕 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 またはその製薬上許容される塩 を主成分として含有する、 腫瘍壊死因子ひ産生抑制剤。
〔3〕 ニコチンアミ ドまたはその製薬上許容される塩、 およびトリブトファンま たはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 腫瘍壊死因子 α産生抑制 剤。
〔4〕 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 1-メチル -2 -ピリ ドン、 およびトリブトファンからなる群から選択されるいずれ かの化合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 インター ロイキン 1 0の産生亢進剤。
〔5〕 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 および卜メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物、 また はその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 アポト一シスの阻害剤。
〔6〕 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 または卜メチル- 2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物、 また はその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 肝炎の予防剤または治療剤
〔7〕 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 および卜メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物、 また はその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 ポリ - ADP-リボースーポリ メラーゼの阻害剤。
〔 8〕 〔 7〕 に記載のポリ - ADP-リボースーポリメラーゼの阻害剤を主成分とし て含有する、 ネクロ一シスに起因する疾患の予防剤または治療剤。
〔9〕·疾患が急性肝炎である 〔8〕 に記載の予防剤または治療剤。
〔1 0〕 肝炎が劇症肝炎である 〔8〕 に記載の予防剤または治療剤。
〔1 1〕 次の工程を含む、 抗炎症剤として有用な化合物のスクリーニング方法。 a ) 被検動物に候補化合物を投与する工程
b ) 被検動物の組織、 および/または生体液中に含まれるニコチン酸、 ニコチン アミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 および卜メチル -2-ピリ ドン からなる群から選択されるいずれかの化合物を測定する工程、 及び
c ) 対照と比較して b ) の測定値を高める候補化合物を選択する工程
〔1 2〕 〔1 1〕 に記載の方法によって得ることができる化合物を主成分として 含む、 抗炎症剤。
本発明において有効成分として利用される化合物はいずれも公知のニコチン酸 関連化合物である。 これらの化合物の構造を以下に示す c
Figure imgf000009_0001
卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド メチル -2-ピリ ドン
Figure imgf000009_0002
トリブトファン；
Figure imgf000009_0003
〔1〕 ィン夕一ロイキン 12および/またはィン夕一フエロンァの産生抑制剤 本発明は、 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサ ミ ド、 および卜メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 インターロイキン 12 および/またはィンターフェロンァの産生抑制剤に関する。
本発明において、 「製薬上許容される塩」 という場合には、 その水和物も包含 される。 例えば、 アルカリ金属 （リチウム、 ナトリウム、 カリウム等） 、 アル力 リ土類金属 （マグネシウム、 カルシウム等）、 アンモニゥム、 有機塩基およびァ ミノ酸との塩、 または無機酸 （塩酸、 臭化水素酸、 リン酸、 硫酸等） 、 および有 機酸 （酢酸、 クェン酸、 マレイン酸、 フマル酸、 ベンゼンスルホン酸、 P-トルェ ンスルホン酸等） との塩が挙げられる。 これらの塩は、 通常行われる方法によつ て形成させることができる。 水和物を形成する時は、 任意の数の水分子を配位し ていてもよい。
あるいは本発明は、 有効量の前記化合物を投与する工程を含む、 インターロイ キン 12および/またはィン夕一フエロン" の産生抑制方法に関する。 更に本発 明は、 前記化合物のィン夕一ロイキン 12および/またはィンターフェロンァの 産生抑制剤の製造における使用に関する。
哺乳動物が LPSの投与によって激しい急性炎症症状を生じることは周知である c 哺乳動物の腹腔に LPSを投与すると、 まず TNF-ひの産生が起きる。 TNF- は IL- 12や IL- 18の産生をもたらし、 更にこの 2つのサイ トカインが IFN-ァ産生を誘 導する。 IFN-ァは Fasと Fas-Lを誘導する結果、 肝臓で急激な肝細胞アポトーシ スが誘導され、 アポト一シスを伴った欝血性壊死により肝不全に陥る（Tsutsui, H. , et al. 1997. IL-18 Accounts for Both TNF -ひ - and Fas Ligand- mediated Hepatotoxic Pathways in Endotoxin- Induced Liver Injury in Mice. J. I腿 u nol. 159:3961. ) o このサイ ト力インの一連の流れは、 同じく急性炎症で上昇す ることが知られている IL- 1、 IL- 6、 IL- 8、 GM-CSFなどの上昇よりも重要である ことが報告されている（Ozman, L.， et al . 1994. Interleukin 12 ， interferon 7 , and tumor necrosis factor are the key cyto ines of the generated Sh arzman reaction. J. Exp. Med. 180: 907, Wysocka, Mリ et al. 1995. Int erleukin 12 is required for interferon r production and lethality in lip opolysaccharide-induced shock in mice. Eur. J. Immunol. 25 : 67 )0
先に述べたようにいくつかのニコチン酸関連化合物には既に TNF-ひの産生抑 制作用が報告されている。 また抗ナイァシン化合物の投与により、 TNF-ひの産生 が亢進することは、 後に述べる実施例 1や実施例 7にも示すとおりである。 これ は、 抗ナイァシン化合物によって内因性ナイァシンが競合的阻害を受け、 TNF -ひ の産生が亢進したためと説明することができる。 実際、 抗ナイァシン化合物が内 因性ナイァシンに対して競合的阻害を起こすことにより、 ナイァシン欠乏症と同 様の症状を示すことが古くから知られている。 本発明者らは特定のニコチン酸関 連化合物が TNF-ひのみならず、 IL- 12や IFN- yに対してもその産生抑制作用を 持つことを明らかにした。
さて、 ここで説明したサイ ト力インの一連の流れにおいては、 T - が最も上 流に位置することに注意しなければならない。 つまり、 ニコチン酸関連ィ匕合物の 炎症性サイ トカイン抑制作用は、 TNF-ひの産生抑制の結果として表れている可能 性がある。 しかし本発明者らの知見によれば、 ニコチン酸関連化合物による炎症 性サイ トカインの産生抑制作用は、 間接的なものではない。 例えば、 LPS投与に よる TNF-ひ産生のピークは LPS投与後 1.25時間であり、 3時間後には血中から 検出されなくなるにも関わらず、 ニコチン酸関連化合物は LPS投与マウスの致死 防御に関して、 血中 TNF-ひ産生が過ぎてしまつてから投与しても （例えば LPS 投与後 3時間後） 、 致死を防御できる。
