WO2002000264A1

WO2002000264A1 - Virus vector for transferring gene into renal cells

Info

Publication number: WO2002000264A1
Application number: PCT/JP2001/005513
Authority: WO
Inventors: Enyu Imai; Yoshitaka Isaka; Masayuki Fukumura; Mamoru Hasegawa
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 2000-06-27
Filing date: 2001-06-27
Publication date: 2002-01-03
Anticipated expiration: 2002-12-27
Also published as: EP1297852A4; AU2001266337A1; CN1281276C; KR20030014392A; HK1056693A1; CN1447700A; HK1052140A1; EP1297852A1; CA2414077A1; US20030170897A1

Description

腎細胞に遺伝子を導入するためのウィルスベクター技術分野

本発明は、腎細胞へ遺伝子を導入するためのパラミクソウィルスベクターに関する。背景技術

近年、哺乳動物細胞への遺伝子導入技術の開発が進み、遺伝子治療によりヒトの様々な疾患を治療する試みに関心が集まっている。生体への遺伝子導入は in vivo または ex vivo により行われ、 in vivo による遺伝子導入ではベクターに組み込んだ遺伝子等を生体に投与することにより、 ex vivo では患者やその他に由来する細胞に遺伝子を導入後、その細胞を生体に戻すことにより行われる。培養細胞などへ遺伝子を導入する場合と違い、生体の臓器への遺伝子を導入することは一般に容易ではない。特に哺乳動物の腎臓は動静脈、細尿管、糸球体などが入り組んだ構造的に複雑な組織からなり、代謝回転が比較的低いことから、これまで十分な遺伝子導入効率を得ることが困難であった。腎臓の構造は器官としての正常な機能にとって極めて重要であり、遺伝子の導入に際しては器官や組織を傷つけずに操作する必要がある。また、腎臓を構成する種々の細胞の中で、糸球体、尿細管、間質等の細胞を標的として効率よく遺伝子を導入することは困難である。

腎臓への遺伝子導入に関しては、例えば HVJ (hemagglutinating virus of Japan; センダイウィルス）とリボソームを用いた方法が試みられている（Tomita, N. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 : 129-134， 1992)。 SV40 large T抗原を発現するプラスミドベクターと HMG- 1 (high mobility group 1) 蛋白質を含むリボソームを作製し、これをラット腎動脈からカテーテルを介して腎臓へ注入することにより腎臓へ遺伝子を導入した。その結果、導入 4日目において 15%の糸球体毛細血管細胞で SV40 large T抗原の発現を免疫組織学的に検出することに成功している。し力し、発現レベルは導入後数日をピークに減少し、発現細胞も糸球体の細胞に限られていた。同様の HVJ-リボソームを用いた実験により、ィヌ腎臓にヒト CD59遺伝子を導入する試みも行われている（Akami, T. et al. , Transplantation Proceedings 26 : 1315-1317, 1994)。しかし、糸球体細胞での CD59遺伝子の発現は一過的で十分なものではなかった。 HVJ -リボソームを用いた遺伝子導入では、リボソームの調製方法の改良も行われている（Tsujie, M. et al. , Kidney Int. 57 : 1973-1980， 2000)。しかし、遺伝子導入効率は未だ満足できるものではない。また、 HVJ -リボソームの調製は煩雑であり、調製した組成物の安定性は十分とは言えない。

カチォニックリボソームとプラスミド DNAの混合物を用いた遺伝子導入において、 Zhuらは成獣マウスの様々な組織への遺伝子導入を報告している（Zhu， N. et al. , Science 261 (5118)： 209-11， 1993)。血管へのベクター混合物の注入により、肺、脾臓、リンパ節、骨髄などの組織の細胞に短時間の発現が見られた。また、腎臓の内皮細胞の 25〜50%に遺伝子がトランスフエクトされたことが報告されている。し力し、糸球体細胞に遺伝子を導入できるのかは示されていない。また、発現期間も示されていない。

ウィルスベクターを用いた腎臓への遺伝子導入としては、アデノウィルスべクターを用いた例も報告されている（Moullier, P. et al. , Kidney Int. 45 (4) : 1220-5, 1994)。 jSガラクトシダーゼ遺伝子を含む複製能を欠失させたアデノウィルスを腎動脈からの灌流、またはカテーテルを介して腎盂から注入して逆行させることにより成獸ラット腎臓へ遺伝子を導入した。腎動脈から灌流させた場合には、一過的な低レベルの ]3ガラクトシダーゼの発現が観察され、逆行注入の場合には、腎乳頭および髄質の尿細管で発現が見られた。しかし腎内皮細胞では発現が見られなかった。一般にアデノウィルスベクターを血管内に注入して感染させても、腎細胞への感染効率は十分ではない。アデノウイルスを用いた遺伝子導入方法ではいくつかの改良も行われている（米国特許第 5869230号)。ここでは、ベクタ一導入時に腎臓を氷上などで冷却して虚血傷害を予防することや、へモグロビン等の酸素供給剤で細胞の酸素欠乏を防止すること、またドーパミンなどの血管拡張剤を併用することによりベクター感染を調節することについて記載されている。そしてこの方法により腎臓内皮細胞の約 5〜15%にベクターを導入できることが記載されている。 '

し力し、アデノウィルスベクターは比較的高い免疫反応を誘発することが知られ、初期段階の非特異的な炎症反応に続き細胞傷害性 Tリンパ球を介した特異的免疫反応により導入細胞が攻撃される。遺伝子の欠損や改変により免疫原性を低下させたアデノウィルスベクターの開発も試みられている力未だ十分とは言えない。

遺伝子治療に用いられるウィルスベクターとしてはレトロウイルスベクターも知られている。レトロウィルスベクターは宿主の染色体に遺伝子を挿入するため、導入遺伝子を長期間安定して発現させることができる利点があるが、一般に標的となる細胞のタイプに制限があり、また、分裂細胞である必要がある。腎臓の細胞の多くは最終分化した非分裂細胞であるため、レトロウイルスベクターを用いた遺伝子治療は主に ex vivoに制限される。このため、シユードタイプ化ゃレンチウィルスを基にしたベクターが開発されているが、染色体へのランダムな揷入による癌遺伝子の活性化や癌抑制遺伝子の欠損などのリスクが存在する。また、高力価のウィルスベクターを調製することが難しいなどの欠点が存在する。発明の開示

本発明は、高い効率で腎細胞へ遺伝子を導入できるウィルスベクターおよびその用途を提供することを課題とする。より詳しくは、本発明は、腎細胞へ遺伝子導入するために用いるパラミクソウィルスベクター、該ベクターを含む腎細胞への遺伝子導入用組成物、およぴ該ベクターを利用して腎細胞へ遺伝子導入する方法を提供する。

近年、センダイウィルスを含むパラミクソウィルスのリバースジエネテイクスにより遺伝子導入用の組換えウィルスベクターが開発されている（Kato， A. et al.， Genes Cells 1 : 569-579, 1996 ; Kato, A. et al. , EMBO J. 16 : 578-587, 1997 ; Yu, D. et al. , Genes Cells 2 : 457-466, 1997 ; Hasan, M. K. et al.， J. Gen. Virol. 78 : 2813-2820, 1997 ; Sakai, Y. et al. , FEBS Lett. 456 : 221-226, 1999 )。そこで、この糸且換えセンダイウィルスベクターを用いて腎への遺伝子導入を行い、このベクターが現在の遺伝子導入べクタ一が抱える障害を克服することができるかについて検討した。すなわち、臨床を考慮した上で、トランスフエクション効率、遺伝子発現効率、遺伝子発現の持続性、およびべクタ一の投与経路の影響を含む、 in vivo におけるセンダイウイノレスベタターのトランスフエクシヨン活性を検討した。

その結果、 in vivo において、外来遺伝子を保持する組換えセンダイウィルスベクターが腎細胞へ極めて高い効率で遺伝子を導入する能力を示すことが判明した。腎動脈からの灌流、およぴ尿管からの逆行のいずれの投与方法においても、腎臓の広い範囲にわたり瀰漫†生に腎細胞へ遺伝子導入が可能であり、特に腎動脈から投与した場合には、間質細胞、糸球体細胞などの細胞で高い GFPの発現が観察された。センダイウィルスにより導入された遺伝子の発現は少なくとも約 1箇月にわたり持続し、長期間経過した腎組織では尿細管細胞での導入遺伝子の発現も見られた。また、尿管からの逆行投与では、主に尿細管細胞（遠位尿細管および近位尿細管）で発現が見られ、間質細胞にも発現が観察された。

すなわち、本発明者らは、組換えパラミクソウィルスベクターが、 1 ) 腎細胞に高い効率で遺伝子を発現させることが可能であり、 2 ) 投与経路により異なる細胞に遺伝子を導入することができ、腎動脈からの投与では、間質細胞おょぴ糸球体組織近傍へのマクロファージの浸潤が起こらないこと、 3 ) ウィルスゲノムおよび外来遺伝子の発現は長期間安定であることを見出した。これらの結果は、パラミクソウィルスベクターが腎への遺伝子導入に有用であることを実証するものである。現在、腎への遺伝子導入研究の分野ではアデノウイルスベクターの使用が試行されているが、本発明のパラミクソウィルスベクターは、腎への遺伝子導入にとってアデノウィルスと同等またはそれ以上の適合性を有するベクターであり得る。アデノウイルスベクターには、導入遺伝子の高発現と高い導入効率が細胞周期によらないなど、幾つかの重要な利点を有しているが、組換えパラミクソウィルスにおいてもそれらは共通している。

アデノウィルスベクターにおいては、短時間感染時間では標的細胞に十分な感染効率が得られないことがしばしば問題となっている。これはコクサッキ一-アデノウィルス受容体（CAR)を介してベクター粒子が細胞内に取り込まれるためには、長時間の接触が必要であるためと考えられている。腎臓へのインビボ投与においては、投与時に血流を遮断する時間が長レ、と虚血傷害による組織の破壊が起こることから、長い時間血流を遮断することは好ましくない。これに対しパラミクソウィルスは、短時間の細胞への露出でも十分な感染効率が得られることから、臨床における遺伝子導入に極めて大きい利点を有している。パラミクソウィルスベクターのこのような特徴を考慮すること、本発明のパラミクソウィルスベクタ一は、様々な臨床状況における遺伝子治療に極めて有望なベクターとなると考えられる。

即ち、本発明は、腎細胞への遺伝子導入用パラミクソウィルスベクターおよびそれを用いた遺伝子導入方法に関し、より具体的には、

( 1 ) パラミクソウィルスベクターを腎細胞に接触させる工程を含む、腎細胞へ遺伝子を導入する方法、

( 2 )パラミクソウィルスベクターを血管内に投与する工程を含む、（1 )に記載の方法、 (3) 血管が腎動脈である、（2) に記載の方法、

(4)パラミクソウィルスベクターを尿管内に投与する工程を含む、（1) にの方法、

(5) 腎細胞が間質細胞、糸球体細胞、および尿細管細胞からなる群より選択される細胞である、（1) から（4) のいずれかに記載の方法、

(6) パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、 (1) から (5) のいずれかに記載の方法、

(7) 腎細胞へ遺伝子を導入するために用いる、パラミクソウィルスベクター、

(8) パラミクソウィルスベクターまたは該ベクターを含む細胞を含む、腎細胞への遺伝子導入用糸且成物、

(9) 血管内に投与するために用いられる、（8) に記載の組成物、

(10) 血管が腎動脈である、（9) に記載の組成物、

(1 1) 尿管内に投与するために用いられる、（8) に記載の組成物、

(1 2) 腎細胞が間質細胞、糸球体細胞、およぴ尿細管細胞からなる群より選択される細胞である、（8) から（1 1) のいずれかに記載の組成物、ならびに

(1 3) パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、（8) から（1 2) のいずれかに記載の組成物、に関する。

