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WO2002006520A1 - Method of screening compound controlling mek/erk signal transduction and medicinal use of the compound - Google Patents

Method of screening compound controlling mek/erk signal transduction and medicinal use of the compound Download PDF

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Publication number
WO2002006520A1
WO2002006520A1 PCT/JP2001/006171 JP0106171W WO0206520A1 WO 2002006520 A1 WO2002006520 A1 WO 2002006520A1 JP 0106171 W JP0106171 W JP 0106171W WO 0206520 A1 WO0206520 A1 WO 0206520A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
lkb1
mek
test sample
erk
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2001/006171
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jun-Ichi Nezu
Takakazu Mizuno
Asuka Ose
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Chugai Research Institute for Molecular Medicine Inc
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Chugai Research Institute for Molecular Medicine Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd, Chugai Research Institute for Molecular Medicine Inc filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority to AU2001271067A priority Critical patent/AU2001271067A1/en
Publication of WO2002006520A1 publication Critical patent/WO2002006520A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a compound that regulates MEK / ERK signaling, and a pharmaceutical use of the compound.
  • the present invention relates to screening for a compound that regulates intracellular signal transduction associated with Peutz-Jeghers syndrome and its pharmaceutical use.
  • Fenne, et al. Considered this to be a candidate for the causative gene, and performed mutation analysis of the LKB1 gene in PJS patients, and found that the LKB1 gene mutation was present in all patients examined (Jenne DE et al., Nat Genet 1998 Jan; 18 (l): 38-43).
  • LKB1 is very important in the regulation of cell proliferation and cell differentiation. It is suggested that it plays a role. Therefore, if the intracellular physiology involved in LKB1 can be clarified at the molecular level, drugs that target the molecular mechanism can be rationally designed, thereby artificially controlling these phenotypes. It is considered possible. Such drugs are also expected to be applied to the treatment and prevention of diseases such as S. However, at this stage, the molecular mechanism of LKB1-related intracellular physiology has not been elucidated at the molecular level. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to elucidate the intracellular physiological mechanism involving LKB1, which is a causative gene, and to provide a compound that controls the intracellular mechanism and a screening method thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a drug containing a compound that controls the intracellular physiological mechanism as an active ingredient.
  • the present inventors aimed to identify intracellular signaling pathways involving LKB1, and examined the involvement of LKB1 in various known signaling pathways. The results revealed that LKB1 strongly suppressed activation of the c-fos gene promoter by activated K_Ras in HeLa cells (Fig. 1).
  • This c-fos promoter has SRE (serum responsive element), CRE (cAMP responsive element), and TRE (TPA responsive element) as known transcription regulatory element binding elements. It is known that activation of the promoter occurs mainly by activation of SRE by a Ras / MEK / ERK-mediated pathway (Fukumoto Y et al., J Biol Chem 1990 Jan 15; 265 (2): 774-80).
  • this pathway activates c-Raf kinase by Ras, which in turn activates MEK1,2 kinase, then ERK1,2 kinase, and ultimately transcription factors.
  • Ras a pathway in which gene transcription is activated by phosphorylation of Elkl, which often plays a very important role in the regulation of cell growth as the so-called Ras / MEK / ERK cascade.
  • LKB1 was thought to act on any step of this signaling pathway activated by forced expression of activated K-Ras to suppress SRE activation. Then, the present inventors examined the steps involving LKB1, and found that LKB1 also strongly suppressed the activation of artificial SRE by MEK1, a downstream factor of Ras. ( Figure 3). This suggests that LKB1 acts at least downstream of MEK1.
  • the Ras / MEK / ERK signal transduction pathway is known to play an important role in normal cell proliferation control mechanism as a pathway for transmitting signals from growth factor receptor Yuichi through Ras.
  • LKB1 kinase is inactivated by gene mutation, and the suppression of MEK / ERK signal does not occur, resulting in excessive proliferation of cells, which is expected to appear as a trait such as polyposis or carcinogenesis. Therefore, inhibition of LKB1 kinase activity or reduction of LKB1 protein can activate MEK / ERK signaling, and conversely, activate LKB1 kinase or increase LKB1 protein Thus, it is thought that this signaling can be suppressed.
  • Drugs targeting the LKB1 gene and its product kinase are expected to be effective against various diseases caused by abnormal MEK / ERK signaling.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides a compound that controls the MEK / ERK signal transduction mechanism, a method for screening the same, and a drug containing the compound that controls the signal transduction mechanism as an active ingredient. I do.
  • the present invention provides
  • a method for screening a compound that inhibits MEK / ERK signaling comprising:
  • step (c) selecting a compound that increases the kinase activity measured in step (b) as compared to the case where the test sample is not contacted;
  • step (c) selecting a compound that increases the expression level of the LKB1 gene measured in step (b) as compared to the case where the test sample is not contacted,
  • step (c) selecting a compound that reduces the kinase activity measured in step (b) as compared to the case where the test sample is not contacted,
  • step (c) selecting a compound that reduces the expression level of the LKB1 gene measured in step (b) as compared to the case where the test sample is not contacted,
  • step (c) selecting a compound that reduces the reporter activity measured in step (b) as compared to when the test sample is not contacted, (6) The method according to (5), wherein the protein constituting the Ras / MEK / ERK signaling pathway is selected from the group consisting of Ras, c-Raf. MEK1, and MEK2.
  • an agent that suppresses MEK / ERK signal transmission comprising a compound that promotes the kinase activity of LKB1 as an active ingredient
  • an agent that suppresses MEK / ERK signal transmission comprising a compound that promotes expression of the LKB1 gene as an active ingredient
  • an agent which suppresses MEK / ERK signal transduction comprising LKB1 as an active ingredient
  • a drug that promotes MEK / ERK signal transmission comprising a compound that inhibits the kinase activity of LKB1 as an active ingredient
  • an agent that promotes MEK / ERK signal transmission comprising a compound that suppresses LKB1 gene expression as an active ingredient
  • (21) a therapeutic agent for Peutz-Jeggars syndrome, comprising a c-fos promoter or a compound that inhibits the activity of SRE as an active ingredient;
  • MEK / ERK signal transduction means that c-Raf kinase is activated by Ras, one of low-molecular-weight GTP-binding proteins, followed by activation of MEK1,2 kinase, ERK1 and 2 kinases are activated, and finally transcription factors such as Elkl are phosphorylated and activated, and the target gene expression is induced by MEK (Ras / MEK / ERK signal transduction pathway). Means downstream signaling.
  • the present invention provides a method for screening a compound that regulates (promotes or suppresses) MEK / ERK signaling.
  • the LKB1 protein suppresses MEK / ERK signal transmission. It was suggested that this suppression was based on the kinase activity of the LKB1 protein.
  • One embodiment of this screening method relates to a method using the kinase activity of LKB1 protein as an index.
  • a test sample is brought into contact with the LKB1 protein (step (a)), and the kinase activity of the LKB1 protein is measured (step (a)).
  • b)) by selecting a compound that increases or decreases the kinase activity measured in step (b) compared to the case where the test sample is not contacted (step (c)). .
  • the test sample is not particularly limited and includes, for example, a cell extract, a cell culture supernatant, a fermented microbial product, a marine organism extract, a plant extract, a purified or crude protein, a peptide, and a non-peptide compound. , Synthetic low molecular weight compounds and natural compounds.
  • the protein of the present invention to which the material is brought into contact may be, for example, a purified protein or a form bound to a carrier.
  • the test sample may be brought into contact with cells expressing the LKB1 protein.
  • the kinase activity of LKB1 protein is determined by, for example, autophosphorylation by LKB1 protein.
  • the activity can be measured with a liquid scintillation counter or the like as the amount of 32 P transferred from [ ⁇ - 32 P] ATP to LKB1 protein.
  • plasmid DNA for LKB1 expression Approximately 10 ig of plasmid DNA for LKB1 expression (pcDNA3 / LKBlmyc), etc. was obtained by the method using SuperFect (Qiagen) by using C0S7 cells, HeLa cells (cells derived from cervical cancer), cells derived from HeLa cells ( HeLa S3, G361 cells (melanomas), human THP1, K562, SW480, HEK293, mouse NIH3 T3, HL60 (human leukemia-derived cells), normal fibroblasts, normal epithelial cells, normal vascular smooth muscle cells, Transfection into cells such as normal osteoblasts.
  • SuperFect Qiagen
  • NP40 kinase lysis buffer (aOmM Tris-HCl pH 7.8, 1% NP40, 0.15 M sodium chloride, lmM EDTA, 50 mM sodium fluoride, 5 mM sodium pyrrolate, 10 g / ml aprotinin, lmM PMSF). Solubilize the evening protein by mixing at 4 ° C for 30 minutes. Protein A / G plus agarose (Santa Cruz) is added to the cell lysate thus obtained and mixed for 30 minutes to remove non-specifically adsorbed beads.
