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WO2002011752A1 - Utilisation du gene glil - Google Patents

Utilisation du gene glil Download PDF

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WO2002011752A1
WO2002011752A1 PCT/JP2001/006688 JP0106688W WO0211752A1 WO 2002011752 A1 WO2002011752 A1 WO 2002011752A1 JP 0106688 W JP0106688 W JP 0106688W WO 0211752 A1 WO0211752 A1 WO 0211752A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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protein
bone
dna
cartilage
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2001/006688
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yuichi Hikichi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Priority to AU2001276722A priority Critical patent/AU2001276722A1/en
Publication of WO2002011752A1 publication Critical patent/WO2002011752A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a compound having an activity of controlling (promoting or inhibiting) the expression of a G1i1 gene or a salt thereof using a cell capable of expressing the G1i1 gene, and a screening method thereof.
  • the present invention relates to a compound or a salt thereof obtainable by using the compound, and a use of the compound. Background art
  • Gli1 protein a product of the GliI gene, belongs to a transcription factor having zinc finger, and Is a homologue of the transcription factor Ci (Cubi tus interruptus) in vertebrates (Aza-Blanc, P. et al., Trends Genet. (1999) 15, .458-462).
  • Ci Cubi tus interruptus
  • Research on the function of Drosophila Ci has been advanced, and molecules induced by Ci have been reported (McMahon, AP et al., Cell (2000) 100, 185-188).
  • Gli protein As for the Gli protein, all three Gli proteins bind to a common sequence via the zinc finger region, and the Gli3 protein binds directly to the promoter region contained in the G1i1 gene. Although it has been reported that it induces transcription, the function of the G1i1 protein is mainly based on the analogy of the function of the Drosophila Ci protein. There are many points of knowledge.
  • Gli1 gene expression is said to be induced by signal transduction by a soluble secreted protein called hedgehog (Dai, P. et al., J. Biol. Cem. (1999) 274, 8143-8152).
  • hedgehog a soluble secreted protein called hedgehog
  • the hedgehog family is a group of protein factors that have attracted attention as a key to morphogenesis in many animal species, from insects to vertebrates, for example, by forcibly expressing the N-terminal domain, the active site of Sonic hedgehog It has been reported that transplantation of fibroblasts into nude mice induces ectopic bone formation (Kinto, N. et al., FEBS let t. (1997) 404, 319-323).
  • hedgehog protein is thought to be effective in the treatment and prevention of various bone and cartilage disorders and bone 'cartilage diseases, but it is present only in trace amounts in nature and is available in large quantities for use in treatment Therefore, it is necessary to produce a recombinant protein.
  • the production of recombinant proteins costs much more than the production of low-molecular-weight compounds, and the properties of proteins impose limitations on the physical properties of pharmaceuticals and the administration method.
  • Bone and cartilage tissue are differentiated and differentiated into bone and cartilage cells after determining the differentiation of pluripotent cells such as undifferentiated mesenchymal cells into bone and cartilage precursor cells. It is formed through a series of processes. In the osteogenesis process such as fetal life and fracture healing, cartilage differentiation generally precedes osteogenesis. Therefore, promotion of cartilage differentiation leads to promotion of bone differentiation. Diseases requiring repair or induction of damaged bone or cartilage tissue, or diseases in which hyperplasia is a problem, may be disrupted by any of these processes, but may be directed to healing There has been a keen need for the creation of inexpensive, effective, and superior pharmaceuticals. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that in the functional analysis study of Gli1, the forced expression of G1i1 enhances the expression of cartilage markers. In addition, it is possible to induce G1i1 by forcibly expressing a transcription factor gene that has not been reported to be involved in hedgehog signals such as Sc1erais. It was found that the expression of G1i1 can be controlled even without using.
  • a prophylactic / therapeutic agent for bone fracture, osteoarthritis, osteoarthritis, cartilage damage, trauma, osteogenesis imperfecta, achondroplasia or osteoporosis containing the G1i1 protein, its partial peptide or its salt Bone and cartilage defect regenerative treatment, bone reconstruction or bone transplant treatment,
  • the agent according to the above (5) comprising a recombinant vector containing a DNA encoding the G1i1 protein or a partial peptide thereof.
  • (9) a method for inducing bone and cartilage differentiation, which comprises administering an effective amount of a G1i1 protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof to a mammal;
  • (13) a method for inducing bone / cartilage differentiation, which comprises administering an effective amount of DNA encoding the G1i1 protein or a partial peptide thereof to a mammal;
  • (21) a diagnostic agent for bone and cartilage disease, comprising an antibody of the G1i1 protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • (22) a method for diagnosing a bone or cartilage disease, which comprises using an antibody of the G1i1 protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • (23) a method for screening a compound having a bone / cartilage differentiation regulating action or a salt thereof, which comprises using a G1i1 protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • a screening kit for a compound or a salt thereof which comprises a G1i1 protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, and has a bone / cartilage differentiation regulating action
  • a compound having a bone / cartilage differentiation regulating effect or a salt thereof which can be obtained by using the screening method according to any one of (23) to (27) or the screening kit according to (28).
  • a method for preventing and treating bone cartilage disease which comprises administering an effective amount of the compound or a salt thereof according to (29) to a mammal;
  • (36) a method for inducing bone / cartilage differentiation, which comprises enhancing or activating the action of a G1i1 protein, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • (38) a method for screening a compound having an activity of controlling the expression of a Gli1 gene or a salt thereof, which comprises using a cell capable of expressing the G1i1 gene;
  • G1i1 gene characterized by containing cells transformed with DNA obtained by linking the promoter or enhancer of G1i1 gene to reporter gene.
  • a compound having an activity of controlling the expression of Gli1 gene or a salt thereof which can be obtained using the screening method according to (38) or the screening kit according to (42) (provided that SEQ ID NO: : G1i3 gene represented by 20 or SEQ ID NO: 22 or a product thereof (excluding SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 21)),
  • (48) a method for preventing or treating bone and cartilage diseases, which comprises administering an effective amount of the compound or a salt thereof according to (44) or (45) to a mammal;
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of mouse G 1 i1 in one letter notation.
  • the Gli1 gene is a known gene described in Sasaki et al. Development (1999) 129, 3915-3924, Kinzler, KW. Et al., Science (1987) 236, 70-73, and the like.
  • mouse genes are registered as AF 026 305 and AB 0 259 22, and human genes are registered as X 07 384 with the amino acid sequences corresponding to GenBank.
  • the “G1i1 protein” includes an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 11, 13, 15 or 17 Can be mentioned.
  • the G1i1 protein may be, for example, a warm-blooded animal (eg, human, guinea pig, rat, mouse, chicken, egret, bush, sheep, pigeon, monkey, etc.) in any cell (eg, spleen cell, neural cell).
  • a warm-blooded animal eg, human, guinea pig, rat, mouse, chicken, egret, bush, sheep, pigeon, monkey, etc.
  • any cell eg, spleen cell, neural cell.
  • the cells or any tissue in which they reside such as the brain, parts of the brain (eg, olfactory bulb, nucleus pulposus, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla oblongata, cere
  • cells of warm-blooded animals eg, humans, guinea pigs, rats, mice, chicks, egrets, bushes, hidges, magpies, monkeys
  • cells of warm-blooded animals eg, humans, guinea pigs, rats, mice, chicks, egrets, bushes, hidges, magpies, monkeys
  • proteins derived from blast cells, chondrocytes, bone cells or osteoblasts, or precursor cells of these cells, stem cells or cancer cells, etc. are preferably used.
  • amino acid sequences that is substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 11, 13, 15, or 17 include, for example, SEQ ID NO: 10, 11, 13, 15 Or about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, further preferably about 80% or more, particularly preferably about 9% or more, with the amino acid sequence represented by 17. Amino acid sequences having 0% or more, most preferably about 95% or more homology, and the like can be mentioned.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 11, 13, 13, 15 or 17 include, for example, SEQ ID NO: 10, 1 It contains an amino acid sequence that is substantially the same as the amino acid sequence represented by 1, 13, 15, or 17, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 11, 13, 15, or 17 Proteins having substantially the same activity as the protein having the same are preferred.
  • Substantially the same activity includes, for example, a transcriptional activity and a bone / cartilage differentiation-inducing action.
  • Substantially the same quality means that the transcriptional activity and the action of inducing bone and cartilage differentiation Indicates that they are the same. Therefore, it is preferable that the transcriptional activity and the action of inducing bone / cartilage differentiation are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times).
  • the quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • the activity such as bone / cartilage differentiation-inducing activity can be measured according to a known method.
  • the activity can be measured according to a screening method described later.
  • the measurement of the transcription activity can be performed by a known method, for example, a method such as reporter assay or RT-PCR.
  • the Gli1 protein used in the present invention includes: 1) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 11, 13, 15 or 17 (preferably, about 1 to 30; More preferably, about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) amino acids are deleted, 2 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 11, 13, 15, or 17 An amino acid sequence obtained by adding one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids to the amino acid sequence; , 11, 13, 15, or 17 or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5) in the amino acid sequence represented by ) Amino acid sequence in which the amino acid is replaced with another amino acid Or (1) A protein containing an amino acid sequence obtained by combining them is also used.
  • Gli 1 protein has an N-terminus (amino terminus) at the left end and a C-terminus (caprolactyl terminus) at the right end, according to the convention of peptide notation.
  • the Gli1 protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 11, 13, 15 or 17, has a C-terminal lipoxyl group (—COOH), It may be any of rate (—COO—), amide (one CONH 2 ) or ester (—COOR).
  • R in the ester is, for example, an alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, Pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, C 6 _ 1 2 Ariru group such as ⁇ one naphthyl, for example, benzyl, full of such phenethyl Eniru C Bok 2 alkyl or ⁇ - naphthyl C7 ⁇ 4 aralkyl groups such as naphthyl-C alkyl groups such as methyl, and pivaloyloxymethyl groups commonly used as oral esters are used.
  • an alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl
  • Pentyl C 3
  • cyclohexyl - 8 cycloalkyl group for example,
  • a protein in which the lipoxyl group is amidated or esterified is also a G1i1 protein of the present invention. included.
  • the ester in this case for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the G li 1 protein in the present invention C E of the protein odor Te, Amino group protecting groups Mechionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, etc. C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechi Le - 6 also Ashiru protected by group, etc.), those glutamyl group N-terminal region is cleaved in vivo to form pin hole glutamine oxide, substituents on the side chains of amino acids in the molecule (e.g., primary OH , One SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group, etc.) are suitable protecting groups (for example,
  • Gli1 protein in the present invention for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, 11, 13, 15 or 17 is used.
  • the partial peptide of the Gli1 protein may be any peptide as long as it is the partial peptide of the Gli1 protein described above.
  • the number of amino acids in the partial peptide in the present invention includes at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more amino acid sequences among the constituent amino acid sequences of the aforementioned G1i1 protein. Peptides that are used are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, and still more preferably about 80% or more of these amino acid sequences.
  • the amino acid sequence preferably has a homology of about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • one or more (preferably about 1 to 10 and more preferably several (1 to 5)) amino acids in the above amino acid sequence are deleted.
  • one or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably several (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence.
  • 1 or 2 or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence are replaced with other amino acids. May be.
  • the C-terminus may be any of a hydroxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO_), an amide (—C ⁇ NH 2 ), or an ester (one COOR).
  • the partial peptide of the present invention has an N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected by a protecting group, and the N-terminal side of which is cleaved in vivo.
  • the resulting G1n is pyroglutamine-oxidized, the amino acid in the molecule has a substituent on the side chain protected by an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound. included.
  • Examples of the salt of the G1i1 protein or a partial peptide thereof of the present invention include a physiologically acceptable salt with an acid or a base, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, G li 1 protein or a salt thereof according to the present invention, wherein a salt with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid or benzenesulfonic acid) is used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid,
  • the protein can be produced from a tissue by a known method for purifying a protein, or a transformant containing a DNA encoding the Gli1 protein of the present invention described later. It can also be produced by culturing the transformant. In addition, the protein can also be produced according to a protein synthesis method described later or a method analogous thereto.
  • a commercially available resin for protein synthesis can usually be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2,, 4, dimethoxyphenyl) L-Fmoc aminoethyl) phenoxy resin.
  • amino acids having appropriately protected amino groups and side chain functional groups are condensed on the resin according to the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the target protein or its amide.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • carpoimides DCC, N, N'-diisopropylcarpoimide, N-ethylN '-(3-dimethylaminoprolyl) carpoimide, and the like are used.
  • Activation by these involves the ability to add the protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOB t, HO OB t), or a symmetric anhydride or HOB t ester or H ⁇ B t ester It can be added to the resin after activating the protected amino acid in advance.
  • Solvents used for activation of protected amino acids and condensation with resins include proteins It can be appropriately selected from solvents known to be usable for the condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformylamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylvinylidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, and trifluoroethanol.
  • Alcohols, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof. Used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected appropriately from a range of about 120 ° C. (to 50 ° C.).
  • the amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times.As a result of the test using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, it is sufficient to repeat the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, Yuichi Shari-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI-Z, Br_Z, Adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification It can be protected by benzyloxycarbonyl hydrazide, short-lived butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower groups such as an acetyl group. Examples thereof include groups derived from carbonic acid such as an aroyl group such as a higher alkanol group and a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarbonyl group.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydroviranyl group, and a tributyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz 1, C 1 2 - Bz l, as 2-two Torobenjiru, B r- Z, protecting group of the imidazole of evening histidine such as single-tertiary butyl is used,
  • Tos 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the activated carbonyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, esters with N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt).
  • active ester alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, esters with N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOBt).
  • active ester alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitrophenol) Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, esters with N-hydroxysucc
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, etc. Is also used.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C to 40 ° C.
  • the acid treatment for example, anisol, phenol, thioanisole, methacresol, paracresol, It is effective to add a force-thione scavenger such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • a force-thione scavenger such as dimethyl sulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is the above 1,1.
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia, etc.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of a protein for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the terminal end of the amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side of the desired chain. After extending the length, a protein was prepared by removing only the protecting group of the amino group at the ⁇ -terminus of the peptide chain and a protein was prepared by removing only the protecting group of the carboxy group at the C-terminus. Condensation in such a mixed solvent. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein. This crude protein is purified by using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • ester of a protein for example, after condensing the high carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein is prepared in the same manner as the amide of the protein Can be obtained.
  • the partial peptide of the Gli1 protein or a salt thereof in the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method or by cleaving the G1i1 protein in the present invention with an appropriate peptide. .
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods, for example, solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and the like.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
  • the polynucleotide encoding the Gli1 protein in the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the G1i1 protein in the present invention. There may be.
  • the polynucleotide is a DNA encoding the Gli1 protein of the present invention, or an RNA such as an mRNA, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • the Gli1 protein can be prepared by a known method described in Experimental Medicine Special Edition "New PCR and Its Applications” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto.
  • the mRNA of one protein can be quantified.
  • the DNA encoding the G1i1 protein may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • DNA encoding the Gli1 protein includes: For example, a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18 and under stringent conditions DNA encoding a Gli1 protein having a nucleotide sequence that hybridizes with G1i1 protein of the present invention and having substantially the same activity as the G1i1 protein of the present invention (eg, transcriptional activity and bone / cartilage differentiation inducing action). Any one may be used.
  • DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by IH column number: 9, 12, 14, 16 or 18 are, for example, about 70% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18
  • a DNA containing a base sequence having a homology of about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization is performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning; 2nd (J. Saibrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • a commercially available library it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual, and more preferably, under high stringent conditions.
  • the high stringent conditions include, for example, conditions at a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. Show. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ⁇ is most preferable.
  • DNA encoding the G1i1 protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 or the like is used.
  • the DNA encoding the Gli1 protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is as follows: DNA containing the base sequence represented is used.
  • DNA encoding the G1i1 protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or the like is used.
  • DNA encoding the G1i1 protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 is used.
  • DNA encoding the G1i1 protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 or the like is used.
  • a polynucleotide comprising a part of the base sequence of DNA encoding Gli1 protein or a part of the base sequence complementary to the DNA in the present invention is a partial peptide of the present invention described below.
  • the term is used to mean not only DNA that encodes but also RNA.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of a Gli1 protein gene is cloned or determined.
  • a polynucleotide can hybridize with the RNA of the G1i1 protein gene, inhibit the synthesis or function of the RNA, or interact with the RNA associated with the Gli1 protein. Can regulate and control the expression of the Gli1 protein gene.
  • Polynucleotides complementary to selected sequences of G1i1 protein-related RNA, and polynucleotides capable of specifically hybridizing to Gli1 protein-related RNA, can be used in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of the i1 protein gene, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes.
  • nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) usually refers to the amino acid of the peptide (protein) as directed by the sequence of the nucleotide (nucleic acid) or its complement.
  • the peptide translation initiation codon, protein coding region, translation termination codon, 3'-end untranslated region, 3'-end palindrome region, and 3'-end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, the Gli 1 protein gene Any area can be selected as a target.
  • the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide complementary to at least a part of the target region that is, the relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide that can hybridize eight times
  • Antisense polynucleotides are polydeoxynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polydeoxynucleotides containing D-liposome, N-glycosides of purine or pyrimidine bases.
  • Certain other types of polynucleotides or other polymers with non-nucleotide backbones eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • the polymer contains a nucleotide having a configuration that allows base pairing and base attachment as found in DNA and RNA).
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can also be unmodified polynucleotides (or non-modified polynucleotides). Modified oligonucleotides) and those with known modifications, such as those with a label, capped, methylated, and one or more natural nucleotides, which are known in the art.
  • an intramolecular nucleotide for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or sulfur
  • bonds for example, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • proteins for example, proteins (nucleases, nucleases * inhibitors, Those having side chain groups such as toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.) and sugars (eg, monosaccharides), and those having interactive compounds (eg, acridine, psoralen, etc.)
  • Compounds containing chelating compounds eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizable metals, etc.
  • alkylating agents those containing modified bonds (eg, an anomer Type nucleic acid).
  • nucleoside and “nucleic acid” may include those containing not only purine and pyrimidine bases but also other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or functionalities such as ethers, amines, etc. It may be converted to a group.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and those resistant to degradation of polynucleoside amides and oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Make sense nucleic acid less toxic.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes and increase nucleic acid uptake (eg, , Phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • ⁇ , end, or 5 'It can be attached to the end, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include capping groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. . Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, such as dalicol such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be measured by using a transformant containing a recombinant vector containing the Gli1 gene or Gli1 gene, an in vivo or in vitro gene expression system, or a Gli1 protein. It can be examined using in vivo and in vitro translation systems.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various known methods.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be directly carried out by a reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) a partial nucleotide sequence of a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18; Or (2) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18 and a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions; 1
  • a DNA containing a partial nucleotide sequence of a DNA encoding the Gli1 protein having substantially the same activity as the protein (eg, a transcriptional activity or an activity of inducing bone / cartilage differentiation) is used.
  • DNA encoding the partial peptide of the present invention for example, (1) DNA containing a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18, or (2) SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16, or A portion of DNA containing a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with DNA containing the nucleotide sequence represented by 18, and encoding a protein having substantially the same activity as the G1i1 protein of the present invention. DNA containing a base sequence is used.
  • Examples of the DNA capable of hybridizing with the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18 include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18 and about 70 % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18 include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, 12, 14, 16 or 18; DNA containing a base sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
  • a synthetic method containing a partial base sequence of the protein of the present invention may be used. Amplified by the PCR method using a DNA primer or incorporated into an appropriate vector, and labeled with a DNA fragment encoding a partial or entire region of the protein of the present invention or a synthetic DNA It can be selected by hybridization with the one that has been used. Hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular 'Cloning (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, the method can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be replaced by PCR or a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo) or Mutan TM -K (Takara Shuzo) using the 0DA-LA PCR method, a It can be carried out according to known methods such as the pped duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA encoding the protein of the present invention can be used as it is or, if desired, digested with a restriction enzyme or added with a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a target DNA fragment from, for example, cDNA containing DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into an appropriate expression vector. It can be produced by ligating downstream of the promoter.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pCR4, pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC 194
  • yeast-derived plasmids eg, pSH19, pSHI5
  • pacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is an appropriate promoter corresponding to the host used for gene expression.
  • SRK promoter overnight SV40 promoter, LTR promoter-CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV Promoter CMV Promoter, SRa promoter and the like.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • the trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ ⁇ promoter, lpp promoter, etc. are used.