本発明において「パラミクソウィルスベクター」とは、パラミクソウィルスに由来し遺伝子を宿主細胞に導入するベクター（担体）を指す。本発明のパラミクソウィルスベクターはリボ核タンパク質（RNP) であってもよく、また、感染力を持つウィルス粒子であってもよい。ここで「感染力」とは、組換えパラミクソゥィルスべクタ一が細胞への接着能おょぴ膜融合能を保持していることにより、接着した細胞の内部にベタター内部の遺伝子を導入することのできる能力のことを言う。好ましい態様では、本発明のパラミクソウィルスベクターは、外来遺伝子を発現することができるように保持する。本発明のパラミクソウィルスベクターは、複製能を有していてもよく、複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウィルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウィルスが複製され、感染性ウィルス粒子が産生されることを指す。

「組み換え」体とは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成した化合物または組成物を言う。組み換えポリヌクレオチドとは、自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。本明細書において、「組換え」パラミクソウィルスベクターとは、遺伝子操作により構築されたパラミクソウィルスベクタ一またはそれを増幅して得られるパラミクソウィルスベクターを言う。組換えパラミクソウィルスベクターは、例えば、組換えパラミクソウィルス cDNAを再構成して生成することができる。

本発明においてパラミクソウィルスとはパラミクソウィルス科に属するウィルスまたはその誘導体を指す。本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、例えばパラミクソウイノレス科の O^aramyxoviridae)のセンダイウィルス（Sendai virus) ニューカツスノレ;/丙ウイノレス (Newcastle disease virus)、おたふ <sカ^¾ぜゥイノレス (Mumps virus)、麻珍ウィルス (Measles virus)、 RSウィルス (Respiratory syncytial virus)、牛投ゥノレス (rinderpest virus)、システンノ一ウイノレス (distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス (SV5)、ヒトパラインフノレェンザウィルス 1, 2, 3型等が挙げられる。本発明のウィルスは、好ましくはパラミクソウィルス属 Paramyxovirus) に属するウィルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なパラミクソウィルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウィルス 1型 (HPIV-1)、ヒトパラインフルエンザウイルス 3型 (HPIV-3)、ゥシウスパラインフルェンザウィルス 1型とも呼ばれる）、およぴサルパラィンフルェンザウィルス 10型（SPIV- 10) などが含まれる。本発明のパラミクソウィルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などであり得る。 DI粒子 ( J. Virol. 68, 8413-8417 (1994) ) 等の不完全ウィルスや、合成したオリゴヌタレォチド等も、本発明のウィルスベクターを製造するための材料として使用することができる。

パラミクソウィルスのウィルスタンパク質をコードする遺伝子としては、 NP、 P 、 M、 F、 HN、およひ 1遺伝子が含まれる。「NP、 P、 M、 F、 HN、および L遺伝子」とは、それぞれヌクレオキヤプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、へマグルチ二ン-ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウィルス亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、 NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもあるパラミクソウィルス属 NP P/C/V M F HN - L

ルブラウィルス属 NP P/V M F HN (SH) L

モービリウィルス属 NP P/C/V M F H - L

例えばパラミクソウィルス科 Paramyxoviridae) のレスピロウィルス（ Respirovirus) にも分類されるセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのァクセッション番号は、 NP遺伝子については M29343、 M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218 P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、 M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、 F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、 HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。

本発明において「遺伝子」とは遺伝物質を指し、 RNAおよび DNA等の核酸が含まれる。遺伝子は蛋白質をコードしてもよく、また蛋白質をコードしていなくてもよい。例えば遺伝子はリボザィムまたはアンチセンス RNAなどの機能的 RNAをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖 DNAおよぴニ本鎖 DNAを含む

「腎細胞」とは、哺乳動物の正常腎臓に含まれる細胞、および病的腎臓に浸潤している細胞が含まれる。腎臓に浸潤している細胞には、例えば単球（monocytes ) マク σファージ (macrophages) , ジンノヽ⁰球 (leukocytes) など力挙 ίずられる。具体的には、哺乳動物の腎臓は、少なくとも 15種類の細胞からなっており、糸球体細月包 (glomerular cell)

メサンギゥム細胞 (mesangial cell)

間質細包 (interstitial cell)

尿細管細胞 (renal tubular cell)

足細胞（podocyte)

内皮細月包 (endothelial cell)

などが含まれる。また糸球体基底膜（GBM) および上皮細胞なども挙げられる。本発明において、これらの細胞は腎細胞に含まれる。

腎動脈とは、腎臓内または腎臓に至る動脈を指し、腹部大動脈（abdominal aorta ) から分岐する腎動脈およびそれより下流の小葉間動脈、右腎動脈、左腎動脈、腎門の近くで分岐した動脈、および 5本の区域動脈（segmental artery)、およびそれより下流の弓状動脈を含む。腎静脈とは、腎臓内または腎臓から出る静脈を指し、右腎静脈、左腎静脈、小葉間静脈、星状静脈、弓状静脈、および葉間静脈を含む。

本発明は、パラミクソウィルスべクターの腎細胞へ遺伝子導入用途を提供する。本発明者等は、パラミクソウィルスが極めて高い効率で腎細胞へ遺伝子を導入することができることを見出した。本発明者等による実験では、腎臓の広範囲の領域で導入遺伝子の発現が検出された。特に、腎動脈からの注入では、主に間質細胞および糸球体細胞への遺伝子導入が確認された。これらの細胞は腎疾患における標的細胞として重要であり、本発明のベタターは腎疾患の遺伝子治療に好適に用いられ得る。

また、本発明者等により、組換えパラミクソウィルスベクターを利用して腎細胞に導入された遺伝子が少なくとも 1箇月にわたり持続的な発現を示すことが示された。このことは、組換えパラミクソウィルスベクターを利用して腎細胞を標的とした遺伝子治療を行った場合に、持続的な治療効果を得ることができるという利点をもたらす。

また、安全性の面においても、パラミクソウィルスベクターはヒトへの遺伝子治療の臨床試験に好適に用いられうる可能性が示唆される。第一に、外来遺伝子の発現は、導入した DNAの核局在化が必要であること力遺伝子導入の成功率を低下させる主要な障害になっている。しかし、例えばセンダイウィルスなどの場合、外来遺伝子の発現は、細胞質内において細胞性チューブリンおよび自身が持つ RNAポリメラーゼ（L蛋白質）の両方によって駆動される。これはまた、センダイウィルスが宿主のゲノムと相互作用しないことを示しており、癌化などの安全面における問題が生じないと考えられる。第二に、センダイウィルスは齧歯類にとつては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人には病原性ではない。これはまた、野生型センダイウィ^/スの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（

Hur itz, J. L. et al. , Vaccine 15 : 533 - 540， 1997)。センダイウィルスのこれらの特 ί敷は、センダイウィルスベクターが、ヒトの治療へ応用しうることを示唆し、センダイウィルスベクターが、腎細胞への遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを結論づけるものである。

このようにパラミクソウィルスベクターが腎細胞への遺伝子導入において様々な利点を有するという本発明により得られた知見は、特に、腎細胞を標的とした遺伝子治療などにおいて大きな進歩をもたらす可能性を示している。

本発明において腎細胞への遺伝子導入に用いるパラミクソウィルスベクターとしては、特に制限はない。好適なパラミクソウィルスベクターとして、例えば、複製能を有し、自立的に増殖するようなベクターが挙げられる。例えば、一般に天然型パラミクソウィルスのゲノムは、 3'の短いリーダー領域に続き、 N (ヌクレォキヤプシド）、 P (ホスホ）、 M (マトリックス）、 F (フュージョン）、 HN (へマグルチニン -ノイラミニダーゼ）、および L (ラージ）蛋白質をコードする 6つの遺伝子が並んでおり、短い 5' トレイラ一領域を他端に有する。これと同様の構造を有するゲノムを設計することにより、自律複製可能な本発明のベタターを製造することができる。また、ゲノム内に外来遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子を発現するベクターを製造することができる。なお、本発明のパラミクソウィルスベクターにおいては、ベクター上のウィルス遺伝子の配置は野生型ウィルスから改変されていてもよレ、。

また、本発明に用いるパラミクソウィルスベクターとしては、野生型パラミクソウィルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってもよい。例えば、センダイウィルスベクターを再構成させる場合、 NP、 P/Cおよび L遺伝子から作られる蛋白質群がトランスに必要だと考えられているが、該蛋白質群をコードする遺伝子自体は、本発明のウィルスベクターに必ずしも含まれている必要なはい。例えば、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、ベクターゲノムをコードする発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフエクシヨンすることにより、再構成を行うことができる。また、該蛋白質群をコードする遺伝子を有する宿主細胞にベタターゲノムをコードする発現べクターを導入し、該宿主細胞から該蛋白質群を供給して再構成を行ってもよい。これらの蛋白質群のアミノ酸配列は、ウィルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウィルスの相同遺伝子で代用してもよい。

また、パラミクソウィルスベクターが細胞に伝播してゆくためには、 M、 Fおよぴ HN遺伝子から作られる蛋白質群が必要だと考えられているが、パラミクソウイルスベクターを RNPとして調製する場合は、これらの蛋白質は必要ない。 RNPに含まれるゲノムに、 M、 Fおよび HN遺伝子が含まれていれば、宿主に導入された時に、これらの遺伝子産物が生産され、感染性のあるウィルス粒子が形成される。感染性ウィルスを産生する RNPベクターとしては、例えば N、 P、 M、 F、 HN、および L 遺伝子をコードするウィルスゲノム RNAと、 N蛋白質、 P蛋白質、および L蛋白質とを含む RNPが挙げられる。このような RNPを細胞内に導入すると、 N蛋白質、 P蛋白質、および L蛋白質の働きによりウィルスゲノムが発現、複製され、感染性ウィルスベクターが増幅する。

RNPを細胞に導入するには、例えばリボフエタトァミンやポリカチォニックリポソームなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフエクション試薬が利用できる。例えば、 DOTMA (Boehringer)、 Superfect (QIAGEN #301305)、 D0TAP、 DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169) などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロ口キンを加えることもできる（Calos, M. P. , 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 3015)。複製型ウィルスの場合、産生されたウィルスは、培養細胞、鶏卵、個体（例えばマウスなどの哺乳動物） 'などに再感染させて増幅または II代することができる。

逆に、 M、 Fおよび/または HN遺伝子が含まれていないパラミクソウィルスベクタ一も、本発明のパラミクソウィルスベクターとして用いることができる。このようなウィルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウィルスべクターは、野生型ウィルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはこれらのいずれかの遺伝子を欠損しているため、最初と同じような感染力を持つ娘ウィルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウィルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えば F遺伝子およぴ Zまたは HN遺伝子が挙げられる。例えば、 F遺伝子が欠損した組換えパラミクソウィルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、 F蛋白質の発現ベクターならびに NP、 P/Cおよび L蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフエクシヨンすることにより、ウイ Λ ^スベタターの再構成を行うことができる（国際公開番号 WO0O/70055および W000/70070 )。また、例えば、 F遺伝子が染色体に組込まれた宿主細胞を用いて製造することもできる。これらの蛋白質群を外から供給する場合、そのアミノ酸配列はウィルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウィルスの相同遺伝子で代用してもよい。