  • NP40 kinase lysis buffer aOmM Tris-HCl pH 7.8, 1% NP40, 0.15 M sodium chloride, lmM EDTA, 50 mM sodium fluoride, 5 mM sodium pyrrolate, 10 g / ml aprotinin, lmM PMSF.
  • the test sample used is MEK / If the kinase activity is reduced, the test sample used will be a candidate for a compound that promotes MEK / ERK signaling, if the kinase activity is reduced.
  • Another embodiment of the method for screening a compound that regulates MEK / ERK signal transduction relates to a method using LKB1 gene expression as an index, comprising contacting a test sample with a cell that expresses LKB1 gene (step ( a))), measuring the expression level of the LKB1 gene in the cells (step (b)), and increasing or decreasing the expression level of the LKB1 gene measured in the step (b) as compared with the case where the test sample is not contacted. It can be carried out by selecting a compound to be reduced (step (c)).
  • the test sample is not particularly limited as in the above-mentioned screening.
  • Cells expressing the LKB1 gene include, for example, C0S7 cells, HeLa cells (cells derived from uterine facial cancer), HeLa cell-derived cells (HeLa S3, etc.), G361 cells (melanoma), human THP1, K562, SW480 Cells such as HEK293, mouse NIH3T3, HL60 (human leukemia-derived cells), normal fibroblasts, normal epithelial cells, normal vascular smooth muscle cells, and normal osteoblasts can be suitably used.
  • Detection of the expression level of the LKB1 gene can be performed using a method known to those skilled in the art, such as a Northern blotting method or an RT-PCR method.
  • the test sample used is MEK / If the expression level of the LKB1 gene is reduced, the test sample used is a candidate for a compound that promotes MEK / ERK signal transmission.
  • the present invention also provides a method for screening a candidate compound for a therapeutic agent for a therapeutic agent for Peutz-Jeghers syndrome.
  • LKB1 which is the causative gene of Peutz-Jeghers syndrome, suppresses MEK / ERK signaling.
  • candidate therapeutic compounds for Peutz-Jeghers syndrome can be screened using inhibition of MEK / ERK signaling as an index.
  • the method for screening a candidate compound for a therapeutic agent for Boyje-Garz syndrome according to the present invention is based on such findings.
  • a vector containing a structure in which a repo overnight gene is functionally linked downstream of the c-fos promoter or SRE, and a vector expressing a protein that constitutes miEK / ERK signaling were introduced.
  • Cells are provided (step (a)), a test sample is brought into contact with the cells, the reporter activity is measured (step (b)), and compared with the case where the test sample is not contacted, It can be carried out by selecting a compound that reduces the measured reporter activity (step (c)).
  • the promoter region of the c-fos gene can be obtained by screening a genomic DNA library by a conventional method using a c-fos cDNA or a synthetic oligo DNA containing the sequence of the c-fos gene as a probe. Alternatively, it can be obtained by PCR using genomic DNA as type III.
  • the C-fos promoter repo overnight gene can be prepared by incorporating an appropriate region of the DNA fragment thus obtained into an upstream regulatory region of an appropriate reporter gene.
  • pTAL_Luc CL0NTECH
  • pTA-Luc CL0NTECH
  • TAL-SEAP CL0NTECH
  • the SRE repo overnight gene is, for example, "AGGATGTCCATATT AGGACATCTZ SEQ ID NO: 7 "can be prepared by incorporating a sequence repeated several times into the upstream regulatory region of the appropriate repo overnight gene as described above.
  • the SRE reporter gene (pSRE-Luc) is commercially available (Stratagene) and can be used.
  • a vector that expresses a protein constituting the Ras / MEK / ERK signal transduction pathway can be prepared as follows. First, a cDNA having all open reading frames of Ras and MEK1, which are proteins constituting the Ras / MEK / ERK signal transduction pathway, is cloned by a conventional cDNA library-screening RT-PCR method. This is inserted into an appropriate animal cell expression vector, for example, pcDNA3 vector (Invitrogen) and used as an expression vector. At this time, an appropriate mutation can be added so that the protein is constantly activated. For example, in the case of Ras, replace the 12th codon with Val etc.
  • Mutagenesis can be introduced, for example, by a general site-specific mutagenesis method using GeneEditor TM (Promega) or the like.
  • proteins constituting the Ras / MEK / ERK signal transduction pathway to be expressed in a vector include Ras, c-Raf, MEK1, and MEK2.
  • a commercially available vector (Stratagene) can be used as a vector for expressing these proteins.
  • Examples of cells into which the vector is introduced include C0S7 cells, HeLa cells (cells derived from uterine face cancer), HeLa cell-derived cells (HeLa S3, etc.), G361 cells (melanomas), human TH Pl, K562, SW480 Cells such as HEK293, mouse NIH3T3, HL60 (human leukemia-derived cells), normal fibroblasts, normal epithelial cells, normal vascular smooth muscle cells, and normal osteoblasts can be used.
  • C0S7 cells HeLa cells (cells derived from uterine face cancer), HeLa cell-derived cells (HeLa S3, etc.), G361 cells (melanomas), human TH Pl, K562, SW480 Cells such as HEK293, mouse NIH3T3, HL60 (human leukemia-derived cells), normal fibroblasts, normal epithelial cells, normal vascular smooth muscle cells, and normal osteoblasts can be used.
  • Reporter genes that can be used for screening include, for example, SRE reporter gene (pSRE-Luc, Stratagene) and the like.
  • Method for introducing vectors into cells Examples are methods using phospholipids such as SuperFect (Qiagen) and Lipofect Amine (GIBCO BRL) (specifically, the method described in Example 2), calcium phosphate method, electoral poration method, DEAE- It can be performed by a method known to those skilled in the art, such as the dextran method.
  • test sample to be brought into contact with the cells includes, for example, cell extract, cell culture supernatant, fermented microorganism product, marine organism extract, plant extract, purified or crude protein, peptide, non-peptide Sex compounds, synthetic low molecular compounds, natural compounds and the like can be used, but there is no particular limitation.
  • the reporter activity of the cells brought into contact with the test sample is measured by using a suitable substrate that emits chemiluminescence when decomposed by luciferase when luciferase is used as the reporter, and measuring the luminescence with a luminometer. Activity can be assessed.
  • a suitable substrate that emits chemiluminescence when decomposed by luciferase when luciferase is used as the reporter
  • Activity can be assessed.
  • firefly luciferase is used as a reporter
  • firefly luciferin can be used as a substrate.
  • coelenterazine can be used as a substrate.
  • kits and reagents such as Dua Luc if erase TM Reporter Assay System (Promega) can be used.
  • i3 galactosidase or alkaline phosphatase When using i3 galactosidase or alkaline phosphatase as a reporter, use an appropriate substrate that develops a color when decomposed by these enzymes, or an appropriate substrate that emits chemiluminescence, and spectrophotometrically measures the color or emission.
  • the activity can be evaluated by measuring with a luminometer.
  • chloramphenicol acetyltransferase (CAT) is used as the repo overnight
  • chloramphenicol acetyl produced by using chloramphenicol and acetyl CoA which are labeled with 14 C, as substrates, is used.
  • the activity can be evaluated by separately measuring the amount of chloramphenicol by thin layer mouth chromatography or the like.
  • the present invention also provides an agent that regulates (promotes or suppresses) MEK / ERK signaling.
  • LKB1 protein suppresses MEK / ERK signaling. It was suggested that this suppression was based on the kinase activity of LKB1 protein. This fact means that a compound that regulates the kinase activity of LKB1 protein or the expression of LKB1 protein can be a drug that regulates MEK / ERK signaling.
  • the agent for regulating MEK / ERK signaling of the present invention is based on such findings.
  • the agents of the present invention include both reagents used for test and research purposes and medicaments used for the treatment and prevention of diseases.
  • As the active ingredient of the drug for suppressing MEK / ERK signaling of the present invention a compound that promotes the kinase activity of LKB1 protein and a compound that promotes the expression of LKB1 gene can be used. These compounds can be isolated by the above-mentioned screening. It is also possible to use the LKB1 protein or a DNA encoding the protein.
  • a compound that promotes the kinase activity of LKB1 protein and a compound that suppresses the expression of LKB1 gene can be used as an active ingredient of the drug.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • human antibodies or humanized antibodies obtained by genetic recombination are preferred. These antibodies can be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for Peutz-Jeghers syndrome.
  • LKB1 which is a causative gene of Peutz-Jeghers syndrome, suppresses MEK / ERK signal transduction. This fact implies that compounds that inhibit MEK / ERK signaling could be therapeutics for Peutz-Jeghers syndrome.
