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WO2002090538A1 - Method of synthesizing nucleic acid - Google Patents

Method of synthesizing nucleic acid Download PDF

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WO2002090538A1
WO2002090538A1 PCT/JP2002/004479 JP0204479W WO02090538A1 WO 2002090538 A1 WO2002090538 A1 WO 2002090538A1 JP 0204479 W JP0204479 W JP 0204479W WO 02090538 A1 WO02090538 A1 WO 02090538A1
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WO
WIPO (PCT)
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primer
nucleic acid
base sequence
region
complementary
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2002/004479
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kentaro Nagamine
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eiken Chemical Co Ltd
Original Assignee
Eiken Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eiken Chemical Co Ltd filed Critical Eiken Chemical Co Ltd
Priority to JP2002587599A priority Critical patent/JPWO2002090538A1/ja
Publication of WO2002090538A1 publication Critical patent/WO2002090538A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • An analysis method based on the complementation of nucleobase sequences can directly analyze genetic characteristics. Therefore, it is a very effective means for identifying genetic diseases, canceration, microorganisms, and the like. In addition, in order to detect the gene itself, there is also a method that can eliminate time-consuming and labor-intensive operations such as culture.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the PCR method requires a special temperature controller to perform the procedure; the amplification reaction progresses exponentially, so there is a problem in the quantification; the sample and the reaction solution are contaminated from outside, Problems have been pointed out, such as the susceptibility to contamination, in which erroneously contaminated nucleic acids function as, and the like. ,
  • S Ps single nucleotide polymorphism
  • the LCR method (Ligase Chain Reaction, Laffler TG; Carrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (Paris), 1993, 51: 9, 821-6) is performed on the sequence to be detected.
  • the basic principle is that one probe is hybridized and the two are linked by ligase. Since the two probes cannot be ligated to ⁇ where the target nucleotide sequence does not exist, the presence of the ligation product is an indicator of the target nucleotide sequence.
  • the LCR method also has the same problems as the PCR method because temperature control is required to separate the synthesized complementary strand.
  • the SM method When it is simply expressed as 5 'side or 3' side, it means the direction in the chain with the «symbol.
  • This is called the SM method because the 5 ′ double-stranded portion is replaced by a newly synthesized complementary strand.
  • the SDA method by introducing a restriction enzyme recognition sequence in advance into a sequence annealed as a primer, the temperature change step, which is indispensable in the PCR method, can be omitted.
  • the nick generated by the restriction enzyme gives the 3'-0H group that serves as the starting point for complementary strand synthesis, and the strand synthesized by strand displacement synthesis releases the previously synthesized complementary strand as a single strand. It will be reused as the type II in the next complementary strand synthesis.
  • the SM method eliminates the need for complicated temperature control, which was essential in the PCR method.
  • the method of supplying 3′-0H3 ⁇ 4 by enzymatically removing the RNA portion using a DNA-RNA chimeric oligonucleotide is also ⁇ P.
  • a chimeric oligonucleotide having a 3'-side thigh is used as a primer.
  • the RNA portion of this oligonucleotide is digested by the action of RNAseH, and new 3, -0H groups are continuously added.
  • the oligonucleotide used for the primer must be a DNA-RNA chimeric oligonucleotide.
  • an enzyme for removing RNA is also required, it can be said that it has the same problem as the above-mentioned SDA method.
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-based Amplification
  • TMA Transcription Mediated Amplification method
  • NASBA uses a target thigh as a face to perform DNA synthesis using a DNA polymerase with a probe to which a T7 promoter has been added, and further forms a double-stranded DNA with a second probe. This is a reaction system that amplifies a large amount of thighs by performing transcription by the DNA (Nature, 350, 91-92, 1991).
  • NASBA requires several heat denaturation steps to complete double-stranded DNA, but the subsequent transcription reaction with T7 RNA polymerase proceeds isothermally.
  • RCA rolling-circle amplification
  • Combination with polymerase that catalyzes the complementary strand synthesis reaction at the strand position ⁇ S enables ligation and cyclization in the presence of the target base sequence.
  • a continuous complementary strand synthesis reaction with the padlock probe ⁇ M triggered is triggered.
  • a single-stranded nucleic acid having a structure in which a region consisting of the same base sequence is repeated continuously is generated.
  • the single-stranded nucleic acid is further annealed with a primer to synthesize its complementary strand, thereby realizing high-level amplification.
  • the need for multiple enzymes remains an issue.
  • the trigger of complementary strand synthesis depends on the ligation reaction between two adjacent regions, and its specificity is at the same level as LCR in principle.
  • 3′-0H supply a method is known in which the 3 ′ has a sequence complementary to the base sequence on the same strand to form a hairpin loop at the end (Gene 71, 29-). 40, 1988). From such a hairpin loop, complementary strand synthesis is performed with itself as a ⁇ -type, and a single-stranded nucleic acid composed of a complementary base sequence is generated.
  • a structure is realized in which the terminal portion where a complementary base sequence is linked anneals on the same strand.
  • This step is said to proceed depending on a delicate equilibrium state between complementary nucleotide sequences involving base pairing.
  • utilizing the state maintained between base pairing with the complementary strand and base pairing on the same strand only the base sequence on the same strand that anneals with the base sequence becomes the starting point for complementary strand synthesis. . Therefore, it is considered that strict setting of reaction conditions is required to achieve high reaction efficiency.
  • the primer itself forms a loop structure. Therefore, once a primer dimer is generated, the amplification reaction is automatically started regardless of the presence or absence of the target base sequence, and a nonspecific synthetic product is formed. This is a serious problem. Furthermore, the generation of primer dimers and the accompanying consumption of primers by non-specific synthesis reactions lead to a decrease in amplification efficiency of the desired reaction.
  • an oligonucleotide having a hairpin-like structure at the end is often used to supply a double-stranded promoter region (see Japanese Patent Application Laid-Open No. H05-205686). 211873). However, they do not allow a continuous supply of 3'-0H for complementary strand synthesis.
  • a hairpin loop structure in which the 3 ′ end is annealed on the same strand is used for the purpose of obtaining DNA transcribed by RNA polymerase. In this method, amplification is performed by using transcription to RA and reverse transcription from RA to DNA.
  • a reaction system cannot be constructed unless a plurality of enzymes are combined.
  • the present applicant has developed and applied for a patent for a novel method for synthesizing nucleic acids that can be carried out under isothermal conditions and that can maintain a high level of reaction specificity as compared with PCR ( W000 / 28082).
  • This method was named Loop-mediated isothermal amp lification (hereinafter abbreviated as LAMP method) ( ⁇ ⁇ Notomi et al., Nucleic Acid Res., 2000, Vol. 28, No. 12, e63).
  • LAMP method Loop-mediated isothermal amp lification
  • the present applicant has also reported a method for detecting SPs using the LAMP method (The 3rd International Workshop on Advanced Genomics 2000.
  • the LAMP method is characterized in that the nucleic acid amplification reaction is remarkably inhibited when the nucleotide sequence is different from the designed one. Due to this feature, the mutation detection method based on the LAMP method achieved high specificity without sacrificing detection sensitivity. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a new method for synthesizing a nucleic acid using the reaction principle of the LAMP method.
  • the LAMP method is a method for synthesizing nucleic acids that can achieve high reaction specificity at an isothermal temperature.
  • the present inventor has conducted studies to apply this method and establish a new principle of nucleic acid synthesis. As a result, they found that by applying the LAMP method with a nucleic acid having a specific structure, it was possible to synthesize a nucleic acid on a new principle. Further, based on this reaction principle, they found that various effects, which were not known by the LAMP method, could be achieved, and completed the present invention. That is, the present invention relates to the following nucleic acid synthesizing methods, kits therefor, and uses thereof.
  • a method for synthesizing a nucleic acid containing a target base sequence comprising the following steps.
  • a step of generating at least two types of single-stranded nucleic acids wherein the two types of single-stranded nucleic acids are It has a complementary base sequence at its 3 'end, and has a target:! ⁇ ⁇ Contains a base sequence selected from the sequence.
  • region (b) region (a) a region that forms a loop when hybridized to any region on the same chain, (c) a region containing a nucleotide sequence complementary to the region (a), and
  • step (1) a step of annealing at least two kinds of single-stranded nucleic acids of step (1) at their 3′-ends and synthesizing a complementary strand by a polymerase that catalyzes a complementary strand synthesis reaction involving strand displacement;
  • step (3) Anneal the 3 'of the nucleic acid synthesized in step (2) to a region consisting of a complementary nucleotide sequence on the same strand, synthesize a complementary strand starting from the 3', and synthesize the complementary strand from the target nucleotide sequence.
  • a step of synthesizing a single-stranded nucleic acid
  • At least one kind of single-stranded nucleic acid of the step (1) is a nucleic acid having a structure that forms a 3 ′ without complementary strand by hybridizing the region ( a ) and the region (c) [ 1].
  • At least one kind of the single-stranded nucleic acid in the step (1) is a nucleic acid having a structure forming a 3 ′ end with a complementary strand by hybridization of the region (a) and the region (c).
  • the constituent base sequences are complementary base sequences
  • insert primer is at least one set of insert primers having mutually complementary nucleotide sequences at the 5 'end.
  • the insert primer has a base sequence complementary to each other at the 5 ′ end thereof composed of RNA, and the 3 ′ end composed of an RNase-resistant polynucleotide.
  • the insert primer is a first insert primer serving as a starting point of complementary strand synthesis in an arbitrary region in the target base sequence, and a target base sequence contained in an extension product starting from the insert primer.
  • the method according to [4], wherein the method comprises a combination with a second insert primer which is a starting point of complementary strand synthesis in an arbitrary region therein.
  • the base sequence constituting the single-stranded nucleic acid contains a base sequence selected from the target base sequence
  • the primer having the sequence is annealed, the complementary strand is synthesized by the DNA polymerase which catalyzes the complementary strand synthesis reaction involving strand displacement starting from the 3 ′ end, and the single-stranded nucleic acid of 'A process of substituting the terminus to enable base pairing,
  • step (b) a step of annealing the insert of the product of step (a) with an insert primer and synthesizing a complementary strand starting from its 3 ′ end; wherein the insert primer is attached to an arbitrary region of the product of step (a).
  • a base sequence complementary to the base sequence is provided at the 3 'end, and the base sequence at the 5' end is complementary to the base sequence constituting the 3 'end of any of the two single-stranded nucleic acids in [1]. Consisting of a base sequence, and
  • the complementary strand synthesized in the step (b) is made into a single strand, the 3 'of which is annealed to itself, and the complementary strand is synthesized starting from the 3'5 ⁇ , Step of generating single-stranded nucleic acid
  • step (a) The method according to [9], wherein the nucleic acid containing the target base sequence in step (a) is the product of step (2) in [1].
  • a method for amplifying a nucleic acid containing a target base sequence comprising the following steps.
  • a step of generating at least two types of single-stranded nucleic acids wherein the two types of single-stranded nucleic acids are It has a complementary base sequence at its 3 'end and contains a base sequence selected from a target base sequence.
  • region (b) region (a) a region that forms a loop when hybridized to any region on the same chain,
  • step (2) a step of annealing at least two kinds of single-stranded nucleic acids in step (1) at their 3'-ends and synthesizing a complementary strand by a polymerase that catalyzes a complementary strand synthesis reaction involving strand displacement;
  • step (3) Annealing the 3 'of the nucleic acid synthesized in step (2) into a region consisting of a complementary nucleotide sequence on the same strand, synthesizing a complementary strand starting from the 3', and A step of synthesizing a single-stranded nucleic acid,
  • step (3) Using the product of step (3) as type I, complementary strand with strand displacement starting from the 3 'end of the inner primer and Z or insert primer Complementary strand by DNA polymerase that catalyzes the synthesis reaction.
  • step (3) complementary strand with strand displacement starting from the 3 'end of the inner primer and Z or insert primer Complementary strand by DNA polymerase that catalyzes the synthesis reaction.
  • a method for amplifying a nucleic acid containing a target base sequence comprising:
  • a method for synthesizing a nucleic acid containing a target base sequence comprising a step of incubating the following elements:
  • Inner primer F wherein inner primer F anneals to a region defining the 3 ′ side of one of the strands constituting the target base sequence at the 3 ′ end, and inner primer F 5 ′ * 3 ⁇ 4 has a base sequence complementary to any region of the complementary strand synthesis reaction product starting from this primer,
  • Inner primer R wherein the inner primer R anneals to a region defining the 3 ′ side of one of the strands constituting the target base sequence at the 3 ′ end, and the inner primer R 5'-dan of one R has a base sequence complementary to an arbitrary region of a complementary strand synthesis reaction product starting from this primer,
  • insert primer F has a base sequence complementary to an arbitrary region of one of the strands constituting the target base sequence at its 3 ′ end.
  • insert primer R has a base sequence complementary to an arbitrary region of the other strand constituting the target base sequence at its 3 ′ end, and
  • the synthetic product originating from each primer of insert primer F and insert primer R has a nucleotide sequence complementary to each other in the region containing 5% of both primers.
  • outer primer F is a starting point of a complementary strand synthesis reaction starting from the 3 ′ side of the region to be identified by the inner primer F in the present invention
  • outer primer R is a starting point of a complementary strand synthesis reaction starting from the 3 ′ side of the region of the key where the inner primer R should be annealed
  • Loop primer F The region containing the 3 'end of the loop primer F is the region containing the 5' end of the inner primer F, and the region containing the 5 'end of the inner primer F is any of the complementary strand synthesis reaction products starting from the inner primer F. Anneal to any region in the loop formed by hybridizing to that region, and
  • Loop primer R the region containing 3% of the loop primer R is the region containing the 5 'end of the inner primer R is any region of the complementary strand synthesis reaction product starting from the inner primer R. Anneal any region in the loop formed by hybridizing to the region
  • the target base sequence in the type I nucleic acid is double-stranded, and each primer should be annealed by incubating under conditions that allow complementary strand synthesis starting from each of the primers.
  • the method according to [17] including a step of bringing the region into a state capable of base pairing.
  • a method for detecting a mutation in a type I nucleic acid based on the method for detecting a nucleic acid according to [24], wherein the method for synthesizing a nucleic acid according to [1] or [17] comprises: A method for detecting a mutation, characterized in that a complementary strand synthesis reaction starting from the 3 'end of a main-strand nucleic acid is prevented when the base sequence of a type III nucleic acid is not a predicted base sequence.
  • a kit comprising the following elements for synthesizing a nucleic acid containing a target base sequence:
  • Inner primer F wherein inner primer F is located at the 3 'end with respect to a region defining the 3' side of one strand constituting the target base sequence.
  • the primer has a nucleotide sequence complementary to an arbitrary region of the complementary strand synthesis reaction product starting from this primer on the 5 ′ side of the inner primer F.
  • Inner primer R wherein the inner primer R is used at its 3 ′ end to a region defining the 3 ′ side of one of the strands constituting the target base sequence, and the inner primer R 5 'side of, to have a nucleotide sequence complementary to an arbitrary region of a complementary strand synthesis reaction product that this primer first and origin,
  • insert primer F has a base sequence complementary to an arbitrary region of one of the strands constituting the target base sequence at its 3 ′ end.
  • an insert primer R wherein the insert primer R has a base sequence complementary to an arbitrary region of the other strand constituting the target base sequence at its 3 ′ end, A synthetic product starting from each of the primer F and the insert primer R has a nucleotide sequence complementary to a region containing both of them.
  • outer primer F is a starting point for a complementary strand synthesis reaction starting from the 3 ′ side of the region to be identified by the inner primer F in
  • Loop primer R the region containing the 3 'portion of the loop primer R is a region containing the 5' end of the inner primer: R is located in any region of the complementary strand synthesis reaction product starting from the inner primer R.
  • the insert primer had a nucleotide sequence different from the expected nucleotide sequence, the complement was synthesized with the 3 'end of the insert primer and the 5' end of Z or the insert primer as ⁇ .
  • the 3 ′ of the inner primer F and the insert primer F serve as a starting point for synthesizing a base sequence derived from the first type I nucleic acid, and the inner primer R and the insert primer R It is a starting point for synthesizing a nucleotide sequence derived from a nucleic acid, and consists of nucleotide sequences complementary to each other in the region including the 5 'end of the force primer F and the insert primer R.
  • the kit according to [37] which comprises a region.
  • nucleic acid in the present invention, can be DNA or RNA, or a chimeric molecule thereof. Nucleic acids can be natural or artificially synthesized. Further, even a nucleotide derivative partially or wholly composed entirely of an artificial structure is included in the nucleic acid of the present invention as long as it can form a base pair bond. Examples of such a molecule include a polynucleotide derivative whose backbone is formed by a phosphotie bond.
  • the number of constituent bases of the nucleic acid in the present invention is not limited. Nucleic acid is synonymous with the term polynucleotide.
  • the term “oligonucleotide” in the present invention is used as a term indicating a polynucleotide having a particularly small number of constituent bases among polynucleotides. Oligonucleotides generally refer to oligonucleotides having a base number of 2 to 100, more generally about 2 to 50, and are referred to as oligonucleotides, but are not limited to these numerical values.
  • the nucleic acids of the invention are generally included in a biological sample.
  • Biological samples can refer to animal, plant, or microbial tissues, cells, cultures, excreta, or extracts thereof.
  • the biological sample of the invention includes genomic DNA or RNA from intracellular parasites such as viruses and mycoplasmas.
  • the nucleic acid of the present invention may be derived from the nucleic acid contained in the biological sample. For example, cDNA synthesized based on mRNA and nucleic acid amplified based on nucleic acid derived from a biological sample are typical examples of the nucleic acid in the present invention.
  • a target nucleotide sequence is a nucleotide sequence of a nucleic acid to be synthesized.
  • the base sequence constituting the nucleic acid to be synthesized in the present invention is the target base sequence.
  • the base sequence constituting the nucleic acid to be amplified is the target base sequence.
  • the base sequence of a nucleic acid describes the base sequence of the sense strand from the 5 'side to the 3' side.
  • the target base sequence in the present invention includes, in addition to the base sequence of the sense strand, its complementary strand, that is, the base sequence of the antisense strand. That is, the term “target base sequence” is used as a term meaning at least one of a base sequence to be synthesized and its complementary strand.
  • the target base sequence is not limited to the base sequence of the nucleic acid used as type III. Therefore, the target nucleotide sequence may be composed of the same nucleotide sequence as that of the recording form, or may be a different nucleotide sequence. It is also possible to introduce a mutation into the base sequence or synthesize a target base sequence consisting of a base sequence obtained by joining a part of the base sequences.
  • terminal or 5 refers to a region located not only at one terminal of either terminal but also at one terminal and containing one base. More specifically, 500 bases, desirably 100 bases, or at least 20 bases from either end are included at the 3, terminal or 5 'end. On the other hand, in order to indicate a base at a specific position that covers one or more bases at the end, the position is specified by specifying a numerical value.
  • the 3 ′ is the starting point of the complementary strand synthesis, it means that the ⁇ 0H group at the 3 ′ end is the starting point of the complementary strand synthesis.
  • the term «And complementary strand: The term « used in the present invention means a nucleic acid on the side that is the type of complementary strand synthesis.
  • a complementary strand having a base sequence complementary to « has a meaning as a strand corresponding to, but the relationship between the two is only a relative one. That is, a chain synthesized as a complementary chain can again function as a chain. That is, the complementary strand can be ⁇ .
  • the synthesis of a nucleic acid having a base sequence different from that of a nucleic acid may be aimed at by synthesizing a base sequence contained in a nucleic acid as a target base sequence as it is.
  • a nucleic acid having a nucleotide sequence different from that of a nucleic acid includes, for example, introducing a mutation into the nucleotide sequence contained in the nucleic acid, or synthesizing a region that is separated on ⁇ S nucleic acid as a continuous nucleotide sequence.
  • the target base sequence in the present invention can be a base sequence obtained by linking base sequences derived from different nucleic acids.
  • Synthesis and amplification of nucleic acid means elongation of nucleic acid from an oligonucleotide which is a starting point of synthesis. In addition to synthesis, when the generation of another nucleic acid and the elongation reaction of the generated nucleic acid occur continuously, a series of reactions is collectively referred to as amplification.
  • Anil “Anil” and “hybridize” mean that nucleic acids form a double helix structure by base pairing based on the Petson-Crick model. Therefore, even if the nucleic acid strand constituting the base pair bond is a single strand, if the complementary base sequence in the molecule forms a base pair bond, it is anneal or hybridized. In this effort, anonymous and hybridized are synonymous in that they form a double helix structure by nucleic acid; ⁇ base pairing.
  • the «paired 3 '» is the starting point for complementary strand synthesis, it is sometimes referred to as an ayur. However, this does not deny that hybridis is the starting point for complementary strand synthesis.
  • nucleotide sequences that make up the primers used in the present invention include nucleotide sequences that are completely identical or not completely complementary. It is. That is, the same as a certain sequence can include a sequence complementary to a base sequence capable of annealing to a certain sequence.
  • complementary refers to sequences that can be annealed under stringent conditions and provide a starting point for complementary strand synthesis.
  • the term “identical” means that the homology of the nucleotide sequence is, for example, 90% or more, It means 5% or more, more preferably 98% or more.
  • the term “complementary” means the same nucleotide sequence as the complementary sequence. That is, it can be said to be complementary when the homology of the base sequence to the complementary sequence is, for example, 90% or more, usually 95% or more, and more preferably 98% or more. In addition, it is preferable that at least one base at the 3 ′ end of the complementary base sequence completely coincides with the complementary sequence when it functions as a starting point of complementary strand synthesis.
  • the homology of the nucleotide sequences can be determined by a known search algorithm such as BLAST.
  • Complementary strand synthesis reaction involving strand displacement In the synthesis of the nucleic acid of the present invention, a polymerase chain catalyzing a complementary strand synthesis reaction involving strand displacement is used.
  • the complementary chain synthesis reaction involving strand displacement refers to the following reaction.
  • the complementary strand synthesis is performed while separating the polynucleotide from The reaction that proceeds is called a complementary strand synthesis reaction involving strand displacement.
  • the separated polynucleotide usually maintains its phosphodiester bond. Therefore, a polynucleotide having a length corresponding to the length of the complementary strand synthesis force S and capable of base pairing is produced.
  • the same one as the DNA polymerase used in SM and the like is used. That is, when a complementary strand is synthesized using a primer complementary to the third and third sides of a certain base sequence as a synthesis starting point, if there is a double-stranded region on the 5 ′ side, the complementary strand is synthesized while displacing the two strands. Specialized polymerases that carry out the above are known. In the present invention, a substrate necessary for complementary strand synthesis is further added.
  • the target base is simply obtained.
  • the reaction can be started simply by incubating the nucleic acid containing the sequence with the primer.
  • the nucleic acid to be type II may remain double-stranded.
  • the present invention utilizes at least two types of single-stranded nucleic acids including the following regions (a) to (d) from the 5 ′ side to the 3 ′ side, Is synthesized.
  • the two types of single-stranded nucleic acids contain a complementary base sequence at their 3, terminal and a base sequence selected from a target base sequence.
  • region (b) region (a) a region that forms a loop when hybridized to any region on the same chain,
  • the at least two types of single-stranded nucleic acids are formed by forming a continuous base sequence that constitutes one of two strands of a nucleic acid chain consisting of a set of complementary base sequences that constitute a target base sequence. Including.
  • both have nucleotide sequences complementary to each other in the 3′-terminal region (d).
  • Each of these nucleic acids has a region (a) consisting of a base sequence complementary to an arbitrary region of the same chain at its 5 '.
  • the arbitrary region of the same chain may be an arbitrary region (c) of the nucleic acid.
  • the region (a) forms a loop by hybridizing to the region (c).
  • An area corresponding to the loop formed at this time is defined as (b).
  • the above relationship can be shown, for example, as follows. (a) (b) (c) (d)
  • each nucleic acid region 1 / the same symbols (a) to (d) are given to each nucleic acid region 1 /, but the nucleotide sequences are not required to be identical. Rather, these regions usually have different base sequences. Furthermore, regions (a) and (d) of each nucleic acid must be located at the 5 'end or 3' end, while regions (b) and (c) are regions (a) and (d) ) Can be placed anywhere. Further, for the region (c), another base sequence is allowed to intervene with the region (d).
  • Desirable positional relationship is such that the number of bases constituting region (a) and region (d) is 10 to 500 bases, usually 10 to 100 bases, and preferably 20 to 50 bases.
  • the salt fiber constituting the region (c) has the number of bases corresponding to the region (a).
  • the size of the loop region (b) formed by hybridization between the region (c) and the region (a) is designed to be 1 to 200 bases, preferably 10 to 100 bases. Since the area (b) is an area sandwiched between the area (a) and the area (c), it is uniquely determined by defining these areas.
  • the region (c) exists adjacent to the region (b) and is complementary to the region (a);
  • the present invention uses a nucleic acid having a long base sequence inserted between (c) and (d). Can be carried out.
  • the target base sequence is a region from one region (a) to the other region (a) of the single-stranded nucleic acid.
  • the length of the target base sequence is determined by the number of bases in each region and the region interposed therebetween.
  • the length of the target base sequence in the present invention is Not restricted. Therefore, the length can be, for example, 30 to 500 bases, usually 50 to 1000 bases, preferably 500 bases or less, and more preferably 400 bases.
  • the nucleotide sequence of the region intervening between the normal region (c) and the region (d) is lengthened.
  • a target base sequence consisting of a long base sequence can be obtained.
  • the number of bases between F 2 ZR 2 is, for example, 90 to 240 bases (the number of bases in the region between F 1 and R 1 is 10 to 40, (Corresponding to a base group).
  • a longer target base sequence can be accurately synthesized or amplified.
  • the entire target base sequence can be constituted by combining the base sequences constituting the single-stranded nucleic acid. More specifically, one of the single-stranded nucleic acids is apparently acted on by the other nucleic acid. As a result of complementary strand synthesis, the base sequence of one nucleic acid constituting the target base sequence can be completed. .
  • the ratio of each single strand to the target base sequence is arbitrary. In order to synthesize a longer nucleotide sequence, it is usually reasonable to use a length of about 1 Z2 with respect to the target nucleotide sequence.
  • the region (c) can be arranged independently or can be arranged so as to overlap with the region (d).
  • Region (c) is arranged so as to overlap with region (d): ⁇ means that the single-stranded nucleic acid has a 5 ′ terminal nucleotide sequence and a 3 ′ nucleotide sequence in a loop region (b )) To form a stem-loop structure.
  • Such a structure is shown as 3 or 4 in FIG.
  • Stem norape refers to a structure consisting of a loop and a double-stranded stem.
  • the 3'-side nucleotide sequence and the 5'-side nucleotide sequence contained in the same molecule are composed of complementary nucleotide sequences, and when they hybridize, a stem is formed. At this time, when the base sequence on the 5 ′ side is completely complementary to the base sequence on the 3 side, the 3 ′ end becomes a double strand with a complementary strand.
  • the single-stranded nucleic acid can be synthesized enzymatically, for example, as follows. First, using four types of primers (insert primer X2 and inner primer X2) having the following characteristics, a DNA polymerase that catalyzes complementary strand synthesis involving strand displacement based on To form a complementary strand.
  • the insert primer and the inner primer will be specifically described below.
  • the insert primer is a primer that contains a target base sequence and anneals to a nucleic acid to serve as a starting point for complementary strand synthesis.
  • the inner primer is annealed to a nucleic acid synthesized by this primer.
  • a synthetic product starting from each of the insert primer F and the insert primer R has a base sequence complementary to each other in a region including the 5 'end of both.
  • the insert primer is a primer unique to the present invention, which has been devised for enzymatically synthesizing a single-stranded nucleic acid composed of the regions (a) to (d), and has novel characteristics. .
  • the insert primer is designed such that its 5 ′ overlaps with a part of the base sequence constituting the nucleic acid to be used.
  • the inner primer FIP anneals to the product of one of the insert primers R to synthesize a complementary strand.
  • the inner primer RIP anneals to the product of the other insert primer F to synthesize a complementary strand.
  • the extension products of the insert primer F and the insert primer-R have a positional relationship such that an overlapping region is synthesized.
  • the base sequence of the region including the 5 'of the insert primer can be any base sequence.
  • the primers may be used to initiate complementary strand synthesis. Therefore, in order for the 3 'ends of both to overlap, it is desirable to set the length of the overlapping portion to a number of bases that cannot be annealed under the reaction conditions.
  • the base sequence of the insert primer By selecting the base sequence of the insert primer, it is possible to synthesize a region located at a distance in the nucleic acid as a continuous base sequence. That is, in a nucleic acid, when the region A and the region B are located across the region S, a target base sequence composed of the region A and the region B can be synthesized.
  • the base sequence on the 3 'side of the insert primer should be a base sequence complementary to the boundary region of region A with region S, and similarly to the boundary region of region B with region S.
  • the 5 'side is designed so that both base sequences are complementary.
  • the base sequences of the regions A and B can be shared on the 5 'side in order to match the amino acid translation frames. That is, for example, when the 3 ′ side is composed of a base sequence complementary to the region A, the base sequence of the region B is added to the 5 ′ side. However, if the shared base sequence is long, a primer-dimer may be formed. Therefore, in order to match the translation frames, an artificial linker sequence can be intervened.
  • a nucleic acid synthesized by such an insert primer has a base sequence in which an arbitrary intermediate portion of a continuous base sequence is deleted. That is, a deletion mutant of the nucleic acid can be obtained.
  • FIG. 9 shows the relationship between the target base sequence and the target base sequence at this time. That is, a mutant (lower in FIG. 9) consisting of a nucleotide sequence in which the portion indicated by “deletion” in (, upper in FIG. 9) has been deleted can be synthesized according to the present invention.
  • One of the functional analyzes of a protein encoded by a gene is to identify the active domain of the protein.
  • a method of expressing a mutant in which a part of a gene is deleted and estimating an active domain based on the relationship between the deleted region and the activity is generally used.
  • PCR is often applied to obtain deletion mutants.
  • the target region can be easily obtained by performing PCR using primers designed for continuous regions of the gene.