また、べクターゲノムが由来するウィルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をベクターのエンベロープに含むベタターを作製することもできる。このようなタンパク質に特に制限はない。例えば、他のウィルスのエンベロープタンパク質、例えば水疱性口内炎ウィルス（VSV) の Gタンパク質 (VSV-G) を挙げることができる。本発明のパラミクソウィルスベクターは、 VSV - Gタンパク質などのように、ゲノムが由来するウィルス以外のウィルスに由来するエンベロープタンパク質を含むシユードタイプウィルスベクターが含まれる。

また、本発明のパラミクソウィルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウィルスエンベロープ由来のポリべプチドを細胞内領域に有するキメラタンパク質などを含むものであってもよい。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作り出すこともできる。これらはゥィルスゲノムにコードされていてもよいし、ウィルスベクターの再構成時に、ゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体などの遺伝子）の発現により供給されてもよい。

また、本発明のウィルスベクターは、例えば、免疫原性を低下させるために、または、 RNAの転写効率や複製効率を高めるために、ベクターに含まれるウィルス遺伝子が改変されたものであってもよい。具体的には、例えば複製因子である NP 遺伝子、 P/C遺伝子おょぴ L遺伝子の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、構造体蛋白質の 1つである HN蛋白質は、赤血球凝集素であるへマグルチニン（hemagglutinin)活性とノイラミニダーゼ（ neuraminidase)活性との両者の活性を有する力例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、膜融合に関わる F蛋白質を改変することにより、膜融合リボソームの融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうる F蛋白質や HN蛋白質の抗原提示ェピトープ等を解析し、これを利用して抗原提示能を弱めたパラミクソウィルスを作製することもできる。

また、本発明のワクチンに用いられる SeVは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えば SeVのアクセサリー遺伝子の 1つである V遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現や複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対する SeVの病原性が顕著に減少する（Kato, A. et al. 1997. J. Virol. 71 : 7266-7272 ; Kato, A. et al. 1997. EMBO J. 16 : 578 - 587; Curran, J. et al. , W001/04272, EP1067179)。このような弱毒化ベクターは、本発明のヮクチンを構成するベクターとして特に好適である。

本発明のウィルスベクターは、ゲノム RNA中に外来遺伝子をコードし得る。外来遺伝子を含む組換えパラミクソウィルスベクターは、上記のパラミクソウィルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、標的とする腎細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、また天然型蛋白質と同等の機能を有する蛋白質をコードする限り、欠失、置換または揷入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。あるいは、天然型蛋白質の欠失型や人工的な蛋白質などであってもよい。例えば、遺伝子治療などを目的とする場合には、該ウィルスベクタ一 DNAに対象となる疾患の治療用遺伝子を揷入する。ウィルスベクター DNAに外来遺伝子を導入する場合は、例えば、センダイウィルスベクター DNAにおいては、転写終結 (E)配列と転写開始 (S) 配列との間などに、 6の倍数の塩基数を有する配列を揷入することが望ましい（ Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 1993， p. 4822 - 4830)。外来遺伝子は、ウィルスの各遺伝子（NP、 P、 M、 F、 HN、および L遺伝子）の前および/または後ろに挿入することができる。前後の遺伝子の発現を妨げないようにするため、外来遺伝子の前または後ろに適宜 E_I- S配列（転写開始配列一介在配列一転写終結配列）またはその部分を揷入し、各遺伝子の間に E- 1- S配列を配置する。あるいは、 IRESを介して外来遺伝子を挿入することもできる。

挿入した外来性遺伝子の発現量は、外来遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる。また、遺伝子挿入の位置、および遺伝子の前後の塩基配列により調節しうる。例えば、センダイウィルスにおいては、挿入位置がゥィルスゲノムのネガティプ鎖 RNAの 3'端に近レヽほど（野生型ゥィルスのゲノム上の遺伝子配置においては、 NP遺伝子に近いほど）、揷入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、外来遺伝子を NP遺伝子の上流 (マイナス鎖においては 3'側）または NP遺伝子と P遺伝子の間など、上流領域（ネガティブ鎖ゲノムにおいて 3'側）に挿入することが好ましい。逆に、揷入位置がネガティブ鎖 RNAの 5'端に近いほど（野生型ウィルスのゲノム上の遺伝子配置においては、 L遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を低く抑えるためには、例えばネガティブ鎖の最も 5'側、すなわち野生型ウィルスゲノムにおいては L遺伝子の下流（ネガティブ鎖においては L遺伝子の 5'隣接部位）、または L遺伝子の上流（ネガティブ鎖においては L遺伝子の 3'隣接部位）に外来遺伝子を揷入する。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウィルスタンパク質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。例えば、高力価ウィルスベクターの投与による導入遺伝子の高発現が毒性を示す場合は、投与するウィルス力価を制限することができる他、例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位置をネガティプ鎖のなるべく 5'側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、個々の SeVベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるすることも可能である。

一般に、細胞毒性を示さない限りにおいて、抗原蛋白質の高い発現が得られれば、免疫獲得に有利と考えられるため、抗原蛋白質をコードする遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの 3'端近くに揷入することが好ましい。好適なベクターの例としては、外来遺伝子が、パラミクソウィルスべクタ一のネガティブ鎖ゲノムにおいて、該パラミクソウィルスのウィルス蛋白質のいずれよりも 3'側に配置されているべクターが挙げられる。例えば N遺伝子の上流（ネガティブ鎖の 3'側）に外来遺伝子が揷入されたベクターが好ましい。あるいは、 N遺伝子のすぐ下流に揷入してもよい。

外来遺伝子を容易に揷入できるようにするために、揷入部位にクローニンダサイトを設計することができる。クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。ゲノムをコードするべクタ一 DNA中の当該制限酵素部位に外来遺伝子断片を挿入することができる。クローユングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。また、本発明のベクターは、このように挿入した以外に位置に他の外来遺伝子を保持していてもよい。

外来遺伝子を有する,袓換えセンダイウィルスベクターは、例えば、 Hasan, M. K. et al. J. Gen. Virol. 78 : 2813 - 2820, 1997 ; Kato, A. et al. , 1997, EMBO J. 16 : 578 - 587及び Yu, D. et al. , 1997, Genes Cells 2 : 457- 466の記載に準じて、次のようにして構築することができる。

まず、所望の外来遺伝子の cDNA塩基配列を含む DNA試料を用意する。 DNA試料は、 25ng/ / I以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、外来遺伝子を Notl部位を利用してウィルスゲノムをコードする DNA に揷入する場合を例にとって説明する。目的とする cDNA塩基配列の中に Notl認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異挿入法などを用いて、コードするァミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、 Notl部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から所望の遺伝子断片を PCRにより増幅回収する。増幅された断片の両端が Notl部位とし、さらに一端にセンダイウィルスの転写終結配列

(E)、介在配列（I) 及び転写開始配列（S) (EIS配列）のコピーを付加するために、 Notl制限酵素切断部位配列及び転写終結配列（E)、介在配列（I)及ぴ転写開始配列（S) と目的遺伝子の一部の配列を含むプライマー対として、フォワード側

(センス鎖）合成 DNA配列及ぴリバース側（アンチセンス鎖）合成 DNA配列（プライマ一対）を作成する。

例えば、フォワード側合成 DNA配列は、 Notlによる切断を保証するために 5'側に任意の 2以上のヌクレオチド（好ましくは GCGおよぴ GCCなどの Notl認識部位由来の配列が含まれない 4塩基、更に好ましくは ACTT) を選択し、その 3，側に Notl 認識部位 gcggccgcを付加し、さらにその 3'側にスぺーサー配列として任意の 9塩基または 9に 6の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその 3'側に所望の cDNA の開始コドン ATGからこれを含めて 0RFの約 25塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基は Gまたは Cとなるように該所望の cDNAから約 25塩基を選択してフォヮード側合成ォリゴ DNAの 3'の末端とすることが好ましい。

リバース側合成 DNA配列は 5'側から任意の 2以上のヌクレオチド（好ましくは GCGおよび GCCなどの Notl認識部位由来の配列が含まれない 4塩基、更に好ましくは ACTT) を選択し、その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、さらにその 3'側に長さを調節するための挿入断片のオリゴ DNAを付加する。このオリゴ DNAの長さは、 Notl認識部位 gcggccgcを含め、 cDNAの相捕鎖塩基配列と後述するセンダイゥィルスに由来するセンダイウィルスゲノムの E I S塩基配列の合計が 6の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「6のルール (rule of six)」； Kolakofski, D. et al. , J. Virol. 72 : 891—899, 1998 ; Calain, P. and Roux, L. , J. Virol. 67 : 4822-4830, 1993)。さらに揷入断片の 3，側にセンダイウィルスの S配列の相補鎖配列、好ましくは 5' -CTTTCACCCT-3' (配列番号： 1 )、 I配列、好ましくは 5' -AAG- 3'、 E配列の相補鎖配列、好ましくは 5' - TTTTTCTTACTACGG- 3，（配列番号： 2 )、さらにその 3'側に所望の cDNA配列の終始コドンから逆に数えて約 25塩基相当の相補鎖の最後の塩基が Gまたはこなるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成オリゴ DNAの 3，の末端とする。

PCRは、例えば、 ExTaqポリメラーゼ（宝酒造）を用いる通常の方法を用いることができる。好ましくは Ventポリメラーゼ（NEB) を用いて行い、増幅した目的断片は Notlで消化した後、プラスミドベクター pBluescriptの Notl部位に揷入する。得られた PCR産物の塩基配列をシークェンサ一で確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片を Notlで切り出し、パラミクソウィルスゲノム cDNAを含むプラスミドの Notl部位にクローニングする。またプラスミドベクター pBluescriptを介さずに Notl部位に直接挿入し、組換えパラミクソウィルス cDNAを得ることも可能である。

例えば、組み換えセンダイウィルスゲノム cDNAであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Yu, D. et al. , Genes Cells 2 : 457-466, 1997 ; Hasan, M. K. et al. J. Gen. Virol. 78 : 2813-2820， 1997)。例えば、まず Notl制限部位を有する 18bpのスぺーサー配列（5' _ (G) - CGGCCGCAGATCTTCACG- 3，）（配列番号： 3 ) を、クローニングされたセンダイウィルスゲノム cDNA (_PSeV(+) ) のリーダー配列と N-タンパク質をコードする配列の 5'末端との間の隣接遺伝子座に挿入し、デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand) 由来の自己開裂リボザィム部位を含むプラスミド _PSeV18+b (+)を得る（Hasan, M. K. et al. , 1997, J. General Virology 78 : 2813-2820)。 pSeV18⁺b (+)の Notl部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組込まれた組み換えセンダイウィルス cDNAを得ることができる。