また、 ニコチン酸関連化合物は、 LPS投与 3時間後に投与してもアポトーシス を抑制する （実施例 1 3 ) 。 このようにニコチン酸関連化合物は、 TNF -ひが放出 された後でも急性炎症性ショックを抑制できるという特徴を有している。 さらに、 ニコチン酸関連化合物は、 LPS投与後 3時間が経過した後でも、 ポリ- ADP-リボ シル化、 および NAD量の低下を抑制する （実施例 1 3 ) 。 ニコチン酸関連化合物 によるこれらの効果は、 抗 TNF-ひ抗体などによる防御が、 TNF-ひが大量に血中 に放出された後に自動的に進む反応を抑えることができないのとは対照的である。 以上のことから、 ニコチン酸関連化合物によるこれらの作用は、 単に TNF-ひの 作用を抑制する結果として表われているものではないことは明らかである。
本発明の炎症性サイ トカイン産生抑制剤により産生を抑制されるサイ トカイン は、 いずれも Tヘルパー 1タイプのサイ ト力インである。 したがって、 本発明の 炎症性サイ トカイン産生抑制剤は、 Tヘルパー 1タイプのサイ トカイン産生の亢 進が原因となっている疾患であって、 特に IL-12、 および IFN-ァの産生の亢進を 原因とするものに有効である。 Tヘルパー 1タイプのサイ ト力インとは、 炎症性 サイトカインのうち、 Tヘルパー 1タイプの免疫応答の誘導に関与するサイ トカ イン群の総称である。 Tヘルパー 1タイプのサイ ト力インには、 Tヘルパー 1細 胞の分化を誘導するサイ トカインおよび Tヘルパー 1細胞が産生するサイ トカイ ンが含まれる。 Tヘルパー 1細胞の分化を誘導するサイ ト力インとしては、 具体 的には、 IL- 12等が含まれる。 これらのサイ ト力インは、 Tヘルパー 1タイプの 免疫応答の誘導に関与している （Xu, B. et al. J. Exp. Med. , 188: 1485, 199 8、 および Takeda, K. et al. Immunity. , 8: 383-390, 1998) 。 また、 Tヘルパ —1細胞が産生するサイ ト力インとしては、 具体的には、 IFN-ァ等が含まれる
(臨床免疫， 第 30卷， 第 11号， pl471-1478, 1998) 。
Tヘルパー 1 /Tヘルパー 2バランスの不均衡は、 免疫病発症の一因になると 考えられている。 Tヘルパー 1型免疫に偏った場合には、 細胞性免疫が増強され 癌や感染症に対する免疫応答は高まる半面、 同時に自己傷害性も高まり免疫病発 症の原因の一つとなる。 したがって本発明による炎症性サイ トカインの産生抑制 剤は、 たとえば Tヘルパー 1タイプの免疫応答の過剰が原因で起こると言われて いるすべての疾患に対して有効性が期待できる。 一般に臓器特異的自己免疫疾患 は、 Tヘルパー 1タイプの免疫応答への偏りが原因とする考え方がある。 具体的 には、 糖尿病、 肝障害、 自己免疫性脊髄炎、 潰瘍性大腸炎、 移植片対宿主病 （GV HD) 、 関節炎、 甲状腺炎、 橋本病、 外分泌腺炎、 細胞内感染症 （リューシュマ二 ァ、 結核菌、 ライ菌） 、 遅延型過敏症、 強皮症、 あるいはベーチエツト病等を示 すことができる。 本発明の炎症性サイ トカイン産生抑制剤は、 これらの疾患の予 防や治療に利用することができる。
上記疾患の中でも以下に示すような疾患は、 その病因が単に TNF- αだけに起 因するものではないと考えられており、 TNF-ひ産生抑制剤の適応症としては考え にくい。 すなわち、 糖尿病、 肝障害、 自己免疫性脊髄炎、 移植片対宿主病 （GVH D) 、 関節炎、 甲状腺炎、 橋本病、 外分泌腺炎、 細胞内感染症 （リューシュマ二 ァ、 結核菌、 ライ菌） 、 遅延型過敏症、 あるいはベーチェット病等は、 本発明に よる炎症性サイ トカイン産生抑制剤に特有の新規適応疾患といえる。
また本発明は、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドまたはその製薬上許容 される塩を主成分として含有する、 TNF-ひの産生抑制剤に関する。 あるいは本発 明は、 ニコチンアミ ドまたはその製薬上許容される塩とトリブトファンまたはそ の製薬上許容される塩を主成分として含有する、 TNF-ひの産生抑制剤に関する。 あるいは本発明は、 有効量の前記化合物を投与する工程を含む、 TNF-ひの産生 抑制方法に関する。 更に本発明は、 前記化合物の TNF- の産生抑制剤の製造に おける使用に関する。
ベンズアミド類とニコチンアミ ドのアポトーシス誘導活性と TNF-産生阻害作 用が公知である （W097/32582) 。 また N-置換ニコチンアミ ド投与によって、 ホ スホジエステラーゼ IVおよび TNF-ひ産生を阻害し、 TNF-ひが関係する慢性炎症 性疾患の治療に有効であることが報告されている （特開平 9-291032号公報） 。 あるいは、 in 7 iroではニコチンアミドが LPS刺激したヒト末梢血モノサイ ト における TNF- a産生を抑制し、 そして in 'TOでは LPSを投与したマウスにお ける TNF-ひの産生抑制を示した（I讓 nol. Lett.1997 59/1, 7-11)。 また、 ニコ チンアミ ドがス一パ一抗原である SEB投与マウスで防御効果を示すとされている。 この報告においては、 IL- 1ひ、 TNF-ひ、 IL- 2R、 IL- 2、 および IFN- yの産生抑制 が確かめられている（Toxicology, 1996, 107/1, 69-81)。 この他に、 IL-1 5刺激 マウス脾臓/?細胞の TNF-ひ産生抑制について、 ニコチンアミ ドの作用をステロ ィ ド、 FK506、 およびサイクロスポリンの作用を比較した報告がある（Life Sci . , 1996， 59/17, 1423-1429)。
しかし、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドの TNF-ひ産生抑制作用につ いては報告が無い。 またニコチンアミ ドとトリブトファンの組み合わせによって、 TNF-ひの産生抑制が達成される事実も未知である。 先に述べたように、 TNF-ひは 炎症性サイ トカインによる情報伝達系において最も上流に位置する。 したがって、 その産生を抑制する化合物は炎症症状のコントロールにおいて重要である。 TNF- ひの産生抑制剤は、 炎症性サイ トカインの作用によってもたらされる前述のよう な疾患の治療に有用である。 なお本発明においては、 インターロイキン 1 2、 ィ ンターフェロンァ、 あるいは TNF-ひの産生抑制剤を、 単に炎症性サイ ト力イン 産生抑制剤と称する場合がある。
〔2〕 PMPの阻害剤
次に本発明は、 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボ キサミ ド、 および 1-メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化 合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 ポリ- ADP-リボ ース一ポリメラーゼ （poly- ADP-ribose- polymerase、 以下 PMPと省略する） の 阻害剤に関する。
あるいは本発明は、 有効量の前記化合物を投与する工程を含む、 PARPの阻害 方法に関する。 更に本発明は、 前記化合物の PMPの阻害剤の製造における使用 に関する。
PARPは、 傷害を受けた DNA鎖近傍の蛋白 （ヒストン、 PARP自身など） をポリ- ADP-リボシル化する反応を触媒する酵素である。 この酵素活性は切断された DNA に依存し、 アポトーシス時にカスパーゼ 3の切断 （116KDから 85KDへ） を受け て活性化されるという性質を有する。 PMPの基質は、 NADとポリ- ADP-リボシル 化のための受容体側の蛋白である。 この酵素の役割としては、 ポリ -ADP-リボシ ル化によって大量の細胞内 NADを消費することも重要視されている。 すなわち、 細胞や組織の NADと ATPを急激に減少させることによって細胞や組織のアポトー シスゃネクロ一シスを促進すると考えられている（Ha， H. C. and Snyder, S. H. Proc . Natl . Acad. Sci . Vol . 96, No.24, 13978 - 13982， 1999)。