  • primers can be designed only at both ends of the nucleic acid to be synthesized. Therefore, it is difficult to synthesize a mutant lacking the intermediate portion in one step.
  • an arbitrary region can be deleted, and a region that exists apart in the and can be synthesized as one continuous base sequence.
  • the features of the present invention are also useful in genome analysis.
  • genes are present in introns.
  • RNA transcribed from the genome is spliced to remove introns, resulting in exon-linked mRNA.
  • Exons and introns in the genome are finding certain laws However, at least at present, the accuracy of the prediction is not sufficient. Therefore, although the structure of the genome has been elucidated, the analysis of the genes contained therein is still a major research topic.
  • a nucleic acid in which a plurality of regions of a genome are linked can be synthesized in one step. That is, it is possible to synthesize a nucleic acid in which the predicted exons are linked. Further, the obtained nucleic acid can be further ligated as necessary.
  • the usefulness of the present invention is apparent from the fact that only one exon can be synthesized in one step by the PCR method.
  • the method for synthesizing a nucleic acid of the present invention can also be used for analyzing a transcription regulatory region.
  • the present invention is useful for searching for a region having promoter activity in the genome.
  • a promoter is a region located upstream of a gene and recognized by a transcription factor of the gene.
  • the search for a region having promoter activity using the present invention can be performed, for example, as follows.
  • an expression cassette comprising a base sequence of a genome to be analyzed and a reporter gene connected downstream thereof is synthesized according to the present invention. That is, it is only necessary to design the inner primer and the insert primer of the present invention for each of the genome and the reporter gene, and to carry out a method for synthesizing nucleic acids having different nucleic acids as templates.
  • primers for various regions in the genome region to be analyzed various types of expression cassettes can be synthesized.
  • an arbitrary region can be freely synthesized as an expression cassette by designing a primer.
  • the resulting expression cassette is actually expressed in an appropriate host, and the promoter activity can be evaluated by observing the signal of the reporter gene.
  • the method for synthesizing nucleic acids of the present invention is useful for synthesizing nucleic acids in which distant regions contained in the same type II are linked. If this principle is further developed, according to the present invention, it is also possible to synthesize a nucleic acid in which two regions included in different regions are linked. That is, the reaction can be started using nucleic acids having different base sequences derived from nucleic acids as the two types of single-stranded nucleic acids in the nucleic acid synthesis method of the present invention.
  • the resulting nucleic acid is a nucleic acid in which base sequences derived from different key nucleic acids are linked on the 5 ′ and 3 ′ sides.
  • a single-stranded nucleic acid containing a base sequence derived from a different type III nucleic acid can be obtained, for example, by the following method. Insert primers and inner primers designed to act as primers for different nucleic acids are used as primers for use in the nucleic acid synthesis method of the present invention.
  • an inner primer F and an insert primer F are designed for the ⁇ M nucleic acid F.
  • a base sequence that acts as a primer for synthesizing a region intended for the synthesis of nucleic acid F is arranged.
  • a base sequence complementary to an arbitrary region of a complementary strand synthesized starting from the 3 ′ side is arranged.
  • an inner primer R and an insert primer R are designed.
  • a base sequence that acts as a primer for synthesizing a region intended for the synthesis of nucleic acid R is arranged.
  • a base sequence complementary to an arbitrary region of the complementary strand synthesized starting from the 3' side is arranged.
  • insert primer F and insert primer It consists of a unique base sequence.
  • the base sequence on the 5 ′ side of the insert primer is designed so that the genes can be linked in frame.
  • the method for synthesizing or amplifying the nucleic acid of the present invention can be carried out under the same conditions, except that the design of such primers and the use of different nucleic acids are different. That is, mix two types of nucleic acid type II, all primers, and DNA polymerase, substrate, buffer, etc. necessary for the reaction, and incubate under appropriate conditions.
  • a complementary primer synthesis reaction may be carried out by adding a corresponding primer to a different type I nucleic acid to generate a single-stranded nucleic acid, and then the two may be mixed, and then the complementary strand synthesis reaction may be continued. it can.
  • the target base sequence can be obtained by collecting the target base sequence or a reaction product having a size larger than the target base sequence from the reaction product.
  • the recovered nucleic acid can be digested with a restriction enzyme and purified if necessary.
  • the method for obtaining a nucleic acid containing a base sequence of a different nucleic acid based on the nucleic acid synthesis method or the amplification method according to the present invention is useful, for example, in the following application fields.
  • a gene encoding a fusion protein can be synthesized according to the present invention. It has been difficult to synthesize large-sized genes simultaneously using known methods. For example, in the method, an artificial base sequence could be added to the end of the target base sequence as long as it could be synthesized as a primer. However, the length of the base sequence that can be added by this method was limited. Therefore, small proteins such as histidine tags cannot be added. On the other hand, in the present invention, since a gene encoding a protein to be added can also be synthesized by a complementary strand synthesis reaction, a gene of any length can be fused in principle.
  • a vector containing the required nucleotide sequence To add a long nucleotide sequence that is difficult to add as a primer, prepare a vector containing the required nucleotide sequence in advance and fuse it with this vector. A method of inserting a gene has been used. However, in this method, a vector containing a fusion partner must be prepared in advance to produce a fusion protein. On the other hand, in the present invention, a target region can be freely selected and fused from different ⁇ M nucleic acids.
  • a mutation or an additional nucleotide sequence can be introduced into the insert primer used in the present invention.
  • the insert primer is required to have a specific condition of base sequence in 3 and 4.
  • various nucleic acids generated by the complementary strand synthesis reaction using the base sequence of the insert primer as a face have various base sequences complementary to each other at the 5 ′ end. Can be arranged freely.
  • the introduction of a mutation or the addition of a base sequence is allowed in the middle of the insert primer.
  • nucleotide sequence obtained by adding a mutation or a nucleotide sequence to the nucleotide sequence contained in. Since the insert primer can be set at any position in the target base sequence, according to the present invention, any mutation can be introduced at any position. Mutations can be substitutions, deletions, or additions of bases. Any of these mutations can be introduced by the present invention.
  • nucleic acid synthesis methods such as PCR
  • PCR a method that can introduce an arbitrary mutation at an arbitrary position in a target base sequence as in the present invention is useful.
  • multiple ML insert primers can be used at the same time.
  • ⁇ M Mutual substitution of nucleic acids occurs, and faster complementary strand synthesis can be expected.
  • the base sequence constituting the 3 'side of the insert primer be set so that the type II nucleic acid can be used as a double-stranded nucleic acid as a starting point for complementary strand synthesis.
  • the primer can function as a primer under the same conditions as in the complementary strand synthesis reaction using the inner primer and the outer primer. Specifically, similarly to the above-mentioned region (d) and the like, it is 5-200 bases, more preferably 10-50 bases.
  • the region constituting the 5 ′ side of the insert primer provides a base sequence necessary for the complementary chain synthesized using this region to be MM, so that its 3 end is the starting point of complementary chain synthesis. Therefore, as in the case of the base sequence constituting the 3 'side, it is 5 to 200 bases, more preferably 10 to 50 salts.
  • the 5, 3 ⁇ 4 base sequence constitutes a region (a) containing 5, «of the single-stranded nucleic acid.
  • a different inner primer is used for each of the two strands constituting the target base sequence. Usually they are called forward side and reparse side.
  • the inner primer is a primer used in the known LAMP method. However, in the known LAMP method, the reaction is basically composed of an inner primer. There is currently no report on the combination of the insert primer and the inner primer.
  • nucleic acid synthesis method of the present invention it is important to first generate a single-stranded nucleic acid consisting of the regions (a) to (d).
  • a nucleic acid can be provided with the structure by a nucleic acid synthesis reaction based on the present invention using the insert primer and an inner primer having the following structure. The details of this reaction will be described later.
  • the inner primer used for the nucleic acid synthesis reaction of the present invention is composed of at least the two regions X2 and X1c.
  • X2 is a region including 3, male
  • X1c is a region including 5, terminal.
  • the structure of the inner primer in the present invention is determined by the target base sequence. At least a part of the target nucleotide sequence is known or can be estimated. The portions whose nucleotide sequences are to be clarified are the region X2c and the region X1c located on the fifth side thereof. These two regions can be assumed to be continuous ⁇ ⁇ and separated ⁇ . The relative position of the two determines the state of the loop formed when the product nucleic acid self-anneals.
  • the distance between the two is not unnecessarily large. Therefore, it is desirable that the positional relationship between the two is usually continuous over a distance of 0 to 500 bases.
  • the later-described loop formation by self-anneal it is expected that there is a case where it is disadvantageous to form a loop in a desirable state if the user is too close.
  • the loop is required to have a structure that can smoothly initiate the annealing of a new oligonucleotide and a complementary strand synthesis reaction involving strand displacement starting from the new strand.
  • the region X 2c and its 5 ′ The distance from the region X1c located on the side is designed to be 0 to 100 bases, more preferably 10 to 70 bases. This value indicates the length not including XIc and X2.
  • the number of bases constituting the loop portion is a length obtained by further adding a region corresponding to X2.
  • the regions X 2 and XIc constituting the inner primer of the present invention with respect to the target base sequence are usually arranged continuously without overlapping. Alternatively, if both base sequences have a common part, they can be partially arranged so as to overlap. Since X2 must function as a primer, it must always be at the 3 'end.
  • X 1c is located at 5 ′ because it is necessary to provide a function as a primer to the 3, 3 terminal of the complementary strand synthesized as described above.
  • the complementary strand obtained using this oligonucleotide 'as the synthesis starting point will be the one for synthesis of the complementary strand from the opposite direction, and finally the inner primer portion according to the present invention will be transferred to the complementary strand as Can be 3.
  • the end generated by copying has the base sequence X1 and anneals to X1c on the same strand to form a loop.
  • the inner primer in the present invention satisfies the two conditions of being capable of forming a complementary base pair bond with the target base sequence, and of giving the -0H group which is the starting point of complementary strand synthesis in (3) above.
  • the pack component is not necessarily limited to a phosphodiester bond.
  • it may be composed of a phosphothioate form.
  • the base may be any one that enables complementary base pairing. In its natural state, it can also be an analog, such as bromodeoxyuridine, which is generally one of the five types of ACTG and U. It is desirable that the oligonucleotide used in the present invention not only serves as a starting point of synthesis but also functions as a source of complementary strand synthesis.
  • the inner primer of the present invention is a strand that is capable of performing base pairing with a complementary strand while maintaining necessary specificity in a given environment in various nucleic acid synthesis reactions described below.
  • an excessively long base sequence is difficult to prepare by chemical synthesis, and the above-mentioned chain length is exemplified as a desirable range.
  • the chain length exemplified here is the chain length of the portion that anneals to the complementary chain.
  • the inner primer according to the invention consists of at least two regions X2 and XIc. Therefore, the chain length exemplified here should be understood as the chain length of each region constituting the in-primer. .
  • FIG. 1 and FIG. show a method for synthesizing a nucleic acid containing a target base sequence, including a nucleic acid containing a target base sequence (between F 2 ZR 2c).
  • the primers indicated by fc in the figure are as follows.
  • a base sequence complementary to an arbitrary region in the target base sequence is arranged at the 3 ′ end of the insert primer F and the insert primer R shown in the figure, and the base sequence is complemented by annealing to a nucleic acid to be It is the starting point for chain synthesis.
  • each instance The 5 'side of the primer is designed so as to have mutually complementary nucleotide sequences.
  • the two insert primers are designed so that the 5 ′ ⁇ s of the two primers overlap each other in an arbitrary region in the two strands constituting the target base sequence.
  • the outer primer F 3 or R 3 is composed of a nucleotide sequence complementary to an arbitrary region F 3c or R 3c 5 ′ from the 5 ′ end of the target nucleotide sequence.
  • the outer primer is intended to provide a starting point for a complementary strand synthesis reaction for displacement of a synthesized strand starting from the inner primer / insert primer.
  • the extension product of the insert primer-R is annealed with the inner primer-FIP to synthesize a complementary strand.
  • the synthesized phase capture strand is displaced by the outer primer F3 and released as a single-stranded nucleic acid (1).
  • This (1) is nothing but one of the nucleic acids having the regions (a) to (d) in the present invention.
  • nucleic acid (1) and nucleic acid (2) hybridize at the 5 'end with the region containing their complementary base sequence, but the region containing the 3' end is single-stranded and Has a complementary nucleotide sequence. Therefore, the region containing the 3 'end of both can hybridize.
  • the nucleic acid (1) and the nucleic acid (2) have a configuration in which the base sequence constituting the target base sequence includes the base sequence on the 5 'side thereof but lacks the base sequence on the 3 side. .
  • the 5 'base sequence of the target base sequence constituting each chain is nothing but a base sequence complementary to the 3' base sequence lacking in the other chain. Therefore, if the complementary strands are synthesized in the form of ⁇ starting from the 3 ′ of these nucleic acids, the base sequence on the 3 ′ ⁇ side of each strand that is lacking with respect to the target base sequence is synthesized. Thus, the target base sequence is completed. Thus, in the present invention, a nucleic acid comprising the target base sequence is synthesized.
  • the nucleic acid where the insert primer anneals is depicted as a single strand.
  • a denaturation step for making the nucleic acid to become single-stranded is not necessarily required.
  • Most of the complementary strand synthesis reaction constituting the present invention is performed by a DNA polymerase that catalyzes a complementary strand synthesis reaction involving strand displacement. When this type of DNA polymerase is used, it is possible to synthesize a complementary strand using a double-stranded nucleic acid under appropriate conditions.
  • the present inventors have clarified the conditions under which a double-stranded nucleic acid can be used as a single-stranded nucleic acid without denaturation. In other words, they found that the conditions under which primer-annealing and double-stranded M-dependent complementary strand synthesis for double-stranded nucleic acid can be set without denaturation step, given the conditions under which the double strand is destabilized to some extent. Also in the present invention, this condition is used for IJ, and a double-stranded nucleic acid can be used as ⁇ as it is.
  • a single-stranded nucleic acid is frequently used as a, and the temperature is lower than the temperature at which the nucleic acid is denatured into a single-stranded nucleic acid. What is necessary is just to set to the temperature which can react.
  • the temperature required for the reaction can be adjusted with a melting temperature regulator (hereinafter, the melting temperature is abbreviated as Tm).
  • Tm melting temperature regulator
  • nucleic acid containing the target base sequence which is generated based on the combination of the nucleic acid (1) and the nucleic acid (2).
  • FIG. 3 as a nucleic acid generated by such a combination, first, a product in which nucleic acid (1) and nucleic acid (2) are extended in the 3 ′ direction will be described.
  • the nucleic acid (1) and the nucleic acid (2) have a base sequence complementary to an arbitrary region of the nucleic acid at the 5 ′ end. Therefore phase
  • the nucleic acid produced as a result of complement synthesis has a base sequence complementary to itself at the 3 'end. As a result, if the region containing the 3 'becomes a single-stranded structure, the 3' end is annealed to itself, and the synthesis of the complementary chain is started.
  • This step is shown in FIG.
  • the double-stranded nucleic acid generated from the nucleic acid (1) and the nucleic acid (2) is further annealed by the insert primer to start phase-trapping synthesis, so that the region containing the 3 ′ is a single-stranded region. It is said.
  • the 3 'end anneals to itself and initiates complementary strand synthesis with itself, generating a nucleic acid with the target base sequence linked through the loop (bottom two products in Figure 3).
  • the lower two products have complementary base sequences at their 3 'and 5', and are ready for annealing of the inner primer in the loop.
  • this nucleic acid has the structure necessary to start the LAMP method. Therefore, once such a structure is generated, a nucleic acid synthesis reaction based on the known principle of the LAMP method is started. That is, the following three reactions are repeated continuously and forcelessly in theory. The result is a high degree of nucleic acid amplification.
  • FIG. 3 also shows that nucleic acid (3) and nucleic acid (4) are produced as products. These nucleic acids are generated by replacing the nucleic acid synthesized with the insert primer as a starting point with the complementary strand synthesis proceeding by allowing the above 3 to be self-assembled. These nucleic acids also contribute to the reaction for synthesizing the nucleic acid of the present invention as a material for initiating a reaction as described later.
  • a nucleic acid having a single-stranded structure originally on the 3 ′ side was used to initiate the reaction.
  • the method for synthesizing a nucleic acid of the present invention is not limited to the case where the region containing 3 ′ as a single-stranded nucleic acid is single-stranded.
  • the 3 'end Even in the case of having a double-stranded structure with a complementary strand, it is possible to initiate the synthesis of the 3'-anneal and the accompanying target base sequence.
  • the nucleic acid (3) and the nucleic acid (4) generated by the above-described reaction have complementary 5'-terminal complementary terminals. It forms a double-stranded structure with the region consisting of the base sequence.
  • Such a structure can be annealed to other nucleic acids by some means if its 3 'is made into a single strand.
  • the 3′ ⁇ S of the inner primer FIP used in the figure is composed of F2c. Since F2c is a nucleotide sequence complementary to F2, it anneals to F2c present in the loop of nucleic acid (3) and provides a starting point for complementary strand synthesis. The complementary strand synthesis initiated from within the loop proceeds in the 5 ′ direction of the nucleic acid (3), which is at the 5 ′ end. At this time, the 3 'end, which had originally hybridized to 5, 5 of the nucleic acid (3), is replaced with the synthesis of a new complementary strand, and becomes a single-stranded state. Similarly, RIP anneals to the loop portion of nucleic acid (4) and opens its 3 'end as a single strand.
  • the nucleic acid (3) and the nucleic acid (4) become single-stranded, and the nucleic acid (3) and the nucleic acid (3) are combined, and a complementary strand synthesis reaction in which the nucleic acids (1) and (2) are separated from each other is started in the same manner as the reaction using the nucleic acid (1) and the nucleic acid (2). Then, the base sequence on the third side is obtained, and the synthesis of the target base sequence is completed.
  • the single-stranded nucleic acid of the present invention can function as a starting point for complementary strand synthesis without having to positively change the 3 ′ to a single-stranded nucleic acid.
  • a double-stranded nucleic acid can be used as a nucleic acid without undergoing a denaturation step depending on conditions.
  • the nucleic acid (3) and the nucleic acid (4) can be annealed at their 3 ′ ends.
  • the reaction between the nucleic acid (3) and the nucleic acid (4) can be initiated by using the RNA-DNA chimeric primer.
  • the nucleic acid (3) and the nucleic acid (4) are composed of RNA on the 5th side, and when a complementary strand is involved, the portion composed of RA can be decomposed. .
  • Nucleic acid (3) and nucleic acid (4) have a structure in which the 3 side is hybridized to its own 5 'end region. Therefore, if the region constituting the 5 ′ end is removed, the 3 ′ side is in a state where base pairing is possible. Since the 3 'ends of both are composed of mutually complementary base sequences, the two are annealed to initiate a complementary strand synthesis reaction with each other as.
  • the RNA can be eliminated from the RNA / DNA hybrid using an enzyme such as RNAseH.
  • a primer whose 5′-containing region is composed of RNA is used as a primer for synthesizing these nucleic acids. Just use it. It is necessary that the region including the 3 'end of the primer has a structure having RNAseH resistance, such as DNA.
  • RNAseH resistance such as DNA.
  • an RNA / DNA hybrid with nucleic acid (3) or nucleic acid (4) is constructed at the stage where nucleic acid (3) or nucleic acid (4) is synthesized. This is because the 3 'end required for nucleic acid (4) is not synthesized.
  • the step of digesting RNA is common to the above-described ICAN method.
  • the principle is different from that of the ICAN method because the thigh must be on the 5 'end side of the nucleic acid (3) or the nucleic acid (4).
  • the nucleic acid (3) and the nucleic acid (4) each have a double-stranded structure at 3 and 3, it has already been described that this region becomes single-stranded by a primer that anneals to the loop.
  • the conditions under which the primer can be annealed without the step of positively making a single strand are also shown above. Further, by setting the 5 'as RNA and digesting this RNA, the 3' can be made into a state capable of base pairing.
  • the single-stranded nucleic acid having the regions (a) to (d) provides A method for synthesizing a nucleic acid is performed.
  • each of the nucleic acids generated by the combination of the nucleic acid (3) and the nucleic acid (4) has an additional base sequence in addition to the target base sequence.
  • the additional base sequence corresponds to the base sequence that nucleic acid (3) and nucleic acid (4) have from the loop to 5. Therefore, the nucleic acid generated from the combination of the nucleic acid (3) and the nucleic acid (4) has an additional nucleotide sequence on the 5 ′ side and 3 ′ side of the target nucleotide sequence.
  • the combination of the nucleic acid (3) or the nucleic acid (4) with the nucleic acid (1) or the nucleic acid (2) has an additional base sequence on either the 5 ′ side or the 3 ′ side of the target base sequence Generates nucleic acids. Since the 3 'end or 5' end having the additional base sequence is a base sequence derived from the insert primer, it does not have a base sequence complementary to itself. Therefore, the nucleic acid itself is not in a state where the reaction of the LAMP method can be directly started. However, in this nucleic acid, the base sequence from the insert primer to the inner primer is conserved in the region containing its 5 '.
  • a new nucleic acid (1) or nucleic acid (2) can be generated based on the inner primer RIP or FIP with this region as ⁇ M.
  • the generated nucleic acid (1) or nucleic acid (2) is displaced by complementary strand synthesis from another nucleic acid that anneals to the 5 side of the inner primer, and is released as a single-stranded nucleic acid .
  • the nucleic acid (1), the nucleic acid (2), the nucleic acid (3), and the nucleic acid (1) can be obtained by using the insert primer and the inner primer, more preferably the outer primer. (4) is continuously synthesized, and a nucleic acid containing the target base sequence is synthesized.
  • the primer primer insert primer is a nucleic acid in a double-stranded state.
  • the conditions that can be used are as described above.
  • the above is the reaction principle of the nucleic acid synthesis method according to the present invention.
  • the reaction as described above can be carried out.
  • all the reactions can be carried out under common conditions. That is, under desirable conditions, it is not necessary to perform a treatment such as heating for the purpose of denaturing the nucleic acid.
  • the present invention relates to a method for synthesizing a nucleic acid containing a target base sequence, comprising a step of incubating the following elements.
  • Inner primer F wherein the inner primer F anneals at its 3 'end to a region defining the 3' side of one of the strands constituting the target base sequence, and The 5 ′ end has a base sequence complementary to any region of the complementary strand synthesis reaction product starting from this primer.
  • insert primer F has a base sequence at its 3 ′ end that is complementary to an arbitrary region of one of the strands constituting the target base sequence
  • an insert primer wherein the insert primer R has a base sequence complementary to an arbitrary region of the other strand constituting the target base sequence at its 3 ′ end,
  • the synthetic product originating from each primer ⁇ "of the insert primer F and the insert primer R has a base sequence complementary to each other in a region containing 5, « of both.
  • the following components can be further added to the reaction solution.
  • outer primer F is a starting point of a complementary strand synthesis reaction starting from the 3 ′ side of the region to be annealed by the inner primer F in, and
  • Outer primer R is a starting point of a complementary strand synthesis reaction starting from the 3 ′ side of the region to be annealed by the inner primer R in the above.
  • the following element can be further added to the reaction solution.
  • loop primer F the region containing 3 of loop primer F is the region containing the 5 ′ end of the above-mentioned inner primer F, and the region containing the 5′-end of the complementary primer synthesis reaction starting from the inner primer F. Anneal to any region in the loop formed by hybridizing to any region, and
  • Loop primer R here, the region containing 3, of the norepe primer R is the region containing the 5, end of the above-mentioned inner primer R.
  • nucleic acids having loops composed of various base sequences are continuously produced.
  • the loop annealed by the inner primer is an important loop for starting complementary strand synthesis starting from the inner primer.
  • the region containing the 5 ' ⁇ of the inner primer hybridizes to an arbitrary region of the complementary strand synthesis reaction product starting from the inner primer.
  • the inner primer is not anneal to the loop formed by the step.
  • the present inventors have found that a primer that anneals to this loop to provide a starting point for complementary strand synthesis improves the reaction rate (W002 / 24902).
  • the inner primer is an anneal.
  • a primer that gives a starting point for complementary strand synthesis in a loop that does not perform is called a loop primer.
  • the loop primer in the present invention can design at least two types of loop primers, that is, a loop primer F for the inner primer F and a loop primer R for the inner primer R.
  • at least one type of loop primer designed in this manner is used.
  • Preferred loop primers are two types of loop primers, namely, a primer Primer F and a loop primer R.
  • three or more types of loop primers may be used in combination with loop primers capable of annealing to different regions in the same loop. If the loop primer is applied to the nucleic acid synthesis method of the present invention, an improvement in the reaction rate can be expected.
  • the insert primer F is, for example, 0.1 to 100 times, preferably 0.1 to 50 times, the inner primer F. It is more preferably used at a concentration of 0.2 to 5 times.
  • the concentration ratio between the insert primer R and the inner primer R can be similarly set.
  • the insert primer F and the insert primer R, or the inner primer F and the inner primer R are usually used at approximately the same concentration.
  • the amount of primers and enzymes used should be set appropriately according to the expected conditions such as the concentration of type I, reaction time, reaction temperature, and the activity of the enzyme used in the reaction. Can be set. More specifically, for example, The concentration is usually from 100 to 400 OnM, preferably from 250 to 300 OnM, more preferably from 500 to 300 OnM, so that the concentration of 6 or more copies can be obtained. Based on the results, an ascertainable level of amplification product can be generated.
  • the first purpose of the outer primer is to displace the strand synthesized from the inner primer by a complementary strand synthesis reaction from the 3 ′ side. Therefore, it is desirable that the complementary strand synthesis reaction starting from the inner primer be initiated preferentially over that of the outer primer.
  • the primer is usually designed so that the Tm of the outer primer is lower than the Tm of the inner primer.
  • the Tm of the inner primer refers to the Tm for the nucleic acid in the region including the terminal 3, which is the starting point of complementary strand synthesis.
  • the outer primer at a lower concentration than the inner primer, the complementary strand synthesis of the inner primer can be preferentially performed.
  • the working concentration of the primer primer can be, for example, 1/2 or less, preferably 1Z10 or less, or 1Z100 or less with respect to the inner primer.
  • the concentration of the loop primer used is desirably set to, for example, lZ10 to an equivalent amount with respect to the concentration of the inner primer. More specifically, it can be 1/3 to 1/2. Usually, the amount of the loop primer F is equal to that of the loop primer R.
  • the use of the outer primer is not an essential condition. Even if the inner primer is not released from »nucleic acid by displacement, the extension reaction product can function as a new type III. Even if the step of forming a single strand is omitted, the complementary strand synthesis reaction based on the primer is started with a certain probability, as described above. Since this phenomenon can be expected even with the extension product from the inner primer, there is a possibility that the complementary strand synthesis reaction starting from the insert primer or the other inner primer can be started without using the outer primer. . However, an extension product generated from the inner primer as a starting point depending on the type III nucleic acid is a product constituting the first step of the nucleic acid synthesis method of the present invention.
  • a loop primer is not required in the present invention.
  • the use of loop primers can improve the reaction rate. Therefore, the use of the loop primer is one of the desirable conditions in the nucleic acid synthesis method of the present invention.
  • primers used in the present invention can be chemically synthesized.
  • a natural nucleic acid can be cleaved with a restriction enzyme or the like, and modified or ligated so as to be composed of the above base sequence.
  • the insert primer and the inner primer in the present invention can be labeled with a known labeling substance.
  • the labeling substance include a binding ligand such as digoxin dibiotin, an enzyme, a fluorescent substance and a luminescent substance, and a sex isotope.
  • a technique of replacing a base constituting the inner primer with a fluorescent analog (W095 / 05391, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 664 4-6648, 1994) is also known.
  • the insert primer / binner primer according to the present invention may be itself bound to a solid phase by a method that does not hinder its function.
  • any part of these primers can be labeled with a binding ligand such as biotin, and then immobilized indirectly with a binding partner such as immobilized avidin.
  • the separation is easy at the ⁇ where the solid-phased primer is used as the synthesis starting point because the nucleic acid synthesis reaction product is captured on the solid phase.
  • a nucleic acid-specific indicator or an additional labeled probe is used. Detection can also be performed by hybridizing.
  • the target nucleic acid fragment can be recovered by digestion with an arbitrary restriction enzyme.
  • the reaction solution can be composed of the above-described components and a buffer solution that maintains appropriate reaction conditions. Further, an enzyme protectant, Tm-adjusted IJ, and the like can be added to the reaction solution.
  • a series of reactions consist of a buffer that provides a suitable pH for the enzymatic reaction, salts necessary for maintaining the catalytic activity of the enzyme and for annealing, a protective agent for the enzyme, and, if necessary, adjusting the melting temperature (Tm). !] And so on.
  • a neutral to weakly alkaline buffering agent such as Tris-HC1 is used. Adjust the pH according to the DNA polymerase used. Salts KC1, NaCl, MgCl 2, MgS0 4, or (NH 4) 2 S0 4 or the like, is suitably added to the melting temperature (Tm) of the adjustment of the active maintenance and nucleic acid enzyme.
  • Serum albumin saccharide is used as a protective agent for the enzyme.
  • Tm melting temperature
  • betaine proline, formamide, dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as DMS0), or trimethylamine N-oxide (hereinafter abbreviated as T-article 0) is generally used. Used. By utilizing the melting temperature (Tm) preparation, the annealing of the oligonucleotide can be adjusted under limited temperature conditions.
  • betaine N, N, N, -trimethylglycine
  • T-article 0 trimethylamine N-oxide
  • Betaine can be expected to promote the nucleic acid amplification reaction of the present invention by adding 0.2 to 3.0 M, preferably 0.5 to 1.5 M, of the reaction solution. Since these melting temperature modifiers act in the direction of lowering the melting temperature, conditions that give appropriate stringency and reactivity should be set in consideration of other reaction conditions such as salt concentration and reaction temperature. You.
  • Tm can be calculated based on the length of the base sequence to be annealed and its GC content, salt concentration, and Tm conversion concentration.
  • the anneal of the primer to the double-stranded nucleic acid is presumably unstable.