ウィルスゲノムをコ一ドする DNAは、適当な転写プロモーターを連結してベクタ一 DNAを構築し、これを試験管内または細胞内で転写させ、パラミクソウィルスの L、 P、および NPタンパク質の共存下で RNPを再構成させることにより、この RNPを含むウィルスベクターを生成させることができる。本発明は、パラミクソウィルスベクターのゲノム DNAを転写させる工程を含む、腎細胞へ遺伝子を導入するために用いるパラミクソウィルスベクターまたは該ベクターを含む腎細胞への遺伝子導入用組成物の製造方法を提供する。また本発明は、該 DNAからなる、本発明のパラミクソウィルスベクターまたは該ベクターを含む腎細胞への遺伝子導入用組成物の成分として用いるパラミクソウィルスベクター製造用 DNAを提供する。また本発明は、本発明のパラミクソウィルスベクターまたは該ベクターを含む腎細胞への遺伝子導入用糸且成物の成分となるパラミクソウィルスベクターを製造するための、該ベクターのゲノムをコードする DNAの使用に関する。ウィルスベクター DNA からのウィルスの再構成は公知の方法に従って行うことができる（国際公開 97/16539号; 国際公開 97/16538号; Durbin, A. P. et al. , 1997, Virology 235 : 323-332 ; Whelan, S. P. et al.， 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 8388 - 8392 ; Schnell. M. J. et al. , 1994, EMBO J. 13 : 4195-4203 ; Radecke, F. et al.， 1995, EMBO J. 14 : 5773-5784 ; Lawson, N. D. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 4477-4481； Garcin, D. et al. , 1995， EMBO J. 14 : 6087 - 6094 ; Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1 : 569 - 579 ; Baron, M. D. and Barrett, T. , 1997， J. Virol. 71 : 1265-1271 ; Bridgen, A. and Elliott, R. M.， 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 15400-15404)。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウィルス、リンダ一ペストウィルス、センダィウィルスなどを含むパラミクソウィルスベクターを DNAから再構成させることができる。ウィルスベクター DNAにおいて、 F遺伝子、 HN遺伝子、および/または M 遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のゥィルス粒子を形成しない、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および/または他のウィルスのェンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し発現させることにより、感染性のウィルス粒子を形成させることが可能である。例えば、ベクター DNAを細胞内に導入する方法には、次のような方法、①目的の細胞が取り込めるような DNA沈殿物を作る方法、②目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つ DNAを含む複合体を作る方法、③目的の細胞膜に、 DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによつて瞬間的に開ける方法などがある。

②としては、種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。例えば、 D0TMA

(Boehringer)、 Superfect (QIAGEN #301305)、 D0TAP、 DOPE, DOSPER (Boehringer #1811169) などが挙げられる。 ①としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフヱクション法が挙げられ、この方法によつて細胞内に入つた DNAは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量の DNAが入ることが知られている（Graham, F. L. and Van Der Eb, J. , 1973, Virology 52 : 456 ; Wigler, M. and Silverstein, S. , 1977, Cell 11 : 223)。 Chenおよひ Okayamaはトランスファー技術の最適化を検討し、 1) 細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を 2〜4% C0₂、 35°C、 15 〜24時間、 2) DNAは直鎖状より環状のものが活性が高く、 3) 沈殿混液中の DNA濃度が 20〜30 μ _§/πι1のとき最適な沈殿が得られると報告している（Chen, C. and Okayama, Η·， 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 2745)。 ②の方法は、一過的なトランスフエクシヨンに適している。古くは DEAE -デキストラン（Sigma ffD- 9885 M. W. 5 X 10⁵ ) 混液を所望の DNA濃度比で調製し、トランスフヱクシヨンを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドノームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロ口キンを加えることもできる（Calos, M. Ρ·， 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 3015)。 ③の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で①ゃ②の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、 DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。

以上、 3つのカテゴリーの中で②の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のための DNAの細胞への導入には、トランスフエクシヨン試薬が適している。好適には Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、または DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169) 力 ^s用ヽられるが、これらに制限されない。

cDNAからの再構成は具体的には次のようにして行うことができる。

24穴から 6穴程度のプラスチックプレートまたは 100醒ペトリ皿上で、 10%ゥシ胎児血清 (FCS)およぴ抗生物質（100 units/mlぺニシリン Gおよぴ 100 μ g/mlストレプトマイシン）を含む最少必須培地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株 LLC- MK2 を 70〜80%コンフルェントになるまで培養し、例えば 1 μ g/ml psoralen (ソラレン）存在下 UV照射処理を 20分処理で不活化した、 T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルス vTF7 - 3 (Fuerst, T. R. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 8122—8126, 1986、 Kato, A. et al. , Genes Cells 1 : 569-579， 1996) を 2 PFU/ 細胞で感染させる。ソラレンの添加量おょぴ UV照射時間は適宜調整することができる。感染 1時間後、 2〜60 ^ g、より好ましくは 3〜5 μ _§の上記の組換えセンダイウィルス cDNAを、全長センダイウィルスゲノムの生成に必須なトランスに作用するウィルスタンパク質を発現するプラスミド（24 - 0. 5 gの pGEM- N、 12-0. 25 _§ の pGEM- Ρ、およぴ 24-0· 5 μ gの pGEM -レより好ましくは例えば 1 μ gの pGEM - Ν、 0. 5 i gの pGEM- Ρ、およぴ 1 μ gの pGEM- L) (Kato, A. et al. , Genes Cells 1 : 569 - 579, 1996) と共に Superfect (QIAGEN社）を用いたリポフエクシヨン法等によりトランスフエクションする。トランスフエクションを行つた細胞は、所望により 100 μ g/mlのリファンピシン（Sigma) 及ぴシトシンァラビノシド（AraC)、より好ましくは 40 μ g/mlのシトシンァラビノシド（AraC) (Sigma) のみを含む血清不含の MEMで培養し、ワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Kato, A. et al. ， 1996, Genes Cells 1 : 569 - 579)。トランスフエクシヨンから 48〜72時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を 3回繰り返して細胞を破砕した後、 LLC-MK2細胞にトランスフエクシヨンして培養する。培養 3〜7日後に培養液を回収する。ェンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウィルスベクターを再構成させるには、エンベロープタンパク質を発現する LLC - MK2細胞をトランスフエクシヨンに使用する力 \ またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフエクシヨンすればよい。また、トランスフエクシヨンを行った細胞にエンベロープタンパク質を発現する LLC - MK2細胞に重層して培養することによつて欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号 W000/70055 および WO0O/70070参照）。あるいは、上記の凍結融解による細胞破碎物を 10日齢の発育鶏卵の尿膜内へ接種し、約 3日後、尿液を回収してもよい。培養上清または尿液に含まれるウィルス力価は赤血球凝集活性 (HA)を測定することにより決定することができる。 HAは「_endo- point希釈法」（Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1 : 569 - 579 ; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y. , Hemaggulut i nat i ng virus of Japan - liposome— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method m Molecular Medicine : Humana Press : pp. 295-306, 1999) により決定することができる。混入し得るワクシニアウィルス vTF7- 3を除去するために、得られた尿液試料を適宜希釈（例えば 10⁶倍）して、鶏卵で再増幅させることができる。再増幅は、例えば 3回上繰り返すことができる。得られたウィルスストツクは- 80°Cで保存することができる。

回収したパラミクソウィルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーシヨン、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製 ·分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、単離した物質（化合物、ポリペプチド、またはウィルス等）力それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、試料中に存在する実質的に純粋な成分は、試料中の他の成分を合わせた全体の 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上を占める。割合は当業者に公知の手順により、例えば重量比率 [w/w]等で算出される。溶媒、塩、添加化合物などは除外して算出する。パラミクソウィルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカラィド硫酸エステルを用いる方法（特公昭 62- 30752号公報、特公昭 62-33879号公報、およぴ特公昭 62- 30753号公報）、およぴフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法（W097/32010) 等を例示することができる。

ウィルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、 LLCMK2細胞、サル腎由来の CV - 1細胞、ハムスター腎由来の BHK細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。また、大量にセンダイゥィルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウィルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウィルスべクタ一の製造方法は既に開発されている（中西ら編，（1993)，「神経科学研究の先端技術プロトコール III，分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪， pp. 153- 172)。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ 9〜12日間 37〜38°Cで培養し、胚を成長させる。ウィルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間卵を培養してウィルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組換えセンダイウィルスにより変わり得る。その後、ウィルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウィルスベクターの分離 ·精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウィルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビユー社， pp. 68 - 73, (1995) )。

欠損型ウィルスベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウィルスゲノム上で欠損しているエンベロープ遺伝子が異なる 2種のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するエンベロープタンパク質が、もう一方のベクタ一からの発現により供給されるため、互いに相捕しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅される。すなわち、 2種またはそれ以上の本発明のベクターを、エンベロープタンパク質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのエンベロープ遺伝子欠損型ウィルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、エンベロープ遺伝子が欠損しているため、エンベロープ遺伝子を欠損していないウィルスに比べゲノムサイズが小さくなり長、外来遺伝子を保持することができる。また、元々感染性のないこれらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある

外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウィルスベクターを調製すれば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウィルスベクターの遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接（ ex vivo)投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を発現させることが可能である。外来遺伝子としては特に制限はなく、蛋白質をコードする核酸に加え、例えば、アンチセンスまたはリポザィムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。

本発明のパラミクソウィルスベクターは、薬学的に許容される所望の媒体と共に、腎細胞への遺伝子導入用の組成物とすることができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えば本発明のパラミクソウィルスベクタ一を生理食塩水ゃリン酸緩衝生理食塩水（PBS)などで適宜希釈して組成物とすることができる。本発明のパラミクソウィルスベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。また本発明のパラミクソウィルスベクターを含む組成物は、脱イオン水、 5%デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよレ、。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤やその他の添加剤を添加することがでさる。

上記のようにして得られたパラミクソウィルスべクターまたは該べクターを含む組成物を腎細胞に接触させることで、パラミクソウィルスベクターが持つ外来遺伝子を腎細胞へ導入することができる。本発明は、腎細胞へ遺伝子を導入するための、パラミクソウィルスベクターの使用を提供する。感染経路は特に制限はなく、例えば静脈注射などにより全身に投与してもよく、あるいはベクターをより局部的に投与してベクターの導入範囲を制限することもできる。腎への局所投与には、腎血管内、尿管内、腎盂内、およぴ腎実質内への投与などが挙げられる。具体的には腎動脈または腎静脈からの注入、あるいは尿管または腎盂からの逆行など力 ^s好適である (Tomita, N. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 : 129-134, 1992 ; Isaka, Y. et al. , J. Clin. Invest. 92 : 2597-2601 ; Arai, M. et al.， Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 : 525-532， 1995 ; Heikkila, P. et al. , Gene Ther. 3 : 21-27, 1996 ; Rappaport, J. et al. , Kidney Int. 47 : 1462-1469, 1995 ; Oberbauer, R. et al. , Kidney Int. 48 : 1226-1232, 1995 ; Haller, H. et al. , Kidney Int. 50 : 473—480， 1996 ; Lien, Y. et al. , Exp. Nephrol. 5 : 132-136 ; Moullier, P. et al. , Kidney Int. 45 : 1220-1225， 1994 ; Bosch, R. et al. , Exp. Nephrol. 1 : 49—54, 1993 ; Zhu， G. et al. , Gene Ther. 3 : 298-304)。特に、血管を介してベクターを注入した場合は間質細胞および糸球体に効率よく遺伝子が導入され、これらの細胞の近傍にはマクロファージの浸潤も見られないことから好ましい。

血管から注入する場合、例えば、対象となる遺伝子を含むベクターを、カテーテルを介して動脈注射（米国特許第 5, 328, 470号参照）したり、または翼付注入セット（Terumo Medical Corporation) により注入することができる。注入に際しては、クランプ等により血流を遮断することが好ましい。例えば、カテーテルを左腎動脈に挿入し、腹部大動脈近傍をクランプで留めて血流を遮断し、生食で灌流後べクター溶液を注入し遺伝子を導入することで左腎の細胞に遺伝子を導入することができる。