  • the screening method for a therapeutic agent for Boyle-Jaez syndrome of the present invention is based on such findings.
  • the active ingredient of the therapeutic agent for Peutz-Jeghers syndrome of the present invention includes MEK / ERK sig.
  • Compounds that suppress null transmission can be used.
  • the compound may be a compound that suppresses the activity of the c-fos promoter or SRE. Since SRE is an element specific to MEK / ERK signal transmission involving LKB1, a compound that inhibits the activity of SRE is suitable as an active ingredient of the therapeutic agent for Peutz-Jeggars syndrome of the present invention. is there. These compounds can be isolated by the above-described screening of the present invention.
  • the agent of the present invention is effective when used as a medicament for human animals such as mice, rats, guinea pigs, egrets, chicks, cats, dogs, sheep, bush dogs, sea lions, monkeys, baboons, and chimpanzees.
  • human animals such as mice, rats, guinea pigs, egrets, chicks, cats, dogs, sheep, bush dogs, sea lions, monkeys, baboons, and chimpanzees.
  • a known pharmaceutical method for example, tablets, capsules, elixirs, and microcapsules, which are sugar-coated as necessary, orally, or aseptic solution or suspension in water or other pharmaceutically acceptable liquids Can be used parenterally in the form of injections.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically, sterile water or saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives It is possible to formulate a drug product by combining it with a drug, a binder and the like as appropriate and mixing it in a unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, acacia, excipients such as crystalline cellulose, swelling agents such as corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • Lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above-mentioned materials may further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous injection solutions include, for example, saline, dextrose and other adjuvants Isotonic solution, eg!)-Sorbitol, D-mannose, D_manni! And sodium chloride, and suitable solubilizers, for example, alcohols, specifically, ethanol, polyalcohols, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants, for example, polysorbate 80 (TM), HCO May be used with -50.
  • solubilizers for example, alcohols, specifically, ethanol, polyalcohols, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants, for example, polysorbate 80 (TM), HCO May be used with -50.
  • the oily liquid includes sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent. It may also be combined with a buffer, for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule.
  • Administration to patients can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., or intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally by methods known to those skilled in the art. Yes.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the method of administration, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA, the DNA may be incorporated into a gene therapy vector to perform gene therapy.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, and the like, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the dose of the drug of the present invention varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, generally, for an adult (assuming a body weight of 60 kg), it is about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 100 mg per day. It is believed to be 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the subject of administration, target organ, symptoms, and administration method.
  • injection usually in adults (with a body weight of 60 kg)
  • the amount can be administered in terms of the amount converted per 60 kg body weight or the amount converted per body surface area.
  • FIG. 1 shows the results of detecting the effect of LKB1 on activation of c-fos promoter by activated K-Ras (K-RasV12).
  • LKBl WT represents the wild type LKB1
  • LKBl K78I represents the K78I mutant. + Indicates that each protein was expressed, and-indicates that it was not expressed. The triangles indicate that the amount of transfected plasmid DNA increases as going to the right.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of various intracellular signal transmissions involved in activation of various transcription regulatory factor binding elements on the c-fos promoter-reporter gene.
  • FIG. 3 shows the results of detecting the effect of LKB1 on SRE activation by MEK1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of detecting the effect of LKB1 on activation of the c_fos promoter by MEKK1.
  • FIG. 5 is a view showing the results of detecting the effect of LKB1 on the activation of NFKB by MEKK1.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of detecting the effect of LKB1 on activation of the C-fos promoter by PKA.
  • FIG. 7 is a diagram and a photograph showing the results of detecting the effects of various LKB1 mutants on SRE promoter activation by MEK1. The bottom shows the kinase activity of each mutant.
  • pcDNA3 / LKBlmyc was used as type III, and various mutants were produced by in vitro mutagenesis using GeneEditor TM (Promega). The following primers for mutagenesis were used.
  • K78I mutant 5 'agg agg gcc gtc ate ate e tc aag aag 3' / SEQ ID NO: 3
  • D176N mutant 5 'at t gig cac aag aac ate aag ccg ggg 3' Z distribution 'J number: 4 W308C Mutant: 5 'egg cag cac age tgc t tc egg aag aa 3' Z distribution system No .: 5 L67P mutant: 5 'gtg aag gag gtg ccg gac tcg gag acg 3' distribution!
  • Plasmid DNAs for expression of MEK1 and MEKKU PKA were purchased from Stratagene.
  • Activated K-Ras expression plasmid DNA (pCEV / k-RasV12) was kindly provided by Dr. Fukumo to Yauso of Kobe University School of Medicine. ⁇ Michitake luciferase expression plasmid (PRL / SV40) was purchased from Promega.
  • c_fosLV The c-fos promoter reporter gene (c_fosLV) was kindly provided by Dr. Fukumoto Yauso of Kobe University School of Medicine.
  • the SRE repo overnight gene (pSRE_Luc) was purchased from Stratagene.
  • the NFKB reporter gene (PNFKB_LUC) was purchased from Ciontech.
  • Transfection was performed using SuperFect (Qiagen) according to the method recommended by the manufacturer. That is, Hela cells were sown on a 12-well plate at 10 soils, cultured at room temperature, a mixture of DNA 1.5 and SuperFect 41 was added, and cultured for 3 hours. Thereafter, the medium was replaced, and after culturing for further 24 hours, luciferase activity was measured.
  • SuperFect Qiagen
  • Dual-Lucif eRase TM Reporter Assay System Promega
  • a dual assay method using Mycobacterium luciferase as an endogenous control was performed using the Dual-Lucif eRase TM Reporter Assay System (Promega). Measured. That is, the transfected cells were washed with PBS and then lysed with lXPassive Lysis Buffer of IOOI. Using 51 of these, LucifeRase Assay Reagent II (50 ⁇ 1) was used as a substrate for firefly luciferase, and Stop & Glo ( R ) Reagent (501) was used as a substrate for M. luciferase. Was measured.
  • the cfos promoter has SRE (serum responsive element), CRE (cAMP responsive element), and TRE (TPA responsive element) as known transcription regulatory element binding elements (Fig. 2). ),
  • SRE serum responsive element
  • CRE cAMP responsive element
  • TRE TAA responsive element
  • the activation of this promoter by Ras is known to occur mainly by the activation of SRE by the MEK / ERK-mediated pathway (Fukumoto Y et al., J Biol Chem. 1990 Jan 15; 265 (2): 774-80), LKBl was thought to act on any step in the MEK / ERK signaling pathway to suppress SRE activation.
  • LKBl was thought to act on any step in the MEK / ERK signaling pathway to suppress SRE activation.
  • LKB1 acts on pathways other than the MEK / ERK signaling pathway.
  • C-fosLV cfs promoter-reporter gene
  • pNF / cB-Luc NFKB reporter gene
  • the present invention provides a method for screening a compound that regulates MEK / ERK signaling targeting LKB1.
  • a method for screening PJS therapeutic zen compounds targeting MEK / ERK signaling was provided. This has enabled efficient screening of compounds that regulate MEK / ERK signaling and candidate compounds for PJS therapeutics.
  • the present invention provides pharmaceutical uses of these compounds.
  • the drug is expected to be used as a reagent for regulating MEK / ERK signal transduction or as a medicament for treating or preventing diseases including PJS.