  • the SPOL promoter, SP02 promoter, etc. If the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the SPOL promoter, SP02 promoter, etc.
  • the host is yeast, such as the P promoter, the PH05 promoter Evening, PGK Promoting, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter, sometimes abbreviated as SV40 ori), etc., if desired.
  • an enhancer e.g., a splicing signal
  • polyA addition signal e.g., a polyA addition signal
  • a selection marker e.g., SV40 replication origin
  • SV40 ori SV40 replication origin
  • SV40 ori SV40 replication origin
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ampf), neomycin Resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neor, G418 resistance) and the like.
  • the target gene when used as a selection marker by using CHO (dhfr-) cells, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. If the host is a genus Escherichia, Pho A signal sequence, OmpA signal sequence, etc., if the host is a Bacillus genus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. If yeast, use MFo! Signal sequence, SUC2 signal sequence, etc.If the host is an animal cell, use insulin signal sequence, ⁇ -interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. it can.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K12 DH1 [Processing's of the National Academy of Sciences' Sciences of the USA. Natl. Acad. Sci. US A), Vol. 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research], (Nucleic Acids Research), Vol. 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Ob. ⁇ Molecular ⁇ Biology (Journal of Molecular Bio HB 101 (Journal of Molecular Molecular 'Biology, 41, 459 (1969)), C 600 (Genetics, 39) , 440 (1954)], DH5 o; [Inoue, H., Noj im a, H.
  • Bacillus spp. include, for example, Bacillus subtilis MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95] Vol. 87 (1 984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R ⁇ , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC19 13, NCYC 2036, Pichia pastoris, etc. are used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larva of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, J ⁇ et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Is used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh fr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr_) cell). ), Mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like.
  • Inorganic or organic substances such as calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride Nesium and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acids As a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Miller), Journal of Experiments in Molecular Genetics] Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]. If necessary, an agent such as 3 / 3-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently. When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, the medium may be 10% serum inactivated in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195,788 (1962)). And the like, to which the additives described above are appropriately added.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and / or agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association at Volume 199, 519 (1967)), 199 medium [Procedure 'Probed's'Society' for the Biological Medicine (Proceeding of the Society for the Biological Medicine), Vol. 73, 1 (1950)].
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30 ° (: ⁇ 40 for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • the protein contained in the culture supernatant or the extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting-out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method using difference in charge method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, hydrophobicity such as reversed phase high performance liquid chromatography
  • a method using the difference between the isoelectric points, such as an isoelectric focusing method, and the like, may be used.
  • the thus obtained protein is obtained in a free form
  • a known method can be used.
  • it can be converted to a salt by a method analogous thereto, and conversely, when it is obtained as a salt, it can be converted to a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, tribcine, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the activity of the G1i1 protein or a salt thereof of the present invention thus produced can be measured, for example, using the ability to bind to a double-stranded DNA having a Gli1 binding sequence as an index.
  • An antibody against the Gli1 protein or its partial peptide or a salt thereof according to the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the Gli1 protein or its partial peptide or a salt thereof according to the present invention. Any of these may be used.
  • an antibody against the Gli1 protein or a partial peptide thereof or a salt thereof may be obtained by using a protein or the like of the present invention as an antigen, and using a known antibody or antiserum. It can be manufactured according to the manufacturing method.
  • the protein or the like of the present invention is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, and goats, and mice and rats are preferably used.
  • monoclonal antibodies When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, monoclonal antibodies can be obtained by selecting individuals with antibody titers from mice, collecting spleens or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization, and fusing the antibody-producing cells contained in them with myeloma cells. Production hybridomas can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein or the like described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be carried out according to a known method, for example, the method of Keller and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • a force P3U1 including NS-1, P3U1, SP2Z0 and the like is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • PEG preferably PEG1000 to PEG6000
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which an antigen such as a protein is adsorbed directly or together with a carrier.
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A, and a monoclonal antibody bound to the solid phase
  • a method for detecting a null antibody is if the cells used for cell fusion are mice.
  • the selection of the monoclonal antibody can be carried out according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be carried out in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • RPMI 16 containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum GIT medium containing 40 to 100% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free medium for hybridoma culture (SFM—101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) Etc.
  • SFM serum-free medium for hybridoma culture
  • the cultivation temperature is usually 20 to 40, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the culture can be usually performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies (e.g., salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchange).
  • Absorption / desorption method using body e.g, DEAE
  • ultracentrifugation method e.g., ultracentrifugation method
  • gel filtration method e.g., antigen-binding solid phase or active adsorbent such as protein A or protein G to collect only antibody, dissociate and dissociate antibody Specific Purification Method Obtained].
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (an antigen such as a protein) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting the product and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by the efficiency of the antibody against the hapten immunized by cross-linking with the carrier. If possible, any kind of cross-linking may be used in any ratio.
  • hapten 1 may be used in a weight ratio of ⁇ serum albumin, ⁇ ⁇ psiloglopurine, keyhole, limpet, hemocyanin, etc.
  • a method of pulling at a rate of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a daltaraldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group or a dithioviridyl group is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood, of the mammal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above.
  • Separation and purification of polyclonal antibodies can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of monoclonal antibodies.
  • the G1i1 protein, its partial peptide or a salt thereof, or the DNA encoding the protein or its partial peptide is useful as an agent for inducing bone / cartilage differentiation.
  • G1i1 protein It has the ability to express G1i1 protein, its partial peptide or its salt, Gli1 gene DNA or its complementary DNA, or its partial DNA and G1i1 protein or its partial peptide
  • Cells are compounds having an activity of controlling the expression of the Gli1 gene, compounds having an activity of controlling the activity of the promoter or enhancer of the Gli1 gene, and compounds having an action of regulating bone / cartilage differentiation, etc. Can be used for screening.
  • the antisense DNA of the G1i1 gene is used as a so-called gene therapy agent (bone-cartilage differentiation inhibitor or an agent for preventing and treating bone and hyperchondrosis) or a gene diagnostic agent (bone and cartilage). It is useful as a diagnostic agent for diseases).
  • An antibody against the G1i1 protein, its partial peptide, or a salt thereof is useful as a diagnostic agent for osteochondral disease.
  • G1i1 protein or partial peptide or a salt thereof hereinafter sometimes abbreviated as protein of the present invention
  • DNA of the present invention DNA encoding Gli1 protein or a partial peptide thereof
  • Antibodies against the Gli1 protein and the like hereinafter, sometimes abbreviated as the antibody of the present invention
  • the Gli1 protein, its partial peptide or a salt thereof, or the DNA encoding the protein or its partial peptide can be used as a drug such as a bone and cartilage differentiation inducer.
  • the physiological action of the G1i1 gene or its product due to a decrease in Gli1 protein or hedgehog in the living body, or the ineffective transmission of signals by hedgehog.
  • Gli1 protein deficiency can be expected in some patients.
  • the DNA encoding the protein of the present invention or a recombinant vector containing the DNA is administered to the patient and expressed, or (mouth) the target cells (eg, glial cells, bone marrow cells, epidermal cells, The protein of the present invention to fibroblasts, myoblasts, chondrocytes, bone cells or osteoblasts, or precursor cells or stem cells of these cells).
  • the target cells eg, glial cells, bone marrow cells, epidermal cells, The protein of the present invention to fibroblasts, myoblasts, chondrocytes, bone cells or osteoblasts, or precursor cells or stem cells of these cells.
  • the amount of Gli1 protein in the patient's body is increased by, for example, transplanting the cells into the patient to sufficiently exert transcriptional activity and bone / cartilage differentiation-inducing action. Can be done. That is, the protein of the present invention or DNA encoding the protein is useful as a safe and low toxic bone / cartilage differentiation inducer.
  • the protein of the present invention or DNA encoding the protein may be used for bone and cartilage diseases, for example, diseases in the orthopedic field (eg, fractures, osteoarthritis, osteoarthritis, cartilage damage such as meniscal damage, trauma, tumor removal, etc. Bone and cartilage defects, bone reconstruction such as spinal fusion, spinal canal enlargement, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta and achondroplasia), and diseases in the dental field (eg, Bone reconstruction such as cleft palate, mandibular reconstruction, alveolar ridge formation), osteoporosis and other prophylactic and therapeutic agents.
  • it can be used as a medicine such as a therapeutic agent for bone transplantation in the field of cosmetic surgery, and can also be used as a differentiation inducer in autologous transplantation in regenerative medicine.
  • the protein of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • DNA of the present invention a DNA encoding the protein of the present invention (hereinafter abbreviated as DNA of the present invention) Is used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent
  • the DNA of the present invention may be inserted alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus vector, or the like. Later, it can be carried out according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an adjuvant for promoting ingestion, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the protein of the present invention or (2) DNA encoding the protein may be orally administered as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, or the like, or coated with water or other pharmaceuticals, if necessary. It can be used parenterally in the form of an injection such as a sterile solution with a liquid that is acceptable or a suspension.
  • the protein of the present invention or (2) DNA encoding the protein is generally combined with known carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., which are physiologically recognized. It can be manufactured by admixing in the unit dosage form required for approved drug product practice. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like.
  • Agents for example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene daricol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM, HCO-50) You may use together with.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • prophylactic and therapeutic agents examples include, for example, buffers (for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum Albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in mammals (eg, humans, rats, mice, puppies, sheep, bush, puppies,
  • the dosage of the protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a cartilage damaged patient (60 kg), the daily About 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc.For example, in the case of injection, it is usually used, for example, in patients with cartilage damage (as 6 Okg). It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in a cartilage damage patient (as 6 O kg), one dose is required. It is about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, etc. ), About 0.01 to 3 Omg / day, preferably about 0.1 to 20 mg / day, more preferably about 0.1 to 1 Omg / day is administered by intravenous injection. It is convenient. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • Gli1 protein, its partial peptide or a salt thereof, G1i1 gene DNA or its complementary DNA or its partial DNA and a cell capable of expressing the G1i1 protein or its partial peptide are: It can be used for screening compounds having an activity of controlling the expression of the Gli1 gene, compounds having an activity of controlling the promoter of the G1i1 gene or the activity of the G1i1 gene, and the like. It can be used for screening of compounds having.
  • Cells having the ability to express the G1i1 gene include cells of warm-blooded animals (eg, humans, guinea pigs, rats, mice, chicks, egrets, bushes, hidges, eggs, sals, etc.). , Glial cells, bone marrow cells, epidermal cells, fibroblasts, myoblasts, chondrocytes, osteocytes or osteoblasts, or precursor cells, stem cells or cancer cells of these cells).
  • cells capable of differentiating into bone or cartilage or cells already showing a differentiated form are preferred.
  • Chondrocytes, fibroblasts (eg, mouse fibroblast cell line C3H10 T 1/2), myoblasts (eg, The mouse myoblast cell line C2C12) and the like are more preferable.
  • the method for screening a compound having an activity of controlling (promoting or inhibiting) the expression of the Gli1 gene or a salt thereof according to the present invention is described in detail below.
  • G1i1 gene expression is induced by signal transmission by a soluble protein called hedgehog, which induces bone formation and has an activity to promote bone and cartilage differentiation.
  • hedgehog a soluble protein called hedgehog
  • its salt has the effect of regulating (particularly promoting) the differentiation of bone and cartilage, and can be used for bone and cartilage diseases, such as those in the orthopedic field (eg, fractures, osteoarthritis, osteoarthritis, cartilage such as meniscal injury) Reconstruction of bone and cartilage defects due to injury, trauma, removal of tumor, bone reconstruction such as spinal fusion, spinal canal enlargement, etc.
  • Congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta and achondroplasia
  • diseases in the dental field eg, cleft palate, bone reconstruction such as mandibular reconstruction, alveolar plasty
  • prevention and treatment of osteoporosis It can be used as a medicine such as an agent.
  • it can be used as a medicine such as a therapeutic agent for bone transplantation in the field of cosmetic surgery, and can also be used as a differentiation inducer for autologous transplantation in regenerative medicine.
  • a compound having an activity of inhibiting the expression of the Gli1 gene or a salt thereof has an effect of regulating (particularly inhibiting) the differentiation of bone and cartilage, and is used, for example, in the treatment and prevention of bone and hyperchondrosis. Can be used as medicine.
  • a cell capable of expressing the Gli1 protein, its partial peptide or a salt thereof, the G1i1 gene DNA or its complementary DNA or its partial DNA or the G1i1 gene is expressed by the Gli1 gene expression.
  • G1i1 gene-expressing cells are cultured in the presence of a test compound, and G1i1 gene DNA or its complementary DNA or a partial DNA thereof is used to encode G1i1 protein mRNA (hereinafter referred to as G1i1 protein) , which may be abbreviated as Gli lmRNA.)
  • G1i1 protein G1i1 protein mRNA
  • Gli lmRNA G1i1 protein mRNA
  • Examples of the cells capable of expressing the G1i1 gene include known warm-blooded animal cells capable of expressing the G1i1 gene described above.
  • Known warm-blooded animal cells having the ability to express the G1i1 gene include, for example, cells capable of differentiating into bone or cartilage or cells already showing a differentiated form.
  • chondrocytes eg, mouse fibroblast cell line C3H10T1 / 2)
  • myoblast cells eg, mouse myoblast cell line C2C12
  • Culture of cells capable of expressing the G1i1 gene is performed in the same manner as in a known animal cell culture method.
  • MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)] )], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, Vol. 199, 519 (1967)], 199 medium [Processing of the American Medical Association] Proceeding of the Society for the Biologic Medicine, Vol. 73, 1 (1950)].
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the animal cell When an animal cell that expresses the G1i1 gene by contacting it with an expression inducer is used, the animal cell can be cultured in the presence or absence of the expression inducer.
  • the amount of mRNA encoding Gl l1 protein was measured by extracting RNA extracted from cells according to a known method with DNA encoding G1i1 gene (G1i1 gene DNA) or its complement. It is carried out by contacting DNA or its partial DNA, and measuring the amount of mRNA bound to the G1i1 gene DNA or its complementary DNA.
  • the amount of G1i1 mRNA bound to Gli1 gene DNA can be easily measured by labeling the DNA complementary to Gli1 gene DNA or its partial DNA with, for example, a radioisotope or a dye. it can .
  • the radioisotope for example, 32 P, 3 H, etc.
  • the amount of Gli lmRNA is determined by converting RNA extracted from cells into cDNA using reverse transcriptase, and then using the DNA encoding the G1i1 gene or its complementary DNA or its partial DNA as the primer. Depending on the PCR used, this can be done by measuring the amount of cDNA to be amplified.
  • Examples of the complementary DNA of the G1i1 gene DNA used for measuring the amount of the G1i lmRNA include a DNA (lower chain) having a sequence complementary to the G1i1 gene DNA (upper chain).
  • As the partial DNA of Gl ⁇ 1 gene DNA for example, in the base sequence of G1i1 gene DNA, about 10 to 2200 contiguous, preferably about 10 to 300, more preferably about 10 to 30 bases
  • a base sequence composed of Examples of the partial DNA of the complementary DNA of the Gli1 gene DNA include a DNA having a sequence complementary to the partial DNA of the Gli1 DNA described above. That is, for example, in the base sequence of the G1i1 gene DNA, it is complementary to a base sequence composed of about 10 to 2200 consecutive bases, preferably about 10 to 300 bases, and more preferably about 10 to 30 bases. DNA having a specific sequence.
  • primers used for PCR include a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a test compound that increases the amount of Gli1 mRNA can be selected as a compound having an activity of promoting the expression of the Gli1 gene or a compound having an activity of regulating (particularly promoting) bone / cartilage differentiation.
  • a test compound that reduces the amount of G1i1 mRNA can be selected as a compound having an activity of inhibiting the expression of the Gli1 gene or a compound having an activity of regulating (particularly inhibiting) the differentiation of bone and cartilage.
  • Examples of test compounds in the screening methods shown in the above 1 to 2 include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the present invention include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the present invention include peptides, proteins, non-
  • chondrocytes e.g., chondrocytes, fibroblasts (e.g., mouse murine fibroblast cell line C3H10T1Z2), myoblasts (e.g., mouse myoblast cell line C2C12), etc.
  • fibroblasts e.g., mouse murine fibroblast cell line C3H10T1Z2
  • myoblasts e.g., mouse myoblast cell line C2C12
  • a method for screening for a compound having a function of controlling the activity of a promoter or enhancer of Gli1 gene or a salt thereof which comprises detecting the expression of a reporter gene instead of the expression of G1i1 It is intended to provide a method for screening a compound or a salt thereof having an activity of controlling the expression of a gene.
  • a staining marker gene such as lacZ (j3-galactosidase gene) and the like are used.
  • a test compound that increases the amount of a reporter gene product can be used to increase the activity of the G1i1 gene promoter or enhancer.
  • Compounds that have the effect of controlling (especially promoting) Gli1 gene expression, and conversely, test compounds that reduce the amount of repo overnight gene product Can be selected as a compound having an activity of controlling (particularly inhibiting) the activity of the promoter or enhancer of the Gli1 gene, that is, a compound having an activity of inhibiting the expression of the Gli1 gene.
  • test compound the same compounds as described above are used.
  • Cell culture can be performed in the same manner as known animal cell culture.
  • Bone characterized by culturing cells capable of expressing the Gli1 protein or its partial peptide in the presence and absence of a test compound, and measuring the expression level of a marker gene for cartilage differentiation.
  • ⁇ To provide a method for screening a compound having a cartilage differentiation regulating (promoting or inhibiting) action or a salt thereof.
  • the type II B collagen gene is preferred as a marker gene for cartilage differentiation.
  • the measurement of the expression level of a marker gene for cartilage differentiation can be performed by, for example, SEQ ID NO: 5, 6, 7 or It can be measured by performing an RT-PCR method using a primer having the nucleotide sequence represented by 8.
  • a test compound that increases the expression level of a cartilage differentiation marker gene can be selected as a compound that has a bone / cartilage differentiation regulating (particularly promoting) action, and a test compound that decreases the expression level of a cartilage differentiation marker gene.
  • test compound the same compounds as described above are used.
  • Cell culture can be performed in the same manner as known animal cell culture.
  • ⁇ Culturing cells capable of expressing the Gli1 protein or its partial peptide in the presence and absence of the test compound, and measuring the cartilage differentiation state of the cells, for example, the expression of a cartilage differentiation marker.
  • a method for screening a compound or a salt thereof, which has a characteristic regulation (promotion or inhibition) of bone / cartilage differentiation is disclosed.
  • test compound the same compounds as described above are used.
  • Cell culture can be performed in the same manner as known animal cell culture.
  • the Gli1 protein induces the transcription of the Gli1 gene itself or the transcription of the HNF-3 / 3 gene involved in brain or lung differentiation.
  • the transcriptional activity of the Gli1 protein can be directly measured by performing the screening method of (1) or (2), or the above-described method can be performed by using a cell line capable of expressing HNF-3 ⁇ .
  • the screening kit of the present invention includes a cell capable of producing the Gli protein, a partial peptide thereof or a salt thereof, or a G1i1 gene or a product thereof, for performing the above-described screening method.
  • a cell into which a Gli1 gene expression reporter vector has been introduced (a cell transformed with a DNA in which a promoter or enhancer of the Gli1 gene is linked to the repo allele), And G1i1 gene DNA or its complementary DNA or its partial DNA.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a test compound as described above, for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, or a plant extract.
  • a compound selected from animal tissue extract, plasma, etc. which has the activity of controlling (promoting or inhibiting) the expression of the Gli1 gene or the promoter of the G1i1 gene. It is a compound having a controlling (promoting or inhibiting) action, and eventually a compound having a bone / cartilage differentiation regulating action.
  • salt of the compound examples include salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids and organic acids) and bases (eg, alkali metal salts).
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids and organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • the compound having the activity of promoting the expression of the G1i1 gene (or the compound having the activity of promoting the activity of the promoter or the enhancer of the Gli1 gene, the compound having the activity of inducing bone and cartilage differentiation) or a salt thereof is Bone and cartilage diseases, for example, diseases in the field of orthopedic surgery (e.g., fractures, osteoarthritis, osteoarthritis, cartilage damage such as meniscal injury, trauma, regeneration of bone and cartilage defects due to tumor removal, spinal fixation, etc.) Surgery, bone reconstruction such as spinal canal enlargement, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta and achondroplasia, and diseases in the dental field (eg, cleft palate, mandibular reconstruction, alveolar ridge formation) It can be used as a medicament such as an agent for preventing and treating osteoporosis and the like. In addition, it can be used as a medicine such as a therapeutic agent for bone transplantation in the field of cosmetic surgery, and can also be
  • a compound having an activity of inhibiting the expression of the Gli1 gene (or a compound having an activity of inhibiting the activity of the promoter or the enhancer of the Gli1 gene, or a compound having an activity of inhibiting bone / cartilage differentiation)
  • the salt thereof can be used as a medicament such as an agent for treating or preventing bone and hyperchondrosis.