このような方法は、（a ) 腎血管の血流を遮断する工程、（b ) 腎血管内に、本発明のパラミクソウィルスベクターを注入する工程、および（c ) 該ベクターが感染するようにインキュベートする工程を含む。遮断する血流は、例えば腎動脈の血流である。動脈を遮断してベクターを注入後、さらに静脈を遮断してインキュベートすることが好ましい。

具体的には、例えば、腎臓への血流を、上腸間膜動脈直下と下腸間膜動脈上方の大動脈をクランプすることで遮断することができる。このようにして左右片方の腎臓の血流だけを遮断することができる。生食で灌流後、適当なゲージの針により腎大動脈から本発明のベクターを直接注入することができる。短時間のィンキュベーシヨンによりベクターを感染させた後、クランプを取り除き血流を回復させる。

また、総類動脈及び胸部大動脈から腎動脈近位にカテーテル揷入し、ここからベクターを注入することもできる（Tomita, N. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 : 129-134， 1992)。この場合、例えば腹部大動脈のクリップにより腎動脈の遠位で血流を遮断し、生食で灌流後カテーテルからベクター溶液を注入する。これら以外でも、公知の方法により血管を介してベクターを注入してもよい尿管から逆行させてベクターを導入する場合、尿管からシリンジまたはカテーテルを揷入してベクター溶液を注入することができる。注入の際に、血管をクランプなどで遮断することもできる。この方法は、（a )腎血管の血流を遮断するェ程、（b )尿管内に、本発明のパラミクソウィルスベクターを導入する工程、およぴ（c ) 該ベクターが感染するようにインキュベートする工程を含む。例えば左腎静脈をクランプで遮断した後、ベクターを注入することができる。尿管から力テーテルを揷入すれば、腎盂手前または腎盂内などにべクタ一溶液を注入することができる。

ベクターを感染させるためのインキュベーションは、例えば数分（約 1分〜約 10 分程度）行うことができる。血流を遮断する場合、約 10分を超えると虚血性の組織損傷が生じる恐れがあることから、十分な感染効率が得られる限り、なるべく短時間で血流を再開させることが好ましい。組織損傷を低減するため、長時間血流を遮断する場合は組織を氷などで冷やすことが好ましい。

さらに、ウィルスベクターに生体適合性のポリオル（例えば poloxamer 407など）を組み合わせることで、ウィルスベクターの形質導入率を 10〜100倍に上昇させ得る（March et al.， Human Gene Thrapy 6 : 41-53， 1995)。これによりウィルスベクターの投与量を低く抑え、また感染時間を短縮することができる。本発明においては、生体適合性のポリオルを、本発明のパラミクソウィルスベクターと組み合わせて組成物とすることができる。また、別の生体適合性ポリオルを組み合わせて用いてもよい。また、血圧を上昇または下降させる種々の薬剤を組み合わせて投与することも可能である。上記の薬剤は、ベクターと一緒に投与することもできれば、別々に投与することもできる。

さらに本発明の方法を用いて生体外（ex vivo) で腎細胞に遺伝子を導入することもできる（Kitamura, M. et al. , J. Clin. Invest. 94 : 497—505 ; Kitamura, M. et al. , Kidney Int. 51 : 1274—1279, 1997 ; Naito, T. et al. , Mol. Med. 2 : 297-312, 1996 ; Koseki, C. et al. , Am. J. Physiol. 261 : C550-C554, 1994 ; Heikkila, P. et al.， Gene Ther. 3 : 21 - 27， 1996; Zeigler, S. et al. , Transplantation 61 : 812-817, 1996)。例えば、移植においてドナーから腎臓を回収し、この腎臓に対して本発明のベクターを投与する。また、腎臓から腎細胞を回収し、これらの細胞に遺伝子を導入後、患者体内に注入することもできる。このような細胞としては、例えばメサンギゥム細胞、マクロファージ、尿細管上皮細胞などが挙げられる。具体的には、例えば、バイオプシーにより患者腎臓よりメサンギゥム細胞を採取し、遺伝子導入後に患者腎臓に戻すことが考えられる。このようなメサンギゥム細胞への遺伝子導入のために、本発明のベクターを用いることが可能である。また、尿細管上皮細胞に遺伝子を導入し、被膜下に移植して間質への ex vivoによるトランスフエクシヨンを行うこともできる。本発明のパラミクソウィルスベクターを利用した遺伝子導入の標的となる腎細胞としては、特に制限はないが、例えば、間質、糸球体、血管（動脈、静脈、および毛細管を含む）、尿細管（遠位尿細管および近位尿細管を含む）など細胞が挙げられる。具体的には、間質性線維芽細胞、メサンギゥム細胞、血管内皮細胞、尿細管上皮細胞（TEC)、マクロファージなどが好適な標的細胞である。また、成体および胚（胎児）の腎細胞（後腎、中腎、前腎の細胞を含む）が対象となる。また、間葉系細胞などの腎始原細胞に遺伝子を導入することもできる。

本発明のパラミクソウィルスにより導入する遺伝子としては、特に制限はないが、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイ卜力イン、増殖因子、受容体、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子およぴ細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナルや膜局在化シグナル、核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子は、腎細胞で発現していない遺伝子であってもよく、また腎細胞で発現している遺伝子を導入し、発現を増大させてもよい。また、アンチセンス RNA分子または RNA切断型リポザィムなどを発現させて腎細胞で発現する望ましくない遺伝子の機能を抑制することもできる本発明のベクターは、様々な腎疾患に対する遺伝子治療に適用することが期待される。このような遺伝子治療には、例えば、遺伝子欠損による細胞での発現の異常を補正するために、また、外来遺伝子を細胞に導入することにより新しい機能を付加させるために、あるいは、ある遺伝子に対して抑制的に働く遺伝子を導入することにより細胞における望ましくなレ、作用を抑制するために行レ、得る。また、本発明のベクターは非ヒト哺乳動物の腎細胞への遺伝子導入にも有用である。例えば、様々な疾患モデルの作製や、疾患モデルおょぴ腎移植等における治療方法の開発または評価において有用である。

本発明は、例えば腎移植において適用することが考えられる。腎同種移植または異種移植などにおいて、本発明のベクターを用いて移植組織に外来遺伝子を導入することが可能である。例えば拒絶反応を抑制する遺伝子を発現させ、移植後の急性拒絶反応を抑制することが考えられる（例えば Zeigler, S. et al.， Transplantation 61 : 812-817， 1996参照）。また、上述のようにマクロファージ、あるいはメサンギゥム細胞または内皮細胞などの腎細胞を単離し、これに外来遺伝子を導入して腎臓へ移入することもできる。メサンギゥム細胞を使った移植による投与は、例えば公知のメサンギゥム細胞べクタ一系を利用することができる（Kitamura, M. et al. , J. Clin. Invest. 94 : 497-505， 1994; Kitamura, M. Exp. Nephrol. 5 : 118 - 125， 1997)。この方法では、メサンギゥム細胞は糸球体毛細管に捕捉され外来遺伝子を発現する。また、マクロファージベクターなどを用いてもよい (Kitamura, M. et al. , Kidney Int. 51 : 1274 - 1279)。例えば、炎症を起した糸球体に対して各種サイト力イン、免疫抑制蛋白質、または抗線維蛋白質などの遺伝子を導入することが考えられる。

本発明は、腎臓における癌の治療にも適用され得る。動脈カテーテルなどを介して癌治療のための遺伝子を癌病巣に導入することが考えられる。用いられる遺伝子としてはサイトカイン、可溶性 VEGF受容体等の血管新生を阻害する蛋白質などが挙げられる。

また、本発明のベクターは、急性尿細管壌死（acute tublar necrosis) に対して酸化窒素合成酵素（N0S) の導入、または細胞内接着分子一 1 (ICAM- 1) の機能を阻害する遺伝子の導入などに用いることが考えられる。また、血管形成術後の腎動脈狭窄症の予防、腎嚢胞の治療等に本発明のベクターを用いることもできるその他の適用可能な疾患としては、上気道などの細菌感染によって起こる急性糸球体腎炎（acute glomerulonephritis ; AGN；)、急速進行性糸球体腎炎（rapidly progressive glomerulonephritis ; RPGN ) 、慢性糸球体腎炎 ( chronic glomerulonephritis ; CGN) [微小変化型（minimal change)、巣状糸球体硬化症 ( focai glomerular sclerosis)、 I¾ttW¾E (membranous nephropathy) _s メサンギクム増殖性腎症 (mesangial proliferative glomerulonephritis) 膜性: t 殖性糸球体腎；)正 (merabranoproliferative glomerulonephritis)、硬ィ匕性糸球体腎炎 ( sclerosing glomerulonephritis) を含む]、糖尿病や FF炎などに伴い二次的に糸球体が侵される二次性糸球体疾患（secondary glomerular disease)、ネフローゼ症候群（nephrotic syndrome) などが挙げられる。また、管内増殖性腎症、半月体形成性腎炎等への適用などが挙げられる。また、 HIV等の感染による腎障害の予防および治療に適用することも考えられる。

さらに、本発明のベクターによる腎細胞を標的とした治療の対象となりうる疾患または傷害とその治療用遺伝子侯補の具体例としては、以下のようなものが挙げられる。

1 . 慢性糸珠体炎 hepatocyte growth factor (HGF) , Smad 6/7

dominant negative TGF- β receptor

2 . 糖尿病†生腎症 hepatocyte growth factor (HGF) , Smad 6/7

dominant negative TbF- β receptor

3 . 糸球体硬ィ匕症 hepatocyte growth factor (HGF) , Smad 6/7

dominant negative TijF- β receptor

4 . アルポート症候群 type IV collagen

5 . 尿細管間質性腎炎 hepatocyte growth factor (HGF) , Smad 6/7

dominant negative TGF- β receptor

TGF- J3 (transforming growth factor j3 ) は多機能サイトカインであり、組織回転や損傷回復などにおいて重要な機能を果たしている。 TGF- j3は特に細胞外マトリタス（ECM) の蓄積を誘導する機能を有しており、またインテグリン等の ECM 受容体の発現も調節する。糖尿病性腎症などを含む様々な進行性腎疾患において共通する現象に、糸球体の ECM蓄積が挙げられる。このことから、 TGF- 13の発現または機能を阻害することにより、 ECMの蓄積を抑制することが可能である。

例えば、小分子デルマタン硫酸プロテオダリカンの 1つである decorin は、 TGF- ;3に対する天然の阻害因子である。この遺伝子（decorin cDNA) の導入により、糸球体の ECMの蓄積が低減される (Isaka, Y. et al. , Nat. Med. 2 : 418-423，

1996)。

また、 TGF- β受容体の細胞外ドメィンを持つ分子は、 TGF- βを中和して TGF - β の機能発現を阻害する。 TGF - 受容体には I型と II型が存在し、 II型受容体に TGF - jSが結合し、これが I型受容体と相互作用する。 TGF- i3の抑制に用いる受容体断片としては、 I型おょぴ II型のどちらでもよいが、 TGF- i3と直接相互作用する II型受容体断片を用いることが好ましい。シグナル伝達機能を欠損させた不活性化型 TGF- jS受容体を発現させることで、 TGF- j8を中和することができる。単に可溶型受容体を発現させるだけでも一定の効果は得られる（し in, H. Y. et al. , J. Biol. Chem. 270 : 2747-2754, 1995) 、例えば TGF- jS受容体の細胞外ドメインを IgG - Fcと融合させた分子（例えば TGF- RII/Fc) (Isaka, Y. et al.， Kidney Int. 55 : 465-475, 1999 ; Isaka, Y. et al.， J. Am. Soc. Nephrol. 7 : 1735， 1996) を発現させれば、効果を有意に増強させることが可能である。この分子を腎細胞に発現させることで、糸球体における細胞外マトリタスの蓄積を抑制することができる。また、 PDGF (platelet-derived growth factor) の細胞外ドメインを同様に Fcとの融合蛋白質として導入することも考えられる（Iinai, R. and Y. Isaka, Nephron 83 : 296-300， 1999 ; Isaka et al. , Kidney Int. 52 : Suppl. S100-S103,