  • the complementary strand is synthesized from the primer as a synthesis starting point while being unstable.
  • the hybridization between the synthesized complementary strand and the nucleic acid is gradually stabilized.
  • a DNA polymerase as shown below can catalyze the synthesis of a complementary strand using a primer as a starting point for synthesis of a double-stranded ⁇ M nucleic acid.
  • Supporting the method for synthesizing nucleic acids according to the present invention is a DNA polymerase that catalyzes a complementary strand synthesis reaction involving strand displacement.
  • the following are known as this kind of DNA polymerase.
  • various mutants of these enzymes can be used in the present invention as long as they have sequence-dependent #S complementary chain synthesis activity and strand displacement.
  • the term “mutant” as used herein refers to a structure in which only the structure that provides the catalytic activity required by the enzyme is extracted, or a structure in which the catalytic activity, stability, or heat resistance is altered by amino acid mutation or the like. it can.
  • DNA polymerases are used in amounts that can achieve the required reaction under the reaction conditions.
  • a sufficient amount of a synthetic product can be produced in a short time by setting the amount to 2 to 20 ml, usually 5-1 OU, per 25 ⁇ L of the reaction solution.
  • Vent Exo- DNA polymerase (Vent DNA polymerase from which etasonuclease activity has been removed)
  • Bst DNA polymerase ⁇ Bca (exo-) DNA polymerase is a particularly desirable enzyme because it has a certain degree of heat resistance and high tactility.
  • a step of using a primer as a synthesis starting point and a complementary strand synthesis reaction are optionally performed on a double-stranded nucleic acid under the same conditions. While such reactions often require some degree of heating, it is a desirable condition that the enzyme be thermostable. By using a thermostable enzyme, it can respond to a wide range of reaction conditions.
  • nt (Exo-) DNA polymerase is an enzyme that has a high degree of thermostability along with its strand placement.
  • Vent (Exo-) DNA polymer T4 gene 32 is effective as a single-stranded binding protein against lysase.
  • DNA polymerases that do not have 3, 5 'ethanonuclease activity have a phenomenon that complementary strand synthesis does not stop at the 5' end of the DNA and proceeds to the point where one base is protruded.
  • a phenomenon is undesirable because the sequence at the 3 ′ end when the complementary strand synthesis reaches the end leads to the start of the next complementary strand synthesis.
  • the addition of a base to the 3 'by a DNA polymerase is A with a high probability. Therefore, the sequence may be selected so as to start with the synthetic power from the 3 'end so that there is no problem even if dATP is added by one base by mistake.
  • a DNA polymerase such as Taq polymerase generally used in PCR and the like has substantially no strand displacement under ordinary conditions.
  • this type of DNA polymerase can be used in the present invention if it can provide conditions that allow strand displacement.
  • the nucleic acid synthesis method of the present invention uses a nucleic acid as a key.
  • the type of nucleic acid used as ⁇ is not limited. Therefore, double-stranded, single-stranded, or triple-stranded, DNA-RNA hybrids, or DNA or RNA derivatives including artificial nucleotide derivatives, etc. can be made into type III.
  • the nucleic acid of the present invention may be purified or unpurified.
  • the method of the present invention can be applied in a state where it is present in a cell (in situ). By using a double-stranded nucleic acid in a cell, in situ analysis of the genome becomes possible. Intracellular mRNA (single-stranded nucleic acid) can also be used as a key.
  • the step of synthesizing the cDNA and the method of synthesizing a nucleic acid according to the present invention can be performed under the same conditions. Brittle By synthesizing the first strand of the cDNA, a double-stranded nucleic acid based on DM-spirodipride is completed. Using this double-stranded nucleic acid in the present invention, a method for synthesizing a nucleic acid can be carried out. If the DNA polymerase used in the nucleic acid synthesis method of the present invention has reverse transcriptase activity, nucleic acid can be synthesized under the same conditions using a single enzyme.
  • ca DNA polymerase is a DNA polymerase that has strand mimicry and also has reverse transcriptase activity. It goes without saying that the nucleic acid synthesis method according to the present invention can be applied after the second strand is synthesized to obtain a complete double-stranded cDNA.
  • a nucleic acid in a double-stranded state when used as a key, an arbitrary primer is added, and the mixture is incubated under conditions capable of achieving a complementary strand synthesis reaction starting from the primer.
  • the region to be inserted by the insert primer / binner primer can be brought into a state where base pairing is possible.
  • arbitrary primer refers to a region in which various primers are to be annealed so as to be capable of base pairing. Therefore, the arbitrary primer is a primer capable of initiating complementary strand synthesis with the insert primer and the primer primer of the double-stranded nucleic acid to be used as a complementary strand to the nucleic acid strand to be affixed. There is a need. Furthermore, the complementary strand synthesis using an arbitrary primer in the present invention as a starting point of synthesis should be in a positional relationship such that the insert primer / binner primer proceeds toward the region to be annealed.
  • any primer can be composed of a nucleotide sequence complementary to any region as long as this condition is satisfied.
  • one of a set of an inner primer and an insert primer can be used as an arbitrary primer.
  • Such an embodiment is one of the desirable embodiments in the present invention because it reduces the components required for the reaction.
  • an insert primer and an inner primer are used for different nucleic acids, only one set of inner primer or insert primer is provided for one type III. In such a case, a quick reaction can be expected by adding an arbitrary primer in addition to these primers and setting a region where these primers should be annealed to be capable of base pairing.
  • a primer could not give a synthetic origin unless at least the region to be annealed was a single strand. For this reason, conventionally, in order to convert a double-stranded nucleic acid into type II, a step of making the double-stranded nucleic acid single-stranded by denaturation is always performed prior to the use of the primer. However, even if it is not necessarily a single strand, a starting point for synthesis can be given by incubating with a primer under the condition that the double strand is unstable by some means. As a condition for destabilizing the duplex, for example, a method of heating to near the melting temperature (Tm) can be shown. Alternatively, it is also effective to have Tm conversion.
  • Tm melting temperature
  • nucleic acid in the nucleic acid synthesis method or amplification method of the present invention, any nucleic acid can be used as the nucleic acid.
  • the nucleic acid can be single-stranded, double-stranded, or triple-stranded. It has already been mentioned that even if it is not single-stranded, it can be used as a nucleic acid without a denaturation step if appropriate conditions are given.
  • the nucleic acid to be used may be DA or RNA.
  • 4 complementary strand synthesis reaction can be used as RNA.
  • DNA polymerases having a reverse transcriptase activity with respect to RA and catalyzing a complementary strand synthesis reaction involving strand displacement are known.
  • ca DNA polymerase is a DNA polymerase having a strand displacement property and also having a reverse transcriptase activity.
  • the method for synthesizing a nucleic acid according to the present invention can be applied after synthesizing the second strand to obtain a complete double-stranded cDNA.
  • the origin of the nucleic acid is not limited. Normally, nucleic acids are derived from biological materials, but artificially synthesized nucleic acids can be used as ⁇ M.
  • the method for synthesizing a nucleic acid or the method for amplifying a nucleic acid according to the present invention is useful for synthesizing DNA to be immobilized on a DNA chip.
  • a process for preparing a DNA chip using the present invention will be exemplified.
  • the primer of the present invention is designed based on the base sequence of the nucleic acid to be immobilized on the DNA chip. Designing primers necessary for amplification of a desired nucleic acid based on the disclosure of the present invention can be usually performed by those skilled in the art. By incubating the designed primer together with the components necessary for the amplification reaction of the nucleic acid of the present invention under appropriate conditions, the reaction solution has a unique characteristic of the LAMP method in which the target base sequence is linked. A large amount of nucleic acid having a structure is produced. The obtained product is fixed on a substrate by a known method as it is or after an appropriate treatment. A glass slide / nylon membrane is used for the substrate. Methods for immobilizing nucleic acids on a substrate are known.
  • any nucleic acid can be used as a symbol. More specifically, cDNA clones derived from various cells are used as. Alternatively, an arbitrary region can be amplified according to the present invention with the genome as a type III, and immobilized on a DNA chip.
  • the structural feature of LAMP products is that they have an impartet repeat structure. That is, it has a structure in which complementary base sequences are alternately linked.
  • a nucleic acid having such a structure it is expected that intramolecular annealing occurs between regions each having a complementary base sequence, which may affect the efficiency of the hybrid.
  • problems due to intramolecular annealing can be easily solved by simple processing.
  • the LAMP product can be fragmented by restriction enzyme treatment, for example, using a restriction enzyme site introduced at a specific position. Respective fragmented nucleic acids no longer cause intramolecular annealing.
  • the nucleic acid synthesized by the LAMP method has a region of about 20-100 bp between the inner primers. With such a length, it is difficult to increase the reactivity with the probe.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, comparatively long DNA which has not been tried before can be amplified based on LAMP method. As a result, a DNA chip prepared using the synthetic product of the present invention can detect signals more efficiently than a chip using a nucleic acid synthesized by the known LAMP method.
  • the following method is generally used. First, labeled cDNA prepared from mRNA samples derived from two different cells is hybridized to a microarray. Next, immobilize it on a DNA chip The signal of the probe hybridized to the nucleic acid is measured. If the signal is measured for each nucleic acid and the signal intensity is analyzed, the relative expression levels of each mRNA are compared. At this time, if there is a variation in the hybridization efficiency between the nucleic acids immobilized on the chip, this may cause a loss of the reliability of the analysis result. Therefore, it is significant to immobilize longer nucleic acids and provide sufficient reactivity.
  • a polynucleotide comprising a target nucleotide sequence obtained by linking nucleotide sequences derived from two different genes can be synthesized and used as a probe in a DNA chip.
  • a probe must be prepared for each gene in a DNA chip.
  • polynucleotides synthesized by combining base sequences derived from different genes according to the present invention are used, one polynucleotide functions as a probe for two genes. Furthermore, there is no need to calibrate (normalize) the signal because the amount of probe for each gene is equal.
  • the method for synthesizing a nucleic acid of the present invention can be applied to gene closing. Cloning of a gene based on the PCR method is performed by digesting the reaction product of the PCR method with a restriction enzyme and inserting the product into a cloning vector. Similarly, the LAMP product can be used as a fragment for integration into a cloning vector by digesting the LAMP product with an appropriate restriction enzyme.
  • the LAMP product can be used not only for synthesizing a nucleic acid to be immobilized on a DNA chip, but also for preparing a labeled probe. That is, it is possible to prepare a labeled probe by primer extension using the LAMP product as ⁇ S. Since the LAMP method produces a large amount of DNA, the labeled probe can be easily prepared in a large amount. The labeled probe prepared in this way is useful as a probe for hybridization or analysis using a DM chip.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention can be used for obtaining a gene for expression.
  • the amino acid sequence of the protein The average was predicted to be 352 amino acids. This corresponds to 1056 bp of DNA.
  • DNA of at least about 500 bp can be amplified. In other words, about half the area of the average human protein can be enhanced.
  • Functional analysis of proteins has been positioned as an important research theme for the bost genome generation. For that, it is necessary to express the protein. It is believed that the present invention can contribute to the amplification of the translation region of a gene.
  • nucleic acids can be detected or quantified using the product of the nucleic acid amplification method of the present invention as an index. That is, when a primer designed for the purpose of amplifying a specific nucleotide sequence is used, a large amount of product is generated, which means that the nucleotide sequence is present in the sample. Furthermore, the abundance of the nucleic acid containing the target base sequence in the sample can be compared using the signal intensity or the reaction time required to reach a certain signal intensity as an index.
  • Nucleic acids synthesized by the LAMP method are composed of complementary base sequences, although they are single-stranded, and most of them form base pair bonds. By utilizing this feature, it is possible to detect synthetic products. If the method for synthesizing a nucleic acid according to the present invention is carried out in the presence of a fluorescent dye which is a double-strand-specific interpolator such as ethidium promide, SYBR Green I, or Pico Green, an increase in the product A corresponding increase in the fluorescence intensity is observed.
  • a fluorescent dye which is a double-strand-specific interpolator such as ethidium promide, SYBR Green I, or Pico Green
  • mutations can be detected based on the nucleic acid amplification method of the present invention. ⁇ If the nucleic acid does not have the expected base sequence, any complementary strand synthesis reaction that constitutes the method for synthesizing or amplifying the nucleic acid of the present invention is inhibited so that the reaction is generated. Mutation can be detected using the amount or presence or absence of the substance as an index. The method for detecting a mutation according to the present invention is specifically described below.
  • the method for synthesizing or amplifying a nucleic acid of the present invention comprises a plurality of complementary strand synthesis reactions.
  • the complementary strand synthesis reaction starting from the 3 ′ of the insert primer or the complementary strand synthesis reaction starting from the 3 ′ end of the complementary strand synthesized using the insert primer is a unique feature of the present invention. It is a reaction.
  • at least one of the two types of complementary strand synthesis reactions related to these insert primers is controlled by the nucleotide sequence of the nucleic acid.
  • the base sequence at the 5' end of the insert primer does not become a complementary base sequence. It is desirable to do so.
  • the insert primer described as [[insert primer 2 for synthesizing a continuous target base sequence in S nucleic acid]] may be used.
  • the complementary strand synthesized using the insert primer as type II always anneals to the region consisting of the target base sequence, and the base sequence check mechanism operates.
  • the nucleic acid synthesized using the insert primer as the base sequence is based on the base sequence derived from the base sequence of the insert primer. Will be anneal. Unless the base sequence derived from the target base sequence is annealed, the base sequence cannot be checked.
  • the insert primer may be designed so that the region near the Z or 5 'end corresponds to the region where the mutation is to be detected. More specifically, if the design is designed such that the mutation to be detected is located in the region from 3 ′ ⁇ ® to 53 ⁇ 4S, more preferably 2 to 4 bases, the complementary strand synthesis is performed by changing the base sequence in the type III nucleic acid. The reaction can be adjusted. It is needless to say that the base sequence can be designed under the same conditions in the case where the synthesis of the complementary strand is adjusted with 3, of the complementary strand synthesized using the insert primer as the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the complementary strand synthesis reaction starting from the 3 'end of the inner primer or the 3' end of the complementary strand synthesized using the inner primer as ⁇ M is used. It can also be regulated by nucleic acid mutations.
  • the base sequence of each primer is designed so that the vicinity of 3 ′, which is the starting point of phase capture synthesis, corresponds to the mutation to be detected.
  • a mutation check mechanism is required since the 3 'of the complementary strand synthesized using the inner primer as a anneal many times to the region consisting of the base sequence derived from, and serves as a starting point for complementary strand synthesis.
  • the interval between the insert primer and the inner primer can be freely set, so that there is no problem even if the mutation to be detected is distant.
  • various analysis methods can be used in accordance with the type of mutation to be detected.
  • the analysis method according to the present invention will be described using an example in which two SNPs A and B are linked to a specific trait.
  • a and B are a combination of specific bases
  • design primers so that a complementary strand synthesis reaction is formed only for that combination.
  • the formation of the reaction product means that the bases A and B in the nucleic acid contained in the sample are both bases to be detected. I have.
  • any combination of bases can be detected for two SNPs.
  • B is not any of ate, that is, g. Therefore, the base of this nucleic acid can be determined to be A-aZB_g. That is, all combinations of two bases can be determined by using 12 combinations.
  • the method for detecting a mutation according to the present invention is excellent in specificity.
  • the primer is annealed to the nucleic acid copied with the primer as ⁇ M, and a complementary strand synthesis reaction is performed. Therefore, it is considered difficult to detect a single base mutation.
  • the complementary strand synthesis reaction is controlled by a region that anneals to a base sequence derived from waking. That is, the mutation can be detected more specifically.
  • reagents required for the nucleic acid synthesis method or amplification method according to the present invention can be packaged in advance and supplied as a kit.
  • various oligonucleotides required as insert primers, inner primers, outer primers, or loop primers, dNTPs as substrates for complementary strand synthesis, and complementary strand synthesis with strand displacement A kit comprising a DNA polymerase to be carried out, a buffer for providing suitable conditions for the enzymatic reaction, and, if necessary, reagents necessary for separating and cleaving the synthesis reaction product is provided.
  • kits of the present invention when the kit of the present invention is aimed at detecting a nucleic acid, a detecting agent for detecting a nucleic acid synthesized by the synthesis method of the present invention can be combined. Or In a kit for obtaining a DNA encoding a fusion protein based on the above description, a DNA encoding a fusion partner can be combined with the kit.
  • the addition of reagents during the reaction is unnecessary, so that the reagent necessary for one reaction is supplied in a dispensed state to the reaction vessel, and the reaction is performed only by adding the sample. Can be started. If the system is designed so that the required DNA can be prepared in the reaction container, the opening of the container after the reaction can be completely abolished. This is very desirable in preventing contamination.
  • FIG. 1 is a diagram showing a basic reaction principle of a nucleic acid synthesis method according to the present invention.
  • the 3 'end of each chain is indicated by an arrow.
  • FIG. 2 shows the basic reaction principle of the nucleic acid synthesis method according to the present invention (continuation of FIG. 1).
  • FIG. 3 is a diagram showing the basic reaction principle of the nucleic acid synthesis method according to the present invention (continuation of FIG. 2).
  • FIG. 4 is a diagram showing the basic reaction principle of the nucleic acid synthesis method according to the present invention (continuation of FIG. 3).
  • FIG. 5 shows the basic reaction principle of the nucleic acid synthesis method according to the present invention (continuation of FIG. 4).
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing the positional relationship of the inner primer and the insert primer set in the example with respect to the nucleic acid to be activated.
  • FIG. 7 is a photograph showing the result of agarose electrophoresis of a reaction product of the LAMP method using an insert primer. Each lane shows the following result in order from the left! / Lane 1: 10 Obp DNA ladder
  • Lane 3 Insert primer 10 pmol / 25 / z L added
  • Lane 7 Insert primer 50 pmol / 25 / z L inlet
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of agarose gel electrophoresis of a reaction product of the LAMP method using an insert primer, which was digested with a restriction enzyme BamHI. Each lane shows the following results from left to right
  • Lane 2 1: BamHr digest of product (when insert primer was not used)
  • Lane 3 +: BamHI digest of product (when insert primer was used) The figure which shows the positional relationship of a primer.
  • FIG. 10 is a photograph showing the result of agarose electrophoresis after digestion of the reaction product of the LAMP method using an insert primer that anneals to a distant position on type III with the restriction enzyme EcoRV.
  • FIG. 11 is a diagram showing a design position of an insert primer.
  • FIG. 12 is a photograph showing the result of electrophoresis of a LAMP product.
  • FIG. 13 is a photograph showing the result of digesting the LAMP product with the restriction enzyme BssHII and performing agarose gel electrophoresis.
  • Lane 5 InsF2 / R2, BssHII digest Best mode for carrying out the invention
  • nucleic acid synthesis reaction Using the 387b P DNA fragment inserted into the pBSTspRI vector as, a nucleic acid synthesis reaction according to the present invention was performed under the following reaction conditions.
  • the nucleotide sequence of the nucleic acid used as the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1 (base sequence of human 'interleukin 8 gene).
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 includes a region that recognizes each primer.
  • Various primers having the base sequences described below were synthesized and used for this nucleic acid.
  • Inner primer F / Inner F (SEQ ID NO: 2)
  • Insert primer / Insert R (SEQ ID NO: 7)
  • Lane 2 Insert primer 10 pmol / 25 / i L
  • Lane 3 Insert primer 20 pmol / 25 / z L added
  • Lane 4 Insert primer 30 pmol / 25 / L added
  • Lane 5 Insert primer 40 pmol / 25 / L added
  • the above reaction product was digested with BamHI to confirm that it had the desired structure. While the fragments produced according to the theory were generated by restriction enzyme digestion, if the high-sized smeared pattern and the unmigrated band observed in FIG. 7 disappeared, all of these fragments were synthesized according to the present invention. It can be confirmed that the nucleic acid has a complementary base sequence linked on the chain.
  • a reaction product using an insert primer of 40 pmol / 25 L was used.
  • the digest was run on a 2% agarose gel at 100 V for 30 minutes. After electrophoresis, the gel was stained with Etbr to detect nucleic acids. As the molecular weight marker, 10 Obp DNA ladder (NEW ENGLA D BioLabs) was used. The results are as shown in FIG. Each lane corresponds to the next sample.
  • Lane 2 BamHI digest of the product (when no insert primer is used)
  • Lane 3 +: BamHI digest of the product (when the insert primer is used) If the insert primer has not been added, this is the target. No pande could be confirmed, but the added one detected a pande around 400 bp. The region between the inner primers is 396 bp.
  • BssHII digestion was performed to confirm that the LAMP product had the desired structure.
  • the 25/251 reaction solution containing the reaction product was purified using a QIAquic PCR purification kit, and eluted with 50 / il Tris / HCl pH 8.0. Of these, 1 ⁇ 1 was digested with BssHII at 37 ° C for 1 hour. If the ladder-formed amplification product in FIG. 12 is digested with BssHII, the portion corresponding to the sequence sandwiched by BssHII in FIG. 11 should be produced as a main band of about 600 bp.
  • the digest was electrophoresed on a 2% agarose gel at 100 V for 30 minutes. After electrophoresis, the gel was stained with EtBr to detect nucleic acids. As a marker, a 100 bp DNA ladder (NEW ENGLAND Bio Labs) was used. As a result, a pan was confirmed at the expected position (Fig. 13). This time, the region between the inner primers is 536 bp. As described above, even when another mirror type was used, the use of the insert primer could easily amplify a relatively long primer. Further, in this example, two types of insert primers (InsF / R and InsF2 / R2) were designed, and it was possible to amplify either primer.
  • InsF / R and InsF2 / R2 two types of insert primers
  • oligonucleotides having the following nucleotide sequences were used as an inner primer, an insert primer, and an outer primer.
  • a sense or antisense of an arbitrary sequence CATCAAATAT was added as a linker sequence.
  • the insert primer F / Insert F and the insert primer: / Insert R each anneal to a distant region of IDA.
  • the part shown in [Deletion] located in the middle part was deleted as shown in Fig. 9, and the base connecting the two regions between the arrows was linked via the linker sequence CATCAAATAT.
  • the target base sequence consisting of the sequence should be synthesized.
  • the number of bases between F1 / R1 in Fig. 9 was 5 bp in type II (upper in Fig. 9), It is synthesized as a 6 bp target nucleotide sequence (lower in Fig. 9).
  • Example 1 prepare a DNA that does not undergo thermal transformation '
  • the following concentrations of the primers were added to the reaction solution having the composition, and reacted at 65 ° C. for 4 hours.
  • LDNA (1 ⁇ 10 6 molecules) as type I
  • a synthesis reaction of the nucleic acid of the present invention was performed under the conditions described above.
  • the reaction solution of 25 / ⁇ was purified using a 0 ⁇ ( ⁇ : 1 ⁇ 1 ⁇ PCR purification kit (QIAGEN) and eluted with Tris / HCl pH 8.0, of which 1 ⁇ L was extracted with EcoRV. Digested for 1 hour at ° C.
  • the nucleotide sequence of the above reaction product was determined.
  • the vector (pBlue script) previously digested with EcoRV and the reaction product digested with EcoRV were ligated to obtain pBS525 / EcoRV. Furthermore, this vector was transformed into a competent cell (DH5). After cloning and growing the transformed E. coli, The plasmid was recovered by the SDS method.
  • the sequencing reaction was performed using Cy5.5-labeled vector-specific primer, ThermoSequenas e Cycle Sequencing Kit (Amersham pharmacia biotech II), and the base sequence was determined using the TYPEFIMA method. It was determined using the (Fuarumashiane ring model S e q4x4).
  • Each insert primer has a 10-base linker sequence (CATCAAATAT), which is a complementary base sequence.
  • CAAATAT 10-base linker sequence
  • a sequence occurs through this sequence to initiate DNA synthesis. This can be expected to yield a sequence in which the region flanked by the insert primers ([deletion] in FIG. 9) has been deleted.
  • DM consisting of the predicted nucleotide sequence was synthesized.
  • a deletion mutation can be obtained by using an insert primer.
  • an insert primer to which a base sequence other than the target base sequence was added, a base could be inserted into the amplified sequence.
  • a new method for synthesizing a nucleic acid which was not known by the known LAMP method, is provided while utilizing the principle of the LAMP method. According to the nucleic acid synthesis method of the present invention, the following new advantages can be expected.
  • the nucleic acid synthesis method of the present invention can synthesize a long target base sequence in a base sequence-specific manner.
  • the LAMP method of ⁇ P in which primers are set at the end of the target nucleotide sequence, depending on the conditions, non-specific synthetic Sometimes a product was formed. Non-specific synthesis products imply reduced yields in nucleic acid synthesis.
  • the method of the present invention suppresses the production of nonspecific by-products even with a long target nucleotide sequence of, for example, more than 400 nucleotides, and can rapidly produce the target nucleic acid. Can be synthesized.
  • the nucleic acid synthesis method of the present invention is useful for synthesizing a probe to be immobilized on a DNA microarray. It has already been mentioned that DNA having a length of several hundred bases is required for a probe to be immobilized on a DNA microarray. According to the present invention, DNA having a length of 400 bases or more can be synthesized quickly and easily. Also, since the LAMP method is originally a method that can be expected to be highly specific to ⁇ M, high accuracy can be expected for the synthesized product.
  • a primer is set not only at the target base sequence but also at the middle. Using this feature, mutations can be introduced in the middle of the target base sequence. Even in the PCR method, which is now widely used as a method for synthesizing a gene, the primer is not set at a part of the target base sequence. Therefore, a technique capable of introducing a mutation into the central portion of a target nucleotide sequence as in the present invention is very useful as a technique for gene manipulation.
  • nucleic acid consisting of a base sequence obtained by linking a plurality of regions located at a distance in a nucleic acid can be obtained. This feature enables the present invention to freely synthesize mutants in which any region of a nucleic acid has been deleted.
  • nucleic acid having an arbitrary region selected from different nucleic acids as one continuous base sequence can be obtained by the nucleic acid synthesis method or the amplification method of the present invention. Due to this feature, the present invention regards freely synthesizing a gene encoding any fusion protein as g.