  • the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, it can be carried out according to conventional means, for example, tablets, capsules, elixirs, microcapsules Can be administered orally or parenterally as a sterile solution, suspension, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, warm-blooded animals (eg humans, mice, rats, puppies, higgs, bush, puppies, pumas, birds, cats, cats) Nu, monkey, chimpanzee, etc .; preferably mammals).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.For example, an activity to promote the expression of the Gli1 gene for the purpose of treating cartilage damage.
  • the compound having the compound is orally administered, generally, in an adult (as a body weight of 60 kg), the compound is used in an amount of about 0.1 to about 100 mg / day, preferably about 1.0 to 5 mg / day, more preferably about 1.0 to 50 mg / day. Is administered at about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound having an activity to promote expression of the G lil gene for the purpose of treating cartilage damage may be used.
  • the compound When administered to an adult (as 6 O kg) usually in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about 1 to 1 Omg by intravenous injection. For other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a compound having the activity of inhibiting the expression of the Gli1 gene is orally administered for the purpose of treating bone and hyperchondrosis, generally, for an adult (assuming a body weight of 6 O kg), it is necessary to treat the compound daily.
  • the compound is administered in about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration target, target disease, etc., for example, the expression of G1i1 gene is inhibited for the treatment of bone and hyperchondrosis.
  • a compound having an activity of administering to a subject when administered to an adult (as 6 O kg) in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg per day. More preferably, about 0.1 to 1 Omg is administered by intravenous injection. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • Antisense nucleotide-containing drug (bone / cartilage differentiation inhibitor) or Diagnostic agent (Bone and cartilage disease diagnostic agent)
  • the antisense nucleotide (eg, antisense DNA) used in the present invention that can complementarily bind to the DNA used in the present invention and suppresses the expression of the DNA has low toxicity, Since the function of the protein used in the present invention or the function of the DNA used in the present invention can be suppressed, it can be used, for example, as an agent for treating and / or preventing bone and hyperchondrosis.
  • the antisense nucleotide When used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent, it can be formulated and administered according to known methods.
  • the antisense nucleotide when used, the antisense nucleotide is inserted alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector.
  • an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector.
  • warm-blooded animals e.g., mammals, preferably humans, mice, rats, egrets, higgins, bushes, sea lions, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • warm-blooded animals e.g., mammals, preferably humans, mice, rats, egrets, higgins, bushes, sea lions, horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • it can be administered orally or parenterally.
  • the antisense nucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake
  • the dosage of the antisense nucleotide varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.For example, when the antisense nucleotide used in the present invention is orally administered for the purpose of treating bone and hyperchondrosis. About 0.1 to 100 mg of the antisense nucleotide is administered to an adult (body weight of 60 kg) daily.
  • the antisense nucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or the state of expression of the DNA used in the present invention in tissues or cells.
  • double-stranded RNA, lipozyme, decoy oligonucleotide and the like can also suppress the expression of the above-mentioned DNA, and can be used in vivo in the protein used in the present invention or in the present invention. Because it can suppress the function of DNA, it can be used, for example, in the prevention and treatment of bone, hyperchondrosis, etc. Can be used.
  • the double-stranded RNA can be obtained by designing based on the sequence of the DNA used in the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • Lipozyme can be obtained by designing a decoy oligonucleotide obtained by designing based on a DNA sequence used in the present invention in accordance with a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, p. 221, 2001). (Eg, The Journal of Clinical Investigation, vol. 106, p. 1071, 2000) and can be obtained by designing based on the sequence of the DNA used in the present invention. Since Gli1 is a transcription factor, a decoy containing a G1i1 binding sequence G1i1 binding oligonucleotide (e.g., 5′-GACCACC CA-3 ′ (Kinzler KW, Vogelstein B., Mol Cell Biol 1990 Feb. ; 10 (2): Oligonucleotides containing 634-42)] can be used effectively.
  • a decoy containing a G1i1 binding sequence G1i1 binding oligonucleotide e.g., 5′-GACCACC CA-3
  • the DNA or antisense DNA of the present invention can be used in mammals (eg, humans, rats, mice, egrets, higgs, bushes, pests, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • mammals eg, humans, rats, mice, egrets, higgs, bushes, pests, cats, dogs, monkeys, etc.
  • Abnormalities (genetic abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the protein or its partial peptide can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, or increase in the DNA or mRNA.
  • it is useful as a diagnostic agent for gene expression such as overexpression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA or the antisense DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, 874-879). Page (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Procedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol.
  • bone and cartilage diseases for example, diseases in the field of orthopedic surgery ( Examples: bone fractures, osteoarthritis, osteoarthritis, cartilage damage such as meniscal injury, trauma, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta, achondroplasia), diseases in the dental field (eg, cleft palate) It can be diagnosed that the disease is likely to be osteoporosis or the like or is likely to suffer in the future.
  • the antibody of the G1i1 protein, its partial peptide, or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention) can specifically recognize the protein of the present invention or the like. It can be used for quantification of the protein of the present invention in a liquid, particularly for quantification by sandwich immunoassay. That is, the present invention, for example,
  • the protein and the like of the present invention can be measured using a monoclonal antibody against the protein and the like of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention). Alternatively, detection by tissue staining or the like can be performed.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the measurement method using an antibody against the protein or the like of the present invention is not particularly limited, and the amount of the antibody, the antigen, or the antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (eg, the mass of the protein) in the liquid to be measured is determined.
  • Any measurement method may be used as long as it is detected by chemical or physical means and calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioactive isotope for example, [ 125 I], [ 13i I], [ 3 H], [ i4 C] and the like are used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • 3-galactosidase, ⁇ _darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing or immobilizing a protein or enzyme may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass are used.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction the labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary and secondary reactions are reversed They may be performed in order, simultaneously, or at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the protein or the like. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein, the antibody used in the primary reaction is preferably the C-terminal Other than the above, for example, an antibody that recognizes the N-terminal is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephelometry method.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen is separated from (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody.
  • BZF separation Measure the amount of any of B and F, and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is carried out using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the above antibody or an immobilized antibody is used as the first antibody.
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the protein and the like of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • bone / cartilage disease for example, a disease in the orthopedic field (eg, fracture, osteoarthritis) Osteoarthritis, cartilage damage such as meniscal damage, trauma, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta, achondroplasia), diseases in the dental field (eg, cleft palate), osteoporosis, etc.
  • a disease in the orthopedic field eg, fracture, osteoarthritis
  • Osteoarthritis e.g., cartilage damage such as meniscal damage, trauma, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta, achondroplasia
  • diseases in the dental field eg, cleft palate
  • osteoporosis etc.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells Can be used for such purposes.
  • the present invention has a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention).
  • a non-human mammal is provided.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells containing spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • a calcium phosphate method, an electric pulse method it can be produced by transferring the target DNA by the lipofection method, agglutination method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, or the like.
  • the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a known cell fusion method.
  • mice for example, Japanese lions, bushes, higgies, goats, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are used.
  • the ontogeny and biological cycle are relatively short, and rodents that are easy to breed, especially mice (for example, as pure strains, as hybrid strains such as C57 BLZ6 strain, DBA2 strain, etc.) , B6C3F 1 system, BDF 1 system, B6D2F 1 system, BALBZc system, ICR system, etc.) or rats (eg, Wistar, SD, etc.) are preferable.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal.
  • mutant DNA of the present invention DNA having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. DNA that has been used is used, and also includes abnormal DNA.
  • the abnormal DNA means a DNA expressing an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA expressing a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • a promoter capable of being expressed in animal cells For example, when the human DNA of the present invention is transferred, it is derived from various mammals having the DNA of the present invention having a high homology with the DNA (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.).
  • the present invention is achieved by microinjecting the DNA construct (eg, a vector, etc.) to which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA transgenic mammal that highly expresses DNA can be created.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or Animal viruses such as baculovirus are used.
  • E. coli A plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from Bacillus subtilis, or a plasmid derived from yeast is preferably used.
  • promoters that regulate the above-mentioned DNA expression include: (1) promoters of DNA derived from viruses (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, polio virus, etc.); Promoters derived from mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hams, rats, mice, etc.), for example, albumin, insulin II, peroplacin II, erasase, erythropoietin, endothelin, muscle creatures Atin kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin Kl, 10 and 1:14, collagen type I and II, cyclic AMP-dependent protein kinase ] 3 I-subunit, gyst Fins, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial sodium diuretic factor, end
  • the vector preferably has a sequence that terminates the transcription of the target mRNA in a DNA transgenic mammal (generally referred to as Yuichi Minei Yuichi).
  • the sequence of each DNA derived from mammals can be used, and preferably, Simian virus SV40 / Mine / Minute is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, and a part of the intron of eukaryotic DNA are translated to the 5 'upstream of the promoter region and the promoter region for the purpose of further expressing the target exogenous DNA. Linking between regions or 3 'downstream of the translation region is also possible depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention includes liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from various mammals (for example, humans, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.). Origin and complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cells and fibroblast-derived RNA as whole or part of genomic DNA from various commercially available genomic DNA libraries Can be obtained as In addition, an exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional genetic engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells Means that.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after transfer of DNA indicates that all the offspring of the animal produce the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. It means having extra.
  • the progeny of this type of animal that inherited the exogenous DNA of the present invention obtained homozygous animals that had the introduced DNA in excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells and that had the introduced DNA in both homologous chromosomes. By breeding the male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA in excess.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the function of endogenous normal DNA, thereby ultimately obtaining the protein of the present invention.
  • Hyperfunction eg, hypertension such as transcription, induction of bone and cartilage differentiation
  • the normal DNA-transferred animal of the present invention is used to elucidate the hyperfunction of the protein of the present invention and the pathological mechanism of a disease associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it is also used for a screening test for a therapeutic drug for a disease associated with the protein of the present invention. It is possible.
  • non-human mammals having the foreign abnormal DNA of the present invention should be stably reared in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably retained by mating. Can be done.
  • the target exogenous DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • the DNA construct with the promoter can be prepared by a usual genetic engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing the male and female animals, it is possible to breed so that all offspring have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high level of expression of the abnormal DNA of the present invention, and eventually impairs the function of the protein of the present invention by inhibiting the function of endogenous normal DNA. It may be active refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention (dominant negative activity). Action).
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used in a therapeutic drug screening test for a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. Is also available.
  • ⁇ ⁇ Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of its antibody are considered. Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of a disease related to the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention, and the like. More detailed pathological findings in each organ of the protein-related disease model can be obtained, contributing to the development of new treatment methods and the research and treatment of secondary diseases caused by the disease. . In addition, after removing each organ from the DNA-transferred animal of the present invention, shredding it, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells by using a protease such as trypsin. It is. Furthermore, the protein of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism can be examined, and its abnormality can be examined. It is an effective research material for elucidation.
  • the DNA transgenic animal of the present invention in order to use the DNA transgenic animal of the present invention to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including a refractory inactive type of the protein of the present invention, Using a quantitative method or the like, it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease.
  • using the DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention it is possible to examine and develop a method for treating DNA associated with the protein of the present invention.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal deficient in the expression of DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene is transformed into the DN of the present invention.
  • a reporter gene eg, a / 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • Non-human mammal according to item (6) which can be expressed under the control of a promoter for A.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are defined as artificially mutating the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal to suppress the DNA expression ability.
  • the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the knockout DNA of the present invention).
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method for artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA sequence by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells of the present invention in which DNA is inactivated include:
  • the DNA of the present invention possessed by the target non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or 1acZ (jS-galactosidase gene), cat (A chloramphenicol acetyltransferase gene) to disrupt the exon function by inserting a reporter gene or the like, or to terminate the transcription of the gene in the intron between the exons (for example, a poly (DNA) sequence).
  • a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or 1acZ (jS-galactosidase gene), cat (A chloramphenicol acetyltransferase gene) to disrupt the exon function by inserting a reporter gene or the like, or to terminate the transcription of the
  • a signal, etc.) to prevent complete mRNA synthesis, resulting in gene disruption A DNA strand having a DNA sequence constructed as described above (hereinafter abbreviated as a “getting vector”) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cells are subjected to the DNA of the present invention.
  • a DNA sequence constructed as described above hereinafter abbreviated as a “getting vector”
  • Southern hybridization analysis using a DNA sequence in the vicinity as a probe or DNA sequence on the targeting vector and targeting vector The DNA can be obtained by analyzing the DNA sequence of a nearby region other than the DNA of the present invention used in the evening production by the PCR method using primers and selecting the knockout ES cells of the present invention.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or the methods described in the known methods of Evans and Kauima may be used. A newly established one may be used. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used. However, since the immunological background is not clear, an alternative pure immunogenic genetic background is used. For example, for the purpose of obtaining ES cells in which C57BL / 6 mice and C57BL / 6 mice were obtained, the number of eggs collected was reduced by crossing with DBA / 2. Those established using F1) of / 6 and DBAZ2 can also be used favorably.
  • BDF1 mice have the advantage of high number of eggs collected and robust eggs.
  • C57BLZ6 mice are used as background, the ES cells obtained using them have This method can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BLZ6 mice by backcrossing with C57BL / 6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • a method for determining the sex of ES cells for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be mentioned.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture
  • the primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between males and females, and the early stages of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the number of chromosomes in the obtained ES cells is 100% of the normal number.
  • normal cells for example, in mice
  • It is desirable to clone again into cells with 2 n 40 chromosomes.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative properties, but they must be carefully subcultured because they tend to lose their ability to generate individuals.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air
  • LIF 1-1000 OU / m'l
  • oxygen preferably 5% oxygen, 5% carbon dioxide, 90% air
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin
  • 1-5 mM EDTA (preferably, about 0.1% trypsin / ImM EDTA) is treated to form a single cell, which is then seeded on a newly prepared feeder cell. Such subculture is usually performed every 11 to 13 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells can be cultured in monolayers at high densities or in suspension cultures to form cell clumps under appropriate conditions to produce various types of cells such as parietal, visceral, and cardiac muscles.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature, Vol. 292, p. 154, 1981; GR Martin Proceedings of National Academy of Sciences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Ob. 87, 27, 1985
  • DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful in the cytobiological examination of the protein of the present invention in the mouth of in vivo.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA amount of the animal using a known method and indirectly comparing the expression levels.
  • the non-human mammal those similar to the aforementioned can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be prepared, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the targeting vector into the DNA of the present invention. Is knocked out by homologous recombination in which the DNA sequence in which DNA is inactivated replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination. be able to.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be compared with a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe. It can be determined by analysis by PCR using the DNA sequence of a nearby region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used as the primer vector as a primer.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell the cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated is cloned by homologous gene recombination, and the cell line is cloned at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudo-pregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both a cell having a normal DNA locus of the present invention and a cell having an artificially altered DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention, and mated with individuals deficient in the hetero-expression of the protein of the present invention.
  • a homozygous deficient individual can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a getter vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of the egg cell by microinjection.
  • a transgenic non-human mammal of the present invention by selecting those having a mutation at the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
  • the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out may be subjected to subculture in a normal breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal individual obtained by mating. it can.
  • the germline can be obtained and maintained according to a standard method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are very useful for producing a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. This model is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be a disease caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention, for example, a bone / cartilage disease, for example, a disease in the orthopedic field (eg, a fracture, a osteoarthritis).
  • a bone / cartilage disease for example, a disease in the orthopedic field (eg, a fracture, a osteoarthritis).
  • Osteoarthritis, cartilage damage such as meniscal injury, trauma, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta, achondroplasia
  • diseases in the dental field eg, cleft palate
  • osteoporosis It can be used to screen for compounds that have therapeutic and / or preventive effects on such diseases.
  • the present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal.
  • Non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method examples of the animal include the same as described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are used as indices.
  • the test compound can be tested for its therapeutic and prophylactic effects.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention may be treated with a bone / cartilage damage treatment (for example, a fracture is performed, and a test compound is administered before or after the bone / cartilage damage treatment, and the expression level of cartilage differentiation marker, weight change, and the like of the animal are measured over time.
  • a bone / cartilage damage treatment For example, a fracture is performed, and a test compound is administered before or after the bone / cartilage damage treatment, and the expression level of cartilage differentiation marker, weight change, and the like of the animal are measured over time.
  • the cartilage differentiation marker of the test animal increases by about 10% or more, preferably about 30% or more, and more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on cartilage damage.
  • the compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound selected from the test compounds described above, and is a disease caused by deficiency or damage of the protein or the like of the present invention, for example, a bone / cartilage disease, for example.
  • Diseases in the orthopedic field eg, bone fractures, osteoarthritis, osteoarthritis, cartilage damage such as meniscal injury, trauma, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta, achondroplasia
  • dental field It has a therapeutic and preventive effect on diseases such as the disease (eg, cleft palate) and osteoporosis, and can be used as a drug such as a safe and low-toxic therapeutic and preventive agent for the disease.
  • compounds derived from the compounds obtained by the above screening can also be used. You.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal).
  • a physiologically acceptable acid addition salt is preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the drug containing the compound that regulates the activity of the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, mammals (e.g., humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, dogs, bushus, horses, horses, cats, dogs, Monkeys).
  • mammals e.g., humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, dogs, bushus, horses, horses, cats, dogs, Monkeys.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like.
  • the compound is orally administered for the purpose of treating cartilage damage, it is generally required for an adult (body weight 60%).
  • the compound is administered from about 0.1 to about L Omg, preferably from about 1.0 to 5 Omg, more preferably from about 1.0 to 2 Omg per day.
  • the single dose of the compound may vary depending on the administration target, target disease, etc.
  • the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (6 O kg ), About 0.01 to 3 Omg of the compound per day, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. It is convenient to administer. In the case of other animals, the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the present invention relates to a compound which promotes the activity of a promoter for the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention and detecting the expression of a reporter gene.
  • a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention and detecting the expression of a reporter gene.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention in which the DNA of the present invention introduces a repo overnight gene. And those in which the repo overnight gene can be expressed under the control of the promoter for the DNA of the present invention.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • a / 3-galactosidase gene (1 ac Z), a soluble alkaline phosphatase gene or a luciferase gene is suitable.
  • the repo overnight gene is under the control of a promoter for the DNA of the present invention, the repo overnight gene By tracing the expression of the substance encoded by the promoter, the activity of the promoter can be detected.
  • a tissue that originally expresses the protein of the present invention may JS-galactosidase is expressed instead of the protein of the invention. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a substrate for / 3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl / 3 / 1-galactopyranoside (X-gal), it is easy to perform the staining.
  • a reagent serving as a substrate for / 3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl / 3 / 1-galactopyranoside (X-gal)
  • X-gal 1-galactopyranoside
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour at about ° C, the] -galactosidase reaction can be stopped by washing the tissue specimen with ImM EDTA / PBS solution, and the coloration can be observed. Further, mRNA encoding 1acZ may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and has a promoter activity for DNA of the present invention. Is a compound that promotes or inhibits
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). And particularly preferably a physiologically acceptable acid addition salt.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids
  • bases eg, organic acids
  • a physiologically acceptable acid addition salt examples include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, prop
  • the compound of the present invention which promotes the promoter activity against DNA or a salt thereof can promote the expression of the protein of the present invention and promote the function of the protein.
  • Diseases in the field eg, bone fractures, osteoarthritis, osteoarthritis, cartilage damage such as meniscal injury, trauma, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta, achondroplasia
  • diseases in the dental field e.g, it is useful as a safe and low toxic therapeutic / prophylactic agent for diseases such as cleft palate
  • osteoporosis e.g, a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity and, for example, mammals (e.g., humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs) , Monkeys, etc.).
  • mammals e.g., humans, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs
  • Monkeys etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like.