1997) oアンチセンス RNA分子または RNA切断型リボザィムなどにより、これらの遺伝子の発現を抑制することも考えられる。逆に急性糸球体損傷などにおいては、 TGF_ i3遺伝子の導入が効果を有する可能性がある。また、腎疾患モデルの作製に TGF - j8遺伝子を用いることもできる。

Smadは TGF- jSのシグナルを伝達するシグナル分子のフアミリ一であり、この遺伝子ファミリーの機能も遺伝子導入による制御の対象となる。特に、 TGF- jSシグナルを抑制的に調節する抑制型 Smad遺伝子の導入は、 TGF- βの作用を抑制するために好適である。このような分子としては Smad6および Smad7が挙げられる。

HGF (hepatocyte growth factor) は間葉系細胞で産生される増殖因子であり、肝臓おょぴ腎臓を含む臓器の内皮細胞や上皮細胞の細胞増殖を調節している。また HGFは形態形成を誘導し、分枝した尿細管を形成させる。また、虚血ゃ薬剤による組織損傷により引き起こされる急性腎不全を予防する（Kawaida, K. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 4357-61, 1994)。 HGFによる腎疾患マウスの治療も試みられている（Mizuno, S. et al. , J. Clin. Invest. 101 : 1827-34, 1998 )。このように、 HGFは腎細胞を標的とする遺伝子治療における導入遺伝子として重要である（Imai， R. and Y. Isaka, Nephron 83 : 296-300， 1999)。 HGFは腎疾患における進行性の線維化を予防するためにも有用である。

15 -リポキシゲナーゼ（15_Lipoxygenase ; 15- L0) はロイコトリェンの炎症作用アンタコナイス、する 15— S - hydroxyeicosatetraenoic acidぉょぴ lipoxin A₄の合成を媒介する酵素である。糸球体腎症モデルにおいて、 15-L0遺伝子の導入が効果を有するという報告があり (Yura, T. et al. , J. Am. Soc. Nephrol. 6 : 890, 1995 ; Imai, E. et al. , Exp. Nephrol. 5 : 112—117， 1995 ; Munger, K. A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 : 13375-13380, 1999)、この遺伝子も治療遺伝子として有効である。

また、腎細胞を標的とした遺伝子導入（例えば、遺伝子治療）において特に有用な外来遺伝子としては、以下のようなものが挙げられる。

1 ) 細胞周期抑制遺伝子（例えば p53、 p21、 pl6、 p27など）

2 ) 細胞内増殖シグナル抑制因子遺伝子（例えば、変異型 H-Rasなど）

3 ) 分泌型細胞増殖抑制因子遺伝子（例えば、 eN0S、 CNP:C型ナトリウム利尿ぺプチドなど）

4 ) 血管平滑筋細胞弛緩因子遺伝子（例えば、 eN0S、 CNPなど） 5 ) 血管平滑筋細胞弛緩イオンチャンネル遺伝子（例えば、 C末欠損型 Kir 6. 2力リゥムイオンチャンネルなど)

6 ) 血栓溶解蛋白遺伝子（例えば組織プラスミノーゲン ·ァクチベータ一、ゥロキナーゼなど）

7 ) 組織因子反応経路阻害因子遺伝子（TFPI： Tissue Factor Pathway Inhibitor など）

8 ) 血管新生因子遺伝子（例えば VEGF、 FGF、 HGFなど）

9 ) スーパーォキシドデイスムターゼ（SOD,超酸化物不均化酵素）（例えば Cu/Zn 型 S0D、 Mn型 S0D、 EC- SODなどを含む）

本発明のベクターは、腎間質細胞に高い効率で遺伝子を導入できることが特徴の一つである。この性質を利用して、様々な腎疾患に対する遺伝子治療が可能になるものと期待される。ヒトにおける進行性の腎疾患は、最終的には共通して尿細管間質性線維症（tubulointerstitial fibrosis) を発症する。持続性の炎症や間質で繰り返される傷害が次第に腎組織を破壊し、その結果、多くの場合において腎機能の深刻な機能低下が引き起こされる（Schainuck, L. I. et al. , Hum. Pathol. 1 : 631-641, 1970 ; Bohle, A. et al.， Virchows Arch. 376: 211-232 ; Bohle, A. et al. , Virchows Arch. 373 : 15 - 22, 1977 ; Mackensen, S. et al.， Nephron 24: 30-34， 1979)。また、間質性線維症は、糸球体または血管の傷害により二次的に引き起こされることもあり得る。腎疾患の進行が腎不全の最終場面に至る機構の詳細は知られていないが、幾つかの研究では、糸球体の損傷ではなく尿細管間質の傷害の程度が、腎機能障害および長期的な予後の程度と正確に相関し得ることが報告されている (Risdon, R. A. et al. , Lancet 2 : 363-366, 1968 ; Schainuck, L. et al. , Hum. Pathol. 1 : 631-641, 1970)。

間質性線維症の過程は、細胞成分おょぴ細胞外マトリクスの代謝回転で働く正常な調節が異常に引き伸ばされたものと見ることができる。間質性線維芽細胞は、いわゆる筋線維芽細胞と呼ばれる合成表現型を獲得し、増殖して活発な炎症が起こるレジデント領域 (residential areas) に浸潤する (Alpers, C. et al. , J. Am. Soc. Nephrol. 5 : 201 - 210， 1994)。その後、これらの細胞は細胞外マトリクスの合成を引き起こし、局所的な線維形成を促進する。従って、間質性線維芽細胞を標的とする遺伝子導入技術により、インビポ（in vivo) での間質における特定分子の効果を検証することが可能となる。さらに、この技術は間質性線維症の治療法の開発にとっても重要である。

遺伝子治療は、腎器官内または外から、パラミクソウィルスベクター含有組成物をインビポ（in vivo) で投与し、外来遺伝子を腎細胞內で発現させることにより実施することができる。また、エタスビポ（ex vivo) による投与を行ってもよレ、。インビボ（in vivo) による遺伝子導入は例えば、腎動脈または腎静脈へのベクタ一注入、腎臓への直接注入、尿管からの逆行、腎盂からの逆行等の局所投与により行うことができる。その他に、例えば、全身または他の器官への投与を介して間接的に腎細胞に投与することもできる。ェクスビボ（ex vivo) による遺伝子導入は、例えば、摘出した腎臓に対して、腎動脈または腎静脈へのベクター注入、腎臓への直接注入、尿管からの逆行、腎盂からの逆行等により投与することができる。あるいは、臓器等から腎細胞を調製し、本発明のベクターとインキュペートすることにより遺伝子を導入することもできる。遺伝子が導入された腎細胞は、例えば腎臓へ移入することができる。

治療おょぴ予防において腎細胞への遺伝子導入用パラミクソウィルスベクターは、有効量のベクターが腎細胞に導入されるのに十分な量を投与される。「有効量」とは、本発明に方法において、所望の治療または予防効果を少なくとも部分的にもたらすように腎細胞に遺伝子が導入される量を言う。所望の遺伝子を含む本発明のパラミクソウィルスベクターの有効量が投与されることにより、ベクターが導入された細胞において導入遺伝子産物が産生され、それに伴つて該細胞およぴ /またはその周囲の腎細胞の表現型の変化（すなわち導入遺伝子おょぴその他の遺伝子の発現誘導または抑制、並びに形態学的、生化学的変化など）が誘導される。好ましくは、所望の遺伝子を有する本発明のベクターの有効量が投与されることにより、投与された腎臓中の有意な数の細胞に遺伝子が導入され、該細胞の表現型の変化が誘導される。「有意な数の細胞 j とは、本発明のベクターが、投与部位における標的腎細胞の少なくとも約 0. 1%、好ましくは約 1%以上、より好ましくは約 5%以上、より好ましくは約 10%以上、最も好ましくは約 20%以上の細胞で遺伝子が導入されることを言う。標的腎細胞としては、例えば、間質細胞、糸球体細胞、または尿細管細胞、あるいはメサンギゥム細胞、上皮細胞、内皮細胞等が挙げられる。

細胞への遺伝子導入は、当業者に公知の方法によりアツセィすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイプリダイゼーシヨン、 RT- PCR 、 RNAプロテクションアツセィ等により検出'定量することができる。ノーザンハイブリダィゼーシヨンや RT - PCR等による検出は in situでも行い得る。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンプロット、免疫沈降、 RIA、 ELISA 、プルダウンアツセィ等により行うことができる。また、遺伝子導入の検出を容易にするため、発現させる蛋白質にタグを付加したり、レポーター遺伝子を発現するように組み込んでおくことも可能である。レポーター遺伝子は、 jSガラタトシダーゼ、 CAT、アルカリホスファターゼ、または GFPをコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに制限されない。

ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、導入遺伝子、投与組成物の形態、投与方法等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。好ましくは、投与するベクター量は約 10⁵ pfu/mlから約 10^u pfu/mlの範囲内であるとよい。より好ましくは、投与するベクターの量は約 10⁷ pfu/mlから約 10⁹ pfu/mlの範囲内であるとよい。最も好ましくは、約 1 X 10⁸ pfu/mlから約 5 X 10⁸ pfu/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。

本発明のウィルス含有組成物の投与対象としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ゥシ、ィヌなど全ての哺乳動物が含まれる。図面の簡単な説明

図 1は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 4日目のラット腎臓を回収し、前頭断にして蛍光実体顕微鏡下で観察した結果を示す写真である。皮質部から髄質部の広範囲にかけて強い蛍光が認められる。

図 2は、尿管から SeV/GFPを投与して 4日目のラット腎臓を回収し、前頭断にして蛍光実体顕微鏡下で観察した結果を示す写真である。皮質部から髄質部の広範囲にかけて強い蛍光が認められる。

図 3は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 4日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。陽性シグナルが瀰漫性に間質の線維芽細胞に観察される。下段に各糸且織を表記した。

図 4は、尿管から SeV/GFPを投与して 4日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。陽性シグナルが瀰漫性に間質の線維芽細胞に観察される。下段に各組織を表記した。

図 5は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 4日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。 GFP抗体陽性像が糸球体にも認められ、およそ 20%の糸球体に感染していた。下段に糸球体を表記した。浸潤細胞は斜線で示した図 6は、尿管から SeV/GFPを投与して 4日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。陽性シグナルが散在性に尿細管の上皮細胞で観察された。また、マクロファージの浸潤が認められた。下段に各組織'細胞を表記した。浸潤細胞は斜線で示した。

図 Ίは、腎動脈から SeV/GFPを投与して 7日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。糸球体の GFP抗体陽性像が観察される。

図 8は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 7日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。間質細胞およぴ糸球体の GFP抗体陽性像が観察される。

図 9は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 7日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。 GFP抗体陽性像が観察される。

図 1 0は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 14日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。

図 1 1は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 14日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。

図 1 2は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 14日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。

図 1 3は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 14日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。

図 1 4は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 28日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。