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Description

核酸を合成する方法 技術分野
本発明は、 ,に対して相補的な塩基配列で構成される核酸を合成する方法に 関する。 背景技術
核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、 遺伝的な特徴を直接的に分析する ことが可能である。 そのため、遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有- 力な手段である。 また遺伝子そのものを検出対象とするために、 例えば培養のよ うな時間と手間のかかる操作を省略できる ¾ ^もある。
とはいえ試料中に存在する目的の遺伝子量が少ない場合の検出は一般に容易で はなく、 標的遺伝子そのものを、 あるいは検出シグナル等を増幅することが必要 となる。 標的遺伝子を増幅する方法の一つとして Polymerase Chain Reaction (PC R)法が知られている（Science, 230， 1350-1354， 1985)。 PCR法は、 in vitroにおける 核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法である。 その指数的な増幅効果に基 づく高い感度により優れた検出方法として定着した。また、増幅生成物を DNAとし て回収できることから、 遺伝子ク口一二ングゃ構造決定などの遺伝子工学的手法 を支える重要なツールとして幅広く応用されている。 しかし PCR法においては、実 施のために特別な温度調節装置が必要なこと；増幅反応が指数的に進むことから 定量性に問題があること；試料や反応液が外部からの汚染を受け、 誤って混入し た核酸が として機能してしまうコンタミネ一ションの影響を受け易いこと等 の問題点が指摘されている。 ,
ゲノム情報の蓄積に伴って、 1塩基多型 (S Ps; single nucleotide polymorph ism)の解析が注目されている。 プライマーの塩基配列に SNPsを含むように設計す ることによって PCRを利用した SNPsの検出が可能である。すなわち、反応生成物の 有無によってプライマーに相補的な塩基配列の有無を知ることができる。しかし P CRにおいては、 万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合には、 その生成 物が以降の反応の,として機能して誤った結果を与える原因となる。現実には、 プライマーの末端における 1塩基の相違のみでは、 PCRを厳密に制御することは難 しいといわれている。 したがって、 PCRを SNPsの検出に利用するには特異性の改善 が必要とされている。
一方リガーゼに基づく核酸合成方法も実用化されている。 LCR法 (Ligase Chai n Reaction, Laffler TG; Carrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (Pari s) , 1993, 51:9, 821 - 6)は、検出対象となる配列上において ¾する 2つのプロ ープをハイプリダイズさせ、 リガーゼによって両者を連結する反応が基本原理に なっている。 標的塩基配列が存在しない^^には 2つのプローブを連結すること はできないので、連結生成物の存在は標的塩基配列の指標となる。 LCR法も合成し た相補鎖と,との分離に温度制御が必要となることから、 PCR法と同じ問題点を 伴っている。 LCRについては、 隣接するプロープの間にギャップを設け、 これを D NAポリメラーゼで充填する工程を加え特異性を改善する方法も報告されている。 し力、し、 この改良方法によって期待できるのは特異性のみであり、 温度制御を要 求する点については依然として課題を残している。 し力も、 必要な酵素が増える ため、 コストを犠牲にしているといえる。
検出対象配列を として相補的な配列を持つ DNAを増幅する方法には、 Stran d Displacement Amplification (SDA)法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396 ; 1 992] [Nucleic Acid. Res.， 20， 1691 - 1696; 1992]と呼ばれる方法も知られている。 S M法は、 ある塩基配列の 3，側に相補的なプライマーを合成起点として相補鎖合成 を行うときに、 5，側に 2本鎖の領域が有るとその鎖を置換しながら相補鎖の合成 を行う特殊な DNAポリメラーゼを利用する方法である。なお以下本明細書において 単に 5'側、 あるいは 3'側と表現するときには、 いずれも «となっている方の鎖 における方向を意味している。 5'側の 2本鎖部分が新たに合成された相補鎖によ つて置換 (displacement)されることから SM法と呼ばれて 、る。 SDA法では、 プラ イマ一としてァニールさせた配列に予め制限酵素認識配列を揷入しておくことに よって、 PCR法においては必須となつ Tいる温度変ィ匕工程の省略を実現できる。す なわち、 制限酵素によってもたらされるニックが相補鎖合成の起点となる 3' -0H 基を与え、 そこから鎖置換合成を行うことによって先に合成された相補鎖が 1本 鎖として遊離して次の相補鎖合成の铸型として再利用される。このように SM法は PCR法で必須となっていた複雑な温度制御を不要とした。
しかし、 SDA法では鎖置 の DNAポリメラーゼにカ卩え、 必ずニックをもたらす 制限酵素を組み合わせる必要がある。 必要な酵素が増えるということは、 コスト アップの要因である。 また、 用いる制限酵素によって 2本鎖の切断ではなくニッ クの導入 （すなわち一方の鎖だけの切断） を行うために、 一方の鎖には酵素消化 に耐性を持つように合成の際の基質として チォ dNTPのような dNTP誘導体を利用 しなければならな 、。このため、 SDAによる増幅産物は天然の核酸とは異なつた構 造となり、 制限酵素による切断や、 増幅産物の遺伝子クローニングへの応用とい つた利用は制限される。 またこの点においてもコストアップの要因を伴っている といえる。力 Qえて、未知の配列に SDA法を応用するときには、合成される領域の中 に二ック導入のための制限酵素認識配列と同じ塩基配列が存在する可能性を否定 できない。 このようなケースでは完全な相補鎖の合成が妨げられる心配がある。
DNA- RNAのキメラオリゴヌクレオチドを利用して、 RNA部分を酵素的に除去する ことにより、 3' - 0H¾を供給する方法も^ Pである。 たとえば Isothermal and Ch imeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids (ICANfe、 W000/568 77) と名付けられた核酸の合成方法においては、 3'側が腿で構成されたキメラォ リゴヌクレオチドをプライマーとして用いる。 相捕鎖合成の後に、 RNAseHの作用 によってこのオリゴヌクレオチドの RNA部分が消化され、 新たな 3， - 0H基が連続的 に供給される。 一連の反応は等温で進行させることができるとされている。 しか し、プライマ一に用いるオリゴヌクレオチドは、 DNA - RNAキメラオリゴヌクレオチ ドでなければならない。また、 RNAを除去するための酵素なども必要となるため、 前述の SDA法と同様の問題点を有するといえる。
複雑な温度制御を不要とする核酸の増幅方法として、 Nucleic Acid Sequence- based Amplification (NASBA、TMA/Transcription Mediated Amplification法とも 呼ばれる）が公知である。 NASBAは、標的腿を顏として T7プロモーターを付加し たプロープで DNAポリメラーゼによる DNA合成を行い、 これを更に第 2のプロープ で 2本鎖とし、生成する 2本鎖 DNAを铸型として T7 RNAポリメラーゼによる転写を 行わせて多量の腿を増幅する反応系である（Nature, 350, 91-92， 1991)。NASBAは 2 本鎖 DNAを完成するまでにいくつかの加熱変性工程を要求するが、 以降の T7 RNA ポリメラーゼによる転写反応は等温で進行する。 しかし、逆転写酵素、 R aseH, D NAポリメラーゼ、 そして T7 RNAポリメラーゼといつた複数の酵素の組み合わせが 必須となることから、 SMと同様にコストの面では不利である。また複数の酵素反 応を行わせるための条件設定が複雑なので、 一般的な分析方法として普及させる ことが難しい。 このように公知の核酸増幅反応においては、 複雑な温度制御の問 題点、 あるいは複数の酵素が必要となることといった課題が残されている。
更に、 これらの公知の核酸合成反応について、 特異性やコストを犠牲にするこ となく核酸の合成効率を更に向上させる試みについては、 ほとんど報告が無い。 たとえば、 Rolling-circle amplification (RCA)と呼ばれる方法では、標的塩基配 列の存在下でパドロックプロープ (padlock probe)に相補的な^ ¾配列が連続し た 1本鎖の DNAを継続して合成できることが示された (Paul M. Lizardi et al， Nat ure Genetics 19, 225 - 232， July, 1998)。 RCAでは、 1本のォリゴヌクレ才チドの 5'末端と 3' ¾が LCRにおける隣接プローブを構成する特殊な構造のパドロック プローブが利用される。 そして鎖置^ Sの相補鎖合成反応を触媒するポリメラー ゼを組み合わせることにより、 標的塩基配列の存在下でライゲーションされ環化 したパドロックプローブを^ Mとする連続的な相補鎖合成反応がトリガーされる。 同じ塩基配列からなる領域が繰り返し連続した構造を持つた 1本鎖核酸が生成さ れる。 この 1本鎖核酸に対して更にプライマーをァニールさせてその相補鎖の合 成を行って、 高度な増幅を実現している。 しカゝし、 複数の酵素が必要な点は依然 として残された課題である。 また、 相補鎖合成のトリガーは、 2つの隣接領域の 連結反応に依存しており、 その特異性は原理的に LCRと同じレベルである。
3' - 0Hの供給という■に対しては、 3' に同一鎖上の塩基配列に相補的な配 列を持たせ、 末端でヘアピンループを形成させる方法が公知である（Gene 71, 29- 40, 1988)。 このようなヘアピンループからは、 自身を铸型とした相補鎖合成が行 われ、 相補的な塩基配列で構成された 1本鎖の核酸を生成する。 たとえ «PCT/FR 95/00891では、 相補的な塩基配列を連結した末端部分で同一鎖上にァニールする 構造を実現している。 しかしこの方法では、 が相補鎖との塩基対結合 (base pairing)を解消して改めて同一鎖上で塩基対結合を構成するステップが必須であ る。 このステツプは塩基対結合を伴う相補的な塩基配列同士の «における微妙 な平衡状態に依存して進むとされている。 すなわち、 相補鎖との塩基対結合と、 同一鎖上での塩基対結合との間で維持される 状態を利用し、 同一鎖上の塩基 配列とァニールしたもののみが相補鎖合成の起点となる。 したがって、 高度な反 応効率を達成するためには、 厳密な反応条件の設定が求められるものと考えられ る。 更にこの先行技術においては、 プライマー自身がループ構造を作っている。 そのためプライマーダイマーがいったん生成すると、 標的塩基配列の有無にかか わらず自動的に増幅反応が開始され非特異的な合成産物を形成してしまう。 これ は重大な問題点といえる。 更に、 プライマーダイマーの生成とそれに伴う非特異 的な合成反応によるプライマーの消費が、 目的とする反応の増幅効率の低下につ ながる。
その他に、 DNAポリメラ一ゼに対して^ Mとならない領域を利用して同一鎖にァ 二一/レする 3，末端構造を実現した報告 (EP713922)がある。 この報告も 部分に おける動的 ffiを利用している点、 あるいはプライマーダイマー形成にともなう 非特異的な合成反応の可能性においては先の PCT/FR95/00891と同様の問題点を持 つ。更に、 DNAポリメラーゼの讓とならない特殊な領域をプライマ一として用意 しなければならない。
また前記 NASBAの原理を応用した各種のシグナル増幅反応においては、 2本鎖の プロモータ一領域を供給するためにしばしば末端でヘアピン状の構造を伴ったォ リゴヌクレオチドが利用される （特開平 5- 211873) 。 しかしこれらは、 相補鎖合 成の 3' - 0Hの連続的な供給を可能とするものではない。 更に特表平 10- 510161 (W09 6/17079)においては、 RNAポリメラーゼによって転写される DNA を得ることを 目的として同一鎖上に 3'末端をァニールさせたヘアピンループ構造が利用されて いる。 この方法では、 R Aへの転写と、 R Aから DNAへの逆転写を利用して,の増 幅が行われる。 しかし、 この方法も複数の酵素を組み合わせなければ反応系を構 成できない。
この他、 5'末端にプライマーの伸長生成物の塩基配列に相補的な塩基配列を有 するプライマーを用いた核酸の増幅反応が報告されている。 この報告によれば、 相補鎖が合成されると、プライマーの 5' «が相補的な 配列に対して結合し、 その結果として初めにプライマーがァニールした領域が開放され、 新たなプライ マーのァニールが起きるとされている（EP971039)。 この報告は、 等温でプライマ 一のァニールが可能な領域を連続的に供給することは実現する力^ 基本的な原理 は PCR等に頼っている。 したがって、 先に述べたような、 PCRにおける反応特異性 の問題を改善することはできない。
これに対して本出願人は、等温条件で実施することができ、しかも PCRに比較し て、 反応特異性を高い水準に維持することができる新規な核酸の合成方法を開発 し特許出願した（W000/28082)。 そしてこの方法を Loop - mediated isothermal amp lification (以下 LAMP法と省略する） と名付けた（Τ· Notomi et al. , Nucleic Ac id Res. , 2000， Vol. 28, No. 12， e63)。 更に本出願人は、 LAMP法を応用した S Psの検出方法についても報告している（T he 3rd international Workshop on Advanced Genomics 2000. 11. 13〜丄 4 ； Yok ohama, A Novel SNP Typing Technology Based on the Nucleic Acid Amplifica tion Method, LAMP KANDA, Hidetoshi et al. )。 LAMP法には、 の塩基配列が 設計とは異なっていたときに核酸の増幅反応が著しく阻害されるという特徴があ る。 この特徴により、 LAMP法に基づく変異の検出方法は、 検出感度を犠牲にする ことなく高い特異性を実現した。 発明の開示
本発明の課題は、 LAMP法の反応原理を応用した新たな核酸の合成方法を提供す ることである。
LAMP法は、 高度な反応特異性を等温で達成することができる核酸の合成方法で ある。 本発明者は、 この方法を応用して、 更に新たな核酸の合成原理を確立する ために研究を重ねた。 その結果、 特定の構造を有する核酸と LAMP法を応用するこ とによって、新しい原理で核酸の合成を行うことができることを見出した。更に、 この反応原理に基づいて、 の LAMP法では知られていなかった、 様々な効果を 達成できることを見出し本発明を完成した。 すなわち本発明は、 以下の核酸の合 成方法、 そのためのキット、 並びにそれらの用途に関する。
〔1〕 次の工程を含む、 標的塩基配列を含む核酸の合成方法。
( 1 ) 5'側から 3'側にかけて次の領域 (a)-(d)を含む、少なくとも 2種類の 1 本鎖の核酸を生成する工程、 ここで前記 2種類の 1本鎖核酸は、その 3'末端 にお ヽて相補的な塩基配列を有し、力、つ標的:！ ¾配列から選択された塩基配 列を含む。
(a)同一鎖上の任意の領域に相捕的な塩基配列からなる領域、
(b)領域 (a)が同一鎖上の任意の領域に対してハイプリダイズしたときにルー プを形成する領域、 (c)領域 (a)に相補的な塩基配列を含む領域、 および
(d) 3'末端を構成する塩基配列からなる領域
( 2 ) 工程 ( 1 ) の少なくとも 2種類の 1本鎖の核酸を、 その 3'末端にお いてァニールさせ、鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼに よって相補鎖を合成する工程、 および
( 3 ) 工程 ( 2 ) で合成された核酸の 3'«を、 同一鎖上の相補的な塩基 配列からなる領域にァニールさせ、 その 3' を起点として相補鎖を合成し、 標的塩基配列からなる 1本鎖の核酸を合成する工程、
〔 2〕 工程 （ 1 ) の 1本鎖の核酸の少なくとも 1種類力 領域 (a)と領域 (c)のハイ プリダイズによって、相補鎖を伴わない 3'«を形成する構造を有する核酸 である 〔1〕 に記載の方法。
〔3〕 工程 （1 ) の 1本鎖の核酸の少なくとも 1種類が、領域 (a)と領域 (c)のハイ ブリダィズによって、相補鎖を伴った 3'末端を形成する構造を有する核酸で ある 〔1〕 、 または 〔2〕 に記載の方法。
〔4〕 工程 ( 1 ) の 1本鎖の核酸を、 以下の工程によって生成する 〔1〕 に記載 の方法。
i)標的塩基配列を含む核酸を醒として、 少なくとも 1組のィンサートブラ イマ一を用いて相補鎮を合成する工程；ここでィンサートプライマーを起点 として合成された相補鎖は、 その 5'¾«を構成する塩基配列が互いに相補的 な塩基配列からなっており、 そして
ii)ェ齒)の生成物を,として、 標的塩基配列の 5' に相補的な塩基配列 を 3'末端に有し、カゝっその 5' に前記 3' を起点として合成される相補鎖 の任意の領域に対して相補的な塩基配列を有するインナープライマーで相 補鎖を合成し、 工程 ( 1 ) に記載の 1本鎖核酸を生成する工程
〔5〕 インサートプライマーが、 互いに相補的な塩基配列を 5'末端に有する少な くとも 1組のインサートプライマーである 〔4〕 に記載の方法。 〔6〕 インサートプライマーが、 その 5'末端における互いに相補的な塩基配列が RNAで構成され、 かつ 3'末端が RN a s e耐性のポリヌクレオチドから構 成されており、 DNAとハイブリダィズした該 RNAを RN a s eによって 消化する工程を含む 〔5〕 に記載の方法。
〔7〕 インサートプライマーが、 標的塩基配列中の任意の領域において相補鎖の 合成起点となる第 1のィンサートプライマ一と、このィンサ一トプライマー を起点とする伸長生成物に含まれる標的塩基配列中の任意の領域において 相補鎖の合成起点となる第 2のィンサートプライマーとの組み合わせから なる 〔4〕 に記載の方法。
〔8〕 工程 （1 ) の 1本鎖の核酸を、 以下の工程によって生成する 〔1〕 に記载 の方法。
り次の条件を有する少なくとも 2種類の 1本鎖の核酸を生成する工程、 a) 5'末端を含む領域と 3' を含む領域が相補的な塩基配列で構成される、 b) a)の相補的な塩基配列からなる領域がハイブリダイズしたときにループ を形成する塩基配列によって、 この相補的な塩基配列が連結されている、 c)一方の核酸の 3'末端は他方の核酸の 3'¾«に相補的な塩基配列を有する、 および
d)該 1本鎖核酸を構成する塩基配列が、標的塩基配列から選択される塩基配 列を含む
ii)ェ @i)の 1本鎖の核酸におけるループにァニールして相補鎖合成の起点 となるプライマーであって、その 5'5¾に該プライマーを起点として合成さ れる相補鎖に相補的な驢配列を有するプライマーをァニールさせ、 その 3' 末端を起点として鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラー ゼによって、 相補鎖を合成するとともに、 ェ @i)の 1本鎖の核酸の 3'末端を 置換して塩基対結合が可能な状態とする工程、
iii)ェ @ii)によつて塩基対結合が可能となった を相互にァニールさ せ、 その 3'末端を起点として相補鎖を合成するとともに、 工程りで合成した 相補鎖を置換して工程 (1) の 1本鎖の核酸を生成する工程、
〔9〕 前記工程 (1) の 1本鎖の核酸を以下の工程によって生成する 〔1〕 に記 載の方法。
( a )標的塩基配列を含む核酸を,としてィンナープライマーをァニール させ、 その 3'末端を起点として相補鎖を合成する工程；ここでィンナーブラ イマ一は、 標的塩基配列の 5'末端に相補的な塩基配列を 3 ' に有し、 カゝっ その 5'末端に前記 3'¾¾を起点として合成される相補鎖の任意の領域に対し て相補的な塩基配列を有し、
(b) 工程 (a) の生成物にインサートプライマーをァニールさせ、 その 3' 末端を起点として相補鎖を合成する工程；ここでィンサートプライマーはェ 程 （a) の生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を 3'末端に備え、 かつその 5'末端の塩基配列は 〔 1〕 における 2種類の 1本鎖核酸のいずれか の 3'末端を構成する塩基配列に相補的な塩基配列からなり、 そして
(c) 工程 (b) で合成された相補鎖を 1本鎖とし、 その 3'«を自身にァ ニールさせ、 その 3'5 ^を起点として相補鎖を合成し、 前記工程 （1) の 1 本鎖の核酸を生成する工程
〔1 0〕 工程 （a) の標的塩基配列を含む核酸が、 〔1〕 における工程 (2) の 生成物である 〔9〕 に記載の方法。
〔1 1〕 2種類の 1本鎖の核酸が、 いずれも同一の羅に由来する塩基配列を含 む、 〔1〕 に記載の方法。
〔1 2〕 2種類の 1本鎖の核酸に含まれる塩基配列が、 ,において連続してい る 〔 1 1〕 に記載の方法。
〔1 3〕 2種類の 1本鎖の核酸に含まれる塩基配列が、 ,において連続してい ない 〔1 1〕 に記載の方法。
〔14〕 2種類の 1本鎖の核酸力 S、異なる翻に由来する塩基配列を含む、 〔1〕 に記載の方法。
〕 次の工程を含む標的塩基配列を含む核酸の増幅方法。
(1) 5'側から 3'側にかけて次の領域 (a)-(d)を含む、少なくとも 2種類の 1 本鎖の核酸を生成する工程、 ここで前記 2種類の 1本鎖核酸は、 その 3'末端 におレヽて相補的な塩基配列を有し、かつ標的塩基配列から選択された塩基配 列を含む。
(a)同一鎖上の任意の領域に相補的な塩基配列からなる領域、
(b)領域 (a)が同一鎖上の任意の領域に対してハイプリダイズしたときにルー プを形成する領域、
(c)領域 (a)に相補的な塩基配列を含む領域、 および
(d) 3'末端を構成する塩基配列からなる領域
(2) 工程 （1) の少なくとも 2種類の 1本鎖の核酸を、 その 3'末端にお いてァニールさせ、鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼに よって相補鎖を合成する工程、
(3) 工程 (2) で合成された核酸の 3'«を、 同一鎖上の相補的な塩基 配列からなる領域にァニールさせ、 その 3' を起点として相補鎖を合成し、 標的塩基配列からなる 1本鎖の核酸を合成する工程、
(4) 工程 (3) の生成物を铸型として、 インナープライマー、および Z またはィンサートプライマーの 3'末端を起点として、鎖置換を伴なう相補鎖 合成反応を触媒する DNAポリメラーゼによって相補鎖を合成する工程、
( 5 ) 各プライマーからの伸長生成物の 5'側に位置する他のプライマーの 伸長生成物を置換して前記工程（1) の 1本鎖の核酸を生成するか、 または 該 1本鎖の核酸が、その 3'末端に同一鎖に対する相補的な塩基配列を有する ときには、 該 3'末端を自身にァニールさせ、 その 3'末端を起点として相補鎖 を合成して前記工程 (1) の 1本鎖の核酸を生成する工程、 および
(6) 工程 (5) で生成した核酸を用いて 〔1〕 に記載の方法を繰り返し、 標的塩基配列からなる核酸を増幅する工程
〔1 6〕 〔2〕 - 〔9〕 のいずれかに記載の方法によって生成された 1本鎖の核 酸を用いて、 〔1〕 一 〔7〕 のいずれかに記載の方法を開始する工程を含む、 標的塩基配列を含む核酸の増幅方法。
〔1 7〕 以下の要素をインキュベートする工程を含む、 標的塩基配列を含む核酸 を合成する方法。
(a)ィンナープライマー F；ここでィンナープライマー Fはその 3'末端にお いて前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対して ァニールし、 かつインナープライマー Fの 5'*¾には、 このプライマーを起 点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を 有する、
(b)ィンナープライマー R；ここでィンナ一プライマー Rはその 3'末端にお いて前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対して ァニールし、 かつインナ一プライマ一 Rの 5' 湍には、 このプライマーを起 点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を 有する、
(c)インサートプライマー F；ここでィンサートプライマー Fはその 3'末端 において前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の任意の領域に対して相補 的な塩基配列を有する、
(d)ィンサートプライマ一 R；ここでィンサートプライマー Rはその 3'末端 において前記標的塩基配列を構成する他方の鎖の任意の領域に対して相補 的な塩基配列を有し、力っィンサートプライマ一 Fとィンサートプライマー Rの各ブラィマーを起点とする合成生成物は、 両者の 5¾¾を含む領域に互 V、に相補的な塩基配列を有する、
(e)標的塩基配列を含む翻核酸、
(りヌクレオチド基質、 および (g)鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラーゼ
〔1 8〕 更に付加的に次の要素を存在させる 〔1 7〕 に記載の方法。
(h)アウタープライマー F；ここでアウタープライマー Fは、 顯におけ るインナープライマー Fがァユールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖 合成反応の起点となる、 および
(i)アウタープライマー R；ここでアウタープライマー Rは、鍵における インナープライマー Rがァニールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖合 成反応の起点となる、
〔1 9〕 更に付加的に次の要素を させる 〔1 7〕 に記載の方法。
①ループプライマー F ；ここでループプライマー Fの 3'¾«を含む領域は、 前記ィンナープライマー Fの 5'末端を含む領域が、ィンナープライマー Fを 起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイブリダイズす ることによって形成されるループ内の任意の領域に対.してァニールする、お よび
(k)ループプライマー R；ここでループプライマー Rの 3¾¾を含む領域は、 前記ィンナープライマー Rの 5'末端を含む領域が、 ィンナープライマー Rを 起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイプリダイズす ることによって形成されるループ内の任意の領域に対してァニールする
〔2 0〕 铸型核酸における前記標的塩基配列が 2本鎖であり、 前記各プライマ一 を起点とする相補鎖合成が可能な条件下でィンキュベートすることによつ て、各プライマーがァニールすべき領域を塩基対結合が可能な状態とするェ 程を含む、 〔1 7〕 に記載の方法。
〔2 1〕 鎵型核酸における前記標的塩基配列が 2本鎖であり、 変性工程の後にィ ンキュベートを開始する ？〕 に記載の方法。
〔2 2〕 融解温度調整剤の存在下でインキュベートする 〔1 7〕 に記載の方法。 〔2 3〕 融解温度調整剤が、 ベタイン、 プロリン、 ジメチノレスノレホキシド、 およ びトリメチルァミン N-ォキシドからなる群から選択される少なくとも 1つ の化合物である 〔2 2〕 に記載の方法。
〔2 4〕 〔1〕 、 または 〔1 7〕 に記載の核酸の合成方法、 若しくは 〔1 5〕 に 記載の核酸の増幅方法の反応生成物の量を測定する工程を含む、試料中に含 まれる铸型核酸の検出方法。
〔2 5〕 〔2 4〕 に記載の,核酸の検出方法に基づいて铸型核酸における変異 を検出する方法であって、 〔1 5〕 に記載の核酸の増幅方法において、イン サ一トプライマーの 3'末端を起点とする相補鎖合成反応力 核酸の塩基 配列が予測される塩基配列でなかったときに妨げられることを特徴とする、 変異の検出方法。
〔2 6〕 〔2 4〕 に記載の 核酸の検出方法に基づいて铸型核酸における変異 を検出する方法であって、 〔1〕 、 または 〔1 7〕 に記載の核酸の合成方法 において、 1本鎖の核酸の 3'末端を起点とする相補鎖合成反応が、鎵型核酸 の塩基配列が予測される塩基配列でなかったときに妨げられることを特徴 とする、 変異の検出方法。
〔2 7〕 〔4〕 に記載の核酸の合成方法、 または 〔1 5〕 に記載の核酸の増幅方 法を利用した変異の導入方法であって、ィンサ '一トプライマーが錄型核酸に 含まれる塩基配列とは異なる塩基配列を含むことを特徴とする、変異の導入 方法。
〔2 8〕 «核酸に含まれる塩基配列とは異なる塩基配列が、 インサートプライ マーの塩基配列に対する置換、欠失、および Zまたは付加によって構成され ている 〔2 7〕 に記載の方法。
〔2 9〕 以下の要素で構成される、 標的塩基配列を含む核酸を合成するためのキ ッ卜。
(a)ィンナープライマー F；ここでインナープライマー Fはその 3'末端にお いて前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対して ァニーノレし、 かつインナープライマー Fの 5'側には、 このプライマーを起点 とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を有 する、
(b)ィンナープライマー R；ここでィンナープライマー Rはその 3'末端にお いて前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対して ァユールし、 かつインナープライマー Rの 5'側には、 このプライマ一を起点 とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を有 する、
(c)ィンサートプライマー F；ここでインサートプライマー Fはその 3'末端 において前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の任意の領域に対して相補 的な塩基配列を有する、
(d)ィンサートプライマー R；ここでィンサートプライマー Rはその 3'末端 において前記標的塩基配列を構成する他方の鎖の任意の領域に対して相補 的な塩基配列を有し、力っィンサートプライマ一 Fとィンサートプライマー Rの各プライマーを起点とする合成生成物は、 両者の を含む領域に互 いに相補的な塩基配列を有する、
(e)ヌクレオチド基質、 および
鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラーゼ
〔3 0〕 更に付加的に次の要素を含む、 〔2 9〕 に記載のキット。
(g)アウタープライマー F； ここでアウタープライマー Fは、 におけ るインナープライマー Fがァユールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖 合成反応の起点となる、 および
(h)アウタープライマー R；ここで第 6のプライマーは、 におけるィ ンナープライマー Rがァユールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖合成 反応の起点となる、
〔3 1〕 更に付加的に次の要素を含む、 〔2 9〕 に記載のキット。 (i)ループプライマー F；ここでループプライマー Fの 3'¾Sを含む領域は、 前記ィンナープライマー Fの 5'末端を含む領域力 ィンナープライマ一 Fを 起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイブリダイズす ることによって形成されるループ内の任意の領域に対してァニールする、お ょぴ
①ループプライマー R；ここでループプライマー Rの 3' を含む領域は、 前記ィンナープライマー： Rの 5'末端を含む領域力 ィンナープライマ一 Rを 起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイプリダイズす ることによって形成されるループ内の任意の領域に対してァニールする 〔3 2〕 標的塩基配列が、 一つの顯核酸に由来する 〔2 9〕 に記載のキット。 〔3 3〕 インサートプライマーが、 核酸の塩基配列が予測と異なる塩基配列 であったときに、 ィンサートプライマーの 3'末端、 および Zまたはインサー トプライマーの 5'末端を鎳型として合成された相補鎖の 3'¾Sを起点とする 相補鎖合成反応が妨げられる塩基配列からなる、 〔2 9〕 に記載のキット。 〔3 4〕 試料中に含まれる錶型核酸の検出に用いるための 〔2 9〕 に記載のキッ
〔3 5〕 核酸の検出剤を付加的に含む 〔3 4〕 に記載のキット。
〔3 6〕 インサートプライマーが,核酸に含まれる塩基配列とは異なる塩基配 列を含むことを特徴とする、 〔2 9〕 に記載のキット。
〔3 7〕 標的塩基配列が異なる^ M核酸に由来する塩基配列を有する 〔2 9〕 に 記載のキット。
〔3 8〕 インナープライマー Fおよびインサートライマー Fの 3' が第 1の铸 型核酸に由来する塩基配列を合成するための起点となり、ィンナープライマ 一 Rおよぴィンサートプライマ一 Rが第 2の醒核酸に由来する塩基配列 を合成するための起点となり、力っィンサートプライマー Fとィンサートプ ライマー Rの 5'末端を含む領域において互いに相補的な塩基配列からなる 領域を含むことを特徴とする、 〔3 7〕 に記載のキット。
〔3 9〕 融合蛋白質をコードする遺伝子を合成するための、 〔3 7〕 に記載のキ ッ卜。
〔4 0〕 付加的に、 融合パートナーをコードする遺伝子を含む、 〔3 9〕 に記载 のキット。
核酸：本発明において、 核酸とは、 DNA、 または RNA、 あるいはそれらのキメラ 分子であることができる。 核酸は、 天然のものであることもできるし、 人工的に 合成されたものであることもできる。 また部分的に、 あるいは全体が完全に人工 的な構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、 それが塩基対結合を形成しう るものであるかぎり本発明の核酸に含まれる。 このような分子としては、 たとえ ばホスホチ才ェ一ト結合によつてバックボーンが形成されているポリヌクレオチ ド誘導体などを示すことができる。
本発明における核酸の構成塩基数は、 制限されない。 核酸は、 用語ポリヌクレ ォチドと同義である。 一方本発明におけるオリゴヌクレオチドとは、 ポリヌクレ ォチドの中でも特に構成塩基数が少ないものを示す用語として用いる。 一般にォ リゴヌクレオチドは、 2〜 1 0 0、 より一般的には、 2〜 5 0程度の塩基数のポ リヌクレオチドを指してオリゴヌクレオチドと呼ぶが、 これらの数値には限定さ れない。