  • a compound that promotes the overnight activity of the promoter of DNA of the present invention against DNA of the present invention When the compound is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 0.1 to 100 mg of the compound per day is used. Approximately 1.0 to 20 mg is administered.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • a compound that promotes the promoter activity of the DNA of the present invention for the purpose of treating cartilage damage may be used.
  • the compound When administered to an adult (as 6 O kg) usually in the form of an injection, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 O mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg per day. It is convenient to administer about mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection. For other animals, the dose can be administered in terms of 6 O kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by expression deficiency or the development of preventive and therapeutic drugs.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene). Creating an introduced animal) will allow the protein to be specifically synthesized and its effects on the living body to be studied. Furthermore, by linking an appropriate reporter gene to the above-mentioned promoter portion and establishing a cell line in which this is expressed, a low-molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the ability of the protein of the present invention itself to be produced in the body. Can be used as a search system. By analyzing a part of the promoter, it is also possible to find a new cis element and a transcription factor binding thereto.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below. If there is an optical isomer of the amino acid, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • sequence numbers in the sequence listing of the present specification show the following sequences.
  • FIG. 4 shows primers for PCR that can be used for measuring the amount of G 1 i 1 mRNA (Examples 4 and 5)
  • mouse G1i1 cDNA was obtained by PCR using PfuTurbo (Stratagene) DNA polymerase. The obtained fragment was cloned into a pCRb1unt (Invitrogen) vector, and the nucleotide sequence was determined.
  • the obtained gene had 24 different amino acid levels from AF 026305, a known mouse gene, and 2 different sequences from AB 025922 (DNA sequence: SEQ ID NO: : 9 (specifically, the nucleotide sequence of mouse G1i1 gene is the nucleotide sequence from the 213nd A to the 3545th C of SEQ ID NO: 9), the amino acid sequence of the protein: SEQ ID NO: 10 and Figure 1 ⁇ .
  • this vector was digested with Not I and Hind III, and an animal cell expression vector was prepared by subcloning the G1i1 fragment into pcDNA3.1 (Invitrogen).
  • Sc 1 era X is reported to be involved in bone and cartilage differentiation (Liu, Y. et al. J. Biol. Cem. (1997) 272, 29880-29885), but details of its function Is a transcription factor that is often unknown.
  • Mouse ScEleraXiscDNA was obtained from the mouse library by PCR. The obtained fragment was cloned into a pCRb1unt (Invitrogen) vector, digested with BamHI-XhoI, and subcloned with a Scalaxis fragment into pcDNA3.1 (Invitrogen). Thus, an animal cell expression vector was prepared.
  • the mouse fibroblast cell line C3H10T1Z2 and the mouse myoblast cell line C2C12 were purchased from ATCC and cultured in DMEM (GI BCO) containing 10% FBS.
  • Normal human chondrocytes were purchased from Toyobo and cultured in a cell culture dish (Falcon) using Chondrocytes growth medium contained in a human normal chondrocyte culture kit.
  • Chondrocytes growth medium contained in a human normal chondrocyte culture kit.
  • these cells are cultured in a dish, they are dedifferentiated, and the type I B collagen gene, which is a chondrocyte marker, is no longer expressed.
  • RT-PCR was performed on the second day after transfection of the G1i1 expression vector or pCDNA3.1 into dedifferentiated human normal chondrocytes using the primers shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, and the cells were analyzed.
  • COL 2 A1 was not expressed at all, but by introducing the Gli1 gene, the expression of COL 2 A1 was observed.
  • Example 4 Effects of Sc 1 e ra xis gene on cartilage differentiation by cartilage differentiation of mouse C3H10T 1Z2 cells
  • the ScEraxis gene was transfected.
  • RT_PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, and the expression of the type II B collagen gene (Co12a1), a marker for cartilage differentiation, was expressed in a vector. It was about twice as high as when pcDNA3.1 was introduced.
  • the expression of Gli1 gene by Sc 1 era X in situ gene expression was similarly observed using the primers shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and the expression of about 2.5 when pCDNA3.1 was introduced was obtained. It was found to be doubled.
  • C3H10T1Z2 cells were used to search for low-molecular compounds that induce G1i1 expression.
  • THFA 9- (2-Tetraiiydrofuryl) adenine
  • the G1i1 gene or its product has an activity to induce bone or cartilage differentiation
  • diseases in the field of orthopedic surgery eg, fractures, osteoarthritis, osteoarthritis, cartilage damage such as meniscal damage, trauma, tumors
  • bone reconstruction such as spinal fusion, spinal canal enlargement, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta and achondroplasia
  • diseases in the dental field e.g, bone reconstruction such as cleft palate, mandibular reconstruction, alveolar ridge formation
  • bone reconstruction such as cleft palate, mandibular reconstruction, alveolar ridge formation
  • It can also be used as a therapeutic agent for bone transplantation in the field of cosmetic surgery and as a differentiation inducer in autologous transplantation in regenerative medicine.
  • a screening method using a Gli1 protein or the like, a screening method using cells capable of expressing the Gli1 gene, or a screening method using a repo overnight gene-expressing transformant includes the Gli1 gene A compound having an activity of controlling (promoting or inhibiting) the expression of Gli1 gene, a compound having an activity of controlling (promoting or inhibiting) the activity of Gli1 gene or enhansa, regulating the differentiation of bone and cartilage (promoting Or a compound having an inhibitory action or a salt thereof.
  • Bone / cartilage differentiation can be induced by enhancing or activating the action (eg, transcriptional activity) of the G1i1 gene or its product using such a compound.
  • Compounds that have the activity of promoting the expression of the i1 gene have bone or cartilage-inducing activity, and therefore are used in orthopedic diseases (eg, cartilage damage such as fractures, osteoarthritis, osteoarthritis, meniscal damage, etc.) , Trauma, resection of bone and cartilage defects due to removal of tumor, bone reconstruction such as spinal fusion, spinal canal enlargement, congenital bone and cartilage diseases such as osteogenesis imperfecta, achondroplasia) or dental area It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases (eg, cleft palate, bone reconstruction such as mandibular reconstruction, alveolar plasty) and osteoporosis. It can also be used as a therapeutic agent for bone transplantation in the field of cosmetic surgery and as a differentiation inducer in autologous transplantation in regenerative medicine.
  • orthopedic diseases eg, cartilage damage such as fractures, osteoarthritis, osteoarthritis, meniscal damage, etc.
  • Trauma resection
  • a compound having an activity of inhibiting the expression of the G1i1 gene and an antisense DNA of the Gli1 gene which can be obtained by the above screening, may be used as an agent for preventing or treating bone and hyperchondrosis, for example. Can be.

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Description

明細書
G 1 i 1遺伝子の用途 技術分野
本発明は G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を用いた G 1 i 1遺伝子 の発現を制御 （促進または阻害） する活性を有する化合物またはその塩のスクリ —ニング方法、 該スクリーニング方法を用いて得られうる化合物またはその塩、 および該化合物の用途に関する。 背景技術
グリア芽腫遺伝子 （G 1 i 1、 G 1 i 2および G 1 i 3 ) のうち、 G l i l遺 伝子の産物である G l i 1タンパク質は zinc f ingerを有する転写因子に属し、 ショウジヨウバエの転写因子 C i (Cubi tus interruptus) の脊椎動物における ホモログとされている （Aza- Blanc, P. et al. , Trends Genet. (1999) 15, .45 8-462) 。 ショウジヨウバエ C iの機能については研究が進んでおり、 C iが誘 導する分子などが報告されている （McMahon, A. P. et al. , Cel l (2000) 100, 1 85-188) 。 G l iタンパク質については、 3種の G l iタンパク質すべてが zinc f inger領域を介して共通な配列に結合すること、 G l i 3タンパク質が直接 G 1 i 1遺伝子に含まれるプロモーター領域に結合し、 その転写を誘導しているこ となどが報告されてはいるが、 G 1 i 1タンパク質の機能はショウジヨウバエの C iタンパク質の機能からの類推が主となっており、 誘導分子などについても未 知の点が多い。
一方、 G l i 1遺伝子発現はヘッジホッグ （hedgehog) と呼ばれる可溶性分泌 タンパク質によるシグナル伝達によって誘導されるとされている （Dai，P. et al . , J. Biol. C em. (1999) 274, 8143-8152) 。 ヘッジホッグファミリ一は昆虫 から脊椎動物までを含む多くの動物種における形態形成の鍵として注目されてい る一群のタンパク因子であり、 例えば Sonic hedgehogの活性部位である N末端ド メインを強制発現させた繊維芽細胞をヌードマウスに移植すると異所性骨形成が 誘導されることが報告されている (Kinto, N. et al. , FEBS let t. (1997) 404， 319-323) 。 これらの点でヘッジホッグタンパク質は様々な骨 ·軟骨障害、 骨 ' 軟骨疾患の治療、 予防に有効と考えられるが、 天然には微量にしか存在せず、 治 療に使用するべく大量に入手するためには組み換え型タンパク質を生産する必要 がある。 一般的に組み換え型タンパク質の生産は低分子化合物の生産よりはるか に多くの費用を要し、 またタンパク質という特性から、 医薬品としての物性、 投 与法にも制約がある。
骨 ·軟骨組織は未分化間葉系細胞等の多分化能を有する細胞の骨 ·軟骨前駆細 胞への分化決定の後、 骨 ·軟骨細胞への分化、 増殖、 骨 ·軟骨基質の合成といつ た一連の過程を経て形成される。 胎生期や骨折治癒などの骨形成過程においては 一般に軟骨分化が骨形成に先立つて起こることから、 軟骨分化促進は骨分化促進 にもつながる。 障害を受けた骨 ·軟骨組織の修復や誘導を要する疾患、 あるいは 過形成が問題となっている疾患はこれらのいずれかの過程が破綻していると考え られるが、 これらを治癒に向わせる安価で、 効果的な優れた医薬品の創製が切望 されていた。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、 G l i 1の機 能解析研究において G 1 i 1を強制発現させると、 軟骨マ一カーの発現が亢進す ることを見出し、 さらには例えば S c 1 e r a i sなどのヘッジホッグシグナ ルに関与するとの報告がない転写因子の遺伝子を強制発現させることによつても G 1 i 1誘導は可能であることなどからヘッジホッグタンパク質を用いなくとも G 1 i 1発現の制御が可能であることを見出した。
さらにへッジホッダレセプターに直接作用するものではない一部の既存低分子 化合物が G l i 1の発現を誘導し、 ひいては軟骨マーカー遺伝子の発現をも誘導 することを見出した。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重 ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は
( 1 ) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩を含有する骨 ·軟 骨分化誘導剤、 (2) G 1 i 1タンパク質が配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 1 3、 配列番号： 15または配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と同一もしく は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である前記 （1) 記載の剤 (3) G 1 i 1タンパク質が配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 1 3、 配列番号： 15または配列番号： 17で表されるアミノ酸配列を含有する夕 ンパク質である前記 （1) 記載の剤、
(4) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩を含有する骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症または 骨粗鬆症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再建剤または骨移植 治療剤、
(5) G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAを含有 する骨 ·軟骨分化誘導剤、
(6) DN Aが配列番号： 9、 配列番号： 12、 配列番号： 14、 配列番号： 16または配列番号： 18で表される塩基配列を含有する前記 （5) 記載の剤、
(7) G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAを含有 する組換えベクターを含有する前記 （5) 記載の剤、
(8) G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAを含有 する骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形 成症または骨粗鬆症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再建剤ま たは骨移植治療剤、
(9) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の有効量を哺乳動 物に投与することを特徴とする骨 ·軟骨分化誘導方法、
(10) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の有効量を哺乳 動物に投与することを特徴とする骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外 傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療方法、
(11) 骨 ·軟骨分化誘導剤を製造するための G l i 1タンパク質、 その部分 ぺプチドまたはそれらの塩の使用、
(12) 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟 骨無形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再 建剤または骨移植治療剤を製造するための G 1 i 1タンパク質、 その部分べプチ ドまたはそれらの塩の使用、
(13) G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAの有 効量を哺乳動物に投与することを特徴とする骨 ·軟骨分化誘導方法、
(14) G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAの有 効量を哺乳動物に投与することを特徴とする骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟 骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療方法、
(15) 骨 ·軟骨分化誘導剤を製造するための G 1 i 1タンパク質またはその 部分ペプチドをコードする DN Aの使用、
(16) 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟 骨無形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再 建剤または骨移植治療剤を製造するための G 1 i 1タンパク質またはその部分べ プチドをコ一ドする DNAの使用、
(17) 配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 13、 配列番号： 15 または配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DN Aの 塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス D NAを含有する骨 ·軟骨分化阻害剤、
(18) 配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 13、 配列番号： 15 または配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNA、 または該 DNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有す るアンチセンス DNAを含有する骨 ·軟骨形成過剰症の予防 ·治療剤、
(19) 配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 13、 配列番号： 15 または配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAの 塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するァンチセンス D NAを含有する骨 ·軟骨疾患の診断剤、 (20) 配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 13、 配列番号： 15 または配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNA、 または該 D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有す るアンチセンス DNAを用いることを特徴とする骨 ·軟骨疾患の診断方法、
(21) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の抗体を含 有する骨 ·軟骨疾患の診断剤、
(22) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の抗体を用 いることを特徴とする骨 ·軟骨疾患の診断方法、
(23) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を用いるこ とを特徴とする骨 ·軟骨分化調節作用を有する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(24) G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する 細胞を用いることを特徴とする前記 （23) 記載のスクリーニング方法、
(25) G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する 細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、 軟骨分化のマーカー遺伝子 の発現量を測定することを特徴とする前記 （23) 記載のスクリーニング方法、
(26) 軟骨分化のマーカ一遺伝子が I I型 Bコラーゲン遺伝子である前記 （ 25) 記載のスクリーニング方法、
(27) G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する 細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、 細胞の軟骨分化状態を観察 することを特徴とする前記 （23) 記載のスクリーニング方法、
(28) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を含有する ことを特¾ [とする骨 ·軟骨分化調節作用を有する化合物またはその塩のスクリー ニング用キッ卜、
(29) 前記 （23) 〜 （27) 記載のスクリーニング方法、 または前記 （2 8) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、 骨 ·軟骨分化調節作用 を有する化合物またはその塩、
(30) 前記 （29) 記載の化合物またはその塩を含有する骨 ·軟骨分化調節 剤、
(31) 前記 （29) 記載の化合物またはその塩を含有する骨折、 変形性関節 症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症、 骨粗鬆症または 骨 ·軟骨形成過剰症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再建剤ま たは骨移植治療剤、
(32) 前記 （29) 記載の化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与す ることを特徴とする骨'軟骨疾患の予防 ·治療方法、
(33) 前記 （29) 記載の化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与す ることを特徴とする骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不 全症、 軟骨無形成症、 骨粗鬆症または骨 ·軟骨形成過剰症の予防 ·治療方法、
(34) 骨'軟骨疾患の予防'治療剤を製造するための前記 （29) 記載の化合 物またはその塩の使用、
(35) 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟 骨無形成症、 骨粗鬆症または骨 ·軟骨形成過剰症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損 部の再生治療剤、 骨再建剤または骨移植治療剤を製造するための前記 （29) 記 載の化合物またはその塩の使用、
(36) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の作用を増強ま たは活性化することを特徴とする骨 ·軟骨分化誘導方法、
(37) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の作用を増強ま たは活性化することを特徴とする骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外 傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療方法、
(38) G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を用いることを特徴とす る G l i 1遺伝子の発現を制御する活性を有する化合物またはその塩のスクリー ニング方法、
(39) G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下お よび非存在下に培養し、 G l i 1遺伝子 DNAもしくはその相補 DNAまたはそ の部分 DNAを用いてそれぞれの G 1 i 1タンパク質をコードする mRNAの量 を測定することを特徴とする前記 （38) 記載のスクリーニング方法、
(40) G 1 i 1遺伝子のプロモー夕一もしくはェンハンサーをレポーター遺 伝子に連結させた DN Aで形質転換した細胞を試験化合物の存在下および非存在 下に培養し、 それぞれの該レポ一夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする G 1 i 1遺伝子のプロモー夕一もしくはェンハンサ一の活性を制御する作用を有 する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(41) G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞が骨または軟骨への分化 能を有する細胞あるいは既に分化形態を示している細胞である前記 （38) 記載 のスクリーニング方法、
(42) G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を含有することを特徴と する G l i 1遺伝子の発現を制御する活性を有する化合物またはその塩のスクリ —ニング用キット、
(43) G 1 i 1遺伝子のプロモーターもしくはェンハンサ一をレポーター遺 伝子に連結させた DNAで形質転換した細胞を含有することを特徴とする G 1 i 1遺伝子のプロモー夕一もしくはェンハンサ一の活性を制御する作用を有する化 合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(44) 前記 （38) 記載のスクリーニング方法、 または前記 （42) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる、 G l i 1遺伝子の発現を制御する 活性を有する化合物またはその塩 （但し、 配列番号： 20または配列番号： 22 で表される G 1 i 3遺伝子またはその産物 （配列番号： 19または配列番号： 2 1) を除く） 、
(45) 前記 （40) 記載のスクリーニング方法、 または前記 （43) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られうる、 G l i 1遺伝子のプロモーターも しくはェンハンサ一の活性を制御する作用を有する化合物またはその塩、
(46) 前記 （44) または （45) 記載の化合物またはその塩を含有する医
(47) 前記 （44) または （45) 記載の化合物またはその塩を含有する骨 •軟骨疾患の予防 ·治療剤、
(48) 前記 （44) または （45) 記載の化合物またはその塩の有効量を哺 乳動物に投与することを特徴とする骨 ·軟骨疾患の予防'治療方法、
(49) 骨 ·軟骨疾患の予防 .治療剤を製造するための前記 （44) または ( 4 5 ) 記載の化合物またはその塩の使用、
( 5 0 ) G 1 i 1遺伝子の発現を増強または活性化することを特徴とする骨 · 軟骨分化誘導方法、
( 5 1 ) G 1 i 1遺伝子の発現を増強または活性化することを特徴とする骨折 、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症また は骨粗鬆症の予防 ·治療方法などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は一文字表記によるマウス G 1 i 1のアミノ酸配列を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明において G l i 1遺伝子とは Sasaki et al. Development (1999) 129, 3915-3924、 Kinzler, KW. et al. , Science (1987) 236, 70 - 73などに記載され ている公知の遺伝子であり、 マウスの遺伝子は A F 0 2 6 3 0 5、 A B 0 2 5 9 2 2、 ヒトの遺伝子は X 0 7 3 8 4として G e n B a n kに各々対応するァミノ 酸配列とともに登録されている。
また、 G l i 1遺伝子の多型についての研究がなされ、 配列番号： 1 4、 1 6 および 1 8 (対応するアミノ酸配列はそれぞれ配列番号： 1 3、 1 5および 1 7 ) で表される、 ヒト G l i 1遺伝子上に 3箇所の塩基置換が存在していることが 報告されている （J. Invest. Dermatol. (2000) 115, 328-329) 。
本発明において 「G 1 i 1タンパク質」 としては、 配列番号： 1 0、 1 1、 1 3、 1 5または 1 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するタンパク質を挙げることができる。
G 1 i 1タンパク質は、 例えば、 温血動物 （例えば、 ヒト、 モルモット、 ラッ ト、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サル等） のあらゆる細胞 (例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 |S細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥ ム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊 維細胞、 筋細胞、 筋芽細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞 、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球 ) 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝 細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞 など） や血球系の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床 下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄 、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓 、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関 節、 骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、 また合成タンパク質であ つてもよい。
なかでも温血動物 （例えば、 ヒト、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サル等） の細胞 （例えば、 グリア細胞、 骨髄細胞 、 表皮細胞、 繊維芽細胞、 筋芽細胞、 軟骨細胞、 骨細胞もしくは骨芽細胞、 また はこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞等） などに由来するタンパク 質が好ましく用いられる。
配列番号： 1 0、 1 1、 1 3、 1 5または 1 7で表わされるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 1 0、 1 1、 1 3、 1 5または 1 7で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以 上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 なかでも好 ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列などが挙げられる。
本発明の配列番号： 1 0、 1 1、 1 3、 1 5または 1 7で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配 列番号： 1 0、 1 1、 1 3、 1 5または 1 7で表わされるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 0、 1 1、 1 3、 1 5または 1 7 で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有する夕 ンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 転写活性や骨 ·軟骨分化誘導作用など が挙げられる。 実質的に同質とは、 転写活性や骨 ·軟骨分化誘導作用が性質的に 同質であることを示す。 したがって、 転写活性や骨 ·軟骨分化誘導作用が同等 （ 例、 約 0. 01〜100倍、 好ましくは約 0. 5〜20倍、 より好ましくは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク質の分子 量などの量的要素は異なっていてもよい。
骨 ·軟骨分化誘導作用などの活性の測定は、 公知の方法に準じて行うことがで きるが、 例えば、 後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができ る。
転写活性の測定は公知の方法、 例えばレポ一ターアツセィや、 R T— P C Rな どの方法を用いて行うことができる。
また、 本発明で用いられるの Gl i 1タンパク質としては、 ①配列番号： 10 、 11、 13、 15または 17で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好まし くは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 10 、 11、 13、 15または 17で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （ 好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましく は数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 10、 11、 13、 15または 17で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （ 好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましく は数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 ま たは④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられ る。