したがって、 PMPの酵素阻害によって、 関節炎、 I型糖尿病、 各種神経細胞 死に由来する疾患 （脳虚血 .再灌流、 アルツハイマー、 パーキンソン病など） 、 レトロウイルス感染等の治療効果を期待できる。 また本発明の PARP阻害剤は、 ネクロ一シスを伴う疾患の治療剤または予防剤として有用である。 中でも急激な アポトーシスが原因で起きるネクローシスに起因する疾患には、 特に有効である このような疾患としては、 急性肝炎を挙げることができる。
すなわち本発明は、 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-力 ルポキサミ ド、 または メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれか の化合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 肝炎の予防 剤または治療剤に関する。 あるいは本発明は、 有効量の前記化合物を投与するェ 程を含む肝炎の治療方法または予防方法に関する。 また本発明は、 前記化合物の 肝炎の予防剤または治療剤の製造における使用に関する。 前記化合物は、 特に急 性肝炎や劇症肝炎の予防や治療に有用である。
〔3〕 アポトーシスの阻害剤
更に本発明は、 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボ キサミ ド、 および 1-メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化 合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 アポト一シスの 阻害剤に関する。
あるいは本発明は、 有効量の前記化合物を投与する工程を含む、 アポトーシス の阻害方法に関する。 更に本発明は、 前記化合物のアポトーシスの阻害剤の製造 における使用に関する。
ニコチン酸関連化合物が、 実施例に示すように、 アポトーシス阻害作用を持つ ことは新規な知見である。 特に LPS腹膜投与によって人為的に引き起こされた急 性肝炎症状において、 LPS投与後のニコチン酸関連化合物投与が治療的効果を示 すことに注目すべきである。 公知の抗アポト一シス活性化合物の多くは、 アポト —シスを生じる前に予防的に投与しておかなければ十分なアポトーシス阻害効果 を期待できない。 すなわち、 予防剤としては有効であっても治療剤としての有効 性は期待できないものであった。 これに対して本発明によるアポトーシス阻害剤 は、 進行しつつあるアポトーシスを阻害することができる。 すなわち、 治療的な 効果を期待することができるのである。 アポト一シスに対してこのような作用機 構を持つニコチン酸関連化合物は、 たとえば、 急性肝炎で起こる肝臓の内出血性 壊死 （急激な病的アポトーシスを伴う） や、 移植後慢性拒絶などに対する予防剤 であるとともに、 治療剤として発症後の投与に適する。 したがって本発明のアポ トーシス阻害剤は、 進行しつつあるアポトーシスを治療することを目的として用 いる医薬に関する。
アポトーシスが関与するそれ以外の適応疾患としては、 例えば、 糸球体腎炎、 急性肺傷害、 間質性肺炎、 心肥大、 心筋症、 網膜剥離、 自己免疫疾患、 心筋梗塞 虚血、 糖尿病、 炎症性腸疾患、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 全身性エリテ マト一デス、 乾せん、 AIDS、 汎血球減少症、 不応性貧血、 再生不良性貧血、 ウイ ルス性肝炎、 劇症肝炎、 肝硬変、 脳虚血、 脳梗塞、 シ ーダレン症候群、 唾液腺 炎、 激症型骨髄腫、 動脈硬化、 ペーチエツト病、 多発性硬化症、 緑内障、 白内障、 パーキンソン病、 アルツハイマー、 筋萎縮性側索硬化症、 放射線傷害、 敗血症な どが挙げられる。
ニコチン酸関連化合物が、 アポトーシス関連因子である、 IL-12、 IFN-ァ、 P P、 あるいは TNF-ひの産生阻害に有効であることは既に述べた。 これらのアポト —シス関連因子は、 いずれも以下に述べるような機構に基づいてアポトーシスに 密接に関連することから、 ニコチン酸関連化合物は、 アポトーシスの阻害剤とし て有用である。
1 ) IL-12/IFN-ァ産生抑制と抗アポトーシス
実施例において ώ F W LPS投与マウスの実験で示されている通り、 ニコチン 酸関連化合物による上記炎症性サイ トカインの産生抑制は Fas、 Fas- Lの産生を 抑えることに繋がると考えられる。 その結果として、 肝細胞のアポト一シスが効 果的に抑制される。
2 ) 抗 PARPと抗アポトーシス
—般にアポトーシスは、 炎症を伴わないきれいな細胞死と言われている。 ただ し、 LPS腹腔投与による肝炎のような病的なアポト一シスの場合は、 肝組織には 急激なアポト一シスに伴って広汎にネクロ一シスを生じることが報告されている この現象は、 実施例における病理所見でも観察されている。 その原因のひとつと して考えられているのが、 組織における NADの急激な減少である。 アポトーシス を起こした細胞では PMPによる ADP-リボシル化反応が急速に進み NADを大量に 消費することは先に述べた。 したがって、 急激なアポトーシスは、 組織における NADの大量消費を伴う。 ネクロ一シスは、 NADの減少に伴って組織内の ATPが減 少し、 組織の代謝回転が不全状態に陥ることによってもたらされると説明するこ とができる（Ha, H. C. and Snyder, S. H. Proc . Natl . Acad. Sci . Vol .96, No. 24, 13978-13982, 1999 )。
ニコチン酸関連化合物は、 PMP活性の阻害を通じてネクロ一シスの原因とな る NADの消費を抑制すると考えられる。 したがって、 ニコチン酸関連化合物は、 PMP阻害作用を通じて、 急性肝炎で起こる肝臓の内出血性壊死 （急激な病的ァ ポト一シスを伴う） の抑制に薬効的に貢献するものといえる。 .
以上に述べたように、 ニコチン酸関連化合物のアポトーシス阻害作用の作用点 を明らかにしたところに、 本発明の大きな意義がある。 アポトーシスは、 物理的 な作用をはじめとするさまざまな機構によって開始する複雑なシステムである。 したがって、 同じアポトーシスによってもたらされる疾患であっても、 その原因 は多様であることは言うまでも無い。 そのため、 ある疾患に有効であるアポト一 シス阻害剤が、 他のアポトーシス原因疾患に対しても同様の効果を示すとは限ら ない。 アポトーシス阻害剤を有効に治療や予防に生かすには、 その作用点を明ら かにした上で、 アポト一シスの原因に作用点を持つアポトーシス阻害剤を選択す るのが合理的である。 このような理由により、 ニコチン酸関連化合物の阻害作用 がどのアポト一シス関連因子に作用しているのかを見出した本発明の有用性は明 らかである。
「アポトーシス阻害剤」 は、 以下に示す疾患を含有するアポトーシスを起因と する疾患の治療または予防に有効である。 従って、 これらの疾患のための治療剤、 または予防剤として利用することができる。
劇症肝炎、 C型及び B型ウィルス性肝炎、 原発性胆汁性肝硬変、 続発性肝硬変 糸球体腎炎、 尿細管 ·間質性腎炎、 巣状糸球体硬化症、 腎硬化症、 腹膜硬化症、 ネフローゼ症候群、 糖尿病性腎症
急性肺傷害、 間質性肺炎、 放射線肺障害
急性および慢性の移植片対宿主病 ( GVHD )、 手術後癒着
拡張性心筋症、 PTCA後の再狭窄
潰瘍性大腸炎、 クローン病
後天性免疫不全症候群 (AIDS)
慢性関節リウマチ
全身性エリテマトーデス、 ベーチェット病、 シヱーグレン症候群、 皮膚筋炎、 サ ルコィドーシス、 重症筋無力症、 筋萎縮性側索硬化症、 筋ジスドロフィ一、 SLE パーキンソン病、 アルヅハイマー病、 多発性硬化症、 ハンチントン病
再生不良性貧血、 敗血症
熱症、 ケロイ ド ·肥厚性瘢痕、 乾癬
網膜剥離