本発明の核酸は、一般に生物学的な試料に含まれる。生物学的試料とは、動物、 植物、 あるいは微生物の組織、 細胞、 培養物、 排泄物あるいはそれらの抽出物を 示すことができる。 本突明の生物学的試料には、 ウィルスやマイコプラズマのよ うな細胞内寄生体のゲノム DNA、 あるいは RNAが含まれる。 また本発明の核酸は、 前記生物学的試料に含まれる核酸から誘導されたものであってもよい。たとえば、 mRNAをもとに合成された cDNAや、 生物学的試料に由来する核酸をもとに増幅され た核酸は、 本発明における核酸の代表的なものである。
標的塩基配列：本発明において標的塩基配列とは、 合成すべき核酸の塩基配列 を意味する。 すなわち、 本発明において合成を目的とする核酸を構成する塩基配 列が、 標的塩基配列である。 また本発明の核酸の合成方法に基づいて、核酸の増 幅を行う場合には、 増幅すべき核酸を構成する塩基配列が標的塩基配列である。 一般に核酸の塩基配列は、 5'側から 3'側に向けてセンス鎖の塩基配列を記載する。 本発明における標的塩基配列とは、 センス鎖の塩基配列に加えて、 その相補鎖、 すなわちアンチセンス鎖の塩基配列も含む。 すなわち、 用語 「標的塩基配列」 と は、 合成すべき塩基配列、 およびその相補鎖の少なくともいずれかを意味する用 語として用いる。
本発明において、 標的塩基配列は、 铸型として利用する核酸の塩基配列に制限 されない。 したがって、 標的塩基配列は、 録型と同じ塩基配列からなる場合もあ るし、異なる塩基配列とすることもできる。 の塩基配列に変異を導入したり、 あるいは,の塩基配列の一部をつなぎ合わせた塩基配列からなる標的塩基配列 を合成することもできる。
3' «、 あるいは 5，¾¾： 3，末端、 あるいは 5，末端とは、 単にいずれかの末端 の 1塩基のみならず、 の 1塩基を含み、力 末端に位置する領域を意味する。 より具体的には、 いずれかの末端から 5 0 0塩基、 望ましくは 1 0 0塩基、 ある いは少なくとも 2 0塩基は、 3，末端、あるいは 5'末端に含まれる。 これに対して、 末端の 1塩基や 付近に雜する特定の位置の塩基を示すためには、 その位置 を数値で特定することによって示すものとする。 また 3' が相補鎖合成の起点 となるというときには、その 3'末端の - 0H基が相補鎖合成の起点となっていること を意味する。
«と相補鎖：本発明において用いられる «という用語は、 相補鎖合成の铸 型となる側の核酸を意味する。 «に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、 ,に 対応する鎖としての意味を持つが、 両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎ ない。 すなわち、 相補鎖として合成された鎖は、 再び^ として機能することが できる。 つまり、 相補鎖は^ になることができる。 本発明においては、 ,核酸に含まれる塩基配列をそのまま標的塩基配列とし て合成する ^と、 ,核酸とは異なる塩基配列を有する核酸の合成を目的とす る場合とがある。 核酸とは異なる塩基配列を有する核酸とは、 たとえば, 核酸に含まれる塩基配列に対して変異を導入したり、 あるいは^ S核酸上で離れ て存在する領域を連続する塩基配列として合成する が挙げられる。 更に本発 明における標的塩基配列は、 異なる核酸に由来する塩基配列を連結した塩基配列 とすることもできる。
核酸の合成 (synthesis)と増幅 (ampl ication) ：本発明における核酸の合成と は、 合成起点となったオリゴヌクレオチドからの核酸の伸長を意味する。 合成に 加えて、 更に他の核酸の生成と、 この生成された核酸の伸長反応とが連続して起 きるとき、 一連の反応を総合して増幅という。
ァニール： 「ァニール」 と 「ハイプリダイズ」 は、 核酸がヮトソンークリック のモデルに基づく塩基対結合によって 2重らせん構造 (double helix structure) を形成することを意味する。 したがって、 塩基対結合を構成する核酸鎖が 1本鎖 であっても、 分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、 ァニール、 あるいはハイプリダイズである。本努明において、ァニー とハイブリダィズは、 核酸; ^塩基対結合による 2重らせん構造を構成する点で同義である。 «対結合し た 3' «が相補鎖合成の起点となるときに、 特にァユールという場合がある。 た だし、 ハイプリダイズが相補鎖合成の起点となることを否定するものではない。 同一、 あるいは相補的：本発明に用いるプライマーを構成する塩基配列の特徴 付けのために用いられる同一、 あるいは相補的という用語には、 完全に同一、 あ るいは完全に相補的でない塩基配列が含まれる。すなわち、ある配列と同一とは、 ある配列に対してァニールすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも 含むことができる。 他方、 相補的とは、 ストリンジェントな条件下でァニールす ることができ、 相補鎖合成の起点を提供することができる配列を意味する。
本発明において、 同一とは、 塩基配列の相同性が、 例えば 9 0 %以上、 通常 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上であることを言う。 また相補的とは、 相補 配列と同一の塩基配列を意味する。 すなわち、 相補配列に対して、 塩基配列の相 同性が、 例えば 9 0 %以上、 通常 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上である ときに相補的と言うことができる。 なお、 相補的な塩基配列は、 それが相補鎖合 成の起点として機能するときに、 その 3'末端の少なくとも 1塩基が、 相補配列と 完全に一致することが望ましレヽ。塩基配列の相同性は、 BLAST等の公知の検索アル ゴリズムによつて決定することができる。
鎖置換を伴う相補鎖合成反応：本発明の核酸の合成には、 鎖置換を伴う相補鎖 合成反応を触媒するポリメラーゼカ S利用される。 本発明において鎖置換を伴う相 補鎖合成反応とは、 次のような反応を言う。 すなわち、 プライマーを合成起点と する相補鎖合成反応の铸型に他のポリヌクレオチドが既にハイプリダイズして 2 本鎖構造となっているときに、 そのポリヌクレオチドを から分離しながら相 補鎖合成が進行する反応を、 鎖置換を伴う相補鎖合成反応と言う。 このとき、 分 離されるポリヌクレオチドは、 通常、 そのホスホジエステル結合が維持される。 したがって、 相補鎖合成力 S行われた長さに相当する長さを有し、 塩基対結合が可 能な状態のポリヌクレオチドが生成されることになる。
鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒するポリメラ一ゼとしては、 SMなどに用い られた DNAポリメラーゼと同様のものが用いられる。 すなわち、 ある塩基配列の 3 ，側に相補的なプライマーを合成起点として相補鎖合成を行うときに、 5'側に 2本 鎖の領域が有るとその 2本鎖を置換しながら相補鎖の合成を行う特殊なポリメラ ーゼが公知である。 本発明においては、 更に相補鎖合成に必要な基質が添加され る。
続いて本発明の反応原理について述べる。 の LAMP法 (T. Notomi et al. , Nu cleic Acid Res.， 2000, Vol.28， No. 12, e63)では、 3， と 5， に自身の任 意の領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸を生成する。そしてこの核酸の 3 ，末端がその相補的な塩基配列からなる領域にァニールしたときに形成されるル ープに対してァニールするプライマーとともにィンキュベ一トすることにより、 標的塩基配列からなる核酸が連続的に合成される。
実際には、 前記のループに対してァニールするプライマーとして、 その 5，末端 に、 前記核酸の 3'末端がァニールする領域と同じ塩基配列からなる領域を付加し ておくことにより、 単に、 標的塩基配列を含む,核酸とプライマーとをインキ ュペートするだけで、 反応を開始することができる。 しかも望ましい条件におい ては、 鎵型とする核酸は、 2本鎖のままであっても差し支えない。
公知の LAMP法に対して本発明においては、 5'側から 3'側にかけて次の領域 (a)- (d)を含む、少なくとも 2種類の 1本鎖の核酸を利用することによつて核酸を合成 する。 ここで前記 2種類の 1本鎖核酸は、 その 3，末端において相補的な塩基配列 を含み、 かつ標的塩基配列から選択された塩基配列を含む。
(a)同一鎖上の任意の領域に相補的な «配列からなる領域、
(b)領域 (a)が同一鎖上の任意の領域に対してハイブリダイズしたときにループ を形成する領域、
(c)領域 (a)に相補的な塩基配列を含む領域、 および
(d) 3'末端を構成する塩基配列からなる領域
この構造を標的塩基配列と対比させると、 次のような関係となる。 まず前記少 なくとも 2種類の 1本鎖の核酸は、 標的塩基配列を構成する 1組の相補的な塩基 配列からなる核酸鎖のうちのいずれカゝ一方の鎖を構成する連続する塩基配列を含 む。次に、両者はその 3'末端の領域 (d)において互いに相補的な塩基配列を有して いる。 そしてこれらの核酸はいずれもその 5' において同一鎖の任意の領域に 相補的な塩基配列からなる領域 (a)を有する。前記同一鎖の任意の領域は、その核 酸の任意の領域 (c)であってよい。そして領域 (a)は、領域 (c)にハイブリダイズす ることによってループを形成する。 このとき形成されるループに相当する領域を (b)とする。 以上の関係は、 たとえば次のように示すことができる。 (a) (b) (c) (d)
5' + + + + > 3，
3'く H H +5'
(d) (c) (b) (a)
[標的塩基配列 ] +
なおここでは各核酸の領域に対して同じ (a)〜 (d)という記号を与えて 1/、るが、 その塩基配列が同一であることは要求されない。 むしろ、 通常これらの領域は、 異なる塩基配列を有する。 更に、 各核酸の領域 (a)と（d)は 5' «、 あるいは 3'末 端に配置されなければならないが、 領域 (b)および領域 (c)は、 領域 (a)と領域 (d) の間の任意の位置に配置することができる。 また、 領域 (c)については、 領域 (d) との間に他の塩基配列が介入することも許される。
望ましい位置関係としては、 領域 (a)および領域 (d)を構成する塩基数が、 1 0 〜5 0 0塩基、 通常 1 0〜1 0 0塩基、 好ましくは 2 0〜5 0塩基となるように する。 一方、 領域 (c)を構成する塩纖は、 領域 (a)に対応する塩基数となる。 次に領域 (c)と領域 (a)のハイブリダィズによって形成されるループ領域 (b)の 大きさは、 1〜2 0 0塩基、望ましくは 1 0〜1 0 0塩基となるように設計する。 領域 (b)は領域 (a)と領域 (c)に挟まれる領域であることから、これらの領域を定め ることにより、 一義的に決定される。 領域 (c)は、 領域 (b)に隣接して存在し、 領 域 (a)と相補的な；^配列で構成される領域である。
更に領域 (c)と領域 (d)の間には、 任意の数の塩基が介在することができる。 し たがって、 標的塩基配列をたとえば 2 0 0塩基を越えるような長い塩基配列とす る場合には、 (c) - (d)間に長レヽ塩基配列が挿入された核酸を用いて本発明による核 酸の合成方法を実施することができる。
本発明において、標的塩基配列は、前記 1本鎖の核酸の一方の領域 (a)から他方 の領域 (a)にかけての領域となる。標的塩基配列の長さは、各領域とその間に介在 する領域との塩基数によって決定される。 本発明における標的塩基配列の長さは 制限されない。 したがって、 たとえば 3 0〜5 0 0 0塩基、 通常 5 0〜 1 0 0 0 塩基、 好ましくは 5 0 0塩基以下、 更に好ましくは 4 0 0塩基の長さとすること ができる。 標的塩基配列を長くするには、 通常領域 (c)と領域 (d)の間に介在する 領域の塩基配列を長く取る。その他、前記各領域の長さを大きくすることにより、 長い塩基配列からなる標的塩基配列とすることもできる。
公知の LAMP法では、 標的塩基配列として、 F 2 ZR 2間の塩基数としてたとえ ば 9 0〜 2 4 0塩基 （F 1と R 1に挟まれた領域の塩基数としては 1 0〜 4 0塩 基相当） の領域が選択されている。 これに対して本発明では、 より長い標的塩基 配列を、 正確に合成、 あるいは増幅することができる。
また本発明においては、 前記 1本鎖の核酸を構成する塩基配列を組み合わせる ことによって、 標的塩基配列全体を構成することができる。 より具体的には、一 方の 1本鎖の核酸に対して他方の核酸が顯として作用し、 相補鎖合成の結果、 標的塩基配列を構成する 1つの核酸の塩基配列を完成することができる。 本発明 における各 1本鎖の、 標的塩基配列に占める割合は、 任意である。 より長い塩基 配列を合成するには、 通常、 標的塩基配列に対して、 およそ 1 Z 2づつの長さと するのが合理的である。
本発明において、 前記領域 (c)は、 独立して配置することもできるし、 領域 (d) と重複して配置することもできる。 領域 (c)が領域 (d)と重複して配置される:^ とは、 前記 1本鎖の核酸が 5'末端側の塩基配列と 3' 側の塩基配列とが、 ルー プ領域 (b)を介してステムループ構造を形成している場合である。このような構造 を図 4に 3または 4として示した。
ステムノレープとは、 ループと 2本鎖構造のステムからなる構造を言う。 同一分 子に含まれる 3' «側の塩基配列と 5， 側の塩基配列とが、 相補的な塩基配列 で構成され、 それらがハイプリダイズすることによってステムが形成される。 こ のとき、 5' ¾側の塩基配列が完全に 3， 側の塩基配列に相補的な^ こは、 3 ，末端が相補鎖を伴つて 2本鎖となる。 さて、 本発明において、 前記 1本鎖の核酸は、 たとえば次のようにして酵素的 に合成することができる。まず、次のような特徴を有する 4種類のプライマー（ィ ンサートプライマー X 2、 インナ一プライマー X 2 ) を用いて、 となる核酸 をもとに鎖置換を伴う相補鎖合成を触媒する DNAポリメラーゼにより、相補鎖を合 成する。
以下にィンサートプライマー、 およぴィンナープライマーについて具体的に述 ベる。
インサートプライマー：
ィンサートプライマーは、 標的塩基配列を含む ,核酸にァニールして相補鎖 合成の起点となるプライマーであって、 このプライマーによって合成された核酸 には、 前記インナープライマーがァニールする。 更に、 インサートプライマ一 F とィンサートプライマー Rの各プライマーを起点とする合成生成物は、 両者の 5' 末端を含む領域に互いに相補的な塩基配列を有する。 ィンサートプライマーは、 本発明に固有の、前記領域 (a) - (d)で構成される 1本鎖の核酸を酵素的に合成する ために考え出された、 新規な特徴を有するプライマーである。
本発明においてィンサートプライマーには、 様々な組み合わせを想定すること ができる。 以下にィンサートプライマーの代表的な組み合わせを例示する。
核酸中の連続する標的塩基配列を合成するためのィンサートプライマー
1 ] ：
図 1等に示すように、 ィンサートプライマーは,とする核酸を構成する塩基 配列の一部に対して、 それらの 5' が重なるようにデザィンされる。
核酸中の連続する標的塩基配列を合成するためのィンサートプライマー
2 ] ：
プライマー同士が相補的な塩基配列を有していない場合でも、前記領域 (a)- (d) を有し、 かつ 3， が互レヽに相補的な塩基配列からなる2種類の 1本鎖の核酸を 生成することが可能である。 たとえば、 インサートプライマー Zインナープライ マー間の領域が重複するようにデザィンすることにより、 ィンサートプライマー そのものに相補的な塩基配列が無くとも、 最終的な反応生成物の 3'末端に相補的 な塩基配列を与えることができる。
より具体的には、 たとえば一方のィンサートプライマー Rの生成物に対してィ ンナープライマー F I Pがァニールして相補鎖が合成されるとする。 他方のイン サートプライマー Fの生成物に対してインナープライマー R I Pがァニールして 相補鎖が合成される。 このとき、 インサートプライマー Fとインサートプライマ 一 Rの伸長生成物が、 重複する領域を合成するような位置関係にあれば良い。 このとき、 インサートプライマーの 5' を含む領域の塩基配列は、 任意の塩 基配列とすることができる。 つまり、 このような位置関係にあるインサートブラ ィマーを用いるときには、 標的塩基配列中で前記のような位置関係でィンサート プライマーの 3' ¾が相補鎖合成の起点となれば、 結果的に 5' ^に互いに相補 的な塩基配列を有する核酸が生成される。
ただし、 両者の 3'末端が重複するような位置関係の場合、 プライマー同士がァ ユールして相補鎖合成を開始してしまう可能性がある。 したがって両者の 3'末端 が重複する には、 重複する部分の長さを反応条件下ではァニールできない程 度の塩基数としておくのが望ましい。
[ 核酸中の分離した標的塩基配列を合成するためのィンサートプライマ 一] ：
ィンサートプライマーの塩基配列を選択することにより、 ,核酸中に離れて 位置する領域を連続する塩基配列として合成することができる。 すなわち 核 酸において、 領域 Aと領域 Bが領域 Sを挟んで位置しているとき、 領域 Aと領域 Bとで構成された標的塩基配列を合成することができる。
そのためには、 まずインサートプライマーの 3'側の塩基配列は、 領域 Aの領域 Sとの境界領域に、 同様に領域 Bの領域 Sとの境界領域に対して相補的な塩基配 列となるようにする。 そして 5'側は、 両者の塩基配列が相補的となるようにデザ インする。 このとき、 領域 Aと領域 Bとでアミノ酸の翻訳フレームを一致させる ために、互いの塩基配列を 5'側で共有させることもできる。すなわち、たとえば 3 '側が領域 Aに相補的な塩基配列からなる場合には、 5'側には領域 Bの塩基配列を 付加する。 ただし、 共有する塩基配列が長い には、 プライマ一ダイマーを形 成してしまう可能性がある。 したがって、 翻訳フレームを一致させるためには、 人為的なリンカー配列を介入させておくこともできる。
このようなインサートプライマーによって合成される核酸は、 連続した塩基配 列の任意の中間部分を欠失した塩基配列からなる。 すなわち、 ,とした核酸の 欠失変異体を得ることができる。 このときの,となる塩基配列と、 標的塩基配 列の関係を図 9に示した。 すなわち、 , （図 9の上） における 「欠失」 (DELET ION)で示した部分が欠失した塩基配列からなる変異体 （図 9の下） を本発明によ つて合成することができる。
遺伝子によってコードされる蛋白質の機能解析の一つに、 その蛋白質の活性ド メインを特定する手法がある。 遺伝子の一部を欠失させた変異体を発現させ、 欠 失させた領域と活性の関係に基づいて、 活性ドメィンを推定する手法が一般に用 いられる。欠失変異体の取得には、 PCR法がしばしば応用される。遺伝子の連続す る領域に対してデザィンされたプライマーを用いて PCR法を実施すれば、目的とす る領域を容易に得ることができる。 しかし PCR法では、合成すべき核酸の両端にし かプライマーをデザインすることができない。 したがって、 中間部分を欠失した 変異体を 1ステップで合成することは困難である。 本発明を応用すれば、 任意の 領域を欠失させて、 ,において離れて存在する領域を 1つの連続する塩基配列 として合成することができる。
本発明の特徴は、ゲノムの解析においても有用である。真核生物のゲノムには、 遺伝子がイントロンに分断されて存在している。 細胞内では、 ゲノムから転写さ れた RNAがスプライシングによってイントロンを除かれ、 ェキソンが連結した mRN Aとなる。ゲノムにおけるェキソンとイントロンには、一定の法則が見出されつつ あるが、 少なくとも現在のところ、 予測精度は十分とは言えない。 したがって、 ゲノムの構造が明らかにされたとはいえ、 そこに含まれる遺伝子の解析は、 依然 として大きな研究課題と言って良い。
本発明の特徴を利用すれば、 ゲノムの複数の領域を連結した核酸を 1ステップ で合成することができる。 つまり、 予測されたェキソンを連結した核酸を合成す ることができる。更に得られた核酸は、必要に応じて更に連結することができる。 PCR法では、 1ステップでは単一のェキソンしか合成できないことから、本発明の 有用性は明らかである。
ゲノムの解析において、 遺伝子の解析と並んで重要な |¾ となっているのが転 写調節領域の解析である。 本発明の核酸の合成方法は、 転写調節領域の解析に利 用することもで.きる。 たとえば、 本発明は、 ゲノムにおけるプロモーター活性を 有する領域の探索に有用である。 プロモーターは遺伝子の上流に位置し、 遺伝子 の転写因子によって認識される領域である。
本発明を利用したプロモーター活性を有する領域の探索は、 たとえば次のよう にして実施することができる。 まず、 解析の対象となるゲノムの塩基配列と、 そ の下流に接続されたレポーター遺伝子からなる発現カセットを、 本発明によって 合成する。 つまり、 ゲノムと、 レポーター遺伝子のそれぞれに対して本発明のィ ンナープライマー、 およびインサートプライマ一をデザインし、 異なる核酸を铸 型とする核酸の合成方法を実施すれば良 ヽ。 解析の対象となるゲノム上の領域に 対して、 様々な領域に対するプライマーをデザインすることにより、 多種類の発 現カセットを合成することができる。 本発明によれば、 プライマーのデザインに より、 任意の領域を自由に発現カセットとして合成することができる。
得られた発現カセットを、 適当な宿主において実際に発現させ、 レポーター遺 伝子のシグナルを観察することにより、 プロモーター活性を評価することができ る。
[異なる,核酸に別々に含まれる標的塩基配列を合成するためのィンサートプ ライマー] ：
本発明の核酸の合成方法が、 同一の铸型に含まれる離れた領域を連結した核酸 の合成に有用であることを先に述べた。 この原理を更に発展させると、 本発明に よって、 異なる,に含まれる 2つの領域を連結した核酸を合成することもでき る。 すなわち、 本発明の核酸の合成方法における 2種類の 1本鎖の核酸として、 異なる,核酸に由来する塩基配列を含む核酸を用いて反応を開始することがで きる。 その結果生成する核酸は、 5'側と 3'側とで、 異なる鍵核酸に由来する塩 基配列が連結された核酸となる。
異なる铸型核酸に由来する塩基配列を含む 1本鎖の核酸は、 たとえば以下のよ うな方法によって得ることができる。 本発明の核酸の合成方法に用いるプライマ 一として、 異なる 核酸に対してプライマーとして作用するようにデザインさ れたィンサートプライマー、 およぴィンナープライマーを用いるのである。
異なる ,核酸 Fおよび Rの二つの核酸を用レ、、 それぞれの^ S核酸の塩基配 列から選択された任意の領域を連結しようとする場合には、 次のようなプライマ —が用いられる。 まず^ M核酸 Fに対して、 インナ一プライマ一 Fおよびィンサ ートプライマー Fがデザィンされる。 ィンナープライマー Fとインサートプライ マー Fの 3' には、 ,核酸 Fの合成を目的とする領域を合成するためのプラ イマ一として作用する塩基配列が配置される。インナ一プライマー Fの 5'側には、 その 3'側を起点として合成される相補鎖の任意の領域に対して相補的な塩基配列 が配置される。
一方 ,核酸 Rに対して、 ィンナープライマー： Rおよぴィンサートプライマー Rがデザィンされる。 ィンナープライマー Rとインサートプライマー: の 3'末端 には、 核酸 Rの合成を目的とする領域を合成するためのプライマーとして作 用する塩基配列が配置される。 インナープライマー Rの 5'側には、 その 3'側を起 点として合成される相補鎖の任意の領域に対して相補的な塩基配列が配置される。 そして、 インサートプライマー Fとインサートプライマー: の 5，末端は、 相補 的な塩基配列で構成される。 両者の塩基配列によってコードされる蛋白質を融合 蛋白質として発現することができる遺伝子を合成するには、 ィンフレームで連結 できるように、 ィンサートプライマーの 5'側の塩基酉己列をデザィンする。
このようなプライマーのデザインと、 異なる^ ffi核酸を用いる他は、 全て同様 の条件で本発明の核酸の合成方法、 あるいは増幅方法を実施することができる。 すなわち、 2種類の铸型核酸、 すべてのプライマー、 そして反応に必要な DN A ポリメラーゼ、基質、緩衝液などを混合し、適切な条件下でインキュベートする。 あるいは、 異なる铸型核酸に対して、 対応するプライマーを加えて相補鎖合成反 応を行い、 1本鎖の核酸を生成させた後に両者を混合して、 更に相補鎖合成反応 を継続することもできる。
反応生成物から、 標的塩基配列、 あるいは標的塩基配列よりもサイズが大きい 反応生成物を回収すれば、 目的とする塩基配列を得ることができる。 回収した核 酸は、 必要に応じて制限酵素で消化し、 精製することができる。
本発明による核酸の合成方法、 あるいは増幅方法に基づいて、 異なる^ 核酸 の塩基配列を含む核酸を得る方法は、 たとえば、 次のような応用分野に有用であ る。
まず、 本発明に基づいて、 融合蛋白質をコードする遺伝子を合成することがで きる。 公知の方法では、 サイズの大きな遺伝子どうしを同時に合成することは困 難であった。たとえは 法では、プライマーとして合成できる範囲であれば、標 的塩基配列の末端に人工的な塩基配列を付加することができた。 しかし、 この方 法で付加できる塩基配列の長さは限られていた。 したがって、 たとえばヒスチジ ンタグのような、 小さな蛋白質し力付加することはできない。 一方本発明では、 付加すべき蛋白質をコードする遺伝子も相補鎖合成反応によって合成できること から、 原理的には、 自由な長さの遺伝子を融合させることができる。
プライマーとして付加することが難しい長い塩基配列を付加するには、 予め必 要な塩基配列を組み込んだベクターを用意しておき、 このべクターに融合させる 遺伝子を挿入する方法が用いられていた。 しかしこの方法では、 融合蛋白質を作 るために融合パートナーを組み込んだベクターを予め用意しなければならない。 これに対して本発明では、 異なる^ M核酸から、 目的とする領域を自由に選択し て、 融合させることができる。
[インサートプライマーへの変異の導入] ：
本発明に用いるインサートプライマーには、 変異や付加的な塩基配列を導入し ておくことができる。 インサートプライマーには、 その 3， において特定の条 件の塩基配列を有することが求められる。 また、 5' ¾¾側には、 インサートブラ イマ一の塩基配列を顏として相補鎖合成反応によって生成する核酸が、 5'末端 において相互に相補的な塩基配列を有する限り、 様々な;^ ¾配列を自由に配置す ることもできる。 更に、 インサートプライマーの中間部分には、 変異の導入や塩 基配列の付加を許容する。
この特徴を利用して、 が有する塩基配列に対して、 変異や塩基配列を付加 した塩基配列を合成することができる。 ィンサートプライマーは標的塩基配列中 に任意の場所に設定することができることから、 本発明によれば、 任意の場所に 任意の変異を導入することができることになる。 変異には、 塩基の置換、 欠失、 あるいは付加が考えられる。 これらの変異は、 いずれも本発明によって導入可能 である。
PCRのような公知の核酸合成方法では、希望するとおりの変異を導入できる個所 力 «部分に限られていた。 プライマーの塩基配列を 部分にしカゝ導入でき ないためである。 したがって、本発明のように、標的塩基配列中の任意の個所に、 任意の変異を導入できる方法は有用である。
[複数セットのィンサートプライマー] ：
2つのィンサートプライマーの 5'側に配置された相補的な塩基配列が、 特異的 にハイプリダイズするとき、 同時に複 MLのィンサートプライマーを用いること ができる。 複 ¾且のインサートプライマーを用いることにより、 各組の間で^ M 核酸に対する相互の置換が起き、 より迅速な相補鎖合成を期待できる。
ィンサートプライマーの 3'側を構成する塩基配列は、 铸型核酸が 2本鎖のまま «として用いられる^ ^こも、 相補鎖合成の起点を与えることができるように 設定することが望ましい。 更に、 インナープライマー アウタープライマーによ る相補鎖合成反応と同様の条件の下で、 プライマーとして作用できることが望ま しい。 具体的には、 前記領域 (d)などと同様に、 5- 200塩基、 より望ましくは 10 - 5 0塩基とする。
更に、 インサートプライマーの 5'側を構成する領域は、 この領域を^ Mとして 合成される相補鎖に対して、 その 3，末端が相補鎖合成の起点となるために必要な 塩基配列を与える。 したがって、 3'側を構成する塩基配列と同様に、 5 - 200塩基、 より望ましくは 10 - 50塩 とする。
ィンナープライマー：
3' に標的塩基配列の 5'末端に相補的な塩基配列 (X2)を備え、 かつ 5'末端に その 3'末端を起点として合成される核酸の任意の領域 (XI)に相補的な塩基配列 (X lc)を有する。この 5， ¾の塩基配列は、前記 1本鎖の核酸の 5， «を含む領域 (a) を構成する。 標的塩基配列を構成する 2つの鎖のそれぞれに対して異なるインナ 一プライマーが用いられる。 通常それらは、 フォーワード側、 リパース側と呼ば れる。 インナープライマーは、 公知の LAMP法でも用いられたプライマ一である。 ただし公知の LAMP法では、 基本的にはィンナープライマーで反応が構成されてい る。 インサートプライマーとインナープライマーとの組み合わせについては、 現 在のところ報告は無い。
以下の説明では仮に一方のィンナープライマーにおける X 2および X 1 cを F 2および F 1 c、 他方のインナープライマ一における X 2および X 1 cを R 2お ょぴ R l cとする。 そして説明に用いるインナープライマーを、 仮に F I Pおよ ぴ R I Pと名づける。 F I Pと R I Pを構成する領域は、 以下のとおりである。 X 2 X 1 c
F I P F 2 F 1 c
R I P R 2 R 1 c
本発明の核酸の合成方法においては、まず前記領域 (a) - (d)からなる 1本鎖の核 酸を生成することが重要である。 このような核酸は、 前記インサートプライマ一 と、 次の構造を持ったィンナープライマーを利用した本発明に基づく核酸の合成 反応によってその構造を与えることができる。 この反応の詳細については、 後に 改めて述べる。
すなわち本発明の核酸の合成反応に用いるインナープライマーとは、少なくと も前記 2つの領域 X 2および X 1 cとで構成される。 X 2は 3，雄を含む領域で あり、 X 1 cは 5，末端を含む領域である。
本発明におけるィンナープライマーの構造は、 前記標的塩基配列によって決定 される。標的塩基配列は、少なくともその一部の塩基配列が明らかとなっている、 あるいは推測が可能な状態にある。 塩基配列を明らかにすべき部分とは、 前記領 域 X 2 cおよびその 5，側に位置する領域 X 1 cである。 この 2つの領域は、 連続 する^ \ そして離れて存在する^^とを想定することがでぎる。 .両者の相対的 な位置関係により、 生成物である核酸が自己ァニールしたときに形成されるルー プ部分の状態が決定される。
また、 生成物である核酸が分子間のァニールではなく自已ァニールを優先的に 行うためには、 両者の距離が不必要に離れないほうが望ましい。 したがって、 両 者の位置関係は、 通常 0— 5 0 0塩基分の距離を介して連続するようにするのが 望ましい。 ただし、 後に述べる自己ァニールによるループの形成において、 两者 があまりにも接近している には望ましい状態のループの形成を行うには不利 となるケースも予想される。 ループにおいては、 新たなオリゴヌクレオチドのァ ニールと、 それを合成起点とする鎖置換を伴う相補鎖合成反応がスムーズに開始 できる構造が求 られる„ したがってより望ましくは、 領域 X 2 cおよびその 5' 側に位置する領域 X 1 cとの距離が、 0〜 1 0 0塩基、 さらに望ましくは 1 0〜 7 0塩基となるように設計する。 なおこの数値は X I cと X 2を含まない長さを 示している。 ループ部分を構成する塩基数は、 更に X 2に相当する領域を加えた 長さとなる。
標的塩基配列に対して本発明におけるィンナープライマーを構成する領域 X 2 および X I cは、 通常は重複することなく連続して配置される。 あるいはもしも 両者の塩基配列に共通の部分があるのであれば、 部分的に両者を重ねて配置する こともできる。 X 2はプライマーとして機能する必要があることから、 常に 3'末 端となるようにしなければならない。
一方 X 1 cは、 後に述べるように、 これを,として合成された相補鎖の 3，末 端にプライマーとしての機能を与える必要があることから、 5' に配置する。 このオリゴヌクレオチド'を合成起点として得られる相補鎖は、 次のステップにお いては逆向きからの相補鎖合成の,となり、 最終的には本発明によるィンナー プライマー部分も,として相補鎖に写し取られる。 写し取られることによって 生じる 3，末端は塩基配列 X 1を備えており、 同一鎖上の X 1 cにァニールすると ともに、 ループを形成する。
本発明におけるィンナープライマーとは、 標的塩基配列と相補的な塩基対結合 を形成できること、そしてその 3， において相補鎖合成の起点となる - 0H基を与 えること、 の 2つの条件を満たすものを意味する。 したがって、 そのパックポー ンは必ずしもホスホジエステル結合によるものに限定されなレ、。 たとえばホスホ チォエート体からなるものであることもできる。 また、 塩基は、 相補的な塩基対結合を可能とするものであれば良い。 天然の状 態では、一般には ACTGおよひ Uの 5種類となる力 たとえばブロモデォキシゥリジ ン (bromodeoxyuridine)といった類似体であることもできる。本発明に用いるオリ ゴヌクレオチドは、 合成の起点となるのみならず、 相補鎖合成の^ としても機 能するものであることが望ましい。 本発明におけるィンナープライマーは、 以下に述べる各種の核酸合成反応にお いて、 与えられた環境の下で必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合 を行うことができる程度の鎖長を持つ。 具体的には、 5— 2 0 0塩基、 より望ま しくは 1 0— 5 0塩基とする。 配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリ メラーゼが認識するプライマーの鎖長が、最低 5腿前後であることから、ァニー ルする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。 加えて、 塩基配列としての特異 を期待するためには、 確率的に 1 0塩基以上の長さを利用するのが望ましい。 一方、 あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となるこ と力 ら、 前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。
なお、 ここで例示した鎖長はあくまでも相補鎖とァニールする部分の鎖長であ る。 本発明によるインナープライマーは、 少なくとも 2つの領域 X 2および X I cからなつている。 したがって、 ここに例示する鎖長は、 イン ^ プライマーを 構成する各領域の鎖長と理解するべきである。 .