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Description

MEK/ERKシグナル伝達を調節する化合物のスクリ一二ング方法および該化合物の 薬剤用途 技術分野
本発明は、ポイツ ·イエーガーズ症候群に関連する細胞内シグナル伝達を調節す る化合物のスクリーニングおよびその薬剤用途に関する。 背景技術
ポイツ .イエ一ガーズ症候群 (Peutz-Jeghers Syndrome, MIM 175200, PJS)は、 消化管におけるポリポーシス症と、粘膜や皮膚における色素班形成を主な症候とす るヒトの遺伝病である。 PJSは常染色体優性遺伝形式により遺伝するが、 1997年 He 遺 inki等により、 PIS患者家系における連鎖 （リンケージ） 解析からその原因遺伝 子は、第 19番染色体 pl3.3領域にマップされることが示された（He讓 inki A et al., Nat Genet 1997 Jan; 15 (1) :87-90) 。 この領域には、 本発明者らが新規プロティ ンキナーゼ探索プロジェクトにおいて見いだしていた新規セリンノスレオニンキ ナ一ゼ LKB1 (GenBankァクセッションナンバー U63333) が存在する。 ； fenne等はこれ を原因遺伝子の候補であると考え、 PJS患者における LKB1遺伝子の変異解析を行つ たところ、調べた全ての患者において LKB1遺伝子の変異が存在することが明らかと なった （Jenne DE et al., Nat Genet 1998 Jan;18(l) :38-43) 。 さらに、 他のグ ループからも同様の報告が相次いでなされ、 現在までに少なくとも 60種類以上の L KB1遺伝子変異が PJS患者において見いだされている（He匪 inki A et al., Nature 1998 Jan 8;391 (6663) : 184 - 7、 Nakagawa H et al., Hum Genet 1998 Aug; 103 (2)： 168 - 72、 Resta N et al., Cancer Res 1998 Nov 1 ;58(21) :4799- 801、 Ylikorka la A et al., Hum Mol Genet 1999 Jan;8(l) :45-51) 。 また、 本発明者等は、 LKB 1遺伝子産物が自己リン酸化能を持つキナーゼであり、 PJS患者において見いだされ たミスセンス変異はキナーゼ活性を失う変異であることの証明を行った（Mehenn i H et al., Am J Hum Genet 1998 Dec;63(6) :1641-50) 。 これらの事実から、 LKBl セリン/スレオニンキナーゼの遺伝子変異による機能欠損が HSの発症原因である ことが確証されるに至っている。
また、 PJS患者は様々な癌に対する発症リスクが健常人に比較して著しく増加し ていることが疫学的研究から知られており、このことからその原因遺伝子は癌抑制 遺伝子様の活性を持つことが推測されていた。 実際、 PJSと無関係な散発性の癌に おいても LKB1遺伝子の変異がみられることが報告されてきており、一般の散発性癌 においても LKB 1遺伝子の不活が関与していることが明らかとなりつつある （Dong SM et al. , Cancer Res 1998 Sep 1 ;58(17) :3787-90, Rowan A et al., J Inves t Dermatol 1999 Apr ; 112 (4) :509 - 11、 Guldberg P et al. , Oncogene 1999 Mar 4;18(9) :1777-80, Su GH et al., Am J Pathol. 1999 Jun; 154(6) : 1835-40, Wa ng ZJ et al., J Pathol. 1999 May;188(l) :9-13) 。
ところで、 単一の LKBl遺伝子の異常により、 ポリポーシス症や、 癌化といった PJS 患者にみられる表現形質が現れるという事実からは、 LKB1が細胞増殖や細胞分化の 制御機構において要となる非常に重要な役割を果たしていることが示唆される。従 つて、 LKB1が関与する細胞内生理機能を分子レベルで明らかにすることができれば、 その分子機構を標的とする薬剤を合理的に設計することができ、これによりこれら 表現形質を人為的にコントロールすることが可能であると考えられる。そして、 こ のような薬剤には、 Sを初めとする疾患の治療や予防への応用も期待できる。 しかしながら、現段階では、 LKB1が関与する細胞内生理機構に関しては、 その分 子レベルでの解明は、 ほとんどなされていない。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その目的は、 PJSの原 因遺伝子である LKB1が関与する細胞内生理機構を解明すると共に、該細胞内機構を 制御する化合物およびそのスクリーニング方法を提供することにある。 さらに、本 発明は、該細胞内生理機構を制御する化合物を有効成分とする薬剤を提供すること をも目的とする。
本発明者等は、 LKB1が関与する細胞内シグナル伝達経路の特定を目指し、 LKB1 の様々な既知のシグナル伝達経路への関与について検討を行った。 その結果、 HeL a細胞において、 LKB 1が活性化型 K_Rasによる c- f o s遺伝子プロモータ一の活性化を 強く抑制することが明らかとなった （図 1) 。 この c - fosプロモ一ターは、 既知の転 写調節因子結合エレメントとして、 SRE (血清反応性エレメント） 、 CRE (cAMP反応 性エレメント） 、 及び TRE (TPA反応性エレメント） を持つが、 Rasによるこのプロ モータ一の活性化は、 Ras/MEK/ERKを介する経路により、主に SREが活性化されるこ とにより起こることが知られている（Fukumoto Y et al. , J Biol Chem 1990 Jan 15 ; 265 (2) : 774-80) 。 即ち、 図 2に示したように、 この経路は、 Rasにより c- Rafキ ナ一ゼが活性化され、それにより MEK1, 2キナーゼ、ついで ERK1, 2キナーゼが活性 化され、最終的に転写因子である Elklがリン酸化されることにより遺伝子転写が活 性化される経路であり、 いわゆる Ras/MEK/ERKカスケードとして、 主に細胞の増殖 調節において非常に重要な役割をしていることが良く知られている。 LKB1は活性化 型 K- Rasを強制発現することによつて活性化されたこのシグナル伝達経路のいずれ かのステップに作用して SREの活性化を抑制したものと考えられた。 そこで、 本発 明者等は、 次に、 LKB1が関与するステップについて調べたところ、 LKB1は Rasの下 流因子である MEK1による人工的 SREの活性化をも強く抑制することが明らかとなつ た （図 3) 。 このことから、 LKB1は、 少なくとも MEK1よりも下流で作用しているも のと考えられた。
一方、 MEKK1による C- fosプロモーターの活性化 （図 4) 、 同じく MEKK1による NF κ Β (Nuclear Factor of κ Β cel ls) 結合エレメントの活性化 （図 5) 、 PKA (cAM P依存性キナーゼ） による CREを介した C- fosプロモーターの活性化（図 6) に対して は LKB1は全く作用しないことが判明した。 このことから、 LKB1の作用は、 Ras/MEK /ERKシグナル伝達経路特異的であると考えられた。
次に、 PJS患者において見出された変異体 （L67P、 D176N、 W308C) の作用につい て調べた （図 7) 。 その結果、 これらのキナーゼ活性が減弱した変異体は、 その抑 制効果もまた著しく減弱していることが明らかとなった。
Ras/MEK/ERKシグナル伝達経路は、 増殖因子レセプ夕一などからのシグナルを Ra sを介して伝達する経路として、 正常細胞の増殖制御機構などにおいて重要な役割 を持つことが知られている。 PJS患者においては、 遺伝子変異により LKB1キナーゼ が不活化し、 MEK/ERKシグナルの抑制が起こらなくなることにより細胞の過剰な増 殖が起こり、 ポリポーシスや発癌といった形質となって現れることが予想される。 従って、 LKB1キナーゼ活性を阻害する、 あるいは LKB1タンパク量を減少させるこ とにより、 MEK/ERKシグナル伝達を活性化することができ、 逆に、 LKB1キナーゼを 活性化する、 あるいは LKB1タンパク量を増加させることにより、 このシグナル伝達 を抑制することが可能であると考えられる。 LKB1遺伝子やその産物であるキナーゼ を標的とする薬剤は、 MEK/ERKシグナル伝達の異常により生じる様々な疾病に対し て有効であることが期待される。
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものであり、 MEK/ERKシグナル伝達機 構を制御する化合物およびそのスクリーニング法、並びに、該シグナル伝達機構を 制御する化合物を有効成分とする薬剤を提供する。
より詳しくは、 本発明は、
( 1 ) MEK/ERKシグナル伝達を抑制する化合物をスクリ一二ングする方法であつ て、
( a ) LKB1蛋白質に被検試料を接触させる工程、
( b ) LKB1蛋白質のキナーゼ活性を測定する工程、 および
( c ) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 （b ) において測定されるキ ナ一ゼ活性を増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法、 ( 2 ) MEK/ERKシグナル伝達を抑制する化合物をスクリ一二ングする方法であつ て、
(a) LKB1遺伝子を発現する細胞に被検試料を接触させる工程、
(b) 該細胞における LKB1遺伝子の発現量を測定する工程、 および
(c) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 （b) において測定される L KB1遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法、
(3) MEK/ERKシグナル伝達を促進する化合物をスクリーニングする方法であつ て、
(a) LKB1蛋白質に被検試料を接触させる工程、
(b) LKB1蛋白質のキナーゼ活性を測定する工程、 および