特に、 本発明では、 標的因子を明らかにしたことによって、 次のような疾患を 新たに適応症として挙げることができる。 すなわち、 肝炎 （劇症、 慢性、 アルコ ール性、 C型及び B型ウィルス性肝炎も含む） 、 毒物性あるいは代謝性肝障害、 ベーチェット病、 再生不良性貧血、 AIDS、 汎血球減少症、 不応性貧血、 脳梗塞、 緑内障、 白内障、 唾液腺炎、 放射性障害、 紫外線傷害、 日光皮膚炎、 多形紅斑、 固定薬疹、 GVHD, TEN, 偏平疣贅、 単純ヘルぺス、 エリテマトーデス、 苔癬化組 織反応、 尿細管傷害、 呼吸器感染症、 糖尿病、 動脈硬化症、 脳虚血、 心筋梗塞、 拡張型および肥大型心筋症、 円形脱毛症、 あるいは薬剤性脱毛症は、 本発明にお いて明らかにされた抗アポト一シス剤の新たな適応症である。 中でも、 劇症肝炎 と続発性肝硬変については、 本発明のアポトーシス阻害剤の投与によって発症後 の治療が可能なことから、 公知の薬剤では期待できない高度な治療効果を達成す るものである。
更に本発明は、 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボ キサミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン、 およびトリブトファンで構成される群から選 択されるいずれかの化合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有 する、 IL- 10の産生亢進剤に関する。 また本発明は、 有効量の前記化合物を投与 する工程を含む、 IL- 10の産生の促進方法に関する。 加えて本発明は、 前記化合 物の IL-10の産生亢進剤の製造における使用に関する。
本発明者らは、 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボ キサミ ド、 トリブトファン、 メチル -2-ピリ ドンが、 LPS投与マウスの IL -； 10 産生を更に亢進させる作用を有することを明らかにした。 抗炎症性の薬剤が強い 抗炎症作用を発揮するためには、 炎症性サイ ト力インである TNF-ひの産生抑制 のみならず、 抗炎症性サイ トカインである IL-10の産生亢進作用を有することが、 極めて有効であることが論じられている。 すなわち前記ニコチン酸関連化合物は、 いずれも炎症性サイ トカインの産生作用や PARPの阻害作用に加え、 抗炎症性サ ィ トカインである IL- 10の産生促進作用をも併せ持った、 抗炎症性の薬剤として は理想的な化合物であると言って良い。 中でも、 卜メチル -2-ピリ ドンの IL - 10 産生亢進作用は強かった。 本発明による IL-10の産生亢進剤は、 たとえば以下に 示す疾患の治療、 または予防に有用である。
多発性硬化症 （TH1依存性自己免疫疾患） 、 強皮症、 インスリン依存型糖尿病、 炎症性腸疾患、 クローン病、 敗血症、 敗血症性ショック、 C型肝炎、 重症穿孔性 腹 S莫炎、 変形性関節炎、 慢性関節リウマチ
本発明の炎症性サイ ト力イン産生抑制剤、 PMPの阻害剤、 アポトーシスの阻 害剤、 あるいは IL- 1.0の産生亢進剤を、 上記の疾患の治療あるいは予防を目的と してヒトに投与する場合は、 散剤、 顆粒剤、 錠剤、 カプセル剤、 丸剤、 液剤等と して経口的に、 または注射剤、 坐剤、 経皮吸収剤、 吸入剤等として非経口的に投 与することができる。 また、 軟膏剤およびクリーム製剤として外用に用いること ができる。 本化合物の有効量にその剤型に適した賦形剤、 結合剤、 湿潤剤、 崩壊 剤、 滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、 医薬製剤とすることができ る。 注射剤の場合には、 適当な担体と共に滅菌処理を行って製剤とする。 投与量 は疾患の状態、 投与ルート、 患者の年齢、 または体重によっても異なり、 最終的 には医師の判断に委ねられるが、 成人に経口で投与する場合、 通常 10〜40ι^/1 g/日を投与することができる。 これを 1回あるいは数回に分割して投与すれば よい。
さて、 本発明において炎症性サイ ト力インの産生抑制作用、 アポトーシスの阻 害作用、 あるいは IL-10の産生亢進作用を明らかにしたニコチン酸関連化合物は、 いずれも生体中に見出される化合物である。 ニコチン酸関連化合物の生合成系と して、 NADサイクルが知られている。 すなわち、 L-トリブトファンからキヌレニ ンを合成されたキノリン酸が、 ニコチン酸モノヌクレオチドに変換される。 更に ニコチン酸アデニンヌクレオチド、 NAD (ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチ ド） 、 ニコチンアミ ド、 ニコチン酸を経て、 ニコチン酸モノヌクレオチドに戻る のが NADサイクルである。 NADサイクルにおいては、 以下のような生成物が生じ る。 これらの化合物は、 いずれも尿中等に見出されるニコチン酸の代謝物質であ る。 ，
NAD： NADP (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸） を生成
ニコチン酸： トリゴネリンを生成
ニコチンアミ ド ： 1-メチルニコチンアミ ドゃ 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキ サミ ドを生成
これらの化合物は、 生体内において、 急性炎症や慢性炎症に対する潜在的な治 療効果を持つ化合物と位置付けられる。 したがって、 生体中において、 これらの ニコチン酸関連化合物の生成を促進することができれば、 生体の炎症症状の治療 を実現できる。 このような考えかたに基づいて、 本発明者らは、 生体中において、 これらニコチン酸関連化合物の生成を誘導する作用を指標として、 抗炎症剤とし て有用な化合物を見出し得ることを明らかにした。 すなわち本発明は、 次の工程 を含む、 抗炎症剤として有用な化合物のスクリ一ニング方法に関する。
a ) 被検動物に候補化合物を投与する工程
b ) 被検動物の生体液中に含まれるニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル- 2 - ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 および 1-メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択 されるいずれかの化合物を測定する工程
以下に本発明に基づくスクリーニング方法について具体的に説明する。 まず本 発明のスクリーニングは、 ヒトと類似の代謝回路を持ち、 ニコチン酸関連化合物 の代 If過程において、 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-力 ルポキサミ ド、 あるいは 1-メチル -2-ピリ ドン等を生成する動物を被検動物とし て用いる。 たとえば、 マウスやラットなどが一般的な実験動物として挙げられる。 このほか、 ゥサギ、 ィヌ、 ブ夕、 ヒヅジ、 ャギ、 あるいはゥシなどを利用するこ ともできる。 これらの被検動物に候補化合物を与える。 候補化合物は、 その吸収 特性等に基づいて、 経口的に摂取させることもできるし、 非経口的に投与するこ ともできる。 非経口投与とは、 皮注射注や腹腔投与が含まれる。 通常は、 0.5% メチルセルロース水溶液を担体 (Vehicle)として候補化合物の懸濁液 （あるいは 水溶液） を作製し、 それを同用量ずつ動物に経口投与する。 候補化合物の投与量 は、 たとえば体重 l kgあたり、 一般的には 10〜： 1000mg、 通常 50〜500mgの範囲 で適宜設定することができる。 対照としては担体のみを投与する群を置く。
候補化合物を投与して飼育を継続した後、 目的とする組織を摘出し、 そのニコ チン酸関連化合物の含有量の変化を経時的に観察する。 あるいは候補化合物を継 続的に投与して、 その影響を観察することもできる。 目的とする組織とは、 候補 化合物による抗炎症作用を期待する組織を意味する。 具体的には、 肝臓、 肺、 お よび腎臓のような臓器の他、 血清や尿のような体液も、 前記ニコチン酸関連化合 物の測定対象として重要である。 個別の組織における変化をもたらす候補化合物 は、 各組織に特異的な抗炎症作用を持つ化合物として有用である。 一方体液中に おけるニコチン酸関連化合物の含有量の上昇をもたらす化合物には、 全身性の抗 炎症作用を期待できる。
候補化合物投与後のニコチン酸関連ィ匕合物の測定間隔は、 適宜設定することが できる。 たとえば、 急速な作用を期待する場合には、 投与直後から短い時間間隔 で測定を行う。 逆に、 長期的な作用を確認したい場合には、 長時間にわたって二 コチン酸関連化合物の値の変化を継続して観察する。