本発明におけるィンサートプライマーとィンナープライマーの関係を、 図 1お よび図 2に示した。 これらの図は、 標的塩基配列 （F 2 ZR 2 c間） を含む核酸 を,とする標的塩基配列を含む核酸の合成方法を示している。 図の中 fc示され たプライマーは、 次のとおりである。
インサートプライマー F
インサートプライマー R
インナープライマー F I P (フォワード)
インナープライマー R I P (リバース)
アウタープライマー F 3
アウタープライマ一 R 3
図示されたィンサートプライマー Fおよぴィンサートプライマー Rの 3'末端に は、 標的塩基配列中の任意の領域に相補的な塩基配列が配置されていて、 と なる核酸にァニールすることにより相補鎖合成の起点となる。 また各ィンサ一ト プライマーの 5'側は、 互いに相補的な塩基配列を有するようにデザィンされてい る。 言いかえれば、 2つのインサートプライマーは、 標的塩基配列を構成する 2 本鎖の中の任意の領域において、 互いの 5' ^が重なるように設計されている。 他方アウタープライマー F 3、あるいは R 3は、標的塩基配列の 5'末端よりも 5 '側の任意の領域 F 3 cまたは R 3 cに相補的な塩基配列で構成される。アウター プライマーは、 ィンナープライマーゃィンサートプライマーを起点として合成さ れた鎖の置換のための相補鎖合成反応の起点を与えることを目的とする。
図 1においては、 インサートプライマ一 Rの伸長生成物に、 インナープライマ 一 F I Pがァニールして相補鎖が合成されている。 合成された相捕鎖はアウター プライマー F 3によって置換され、 1本鎖の核酸（1 ) として遊離する。この（1 ) は、 本発明における前記領域 (a) - (d)を有する核酸のひとつに他ならない。
一方、 核酸 （1 ) を生成する反応と同様の反応は、 インサートプライマー Fか らも進行し （図 2 ) 、 インナープライマー R I Pに基づく相補鎖合成生成物が 1 本鎖の核酸 （2 ) を形成している。 核酸 ( 1 ) と核酸 （2) は、 5，末端は自身の 相補的な塩基配列を含む領域とハイプリダイズしているが、 その 3'末端を含む領 域は 1本鎖であり、 かつ相互に相補的な塩基配列となっている。 したがって、 両 者の 3'末端を含む領域はハイプリダイズすることができる。
図 3に示すように、 核酸 ( 1 ) と核酸 （2 ) 力 ， においてハイブリダィズ することにより、 その 3'末端は相補鎖合成の起点となり、 互いを^ Mとする新た な相補鎖合成が開始される。 さて、 1本鎖の核酸 ( 1 ) と （2) とは、 もともと «となっていた核酸に含まれる標的塩基配列をもとに合成されている。 そして その塩基配列は、 ィンサートプライマーとィンナープライマーの間の塩基配列で 構成されている。 つまり、 核酸 ( 1 ) と核酸 ( 2 ) とは、標的塩基配列を構成す る塩基配列のうち、 その 5'側の塩基配列を含む一方、 3，側の塩基配列を欠く構成 となっている。 更に、 各鎖を構成する標的塩基配列の 5'の塩基配列とは、 互いに 他方の鎖に欠けている 3'側の塩基配列に対して相補的な塩基配列に他ならない。 したがって、 これらの核酸の 3' を起点とし、 互いを铸型に相補鎖を合成す れば、標的塩基配列に対して不足している各鎖の 3' 耑側の塩基配列が合成され、 結果的に標的塩基配列が完成することになる。 こうして本発明においては、 標的 塩基配列からなる核酸が合成される。
ところで、 たとえば図 1においてィンサートプライマーがァニールする,核 酸は、 1本鎖として描カゝれている。 しかし本発明においては、 ,となる核酸を 1本鎖とするための変性工程は必ずしも要求されない。 本発明を構成する相補鎖 合成反応の大部分は、鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラーゼに よって行われる。この種の DNAポリメラーゼを利用する場合、適切な条件を与えれ ば 2本鎖の核酸を,とする相補鎖合成が可能である。
本発明者は、 2本鎖の核酸を、 変性によって 1本鎖とすることなく,として 利用可能な条件を明らかにしている。 すなわち、 ある程度 2本鎖が不安定化され る条件を与えれば、 変性工程無しで 2本鎖核酸に対するプラィマーのァニーノレと M依存性の相補鎖合成が可能な条件を設定できることを見出している。 本発明 においてもこの条件を禾 IJ用し、 2本鎖の核酸を^としてそのまま用いることが できる。
より具体的には、 たとえば 1本鎖の核酸を,として用いる ょりも高く、 力つ «核酸を 1本鎖に変性する温度よりも低い温度であって、利用する DNAポリ メラーゼによる相補鎖合成反応が可能な温度に設定すれば良い。 反応に必要な温 度は、 融解温度調整剤 （以下、 融解温度を Tmと省略する） によって調整すること ができる。 Tm調整剤については後に具体的に述べる。
さて、 ここで核酸 ( 1 ) と核酸 （2) の組み合わせに基づいて生成された、 標 的塩基配列を含む核酸の構造に着目する。 図 3に示すように、 このような組み合 わせによって生成される核酸として、 まず核酸 ( 1 ) と核酸 ( 2) が 3'方向に伸 長した生成物について説明する。 ,となった核酸 ( 1 ) と核酸 ( 2 ) は、その 5 '末端に自身の任意の領域に対して相補的な塩基配列を有している。したがって相 補鎖合成の結果として生成する核酸は、 その 3'末端に自身に相補的な塩基配列を 有している。 その結果、 3' を含む領域が 1本鎖構造となれば、 自身にその 3' 末端をァニールさせ、 相補鎖合成が開始される。
この工程が図 3に示されている。 すなわち、 核酸 （1 ) と核酸 ( 2) から生成 した 2本鎖の核酸に、 更にィンサートプライマ一がァニールして相捕鎖合成を開 始することにより、 3' を含む領域が 1本鎖とされる。 3'末端は自身にァニー ルして自身を,とする相補鎖合成を開始し、 ループを介して標的塩基配列を連 結した核酸を生成する （図 3の下の 2つの生成物） 。
図 3中、 下の 2つの生成物は、 3' と 5' に自身に相補的な塩基配列を有 しており、 カつループにインナ一プライマーのァニールが可能な状態にある。 つ まり、 この核酸は、 LAMP法の開始に必要な構造を備えている。 したがって、 いつ たんこのような構造が生成されれば、 公知の LAMP法の原理に基づく核酸の合成反 応が開始される。 すなわち、 以下の 3つの反応が、 連続的に、 力つ理論的には無 限に繰り返される。 その結果、 高度な核酸の増幅がもたらされる。
ループからの相補鎖合成による 3' の開放、
1本鎖となった 3'末端の自身を讓とする相補鎖合成、 そして
3'末端から進行する相補鎖合成に伴うループか ¾開始した相補鎖合成生成物の置 換
なお図 3においては、 核酸 ( 3 ) と核酸 （4) が生成物として生じることも示 されている。 これらの核酸は、 インサートプライマーを起点として合成された核 酸で、 前記の 3， を自身にァユールさせて進行する相補鎖合成に伴って置換さ れ生成する。 これらの核酸も、 後に述べるような反応を開始するための材料とし て、 本発明の核酸の合成のための反応に貢献する。
さて、 以上の説明では反応を開始するために、 もともと 3'側において 1本鎖の 構造を有する核酸を用いた。 しかし本発明の核酸の合成方法は、 前記 1本鎖の核 酸として 3' を含む領域が 1本鎖である場合に限定されない。 3'末端において 相補鎖を伴って 2本鎖構造を有する場合であっても、相互の 3' のァニールと、 それに伴う標的塩基配列の合成を開始することができる。
ここで、 前記 1本鎖の核酸が 3， において相補鎖を伴う構造について、 改め て説明する。 たとえば図 1、 図 2、 あるいは図 3において、 前記のような反応に 伴って生成している核酸 (3) や核酸 （4) は、 3' «において自身の 5，末端に 含まれる相補的な塩基配列からなる領域を伴って 2本鎖構造を形成している。 こ のような構造は、 なんらかの手段によって、 その 3' を 1本鎖とすれば他の核 酸にァニールさせることができる。本発明において、核酸（3) や核酸（4) の 3 '末端を 1本鎖の構造とするための手法としてソレープ部分にァニールするプライ マーを起点とする相補鎖合成と、 この相補鎖合成に伴う置換を利用することがで きる。
図中に用いられているインナープライマー F I Pは、 その 3'¾Sが F2 cで構 成されている。 F 2 cは F 2に相補的な塩基配列であるから、 核酸 (3) のルー プに存在する F 2 cにァニールし、 相補鎖合成の起点を与える。 ループ内から開 始された相補鎖合成は である核酸 (3)の 5'方向に進行し、 5'末端に る。 このとき、 もともと核酸（3) の 5， «にハイブリダィズしていたその 3'末端は、 新たな相補鎖の合成に伴って置換され、 1本鎖の状態となる。 R I Pでも同様に、 核酸 （4) のループ部分にァニールして、 その 3'末端を 1本鎖として開放する。
1本鎖となった核酸 (3) と核酸（4) の 3， «はァユールし、 前記核酸 (1) と核酸 (2) による反応と同様に、 互いを讓とする相補鎖合成反応を開始し、 その 3，側の塩基配列を獲得して標的塩基配列の合成が完成する。
更に、 本発明における前記 1本鎖の核酸は、 その 3' を積極的に 1本鎖とす るまでもなく、 相補鎖合成の起点として機能することができる。 先に述べたよう に、 2本鎖の核酸は、 条件しだいで変性工程を経ることなく^ として利用する こともできる。 このような条件を利用することにより、 核酸 (3) と核酸 （4) とは、 その 3'末端をァニールさせることが可能である。 また、 RNA - DNAキメラプライマーを利用することによって、核酸（ 3 )と核酸（ 4 ) との反応を開始することもできる。 具体的には、 核酸 (3) や核酸 （4) の 5，側 を RNAで構成しておき、 相補鎖を伴っているときには、 R Aで構成される部分を分 解できるようにしておくのである。 核酸 (3) と核酸 （4) は、 その 3，側を自身 の 5'末端領域にハイプリダイズさせた構造を有している。 そのため、 5'末端を構 成する領域を除去すれば、 3'側は塩基対結合が可能な状態となる。 両者の 3'末端 は相互に相補的な塩基配列で構成されているから、 両者はァニー/レして、 互いを ,とする相補鎖合成反応が開始される。 RNA/DNAハイプリッドにおける RNAの消 化は、 RNAseHなどの酵素を利用して行うことができる。
核酸 (3)や核酸（4) の 5'末端を醒で構成するには、 これらの核酸を合成す るときに用いるプライマーとして、その 5' を含む領域が RNAで構成されたプラ イマ一を利用すれば良い。 なお当該プライマーの 3' ¾を含む領域は、 DNA等の R NAseH耐性を有する構造とする必要がある。 プライマーの 3' ^側を含む領域を R NAで構成した場合には、 核酸 (3) や核酸 (4) を合成した段皆で,との RNA/ DNAハイプリッドが構成され、核酸 (3) や核酸（4) に必要な 3'末端の合成が行 われなくなってしまうためである。
本発明に R A - DNAォリゴヌクレオチドを利用するとき、 RNAの消化工程を伴う点 は前述の ICAN法と共通する。 しかし本発明では、腿は核酸 (3) や核酸 (4) の 5'末端側になければならないこと力 ら、 ICAN法とは原理が相違することは明らか である。
核酸 （3) と核酸 （4) とは、 いずれも 3， «において 2本鎖構造を有してい るが、 この領域がループにァニールするプライマーによってやがて 1本鎖となる ことは既に述 た。 また積極的に 1本鎖とする工程を経ないまま、 プライマーの ァニールを可能とする条件についても先に示した。更に 5' «を RNAとしておき、 この RNAを消化することによって、その 3' を塩基対結合が可能な状態とするこ ともできる。 こうして、前記領域 (a)- (d)を有する 1本鎖の核酸により、本発明の 核酸の合成方法が実施される。
本発明において、 核酸 （3) と核酸 （4) の組み合わせで生成する核酸は、 い ずれも標的塩基配列に加えて、 付加的な塩基配列を有している。 付加的な塩基配 列は、 核酸 (3) および核酸 (4) がループから 5， にかけて有している塩基 配列に相当する。 したがって、 核酸 (3) と核酸 （4) の組み合わせから生成さ れる核酸は、 標的塩基配列の 5'側と 3'側に付加的な塩基配列を有する。 また、 核 酸 （3) または核酸 （4) と、核酸 (1) または核酸 (2) との組み合わせでは、 標的塩基配列の 5'側または 3'側のいずれかに付加的な塩基配列を有する核酸を生 成する。 そしてその付加的な塩基配列を有する 3'末端、 あるいは 5'末端は、 イン サートプライマーに由来する塩基配列となることから、 自身に相補的な塩基配列 を持たない。 したがって、 この核酸そのものは、 直接的に LAMP法の反応を開始で きる状態にはない。 しかし、 この核酸には、 インサートプライマーからインナー プライマーにかけての塩基配列がその 5' を含む領域に保存されている。
したがって、 この領域を^ Mとし、 インナ一プライマ一 R I Pあるいは F I P に基づいて、 新たに核酸 (1) あるいは核酸 (2) を生成することができる。 生 成された核酸 (1) あるいは核酸 （2) は、 インナープライマーの 5，側にァニ一 ルする他の核酸からの相補鎖合成によって置換され、 1本鎖の核酸として,か ら遊離する。 このように、 図 1一図 5に示すとおり、 インサートプライマーとィ ンナ一ブライマ一、 更に望ましくはアウタープライマーを利用することにより、 核酸 (1) 、 核酸 （2) 、 核酸 (3) 、 および核酸 (4) が連続的に合成され、 標的塩基配列を含む核酸が合成される。 更にこれらの反応に伴って、 LAMP法に基 づく反応を開始する構造が生成し、新たな讓として機能する。これらの反応は、 標的塩基配列を含む核酸を合成するとともに、 反応生成物が新たな反応を開始す るための出発物質として機能することから、 核酸の増幅反応を構成する。
なおここでィンナープラィマーゃィンサートプライマ一は、 2本鎖の状態にあ る核酸を,とすることになる。 2本鎖の,を変性工程を経ることなく,と して利用可能な条件については、 既に述べたとおりである。
以上が本発明による核酸の合成方法の反応原理である。 以上の説明から明らか なように、 結局、 本発明による核酸の合成方法に必要なプライマーを標的塩基配 列を含む,となる核酸とともに、 相補鎖合成が開始できる条件下でィンキュベ ートすることにより、 以上に述べたような反応を実施することができる。 このと き、 望ましい条件下においては、 全ての反応を共通の条件下で実施することがで きる。 すなわち、 望ましい条件においては、 核酸の変性などを目的として、 加熱 などの処理を施す必要が無い。
すなわち本発明は、 以下の要素をインキュベートする工程を含む、 標的塩基配 列を含む核酸を合成する方法に関する。
(a)ィンナープライマー F；ここでィンナープライマー Fはその 3'末端において 前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールし、 かつィンナープライマー Fの 5'末端には、 このプライマーを起点とする相補鎖合 成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を有する、
(b)インナープライマー R ;ここでィンナープライマー Rはその 3'末端において 前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールし、 かつインナ一プライマ一: の 5'末端には、 このプライマーを起点とする相補鎖合 成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を有する、
(c)ィンサートプライマー F；ここでィンサートプライマー Fはその 3'末端にお いて前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の任意の領域に対して相補的な塩基配 列を有する、
(d)ィンサートプライマー： ；ここでィンサートプライマ一 Rはその 3'末端にお いて前記標的塩基配列を構成する他方の鎖の任意の領域に対して相補的な塩基配 列を備え、 力つインサ一トプライマー Fとィンサートプライマー Rの各プライマ ^"を起点とする合成生成物は、 両者の 5， «を含む領域に互いに相補的な塩基配 列を有する、 (e)標的塩基配列を含む,核酸、
(f)ヌクレオチド基質、 および
(g)鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラーゼ
本発明による核酸の合成方法においては、 反応液中に更に付加的に次の要素を 存在させることができる。
(h)アウタープライマー F；ここでアウタープライマー Fは、 ,におけるイン ナープライマー Fがァニールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖合成反応の起 点となる、 および
(i)アウタープライマー R；ここでアウタープライマー Rは、 におけるイン ナープライマー Rがァニールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖合成反応の起 点となる。
また本発明による核酸の合成方法においては、 反応液中に更に付加的に次の要 素を存在させることができる。
(j)ループプライマー F；ここでループプライマ一 Fの 3， を含む領域は、前 記ィンナーブライマ一 Fの 5'末端を含む領域が、 ィンナープライマー Fを起点と する相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイブリダイズすることによつ て形成されるループ内の任意の領域に対してァニールする、 および
(k)ループプライマー R；ここでノレーププライマー Rの 3， を含む領域は、前 記ィンナープライマー Rの 5，末端を含む領域力 ィンナープライマー Rを起点と する相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイブリダイズすることによつ て形成されるループ内の任意の領域に対してァニールする
本発明の核酸の合成方法においては、 様々な塩基配列からなるループを有する 核酸が連続的に生成される。 このうち、 前記インナープライマーがァニールする ループは、 ィンナープライマーを起点とする相補鎖合成を開始するための重要な ループとなる。 一方、 インナープライマーの 5' ^を含む領域力 インナープラ ィマーを起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイブリ することによって形成されるループには、インナ一プライマーはァニールしない。 このループに対してァニールして相補鎖合成の起点を与えるプライマーが、 反応 速度を向上させることを、本発明者は見出している（W0 02/24902) o本発明におい て、 ィンナープライマーがァニールしないループにおいて相補鎖合成の起点を与 えるプライマ一をループプライマ一と呼ぶ。
本発明におけるループプライマーは、 インナープライマー Fに対するループプ ライマー F、 並びにインナープライマー Rに対するループプライマー Rの少なく とも 2種類のループプライマーをデザィンすることができる。本発明においては、 こうしてデザインされるループプライマーの少なくとも 1種類が用いられる。 好 ましいループプライマーは、 ル一ププライマ一 Fおよぴループプライマー Rの 2 種類のループプライマーである。 あるいは、 同一のループ内の異なる領域にァニ —ルすることができるループプライマーを組み合せて、 3種類以上のループプラ イマ一を用いてもよい。 ループブラィマーを本発明の核酸の合成方法に応用すれ ば、 反応速度の向上が期待できる。
本発明の標的塩基配列を含む核酸を合成する方法において、 ィンサートプライ マー Fは、 インナープライマー Fに対して、 たとえばひ. 1〜1 0 0倍、 好まし くは 0. 1〜5 0倍、 より好ましくは 0. 2〜 5倍の濃度で用いる。 インサート プライマー Rとィンナープライマー Rの濃度比も同様に設定することができる。 更に、 1種類の铸型に対しては、 インサートプライマー Fとインサートプライマ 一 R、 あるいはインナープライマ一 Fとインナープライマー Rは、 通常それぞれ ほぼ等しい濃度で用いられる。 «となる核酸が複数種であって、 しかも各^ S の量が異なっているときには、 少ない方の^ Mにァニーノレするプライマ一の濃度 を高めることにより、 効率的な合成反応が期待できる ^もある。
またプライマーや酵素の使用量は、 予想される铸型の濃度、 反応時間、 反応温 度、 反応に用いる酵素の活性などの条件に応じて、 効率的な反応が行われるよう に適切な条件を設定することができる。 より具体的には、 たとえばプライマーの 濃度は、 通常 1 0 0〜4 0 0 O nM、 好ましくは 2 5 0〜3 0 0 O nM、 更に好まし くは 5 0 0〜 3 0 0 O nMとすることにより、 6コピー以上の麵に基づいて、 確 認可能なレベルの増幅生成物を生じることができる。
ァウタ一ブライマ一の第 1の目的は、 ィンナープライマーを起点として合成さ れる鎖を、 より 3'側からの相補鎖合成反応によって置換することにある。 したが つて、 インナ一プライマーを起点とする相補鎖合成反応が、 アウタープライマー のそれよりも優先的に開始されることが望ましい。 そのために、 通常、 アウター プライマーの Tmがィンナープライマーの Tmよりも低くなるようにデザインされる。 なおここで、 インナープライマーの Tmとは、 相補鎖合成の起点となる 3，末端を含 む領域の,核酸に対する Tmを言う。
更にアウタープライマーをィンナ一プライマーよりも低い濃度で用いることに より、 インナ一プライマーの相補鎖合成を優先的に行わせることができる。 ァゥ タープライマ一の使用濃度は、たとえばィンナープライマーに対して 1 / 2以下、 好ましくは l Z l 0以下、 あるいは 1 Z 1 0 0以下とすることができる。
また本発明にループプライマーを利用する場合には、 ループプライマーの使用 濃度をインナ一プライマーの使用濃度に対して、 たとえば l Z l 0〜等量とする のが望ましい。 より具体的には、 1 / 3〜1 / 2とすることができる。 ループプ ライマー Fとループプライマー Rとは、 通常、 等量とする。
本発明において、アウタープライマーの使用は必須の条件ではない。なぜなら、 インナープライマーを置換によつて »核酸から遊離させなくても、 その伸長反 応生成物は、 新たな铸型として機能することができる。 1本鎖とする工程を省略 しても、 一定の確率でプライマ一に基づく相補鎖合成反応が開始される ¾ ^のあ ることは既に述べたとおりである。 この現象はィンナ一プライマーからの伸長生 成物においても期待できるので、 アウタープライマーを用いることなく、 インサ ートプライマーや、 他方のィンナープライマーを起点とする相補鎖合成反応が開 始できる可能性はある。 しかし、 鎵型核酸に依存してインナープライマーを起点として生成する伸長生 成物は、 本発明の核酸の合成方法の、 最初のステップを構成する生成物である。 したがって、 その生成速度は、 本発明の合成方法の効率を大きく左右する。 その ため、 この伸長生成物を効率的に^ ¾として機能させるためにアウタープライマ 一を利用することは、 本発明の核酸の合成方法において望ましい条件の一つであ る。
同様に、 ループプライマーも、 本発明において必須ではない。 しかし、 ループ プライマーの使用によって、 反応速度の向上を期待できる。 したがって、 ループ プライマーの使用は、 本発明の核酸の合成方法において望ましい条件の一つであ る。
本発明に用いる各種のプライマーは、 化学的に合成することができる。 あるい は天然の核酸を制限酵素などによって切断し、 上記のような塩基配列で構成され るように改変する、 あるいは連結することも可能である。
更に、 本発明におけるインサートプライマーやインナープライマーは、 公知の 標識物質によって標識することができる。 標識物質としては、 ジゴキシンゃビォ チンのような結合性リガンド、 酵素、 蛍光物質や発光物質、 あるいは 性同位 元素などを示すことができる。 あるいは、 インナープライマーを構成する塩基を 蛍光性のアナ口グに置換する技術 (W095/05391, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91， 664 4 - 6648， 1994)も公知である。
この他本発明におけるィンサートプライマーゃィンナープライマ一は、 と しての機能を妨げない方法で、 それ自身を固相に結合させておくこともできる。 あるいは、 これらのプライマーの任意の部分をビォチンのような結合性のリガン ドで標識しておき、 これを固相化アビジンのような結合パートナーによって間接 的に固相化することもできる。 固相化したプライマーを合成開始点とする^^に は、 核酸の合成反応生成物が固相に捕捉されることから、 分離が容易となる。 分 離された生成物に対して、 核酸特異的な指示薬や、 あるいは更に標識プローブを ハイプリダイズさせることによって、 検出を行うこともできる。 あるいは、 任意 の制限酵素で消化することによって、 目的とする核酸の断片を回収することもで きる。
加えて本発明による核酸の合成方法において、 反応液は前記の要素と、 適切な 反応条件を維持する緩衝液によって構成することができる。 更に反応液には、 酵 素の保護剤や、 Tmの調歸 IJなどを加えることもできる。
反応に用いる各要素について更に具体的に述べる。
一連の反応は、 酵素反応に好適な pHを与える緩衝剤、 酵素の触媒活性の維持や ァニールのために必要な塩類、 酵素の保護剤、 更には必要に応じて融解温度 (Tm) の調^!]等の共存下で行う。 緩種 ί剤としては、 Tris - HC1等の中性から弱アルカリ 性に緩衝作用を持つものが用いられる。 pHは使用する DNAポリメラーゼに応じて調 整する。 塩類としては KC1、 NaCl、 MgCl2、 MgS04、 あるいは (NH4) 2S04等が、 酵素の 活性維持と核酸の融解温度 (Tm)調整のために適宜添加される。 酵素の保護剤とし ては、 ゥシ血清アルブミンゃ糖類が利用される。
更に融解温度 (Tm)の調整剤には、 ベタイン、 プロリン、 ホルムアミド、 ジメチ ルスルホキシド （以下、 DMS0と省略する） 、 あるいはトリメチルァミン N-ォキシ ド（以下、 T画 0と省略する） が一般に利用される。融解温度 (Tm)の調画を利用 することによって、 前記ォリゴヌクレオチドのァニールを限られた温度条件の下 で調整することができる。更にべタイン (N, N， N， -trimethylglycine)ゃテトラアル キルァンモユウム塩は、 その isostabilize作用によつて鎖置換効率の向上にも有 効である。 ベタインは、 反応液中 0. 2〜3. 0 M、 好ましくは 0. 5~1· 5鹏度の添加 により、 本発明の核酸増幅反応の促進作用を期待できる。 これらの融解温度の調 整剤は、 融解温度を下げる方向に作用するので、 塩濃度や反応温度等のその他の 反応条件を考慮して、 適切なストリンジエンシーと反応性を与える条件を設定す る。
Tm調整剤を利用することにより、 酵素反応に好適な温度条件を容易に設定する ことができる。 また Tm調 »Jを反応液中に共存させることによって、 2本鎖を铸 型とする相補鎖合成反応を迅速に進めることが可能となる。 Tmは塩基配列とその 長さによって変動する。 したがって、 酵素活性を維持できる条件と、 本発明の条 件を満たすィンキュベーションの条件とが一致するように、 Tm調整剤の使用量を 調整することが望ましい。 本発明の開示に基づいて、 プライマーの塩基配列に応 じて適切な 調 の使用量を設定することは、 当業者が通常行いうる。 たとえ ば、 ァニールする塩基配列の長さとその GC含量、 塩濃度、 および Tm調翻の濃度 に基づいて、 Tmを算出することができる。
このような条件下における 2本鎖の核酸に対するプライマーのァニールは、 お そらく不安定であると推測される。 しかし鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒す るポリメラーゼとともにィンキュベートすることにより、 不安定ながらプライマ 一を合成起点として相補鎖が合成される。 相補鎖合成の進行にともなって、 合成 された相補鎖と ,核酸とのハイブリダイズは次第に安定化されることになる。 以下に示すような DNAポリメラーゼは、 2本鎖からなる^ M核酸に対してプライマ 一を合成起点として、 相補鎖の合成を触媒することができる。
本発明による核酸の合成方法を支えているのは、 鎖置換を伴う相補鎖合成反応 を触媒する DNAポリメラ一ゼである。 この種の DNAポリメラーゼには、 以下のよう なものが知られている。 また、 これらの酵素の各種変異体についても、 それが配 列依 #Sの相補鎖合成活性と鎖置^¾性を有する限り、 本発明に利用することが できる。 ここで言う変異体とは、 酵素の必要とする触媒活性をもたらす構造のみ を取り出したもの、 あるいはアミノ酸の変異等によって触媒活性、 安定性、 ある いは耐熱性を改変したもの等を示すことができる。
これらの DNAポリメラーゼは、反応条件のもとで必要な反応を達成できる量が用 いられる。 たとえば、 Bst DNAポリメラーゼであれば、 反応液 2 5 μ Lあたりたと えば 2〜2 0 ϋ、 通常 5— 1 O Uとすることにより、 短時間で十分な量の合成生成 物を生じることができる。 Bst DNAポリメラーゼ
Bca (exo-) DNAポリメラ一ゼ
DNAポリメラ一ゼ Iのタレノウ ·フラグメント
Vent DNAポリメラーゼ
Vent (Exo-) DNAポリメラーゼ (Vent DNAポリメラ一ゼからエタソヌクレア一ゼ活性 を除いたもの）
DeepVent DNAポリメラ一ゼ
DeepVent(Exo -) DNAポリメラ一ゼ（De印 Vent DNAポリメラーゼからェクソヌクレア ーゼ活性を除いたもの）
Φ 29ファージ DNAポリメラーゼ
MS- 2ファージ DNAポリメラーゼ
Z-Taq DNAポリメラーゼ （宝酒造）
KOD DMポリメラーゼ （東洋紡績）
これらの酵素の中でも Bst DNAポリメラーゼゃ Bca (exo-) DNAポリメラーゼは、あ る程度の耐熱 を持ち、 触 性も高いことから特に望ましい酵素である。 本発 明は、 場合により 2本鎖の状態にある核酸に対して、 プライマーを合成起点とす る工程と、 相補鎖合成反応とを同一条件下で行う。 このような反応は、 しばしば ある程度の加温を必要とすること力ゝら、 酵素が耐熱性であることは望ましい条件 の一つである。 耐熱性の酵素を用いることにより、 幅広い反応条件に対応するこ とができる。
たとえは nt (Exo -) DNAポリメラーゼは、鎖置 性と共に高度な耐熱性を備え た酵素である。ところで DNAポリメラーゼによる鎖置換を伴う相補鎖合成反応は、