(c) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 （b) において測定されるキ ナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程、 を含む方法、
(4) MEK/ERKシグナル伝達を促進する化合物をスクリーニングする方法であつ て、
(a) LKB1遺伝子を発現する細胞に被検試料を接触させる工程、
(b) 該細胞における LKB1遺伝子の発現量を測定する工程、 および
(c) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 （b) において測定される L KB1遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択する工程、 を含む方法、
(5) ポイツ ·イエ一ガーズ症候群の治療薬候補化合物をスクリーニングする方 法であって、
(a) c_fosプロモーターまたは SREの下流にレポーター遺伝子が機能的に結合され た構造を含むベクタ一、 および Ras/MEK/ERKシグナル伝達経路を構成する蛋白質を 発現するベクターが導入された細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に被検試料を接触させ、 レポーター活性を測定する工程、 および
(c) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 （b) において測定されるレ ポー夕一活性を低下させる化合物を選択する工程、 を含む方法、 (6) Ras/MEK/ERKシグナル伝達経路を構成する蛋白質が、 Ras、 c-Raf. MEK1、 および MEK2からなる群より選択される、 （5) に記載の方法、
(7) (1) または （2) に記載の方法により単離しうる、 MEK/ERKシグナル伝 達を抑制する化合物、
(8) (3) または （4) に記載の方法により単離しうる、 MEK/ERKシグナル伝 達を促進する化合物、
(9) (5) または （6) に記載の方法により単離しうる、 ポイツ，イエ一ガー ズ症候群の治療薬候補化合物、
(10) LKB1のキナーゼ活性を促進する化合物を有効成分とする、 MEK/ERKシグ ナル伝達を抑制する薬剤、
(11) . 化合物が （1) に記載の方法により単離しうる化合物である、 （10) に記載の薬剤、
(12) LKB1遺伝子の発現を促進する化合物を有効成分とする、 MEK/ERKシグナ ル伝達を抑制する薬剤、
(13) 化合物が （2) に記載の方法により単離しうる化合物である、 （12) に記載の薬剤、
(14) LKB1を有効成分とする、 MEK/ERKシグナル伝達を抑制する薬剤、
(1 5) LKB1のキナーゼ活性を抑制する化合物を有効成分とする、 MEK/ERKシグ ナル伝達を促進する薬剤、
(16) 化合物が LKB1蛋白質に結合する抗体である、 （15) に記載の薬剤、
(17) 化合物が （3) に記載の方法により単離しうる化合物である、 （15) に記載の薬剤、
(18) LKB1遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、 MEK/ERKシグナ ル伝達を促進する薬剤、
(19) 化合物が （4) に記載の方法により単離しうる化合物である、 （18) に記載の薬剤、 ( 2 0 ) MEK/ERKシグナル伝達を抑制する化合物を有効成分とする、 ポイツ ·ィ エーガーズ症候群治療薬、
( 2 1 ) c-f osプロモータ一または SREの活性を抑制する化合物を有効成分とする、 ポイツ ·イエ一ガ一ズ症候群治療薬、 および
( 2 2 ) 化合物が （5 ) または （6 ) に記載の方法により単離しうる化合物であ る、 （2 0 ) または （2 1 ) に記載の治療薬、 を提供するものである。
なお、 本発明において 「MEK/ERKシグナル伝達」 とは、 低分子量 GTP結合タンパク 質の一つである Rasにより、 c-Rafキナーゼが活性化され、 次いで MEK1 , 2キナーゼ が活性化され、 次に ERK1 , 2キナーゼが活性化され、 最終的に E lklなどの転写因子 がリン酸化されて活性化し、 標的遺伝子の発現が誘導される経路 （Ras/MEK/ERKシ グナル伝達経路） における、 MEKより下流のシグナル伝達を意味する。
本発明は、 MEK/ERKシグナル伝達を調節 （促進あるいは抑制） する化合物をスク リーニングする方法を提供する。 本実施例において、 LKB1蛋白質が MEK/ERKシグナ ル伝達を抑制することが示された。そして、 この抑制が、 LKB1蛋白質のキナーゼ活 性に基づくことが示唆された。 これらの事実は、 LKB1蛋白質のキナーゼ活性あるい は LKB1蛋白質の発現を調節することにより、 MEK/ERKシグナル伝達を調節すること ができることを意味する。 本発明の MEK/ERKシグナル伝達を調節する化合物のスク リーニング方法は、 かかる知見に基づくものである。
このスクリーニング方法の一つの態様は、 LKB1蛋白質のキナーゼ活性を指標とす る方法に関し、 LKB1蛋白質に被検試料を接触させ （工程 （a ) ) 、 LKB1蛋白質のキ ナーゼ活性を測定し （工程 （b ) ) 、 被検試料を接触させない場合と比較して、 ェ 程（b ) において測定されるキナーゼ活性を増加または低下させる化合物を選択す る （工程 （c ) ) ことによって実施することができる。
被検試料としては特に制限はなく、 例えば、 細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微 生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 精製若しくは粗精製タンパク質、 ぺプ チド、 非ペプチド性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物が挙げられる。 被検試 料を接触させる本発明のタンパク質は、 例えば、 精製したタンパク質であっても、 担体に結合させた形態であってもよい。 また、 LKB1タンパク質を発現する細胞に被 検試料を接触させても良い。
LKB1タンパク質のキナ一ゼ活性は、例えば、 LKB1タンパク質による自己リン酸化
(オートホスフォリレーション)活性として検出することができる。該活性は、 [ァ -32P] ATPからの32 Pの LKB1タンパク質への転移量として液体シンチレーションカウ ンタ一等で測定することができる。
キナーゼ活性の検出の具体的な方法の一例を以下に挙げる。 LKB1発現用プラスミ ド DNA (pcDNA3/LKBlmyc)などの約 10 i gを、 SuperFec t (Qiagen社） を用いた方法に より、 C0S7細胞、 HeLa細胞 (子宮類部癌由来細胞) 、 HeLa細胞由来細胞 (HeLa S3 など） 、 G361細胞 （メラノ一マ） 、 ヒト THP1、 K562、 SW480、 HEK293、 マウス NIH3 T3、 HL60 (ヒト白血病由来細胞） 、 正常線維芽細胞、 正常上皮細胞、 正常血管平 滑筋細胞、 正常骨芽細胞などの細胞に導入 (卜ランスフエクシヨン) する。 すなわ ち、 約 106個の細胞を 10cmディッシュに蒔き、 ー晚培養した後、 lO gのプラスミド DNAと 60 1の SuperFec tの混合物を添加し、約 3時間培養を行う。その後培養液を新 しいものに交換し、 さらに卜 2日間培養した後、細胞をトリプシン -EDTA液ではがし て回収する。 細胞を NP40 キナーゼライシスバッファ一aOmM トリス塩酸 pH7. 8、 1% NP40、 0. 15M塩化ナトリウム、 lmM EDTA, 50mM フッ化ナトリウム、 5mM ピロリ ン酸ナトリウム、 10 g/ml ァプロチニン、 lmM PMSF) に懸濁し、 4°Cで 30分混合す ることにより夕ンパク質を可溶化する。こうして得た細胞ライゼ一トにプロティン A/Gプラスァガロース（Santa Cruz社）を加え 30分混合することにより非特異的にビ ーズに吸着するタンパクを除く。 次に抗 c_Myc抗体 A (Santa Cruz)を加え 4でで 1 時間放置した後、プロテイン A/Gプラスァガロース を加えてさらに 1時間放置する。 これを遠心する事により免疫複合体を沈殿させ、 NP40 キナ一ゼライシスバッファ 一、 1Mの塩化ナトリウムを含んだバッファー、および 50mM トリス塩酸 (pH7. 8)によ つて何回か洗浄し、 キナーゼアツセィに供する。 キナ一ゼアツセィは 50mM トリス塩酸 (pH 7. 8) , lmM DTT、 10mM二価カチオン (M nなど）および 10 C iの [ァ -3ZP] ATPを含む全量 5.0 1の反応系で行う。 免疫沈降物を このキナーゼアツセィ溶液中で 37°C、 30分保温して反応を行った後、 SDS-PAGEサン プルバッファーを加え煮沸することにより反応を停止し SDS- PAGEを行う。ゲルをメ 夕ノール/酢酸溶液で固定した後、 乾燥させ、 BAS200イメージアナライザ一 （Fuj i Fi lm社） によってイメージを解析する。 キナーゼ活性は、 また、 文献 （Am J Hu m Genet (1988) Dec ; 63 (6) : 1641-50, Hum Mo 1 Genet (1999) Jan; 8 (l) :45-51) に 記載の方法で検出することもできる。
この測定の結果、被検試料を接触させない場合と比較して、被検試料を接触させ た場合において測定される LKB1蛋白質のキナーゼ活性が増加していれば、用いた被 検試料は、 MEK/ERKシグナル伝達を抑制する化合物の候補となり、 一方、 キナーゼ 活性が低下していれば、 用いた被検試料は、 MEK/ERKシグナル伝達を促進する化合 物の候補となる。
本発明における MEK/ERKシグナル伝達を調節する化合物のスクリーニング方法の 他の一つの態様は、 LKB1遺伝子の発現を指標とする方法に関し、 LKB1遺伝子を発現 する細胞に被検試料を接触させ （工程 （a ) ) 、 該細胞における LKB1遺伝子の発現 量を測定し （工程 （b) ) 、 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 ( b ) において測定される LKB1遺伝子の発現量を増加または低下させる化合物を選択す る （工程 （c ) ) ことによって実施することができる。