ニコチン酸関連化合物を測定すべき試料は、 冷凍保存することができる。 した がって、 経時的に採取した試料を凍結保存しておき、 採取を完了した後にニコチ ン酸関連ィ匕合物の測定を同時に行うことができる。
各種生体試料に含まれるニコチン酸関連化合物を測定する方法は公知である。 たとえば NAD含量は、 Nisselbaumの方、法 (Nisselbaum, JS.， and S. Green. A s im le ultramicro method for determination of pyridine nucleotide in tiss ues. Anal . Biochem. 27, 212-217, 1969)で定量することができる。 また、 その 他のニコチン酸関連化合物についても、 測定方法は公知である（T.A. Tyler R.R. S hrago J. Liq. Chromatgr. , 3,269, 1980、 北田善三、 井上雅成、 玉瀨喜久雄、 芋田真子、 蓮池秋一、 佐々木美智子、 谷川薫、 栄養と食糧、 35, 121, 1982、 K. ral， Presenilis A. Anal. Chemリ 314， 479， 1983)。
薬剤非投与のコント口一ル群マゥスの各臓器のそれぞれの二コチン酸関連化合 物濃度に比較して、 有意にニコチン酸関連化合物の濃度上昇が認められた候補化 合物を、 抗炎症作用を持つ化合物として選択する。 選択した候補化合物は、 その 抗炎症作用のレベルや安全性などについて評価する。 たとえば抗炎症作用のレべ ルは、 実施例に示す LPS感作マウスの急性炎症モデルにおける抗炎症作用の比較 によつて評価することができる。
本発明のスクリーニングの候補化合物には、 たとえば次のような化合物群を用 いることができる。 中でも、 NADサイクルに由来する化合物や、 ニコチン酸関連 化合物を合成的手法によつて修飾した化合物には、 ニコチン酸関連化合物の測定 値を上昇させることができる化合物が多く含まれる。
細胞抽出液、
遺伝子ライブラリ一の発現産物、
合成低分子化合物、
合成ぺプチド、
天然化合物
本発明のスクリ一ニング方法によって、 少量の投与によって大量のニコチン酸 投与と同様の抗炎症作用を示す化合物が取得できる可能性がある。 このようなィ匕 合物を抗炎症^の薬剤として用いれば、 ニコチン酸関連化合物の大量投与に換え ることも可能である。 ニコチン酸関連化合物の中には、 大量投与に伴って場合に より顔面紅潮や、 搔痒感等の軽微な副作用が起きることがある。 本発明のスクリ —二ングによって得ることができる化合物を用いれば、 このような副作用を避け ることが可能となる。 図面の簡単な説明
図 1は、 インビボ LPS投与マウスの血中 TNF- 産生に対する各種ニコチン酸 関連化合物の抑制効果を示す図である。 スチュ一デントの t検定により有意差を 検定した。 pく 0. 05 *、 pく 0.01 **、 pく 0.005 ***。
図 2は、 LPS投与マウスの血中 TNF- 、 M r および IL- 12 産生に対する ニコチン酸の抑制効果を示す図である。
図 3は、 LPSショックマウスの血清 TNF- αレベルに対するニコチン酸およびそ の誘導体の効果を示す図である。
図 4は、 LPS接種マウスの血中 TNF-ひ産生に対する卜メチル -2-ピリ ドン- 5- カルボキサミ ドの抑制効果を示す図である。 図 5は、 LPS接種マウスの血中 IL- 12産生に対する 1-メチル -2 -ピリ ドン- 5 -力 ルポキサミ ドの抑制効果を示す図である。 1M2P5Cと記載したカラムが卜メチル- 2 -ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドの結果を示している。
図 6は、 LPS接種マウスの血中 IFNァ産生に対する メチル -2-ピリ ドン- 5 -力 ルポキサミ ドの抑制効果を示す図である。 1M2P5Cと記載したカラムが 1-メチル- 2 -ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドの結果を示している。
図 7は、 LPS接種マウスの血中 TNF-ひ産生に対する 3-ピリジンスルホン酸の 効果を示す図である。
図 8は、 LPSショックモデルマウスの生存に及ぼすニコチンアミ ドの効果を示 す図である。
図 9は、 LPSショックモデルマウスの生存に及ぼすニコチンアミ ド、 およびト リブトファンの効果を示す図である。
図 1 0は、 LPSショックモデルマウスの生存に及ぼすニコチンアミ ドの後処理 効果を示す図である。 NMと記載したプロヅトがニコチンアミ ドの結果を示して いる。
図 1 1は、 LPSショヅクモデルマウスの生存に及ぼす卜メチル -2-ピリ ドン - 5 - カルボキサミ ドの前処理の効果を示す図である。 1M2P5Cと記載したプロットが 1 -メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドの結果を示している。
図 1 2は、 LPSショヅクモデルマウスの生存に及ぼす卜メチル -2-ピリ ドン- 5- カルボキサミ ドの治療効果を示す図である。 1M2P5Cと記載したプロッ卜が卜メ チル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドの結果を示している。
図 1 3は、 LPSショックモデルマウスの肝臓におけるニコチンアミ ドまたは 1- メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド投与の効果を調べた組織切片のへマトキシ リン ·ェォシン染色像を示す写真である。 A： LPS非接種の対照、 B： LPS接種 3 時間後に担体のみを投与したマウス、 C： LPS接種 3時間後にニコチンアミ ドを 投与、 D : LPS接種の 3時間後に メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドを投与。 図 1 4は、 LPSショックモデルマウスの S干臓におけるニコチンアミ ドまたは メチル -2-ビリ ドン- 5-カルボキサミ ド投与の効果を調べた組織切片の ssDNA染色 像を示す写真である。 A〜！）は図 1 3と同様である。
図 1 5は、 LPSショックモデルマウスの DNAラダ一形成、 ポリ - ADP-リボシル 化、 および NAD量に対するニコチンアミ ドおよび メチル -2-ピリ ドン- 5-カル ボキサミ ドの投与効果を示す図及び写真である。 図中、 NAはニコチンアミ ドを、 MPCは卜メチル - 2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドを示す。
図 1 6は、 LPS投与マウスの血清 IL- 10レベルに対するニコチン酸およびその 誘導体の効果を示す図である。 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 トリブトファンの IL- 10産生亢進作用を示す。
図 1 7は、 LPS投与マウスの血清 IL- 10レベルに対するニコチン酸およびその 誘導体の効果を示す図である。 特にその作用が強かった卜メチル -2-ピリ ドンの 結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例および参考例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれ らに限定されるものではない。
[実施例 1 ] ニコチン酸関連化合物の抗 産生作用
血中 TNF-ひ産生に対する各種ニコチン酸関連化合物の抑制効果を調べた。 マ ウス （C57BL/6、 8週齢雌） を用い、 LPS接種の 5分前に担体 (0.5% CMC) (陰 性対照） または図示した各化合物を経口投与した （300mg/kg, n=4) 。
LPS (dO/ g/ g) +D-gal (250mg/kg) を腹腔内投与し、 75分後にマウスを屠 殺し血清を回収した。 血清中の TNF-ひを ELISAによりアツセィした。 その結果、 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン、 および 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドは TNF-ひの産生を抑制することが判明した （図 1 ) 。 抗 ナイァシン活性化合物であるピリジン- 3-スルホン酸を経口投与したマウスでは、 LPS投与による TNF-ひ産生は亢進した。 これは擬似的なナイァシン欠乏動物モデ ルと位置付けることができる。