本明細書における Gl i 1タンパク質は、 ペプチド表記の慣例に従って、 左端 が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号 : 10、 11、 13、 15または 17で表わされるアミノ酸配列を含有するタン パク質をはじめとする、 本発明の Gl i 1タンパク質は、 C末端が力ルポキシル 基 （—COOH) 、 カルポキシレート（—COO―)、 アミド （一 CONH2) ま たはエステル （― COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロべ ンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α 一ナフチルなどの C 6 _ 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニルー C卜 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの —ナフチルー C アルキル基などの C 7 ^ 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用 されるピバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明における G l i 1タンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （または力 ルポキシレート） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル 化されているものも本発明における G 1 i 1タンパク質に含まれる。 この場合の エステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明における G l i 1タンパク質には、 上記したタンパク質におい て、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチ ルなどの C 2 _ 6アルカノィル基などの Cェ— 6ァシル基など） で保護されているも の、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピ口グルタミン酸化した もの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一 O H、 一 S H、 アミノ基 、 イミダゾール基、 インド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば
、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2 _ 6アルカノィル基などの ァシル基など ) で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの 複合タンパク質なども含まれる。
本発明における G l i 1タンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1 0、 1 1、 1 3、 1 5または 1 7で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク 質などが用いられる。
本発明における G l i 1タンパク質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略 記する場合がある） としては、 上記した G l i 1タンパク質の部分ペプチドであ れば何れのものであってもよい。
本発明における部分ペプチドのアミノ酸の数は、 上記した G 1 i 1タンパク質 の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より 好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが好ましい。 実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ま しくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 % 以上、 なかでも好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性 を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 上記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は上記と同様に行うことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が 欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0 個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好まし くは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （― C O O H) 、 カル ポキシレート （― C O O_) 、 アミド （― C〇NH 2) またはエステル （一C O O R) の何れであってもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した本発明の G l i 1タンパク質と 同様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N 端側が生体内で切断され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖 鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明の G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、 酸または 塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸 付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン 酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸 、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる 本発明における G l i 1タンパク質またはその塩は、 上記した哺乳動物の細胞 または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、 後に記載する本発明の G l i 1タンパク質をコードする D NAを含有する形質転 換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後に記載するタン パク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 哺乳動物の組織または細胞をホ モジナイズした後、 酸などで抽出を行い、 該抽出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることに より精製単離することができる。
本発明における G l i 1タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩ま たはそのアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることが できる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチ ル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシべ ンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4 —ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミ ド樹脂、 4ー （2 ' ， 4 ' —ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル） フエノキ シ樹脂、 4— ( 2， ， 4， ージメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエチル） フエ ノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひ—アミノ基と 側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパ ク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジス ルフィド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質またはそのアミド体を取得す る。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチ ルー N ' — （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加する力、、 または、 対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H〇〇B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活 性化を行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメ.チルホルムアミド， N， N—ジメチルァセ卜アミド， N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二卜リル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度は夕ンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 ° (〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な 縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ一ルを用いて未反 応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 夕一シャリーペンチ ルォキシカルポニル、 ィソボルニルォキシカルポニル、 4—メ卜キシベンジルォ キシカルポニル、 C I— Z、 B r _ Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフ ルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 ターシャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステ ル、 4—ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 夕一シャリ一ブトキシカルボニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また 、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラニル 基、 卜ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz 1、 C 12- Bz l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 夕一シャリーブチルなどが用いられる ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメ卜キシ -2, 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル 、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2 , 4, 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N —ヒドロキシフタルイミド、 HOBt) とのエステル〕 などが用いられる。 原料 のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用い られる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0°C〜40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスル フイド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチオフエノ一ル処理により除去され 、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジチオール、 1 , 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による 脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理 によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 力ルポキシ末 端アミノ酸の α—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の Ν末端のひ ーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端の力ルポキシル基の保護基 のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記したような混合 溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し 、 所望の粗タンパク質を得ることができる。 この粗タンパク質は既知の各種精製 手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミ ド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸のひ— カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タン パク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることがで きる。
本発明における G l i 1タンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、 公知のぺ プチドの合成法に従って、 あるいは本発明における G 1 i 1タンパク質を適当な ぺプチダ一ゼで切断することによって製造することができる。 ぺプチドの合成法 としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち 、 本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分と を縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の ペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例 えば、 以下の①〜⑤に記載された方法が挙げられる。
ΦΜ. Bodanszkyおよび M. A. Ondet t i, ペプチド シンセシス （Pept ide Synth esis), Interscience Publishers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205 、 （1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ぺプ チドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体で ある場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で 得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明における Gl i 1タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 上記した本発明における G 1 i 1タンパク質をコードする塩基配列 （DNAまた は RNA、 好ましくは DNA) を含有するものであればいかなるものであっても よい。 該ポリヌクレオチドとしては、 本発明における Gl i 1タンパク質をコ一 ドする DNA、 mRNA等の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であって もよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAの ハイブリッドでもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （すなわち、 コード鎖） であ つても、 アンチセンス鎖 （すなわち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明における Gl i 1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、 例えば、 実験医学増刊 「新 PCRとその応用」 15(7)、 1997記載の公知の方法ま たはそれに準じた方法により、 Gl i 1タンパク質の mRNAを定量することが できる。
G 1 i 1タンパク質をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノム DN Aライブラリー、 上記した細胞 ·組織由来の c DNA、 上記した細胞 ·組織由来 の cDNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリーに使用す るべクタ一は、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなど いずれであってもよい。 また、 上記した細胞 '組織より to lRNAまたは mR NA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— P CR法と略称する） によって増幅することもできる 具体的には、 G l i 1タンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 配列 番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列を含有する DNA 、 または配列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列とハ イストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明の G 1 i 1タンパク質と実質的に同質の活性 （例、 転写活性や骨 ·軟骨分化誘導作用 など） を有する G l i 1タンパク質をコードする DNAであれば何れのものでも よい。
IH列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列とハイプリ ダイズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ま しくは約 90 %以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を 含有する DNAなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー -クローニンク (Molecular Cloning; 2nd (J. Saibrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことが できる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の 方法に従って行うことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン卜な条件 に従って行うことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 19〜 40 mM、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 °C、 好ましくは約 6 0〜 65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 65^ の場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列を含有する G 1 i 1タンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 9で表わされる塩基配列 を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 11で表わされるアミノ酸配列 を含有する G l i 1タンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 12で 表わされる塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 13で表わ されるアミノ酸配列を含有する G 1 i 1タンパク質をコードする DNAとしては 、 配列番号： 14で表わされる塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配 列番号： 15で表わされるアミノ酸配列を含有する G 1 i 1タンパク質をコード する DNAとしては、 配列番号： 16で表わされる塩基配列を含有する DNAな どが用いられる。 配列番号： 17で表わされるアミノ酸配列を含有する G 1 i 1 タンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 18で表わされる塩基配列 を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明における G l i 1タンパク質をコードする DNAの塩基配列の一部、 ま たは該 DN Aと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記の本発明の部分ペプチドをコードする D N Aを包含するだけではなく、 R N Aをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 G l i 1タンパク質遺伝子の複製または発現を阻害すること のできるアンチセンス 'ポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化した、 あるい は決定された G l i 1タンパク質をコードする DNAの塩基配列情報に基づき設 計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド （核酸） は、 G 1 i 1タンパク質 遺伝子の RN Aとハイブリダィズすることができ、 該 RN Aの合成または機能を 阻害することができるか、 あるいは G l i 1タンパク質関連 RNAとの相互作用 を介して G l i 1タンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 G 1 i 1タンパク質関連 RNAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 およ び G l i 1タンパク質関連 RNAと特異的にハイブリダィズすることができるポ リヌクレオチドは、 生体内および生体外で G 1 i 1タンパク質遺伝子の発現を調 節 ·制御するのに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用 語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定 の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列または核酸とペプチド （タンパク質） との間で 「対応する」 とは、 ヌク レオチド （核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド （ タンパク質） のアミノ酸を通常指している。 G l i 1タンパク質遺伝子の 5' 端 ヘアピンループ、 5， 端 6—ベースペア 'リピート、 5， 端非翻訳領域、 ポリべ プチド翻訳開始コドン、 タンパク質コード領域、 翻訳終止コドン、 3 ' 端非翻訳 領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 および 3 ' 端ヘアピンループは好ましい対象 領域として選択しうるが、 G l i 1タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象と して選択しうる。
目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 、 即ち対象物と八イブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、
「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·ポリヌクレオチド は、 2—デォキシ— D—リボースを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 D —リポ一スを含有しているポリデォキシヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン 塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌ クレオチド骨格を有するその他のポリマ一 （例えば、 市販のタンパク質核酸およ び合成配列特異的な核酸ポリマ一） または特殊な結合を含有するその他のポリマ 一 （但し、 該ポリマーは D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリング や塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる 。 それらは、 二本鎖 D NA、 一本鎖 D NA、 二本鎖 R NA、 一本鎖 R NA、 さら に D NA : R NAハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチ ド （または非修飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの 、 例えば当該分野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化 されたもの、 1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌ クレオチド修飾のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネー卜 、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロ ジチォエー卜など) を持つもの、 例えばタンパク質 (ヌクレアーゼ、 ヌクレア一 ゼ*インヒビ夕一、 トキシン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L—リジンなど ) や糖 （例えば、 モノサッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 イン ターカレント化合物 （例えば、 ァクリジン、 ソラレンなど） を持つもの、 キレ一 卜化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を 含有するもの、 アルキル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例え ば、 aァノマー型の核酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌ クレオチド」 および 「核酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみ でなく、 修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプ リンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾 されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されてい てよく、 例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されて いたり、 あるいはェ一テル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 ある いは修飾された核酸 （RNA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例として は核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミド やオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定 されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設 計されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和 性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性 をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al. , Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp. 247, 1992 ; Vol. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Cro oke et al. ed. , Ant isense Research and Appl icat ions, CRC Press, 1993など に開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチォン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ ート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3， 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着 させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3' 端あるいは 5' 端に特 異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 RNas eなどのヌ クレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用 の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのダリ コールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 それ に限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 Gl i 1遺伝子または G l i 1遺伝子を含有 する組換えべクタ一を含有する形質転換体、 生体内や生体外の遺伝子発現系、 あ るいは Gl i 1タンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができ る。 該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明における部分ペプチドをコードする DN Aとしては、 上記した本発明の 部分べプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであつ てもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DN Aライブラリ一、 上記した細胞 '組 織由来の cDNA、 上記した細胞 ·組織由来の c DN Aライブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい。 ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ 、 プラスミド、 コスミド、 ファ一ジミドなどいずれであってもよい。 また、 上記 した細胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcri tase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— P CR法と略称する） によつ て増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 （ 1) 配列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列を含有す る DNAの部分塩基配列を含有する DNA、 または （2) 配列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリンジ ェン卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 本発明の Gl ΐ 1タン パク質と実質的に同質の活性 （例、 転写活性や骨 ·軟骨分化誘導作用など） を有 する Gl i 1タンパク質をコードする DNAの部分塩基配列を含有する DNAな どが用いられる。
より具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば 、 (1) 配列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列を含 有する DNAの部分塩基配列を含有する DNA、 または （2) 配列番号： 9、 1 2、 14, 16または 18で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイストリ ンジェン卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 本発明における G 1 i 1タンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする DNA の部分塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列を含有する DNAとハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を 有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
また、 配列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列を含 有する DNAとハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 9、 12、 14、 16または 18で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好ましくは 約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相 同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明における Gl i 1タンパク質またはその部分ペプチド （以下、 本発明の タンパク質と略記する場合がある） を完全にコードする DNAのクローニングの 手段としては、 本発明のタンパク質の部分塩基配列を含有する合成 DN Aプライ マーを用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み込んだ DNAを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DN A断片もし くは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼ一シヨンによつて選別 することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー ' クローニング (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring H arbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行 うことができる。
DNAの塩基配列の置換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mutan™— super Express Km (宝酒造) 、 Mutan™— K (宝酒造) 等を用いて、 0DA— LA PCR法、 a pped duplex法、 Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って 行うことができる。
クローン化された本発明のタンパク質をコードする DN Aは目的によりそのま ま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用す ることができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを 有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAG を有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質を コードする DNAを含む、 例えば c DNAから目的とする DNA断片を切り出し 、 （口） 該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結する ことにより製造することができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pCR4、 pCR2. 1、 p BR 322, p BR 325, pUC 12、 pUC 13) 、 枯草菌由来のプラス ミド （例、 pUB 110、 pTP 5、 p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSH19、 p SHI 5) 、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイ ルス、 ワクシニアウィルス、 バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρ A 1 - 11 , XT 1, R c/CMV, pRc/RSV、 p cDNA I/Ne oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモータ一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SR Kプロモ一夕一、 SV40プロモーター、 LTRプ ロモ—夕—、 CMVプロモータ一、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられる 。 これらのうち、 CMVプロモー夕一、 S R αプロモーターなどを用いるのが好 ましい。
宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモー ター、 r e cAプロモーター、 λΡ^プロモーター、 l ppプロモーターなどが 、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プロモー 夕一、 p e n Pプロモータ一など、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモ一 夕一、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好 ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P10プロ モータ一などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Ampfと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 CHO (dh f r— ) 細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マ一カーとして 使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。 また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 P h o A ·シグナル 配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α— アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母で ある場合は、 MFo! ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物 細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—インターフェロン ·シ グナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DNAを含有する ベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア ·コリ （Escherichia col i ) K 12 · DH1 〔プロシ一ジングズ 'ォブ ·ザ ·ナショナル .アカデミー ·ォ ブ 'サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. US A) , 60卷， 160 (1968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック ·ァシッズ'リ サーチ， （Nucleic Acids Research) ， 9巻， 309 (1981)〕 ， J A221 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecular Bio logy) , 1 20巻， 5 17 (1 978)〕 ， HB 10 1 〔ジャーナル ·ォブ ·モレ キュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジエネティ ックス （Genetics) , 39巻， 440 (1954)〕 , DH5 o; [Inoue, H. , Noj im a, H. and Okayama, H. , Gene, 96, 23-28 (1990) ) ， DH10 B 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一 エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 87巻， 4645— 4649 (1 9 90)3 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis ) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナ ル ·ォブ ·バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 (1 984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス ·セレピシェ （Saccharomyces cere visiae) AH 22, AH 22 R~, NA87 - 1 1 A, DKD— 5D、 20 B- 12、 シゾサッカロマイセス 'ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1 9 13， NCYC 2036, ピキア 'パストリス （Pichia pastoris) などが 用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） な どが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 (以上、 Vaughn, J丄ら、 イン 'ヴィポ (In Vivo) , 13， 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) ， 3 1 5巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7、 Ve r o, チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh f r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r_) 細胞と略記） 、 マウス L細胞， マウス At T— 20、 マウスミエローマ細胞、 ラット GH3、 ヒト FL 細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ
•ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 2110 ( 1972)やジーン （Gen e) ， 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行うことができる。 バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジエネラ ル'ジェネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168巻， 111 (
1979)などに記載の方法に従って行うことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メッソズ ·イン ·ェンザィモロジ一 （Meth ods in Enzymology) , 194巻， 182— 187 (1991) 、 プロシ一ジン グズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978) などに記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ/テクノロジ一 （Bi o/Technology) , 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行うことができる 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロ卜 コール. 263— 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジー （Virology ) ， 52巻， 456 (1973) に記載の方法に従って行うことができる。
このようにして、 Gl i 1タンパク質をコードする DNAを含有する発現べク ターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源として は、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカー、 ペプトン 、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグ ネシゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子など を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) ， ジャーナル ·ォブ'ェクスペリメンッ ·イン ·モレキュラー ·ジエネティックス （Journal of Experiments in Molecu lar Genetics) , 431 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせるため に、 例えば、 3 /3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜 43 °Cで約 3〜 24時間 行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行い 、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダ一 （Burkliolder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシ一ジングズ *ォ プ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77巻， 4505 (1980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 プロシージングズ ·ォブ •ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスェ 一 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81巻， 5330 (1984) 〕 が挙げら れる。 培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20t：〜 3 5°Cで約 24〜72時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace's Insect Medium (Grace, T.C.C.,ネイチヤー (Nature) , 195,788 (1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培 地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜5日間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻， 501 (1952)〕 , DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) ， 8巻， 396 (1959)〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナル 'ォブ ·ザ ·アメリカン ' メディカ レ'アソシエーション （The Journal of the American Medical Associ at ion) 199巻， 519 (1967)) , 199培地 〔プロシ一ジング 'ォブ' ザ 'ソサイエティ 'フォー ·ザ ·バイオロジカル 'メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 などが 用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30° (：〜 40 で約 15〜60時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタン パク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行うことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後 、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波 、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した のち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いら れる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリトン X- 100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にタンパク質 が分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを 分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 公知の分離 '精製法を適切に組み合わせて行うことができる。 これらの 公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマ卜グラフィ —などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特 異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差 を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用い られる。
このようにして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 公知の方法 あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた 場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変 換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当なタンパ ク質修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 卜リブ シン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明の G 1 i 1タンパク質またはその塩の活性は、 例えば G l i 1結合配列を持つ二本鎖 D N Aへの結合能等を指標に測定すること ができる。
本発明における G l i 1タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体は、 本発明における G l i 1タンパク質もしくはその部分ペプチドま たはその塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗 体の何れであってもよい。
本発明における G l i 1タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 （ 以下、 本発明のタンパク質等と略記する場合がある） に対する抗体は、 本発明の タンパク質等を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造 することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明の夕ンパク質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位 にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能 を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを 投与してもよい。 投与は通常 2〜6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行なわれ る。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギが挙げられるが、 マウスおよびラットが好ましく 用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化タンパク質等と抗血清 とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うこ とができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミルスタインの方法 〔 ネィチヤ一 （Nature)、 256巻、 495頁 （ 1975年） 〕 に従い実施するこ とができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) ゃセンダイウイルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS—1、 P3U1、 SP2Z0などが挙げら れる力 P3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加 され、 約 20〜 40 ° (：、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間ィンキュベ 一卜することにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質等の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させ た固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射 性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞 がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリ ン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し 、 放射性物質や酵素などで標識したタンパク質等を加え、 固相に結合したモノク 口一ナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行うこ とができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を 添加した動物細胞用培地などで行うことができる。 選別および育種用培地として は、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例 えば、 1~20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 16 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） ま たはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） など を用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0で、 好ましくは約 3 7 °Cで ある。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養 は、 通常 5 %炭酸ガス下で行うことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価 は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクロナ一ル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリク口一ナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行うことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法にしたがって 製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質等の抗原） とキャリアー タンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺 乳動物に免疫を行い、 該免疫動物から本発明のタンパク質等に対する抗体含有物 を採取して、 抗体の分離精製を行うことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一タンパク質との複 合体に関し、 キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミン、 ゥシサイログロプリン、 キーホール ·リンペット ·へモシァニン等を重 量比でハプテン 1に対し、 約 0. 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合で力プル させる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜10回程度行うことができる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行うことができる
(1) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 または該夕 ンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAは骨 ·軟骨分化誘導剤とし て有用である。
(2) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 G l i 1遺 伝子 DNAもしくはその相補 DNAまたはその部分 DNAおよび G 1 i 1タンパ ク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞は、 G l i 1遺伝子の 発現を制御する活性を有する化合物、 G l i 1遺伝子のプロモータ一もしくはェ ンハンサ一の活性を制御する作用を有する化合物、 ひいては骨 ·軟骨分化調節作 用を有する化合物等のスクリーニングに用いることができる。
(3) G 1 i 1遺伝子のアンチセンス DNA等は、 所謂遺伝子治療剤 （骨 -軟 骨分化阻害剤または骨 ·軟骨形成過剰症の予防 ·治療剤） として、 または遺伝子 診断剤 （骨 ·軟骨疾患の診断剤） などとして有用である。
(4) G 1 i lタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の抗体は骨- 軟骨疾患の診断剤として有用である。
G 1 i 1タンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発明のタン パク質等と略記する場合がある） 、 G l i 1タンパク質またはその部分ペプチド をコードする DNA (以下、 本発明の DNAと略記する場合がある） 、 G l i 1 タンパク質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） 、 G 1 i 1遺伝子のアンチセンス DNAの用途等について、 以下に具体的に説明する。 ( 1 ) 骨 ·軟骨分化誘導剤
① G l i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 または該タンパ ク質またはその部分ペプチドをコードする D NAは骨 ·軟骨分化誘導剤などの医 薬として使用することができる。
例えば、 生体内において G l i 1タンパク質またはヘッジホッグが減少してい るために、 またはヘッジホッグによるシグナルが有効に伝達されないために G 1 i 1遺伝子またはその産物よる生理作用 （転写活性、 骨 ·軟骨分化誘導作用など ) が期待できない （該 G l i 1タンパク質の欠乏症） 患者がいる場合に、 ① G 1 i 1タンパク質等を該患者に投与し該タンパク質の量を補充したり、 ② （ィ） 本 発明のタンパク質をコードする D NAあるいは該 D N Aを含有する組換えべクタ —を該患者に投与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞 （ 例えば、 グリア細胞、 骨髄細胞、 表皮細胞、 繊維芽細胞、 筋芽細胞、 軟骨細胞、 骨細胞もしくは骨芽細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞等） に本発明の タンパク質をコードする D NAを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植 することなどによって、 患者の体内における G l i 1タンパク質の量を増加させ 、 転写活性、 骨 ·軟骨分化誘導作用を充分に発揮させることができる。 すなわち 、 本発明のタンパク質または該タンパク質をコードする D NAは、 安全で低毒性 な骨 ·軟骨分化誘導剤として有用である。
本発明のタンパク質または該タンパク質をコードする D NAは骨 ·軟骨疾患、 例えば整形外科領域の疾患 （例、 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 半月板損傷等 の軟骨損傷、 外傷、 腫瘍摘出などによる骨、 軟骨欠損部の再生、 脊椎固定術、 脊 柱管拡大術などの骨再建、 骨形成不全症、 軟骨無形成症などの先天性骨 ·軟骨疾 患） 、 歯科領域の疾患 （例、 口蓋裂、 下顎骨再建術、 歯槽堤形成術などの骨再建 ) 、 骨粗鬆症などの予防 ·治療剤などの医薬として用いることができる。 また、 美容外科領域における骨移植の治療剤などの医薬としても用いることができるし 、 再生医療における自家移植の際の分化誘導剤としても利用できる。
本発明のタンパク質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套手段に従 つて製剤化することができる。
一方、 本発明のタンパク質をコードする D NA (以下、 本発明の D NAと略記 する場合がある） を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D NAを 単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウィル スァソシェ一テツドウィルスベクタ一などの適当なベクターに挿入した後、 常套 手段に従って実施することができる。 本発明の D NAは、 そのままで、 あるいは 摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのような カテーテルによって投与できる。
例えば、 ①本発明のタンパク質または②該タンパク質をコードする D NAは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル 剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液と の無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例え ば、 ①本発明のタンパク質または②該夕ンパク質をコードする D NAを生理学的 に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤 などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和するこ とによつて製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指示された 範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0™、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用しても よい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど ) 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤など と配合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 （ 例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
本発明のタンパク質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などに より差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 軟骨損傷患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. lmg〜l 00mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する 場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても 異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 軟骨損傷患者 （6 Okgとして ) においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1~2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与する のが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与する ことができる。
本発明の DNAの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 軟骨損傷患者 （6 O kgとし て） においては、 一日につき約 0. lmg〜 10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜 5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場合 は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異な るが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 軟骨損傷患者 （6 O kgとして） に おいては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20m g程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが 好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与すること ができる。
(2) ① G l i 1遺伝子の発現を制御する活性を有する化合物、 ② G l i 1遺伝 子のプロモーターもしくはェンハンサ一の活性を制御する作用を有する化合物ま たは③骨 ·軟骨分化調節作用を有する化合物のスクリーニング方法
上記したごとく、 G l i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 G 1 i 1遺伝子 DNAもしくはその相補 DNAまたはその部分 DNAおよび G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞は、 G l i 1遺伝子の発現を制御する活性を有する化合物や G 1 i 1遺伝子のプロモーター もしくはェンハンサ一の活性を制御する作用を有する化合物等のスクリーニング に用いることができ、 ひいては骨 ·軟骨分化調節作用を有する化合物のスクリー ニングに用いることができる。
G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞としては、 温血動物 （例えば、 ヒ ト、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サ ル等） の細胞 （例えば、 グリア細胞、 骨髄細胞、 表皮細胞、 繊維芽細胞、 筋芽細 胞、 軟骨細胞、 骨細胞もしくは骨芽細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞 もしくはガン細胞等） が用いられる。
特に、 骨または軟骨への分化能を有する細胞あるいは既に分化形態を示してい る細胞が好ましく、 軟骨細胞、 繊維芽細胞 （例、 マウス繊維芽細胞株 C3H10 T 1/2) 、 筋芽細胞 （例、 マウス筋芽細胞株 C2 C 12) などがより好ましい 以下に、 本発明の G l i 1遺伝子の発現を制御 （促進または阻害） する活性を 有する化合物またはその塩のスクリーニング方法について詳述する。
G 1 i 1遺伝子発現はヘッジホッグと呼ばれる可溶性タンパク質によるシグナ ル伝達によって誘導され、 骨形成を誘導し、 骨 ·軟骨分化促進活性を有するため 、 G l i 1遺伝子の発現を促進する活性を有する化合物またはその塩は、 骨 ·軟 骨分化調節 （特に促進） 作用を有し、 骨 '軟骨疾患、 例えば整形外科領域の疾患 (例、 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 半月板損傷等の軟骨損傷、 外傷、 腫瘍摘 出などによる骨、 軟骨欠損部の再生、 脊椎固定術、 脊柱管拡大術などの骨再建、 骨形成不全症、 軟骨無形成症などの先天性骨 ·軟骨疾患） 、 歯科領域の疾患 （例 、 口蓋裂、 下顎骨再建術、 歯槽堤形成術などの骨再建） 、 骨粗鬆症などの予防 · 治療剤などの医薬として用いることができる。 また、 美容外科領域における骨移 植の治療剤などの医薬としても用いることができるし、 再生医療における自家移 植の際の分化誘導剤としても利用できる。
一方、 G l i 1遺伝子の発現を阻害する活性を有する化合物またはその塩は、 骨 ·軟骨分化調節 （特に阻害） 作用を有し、 例えば骨 ·軟骨形成過剰症などの治 療 ·予防剤などの医薬として使用できる。
したがって、 G l i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 G 1 i 1遺伝子 DNAもしくはその相補 DNAまたはその部分 DNAまたは G 1 i 1 遺伝子を発現する能力を有する細胞は、 G l i 1遺伝子の発現を制御 （促進また は阻害） する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング、 ひいては骨' 軟骨分化調節作用を有する化合物のスクリーニングのための材料として用いるこ とができる。
すなわち、 本発明は、
① G l i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下に培養し、 G 1 i 1遺伝子 DNAもしくはその相補 DNAまたはその部分 DNAを用いて G 1 i 1タンパク質をコードする mRNA (以下、 G l i lmRNAと略称する場 合がある。 ） の量を測定することを特徴とする G 1 i 1遺伝子の発現を制御する 活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 より具体的には、
② （ i) G l i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を培養した場合の G 1 i 1 mRNAの発現量と、 （i i) G l i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を試 験化合物の存在下に培養した場合の G 1 i 1 mRNAの量との比較を行うこと を特徴とする、 G l i 1遺伝子の発現を制御する活性を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞としては、 例えば、 前記した G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する公知の温血動物細胞などがあげられる。
G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する公知の温血動物細胞としては、 例えば 、 骨または軟骨への分化能を有する細胞あるいは既に分化形態を示している細胞 が好ましく、 具体的には軟骨細胞、 繊維芽細胞 （例、 マウス繊維芽細胞株 C 3 H 10T1/2) 、 筋芽細胞 （例、 マウス筋芽細胞株 C2C12) などが用いられ る。
G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞の培養は、 公知の動物細胞培養法 と同様にして行われる。 例えば、 培地としては、 約 5〜 20%の胎児牛血清を含 む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻， 501 (1952)〕 ， DM EM培地 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8巻， 396 (1959)〕 , RPMI 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン ·メディカル ·ァソシエーシ ヨン (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 ( 1967)] , 199培地 〔プロシ一ジング ·ォブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォー •ザ ·バイオロジカル 'メディスン （Proceeding of the Society for the Biol ogical Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕 等が用いられる。 pHは約 6〜8 であるのが好ましい。 培養は通常約 30〜40°Cで約 15〜60時間行い、 必要 に応じて通気や撹拌を加えてもよい。
発現誘導剤を接触させることによって G 1 i 1遺伝子が発現する動物細胞を用 いる場合には、 該動物細胞を発現誘導剤の存在下または非存在下で培養すること ができる。
mRNAの発現量の比較をハイブリダィゼ一ション法によって行うには、 公知 の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クローニング （Mole cular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法等に従って行うことができる。
具体的には、 G l 〖 1タンパク質をコードする mRNAの量の測定は、 公知の 方法に従って細胞から抽出した RNAと G 1 i 1遺伝子をコードする DNA (G 1 i 1遺伝子 DNA) もしくはその相補 DNAまたはその部分 DNAとを接触さ せ、 G 1 i 1遺伝子 DNAまたはその相補 DNAに結合した mRNAの量を測定 することによって行われる。 Gl i 1遺伝子 DNAの相補 DNAまたはその部分 DNAを、 例えば放射性同位元素、 色素などで標識することによって、 G l i 1 遺伝子 DNAの相補 DNAに結合した G 1 i 1 mR N Aの量が容易に測定できる 。 放射性同位元素としては、 例えば32 P、 3Hなどが用いられ、 色素としては、 例えば fluorescein、 FAM (PE Biosystems社製） 、 JOE (PE Biosystems社 製） 、 TAMRA (PE Biosystems社製） 、 ROX (PE Biosystems社製） 、 Cy 5 (Amersham社製） 、 Cy 3 (Amersham社製） などの蛍光色素が用いられる。 また、 G l i lmRNAの量は、 細胞から抽出した RN Aを逆転写酵素によつ て cDNAに変換した後、 G 1 i 1遺伝子をコードする DNAもしくはその相補 DNAまたはその部分 DNAをプライマ一として用いる P CRによって、 増幅さ れる c DNAの量を測定することによって行うことができる。
G 1 i lmRNAの量の測定に用いられる G 1 i 1遺伝子 DNAの相補 DNA としては、 G l i 1遺伝子 DNA (上鎖） に相補的な配列を有する DNA (下鎖 ) があげられる。 G l 〖 1遺伝子 DNAの部分 DNAとしては、 例えば G 1 i 1 遺伝子 DNAの塩基配列中、 連続した 10〜2200個程度、 好ましくは 10〜 300個程度、 さらに好ましくは 10〜30個程度の塩基から構成される塩基配 列があげられる。 G l i 1遺伝子 DNAの相補 DNAの部分 DNAとしては、 例 えば前記した G l i 1 DNAの部分 DNAに相補的な配列を有する DNAがあげ られる。 即ち、 例えば G 1 i 1遺伝子 DNAの塩基配列中、 連続した 10〜22 00個程度、 好ましくは 10〜300個程度、 さらに好ましくは 10〜30個程 度の塩基から構成される塩基配列に相補的な配列を有する DNAがあげられる。
PCRに用いられるプライマーとしては、 例えば配列番号： 1で表される塩基 配列を含有する DN Aおよび配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DN A などがあげられる。
G l i 1 mRNAの量を増加させる試験化合物を、 G l i 1遺伝子の発現を 促進する活性を有す 化合物あるいは骨 ·軟骨分化調節 （特に促進） 作用を有す る化合物として選択することができ、 また G 1 i 1 mRNAの量を減少させる 試験化合物を、 G l i 1遺伝子の発現を阻害する活性を有する化合物あるいは骨 ·軟骨分化調節 （特に阻害） 作用を有する化合物として選択することができる。 上記①〜②に示したスクリーニング方法において試験化合物としては、 例えば 、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞 抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが挙げられ、 これら化合物は新規な化 合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。 また、 本発明は、
③ G 1 i 1の公知プロモーターゃェンハンサ一領域をゲノム DNAよりクロー二 ングし、 適当なレポーター遺伝子の上流に連結させた DNAで形質転換した細胞
(例えば、 軟骨細胞、 繊維芽細胞 （例、 マウズ繊維芽細胞株 C3H10T1Z2 ) 、 筋芽細胞 （例、 マウス筋芽細胞株 C 2C 12) など） を試験化合物の存在下 で培養し、 G l i 1の発現に代えてレポーター遺伝子の発現を検出することを特 徵とする、 G l i 1遺伝子のプロモーターもしくはェンハンサ一の活性を制御す る作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 ひいては G 1 i 1遺 伝子の発現を制御する活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を 提供する。
レポ一夕一遺伝子としては、 例えば、 l a c Z (j3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子 ) などの染色マーカー遺伝子等などが用いられる。
レポーター遺伝子産物 （例、 mRNA、 タンパク質） の量を公知の方法を用い て測定することによって、 レポ一夕一遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を G 1 i 1遺伝子のプロモーターもしくはェンハンサ一の活性を制御 （特に促進） する作用を有する化合物、 すなわち G l i 1遺伝子の発現を促進する活性を有す る化合物として選択でき、 逆に、 レポ一夕一遺伝子産物の量を減少させる試験化 合物を G l i 1遺伝子のプロモーターもしくはェンハンサ一の活性を制御 （特に 阻害） する作用を有する化合物、 すなわち G l i 1遺伝子の発現を阻害する活性 を有する化合物として選択することができる。
試験化合物としては、 前記と同様のものが使用される。
細胞の培養は、 公知の動物細胞培養と同様に行うことができる。
また、 本発明は、
④ G l i 1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を試 験化合物の存在下および非存在下に培養し、 軟骨分化のマ一カー遺伝子の発現量 を測定することを特徴とする骨 ·軟骨分化調節 （促進または阻害） 作用を有する 化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
軟骨分化のマーカー遺伝子としては I I型 Bコラーゲン遺伝子が好ましい。 軟骨分化のマーカー遺伝子の発現量の測定は例えば配列番号： 5、 6、 7または 8で表される塩基配列を有するプライマーを用いた R T— P C R法を実施するこ とにより測定することができる。
軟骨分化のマーカー遺伝子の発現量を増加させる試験化合物を、 骨 ·軟骨分化 調節 （特に促進） 作用を有する化合物として選択することができ、 また軟骨分化 のマーカ一遺伝子の発現量を減少させる試験化合物を、 骨 ·軟骨分化調節 （特に 阻害） 作用を有する化合物として選択することができる。
試験化合物としては、 前記と同様のものが使用される。
細胞の培養は、 公知の動物細胞培養と同様に行うことができる。
また、 本発明は、
⑤ G l i 1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞を試 験化合物の存在下および非存在下に培養し、 細胞の軟骨分化状態、 例えば軟骨分 化マーカ一の発現を測定することを特徴とする骨 ·軟骨分化調節 （促進または阻 害） 作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
試験化合物としては、 前記と同様のものが使用される。
細胞の培養は、 公知の動物細胞培養と同様に行うことができる。
さらに、 G l i 1タンパク質は G l i 1遺伝子自身の転写あるいは、 脳もしく は肺の分化に関与する HN F— 3 /3遺伝子の転写を誘導していると報告されてい る。
したがって、 例えば上記した①または②のスクリーニング方法を実施すること により直接的に G l i 1タンパク質の転写活性を測定できるか、 または HN F— 3 βを発現し得る細胞株を用いれば例えば上記した①または②に記載の方法に準 じて HN F— 3 ]3の mR NAの発現量を試験化合物の存在下および非存在下で測 定し、 比較することにより G l i 1タンパク質の転写活性を測定することも可能 である。
本発明のスクリーニング用キッ卜には上記スクリーニング方法を実施するため 、 上記の G l iタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 または G 1 i 1遺伝子またはその産生物を産生する能力を有する細胞、 または G l i 1遺伝子 発現レポーターベクターを導入した細胞 （G l i 1遺伝子のプロモータ一もしく はェンハンサーをレポ一夕一遺伝子に連結させた D NAで形質転換した細胞） 、 および G 1 i 1遺伝子 D NAもしくはその相補 D NAまたはその部分 D NAを含 有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物 組織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物であり、 G l i 1遺伝子の発現を制御 (促進または阻害） する活性を有する化合物あるいは G 1 i 1遺伝子のプロモー 夕一もしくはェンハンサ一の活性を制御 （促進または阻害） する作用を有する化 合物、 ひいては骨 ·軟骨分化調節作用を有する化合物である。
該化合物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩 基 （例、 アルカリ金属塩） 等との塩が挙げられる。
G 1 i 1遺伝子の発現を促進する活性を有する化合物 （または G l i 1遺伝子 のプロモーターもしくはェンハンサ一の活性を促進する作用を有する化合物、 骨 •軟骨分化誘導作用を有する化合物） またはその塩は、 骨 ·軟骨疾患、 例えば整 形外科領域の疾患 （例、 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 半月板損傷等の軟骨損 傷、 外傷、 腫瘍摘出などによる骨、 軟骨欠損部の再生、 脊椎固定術、 脊柱管拡大 術などの骨再建、 骨形成不全症、 軟骨無形成症などの先天性骨 ·軟骨疾患） 、 歯 科領域の疾患 （例、 口蓋裂、 下顎骨再建術、 歯槽堤形成術などの骨再建） 、 骨粗 鬆症などの予防，治療剤などの医薬として用いることができる。 また、 美容外科 領域における骨移植の治療剤などの医薬としても用いることができるし、 再生医 療における自家移植の際の分化誘導剤としても利用できる。