被検試料としては、 上記スクリーニングと同様に、 特に制限はない。 また、 LKB 1遺伝子を発現する細胞としては、 例えば、 C0S7細胞、 HeLa細胞 （子宮顏部癌由来 細胞） 、 HeLa細胞由来細胞（HeLa S3など） 、 G361細胞（メラノーマ） 、 ヒト THP1、 K562、 SW480、 HEK293, マウス NIH3T3 、 HL60 (ヒト白血病由来細胞） 、 正常線維芽 細胞、 正常上皮細胞、 正常血管平滑筋細胞、 正常骨芽細胞などの細胞を好適に用い ることができる。 LKB1遺伝子の発現量の検出は、 ノーザンブロッテイング法や RT - PCR法などの当業者に公知の手法を用いて行なうことができる。 この測定の結果、被検試料を接触させない場合と比較して、被検試料を接触させ た場合において測定される LKB1遺伝子の発現量が増加していれば、用いた被検試料 は、 MEK/ERKシグナル伝達を抑制する化合物の候補となり、 一方、 LKB1遺伝子の発 現量が低下していれば、 用いた被検試料は、 MEK/ERKシグナル伝達を促進する化合 物の候補となる。
また、 本発明は、 ポイツ ·イエ一ガーズ症候群の治療薬候補化合物をスクリ一二 ングする方法を提供する。本実施例においてポイツ ·イエーガーズ症候群の原因遺 伝子である LKB1が MEK/ERKシグナル伝達を抑制することが示された。 これらの事実 は、 MEK/ERKシグナル伝達の抑制を指標としてポイツ ·イエーガーズ症候群の治療 薬候補化合物をスクリ一二ングできることを意味する。本発明のボイッ ·ィェ一ガ ーズ症候群の治療薬候補化合物のスクリーニング方法は、かかる知見に基づくもの である。
この方法は、 c-fosプロモーターまたは SREの下流にレポ一夕一遺伝子が機能的に 結合された構造を含むベクタ一、 およ miEK/ERKシグナル伝達を構成する蛋白質を 発現するベクターが導入された細胞を提供し （工程 （a ) ) 、 該細胞に被検試料を 接触させ、 レポーター活性を測定し （工程 （b ) ) 、 被検試料を接触させない場合 と比較して、 工程（b ) において測定されるレポーター活性を低下させる化合物を 選択する （工程 （c ) ) ことによって実施することができる。
c - fos遺伝子のプロモーター領域は、 c-fos cDNAや、 c- fos遺伝子の配列を含む合 成オリゴ DNAをプローブとして用いてゲノム DNAライブラリーを通常の方法により スクリーニングすることにより得ることができる。またはゲノム DNAを铸型とした P CRによっても得ることができる。 こうして得た DNA断片のうち適当な領域を、 適当 なレポーター遺伝子の上流調節領域に組み込むことで C- fosプロモーターレポ一夕 —遺伝子を作製することができる。 レポ一ター遺伝子を含むプラスミド DNAとして は、 pTAL_Luc (CL0NTECH社） 、 pTA-Luc (CL0NTECH社） 、 TAL-SEAP (CL0NTECH社） などを用いることができる。 SREレポ一夕一遺伝子は、 例えば、 「AGGATGTCCATATT AGGACATCTZ配列番号： 7」 からなる配列を複数回繰り返す配列を上記のような適 当なレポ一夕一遺伝子の上流調節領域に組み込むことで作製することができる。 S REレポーター遺伝子 （pSRE- Luc) については市販されており （Stratagene社）、 こ れを用いることもできる。
Ras/MEK/ERKシグナル伝達経路を構成するタンパク質を発現するべクタ一は次の ようにして作製することができる。 まず、 Ras/MEK/ERKシグナル伝達経路を構成す るタンパク質である Rasや MEK1の全オープンリーディングフレームを有する cDNAを 通常の cDNAライブラリ一スクリ一二ングゃ RT- PCR法によりクローニングする。これ を適当な動物細胞発現用ベクター、例えば pcDNA3ベクタ一 （Invi trogen) などに組 み込み発現ベクターとする。 この際、恒常的に活性化状態のタンパク質を発現する ように、 適当な変異を加えることもできる。 例えば Rasの場合は、 12番目のコドン を Valなどに置換する。 また、 MEK1の場合は、 上流のキナーゼによりリン酸化され ることが判明している 218番目と 222番目のアミノ酸を Gluなどに置換することによ り、 活性化タンパクとなることが知られている。 変異の導入は、 例えば GeneEdi to r™ (Promega社） などを用いた一般的な部位特異的変異導入法などによって行うこ とができる。
ベクターに発現させる Ras/MEK/ERKシグナル伝達経路を構成する蛋白質としては、 例えば Ras、 c- Raf、 MEK1、 MEK2を例示することができる。 これら蛋白質を発現する ベクタ一としては、 市販 （Stratagene社） のものを用いることもできる。
ベクターを導入する細胞としては、 例えば、 C0S7細胞、 HeLa細胞（子宮顏部癌由 来細胞） 、 HeLa細胞由来細胞 （HeLa S3など） 、 G361細胞 （メラノ一マ） 、 ヒト TH Pl、 K562、 SW480、 HEK293, マウス NIH3T3、 HL60 (ヒト白血病由来細胞） 、 正常線 維芽細胞、 正常上皮細胞、 正常血管平滑筋細胞、 正常骨芽細胞などの細胞を用いる ことができる。
スクリーニングに用い得るレポ一ター遺伝子としては、 例えば、 SREレポーター 遺伝子（pSRE- Luc、 Stratagene社） などが挙げられる。 ベクターの細胞への導入法 は、 SuperFec t (Qi agen社） 、 Lipofec t Amine (GIBCO BRL社) などのリン脂質を用 いた方法 （具体的には実施例 2に記載の方法） 、 リン酸カルシウム法、 エレクト口 ポレーシヨン法、 DEAE-デキストラン法など、 当業者に公知の方法により行なうこ とができる。
これにより調製された細胞に接触させる被検試料としては、例えば、細胞抽出物、 細胞培養上清、 発酵微生物産生物、 海洋生物抽出物、 植物抽出物、 精製若しくは粗 精製蛋白質、 ペプチド、 非ペプチド性化合物、 合成低分子化合物、 天然化合物など を用いることができるが、 特に制限はない。
被検試料を接触させた細胞のレポーター活性の測定は、ルシフエラーゼをレポ一 ターとした場合は、ルシフェラーゼにより分解されると化学発光する適当な基質を 用い、この発光をルミノメーターで測定することにより活性を評価することができ る。 ホ夕ルルシフェラ一ゼをレポーターとした場合は、 例えば、 ホタルルシフェリ ンを基質として用いることができる。またゥミシィタケルシフェラーゼをレポ一夕 —とした場合は、 例えば、 コエレンテラジンを基質として用いることができる。 D ua卜 Luc i f erase™ Repor ter Assay Sys tem (Promega社)などの市販のキットゃ試薬 を用いることができる。 i3ガラクトシダーゼやアルカリフォスファターゼなどをレ ポーターとした場合は、 これらの酵素により分解されると発色する適当な基質、 あ るいは化学発光する適当な基質を用い、 この発色、 あるいは発光をそれぞれ分光光 度計かルミノメーターで測定することにより活性を評価することができる。 また、 クロラムフエニコールァセチルトランスフェラ一ゼ （CAT) をレポ一夕一とした場 合は、 例えば、 14Cなどで標識したクロラムフエ二コールとァセチル CoAを基質とし て用い、生成したァセチルクロラムフエ二コールの量を薄層ク口マトグラフィ一な どで分離して測定することにより活性を評価することができる。
この測定の結果、被検試料を接触させない場合と比較して、被検試料を接触させ た場合において測定されるレポ一ター活性が低下していれば、用いた被検試料に含 まれる化合物は、 ポイツ ·イエーガーズ症候群の治療薬の候補となる。 本発明は、 また、 MEK/ERKシグナル伝達を調節 （促進あるいは抑制） する薬剤を 提供する。 本実施例において、 LKB1蛋白質が MEK/ERKシグナル伝達を抑制すること が示された。そして、 この抑制が、 LKB1蛋白質のキナーゼ活性に基づくことが示唆 された。 この事実は、 LKB1蛋白質のキナーゼ活性あるいは LKB1蛋白質の発現を調節 する化合物が、 MEK/ERKシグナル伝達を調節する薬剤となりうることを意味する。 本発明の MEK/ERKシグナル伝達を調節する薬剤は、かかる知見に基づくものである。 本発明の薬剤には、試験研究目的で用いる試薬および疾患の治療や予防などの目 的で用いる医薬の双方が含まれる。 本発明の MEK/ERKシグナル伝達を抑制する薬剤 の有効成分としては、 LKB1蛋白質のキナ一ゼ活性を促進する化合物や LKB1遺伝子の 発現を促進する化合物を用いることができる。 これら化合物は、上記のスクリー二 ングにより単離しうる。 また、 LKB1蛋白質または該蛋白質をコードする DNAを用い ることも可能である。
一方、 本発明の MEK/ERKシグナル伝達を促進する薬剤の有効成分としては、 LKB1 蛋白質のキナーゼ活性を促進する化合物や LKB1遺伝子の発現を抑制する化合物を 用いることができる。 これら化合物は上記のスクリーニングにより単離しうる。 ま た、該薬剤の有効成分として LKB1蛋白質に結合する抗体を用いることも可能である。 該抗体は、 ポリクロ一ナル抗体であっても、 モノクローナル抗体であっても良い。 ヒトに投与する場合には、ヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体であるこ とが好ましい。 これら抗体は、 当業者に公知の方法により調製することができる。 また、 本発明は、 ポイツ'イエーガーズ症候群治療薬を提供する。本実施例にお いてポイツ ·イエ一ガーズ症候群の原因遺伝子である LKB1が MEK/ERKシグナル伝達 を抑制することが示された。 この事実は、 MEK/ERKシグナル伝達の抑制する化合物 がポイツ ·イエ一ガーズ症候群の治療薬となり得ることを意味する。本発明のボイ ッ 'イエ一ガ一ズ症候群の治療薬のスクリーニング方法は、かかる知見に基づくも のである。
本発明のポイツ ·イエ一ガーズ症候群治療薬の有効成分としては、 MEK/ERKシグ ナル伝達を抑制する化合物を用いることができる。 該化合物は、 c-fosプロモータ —または SREの活性を抑制する化合物であり得る。 SREは LKB1が関係する MEK/ERKシ グナル伝達に特異的な要素であるため、 SREの活性を抑制する化合物は、 本発明の ポイツ ·イエ一ガ一ズ症候群の治療薬の有効成分として好適である。 これら化合物 は、 上記の本発明のスクリーニングにより単離しうる。