また、 ニコチンアミ ドとトリブトファンの両方を除いた RPMI1640 (日研） に 透析 FCS(Gibco BRL)を 10%添加した培地 （欠損培地） で THP- 1細胞を 2回洗浄し、 そのまま同培地で培養した。 10 g/mLの LPSを添加してから 3.5時間後の培養 上清中への TNF- 産生量を比較したところ、 以下のような結果となった。 TNF - ひ産生は、 欠損培地で培養したものの方が逆に有意に高い分泌を示すことがわか つた
通常培地 （LPS無し） 1 5 . 7 ± 1 . 2 pg/mL
通常培地 （LPS添加） 1 9 7 + 1 5 pg/mL
欠損培地 （LPS無し） 9 3 ± 2 . 9 pg/mL . 欠損培地 （LPS添加） 7 2 7 ± 3 1 pg/mL
これらのことから、 ニコチンアミ ドとトリブトファンには LPS刺激に反応して 細胞が過剰に TNF-ひを産生しないよう潜在的に抑制をかけているような働きが あるのではないかと推察される。
以上のことから、 ニコチン酸関連化合物は、 急性炎症におけるサイ ト力イン産 生を制御し、 抗炎症作用を発揮することが明らかとなった。 急性炎症におけるサ ィ トカイン産生応答を、 ニコチン酸関連化合物によって制御する機構が生体内に 存在することが示唆される。
[実施例 2 ] ニコチン酸の抗炎症作用
インビボ LPSショックマウスの血中 T F-ひ、 IFNァ、 および IL- 12産生に対す るニコチン酸の抑制効果を調べた。 マウス （C57BL/6、 8週齢雌） を用い、 LPS接 種の 5分前に担体 （PBS) (P貪性対照） またはニコチン酸を経口投与した。 LPS (50 g/kg) +D-gal (250mg/kg) を腹腔内投与し、 TNFに関しては 75分後、 IL -12および INFに関しては 5時間後にマウスを屠殺し、 血清を回収した。 血清中 の TNF、 IL- 12、 および IFNを ELISAによりアツセィした。 ELISAには、 以下の巿 販のキヅトを用いた。 その結果、 ニコチン酸はインビボマウスの LPSショックに おいて血清中に出現する一連の炎症性サイ ト力イン、 TNF-ひ、 IL- 12、 および IF Nァの産生を抑制することが判明した （図 2 ) 。
ELISAに用いたキット ：
マウス TNF- EUSAキット （ D Systems Cat. No.MTAOO)
マウス IL-12 ELISAキヅト （Genzyme Cat. No. Part 80-4244-03)
マウス IFN-ァ ELISAキヅト （R&D Systems Cat. No.MIFOO)
[実施例 3 ] ニコチン酸およびその誘導体の抗 TNF- α産生作用
血中 TNF- 産生に対するニコチン酸およびその誘導体の抑制効果を調べた。 マウス （C57BL/6、 9週齢雌） を用い、 LPS接種の 5分前に担体 （0.5% CMC) (陰 性対照） または図示した各化合物を経口投与した （300mg/kg, n=4) 。 LPS (10〃 g/kg) +D-gal (250mg/kg) を腹腔内投与し、 75分後にマウスを屠殺し血清を回 収した。 血清中の TNF-ひを ELISAによりアツセィした。 ニコチン酸、 ニコチン アミ ド、 および卜メチル -2-ピリ ドンは、 TNF-ひの産生を抑制した （図 3 ) 。
[実施例 4 ] ニコチン酸尿中代謝物の TNF-ひ産生抑制作用
インビボ LPSショックマウスの血中 TNF-ひ産生に対する メチル -2-ピリ ドン - 5 -カルボキサミ ドの抑制効果を調べた。 マウス （C57BL/6、 9週齢雌） （n二 4) を用い、 LPS接種の 5分前に担体 (0.5% CMC) (P貪性対照） または メチル -2-ピ リ ドン- 5-カルボキサミ ドを経口投与した。 LPS (50 g/kg) +D-gal (250mg/k g) を腹腔内投与し、 75分後にマウスを屠殺し、 血清を回収した。 血清中の TNF - αを ELISA (R&D, Quantikine) によりァヅセィした。 その結果、 卜メチル -2 -ピ リ ドン- 5-カルボキサミ ドはインビボマウスの LPSショックにおいて血清中に出 現する ひの産生を抑制することが判明した （図 4 ) 。
[実施例 5 ] ニコチン酸尿中代謝物の IL- 12産生抑制作用
インビボ LPSショックマウスの血中 IL- 12産生に対する卜メチル -2-ビリ ドン -5 -カルボキサミ ドの抑制効果を調べた。 マウス （C57BL/6、 9週齢雌） （n=4) を用い、 LPS接種の 5分前に担体 （0.5% CMC) (陰性対照） または卜メチル -2 -ピ リ ドン- 5-カルボキサミ ドを経口投与した。 LPS (50 /g/kg) +D - gal (250mg/k g) を腹腔内投与し、 5時間後にマウスを屠殺し、 血清を回収した。 血清中の IL - 12を ELISAによりァヅセィした。 その結果、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキ サミ ドはインビボマウスの LPSショックにおいて血清中に出現する IL- 12の産生 を抑制することが判明した （図 5 ) 。
[実施例 6 ] ニコチン酸尿中代謝物の IFNァ産生抑制作用
インビボ LPSショヅクマウスの血中 IFNァ産生に対する 1-メチル -2 -ピリ ドン - 5 -カルボキサミ ドの抑制効果を調べた。 マウス （C57BL/6、 9週齢雌） （n二 4) を 用い、 LPS接種の 5分前に担体 （0.5% CMC) (陰性対照） または 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドを経口投与した。 LPS (50 zg/kg) +D-gal (250mg/kg) を腹腔内投与し、 5時間後にマウスを屠殺し、 血清を回収した。 血清中の IFNァ を ELISAによりァヅセィした。 その結果、 メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドはインビボマウスの LPSショックにおいて血清中に出現する IFN yの産生を抑 制することが判明した （図 6 ) 。
[実施例 7 ] 抗ナイァシン化合物の TNF-ひ産生亢進作用
インビボ LPSショックマウスの血中 TNF-ひ産生に対する抗ナイァシン化合物 の効果を調べた。 マウス （C57BL/6、 7週齢雌） （n=3) を用い、 LPS接種の 1. 5 時間前に担体 （0.5% CMC) (陰性対照） または 3-ピリジンスルホン酸を経口投与 した。 LPS (50〃g/kg) +D-gal (250mg/kg) を腹腔内投与し、 75分後にマウス を屠殺し血清を回収した。 血清中の ひを ELISAによりアツセィした。 その結 果、 3-ピリジンスルホン酸はインビボマウスの LPSショックにおいて血清中に出 現する TNF o:の産生を亢進した （図 7 ) 。
[実施例 8 ] LPSショックモデルマウスの生存に及ぼすニコチンアミ ドの効果
LPSショックモデルマウスの生存に及ぼすニコチンアミ ドの効果を調べた。 LP S投与の 5分前に、 担体またはニコチンアミ ド 500ing/kg (200^ 1 . o. ) をマウ ス （C57BL/6、 12週齢雌） (n=5) に経口投与した。 LPS [(E. coli, 50 ig/kg) +D-gal(250mg/kg)] を腹腔内投与した。 その後、 経時的に生き残ったマウスを 計数した。 その結果、 ニコチンアミ ドは LPSショヅクを防御することが判明した (図 8) 。
[実施例 9] LPSショックモデルマウスの生存に及ぼすニコチンアミ ドおよび トリブトフアンの効果
LPSショックモデルマウスの生存に及ぼすニコチンアミ ド、 およびトリプトフ アンの効果を調べた。 LPS投与の 5分前に、 担体 (0.5% CMC) または各化合物 (ニコチンアミ ドは 500mg/kg、 トリプ卜ファンは lg/kg) (200〃1 p.o.) をマ ウス (C57BL/6, 12週齢雌） (n=5) に経口投与した。 LPS [(E. coli, 50 g/k g)+D-gal(250mg/kg)] を腹腔内投与した。 その後、 経時的に生き残ったマウス を計数した。 その結果、 ニコチンアミ ド、 およびトリブトファンは LPSショック を防御することが判明した （図 9) 。