1本鎖結合タンパク質（single strand binding protein)の添加によって促進さ れることが知られている（Paul M. Lizardi et al, Nature Genetics 19, 225-232,
July, 1998)。この作用を本発明に応用し、 1本鎖結合タンパク質を添加すること によつて相補鎖合成の促進効果を期待することができる。 Vent (Exo-) DNAポリメラ ーゼに対しては、 1本鎖結合タンパク質として T4 gene 32が有効である。
なお 3， - 5'エタソヌクレアーゼ活性を持たない DNAポリメラーゼには、 相補鎖合 成が の 5'末端に達した部分で停止せず、 1塩基突出させた状態まで合成を進 める現象が知られている。 本発明では、 相補鎖合成が末端に至ったときの 3'末端 の配列が次の相補鎖合成の開始につながるため、このような現象は望ましくない。 しかし、 DNAポリメラーゼによる 3' への塩基の付加は、 高い確率で Aとなる。 したがって、 dATPが誤って 1塩基付加しても問題とならないように、 3'末端から の合成力 で開始するように配列を選択すれば良い。また、相補鎖合成時に 3'末端 がたとえ突出してしまっても、これを消化して blunt endとする 3，→5，エタソヌク レアーゼ活性を利用することもできる。 たとえば、 天然型の Vent DNAポリメラー ゼはこの活性を持つことから、 Vent (Exo- )DNAポリメラ一ゼと混合して利用するこ とにより、 この問題を回避することができる。
これらの DNAポリメラーゼに対して、 PCRなどで一般に用いられている Taqポリメ ラーゼ等の DNAポリメラーゼは、通常の条件では鎖置換作用は実質的に見られない。 しかし、この種の DNAポリメラーゼであっても、鎖置換が可能な条件を与えること ができる場合には、 本発明に利用することができる。
本発明の核酸の合成方法は、 核酸を鍵として用いる。 麵とする核酸のタイ プは限定されない。 したがって、 2本鎖、 1本鎖、 あるいは 3本鎖、 更に DNA-RN Aハイプリッド、あるいは人工的なヌクレオチド誘導体を含む DNAや RNAの誘導体等 を铸型とすることができる。
本発明の核酸は、精製されていても良いし、未精製であることもできる。また、 細胞内に存在する状態 (in situ)で、本発明の方法を適用することもできる。細胞 内の 2本鎖核酸を,とすることによって、ゲノムの in situ解析が可能となる。 また細胞内の mRNA ( 1本鎖核酸） を鍵として利用することもできる。
本発明において cDNAを,として用いる場合、 cDNAを合成する工程と、 本発明 に基づく核酸の合成方法とを、同一の条件下で実施することができる。脆を として cDNAの第 1鎖を合成すると、 DM -靈ノヽィプリッドによる 2本鎖核酸が完成 する。 この 2本鎖核酸を本発明における,として、 核酸の合成方法を実施する ことができる。本発明の核酸の合成方法に用いる DNAポリメラーゼが、逆転写酵素 活性を備えるものであれば、 単一の酵素を用い、 同一の条件下で核酸の合成を行 うことができる。たとえは ca DNAポリメラーゼは、鎖置擬性を有し、逆転写酵 素活性を併せ持つ DNAポリメラーゼである。なお、第 2鎖を合成したうえで完全な 2本鎖 cDNAとした後に、 本究明による核酸の合成方法を適用しうることは言うま でも無い。
本発明においては、 2本鎖の状態にある核酸を鍵とするとき、 任意のプライ マーを加え、 このブラィマーを起点とする相補鎖合成反応が達成できる条件のも とでインキュベートすることにより、 ィンサートプライマーゃィンナープライマ 一がァユールすべき領域を塩基対結合が可能な状態とすることができる。
任意のプライマーとは、 各種のプライマーがァニールすべき領域を塩基対結合 可能な状態とするために用いられる。 したがって、 任意のプライマーは、 と なる 2本鎖核酸の、 ィンサートプライマーゃィンナープライマーがァ-ールすべ き核酸鎖に対して、 その相補鎖を,として相補鎖合成を開始できるものである 必要がある。 更に、 本発明における任意のプライマーを合成起点とする相補鎖合 成は、 ィンサートプライマーゃィンナープライマーがァニールすべき領域に向か つて進行するような位置関係にあるべきである。
言いかえれば、 ィンナープライマーゃィンサートプライマーを起点とする相補 鎖合成反応において翻として機能する領域の、 任意の領域において合成起点を 与えるようにデザインすることができる。 任意のプライマーは、 この条件を満た す限り、 任意の領域に相補的な塩基配列からなることができる。 たとえば、 イン ナープライマーやインサ一トプライマーのセットの一方を、 任意のプライマーと して用いることもできる。 このような態様は反応に必要な成分を少なくすること から、 本発明における望ましい態様の一つである。 特に、 異なる,核酸に対してインサートプライマーとインナープライマーを 用いる場合には、 インナ一プライマーやインサートプライマーは、 1つの铸型に 対して 1セットしか与えられない。 このようなケースでは、 これらのプライマ一 に加えて、 任意のプライマーを加え、 これらのプライマーがァニールすべき領域 を塩基対結合が可能な状態とすることで、 迅速な反応を期待できる。
なお任意のプライマーによる 2本鎖の状態にある核酸を,とする相補鎖合成 反応が達成できる条件とは、 実際には次の複数の工程を同じ条件下で進めること ができる条件ということができる。
i) 2本鎖の状態にある铸型核酸に対して任意のプライマーが合成起点を与える ii) 前記合成起点を利用して相捕鎖合成反応が進む
プライマーは少なくともそれがァニールすべき領域が 1本鎖でなければ合成起 点を与えることはできないと考えられていた。 そのため従来は、 2本鎖の核酸を 铸型とする には、 プライマーのァユールに先立って必ず変性によって 1本鎖 とする工程が実施されてきた。 しかし必ずしも完全な 1本鎖としなくとも、 何ら かの手段によって 2本鎖が不安定ィヒされる条件のもとで、 プライマーとインキュ ペートすることにより、 合成起点を与えることができる。 2本鎖が不安定化され る条件としては、 たとえば融解温度 (Tm)近くにまで加温する方法を示すことがで きる。 あるいは、 更に Tm調翻を存在させることも有効である。
2本鎖核酸が不安定化する条件下で、 プライマーをィンキュベートすることに よって相補鎖が合成される現象は、 既に報告されている （特表平 11 - 509406;W097 /00330) 。 しかし報告された条件では、 実際にはごくわずかな量の合成生成物し 力期待できない。 2本鎖核酸の不安定化を利用してプライマーを合成起点として 相補鎖合成を行うことは、 原理的には可能であるが、 1本鎖の核酸を,とする 反応ほど効率的な反応を期待できないのである。 PCR法のような温度変化を必要と する相補鎖合成反応との組み合わせにおいては、 2本鎖の不安定化を利用した相 補鎖合成反応の効率が全ての相補鎖合成反応に影響するので、 実用的な反応効率 を達成することは困難である。 このことが公知の方法における不十分な増幅効率 の原因となっていた。
一方本発明では、 2本鎖核酸の不安定化に基づく相補鎖合成反応を、 もともと 等温で進行する核酸合成反応のためのプライマーがァニールすべき領域を供給す ることに応用したことによって、 2本鎖の不安定化に基づく相捕鎖合成の効率の 低さをネ甫うことができるという新規な知見に基づいている。
本発明の核酸の合成方法、 あるいは増幅方法において、 核酸には任意の核 酸を用いることができる。 まず^ 核酸は、 1本鎖、 2本鎖、 あるいは 3本鎖で あることができる。 1本鎖でなくとも、 適切な条件を与えれば、 変性工程無しで ,核酸として利用しうることは既に述べた。また,とする核酸は、 D Aであつ ても RNAであっても良い。 RNAを铸型とするときには、 RNAを,として^ 依存' |4 の相補鎖合成反応を触媒する酵素を利用することができる。 R Aを «とする逆転 写酵素活性を有し、かつ鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラーゼ が知られている。たとえは ca DNAポリメラーゼは、鎖置^ ¾性を有し、逆転写酵 素活性を併せ持つ DNAポリメラーゼである。なお、第 2鎖を合成したうえで完全な 2本鎖 cDNAとした後に、 本発明による核酸の合成方法を適用しうることは言うま でも無い。 本発明において、 核酸の由来は制限されない。 通常核酸は生体材料に 由来するが、 人工的に合成された核酸を^ Mとすることもできる。
本発明に基づく核酸の合成方法、あるいは核酸の増幅方法は、 DNAチップに固定 するための DNAの合成に有用である。 以下に本発明を利用して、 DNAチップを調製 する工程を例示する。
まず、 DNAチップに固定すべき核酸の塩基配列に基づいて、本発明のプライマ一 をデザインする。 本発明の開示に基づいて、 所望の核酸の増幅に必要なプライマ 一をデザィンすることは、当業者が通常行いうる。デザインされたプライマーを、 本発明の核酸の増幅反応に必要な成分とともに、 適当な条件下でィンキュベート することにより、 反応液中には、 目的とする塩基配列が連結した LAMP法に特有の 構造を有する核酸が多量に生成される。 得られた生成物は、 そのまま、 あるいは 適当な処理の後に、 公知の方法によって基板上に固定される。 基板には、 ガラス スライドゃナイロンメンプレンなどが用いられる。 基板上に核酸を固定化する方 法は公知である。
本発明に基づいて DNAチップに固定するための核酸を合成するとき、,として は任意の核酸を利用することができる。より具体的には、様々な細胞に由来する c DNAクローン等を,として用いる。あるいはゲノムを铸型として、任意の領域を 本発明によつて増幅し、 DNAチップに固定化することもできる。
たとえば LAMP産物は、 ィンパーテットリピート構造になることが構造上の特徴 である。 すなわち、 相補的な塩基配列が、 交互に連結された構造である。 このよ うな構造を持つ核酸においては、 相補的な塩基配列からなる領域同士で分子内ァ ニールが起きハイプリ効率に影響を与えることが予想される。 しかし分子内ァニ ールによる問題は、 簡単な処理で容易に解消することができる。 LAMP産物は、 た とえば特定の位置に導入しておいた制限酵素サイトを利用して、 制限酵素処理に より断片化することができる。 レ、つたん断片化された核酸は、 もはや分子内ァニ ールを起こすことは無い。
一般に、固定化されている DNAの長さが長いほどプローブとの反応性は良いとさ れている。 これまでに LAMP法で合成された核酸は、 インナ一プライマーに挟まれ た領域の長さが 20- 100 bp程度のものであった。この程度の長さでは、プローブと の反応性を高めることが難しい。 本発明によれば、 これまでに試みられたことの 無い、比較的長い DNAを LAMP法に基づいて増幅することができる。その結果、本発 明の合成生成物を利用して調製した DNAチップは、公知の LAMP法で合成した核酸を 用いたチップに比べて効率よくシグナルを検出できる。
DNAチップを用いた遺伝子の解析方法として、たとえば次のような手法が一般に 用いられている。 まず異なる 2つの細胞に由来する mRNA試料から調製した標識 cD NAをマイクロアレイに対してハイプリダイズさせる。次に、 DNAチップに固定化し た核酸にハイプリダイズしたプローブのシグナルを測定する。 各核酸ごとにシグ ナルを測定し、 シグナル強度を解析すれば、 各々の mRNAの相対的な発現レベルが 比較される。 このとき、 チップ上に固定ィ匕された核酸の間でハイプリダイズ効率 にばらつきがあると、 解析結果の信頼性が失われる原因となる。 したがって、 よ り長い核酸を固定し、 十分な反応性を与えることには意義がある。
更に、 本発明に基づいて 2つの異なる遺伝子に由来する塩基配列を連結した標 的塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成し、 DNAチップにおけるプローブとし て用いることもできる。一般に DNAチップにおいては、遺伝子ごとにプロープを用 意しなければならない。 一方本発明によって合成された異なる遺伝子由来の塩基 配列を連結したポリヌクレオチドを利用すれば、 1つのポリヌクレオチドが 2つ の遺伝子に対するプローブとして機能する。 さらに、 それぞれの遺伝子に対する プローブの量が均等になるので、 シグナルを較正 （ノーマライズ） する必要がな い。
本発明の核酸の合成方法は、遺伝子のクローユングに応用することができる。 P CR法に基づく遺伝子のクロー二ングは、 PCR法の反応産物を制限酵素で消化し、ク ローニングベクターに組み込んで行われる。 本癸明においても同様に、 LAMP産物 を適当な制限酵素で消化すれば、 クローニングべクターに組み込むための断片と することができる。
LAMP産物は、 DNAチップに固定すべき核酸の合成の他、標識プローブの調製に利 用することもできる。 すなわち、 LAMP産物を^ Sとしてプライマ一ェクステンシ ョンによる標識プロープを調製することができる。 LAMP法では多量の DNAを生成す るので、 標識プローブを容易に、 カゝっ多量に調製することができる。 このように して調製された標識プローブは、ハイプリダイゼーションアツセィや、 DMチップ による解析用のプローブとして有用である。
また本発明の核酸の増幅方法は、 発現用の遺伝子の取得に利用することができ る。 ヒトのゲノムドラフトの塩基配列情報から、 蛋白質を構成するアミノ酸の平 均は 352アミノ酸であると予測された。これは 1056 bpの DNAに相当する。本発明の 方法では、 少なくとも約 500bp前後の DNAを増幅することができる。 つまりヒトの 平均的な蛋白質の約半分の領域を力パーすることができることになる。 タンパク 質の機能解析はボストゲノム世代の重要な研究テーマに位置付けられている。 そ してそのためには、 蛋白質を発現させる必要がある。 本発明は、 遺伝子の翻訳領 域の増幅に貢献できると考える。
更に本発明の核酸の増幅方法による生成物を指標として、 核酸を検出、 あるい は定量することができる。 すなわち、 特定の塩基配列の増幅を目的としてデザィ ンされたプライマーを用いたときに、 多量の生成物が生じた^ こは、 その塩基 配列が試料中に存在していることがわかる。 更に、 シグナルの強度や、 一定のシ グナル強度に達するまでの反応時間を指標として、 試料中の標的塩基配列を含む 核酸の存在量を比較することもできる。
合成される核酸を測定する方法は公知である。 LAMP法によつて合成された核酸 は、 1本鎖とは言え相補的な塩基配列から構成されるため、 その大部分が塩基対 結合を形成している。 この特徴を利用して、 合成生成物の検出が可能である。 ェ チジゥムプロマイド、 SYBR Green I、 あるいは Pico Greenのような 2本鎖特異ィ ンタ一力レーターである蛍光色素の存在下で本発明による核酸の合成方法を実施 すれば、 生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。
これをモニタ一すれば、閉鎖系でリアルタィムな合成反応の追跡が可能である。 この種の検出系は PCR法への応用も考えられてレヽるが、プライマーダイマー等によ るシグナルの発生と区別がつかないことから問題が多いとされている。 しかし本 発明に応用した場合には、 非特異的な塩基対結合が増加する可能性が非常に低い ことから、 高い感度と少ないノイズが同時に期待できる。 2本鎖特異インタ一力 レーターと同様に、 均一系の検出系を実現する方法として、 蛍光エネルギー転移 の利用が可能である。
加えて、 本発明の核酸の増幅方法に基づいて、 変異を検出することができる。 麵核酸が予測された塩基配列でなかった場合に、 本発明の核酸の合成方法、 あ るいは増幅方法を構成する、 いずれかの相補鎖合成反応が阻害されるようにして おけば、 反応生成物の量、 あるいは有無を指標として変異を検出することができ る。 本発明による変異の検出方法について、 以下に具体的に述べる。
本発明の核酸の合成方法、 あるいは増幅方法は、 複数の相補鎖合成反応によつ て構成される。 このうち、 インサートプライマ一の 3' を起点とする相補鎖合 成反応、 あるいはィンサートプライマーを,として合成された相補鎖の 3'末端 を起点とする相補鎖合成反応は、 本発明に固有の反応である。 本発明による変異 の検出方法においては、 これらィンサートプライマーに関連する 2種類の相補鎖 合成反応の、 少なくともいずれかが、 讓核酸の塩基配列によって調節されるよ うにする。
本発明において、 ィンサートプライマーの 5'末端を変異を検出すべき領域に相 当するようにデザィンするときには、 2つのィンサ一トプライマーの 5，末端の塩 基配列が相補的な塩基配列とならないようにするのが望ましい。 具体的には先に 述べたィンサートプライマーの具体例のうち、 [»S核酸中の連続する標的塩基 配列を合成するためのィンサートプライマー 2 ] として説明したようなィンサー トプライマーを用いれば良い。 この例では、 インサートプライマーを踌型として 合成された相補鎖は、 常に標的塩基配列からなる領域にァニールして、 塩基配列 のチェック機構が作用することになる。
これに対して、 ィンサートプライマーの 5' が相補的な塩基配列で構成され ていた場合には、 インサートプライマーを,として合成された核酸は、 インサ ートプライマーの塩基配列に由来する塩基配列に対してァニールすることになる。 標的塩基配列に由来する塩基配列に対してァニールしなければ、 塩基配列をチェ ックすることはできない。
,依存型の相補鎖合成反応は、 合成起点となる 3， 付近の塩基配列の組み 合わせに大きな影響を受ける。 したがって、 インサートプライマーの 3'末端、 お よび Zまたは 5'末端付近を、 変異を検出すべき領域に相当するように、 インサー トプライマーをデザインすればよい。 より具体的には、 3' ^®から 5¾S、 より 望ましくは 2 ~ 4塩基の領域に検出すべき変異が位置するようにデザィンすれば、 铸型核酸における塩基配列の変ィ匕によって相補鎖合成反応を調節することができ る。 インサートプライマーを,として合成された相補鎖の 3， «で、 相補鎖合 成を調節する場合にも、 同様の条件で、 塩基配列をデザインできることは言うま でもない。
本発明に基づいて铸型核酸の塩基配列の変異を検出するとき、 ィンナープライ マーの 3'末端、 あるいはインナープライマーを^ Mとして合成された相補鎖の 3， 末端を起点とする相補鎖合成反応を、 核酸の変異によつて調節することもで きる。 そのためには、 前記のように、 相捕鎖合成の起点となる 3' 付近が、 検 出すべき変異に相当するように各プライマーの塩基配列をデザィンする。 特に、 インナープライマーを,として合成される相補鎖の 3' は、 ,に由来する 塩基配列からなる領域に対して何度もァニールして相補鎖合成の起点となること から、 変異のチェック機構を厳しくすることができる。 インサートプライマーに 合わせて、 インナープライマーを利用して変異の検出を行えば、 1組のプライマ 一によつて、複数個所の変異を同時に解析することができる。本発明においては、 ィンサートプライマーとィンナーブラィマーの間隔を自由に設定することができ るので、 検出すべき変異が離れて存在していても、 問題とならない。
本発明の変異の検出方法を利用して複数の変異を同時に解析するときには、 検 出すべき変異の種類に合わせて、 様々な解析手法を利用することができる。 たと えば、 2つの SNPs Aおよび Bが特定の形質とリンクしている場合を例に、 本発明 による解析手法を説明する。 Aと Bが特定の塩基の組み合わせであるときに、 特 定の形質が発現するときには、 その組み合わせに限って、 相補鎖合成反応が構成 されるように、 プライマーをデザインする。 反応生成物の生成は、 試料に含まれ る核酸における Aと Bの塩基が、 いずれも検出すべき塩基であることを意味して いる。
あるいは、 4 X 4 = 1 6とおりの組み合わせのプライマーを用いれば、 2つの SNPsに対して、 あらゆる塩基の組み合わせを検出することができる。 なお、 全て の組み合わせを検出しようとするとき、 必ずしも 1 6とおりの組み合わせの全て を実験的に確認する必要はない。たとえば Aが塩基 aであるときに、 Bの塩基を決 定する場合、 Bについて a、 t、および cのためのプライマーをデザインして 3通り の実験を行えば、反応生成物が観察されない場合には、 Bは ateのいずれでもない こと、.すなわち gであることが推測できる。 したがって、 この核酸の塩基は、 A— aZB _gであると決定することができる。 すなわち、 1 2通りの組み合わせによ つて、 2点の塩基の全ての組み合わせを決定することもできる。
このように、 複数個所の変異を同時に確認できることは、 本発明の大きな特徴 である。 しかも本発明による変異の検出方法は、特異性に優れる。 PCR法では、プ ライマーを^ Mとして写し取った核酸に対してプライマーがァニールし、 相補鎖 合成反応が行われるので、 1塩基の変異の検出を検出することは困難とされる。 しかし本発明では、 相補鎖合成反応が、 醒に由来する塩基配列に対してァニー ルする領域によってコントロールされる。 つまり、 より特異的に変異を検出する ことができる。
本発明による核酸の合成方法、 あるいは増幅方法に必要な各種の試薬類は、 あ らかじめパッケージングしてキットとして供給することができる。 具体的には、 本発明のために、 インサートプライマー、 インナープライマー、 アウタープライ マー、 あるいはループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、 相補 鎖合成の基質となる dNTP、鎖置換をともなって相補鎖合成を行う DNAポリメラーゼ、 酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、 更に必要に応じて合成反応生成物の分離 や切断のために必要な試薬類で構成されるキットが される。 たとえば本発明 のキットが、 核酸の検出を目的とする場合には、 本努明の合成方法によって合成 される核酸を検出するための検出剤を組み合せることができる。 あるいは、 本発 明に基づいて融合蛋白質をコードする DNAを得ることを目的とするキットにお いては、融合パートナーをコードする D NAをキットに組み合せることができる。 特に、 本発明の望ましい態様においては、 反応途中で試薬の添加が不要なこと から、 1回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給することにより、 サンプルの添加のみで反応を開始できる状態とすることができる。必要な DNAの調 製を反応容器のままで行えるようなシステムとすれば、 反応後の容器の開封を全 面的に廃止することができる。 これは、 コンタミネーシヨンの防止上、 たいへん 望ましいことである。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明による核酸の合成方法の、 基本的な反応原理を示す図。 図中、 各鎖の 3'末端を矢印で示した。
図 2は、 本発明による核酸の合成方法の、 基本的な反応原理を示す図 （図 1の 続き） 。
図 3は、 本発明による核酸の合成方法の、 基本的な反応原理を示す図 （図 2の 続き） 。
図 4は、 本発明による核酸の合成方法の、 基本的な反応原理を示す図 （図 3の 続き） 。
図 5は、 本発明による核酸の合成方法の、 基本的な反応原理を示す図 （図 4の 続き） 。
図 6は、 実施例において設定したィンナープライマーとィンサートプライマー の醒とする核酸に対する位置関係を模式的に示す図。
図 7は、 インサートプライマ一を用いた LAMP法の反応生成物をァガロース電気 泳動した結果を示す写真である。 各レーンは左から順に次の結果を示して！/、る。 レーン 1： 1 0 Obp DNAラダー
レーン 2：インサートプライマーなし
レーン 3：インサートプライマー 10 pmol/25/z L添加
レーン 4：ィンサートプライマ一 20 pmol/25/z L添加
レーン 5：インサートプライマ一 30 pmol/25 L添加
レーン 6：ィンサートプライマー 40 pmol/25 i L添加
レーン 7：ィンサートプライマー 50 pmol/25/z L添口
図 8は、 インサートプライマーを用いた LAMP法の反応生成物を.、 制限酵素 BamH Iで消ィ匕しァガロース電気泳動した結果を示す写真である。各レーンは左から順に 次の結果を示している
レ一ン 1： 1 0 Obp DNAラダー
レーン 2：一：生成物の BamHr消化物 （インサートプライマーを用いないとき） レーン 3： +：生成物の BamHI消化物 （インサートプライマーを用いたとき） 図 9は、 顯核酸の驢配列と、 各プライマーの位置関係を示す図。
図 1 0は、 錶型上において離れた位置にァニールするインサートプライマーを 用 ヽた LAMP法の反応生成物を、制限酵素 EcoRVで消化しァガロース電気泳動した結 果を示す写真である。
レーン 1： 1 0 Obp DNAラダー
レーン 2：反応生成物 EcoRV消化前
レーン 3：反応生成物を EcoRVで消化後
図 1 1は、 ィンサートプライマーの設計位置を示す図。
図 1 2は、 LAMP産物の電気泳動した結果を示す写真である。
レーン 1：マーカー
レーン 2：インサートプライマー無し
レーン 3：ィンサートプライマー InsF/R
レーン 4：ィンサートプライマー InsF2/R2 図 1 3は、 LAMP産物を制限酵素 BssHIIで消化しァガロースゲル電気泳動した結 果を示す写真である。
レーン 1：マーカー
レーン 2： InsF/R、 BssHII未消化物
レーン 3： InsF/R、 BssHII消化物
レーン 4： InsF2/R2、 BssHII未消化物
レ―ン 5： InsF2/R2、 BssHII消化物 発明を実施するための最良の形態
実施例 1 ：
<ィンサートプライマーの設計 >
LAMP法に基づく核酸増幅反応において、 反応系に付加的なプライマーを加える ことについて検討した。 プライマーを設計する場所は、 インナープライマーに挟 まれた領域である。 またプライマーの方向は、 F1あるいは R1と同じ向きとし、 こ れらのプライマーの 5'部分が重なるように設計した。 R1あるいは F1とは、 L着法 において、 自身を铸型とする相補鎖合成反応にあたり、 自身にァニールする 3'末 端を含む領域である。 この付加的なブライマーをィンサートプライマー（Insert primer)と名付けた。各プライマーと標的塩基配列との位置関係を図 6に示した。 <ィンサートプライマーを用いた反応 >
pBSTspRIベクターに挿入した 387bP DNA断片を,として用い、以下に示す反応 条件で本発明に基づく核酸の合成反応を行った。 讓として用いた核酸の塩基配 列を配列番号： 1 (ヒト 'インターロイキン 8遺伝子の塩基配列） に示した。 配 列番号： 1の塩基配列は、 各プライマーカ認識する領域を含む。 この顯核酸に 対して、 以下に記載の塩基配列からなる各種のプライマーを合成して用いた。 インナープライマー F /Inner F (配列番号： 2)
5' -GTGTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTTCACACAGGAAACAGCTATG-3' インナープライマー R/inner R (配列番号： 3 )
5' -TGTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACCAGTCACGACGTTGTAM-3'
アウタープライマー F /Outer F (配列番号： 4 )
5' -GAATTGTGAGCGGATAACAAT-3'
アウタープライマー R/0uter R (配列番号： 5 )
5， -GTAACGCCAGGGTTTTCC-3'
インサートプライマー F /Insert F (配列番号： 6 )
5' -CATCAAATATTTGTGCAAGAATTTGGAAAA-3'
インサートプライマー: /Insert R (配列番号： 7 )
5， -ATATTTGATGCTTAAATAAATACATAAATA-3'
反応液組成 （25 L中）
20 mM Tris-HCl pH 8. 8
10 mM KC1
10 mM (NH4) 2S04
4 mM MgS04
1 M Betaine
0. 1% Triton X- 100
0. 4 mM dNTPs
8 U Bst DNAポリメラーゼ （NEW ENGLAND BioLabs)
プライマー：
1600 nMインナープライマー F/Inner F
1600 nMインナープライマ一 R/Inner R
400 nMアウタープライマー F/0uter F
400 nMアウタープライマー R/0uter R
鏡型とした核酸は熱変性をしないものを用意し、 反応液を 6 5 °Cでォ一パーナ イトインキュベートした。 このとき、 インサートプライマー （インサートプライ マー F/Insert Fとインサートプライマー R/Insert R) を終濃度 10、 20、 30、 40、 50 pmol/25 Lになるように同時に加えた。 この条件で、インサートプライマーの 添加量は、インナ一プライマー （1 6 0 0 nM=4 O mol/25/i L) に対して、 0 . 2 5〜1 . 2 5倍となる。 上記反応液の 5 μ Lに 5 μ Lの loading buf erを添加し、 2% ァガロースゲル（0. 5% TBE)を使って、 0. 5時間、 100 Vで電気泳動した。分子サイ ズマーカーとして、 1 0 Obp DNAラダー（NEW ENGLAND BioLabs)を使用した。泳動 後のゲルをェチジゥムブ口マイド（EtBrと省略する）で染色して核酸を確認した。 結果は図 7に示すとおりである。 各レーンは次のサンプルに対応している。
レーン 1 ： 1 0 Obp DNAラダー
レーン 2：ィンサートプライマー 10 pmol/25/i L添加
レーン 3：ィンサートプライマー 20 pmol/25/z L添加
レーン 4：ィンサートプライマー 30 pmol/25〃L添加
レーン 5：ィンサートプライマー 40 pmol/25/ L添加
レーン 6：ィンサートプライマー 50 11101/25 し添加
この結果、 インサートプライマーの濃度が増加するのに従い予想されるサイズ の明瞭なパンドが確認できた。 これは、 インサートプライマーによって、 期待さ れた反応が進行していることを示している。 一方、 インサートプライマーを加え ない^ 8 こはスメァなパンドが観察され、 非特異的な増幅が起きている可能性が 示唆された。
ぐ反応産物の BamHI消化 >