図 1 5は、腎動脈から SeV/GFPを投与して 28日目の腎組織切片を GFPに対する抗体で染色した結果を示す写真である。発明を実施するための最良の形態

実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書全体を通じて引用された文献（文献、特許、公開特許出願を含めて）の内容はすべて、本明細書に組み込まれる。

[実施例 1 ] 腎臓投与用の GFP遺伝子を有する組換えセンダイウィルスべクター (GFP/SeV) の構築と調製

GFP遺伝子を有する組換えセンダイウィルスベクタ^" (GFP/SeV)は、 Kato, A. et al. , 1997, EMBO J. 16 : 578-587及ぴ Yu, D. et al. , 1997, Genes Cells 2 : 457-466 の記載を基本に以下のように構築した。まず、 GFP遺伝子の cDNA塩基配列（構造遺伝子長 717bp) を含む DNA試料を用意した。 DNA試料は、 25ng/ U以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドとした。この試料から所望の遺伝子断片を増幅回収するために、 Notl制限酵素切断部位配列及ぴ後述する転写終結配列（E)、介在配列 ( I ) 及び転写開始配列 ( S ) 配列と GFP遺伝子の一部の配列を含むプライマー対として、フォワード側合成 DNA配列及ぴリバース側合成 DNA配列（アンチセンス鎖）を作成した。

フォヮ一ド側合成 DNA配列は 5'側から ACTTを選択し、その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、さらにその 3'側にスぺーサー配列を付カ卩した。さらにその 3' 側に所望の cDNAの開始コドン ATGからこれを含めて 0RFの 25塩基相当の配列を付カロした。

リパース側合成 DNA配列は 5'側から ATCCを選択し、その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、さらにその 3'側に長さを調節するための挿入断片のオリゴ DNA を付加した。このオリゴ DNAの長さは、 Notl認識部位 gcggccgcを含め、 cDNAの相補鎖塩基配列と後述するセンダイウィルスに由来するセンダイウィルスゲノムの E I S塩基配列の合計が 6の倍数になるように塩基数を設計した（いわゆる「6のル一ノレ（rule of six)」；Kolakofski， D. et al. , J. Virol. 72 : 891 - 899, 1998, Calain, P. and Roux, L.， J. Virol. 67 : 4822-4830, 1993)。さらに揷入断片の 3，側にセンダイウィルスの S配列の相捕鎖配列： 5' - CTTTCACCCT- 3，（配列番号： 1 )、 I配列： 5' - AAG- 3'、 E配列の相捕鎖配列： 5， - TTTTTCTTACTACGG- 3' (配列番号： 2 ) 、さらにその 3'側に目的の cDNA配列の終始コドンから逆に数えて 25塩基相当の相補鎖配列を付加し、リパース側合成ォリゴ DNAの 3'の末端とした。

PCRは、 Ventポリメラーゼ（NEB) を用いて行い、増幅した目的断片は Notlで消化した後、プラスミドベクタ一 pBluescriptの Notl部位に揷入した。得られた PCR 産物の塩基配列をシークェンサ一で確認し、正しい配列のプラスミドを選択した組換えセンダイウィルスゲノム cDNAは文献記載の方法に準じて構築した（Kato, A. et al. , EMBO J. 16 : 578—598， 1997, Hasan, M. K. et al. J. Gen. Virol. 78 : 2813-2820, 1997)。まず、 No«制限部位を有する 18bpのスぺーサー配列（5' - (G) - CGGCCGCAGATCTTCACG - 3' ) (配列番号： 3 ) を、クローニングされたセンダイウィルスゲノム cDNA (pSeV (+) ) のリーダー配列と N -タンパク質をコードする配列の 5'末端との間の隣接遺伝子座に挿入し、肝炎デルタウィルスのアンチゲノム鎖 ( ant i genomic strand) 由来の自己開裂リポザィム部位を含むプラスミド pSeV18⁺b (+)を得た（Hasan, M. . et al. , 1997, J. General Virology 78 : 2813-2820) ₀ GFPをコードする上記 DNAを Notlで切断し、センダイウィルスのゲノム cDNAプラスミド、 pSeV18+b (+)の Notl部位に挿入し、 GFP遺伝子が組込まれた組換えセンダイウイ/レス cDNAを得た。

このようにして作製した組換えセンダイウィルス cDNAを試験管内または細胞内で転写させ、ウィルスを再構成させることによって、組換えウィルスベクターを以下のようにして得た。

6穴のプラスチックプレート上で、 10%ゥシ胎児血清 (FCS)およぴ抗生物質（100 units/ml ペニシリンおおよび 100 i g/ml ストレプトマイシン）を含む最少必須培地（MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株 LLCMK2を 70〜80%コンフルェント（1 X 10⁶ 細胞）になるまで培養し、 T7ポリメラーゼを発現する UV照射により不活化した組換えワクシニアウィルス vTF7-3 (Fuerst, T. R. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA 83 : 8122-8126, 1986、 Kato, A. et al. , Genes Cells 1 : 569-579， 1996) を 2 PFU/細胞で感染させた。感染 1時間後、 3〜5 μ gの組換えセンダイウィルス cDNA を、全長センダイウィルスゲノムの生成に必須なトランスに作用するウィルスタンパク質を発現するプラスミド（l /i gの pGEM - Ν、 0. 5 gの pGEM- P、および l /i gの pGEM-L) (Kato, A. et al.， Genes Cells 1 : 569-579， 1996) と共に Superfect (QIAGEN社）を用いたリポフエクシヨン法によりトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨンを行った細胞は、 100 / g/mlのリファンピシン（Sigma) 及びシド（AraC) (Sigma)のみを含む血清不含の MEMで培養した。これら薬剤はワクシニアウィルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするよう最適濃度を設定した（Kato, A. et al. , 1996， Genes Cells 1 : 569-579)。トランスフエクシヨンから 48時間後、細胞を回収し、凍結融解を 3回繰り返して細胞を破枠した後、 10日齢の発育鶏卵の尿膜内へ接種した。 3日後、尿液を回収し、ウィルス力価は赤血球凝集活性 (HA)を測定することにより決定した。 HAは「endo - point 希釈法」 (Kato, A. et al. , 1996， Genes Cells 1 : 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y. , Hemaggul ut i nat i ng virus of Japan - liposome - mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine : Humana Press : pp. 295-306, 1999) により決定した。 10³〜10⁴ pfu/ml以下であると予想されるワクシニアウィルス vTF7- 3を除去するために、尿液試料を 10⁶倍に希釈し鶏卵で再増幅さた。本操作を 3回上繰り返し、得られた尿液を腎臓投与試料溶液として 4°Cに保存した。 HA値からウィルスタイターは 2 X 10⁹ pfu/mlであると見積もられた。

[実施例 2 ] F欠失型センダイウィルスベクターの構築と調製

<1> F欠失型センダイウィルスゲノム cDNAおよび F発現プラスミドの構築

センダイウィルス（SeV) 全長ゲノム cDNA、 pSeV18⁺ b (+) (Hasan, M. K. et al. , 1997, J. General Virology 78 : 2813—2820) (「pSeV18⁺ b (+)」は「pSeV18+」ともいう）の cDNAを Sphl/Kpnlで消化してフラグメント（14673bp)を回収し、 pUC18 にクローユングしてプラスミド pUC18/KSとした。 F欠損部位の構築はこの pUC18/KS 上で行った。 F遺伝子の欠損は、 PCR -ライゲーシヨン方法の組み合わせで行い、結果として F遺伝子の 0RF (ATG- TGA=1698bp) を除いて atgcatgccggcagatga (配列番号： 4 ) で連結し、 F欠失型 SeVゲノム cDNA (_PSeV18⁺/AF) を構築した。 PCRは、 Fの上流には、フォワードプライマー（5，-gttgagtactgcaagagc/配列番号： 5 )およぴリノ一スプラマー (5 -tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc Z配列番号： 6 ) を用い、 F遺伝子の下流にはフォワードプライマー (5' - atgcatgccggcagatga Z配列番号： 7 ) およびリバースプライマー（ 5， - tgggtgaatgagagaatcagc/配列番号： 8 ) を用いて増幅を行い、 PCR産物を EcoT22I で連結した。このように得られたプラスミドを Saclと Sailで消化して、 F欠損部位を含む領域の断片（4931bp) を回収して pUC18にクローユングし、 pUC18/dFSSとした。この pUC18/dFSSを Dralllで消化して、断片を回収して pSeV18+の F遺伝子を含む領域の Dralll断片と置き換え、ライゲーシヨンしてプラスミド pSeV18⁺/AF を得た。

さらに、 F欠失部位に EGFP遺伝子を搭載した cDNA (_PSeV18⁺/AF-GFP) を構築するため、 PCRにより、EGFP遺伝子の増幅を行った。 EGFP遺伝子を 6の倍数 (Hausmann, S. et al. , RNA 2, 1033-1045 (1996) ) に合わせるため 5，は Nsil - taildプライマ一（5， -atgcatatggtgatgcggttttggcagtac：配歹幡号： 9 )、 3，は NgoMIV - tailed プライマー（5， - Tgccggctattattacttgtacagctcgtc：配列番号： 1 0 )を用いて PCR を行った。 PCR産物を制限酵素 Nsil と NgoMIVで消化してゲルから断片を回収し、 pUC18/dFSSの F欠失部位にある Nsilと NgoMIVという制限酵素部位に連結し、シークエンスを確認した。ここ力ら、 EGFP遺伝子を含む Dralll断片を回収し、 pSeV18+ の F遺伝子を含む領域の Dralll断片と置き換え、ライゲーシヨンしてプラスミド pSeV18⁺/AF-GFP を得た。

<2> SeV_F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製

センダイウィルスの F遺伝子（SeV- F) を発現する Cre/loxP誘導型発現プラスミドの構築は SeV- F遺伝子を PCRで増幅し、シーケンスを確認した後、 Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物を誘導発現されるように設計されたプラスミド pCALNdl (Arai, T. et al.， J. Virol. 72, 1115-1121 (1998) ) のユニークサイト Swal部位に揷入し、プラスミド pCALNdLw/Fとした。

F欠損ゲノムから感染ゥィルス粒子を回収するため、 SeV- F蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立した。細胞は SeVの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株 LLC- MK2細胞を用いた。 LLC- MK2細胞は、 10%の熱処理した不動化ゥシ胎児血清 (FBS)、ぺニシリン Gナトリウム 50単位 /ml、およぴストレプトマイシン 50 j g/ml を添加した MEMで 37°C、 5% C0₂で培養した。 SeV- F遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、 Cre DNAリコンビナーゼにより F遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミド pCALNdLw/Fを、リン酸カルシウム法（ mammalian transfection kit (Stratagene) ) により、そのプロトコールに従って LLC- MK2細胞に遺伝子導入を行った。

10cmプレートを用レ、、 40%コンフルェントまで生育した LLC- MK2細胞に 10 /z gのプラスミド pCALNdLw/Fを導入後、 10mlの 10% FBSを含む MEM培地にて、 37°Cの 5 % C0₂インキュベータ一中で 24時間培養した。 24時間後に細胞をはがし、 10ml培地に懸濁後、 10cmシャーレ 5枚を用い、 5ml 1枚、 2ml 2枚、 0. 2ml 2枚に蒔き、 G418 (GIBC0-BRL)を 1200 μ g/mlを含む 10mlの 10%FBSを含む MEM培地にて培養を行い、 2 日毎に培地交換しながら、 14日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行った。該培地により生育してきた G418に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて 30株を回収した。各クローンは 10cmプレートでコンフルェントになるまで拡大培養を続けた。