一方、 G l i 1遺伝子の発現を阻害する活性を有する化合物 （または G l i 1 遺伝子のプロモ一夕一もしくはェンハンサ一の活性を阻害する作用を有する化合 物、 骨 ·軟骨分化阻害作用を有する化合物） またはその塩は、 例えば骨 ·軟骨形 成過剰症などの治療 ·予防剤などの医薬として使用できる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 常套手段に従って実施するこ とができ、 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無 菌性溶液、 懸濁液剤などとして、 経口的または非経口的に投与することができる このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 温血動物 （ 例えば、 ヒト、 マウス、 ラッ卜、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネ コ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど；好ましくは哺乳動物） に対して投与するこ とができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル一 トなどにより差異はあるが、 例えば、 軟骨損傷の治療目的で G l i 1遺伝子の発 現を促進する活性を有する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜： L 00mg、 好まし くは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omg投与する。 非経口 的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによって も異なるが、 例えば、 軟骨損傷の治療目的で G l i l遺伝子の発現を促進する活 性を有する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20m g程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが 好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与すること ができる。
一方、 骨 ·軟骨形成過剰症の治療目的で G l i 1遺伝子の発現を阻害する活性 を有する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O kgとして） にお いては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合 は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例え ば、 骨 ·軟骨形成過剰症の治療目的で G 1 i 1遺伝子の発現を阻害する活性を有 する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日に つき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度 、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合 である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができ る。
(3) アンチセンスヌクレオチドを含有する医薬 （骨 ·軟骨分化阻害剤） または 診断剤 （骨 ·軟骨疾患の診断剤）
本発明で用いられる D N Aに相補的に結合し、 前記 D N Aの発現を抑制するこ とができる本発明で用いられるアンチセンスヌクレオチド （例、 アンチセンス D NA) は低毒性であり、 生体内における本発明で用いられるタンパク質または本 発明で用いられる D NAの機能抑制することができるので、 例えば、 骨 '軟骨形 成過剰症などの治療 ·予防剤などとして使用することができる。
上記アンチセンスヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場合、 公 知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
例えば、 前記アンチセンスヌクレオチドを用いる場合、 前記アンチセンスヌク レオチドを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 ァ デノウィルスァソシエーテッドウィルスベクタ一などの適当なベクタ一に揷入し た後、 常套手段に従って、 温血動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど、 好ま しくは哺乳動物） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 前記 アンチセンスヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤な どの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテ 一テルのようなカテーテルによって投与できる。
前記アンチセンスヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルート などにより差異はあるが、 例えば、 骨 ·軟骨形成過剰症の治療の目的で本発明で 用いられるアンチセンスヌクレオチドを経口投与する場合、 成人 （体重 6 O k g ) に対し、 一日につき前記アンチセンスヌクレオチドを約 0 . l〜1 0 0 m g投 与する。
さらに、 前記アンチセンスヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明で用い られる D NAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプ ローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスヌクレオチドと同様に、 二本鎖 R NA、 リポザィム、 デコイ オリゴヌクレオチドなども、 前記 D NAの発現を抑制することができ、 生体内に おける本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられる D N Aの機能抑 制することができるので、 例えば、 骨 ·軟骨形成過剰症の予防 ·治療剤などとし て使用することができる。
二本鎖 RNAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じて 、 本発明で用いられる DNAの配列を基に設計して得られる。
リポザィムは、 公知の方法 （例、 TRENDS in Molecular Medicine, 7巻， 221頁 ， 2001年） に準じて、 本発明で用いられる DNAの配列を基に設計して得られる デコイオリゴヌクレオチドは、 公知の方法 （例、 The Journal of Clinical In vestigation, 106巻， 1071頁， 2000年） に準じて、 本発明で用いられる DNAの 配列を基に設計して得られる。 Gl i 1は転写因子であるので G 1 i 1の結合配 列を含むデコイ G 1 i 1バインディングオリゴヌクレオチド 〔例えば 5'- GACCACC CA-3'(Kinzler KW, Vogelstein B., Mol Cell Biol 1990 Feb; 10 (2)： 634 - 42)を 含有するオリゴヌクレオリドなど〕 などを有効に使用できる。
上記の予防 ·治療剤として使用する場合、 公知の方法に従って製剤化し、 投与 することができる。
(4) 遺伝子診断剤
本発明の DNAまたはアンチセンス DNAは、 プローブとして使用することに より、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ 、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明のタンパク質またはその部分ペプチド をコードする DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができ るので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や 、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有 用である。
本発明の DN Aまたはアンチセンス DN Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例え ば、 公知のノーザンハイブリダィゼ一シヨンや PCR— S SCP法 （ゲノミック ス （Genomics) ， 第 5巻， 874〜 879頁 （1989年） 、 プロシージングズ •ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエス エー (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA) , 第 8 6巻， 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実施することができる 例えば、 ノ一ザンハイブリダイゼーシヨンにより本発明の夕ンパク質またはそ の部分ペプチドをコードする m R N Aの発現低下が検出された場合は、 例えば、 骨 ·軟骨疾患、 例えば整形外科領域の疾患 （例、 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎 、 半月板損傷等の軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症などの先天性骨 ·軟骨疾患） 、 歯科領域の疾患 （例、 口蓋裂） 、 骨粗鬆症などの疾患である可能 性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、 ノーザンハイブリダイゼ一シヨンにより本発明のタンパク質またはその 部分ペプチドをコードする mR NAの発現過多が検出された場合は、 例えば、 骨 •軟骨形成過剰症などの疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高 いと診断することができる。
( 5 ) G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の抗体を用いた 診断剤
G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の抗体 （以下、 本発 明の抗体と略称する場合がある） は、 本発明のタンパク質等を特異的に認識する ことができるので、 被検液中の本発明のタンパク質等の定量、 特にサンドイッチ 免疫測定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例え ば、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化タンパク質等とを競合的に反応さ せ、 該抗体に結合した標識化タンパク質等の割合を測定することを特徴とする被 検液中の本発明のタンパク質等の定量法、
(i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を 測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質等の定量法を提供する 上記 （i i) においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質等の N端部を認識す る抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質等の C端部に反応する抗体であるこ とが好ましい。
本発明のタンパク質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノクロ ーナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質等の測定を行なえ るほか、 組織染色等による検出を行うこともできる。 これらの目的には、 抗体分 子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。 本発明のタンパク質等に対する抗体を用いる測定法 は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク 質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理 的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲 線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフ ロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いら れるが、 感度、 特異性の点で、 後に記載するサンドイッチ法を用いるのが特に好 ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔125 I〕 、 〔13i I〕 、 〔3H〕 、 〔i4C〕 などが用いられる。 上記酵素とし ては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 3—ガラクトシダ一ゼ、 ^ _ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パ一ォキシダーゼ、 リンゴ酸 脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例え ば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられ る。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用い ることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用い る方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロー スなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成 樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応さ せ （2次反応） た後、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液 中の本発明の夕ンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応は逆の 順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよ レ 。 標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用 抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させ る等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法によるタンパク質等の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はタンパク質等の結合する部 位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次反応に 用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 タンパク質の C端部 を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることができる 。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原と（F) と抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し （ BZF分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する 。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B ZF分離をポリエチレンダリ コール、 上記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体とし て固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体と して固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈 降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー などが好適に用いられる。 これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質等の測定系を 構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書など を参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談 社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「 メソッズ ·イン ·ェンザィモノジー （Methods in ENZYMOLOGY) 」 Vol. 70 (I讓 un ochemical Techni ues (Part A) )、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniaues (P art B) ) 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniaues (Part 0 ) , 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniaues (Part D: Selected Immunoassays) ) , 同書 Vol. 92 (I匪 nochemical Techniaues (Part E: Monoclonal Ant ibodies and General I匪 u noassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniaues (Part I： Hybri doma Technology and Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発 行)など参照」 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質等を 感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のタンパク質等を定量する ことによって、 上記したような各種骨 ·軟骨疾患の診断をすることができる。 例えば、 上記の定量法を用いることにより本発明のタンパク質またはその部分 ペプチドの濃度減少が検出された場合は、 例えば、 骨 ·軟骨疾患、 例えば整形外 科領域の疾患 （例、 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 半月板損傷等の軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症などの先天性骨 ·軟骨疾患） 、 歯科領域の疾 患 （例、 口蓋裂） 、 骨粗鬆症などの疾患である可能性が高いまたは将来罹患する 可能性が高いと診断することができる。
一方、 上記の定量法を用いることにより本発明のタンパク質またはその部分べ プチドの濃度上昇が検出された場合は、 例えば、 骨 ·軟骨形成過剰症などの疾患 である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパ ク質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパ ク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明 のタンパク質等の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析な どのために使用することができる。
(6) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質等をコードする DNA (以下、 本発明 の外来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DNA と略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒ卜哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および (4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒ卜哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒ卜哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法 、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキ ストラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作出することが できる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに 目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用する こともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融 合させることにより本発明の DNA転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ 、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも 、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57 BLZ6系統， DBA 2系統など、 交雑系として、 B 6 C 3 F 1系統， BDF 1 系統， B6D2F 1系統， BALBZc系統， I CR系統など） またはラッ卜 （ 例えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒ卜哺乳動物の他にヒ卜などが挙げられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒ卜哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば 、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への 置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DN Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる DN Aを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DN Aは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の DNAを対象動物に転移させるにあた つては、 該 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した D N Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D NAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNAを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト DN Aを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の DN Aを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好 ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 ①ウィルス （ 例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J C ウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモータ 一、 ②各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス夕一、 ラ ット、 マウスなど） 由来のプロモーター、 例えば、 アルブミン、 インスリン I I 、 ゥロプラキン I I、 エラス夕ーゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレ ァチンキナーゼ、 グリア繊維性酸性タンパク質ク、 ダルタチオン S—トランスフ エラーゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン K l， 1 0ぉょび1：1 4、 コラー ゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ] 3 Iサブュ ニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナトリ ゥム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略される ) 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロテ イナーゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン /3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ポリ ペプチド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 α) 、 βァクチン、 ひおよび j8ミオシン重鎖 、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy — 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポ一ネン ト、 ミオグロビン、 トロポニン (：、 平滑筋ひァクチン、 プレブ口エンケフアリン A、 バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 全身で高発 現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、 ヒトポリペプチド鎖延 長因子 1 ひ （EF— l o のプロモー夕一、 ヒトおよびニヮトリ /3ァクチンプロ モータ一などが好適である。
上記べクタ一は、 DN A転移哺乳動物において目的とする mRN Aの転写を終 結する配列 （一般に夕一ミネ夕一と呼ばれる） を有していることが好ましく、 例 えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用いることがで き、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネ一夕一などが用いられる その他、 目的とする外来性 D N Aをさらに高発現させる目的で各 D N Aのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 D NAのイントロンの一部などを プロモーター領域の 5 '上流、 プロモー夕一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 '下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 各種哺乳動物 （例えば、 ヒ卜、 ゥサ ギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 繊維芽細胞由来 D NAおよび市販の各種ゲノム D NAライブ ラリーよりゲノム D NAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺 細胞、 繊維芽細胞由来 R NAより公知の方法により調製された相補 D NAを原料 として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D NAは、 上記の細胞または 組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異し た翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D NAコンストラクトとして、 前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の 遺伝子工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D N Aが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D NAを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能亢進症 (例、 転写、 骨 ·軟骨分化誘導などの亢進症）を発症 することがあり、 その病態モデル動物として利用することができる。 例えば、 本 発明の正常 D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能亢進症や、 本発 明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法 の検討を行なうことが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連する疾患に 対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D NA保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D N Aを前述のプラス ミドに組み込んで原科として用いることができる。 プロモータ一との D NAコン ストラク卜は、 通常の遺伝子工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D NAが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D NAを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D NAを相同染色体の両方に持つホ モザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 本発明の異常 D N Aを有する非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の異常 D N Aが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D NA転移動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の夕 ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応 症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D NA転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D NA転移動物の組織中の D N Aもしくは R N Aを直接分析するか、 または D N Aにより発現されたタンパク質組織を分析することによる、 本発明の タンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性につい ての解析、
③ D N Aを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使用し て、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリ 一二ング、 および
⑤本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D N A転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。 また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のタンパク 質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DNA転移動物ま たは本発明の外来性 DNA発現べクタ一を用いて、 本発明のタンパク質が関連す る疾患の D N A治療法を検討、 開発することが可能である。
(7) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本 発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の DNAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞、
(2) 該 DNAがレポ一ター遺伝子 （例、 大腸菌由来の ;8—ガラクトシダ一ゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒ卜哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポーター遺伝子 （例、 大腸菌由来の /3—ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポーター遺伝子が本発明の DN
Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒ卜哺乳動物、 および (10) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒ卜哺乳 動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 DNAがコードしている本発明のタンパク質の活性 を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明のタンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒ卜 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 D N A配列の一部又は全部の削除、 他の D N Aを挿入または置換さ せることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの 読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊すること により本発明のノックァゥト DNAを作製すればよい。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z (jS—ガラクトシダーゼ遺伝子 ) 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表 とするレポーター遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソン間のィントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DN A配列 （ 例えば、 ポリ A付加シグナルなど） を挿入し、 完全な mRNAを合成できなくす ることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 夕ーゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え 法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DNA上 あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーシヨン 解析あるいは夕一ゲッティングベクター上の DNA配列とターゲッティングべク 夕一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列をプライマーと した PC R法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を選別することによ り得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Eva nsと Kauimaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES 細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学 的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が 明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BL/6マウスや C 5 7 BL/6の採卵数の少なさを DBA/2との交雑により改善した BDF 1マウ ス （C 57BL/6と DBAZ2との F 1) を用いて樹立したものなども良好に 用いうる。 BDF1マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点 に加えて、 C 57 BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES 細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BL/ 6マウスとバッククロス することでその遺伝的背景を C 57 BLZ 6マウスに代えることが可能である点 で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例として挙げることができる 。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要し ていたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養 初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能で あり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。 また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1- 1000 OU/m'l) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気ま たは 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90 %空気） で約 37 °Cで培養するなどの方法で 培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0. 001— 0 . 5%トリプシン Z0. 1— 5mM EDTA、 好ましくは約 0. 1 %トリプシ ン /ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフィーダ一細胞 上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1一 3日毎に行なう が、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその 培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの種 々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufm an, ネィチヤ一 （Nature) 第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin プロシ一デ ィングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス ·ュ一エスェ一 （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschmanら、 ジャーナル ·ォブ ·ェンブリオロジ一 ·アンド ·ェクスペリメンタル ·モルフォ 口ジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発 明の DNA発現不全細胞は、 インビト口における本発明のタンパク質の細胞生物 学的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRN A量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。 該非ヒ卜哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入により夕ーゲッティングベクタ一の本発明の D N Aが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の D NAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D NAを ノックアウトさせることができる。
本発明の D NAがノックアウトされた細胞は、 本発明の D NA上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼ一ション解析またはター ゲッティングベクター上の D N A配列と、 夕一ゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D NAが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D NA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することにより夕一ゲッティングベクタ一を染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に 変異のあるものを選択することにより得られる。 このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D NAがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D NAの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NAを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ —ト動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴ一トおよびへテ ロザィゴ一卜動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 本発明のタンパク質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及 び治療法の検討に有用である。