本発明の薬剤をヒトゃ動物、 例えばマウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ニヮ トリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーの医薬 として使用する場合には、有効成分である化合物自体を直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要 に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤とし て経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される 担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 結合剤などと適宜組み 合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することに よって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された 範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コ ーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セルロース のような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステア リン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、 ぺパ一ミント、 ァカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形 態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有す ることができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用い て通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む 等張液、 例えば!) -ソルビトール、 D-マンノース、 D_マンニ！ ^一ル、 塩化ナトリウム が挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはエタノール、 ポリ アルコール、例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 非イオン性 界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM) 、 HCO-50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝液、 酢 酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例えばべンジ ルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された注射液は通 常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻腔 内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法により行 いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業者で あれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNAによ りコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、 遺伝子 治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症状など により変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明の薬剤の投与量は、 症状により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に 成人 （体重 60kgとして） においては、 1日あたり約 0. 1から 100mg、 好ましくは約 1. 0から 50mg、 より好ましくは約 1. 0から 20mgであると考えられる。
非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与 方法によっても異なるが、 例えば注射剤の形では通常成人（体重 60kgとして） にお いては、 通常、 1日当り約 0. 01から 30mg、 好ましくは約 0. 1から 20mg、 より好ましく は約 0. 1から 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。 他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量、 あるいは体表面積あたりに換算 した量を投与することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、活性化型 K- Ras (K-RasV12) による c-f osプロモータ一の活性化に及ぼす LKB1の効果を検出した結果を示す図である。 K- Rasを導入しない時のホタルルシフ エラーゼの活性とゥミシィタケルシフェラ一ゼの活性の比を 1として、相対的な活 性を表した （平均土標準偏差 （n= 3) (以下、 標記法は同じ） ） 。 LKBl WTは野性 型 LKB1を、 LKBl K78Iは K78 I変異体をそれぞれあらわす。 +はそれぞれのタンパクを 発現させたことを、 -は発現させていないことを表す。 三角は右側に行くに従いト ランスフエクションしたプラスミド DNA量が加していることを表す。
図 2は、 c-f osプロモータ一レポーター遺伝子上の各種転写調節因子結合エレメ ントの活性化に関与する様々な細胞内シグナル伝達の模式図である。
図 3は、 MEK1による SREの活性化に及ぼす LKB1の効果を検出した結果を示す図で ある。
図 4は、 MEKK1による c_ f 0 sプロモータ一の活性化に及ぼす LKB 1の効果を検出した 結果を示す図である。
図 5は、 MEKK1による NF K Bの活性化に及ぼす LKB1の効果を検出した結果を示す図 である。
図 6は、 PKAによる C- f 0 sプロモータ一の活性化に及ぼす LKB 1の効果を検出した結 果を示す図である。
図 7は、 MEK1による SREプロモーターの活性化に及ぼす各種 LKB1変異体の効果を 検出した結果を示す図および写真である。下は、それぞれの変異体のキナーゼ活性 を表す。 発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。
[実施例 1 ] プラスミド DNAの作製 ( 1 ) 発現プラスミド DNA
LK Elフライマ一 (5 gat gaa t ic ggg tec age atg gag gtg gtg gac 3' /配歹 U 番号： 1 ) と E2プライマー （5' gat gaa t tc t ta gag gtc t tc t tc tga gat g ag c.t t ctg e tc c tg c tg c t t gca ggc cga 3' /配列番号: 2 ) を用いた PCRを行う ことにより、 C末端に c- Myc ェピトープ配列（Glu Gin Lys Leu l ie Ser Glu Glu A sp Leu)が付加された全ヒト LKB1アミノ酸配列をコードする DNA断片を増幅した。こ れをプライマーに付加した EcoRIサイ卜で切断した後、 哺乳動物細胞用発現べクタ 一である PCDNA3ベクター（Invi trogen)の EcoRIサイに組み込んだ。 シークェンシン グにより PCRエラ一が無いことを確認したクローン（pcDNA3/LKBl myc) を選抜し発 現実験に用いた。
また、 pcDNA3/LKBlmycを铸型とし、 GeneEdi tor™ (Promega)を用いた in vi t roミ ユータジエネシスにより、各種変異体の作製を行った。変異導入用プライマーは以 下のものを使用した。
K78I変異体： 5' agg agg gcc gtc ate ate e tc aag aag 3' /配列番号： 3 D176N変異体： 5' at t gig cac aag aac ate aag ccg ggg 3' Z配歹 'J番号： 4 W308C変異体： 5' egg cag cac age tgc t tc egg aag aaa 3' Z配歹幡号： 5 L67P変異体： 5' gtg aag gag gtg ccg gac tcg gag acg 3' 配歹 !J番号： 6 変異導入用プライマーとキットに添付されている選択用プライマ一（ボトムスト ランド用） を共に一本鎖にした铸型プラスミド DNAとァニールさせ、新たな DNA鎖を 合成した。 これを大腸菌に導入し、 変異を持つプラスミドを保持したクロ一ンを G eneEdi tor™抗生物質耐性クローンとして選択した。シークェンシングにより変異が 入っていることを確認し、 発現実験に用いた。
MEK1、 MEKKU PKA発現用のプラスミド DNA (それぞれ pFC- MEK1、 pFC-MEKKK pFC -PKA) は Stratagene社から購入した。
活性化型 K- Ras発現プラスミド DNA (pCEV/k-RasV12) は神戸大学医学部の Fukumo to Yauso博士より御供与いただいた。 ゥミシィタケルシフェラ一ゼ発現プラスミド （PRL/SV40) は Pr omega社から購入 した。
(2) レポ一夕一遺伝子
c - f osプロモーターレポ一ター遺伝子 （c_fosLV) は神戸大学医学部の Fukumoto Yauso博士より御供与いただいた。 SREレポ一夕一遺伝子 （pSRE_Luc) は Stratagen e社から購入した。 NFKBレポーター遺伝子（PNFKB_LUC) は C Ion tech社から購入し た。
[実施例 2] レポーター遺伝子アツセィ
( 1) 卜ランスフエクシヨン