[実施例 10] LPSショックモデルマウスの生存に及ぼすニコチンアミ ドの後 処理の効果
LPSショックモデルマウスの生存に及ぼすニコチンアミ ド （NM) の LPS接種 後投与の効果を調べた。 LPS [(E. coli, 50 g/kg)+D-gal(250mg/kg)] をマウ ス （C57BL/6、 ； U- 12週齢雌） （n=5) に腹腔内投与する 5分前または 3時間後に、 担体 (0.5% CMC) またはニコチンアミ ド 1000mg/kg (200 /1 p.o.) を経口投与 した。 その後、 経時的に生き残ったマウスを計数した。 その結果、 ニコチンアミ ドは LPS接種の 3時間後の投与においても LPSショックを防御することが判明し た （図 10) 。
[実施例 1 1] LPSショヅクモデルマウスの生存に及ぼす卜メチル -2-ピリ ド ン- 5-カルボキサミ ドの前処理の効果
インビボ LPSショックモデルマウスの生存に及ぼす メチル -2-ピリ ドン- 5- カルボキサミ ド （1M2P5C) の LPS接種前投与の効果を調べた。 LPS [(E. coli, 5 0 ig/kg)+D-gal(250mg/kg)] をマウス （C57BL/6、 11週齢雌） （n=5) に鹰腔内 投与する 5分前に、 担体 (0.5% CMC) または 1M2P5C 1000mg/kg (200 zl p.o.) を投与した。 その後、 経時的に生き残ったマウスを計数した。 その結果、 1M2P5C は LPS接種の前投与においても LPSショックを防御することが判明した （図 1
1) o
[実施例 1 2] LPSショックモデルマウスの生存に及ぼす卜メチル -2-ピリ ド ン- 5-カルボキサミ ドの治療効果
インビボ LPSショックモデルマウスの生存に及ぼす卜メチル -2-ピリ ドン - 5 - カルボキサミド （1M2P5C) の治療効果を調べた。 LPS [{E. coli, 50 zg/kg)+D- gal(250mg/kg)] をマ.ウス (C57BL/6, 11週齢雌) (n=5) に腹腔内投与し、 3時 間後に担体 （0.5°/D CMC) または 1M2P5C 1000mg/kg (200 /1 p.o.) を投与した。 その後、 経時的に生き残ったマウスを計数した。 その結果、 1M2P5C は LPS接種 後に投与しても、 LPSショックを防御する治療効果を示すことが判明した （図 1
2) o
[実施例 13〗 LPS投与マウスの肝臓の鬱血性壊死ならびにアポト一シスに対 するニコチン酸関連化合物投与の効果
マウスに LPSを投与しておこる肝臓の鬱血性壊死に対するニコチン酸関連化合 物の効果を病理組織学的ならびに生化学的に検討を行った。 マウス（C57BL/6 約 10週齢雌）を用い、 健常マウス（対照）（ビ一クル (0.5%CMC)投与)および LPS投与 マウス、 E. coli ζ0μg/ g + D-galactosamine 250 mg/kg、 i.p. (volume 200〃 1))で、 薬剤投与群は、 ニコチン酸関連化合物としてニコチンアミ ドと メチル -2 -ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドを選び、 それぞれニコチンアミ ド lg/kg、 1-メチ ル- 2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド lg/kgを LPS接種から 3時間後に経口投与し、
LPS接種から約 5.5時間後に屠殺後解剖して肝臓を採取し一部は ioy。ホルマリン 緩衝液で固定し (病理組織学的検討用）一部はすぐにドライアイスで凍結後- 80°C で冷凍保存 (生化学的検討用）した。 病理組織学的検討では肝を切り出した (外側 左葉)後、 組織切片を作製後、 へマトキシリン 'ェォジン (H. E. )染色と ssDNA法 による染色を行った。 ssDNA法では抗 Single Stranded DNA(ssDNA) ·ゥサギポリ クロ一ナル抗体 (DAK0社製品コード A4506)を 1次抗体として使用し、 検出は DAK 0社 LSAB2キヅ卜/ HRP -ユニバーサル（カタログ NO.K0677)を使用した。 1次抗体 使用のプロトコールは以下の文献と同様に行なった。
Narese I， et al. , Antibody against single-stranded DNA detects both pr ogranuned cell death and drug- induced apoptosis. Histochemistry 101 : 73-7 8, 1994.
oba ashi S, et al . , Detection of DNA fragmentation in human breast ca ncer tissue by an antibody specific to single stranded DNA. Breast Cance r 5:47-52, 1998.
検出は添付のプロトコールに従って行った。
所見は表 1に一括した。 健常マウスでは表の項目については全く異常は認めら れなかった。 一方 Vehicle (担体） 投与群では高度の鬱血 (一部に出血)、 好酸体 (単細胞性の壊死)、 核の濃縮と崩壊、 空胞、 肝細胞内に大小の硝子滴を多少認め た。 なお、 ssDNA染色では散在性に褐色に染まるかなりの数の肝細胞を認めた。 ニコチンアミ ド投与群 （表中の M) では、 好酸体と硝子滴がほんの数箇所で見 られ、 一部に微小空胞と粗鬆化も見られるが、 全体として殆ど 「正常」 （対照） と変わらない。 ssDNA染色では陽性細胞が極少数観察されたが、 Vehicle群に比 ベると著しく抑制されていた。 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド投与群 (表中の MPC) はニコチンアミ ド群と比べて核の所見や硝子滴がやや多く認めら れ、 ssDNA陽性細胞も少数認められるが、 この群も Vehicle群と比較するとアポ ト一シスが顕著に抑制されている。 以上の顕微鏡の写真を図 1 3 (へマトキシリ ン■ェォジン（H.E. )染色） および図 1 4 (ssDNA法による染色） に示した。 表 1
[マウス C57BL/6]
披検據器 肝艨
染色方法 H.E. ssDNA
病理所見 a小菜像明瞭 e核濃縮 h粗鬆化 kアポト—シス
b ¾g血 (出血） f 核崩壊 i硝子滴
c暗細胞 g空胞 j細胞浸潤
d好酸体 (単細胞壊死） 総合判定 b c d e f h 1 j k
正常マウス 士 ±
担体 +++一 ++ ++ ++ + ++ ++ ++++
NA 土 ― 十 + ± ± + + + +
PC ± + + + + + 土 + ++ 注） 1. [病変の程度] —：所見なし 士：極軽度 +:軽度 ++:中等度 +++:髙度
++++:極 i¾度 これらの肝臓組織の生化学的検討も行った。 検討した項目は肝臓の MAラダー 形成、 ポリ- ADP-リボシル化、 NAD含量の変化である。 DNAラダ一形成は、 各マウ スの月干臓からゲノム DNAを調製し、 ヮコ一の Apoptosis Ladder Detection Kit Wakoに従って検出した。 ポリ- ADP-リボシル化は Anti-poly(ADP- Ribose)polyclo nal antibody(rabMt, polyclonal )でウエスタンブロットにて検出した。 NAD量 は Nisselbaumの方法によって行った。 (Nisselbaum,J. S. , and S. Green. A sim l e ultramicro method for determination of pyridine nucleotides in tissues. Anal . Biochem. 27， 212-217(1969) )。 生化学的な検討の結果を図 1 5にまとめ