( 7 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効 果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷など に起因する疾病、 例えば、 骨 ·軟骨疾患、 例えば整形外科領域の疾患 （例、 骨折 、 変形性関節症、 骨関節炎、 半月板損傷等の軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟 骨無形成症などの先天性骨 ·軟骨疾患） 、 歯科領域の疾患 （例、 口蓋裂） 、 骨粗 鬆症などの疾患に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などが 挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。
具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し 、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を 指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
例えば、 G L I 1遺伝子発現不全に起因して起こるような軟骨損傷治癒不全に 対して治療 ·予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物に骨 ·軟骨損傷処置 （例えば、 骨折など） を行ない、 骨 ·軟骨損傷処置前または処置後に試験化合物を投与し、 該動物の軟骨分化マ一 カーの発現量、 体重変化などを経時的に測定する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の軟骨分化マーカーが約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ま しくは約 5 0 %以上上昇した場合、 該試験化合物を軟骨損傷に対して治療 ·予防 効果を有する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物 から選ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質等の欠損や損傷などによって引 き起こされる疾患、 例えば、 骨 ·軟骨疾患、 例えば整形外科領域の疾患 （例、 骨 折、 変形性関節症、 骨関節炎、 半月板損傷等の軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症などの先天性骨 ·軟骨疾患） 、 歯科領域の疾患 （例、 口蓋裂） 、 骨 粗鬆症などの疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で 低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記ス クリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができ る。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例アル カリ金属） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好 ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水 素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フ マル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸 、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、，前記 した本発明のタンパク質の活性を調節する化合物を含有する医薬と同様にして製 造することができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 軟骨損傷の治療目的で該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜； L 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象 、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 軟骨損傷の治療目的で該化合物を 注射剤の形で通常成人 （6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物 を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好まし くは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の 動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投与することができる。
(7 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進する化合物をスクリ 一二ング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DNAに対するプ ロモ一ターの活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供す る。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D NAがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕一遺伝 子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものが挙げられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 /3—ガラクトシダ ーゼ遺伝子 （1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファタ一ゼ遺伝子またはルシフ エラ一ゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DN Aをレポーター遺伝子で置換された本発明の DNA発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの支 配下に存在するので、 レポ一夕一遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする DNA領域の一部を大腸菌由来の ]3 —ガラクトシダーゼ遺伝子 （1 a c Z) で置換している場合、 本来、 本発明の夕 ンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに jS—ガラクトシダ一 ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモ—4—クロロー 3—インドリル一 /3 一ガラクトピラノシド （X— g a l) のような /3—ガラクトシダーゼの基質とな る試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内に おける発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損 マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩液 （PBS) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 37°C付近 で、 約 30分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を ImM EDTA/PBS 溶液で洗浄することによって、 ]8—ガラクトシダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を観 察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mRNAを検出しても よい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の DN Aに対するプロモーター活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸） や塩基 （例、 有機酸） な どとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この 様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレ イン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスル ホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明の D NAに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質の発現を促進し、 該タンパク質の機能を促進することができ るので、 例えば、 骨 ·軟骨疾患、 例えば整形外科領域の疾患 （例、 骨折、 変形性 関節症、 骨関節炎、 半月板損傷等の軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成 症などの先天性骨 ·軟骨疾患） 、 歯科領域の疾患 （例、 口蓋裂） 、 骨粗鬆症など の疾患などに対する安全で低毒性な治療 ·予防剤などの医薬として有用である。 該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造すること ができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 哺乳動物 (例えば、 ヒト、 ラッ卜、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 軟骨損傷の治療目的で本発明の D NAに対するプロモ 一夕一活性を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k g として） においては、 一日につき該化合物を約 0 . l〜1 0 0 m g、 好ましくは 約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜 2 0 m g投与する。 非経口的に 投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異 なるが、 例えば、 軟骨損傷の治療目的で本発明の D N Aに対するプロモーター活 性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 O k gとして） に投与する場合 、 一日につき該化合物を約 0 . 0 1〜3 O m g程度、 好ましくは約 0 . 1〜2 0 m g程度、 より好ましくは約 0 . 1〜1 O m g程度を静脈注射により投与するの が好都合である。 他の動物の場合も、 6 O k g当たりに換算した量を投与するこ とができる。
このように、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAに対 するプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩をスクリーニングする上 で極めて有用であり、 本発明の D NA発現不全に起因する各種疾患の原因究明ま たは予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有する D NAを使って、 そ の下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注 入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異 的にその夕ンパクを合成させ、 その生体での作用を検討することも可能となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発現 するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内での産生 能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使 用できる。 また該プロモータ一部分を解析することにより新たなシスエレメント やそれに結合する転写因子を見つけることも可能である。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、 I U P A C - I U B Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるい は当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミ ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものと する。
D NA デォキシリポ核酸
c D NA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
R NA リポ核酸 mRNA リポ核酸
G 1 y
A 1 a ァラニン
Va 1
Leu
I 1 e イソロイシン
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グル夕ミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリブトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
[配列番号： 1 ]
G 1 i 1 mRNAの量を測定する際に使用できる PCR用プライマ一を示す （実施例 4および 5)
[配列番号： 2]
G 1 i 1 mRNAの量を測定する際に使用できる PCR用プライマーを示す (実施例 4および 5)
[配列番号： 3]
マウス G 1 i 1 cDN Aの取得のために使用したプライマ一を示す。
[配列番号： ]
マウス G 1 i 1 cDN Aの取得のために使用したプライマ一を示す。
[配列番号： 5]
実施例 1、 2および 4の RT— PCRで使用したプライマーを示す。
[配列番号： 6]
実施例 1、 2および 4の RT— PCRで使用したプライマーを示す。
[配列番号： 7]
実施例 3の RT P C Rで使用したプライマーを示す。
[配列番号： 8]
実施例 3の RT PCRで使用したプライマ一を示す。
[配列番号： 9]
マウス G i 1遺伝子 （cDNA) の塩基配列を示す。
[配列番号 10]
マウス G i 1タンパク質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号 11]
ヒ卜 G 1 1タンパク質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号 12]
ヒ卜 G 1 1遺伝子 （cDNA) の塩基配列を示す。
[配列番号 13]
ヒ卜 G 1 1変異タンパク質 1のァミノ酸配列を示す。
[配列番号 14]
ヒ卜 G 1 1変異遺伝子 1 (cDNA) の塩基配列を示す。
[配列番号 15]
ヒ卜 G 1 1変異タンパク質 2のァミノ酸配列を示す。
[配列番号 16]
ヒ卜 G 1 1変異遺伝子 2 (cDNA) の塩基配列を示す。 [配列番号： 17]
ヒト Gl i 1変異タンパク質 3のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 18]
ヒ卜 Gl i 1変異遺伝子 3 (cDNA) の塩基配列を示す。
[配列番号： 19]
マウス Gl i 3タンパク質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 20] . マウス Gl i 3遺伝子 （cDNA) の塩基配列を示す。
[配列番号： 21]
ヒト Gl i 3タンパク質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 22]
ヒト G l i 3遺伝子 （cDNA) の塩基配列を示す。 実施例
以下に、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、 本発明はそれらに限定 されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作は、 モレキユラ一 .ク ローニング （Molecular Cloning) に記載されている方法に従い、 各種キット類 の使用法は添付されているマニュアルに従った。 まず実施例に用いた G 1 i 1および S c 1 e r a X i s発現べクタ一の作製方 法、 細胞培養条件、 遺伝子導入法を以下に示す。
CG 1 i 1発現べクタ一の調製〕
マウス 19日胎児ライブラリ一より配列番号： 3および 4に示すプライマーを 使用し、 PfuTurbo(Stratagene)DNA polymerase を用いて P C R法にてマウス G 1 i 1 cDNAを得た。 得られた断片は pCRb 1 un t (Invitrogen) べク ターにクローニング後、 塩基配列を決定した。 その結果、 得られた遺伝子は公知 のマウス遺伝子である AF 026305とはアミノ酸レベルで 24個、 また AB 025922とは同じく 2個の異なる配列を有していた 〔DNA配列:配列番号 ： 9 (マウス G 1 i 1遺伝子の塩基配列は具体的には配列番号： 9の第 213番 目の Aから第 3545番目の Cまでの塩基配列） 、 タンパク質のアミノ酸配列： 配列番号： 10および図 1〕 。 次にこのべクタ一を No t I、 H i n d I I Iで 消化し、 pcDNA3. 1 (Invitrogen) に G 1 i 1断片をサブクロ一ニングす ることによつて動物細胞発現べクターを調製した。
CS c 1 e r a X i s発現べクタ一の調製〕
S c 1 e r a X i sは骨 ·軟骨分化に関与することが報告されているが (Liu， Y . et al. J. Biol. C em. (1997) 272, 29880-29885), その機能の詳細は不明な ところが多い転写因子である。 マウスライブラリーより PCR法にてマウス S c 1 e r a X i s c D NAを得た。 得られた断片は p C R b 1 u n t (Invitroge n) ベクタ一にクローニング後、 B amH I— Xh o Iで消化し、 pcDNA3 . 1 (Invitrogen)に Sc l e r ax i s断片をサブクローニングすることによつ て動物細胞発現べクタ一を調製した。
〔細胞培養法〕
マウス繊維芽細胞株 C 3 H 10 T 1 Z 2株、 およびマウス筋芽細胞種 C 2 C 1 2は ATCCより購入し、 10% FBSを含む DMEM (GI BCO) にて培 養した。 ヒ卜正常軟骨細胞は東洋紡より購入しヒト正常軟骨細胞培養キッ卜に含 まれる Chondrocytes growth mediumを用い、 細胞培養ディッシュ （Fa l c on ) で培養した。 なお、 この細胞はディッシュで培養しているため脱分化しており 、 軟骨細胞マ一カーである I I型 Bコラーゲン遺伝子は発現しなくなつている。
〔遺伝子導入法〕
ゥエルあたり約 15万個の細胞を 24ゥエルプレートに播き、 翌日上記発現べ クタ一と Fugene6 (ベーリンガー） を混和し、 各種細胞に添加することによって トランスフエクシヨンした。
〔化合物添加法〕 ゥエルあたり約 20万個の細胞を 24ゥエルプレートに播き、 2時間後、 ジメ チルスルフォキシド （DMSO) に溶解した 9- (2- Tetrahydrofury adenine (T HFA) を添加した。 最終 DMSO濃度は 0. 1% (v/v) 以下とした。 〔発現量比較〕
トランスフエクシヨン、 あるいは化合物添加後 2日目に RNeasy mini kit (Qia gen) を用いて RNAを抽出し、 message clean kit (genhunter) で DNas e 処理した後、 RNAPCR kit (Takara) に従い RT— P CRを行った。 反応後、 ァ ガロースゲルにて電気泳動し、 Gel image (Genomic solutions) を用いて目的の バンドの比較を行った。 実施例 1 G l i 1発現ベクター導入によるマウス C3H10T1Z2細胞の軟 骨分化に及ぼす影響
G 1 i 1発現べクタ一または p c DNA3. 1を C 3H 10 T 1 / 2細胞株に トランスフエクシヨン後， 2日目に配列番号： 5および 6に示すプライマーを用 いて RT— P CRを行ったところ軟骨分化のマーカ一である I I型 Bコラーゲン 遺伝子 （Co 12 a l) の発現が、 ベクター pcDNA3. 1 (Invitrogen) を 導入した場合を 1とすると G 1 i lを導入すると 3. 0を示した。 また、 この時 同時に Sonic hedgehog, Indian hedgehogおよび S c 1 e r a x i sの発現を見 たが、 全く発現を認めなかった。 実施例 2 G 1 i 1発現ベクター導入によるマウス C2C 12細胞の軟骨分化に 及ぼす影響
G 1 i 1発現べクタ一または p c DNA3. 1を C 2 C 12細胞株にトランス フエクシヨン後 2日目に配列番号： 5および 6に示すプライマーを用いて RT— PCRを行ったところ、 この細胞はベクター p CDNA3. 1を導入した場合 C o 12 a 1を全く発現していなかつたのに対し、 G l i l遺伝子を導入すること によって C o 12 a 1の発現を認めた。 実施例 3 G l i 1発現ベクター導入による脱分化型ヒ卜正常軟骨細胞の再分化 に及ぼす影響
G 1 i 1発現ベクターまたは p CDNA3. 1を脱分化型ヒト正常軟骨細胞に トランスフエクシヨン後 2日目に配列番号： 7および 8に示すプライマーを用い て RT— PCRを行ったところ、 この細胞はべクタ一 p cDNA3. 1を導入し た場合 COL 2 A1を全く発現していなかつたのに対し、 G l i 1遺伝子を導入 することによって COL 2 A1の発現を認めた。 実施例 4 マウス C3H10T 1Z2細胞の軟骨分化に及ぼす S c 1 e r ax i s遺伝子の発現による軟骨分化に及ぼす効果
マウス C3H10T 1X2細胞の軟骨分化に及ぼす G 1 i 1以外の転写因子の 発現による軟骨分化に及ぼす効果を見るために、 S c 1 e r ax i s遺伝子をト ランスフエクシヨンした。 トランスフエクシヨン 2日目に配列番号： 5および 6 に示すプライマーを用いて RT_ PC Rを行ったところ軟骨分化のマーカーであ る I I型 Bコラーゲン遺伝子 （Co 1 2 a 1) の発現が、 ベクター p cDNA3 . 1を導入した場合の約 2倍向上していた。 この時同様に S c 1 e r a X i sit 伝子発現による G l i 1遺伝子の発現を配列番号： 1および 2に示すプライマー を用いて見たところ p CDNA3. 1を導入した場合の約 2. 5倍向上している ことがわかった。
このことは S c 1 e r ax i sの軟骨分化に対する効果は G 1 i 1の発現上昇 に起因することを示唆しているが、 Sonic hedgehogおよび Indian hedgehogはこ の条件ではいずれも発現しておらず、 S c 1 e r ax i sはヘッジホッグを介さ ずに G l i 1を誘導しうることがわかった。 即ちヘッジホッグタンパク質を用い なくとも G l i 1を介した軟骨分化を誘導しうることが明らかとなった。 実施例 5 G 1 i 1発現を誘導する低分子化合物の探索
C3H10T1Z2細胞を用いて G 1 i 1発現を誘導する低分子化合物を探索 した。 その結果、 9- (2-Tetraiiydrofuryl) adenine (THFA) を 500 /iMで添加 すると 2日後には G l i 1遺伝子の発現は DM SO添加時に比べ約 2. 3倍向上 していることが配列番号： 1および 2に示すプライマーを使用した R T— P C R にてわかった。
この時 C o 1 2 a 1の発現も約 2 . 3倍向上していた。 この場合も S c l e r a x i sや Sonic hedgehog, Indian hedgehogの発現は認められず、 TH F Aの 軟骨分化誘導効果はヘッジホッグタンパクを介さずに G 1 i 1を誘導することに 起因していることがわかった。 以上の結果より、 G l i 1の発現の増減を指標として選択される化合物は骨- 軟骨疾患予防、 治療薬として有望であることが判明した。
また上記の実験はマウスの遺伝子を用いて実施されたが、 ヒトの遺伝子とマウ スの遺伝子には非常に高い相同性があることは既知であり、 ヒ卜の遺伝子を用い てもこれらの結果と同様の結果が得られることは容易に予測できる。 産業上の利用可能性
G 1 i 1遺伝子またはその産物は骨あるいは軟骨分化誘導活性をするため、 整 形外科領域の疾患 （例、 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 半月板損傷等の軟骨損 傷、 外傷、 腫瘍摘出などによる骨、 軟骨欠損部の再生、 脊椎固定術、 脊柱管拡大 術などの骨再建、 骨形成不全症、 軟骨無形成症などの先天性骨 ·軟骨疾患） また は、 歯科領域の疾患 （例、 口蓋裂、 下顎骨再建術、 歯槽堤形成術などの骨再建） 、 さらには骨粗鬆症などの予防 ·治療剤として用いることができる。 また、 美容 外科領域における骨移植の治療剤としても用いることができるし、 再生医療にお ける自家移植の際の分化誘導剤としても利用できる。
また、 G l i 1タンパク質等を用いたスクリーニング方法、 G l i 1遺伝子を 発現する能力を有する細胞を用いたスクリーニング方法またはレポ一夕一遺伝子 発現形質転換体を用いたスクリーニング方法は、 G l i 1遺伝子の発現を制御 （ 促進または阻害） する活性を有する化合物、 G l i 1遺伝子のプロモー夕一もし くはェンハンサ一の活性を制御 （促進または阻害） する作用を有する化合物、 骨 ，軟骨分化調節 （促進または阻害） 作用を有する化合物、 またはそれらの塩の探 索に用いることができる。 このような化合物を用いて G 1 i 1遺伝子またはその産物の作用 （例、 転写活 性） を増強または活性化することによって骨 ·軟骨分化を誘導することができる 上記スクリーニングにより得られうる G 1 i 1遺伝子の発現を促進する活性を 有する化合物などは骨、 あるいは軟骨誘導活性を有するため、 整形外科領域の疾 患 （例、 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 半月板損傷等の軟骨損傷、 外傷、 腫瘍 摘出などによる骨、 軟骨欠損部の再生、 脊椎固定術、 脊柱管拡大術などの骨再建 、 骨形成不全症、 軟骨無形成症などの先天性骨 ·軟骨疾患） または、 歯科領域の 疾患 （例、 口蓋裂、 下顎骨再建術、 歯槽堤形成術などの骨再建） 、 さらには骨粗 鬆症などの予防 ·治療剤として用いることができる。 また、 美容外科領域におけ る骨移植の治療剤としても用いることができるし、 再生医療における自家移植の 際の分化誘導剤としても利用できる。
一方、 上記スクリーニングにより得られうる G 1 i 1遺伝子の発現を阻害する 活性を有する化合物や G l i 1遺伝子のアンチセンス D NAなどは、 例えば骨 · 軟骨形成過剰症の予防 ·治療剤として用いることができる。

Claims

請求の範囲
1. G 1 i lタンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩を含有する骨 ·軟骨分 化誘導剤。
2. G 1 i 1タンパク質が配列番号： 10、 配列番号： 1 1、 配列番号： 13、 配列番号： 15または配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である請求項 1記載の剤。
3. G 1 i 1タンパク質が配列番号： 10、 配列番号： 1 1、 配列番号： 13、 配列番号： 15または配列番号： 17で表されるアミノ酸配列を含有するタンパ ク質である請求項 1記載の剤。
4. G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩を含有する骨折、 変形 性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症または骨粗 鬆症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再建剤または骨移植治療 剤。
5. G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAを含有する 骨 ·軟骨分化誘導剤。
6. DN Aが配列番号： 9、 配列番号： 12、 配列番号： 14、 配列番号： 16 または配列番号： 18で表される塩基配列を含有する請求項 5記載の剤。
7. G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAを含有する 組換えベクターを含有する請求項 5記載の剤。
8. G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAを含有する 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症 または骨粗鬆症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再建剤または 骨移植治療剤。
9. G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の有効量を哺乳動物に 投与することを特徴とする骨 ·軟骨分化誘導方法。
10. G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の有効量を哺乳動物 に投与することを特徴とする骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療方法。
11. 骨 '軟骨分化誘導剤を製造するための G 1 i 1タンパク質、 その部分ぺプ チドまたはそれらの塩の使用。
12. 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無 形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再建剤 または骨移植治療剤を製造するための G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドま たはそれらの塩の使用。
13. G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAの有効量 を哺乳動物に投与することを特徴とする骨 ·軟骨分化誘導方法。
14. G l i 1タンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAの有効量 を哺乳動物に投与することを特徴とする骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損 傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療方法。
15. 骨 ·軟骨分化誘導剤を製造するための G l i 1タンパク質またはその部分 ペプチドをコードする DN Aの使用。
16. 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無 形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再建剤 または骨移植治療剤を製造するための G 1 i 1タンパク質またはその部分べプチ ドをコードする DN Aの使用。
17. 配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 13、 配列番号： 15また は配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNAの塩基 配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するァンチセンス D N A を含有する骨 ·軟骨分化阻害剤。
18. 配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 13、 配列番号： 15また は配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DN Aの塩基 配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンス DNA •を含有する骨 ·軟骨形成過剰症の予防 ·治療剤。
19. 配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 13、 配列番号： 15また は配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNA、 また は該 D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するァ ンチセンス D N Aを含有する骨 ·軟骨疾患の診断剤。
2 0 . 配列番号： 1 0、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 3、 配列番号： 1 5また は配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードする D NA、 また は該 D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含有するァ ンチセンス D NAを用いることを特徴とする骨 ·軟骨疾患の診断方法。
2 1 . G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の抗体を含有す る骨 ·軟骨疾患の診断剤。
2 2 . G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の抗体を用いる ことを特徴とする骨 ·軟骨疾患の診断方法。
2 3 . G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を用いることを 特徴とする骨 ·軟骨分化調節作用を有する化合物またはその塩のスクリーニング 方法。
2 4 . G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞 を用いることを特徴とする請求項 2 3記載のスクリーニング方法。
2 5 . G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞 を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、 軟骨分化のマーカー遺伝子の発 現量を測定することを特徴とする請求項 2 3記載のスクリ一ニング方法。
2 6 . 軟骨分化のマーカー遺伝子が I I型 Bコラーゲン遺伝子である請求項 2 5 記載のスクリーニング方法。
2 7 . G 1 i 1タンパク質またはその部分ペプチドを発現する能力を有する細胞 を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、 細胞の軟骨分化状態を観察する ことを特徴とする請求項 2 3記載のスクリーニング方法。
2 8 . G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を含有すること を特徴とする骨 ·軟骨分化調節作用を有する化合物またはその塩のスクリ一ニン グ用キッ卜。
2 9 . 請求項 2 3〜2 7記載のスクリーニング方法、 または請求項 2 8記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる、 骨ノ軟骨分化調節作用を有する化合 物またはその塩。
3 0 . 請求項 2 9記載の化合物またはその塩を含有する骨 ·軟骨分化調節剤。
3 1 . 請求項 2 9記載の化合物またはその塩を含有する骨折、 変形性関節症、 骨 関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症、 骨粗鬆症または骨 ·軟 骨形成過剰症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の再生治療剤、 骨再建剤または骨 移植治療剤。
3 2 . 請求項 2 9記載の化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与すること を特徴とする骨 ·軟骨疾患の予防 ·治療方法。
3 3 . 請求項 2 9記載の化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与すること を特徴とする骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症、 骨粗鬆症または骨 ·軟骨形成過剰症の予防 ·治療方法。
3 4 . 骨 ·軟骨疾患の予防'治療剤を製造するための請求項 2 9記載の化合物また はその塩の使用。
3 5 . 骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無 形成症、 骨粗鬆症または骨 ·軟骨形成過剰症の予防 ·治療剤、 骨 ·軟骨欠損部の 再生治療剤、 骨再建剤または骨移植治療剤を製造するための請求項 2 9記載の化 合物またはその塩の使用。
3 6 . G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の作用を増強または 活性化することを特徴とする骨 ·軟骨分化誘導方法。
3 7 . G 1 i 1タンパク質、 その部分ペプチドまたはその塩の作用を増強または 活性化することを特徴とする骨折、 変形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症または骨粗鬆症の予防 ·治療方法。
3 8 . G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を用いることを特徴とする G 1 i 1遺伝子の発現を制御する活性を有する化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法。
3 9 . G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および 非存在下に培養し、 G l i 1遺伝子 D NAもしくはその相補 D NAまたはその部 分 D NAを用いてそれぞれの G 1 i 1タンパク質をコードする mR NAの量を測 定することを特徴とする請求項 3 8記載のスクリ一二ング方法。
4 0 . G 1 i 1遺伝子のプロモーターもしくはェンハンサ一をレポーター遺伝子 に連結させた D N Aで形質転換した細胞を試験化合物の存在下および非存在下に 培養し、 それぞれの該レポ一夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする G 1 i 1遺伝子のプロモータ一もしくはェンハンサ一の活性を制御する作用を有する 化合物またはその塩のスクリーニング方法。
4 1 . G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞が骨または軟骨への分化能を 有する細胞あるいは既に分化形態を示している細胞である請求項 3 8記載のスク リーニング方法。
4 2 . G 1 i 1遺伝子を発現する能力を有する細胞を含有することを特徴とする G 1 i 1遺伝子の発現を制御する活性を有する化合物またはその塩のスクリ一二 ング用キッ卜。
4 3 . G 1 i 1遺伝子のプロモーターもしくはェンハンサーをレポ一夕一遺伝子 に連結させた D NAで形質転換した細胞を含有することを特徴とする G 1 i 1遺 伝子のプロモーターもしくはェンハンサ一の活性を制御する作用を有する化合物 またはその塩のスクリーニング用キット。
4 4. 請求項 3 8記載のスクリーニング方法、 または請求項 4 2記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうる、 G l i 1遺伝子の発現を制御する活性を有 する化合物またはその塩 （但し、 G l i 3遺伝子またはその産物を除く） 。
4 5 . 請求項 4 0記載のスクリーニング方法、 または請求項 4 3記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られうる、 G l i 1遺伝子のプロモーターもしくはェ ンハンサ一の活性を制御する作用を有する化合物またはその塩。
4 6 . 請求項 4 4または 4 5記載の化合物またはその塩を含有する医薬。
4 7 . 請求項 4 4または 4 5記載の化合物またはその塩を含有する骨 ·軟骨疾患 の予防 ·治療剤。
4 8 . 請求項 4 4または 4 5記載の化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投 与することを特徴とする骨 ·軟骨疾患の予防'治療方法。
4 9 . 骨 ·軟骨疾患の予防 ·治療剤を製造するための請求項 4 4または 4 5記載 の化合物またはその塩の使用。
5 0 . G 1 i 1遺伝子の発現を増強または活性化することを特徴とする骨 ·軟骨 分化誘導方法。
5 1 . G 1 i 1遺伝子の発現を増強または活性化することを特徴とする骨折、 変 形性関節症、 骨関節炎、 軟骨損傷、 外傷、 骨形成不全症、 軟骨無形成症または骨 粗鬆症の予防 ·治療方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1960758B (zh) * 2004-03-31 2014-10-22 中外制药株式会社 关节炎的治疗剂或预防剂

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000025725A2 (en) * 1998-11-02 2000-05-11 Biogen, Inc. Functional antagonists of hedgehog activity
WO2000041545A2 (en) * 1999-01-13 2000-07-20 Ontogeny, Inc. Regulators of the pct or smoothened pathway, compositions and uses related thereto

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000025725A2 (en) * 1998-11-02 2000-05-11 Biogen, Inc. Functional antagonists of hedgehog activity
WO2000041545A2 (en) * 1999-01-13 2000-07-20 Ontogeny, Inc. Regulators of the pct or smoothened pathway, compositions and uses related thereto

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE CAPLUS [online] AMERICAN CHEMICAL SOCIETY (ACS), (COLUMBUS, OHIO, USA); accession no. STN Database accession no. 131:309211 *
KOGERMAN P. ET AL.: "Mammalian suppressor-of-fused modulates nuclear-cytoplasmic shuttling of GLI-1", NAT. CELL BIOL., vol. 1, no. 5, 1999, pages 312 - 319, XP002948317 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1960758B (zh) * 2004-03-31 2014-10-22 中外制药株式会社 关节炎的治疗剂或预防剂

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