トランスフエクシヨンは SuperFect (Qiagen社） を用い、 メーカーにより推奨さ れている方法に従って行った。 すなわち、 Hela細胞を 10ソゥエルで 12ゥエルプレ一 トに蒔き、 ー晚培養後、 DNA 1.5 と SuperFect 4 1との混合物を添加し、 3時間 培養した。その後培地を交換し、 さらに 24時間培養した後ルシフェラーゼ活性を測 定した。
(2) ルシフェラ一ゼ活性の測定
レシフェラーゼ活'性ま、 Dual-Luc if eRase™ Reporter Assay System (Promega社) を用い、 メーカー推奨の方法に従って、 ゥミシィタケルシフェラーゼを内在性コン トロールとした二重測定法（dual assay) にて測定した。 すなわち、 トランスフエ クシヨンした細胞を、 PBSで洗浄した後、 IOO Iの lXPassive Lysis Bufferにて溶 解した。 このうちの 5 1を用い、 LucifeRase Assay Reagent II (50^1) をホタル ルシフェラーゼの基質として、 また Stop & Glo(R) Reagent (50 1) をゥミシイタ ケルシフェラーゼの基質としてそれぞれのルシフエラ一ゼの活性を測定した。
(3) 結果
c-f osプロモ一タ一レポ一ター遺伝子 （C- fosLV) が導入された細胞を用いて、 R asによる c-fosプロモーターの活性化に対する LKB1の影響を検討した。その結果、 L KB1は、 Rasによる c- fosプロモー夕 の活性化を顕著に抑制した （図 1) 。 一方、 自己リン酸化能を失った LKB1変異体である K78Iで同様に検討した場合では、 Rasに よる c-fosプロモー夕一の活性化を顕著に^ ^卬制することはなかった （図 1) 。
この c-f osプロモーターは、 既知の転写調節因子結合エレメントとして、 SRE (血 清反応性エレメ'ント） 、 CRE (cAMP反応性エレメント） 、 及び TRE (TP A反応性エレ メント） を持つが （図 2) 、 Rasによるこのプロモ一ターの活性化は、 MEK/ERKを介 する経路により、主に SREが活性化されることにより起こることが知られており （F ukumoto Y et al., J Biol Chem 1990 Jan 15 ;265 (2) :774-80) 、 LKBlは、 MEK/ER Kシグナル伝達経路のいずれかのステツプに作用して SREの活性化を抑制したもの と考えられた。 そこで次に、 LKB1が関与するステップについて検討した。
SREレポ一夕一遺伝子 （pSRE_Luc) が導入された細胞を用いて、 MEK1による SRE の活性化に対する LKB1の影響を検討した。 その結果、 LKB1は、 MEK1による SREの活 性化を顕著に抑制した （図 3) 。 一方、 K78Iで同様に検討した場合では、 MEK1によ る SRE の活性化を顕著に抑制することはなかった （図 3) 。 この事実から、 LKB1 は、 MEK/ERKシグナル伝達経路の少なくとも MEK1よりも下流で作用しているものと 考えられた。
次に、 LKB1が MEK/ERKシグナル伝達経路以外の経路に作用するか否かの検討を行 なった。 c-f osプロモータ一レポーター遺伝子 （C- fosLV) が導入された細胞、 また は NF KBレポーター遺伝子 （pNF/cB- Luc) 細胞を用いて、 MEKK1または PKAによる c- fosプロモーターまたは NF KBの活性化に対する LKBlの影響を検討した。 その結果、 LKB1は、 MEKK1による c- fosプロモ一夕一の活性化 (図 4) 、 MEKK1による NFKB (NU clear Factor of κΒ cells) 結合エレメントの活性化 （図 5) 、 PKA (cAMP依存性 キナーゼ） による C- fosプロモーターの活性化（図 6) に対しては全く作用しないこ とが判明した。 このことから、 LKB1の作用は、 少なくとも調べた範囲において MEK /ERKシグナル伝達経路特異的であると考えられた。
次に、 PJS患者において見出された変異体 （L67P； 67番目の Leuが Proに置換した 変異体、 D176N ； 176番目の Aspが Asnに置換した変異体、 W308C； 308番目の Τι:ρが C ysに置換した変異体） の作用について調べた。 SREレポ一ター遺伝子が導^^された 細胞を用いて、 MEK1による SREプロモータ一の活性化に対するこれら LKB1変異体の 影響を検討した。 その結果、 これらのキナーゼ活性が減弱した変異体は、 その MEK /ERK抑制効果も著しく減弱していることが明らかとなった （図 7 ) 。 産業上の利用の可能性
本発明により LKB1を標的とした MEK/ERKシグナル伝達を調節する化合物のスクリ 一二ング方法が提供された。 さらに、 MEK/ERKシグナル伝達を標的とした PJS治療薬 候禅化合物のスクリーニング方法が提供された。 これにより MEK/ERKシグナル伝達 を調節する化合物や PJS治療薬候補化合物を効率的にスクリーニングすることが可 能となった。 また、 本発明により、 これら化合物の薬剤用途が提供された。 該薬剤 は、 MEK/ERKシグナル伝達を調節するための試薬として、 あるいは PJSを含む疾患の 治療や予防のための医薬としての利用が期待される。

Claims

請求の範囲
1. MEK/ERKシグナル伝達を抑制する化合物をスクリ一ニングする方法であって、
(a) LKB1蛋白質に被検試料を接触させる工程、
(b) LKB1蛋白質のキナーゼ活性を測定する工程、 および
(c) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 （b) において測定されるキ ナーゼ活性を増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
2. MEK/ERKシグナル伝達を抑制する化合物をスクリ一ニングする方法であって、
(a) LKB1遺伝子を発現する細胞に被検試料を接触させる工程、
(b) 該細胞における LKB1遺伝子の発現量を測定する工程、 および
(c) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 （b) において測定される L KB1遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
3. MEK/ERKシグナル伝達を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) LKB1蛋白質に被検試料を接触させる工程、
(b) LKB1蛋白質のキナーゼ活性を測定する工程、 および
(c) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 （b) において測定されるキ ナーゼ活性を低下させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
4. MEK/ERKシグナル伝達を促進する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) LKB1遺伝子を発現する細胞に被検試料を接触させる工程、
(b) 該細胞における LKB1遺伝子の発現量を測定する工程、 および
(c) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程 （b) において測定される L KB1遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
5. ポイツ'イエーガーズ症候群の治療薬候補化合物をスクリ一二ングする方法 であって、
(a) c-fosプロモーターまたは SREの下流にレポ一夕一遺伝子が機能的に結合され た構造を含むベクタ一、 および Ras/MEK/ERKシグナル伝達経路を構成する蛋白質を 発現するべクタ一が導入された細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に被検試料を接触させ、 レポ一ター活性を測定する工程、 および
(c) 被検試料を接触させない場合と比較して、 工程（b) において測定されるレ ポー夕一活性を低下させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
6. Ras/MEK/ERKシグナル伝達経路を構成する蛋白質が、 Ras、 c_Raf、 MEKK お よ miEK2からなる群より選択される、 請求項 5に記載の方法。
7. 請求項 1または 2に記載の方法により単離しうる、 MEK/ERKシグナル伝達を 抑制する化合物。
8. 請求項 3または 4に記載の方法により単離しうる、 MEK/ERKシグナル伝達を 促進する化合物。
9. 請求項 5または 6に記載の方法により単離しうる、 ポイツ ·イエ一ガ一ズ症 候群の治療薬候補化合物。
10. LKB1のキナ一ゼ活性を促進する化合物を有効成分とする、 MEK/ERKシグナ ル伝達を抑制する薬剤。
1 1. 化合物が請求項 1に記載の方法により単離しうる化合物である、請求項 1 0に記載の薬剤。
12. LKB1遺伝子の発現を促進する化合物を有効成分とする、 MEK/ERKシグナル 伝達を抑制する薬剤。
13. 化合物が請求項 2に記載の方法により単離しうる化合物である、請求項 1 2に記載の薬剤。
14. LKB1を有効成分とする、 MEK/ERKシグナル伝達を抑制する薬剤。
15. LKB1のキナーゼ活性を抑制する化合物を有効成分とする、 MEK/ERKシグナ ル伝達を促進する薬剤。
16. 化合物が LKB1蛋白質に結合する抗体である、 請求項 1 5に記載の薬剤。
17. 化合物が請求項 3に記載の方法により単離しうる化合物である、請求項 1 5に記載の薬剤。
1 8 . LKBl遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、 MEK/ERKシグナル 伝達を促進する薬剤。
1 9 . 化合物が請求項 4に記載の方法により単離しうる化合物である、請求項 1 8に記載の薬剤。
2 0 . MEK/ERKシグナル伝達を抑制する化合物を有効成分とする、 ポイツ ·イエ 一ガーズ症候群治療薬。
2 1 . c-fosプロモーターまたは SREの活性を抑制する化合物を有効成分とする、 ポイツ ·イエーガーズ症候群治療薬。
2 2 . 化合物が請求項 5または 6に記載の方法により単離しうる化合物である、 請求項 2 0または 2 1に記載の治療薬。
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