生化学的な検討によって、 DNAラダ一形成、 ポリ -ADP-リボシル化はニコチン アミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ドで顕著に抑制されており、 アポ ト一シスが抑制されていることが判った。 また、 アポトーシスに伴う NAD含量の 減少もこれら薬剤投与で抑制されていたが、 興味深いことにニコチンアミ ドでは NAD含量が上昇していた。 これは、 ニコチンアミ ドが NADの前駆体であり、 大量 の NAD投与によって肝臓で NADが大量に生合成されたからではないかと思われる ( 薬剤の投与が LPS接種 3時間後であることも考え合わせると、 以上の結果から、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミドなどニコチン酸関連化 合物には、 抗炎症作用に加えて抗アポト一シス作用があり、 これらの複合的作用 によって組織障害に対する防御作用を有すると推察される。
[実施例 1 4 ] IL-10産生に対する各種ニコチン酸関連化合物の亢進作用 血中 IL- 10産生に対する各種ニコチン酸関連化合物の亢進作用を調べた。 マウ ス （C57BL/6、 18週齢雌） を用い、 LPS接種の 5分前に担体 (0.5%CMC) (Ρί性 対照） または各種ニコチン酸関連ィヒ合物を経口投与した （300 mg/kg、 n = 3) 。
LPS (50 zg/kg) +D-gal (250 mg/kg) を腹腔投与し、 3時間後にマウスを屠 殺し血清を回収した。 血清中の IL- 10を ELISA (Genzyme) によりアツセィした。 その結果、 検討したすべての化合物 （ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル- 2 -ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 トリブトファン、 卜メチル -2-ピリ ドン） に LPS 投与マウスの IL- 10産生を更に亢進させる作用があることが明らかになった （図 1 6 ) 。 特に卜メチル -2-ピリ ドンの作用は強かった （図 1 7 ) 。 産業上の利用の可倉 I、生
本発明により、 ニコチン酸関連化合物が持つ、 IL- 12、 IFN-ァ、 あるいは TNF - ひといつたアポトーシスに関連する炎症性サイ トカインの産生阻害作用が明らか にされた。 また、 ニコチン酸関連化合物が持つ PARPの阻害作用も明らかとなつ た。 更に、 ニコチン酸関連化合物が、 抗炎症性サイ トカインである IL- 10の産生 亢進作用を有することが見出された。
これらのアポトーシス関連因子は、 いずれも相互に密接に関連しながらアポト 一シス実行カスケードにおいて重要な位置を占める因子である。 したがって、 こ れらの因子を阻害することによって、 アポトーシスを効果的に阻害することがで きる。 アポト一シスは、 疾患において様々な病態の原因となっていることが推定 されている。 たとえば、 劇症肝炎は肝細胞のアポトーシスが原因となっている。 したがって、 アポト一シス関連因子の阻害剤は、 これらの病態の治療に有用であ る。
アポト一シスは、 複雑な細胞制御機構の総合的な作用の結果として生じる現象 である。 一方、 疾患の原因となるアポト一シスを誘導する原因は多様である。 し たがって、 今後は、 何がアポトーシスの原因となっているのかを見極め、 原因に 直接作用する薬剤を選択することによって、 治療効果を高める努力が求められる 本発明のアポトーシス関連因子阻害剤は、 その標的因子が明らかであることから、 このような、 標的因子を見極めた上での効果的な治療を可能とする。
本発明のアポ卜一シス関連因子阻害剤は、 単にアポト一シスの阻害剤として有 用なだけでなく、 その作用機構を明らかにしたことにより、 新たな有用性が期待 される。 すなわち、 たとえば本発明における炎症性サイ ト力イン （IL- 12、 IFN- ァ、 および TNF -ひ） は、 アポト一シス関連因子であると同時に、 様々な炎症症 状においても重要な役割を果たしている。 したがって、 本発明の炎症性サイ ト力 イン産生抑制剤は、 これらのサイ トカインが関与する炎症症状の緩和に利用する こともできる。 また、 PMPは、 例えば NADを消費することによって組織の壊死 を誘導する作用があることから、 PMPの阻害剤はネクロ一シス阻害剤としての 用途が考えられる。 加えてニコチン酸関連化合物が、 抗炎症性のサイ トカインで ある IL-10の産生亢進作用を有することが見出された。 このことは、 ニコチン酸 関連化合物を用いて炎症症状をコントロールすることの意義を更に大きくする。 したがって、 これらの薬剤は、 抗炎症剤、 免疫異常治療剤、 Abdominal cavity i nflammation (腹膜炎等） 、 慢性関節リウマチ、 関節炎、 クローン病、 癌悪液質、 糖尿性網膜症、 乾せん、 虚血性疾患、 アルヅハイマーなどの予防および治療のた めの薬剤としても有用である。
以上のように、 本発明による炎症性サイ トカインの産生抑制剤、 抗炎症性サイ トカインの産生促進剤、 あるいはアポトーシス阻害剤は、 その標的因子が明らか であるために、 アポトーシスが関連する疾患に対して、 より合理的で有効な治療 手段、 あるいは予防手段を提供する。

Claims

請求の範囲 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 および メチル- 2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 ィン夕ーロイキン 1 2および Zまたはイン夕一フエロン yの産生抑制剤。 ;1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 またはその製薬上許容される塩 を主成分として含有する、 腫瘍壊死因子 α産生抑制剤。 ニコチンアミ ドまたはその製薬上許容される塩、 およびトリブトファンま たはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 腫瘍壊死因子 α産生 抑制剤。 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン、 およびトリブトファンからなる群から選択されるい ずれかの化合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 ィン夕一ロイキン 1 0の産生亢進剤。 ニコチン酸、 ニコチンアミド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 および 1-メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 アポト一シスの阻 害剤。 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 卜メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 または 1-メチル- 2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 肝炎の予防剤また は治療剤。 ニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル -2-ピリドン- 5-カルボキサミ ド、 および卜メチル -2-ピリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物、 またはその製薬上許容される塩を主成分として含有する、 ポリ- ADP-リボー ス—ポリメラ一ゼの阻害剤。 . 請求項 7に記載のポリ -ADP-リボース一ポリメラ一ゼの阻害剤を主成分と して含有する、 ネクロ一シスに起因する疾患の予防剤または治療剤。 . 疾患が急性肝炎である請求項 8に記載の予防剤または治療剤。 0 . 肝炎が劇症肝炎である請求項 8に記載の予防剤または治療剤。
1 . 次の工程を含む、 抗炎症剤として有用な化合物のスクリーニング方法。
a ) 被検動物に候補化合物を投与する工程
b ) 被検動物の組織、 および/または生体液中に含まれるニコチン酸、 ニコチンアミ ド、 1-メチル -2-ピリ ドン- 5-カルボキサミ ド、 および 1 - メチル- 2-ビリ ドンからなる群から選択されるいずれかの化合物を測定 する工程、 及び
• c ) 対照と比較して b ) の測定値を高める候補化合物を選択する工程 2 . 請求項 1 1に記載の方法によって得ることができる化合物を主成分とし • て含む、 抗炎症剤。
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