F蛋白質の発現誘導は、細胞を 6cmシャーレにてコンフルェントまで生育させた後、アデノウィルス AxCANCreを斉藤らの方法（Saito et al.， Nucl. Acids Res. 23 : 3816-3821 (1995) ; Arai, T. et al.， J. Virol. 72, 1115-1121 (1998) ) により moi=3 で感染させて行った。

<3> F欠失 SeVウィルスの再構築及び増幅

F欠損咅位に enhanced green fluorescent protein (EGFP) 這子をレポーターとして 6 nルールに従って導入した上記 pSeV18⁺/ AF- GFP を下記のようにして LLC- MK2細胞にトランスフエクシヨンした。

LLC-MK2細胞を 5 X 10⁶ cells/dish で 100mmペトリ皿に蒔き、 24時間培養後、ソラレンと長波長紫外線 (365nm) で 20分間処理した T7 RNAポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイノレス（Fuerst, T. R. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986) )に室温で 1時間感染させた (moi-2) (moi=2 〜3か好ましく、より好適には moi=2が用いられる）。ワクシニアウィルスへの紫外線照射には、 15ヮットバルブを 5本が装備された UV Stratakinker 2400 (カタ口グ番号 400676 (100V) , ストラタジーン社, La Jol la, CA， USA) を用いた。細胞を 3回洗浄してからプラスミド pSeV18V Δ F- GFP, pGEM/NP, pGEM/P, 及ぴ pGEM/L (Kato, A. et al. , Genes cells 1， 569—579 (1996) ) をそれぞれ 12 z g， 4 μ g, 2 μ g, 及ぴ 4 i g /dish の量比で OptiMEM (GIBCO)に懸濁し、 SuperFect transfection reagent (1 i g DNA/5 μ 1 の SuperFect, QIAGEN)を入れて混合し、室温で 10分間放置後、最終的に 3%FBSを含む 0ptiMEM 3mlに入れ、細胞に添加して培養した。 3時間培養後、細胞を、血清を含まなレ、MEMで 2回洗浄し、シトシン ;3 -D-ァラビノフラノシド 40 μ g/ral (AraC, Si gma)，トリプシン 7. 5 g/ml (GIBC0) を含む MEMで 70時間培養した。これらの細胞を回収し、ペレットを OptiMEM に懸濁した（10⁷ cells/ ml )。凍結融解を 3回繰り返して lipofection reagent D0SPER (Boehringer mannheim)と混合し (10⁶ cells/25 // 1 D0SPER) 室温で 15分放置した後、上記でクローニングした F発現ヘルパー細胞の一つ LLC-MK2/F7細胞にトランスフエクシヨン（10⁶ cells /well 12- well- plate) し、血清を含まない MEM (40 μ g/ml AraC, 7. 5 g/ml トリプシンを含む）で培養し、上清を回収した。

[実施例 3 ] センダイウィルスベクターの腎臓へのインビボ投与

( 1 ) 腎動脈からのウィルス投与

6週齢 Sprague Dawley (SD) ラットの体重 160〜180gのものを用いた。動物は、ネンプタールを生食で 10倍希釈し、体重の l/100ml容量を腹腔内に投与し麻酔した。正中切開により開腹し、左腎臓おょぴ腎動脈を、付着する脂肪組織等を除去後露出した。生理食塩水による灌流およびウィルス投与のために、 24Gカテーテルを左腎動脈に挿入した。さらに腹大動脈への逆流を防止するために、腹大動脈近傍をクランプで留めた。腎臓灌流を生理食塩水数百/ を用いて行った。生食による灌流後、各々 300， 500， 700 ^ 1 (titer 2 X 10⁹ pfu/ml) の実施例 1で調製したウィルス試料溶液を、 1mlシリンジを用いて投与した。カテーテルを取り外し、針痕はァロンアルファ一（東亜合成化学）により閉傷した。 5分間放置後、クランプを除去し、ミツヘル縫合びようにより閉腹した。

( 2 ) 尿管からのウィルス投与

6週齢 Sprague Dawley (SD) ラットの体重 160〜180gの動物を用いた。動物は、ネンブタールを生食で 10倍希釈し、体重の l/10(kl容量を腹腔内に投与し麻酔した。正中切開後左部腎臓および尿管を露出した。 26G針を尿管に揷入し、それぞれ 300, 500， 700 l (titer 2 X l0⁹ pfu/ml)の実施例 1で調製したウィルス（GFP/SeV ) 試料溶液を腎臓に投与した。この際左腎静脈はクランプで閉塞した。 5分間放置後、クランプは除去し、ミッヘル縫合びようにより閉腹した。

( 3 ) 腎臓試料の回収と切片作製

ウィルス投与 4, 7, 14, 21， 28日後に腎臓試料の回収を行った。ラットをメンブタールにて麻酔、開腹した。腎臓灌流を行うために、腎動脈に分枝する腹大動脈の上部を止血鉗子で留め、腎動脈に分枝する腹大動脈の下部に翼状針を刺し、生理食塩水 20ml導入し、除血後、腎臓を摘出した。摘出腎臓を前頭断に分割し、直前に調製したメタカルン溶液（メタノール：クロロフオルム：酢酸 =9 : 6 : 1) にて固定した。固定試料を常法によりパラフィン包埋後、厚のパラフィン切片を作製した。脱パラフィンはキシレンおょぴ順次希釈エタノールにより行った。

( 4 ) 免疫組織染色

ウィルス感染組織の同定おょぴ細胞浸潤判定を行うために、抗 GFP抗体（ラビットポリクローナノレ抗体、 Molecular Probes, Oregon, USA) およぴマクロファージに対する抗 ED - 1抗体（マウスモノクローナル抗体、 Serotec, Oxford, England) による反応性を調べた。上述法により作製した切片を、内在性の peroxidaseの不活性化のためにメタノール：過酸ィヒ水素 = 9 : 1溶液で室温 5分間処理した。 PBS溶液 (10分間）で 3回洗浄後、試料切片を 20分間室温でブロッキング処理した（プロッキング剤として以下の組み合わせを選択した：ラビット抗体には 5°/。ャギ血清、マウスモノクローナル抗体には 5%ゥマ血清、各々 200 μ 1)。それぞれ 50倍希釈した 1 次抗体処理を 4°C、 16時間行った。冷 PBSで 3回洗浄後、切片試料を 2抗体反応に供した。 2次抗体は GFP確認用としてピオチン化ャギ抗ゥサギ IgG (H+L)抗体（Vector Laboratories Inc. , Burlingame, CA) を 150倍希釈し、マクロファージ確認用としてビォチンィヒゥマ抗マウス IgG(H+L)抗体（Vector Laboratories Inc.， Burlingame, CA)を 150倍希釈して用いた。抗体反応は室温で 30分間行い、冷 PBS 溶液（10分間）で 3回洗浄した。試料をアビジン-ビォチン化（Vector社アビジン -ビォチン化キットを用いて添付説明書に従って行った）した horseradish peroxidase複合体と室温 30分間放置した後、 DAB溶液存在下で発色反応を行った。反応停止後、試料切片はメチルダリ一ンで共染色を行った。

( 5 ) 投与 4日後の腎臓生切片での蛍光顕微鏡による GFP発現結果

投与 GFP/SeVから発現した GFPを蛍光で確認するために、回収した生腎臓を前頭断にし、蛍光実体顕微鏡下で蛍光光源（励起波長 425nm、吸収波長 480nm) 観察を行った。蛍光観察試料はすべて、腎動脈および尿管から 500 μ 1のウィルス投与 4 日後のものとした。図 1 (腎動脈から投与したもの）および図 2 (尿管から投与したもの）にその結果を示す。皮質部から髄質部の広範囲にかけて強い蛍光が認められることが確認出来る。

( 6 ) 投与 4日後の免疫組織染色結果

GFPに対する抗体反応の結果、腎動脈あるいは尿管からのどちらのウィルス投与においても、ウィルスは瀰漫性に間質の線維芽細胞に感染していた（図 3および 4 )。腎動脈から投与の場合、 GFP抗体陽性像が糸球体にも認められ、およそ 20% の糸球体に感染していた（図 5 )。糸球体での抗体陽性細胞はメサンギゥム細胞と考察された。ここで注目すべき点は、腎動脈からの投与で観察された GFP陽性糸球体および間質細胞付近において炎症性マクロファージの浸潤が認められないことである。尿管導入の場合には腎盂上皮細胞に強い GFPの発現が観察され、散在性に間質細胞、および尿細管の上皮細胞に感染が認められた（図 6 )。尿管からの投与においては、尿細管細胞での発現は遠位尿細管のみならず、近位尿細管でも認められた。また、尿管からの投与においては尿細管周囲の組織中にかなりのマクロファージの浸潤が認められた。浸潤の誘導における投与経路によるこのような違いは、部分的には細尿管上皮細胞が抗原提示細胞としての能力を有することに起因する可能性がある。

( 7 ) 投与 7， 14, 21, 28日後の免疫組織染色結果

動物は、 6週齢 SDラットの^を用い、本実験はすべて腎動脈からの投与とした。投与ウィルス量はタイターが 2 X l0⁹ pfu/mlの GFP/SeVを 700 1/匹とした。免疫糸且織染色の結果、 GFP抗体陽性像が投与全期間で観察された（7日，図 7〜9； 14 日，図 1 0〜1 3 )。感染が確認された間質細胞および糸球体細胞付近には、ほとんどマクロファージの浸潤が認められなかった。この投与実験において、腎動脈投与 4日後には認められなかつた尿細管の上皮細胞で、全期間にわたり GFP抗体陽十生像が認められた（28日，図 1 4および 1 5 )。投与 28日後においては、 GFP抗体陽性尿細管細胞近傍に浸潤細胞が観察される場合が認められ、尿細管間質障害の徴候が示唆された。産業上の利用の可能性

腎細胞への遺伝子導入においては従来のベクターでは十分な遺伝子導入効率が得られなかったが、本発明により、パラミクソウイルベクターを利用して短時間のベクターの露出で極めて高い効率で腎細胞へ遺伝子を導入することが可能となつた。これにより、腎細胞を標的とした遺伝子治療のための基盤技術が提供された。

Claims

請求の範囲

1. パラミクソウィルスベクターを腎細胞に接触させる工程を含む、腎細胞へ遺伝子を導入する方法。

2. パラミクソウィルスベクターを血管内に投与する工程を含む、請求項 1に記載の方法。

3. 血管が腎動脈である、請求項 2に記載の方法。

4. パラミクソウィルスベクターを尿管内に投与する工程を含む、請求項 1に記載の方法。

5. 腎細胞が間質細胞、糸球体細胞、およぴ尿細管細胞からなる群より選択される細胞である、請求項 1から 4のいずれかに記載の方法。

6. パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、請求項 1から 5のいずれかに記載の方法。

7. 腎細胞へ遺伝子を導入するために用いる、パラミクソウィルスベクター。

8. パラミクソウィルスベクターまたは該ベクターを含む細胞を含む、腎細胞への遺伝子導入用,組成物。

9. 血管内に投与するために用いられる、請求項 8に記載の糸且成物。

10. 血管が腎動脈である、請求項 9に記載の組成物。

1 1. 尿管内に投与するために用いられる、請求項 8に記載の組成物。

12. 腎細胞が間質細胞、糸球体細胞、および尿細管細胞からなる群より選択される細胞である、請求項 8から 11のいずれかに記載の組成物。

13. パラミクソウィルスがセンダイウィルスである、請求項 8から 12のいずれかに記載の組成物。