上記反応産物が目的とする構造を有することを確認するために BamHIで消化し た。 制限酵素を使った消ィ匕によって理論どおりの断片を生じる一方、 図 7で観察 された高サイズのスメァなパターンや泳動されないパンドが消滅すれば、 これら がいずれも本発明によって合成された 1本鎖上に相補的な塩基配列を連結した核 酸であることが確認できる。 ここでは 40 pmol/25 Lのインサートプライマーを 使用した反応産物を使用した。 の反応液を QIAquick PCR purification kit (QIAGEN) を用いて精製し、 5 0/ί Lの Tris/HCl pH8. 0で溶出した。このうち 1〃 Lを BamHIにて 3 7 °C、 1時間消化 した。消化物を 2 %ァガロースゲルを使って 100 Vで 30分間泳動した。泳動後、ゲ ルを Etbrで染色し核酸を検出した。 分子量マーカーは 1 0 Obp DNAラダー (NEW E NGLA D BioLabs)を用いた。結果は図 8に示すとおりである。各レーンは次のサン プルに対応している。
レ一ン 1： 1 0 Obp DNAラダー
レーン 2：―：生成物の BamHI消化物 （インサートプライマーを用いないとき） レーン 3： +：生成物の BamHI消化物 （インサートプライマーを用いたとき） ィンサートプライマーを加えていないものでは目的とするパンドが確認できな かったのに対して、 加えたものでは 400 bp付近にパンドが検出された。 なおイン ナープラィマーで挟まれた領域は 396 bpである。
以上の結果より、 インサートプライマーを用いると、 比較的長い標的塩基配列 を容易に、 しかも特異的に増幅できることが確認された。
実施例 2 ：
<ィンサ一トプライマーを用いた LAMP反応 >
pBSTspRIベクターに揷入したラムダ DNA断片 (528 bp Sau3AI断片;配列番号 1 5 )を鎵型として用い、 以下に示す反応条件で LAMP反応を行った。 図 1 1にはプ ライマーの位置、 およぴ制限酵素切断部位を示す。 このとき、 以下に記載の塩基 配列からなるィンサートプライマー（InsFと InsR、あるいは InsF2と InsR2) を終濃 度 400 nMになるように同時に加えた。 インチープライマーおよびアウタープライ マーの濃度は以下の通りである。 またィンナープライマーとアウタープライマー の塩基配列は実施例 1と同じである。 インナープライマー Fおよびインナープラ イマ一R = 800 nM, アウタープライマー Fおよびアウタープライマー R = 200 nM。 増幅後、 2%ァガロースゲル電気泳動し、 EtBrで染色した。 この結果、 予想さ れる位置にパンドが確認できた （図 1 2 )。 インサートプライマー F /Insert F (配列番号： 1 6 )
5' -TAATAGCTTGAAATGATGAAGAGCTCTG-3'
インサートプライマー R/Insert R (配列番号： 1 7)
5' -CAAGCTATTAAATATTGCTAACAGGTATCG-3'
ィンサートプライマー F 2 /Insert F2 (配列番号： 1 8 )
5' -TAATAGCTTGAAATGATGAAGAGCTCTGTGTTTGT-3'
インサートプライマー R 2 /Insert R2 (配列番号： 1 9 )
5' -CATTTCAAGCTATTAAATATTGCTAACAGGTATCGTTTG-3'
<LAMP産物の BssHII消化 >
上記 LAMP産物が目的とする構造を有することを確認するために BssHII消化を行 つた。 反応産物を含む 25/ί 1の反応液を QIAquic PCR purification kit を用いて 精製し、 50/i lの Tris/HClpH8. 0で溶出した。 このうち 1 ^ 1を BssHIIにて 37°C、 1 時間消化した。 図 1 2のラダーを形成した増幅産物を BssHIIで消化すれば、 図 1 1の中の BssHIIで挟まれた配列に相当する部分が約 600 bpのメィンパンドとして 生成するはずである。
消化物を 2%ァガロースゲルを使って 100 Vで 30分間電気泳動した。泳動後、ゲル を EtBrで染色し核酸を検出した。 マーカーは 100 bp DNAラダー (NEW ENGLAND Bio Labs) を用いた。 この結果、予想される位置にパンドが確認できた （図 1 3 )。今 回、 インナ一プライマーで挟まれた領域は 536 bpである。 以上より、 別の鏡型を 用いたときでもインサートプライマーを用いると、 比較的長 、,を容易に増幅 することができた。 また、本実施例では 2種類のィンサートプライマー（InsF/R、 および InsF2/R2) を設計し、 いずれのプライマーでも増幅することが可能であつ た。
実施例 3 ：
くプライマーの設計 >
本発明の方法に基づいて、 ,核酸の任意の部分の欠失変異体を合成できるこ と、 並びに中央部分に塩基配列の変異を導入した標的塩基配列の合成が可能であ ることを確認した。 mi ( X W 配列番号： 8 ) に対して、以下の塩基配列から なるオリゴヌクレオチドをインナ一プライマー、 インサートプライマー、 および アウタープライマーとして用いた。
ィンサートプライマー F/Insert F (配列番号： 9 )
5， -CATCAAATATCGGAGAGGATGAATGACG-3'
インサートプライマ— R/Insert R (配列番号： 1 0)
5' -ATATTTGATGACAATGGTCGGGTCAATC-3'
インナープライマー F /Inner F (配列番号： 1 1 )
5， -CCGCCAGTATCCCAGCAGATAATAAAACCTATACCCGCCGG-3'
イン^ "一プライマー: R/Inner R (配列番号： 1 2 )
5' -CGACAGGAAGAACTTGCCGCCTTTCTGTACTGTTGCCACC-3'
ァウタ一プライマ一 F /Outer F (配列番号： 1 3 )
5， -CGTGTGGATGAGGCCATC-3'
アウタープライマー R/Outer R (配列番号： 1 4 )
5' -GTAAACTCCACCCTTCGT-3'
ィンサートプライマーの 5，側には、 リンカ一配列として任意の配列 CATCAAATAT のセンスあるいはアンチセンスをそれぞれ付加した。 上記ィンサートプライマー F /Insert Fおよび、インサートプライマー: /Insert Rは、それぞれ； ID Aの離れ た領域に対してァニールする。 その結果、 図 9に示すように中間部分に位置する [欠失]で示した部分を欠失 (deletion)し、 リンカ一配列 CATCAAATATを介して、 矢印 で挟まれた 2つの領域を連結した塩基配列からなる標的塩基配列が合成されるは ずである。 このとき铸型の塩基配列と標的塩基配列とを比較すると、 図 9におけ る F1/R1間の塩基数で、铸型においては 5 2 5 bp (図 9の上） だったものが、 4 6 bpの標的塩基配列 （図 9の下） として合成される。
ターゲット DNAとして、 DNAは熱変' |4をしないものを用意し、 実施例 1と同じ 組成の反応液に次の濃度のプライマーを加え、 6 5 °Cで 4時間反応させた。
プライマー ：
800 nMインナープライマー F /Inner F
800 nMインナープライマー R/Inner R
800 nMインサートプライマー F /Insert F
800 nMインサートプライマー R/Insert R
200 nMアウタープライマー F /Outer F
200 nMアウタープライマ一 R/Outer R
<変異導入用ィンサートプライマーを用いた LAMP反応 >
LDNA (1 X 106分子） を铸型として用い、 上記に示す条件で本発明の核酸の合 成反応を行った。 25/^の反応液を0^(^:1じ1^ PCR purification kit (QIAGEN) を 用いて精製し、 の Tris/HCl pH8. 0で溶出した。 このうち 1 ^ Lを EcoRVにて 3 7 °C、 1時間消化した。
消化物を 2 %ァガロースゲルを使って 100 Vで 30分間泳動した。泳動後、ゲルを Etbrで染色し核酸を検出した。 分子量マーカーには 1 0 Obp DNAラダ一 (丽 ENG LAND BioLabs)を用いた。結果は図 1 0に示すとおりである。左側のレーンは 1 0 Obp DNAラダー (丽 ENGLAND BioLabs)である。また各レーンは次のサンプルに対 応している。図 1 0から、欠失したときに予測される位置にパンドが検出された。 レーン 1 ： 1 0 Obp DNAラダー
レーン 2：反応生成物 EcoRV消化前
レーン 3：反応生成物を EcoRVで消化後
く EcoRV消化物のクローニング>
上記反応生成物の塩基配列を決定した。 予め EcoRVで消化したベクター （pBlue script) と EcoRVで消化した反応生成物をライゲーションして、 pBS525/EcoRVとし た。更にこのべクタ一をコンビテントセル (DH5ひ）にトランスフォーメーションし た。 トランスフォームした大腸菌をクローニングし、 増殖させた後、 大腸菌から アル力リ S D S法でプラスミドを回収した。
く塩基配列の決定 >
シーケンシング反応は Cy 5. 5標識ベクター特異的プライマ一、 ThermoSequenas e Cycle Sequencing Kit (Amersham pharmacia biotech ¾：用 ヽ、 タイプフィマ 一法を利用して塩基配列を決定した。 DNA塩基配列は自動蛍光 DNAシーケンサー (フアルマシアネ環モデル Seq4x4) を使用して決定した。
<結果>
ィンサートプライマーにはそれぞれ 10塩基のリンカー配列 (CATCAAATAT)を付け ており、 これらは相補的な塩基配列になっている。 インサートプライマーを用い た LAMP反応では、この配列を介してァユールが起こり DNA合成が開始される。これ によりインサートプライマーで挟まれた領域 （図 9の [欠失]) を欠失した配列が 得られることが期待できる。
塩基配列を決定した結果、予測された塩基配列からなる DMが合成されたことを 確認できた。 以上より、 インサートプライマーを用いることにより欠失変異を得 ることが可能であることが示された。 更に、 標的塩基配列以外の塩基配列を付加 したィンサートプライマーを使用することにより、 増幅配列中に塩基を挿入する ことができた。
今回の実験により、 塩基の欠失および挿入を同時に示すことができた。 産業上の利用の可能性
本発明によって、 LAMP法の原理を利用しながら、 公知の LAMP法では知られてい なかった新たな核酸の合成方法が提供された。本発明の核酸の合成方法によれば、 以下のような新たな利点を期待することができる。
まず、 本発明の核酸の合成方法は、 長い標的塩基配列を塩基配列特異的に合成 することができる。 標的塩基配列の末¾域にプライマーを設定する^ Pの LAMP 法では、 条件によっては、 長レヽ標的塩基配列の合成にあたり、 非特異的な合成生 成物が生じてしまうことがあった。 非特異的な合成生成物は、 核酸の合成におい ては、 収率の低下を意味している。
これに対して本発明の方法では、 たとえば 4 0 0塩基を越える.ような長い標的 塩基配列であっても、 非特異的な副生物の産生を抑制し、 しかも迅速に目的とす る核酸を合成することができる。
本発明の核酸の合成方法は、 DNAマイクロアレイに固定化するためのプロープの 合成に有用である。 DNAマイクロアレイに固定化するプローブには数百塩基の長さ を有する DNAが必要とされていることは既に述べた。本発明によれば、 4 0 0塩基 以上の長さの DNAを迅速に、カゝっ容易に合成することができる。また、 LAMP法がも ともと^ Mに対して高度に特異的な合成を期待できる方法であることから、 その 合成生成物には、 高い正確性が期待できる。
次に、 本発明の核酸の合成方法においては、 標的塩基配列の のみならず、 中間にもプライマーを設定する。 この特徴を利用して、 標的塩基配列の中間にも 変異を導入することができる。 現在遺伝子の合成方法として広く普及している PC R法においても、プライマーは標的塩基配列の «部分にしカゝ設定しない。 したが つて、 本発明のように、 標的塩基配列の中央部分にも変異を導入することができ る技術は、 遺伝子操作のための技術としてたいへん有用である。
本発明の遺伝子の合成方法、 あるいは増幅方法によって、 核酸において離 れて位置する複数の領域を連結した塩基配列からなる核酸を得ることができる。 この特徴によって本発明は、 ,核酸の任意の領域を欠失した変異体を自由に合 成することを可能とする。
更に本発明の核酸の合成方法、 あるいは増幅方法によって、 異なる,核酸か ら選択される任意の領域を、 一つの連続する塩基配列として有する核酸を得るこ とができる。 この特徴によって本発明は、 任意の融合蛋白質をコードする遺伝子 を、 自由に合成することを可倉 gとする。

Claims

請求の範囲 次の工程を含む、 標的塩基配列を含む核酸の合成方法。
( 1 ) 5'側から 3'側にかけて次の領域 (a) - (d)を含む、 少なくとも 2種類 の 1本鎖の核酸を生成する工程、 ここで前記 2種類の 1本鎖核酸は、 その 3 ，末端において相補的な塩基配列を有し、 カゝっ標的塩基配列から選択された 塩基配列を含む。
(a)同一鎖上の任意の領域に相補的な塩基配列からなる領域、
(b)領域 (a)が同一鎖上の任意の領域に対してハイブリダイズしたときに ループを形成する領域、
(c)領域 (a)に相補的な塩基配列を含む領域、 および
(d) 3'末端を構成する塩基配列からなる領域
( 2 ) 工程 （1 ) の少なくとも 2種類の 1本鎖の核酸を、 その 3，末端にお いてァニールさせ、鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼに よって相補鎖を合 する工程、 および
( 3 ) 工程 ( 2 ) で合成された核酸の 3' を、 同一鎖上の相補的な塩基 配列からなる領域にァニールさせ、その 3' を起点として相補鎖を合成し、 標的塩基配列からなる 1本鎖の核酸を合成する工程、
工程 （ 1 ) の 1本鎖の核酸の少なくとも 1種類が、 領域 (a)と領域 (c)の ハイブリダィズによって、相補鎖を伴わない 3， を形成する構造を有する 核酸である請求項 1に記載の方法。
工程 （ 1 ) の 1本鎖の核酸の少なくとも 1種類が、 領域 (a)と領域 (c)の ハイプリダイズによって、相補鎖を伴った 3， を形成する構造を有する核 酸である請求項 1、 または請求項 2に記載の方法。
工程 ( 1 ) の 1本鎖の核酸を、 以下の工程によって生成する請求項 1に 記載の方法。 i)標的塩基配列を含む核酸を^ として、少なくとも 1組のインサートプ ライマーを用いて相補鎖を合成する工程；ここでィンサートプライマ一を起 点として合成された相補鎖は、その 5' «を構成する塩基配列が互いに相補 的な塩基配列からなっており、 そして
i i)工程 i)の生成物を,として、 標的塩基配列の 5'末端に相補的な塩基 配列を 3'末端に有し、かつその 5' «に前記 3' を起点として合成される 相補鎖の任意の領域に対して相補的な塩基配列を有するインナ一プライマ 一で相補鎖を合成し、 工程 （1 ) に記載の 1本鎖核酸を生成する工程
5 . ィンサートプライマーが、 互いに相補的な 配列を 5，末端に有する少 なくとも 1組のインサートプライマーである請求項 4に記載の方法。
6 . インサートプライマーが、 その 5，末端における互いに相補的な塩基配列 が RN Aで構成され、力つ 3，末端が RN a s e耐性のポリヌクレオチドから 構成されており、 DNAとハイプリダイズした該 RNAを RN a s eによつ て消化する工程を含む請求項 5に記載の方法。
7. インサートプライマーが、 標的塩基配列中の任意の領域において相補鎖 の合成起点となる第 1のィンサートプライマーと、このィンサートプライマ 一を起点とする伸長生成物に含まれる標的塩基配列中の任意の領域におい て相補鎖の合成起点となる第 2のィンサートプライマーとの組み合わせか らなる請求項 4に記載の方法。
8 . 工程 （1 ) の 1本鎖の核酸を、 以下の工程によって生成する請求項 1に 記載の方法。
i)次の条件を有する少なくとも 2種類の 1本鎖の核酸を生成する工程、 a) 5' を含む領域と 3'末端を含む領域が相補的な塩基配列で構成される、 b) a)の相補的な塩基配列からなる領域がハイプリダイズしたときにループ を形成する塩基配列によって、 この相補的な塩基配列が連結されている、 c)—方の核酸の 3，末端は他方の核酸の 3，末端に相補的な塩基配列を有する、 および
d)該 1本鎖核酸を構成する塩基配列が、標的塩基配列から選択される塩基配 列を含む
ii)工程 i)の 1本鎖の核酸におけるループにァニールして相補鎖合成の起 点となるプライマーであって、その 5' ¾に該プライマーを起点として合成 される相補鎖に相補的な塩基配列を有するプライマーをァニールさせ、その 3'末端を起点として鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DMポリメラー ゼによって、相補鎖を合成するとともに、工程 i)の 1本鎖の核酸の 3，末端を 置換して塩基対結合が可能な状態とする工程、 および
iii)工程 ii)によって塩基対結合が可能となった 3， を相互にァニール させ、 その 3'末端を起点として相補鎖を合成するとともに、 工程 ii)で合成 した相補鎖を置換して工程 ( 1 ) の.1本鎖の核酸を生成する工程、
前記工程 （ 1 ) の 1本鎖の核酸を以下の工程によつて生成する請求項 1 に記載の方法。
( a )標的塩基配列を含む核酸を讓としてィンナープライマーをァニー ノレさせ、その 3' を起点として相補鎖を合成する工程；ここでィンナープ ライマーは、標的塩基配列の 5'末端に相補的な塩基配列を 3'末端に有し、か つその 5'末端に前記 3'末端を起点として合成される相補鎖の任意の領域に 対して相補的な塩基配列を有し、
( b ) 工程（a ) の生成物にインサートプライマーをァニールさせ、その 3'末端を起点として相補鎖を合成する工程；ここでィンサートプライマーは 工程（a )の生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を 3， «に備え、 かつその 5， の塩基配列は請求項 1における 2種類の 1本鎖核酸のいず れかの 3'末端を構成する塩基配列に相補的な: ¾配列からなり、 そして
( c ) 工程 ( b ) で合成された相補鎖を 1本鎖とし、 その 3 ' を自身に ァニールさせ、その 3' を起点として相捕鎖を合成し、前記工程（1 ) の 1本鎖の核酸を生成する工程
10. 工程 (a) の標的塩基配列を含む核酸が、 請求項 1における工程 （2) の生成物である請求項 9に記載の方法。
1 1. 2種類の 1本鎖の核酸が、 いずれも同一の铸型に由来する塩基配列を含 む、 請求項 1に記載の方法。
1 2. 2種類の 1本鎖の核酸に含まれる塩基配列が、 麵において連続してい る請求項 1 1に記載の方法。
1 3. 2種類の 1本鎖の核酸に含まれる塩基配列が、 ,において連続してい ない請求項 1 1に記載の方法。
14. 2種類の 1本鎖の核酸が、 異なる,に由来する塩基配列を含む、 請求 項 1に記載の方法。
1 5. 次の工程を含む標的塩基配列を含む核酸の増幅方法。
(1) 5'側から 3'側にかけて次の領域 (a) - (d)を含む、 少なくとも 2種類 の 1本鎖の核酸を生成する工程、 ここで前記 2種類の 1本鎖核酸は、 その 3 '末端において相補的な塩基配列を有し、 カゝっ標的塩基配列から選択された 塩基配列を含む。
(a)同一鎖上の任意の領域に相補的な塩基配列からなる領域、
(b)領域 (a)が同一鎖上の任意の領域に対してハイブリダイズしたときにル ープを形成する領域、
(c)領域 (a)に相補的な塩基配列を含む領域、 および
(d) 3' を構成する塩基配列からなる領域
(2) 工程（1) の少なくとも 2種類の 1本鎖の核酸を、その 3，末端にお いてァニールさせ、鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼに よつて相補鎖を合成する工程、
(3) 工程 (2) で合成された核酸の 3， を、 同一鎖上の相補的な塩基 配列からなる領域にァニールさせ、その 3'末端を起点として相補鎖を合成し、 標的塩基配列からなる 1本鎖の核酸を合成する工程、
( 4 ) 工程 ( 3 ) の生成物を羅として、 インナープライマー、 および/ またはィンサートプライマ一の 3，末端を起点として、鎖置換を伴なう相補鎖 合成反応を触媒する DNAポリメラーゼによって相補鎖を合成する工程、
( 5 )各プラィマーからの伸長生成物の 5'側に位置する他のプラィマーの 伸長生成物を置換して前記工程 ( 1 ) の 1本鎖の核酸を生成するか、 または 該 1本鎖の核酸が、その 3' «に同一鎖に対する相補的な塩基配列を有する ときには、該 3' を自身にァニールさせ、その 3' を起点として相補鎖 を合成して前記工程 ( 1 ) の 1本鎖の核酸を生成する工程、 および
( 6 ) 工程 ( 5 ) で生成した核酸を用いて請求項 1に記載の方法を繰り返 し、 標的塩基配列からなる核酸を増幅する工程
6 . 請求項 2一請求項 9の Vヽずれかに記載の方法によって生成された 1本鎖 の核酸を用いて、請求項 1一請求項 7のいずれかに記載の方法を開始するェ 程を含む、 標的塩基配列を含む核酸の増幅方法。
7. 以下の要素をィンキュベートする工程を含む、 標的塩基配列を含む核酸 を合成する方法。
(a)インナープライマー F ；ここでインナープライマー Fはその 3'末端に おいて前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3，側を規定する領域に対し てァニールし、かつインナープライマー Fの 5'末端には、 このプライマーを 起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列 を有する、
(b)インナープライマー R；ここでインナープライマー Rはその 3，末端に おいて前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対し てァニールし、かつインナープライマー Rの 5，末端には、このプライマーを 起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列 を有する、 (c)インサートプライマー F；ここでインサートプライマー Fはその 3，末 端において前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の任意の領域に対して相 補的な塩基配列を有する、
(d)インサートプライマー R；ここでインサートプライマー Rはその 3，末 端において前記標的塩基配列を構成する他方の鎖の任意の領域に対して相 補的な塩基配列を有し、かつィンサートプライマー Fとィンサートプライマ 一 Rの各プライマーを起点とする合成生成物は、両者の 5' «を含む領域に 互 ヽに相補的な塩基配列を有する、
(e)標的塩基配列を含む铸型核酸、
(f)ヌクレオチド基質、 および
(g)鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラーゼ
8 . 更に付加的に次の要素を存在させる請求項 1 7に記載の方法。
(h)アウタープライマー F ；ここでアウタープライマー Fは、 ,におけ るィンナープライマ一 Fがァユールすべき領域の 3，側を起点とする相補鎖 合成反応の起点となる、 および
(i)アウタープライマー R；ここでアウタープライマー Rは、 醒におけ るインナープライマー Rがァユー/レすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖 合成反応の起点となる、
9. 更に付加的に次の要素を存在させる請求項 1 7に記載の方法。
(j)ループプライマー F ； ここでループプライマー Fの 3， を含む領域 は、前記インナ一プライマー Fの 5， «を含む領域が、インナープライマ一 Fを起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイブリダイ ズすることによって形成されるループ内の任意の領域に対してァニールす る、 および
(k)ループプライマー： R；ここでループプライマー Rの 3， を含む領域 は、前記インナープライマー Rの 5， を含む領域が、インナープライマー Rを起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイプリダイ ズすることによって形成されるループ内の任意の領域に対してァエールす る
0. ,核酸における前記標的塩基配列が 2本鎖であり、 前記各プライマー を起点とする相補鎖合成が可能な条件下でィンキュベートすることによつ て、各プライマーがァニールすべき領域を塩基対結合が可能な状態とするェ 程を含む、 請求項 1 7に記載の方法。
1 . 核酸における前記標的塩基配列が 2本鎖であり、 変性工程の後にィ ンキュベートを開始する請求項 1 7に記載の方法。
2. 融解温度調整剤の存在下でィンキュベートする請求項 1 7に記載の方法。 3 . 融解温度調整剤が、 ベタイン、 プロリン、 ジメチルスルホキシド、 およ ぴトリメチルァミン N -ォキシドからなる群から選択される少なくとも 1つ のィ匕合物である請求項 2 2に記載の方法。
4. 請求項 1、 または請求項 1 7に記載の核酸の合成方法、 若しくは請求項 1 5に記載の核酸の増幅方法の反応生成物の量を測定する工程を含む、試料 中に含まれる 核酸の検出方法。
5 . 請求項 2 4に記載の,核酸の検出方法に基づいて 核酸における変 異を検出する方法であって、請求項 1 5に記載の核酸の増幅方法において、 ィンサートプライマーの 3' を起点とする相補鎖合成反応力 ,核酸の 塩基配列が予測される塩基配列でなかつたときに妨げられることを特徴と する、 変異の検出方法。
6 . 請求項 2 4に記載の铸型核酸の検出方法に基づいて铸型核酸における変 異を検出する方法であって、請求項 1、または請求項 1 7に記載の核酸の合 成方法において、 1本鎖の核酸の 3' を起点とする相補鎖合成反応力 铸 型核酸の塩基配列が予測される塩基配列でなかったときに妨げられること を特徴とする、 変異の検出方法。 , 請求項 4に記載の核酸の合成方法、 または請求項 1 5に記載の核酸の増 Ψ畐方法を利用した変異の導入方法であって、ィンサートプライマーが,核 酸に含まれる塩基配列とは異なる塩基配列を含むことを特徴とする、変異の 導入方法。
. ,核酸に含まれる塩基配列とは異なる塩基配列が、 インサートプライ マーの塩基配列に対する置換、欠失、および Ζまたは付加によって構成され ている請求項 2 7に記載の方法。
. 以下の要素で構成される、 標的塩基配列を含む核酸を合成するためのキ ッ卜。
(a)インナープライマー F；ここでインナープライマー Fはその 3，末端に おいて前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対し てァユーノレし、かつィンナープライマー Fの 5'側には、 このプライマーを起 点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を 有する、
(b)インナープライマー R；ここでインナープライマー Rはその 3，末端に おいて前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対し てァニールし、かつィンナープライマー Rの 5，側には、 このプライマーを起 点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を 有する、
(c)インサートプライマー F ；ここでインサートプライマー Fはその 3，末 端において前記標的塩基配列を構成する一方の鎖の任意の領域に対して相 補的な塩基配列を有する、
(d)インサートプライマ一 R；ここでインサートプライマー Rはその 3，末 端において前記標的塩基配列を構成する他方の鎖の任意の領域に対して相 補的な塩基配列を有し、かつィンサートプライマー Fとィンサートプライマ 一 Rの各プライマーを起点とする合成生成物は、両者の 5' を含む領域に 互レヽに相補的な塩基配列を有する、
(e)ヌクレオチド基質、 および
(f)鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DNAポリメラーゼ
更に付加的に次の要素を含む、 請求項 2 9に記載のキット。
(g)アウタープライマー F ；ここでアウタープライマー Fは、 ,におけ るィンナーブライマ一 Fがァニールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖 合成反応の起点となる、 および
(h)アウタープライマー R；ここで第 6のプライマーは、 铸型におけるィ ンナ—プライマー Rがァニールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖合成 反応の起点となる、
更に付加的に次の要素を含む、 請求項 2 9に記載のキット。
(i)ループプライマー F ；ここでループプライマー Fの 3， を含む領域 は、前記ィンナープライマー Fの 5， «を含む領域が、ィンナープライマー Fを起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイプリダイ ズすることによって形成さ るループ内の任意の領域に対してァニールす る、 および
(j)ループプライマー R； ここでループプライマー Rの 3' を含む領域 は、前記インナープライマー Rの 5， を含む領域力 インナ一プライマー
Rを起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対してハイブリダイ ズすることによって形成されるループ内の任意の領域に対してァニールす る
標的塩基配列が、一つの羅核酸に由来する請求項 2 9に記載のキット。 ィンサートプライマーが、 ,核酸の塩基配列が予測と異なる塩基配列 であったときに、インサートプライマーの 3， ¾«、および/またはインサー トプライマーの 5，末端を,として合成された相補鎖の 3' ¾を起点とす る相補鎖合成反応が妨げられる塩基配列からなる、請求項 2 9に記載のキッ 4. 試料中に含まれる鎵型核酸の検出に用いるための請求項 2 9に記載のキ ッ卜。
5 . 核酸の検出剤を付加的に含む請求項 3 4に記載のキット。
6 . ィンサートプライマーが,核酸に含まれる塩基配列とは異なる塩基配 列を含むことを特徴とする、 請求項 2 9に記載のキット。
7 . 標的塩基配列が異なる^ 核酸に由来する塩基配列を有する請求項 2 9 に記載のキット。
8 . インナープライマー Fおよびインサートライマー Fの 3， が第 1の踌 型核酸に由来する塩基配列を合成するための起点となり、ィンナープライマ 一 Rおよびインサートプライマー] が第 2の,核酸に由来する塩基配列 を合成するための起点となり、かつィンサートプライマ一 Fとィンサートプ ライマ一 Rの 5' «を含む領域において互 ヽに相補的な塩基配列からなる 領域を含むことを特徴とする、 請求項 3 7に記載のキット。
9 . 融合蛋白質をコードする遺伝子を合成するための、 請求項 3 7に記載の キット。
0 . 付加的に、 融合パートナーをコードする遺伝子を含む、 請求項 3 9に記 載のキット。
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