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WO2002088299A1 - Dispositif miniature de separation et d'isolement d'objets biologiques et utilisations - Google Patents

Dispositif miniature de separation et d'isolement d'objets biologiques et utilisations Download PDF

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Publication number
WO2002088299A1
WO2002088299A1 PCT/FR2002/001458 FR0201458W WO02088299A1 WO 2002088299 A1 WO2002088299 A1 WO 2002088299A1 FR 0201458 W FR0201458 W FR 0201458W WO 02088299 A1 WO02088299 A1 WO 02088299A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microcuvettes
biological
electrode
microcuvette
objects
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/001458
Other languages
English (en)
Inventor
Alexandra Fuchs
Patrice Caillat
Daniel Dupret
Fabrice Lefevre
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority to JP2002585582A priority Critical patent/JP2004535176A/ja
Priority to EP02727702A priority patent/EP1381670A1/fr
Priority to US10/475,511 priority patent/US20040168916A1/en
Publication of WO2002088299A1 publication Critical patent/WO2002088299A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Definitions

  • the present invention relates to a miniature device for separating and isolating biological objects, to a method for separating and isolating biological objects using this device as well as to its applications.
  • microtechnologies in particular that of microsystems, has the means to meet this demand thanks to its achievements in miniaturization, surface functionalization, microfluidics and large-scale and low-cost manufacturing techniques.
  • microtiter plates have gone from a standard format of 96 wells to a format of 384 and then 1536 wells as robotics progresses.
  • the use of these increasingly miniaturized microtechnologies makes it possible to reduce the volumes of reagents used and thus reduce the analysis costs.
  • the principle of analysis consists in ordering XY matrixing of nucleic probes at increasingly smaller steps, of the order of 20 ⁇ m.
  • the step of processing biological samples is undergoing the race for size reduction with the increasingly common integration of polymerase chain reactions (PCR) in DNA chips or cell lysis function.
  • PCR polymerase chain reactions
  • the nucleic probe then carrying a complementary function so as to form a covalent bond with the silane (O'Donnell MJ. et al, Anal. Chem., 1997, 69, 2438 -2443)
  • the inventors therefore set themselves the goal of providing a new miniature device for separation and isolation of biological objects making it possible to maintain a matrix approach with a large number of points in which each point contains one and only one type or category of biological object, but in which the preliminary operations of preparation, separation or isolation can be avoided or reduced, thus considerably reducing the number of manipulations and pipetting of the biological object to be treated.
  • the present invention therefore relates to a miniature device for separation and / or isolation of biological objects, comprising at least one first electrode integrated into the device, constituted by a structure provided with a matrix of reaction microcuvettes, each microcuvette comprising a bottom constituting a reception area, characterized in that said bottom has no hole and that the maximum surface of said bottom of each microcuvette is defined so as to isolate a single biological object, said structure being linked to a supply circuit for creating a potential difference between said first electrode and at least one second electrode integrated or external to the device.
  • the attachment zone of the biological object to be fixed has either a surface substantially identical to the surface of the reception zone, or a surface greater than the surface of the reception zone.
  • the maximum surface of the bottom of each microcuvette is preferably less than or equal to twice the smallest surface of the biological object to be isolated.
  • the surface of said base is less than or equal to the smallest surface of the biological object to be isolated.
  • this surface is generally between 1 ⁇ m 2 and 400 ⁇ m 2 , in particular between 1 and 50 ⁇ m 2 .
  • the maximum surface of the bottom of each microcuvette is preferably less than the smallest surface of the biological object to be isolated.
  • a biological object is characterized by its container and its content.
  • the container corresponds to any element making it possible to compartmentalize the content.
  • the container can for example be the wall of a bacterial cell, the envelope of a virus, the membrane of a cell, a lipid double layer, micelles, a phospho lipid bilayer crossed by intrinsic proteins, etc.
  • the content corresponds to the biological material isolated in a compartment that is the container.
  • the content can for example correspond to nucleic acids, proteins, ribosomes, membrane vesicles or to a complex mixture of these.
  • a biological object mention may be made of any cell, healthy or not, whether it is prokaryotic or eukaryotic, viruses, liposomes, etc.
  • a cell mention may be made of bacteria, yeasts, fungi, microalgae and also cells of plant, animal and human origin.
  • viruses examples include the HIV virus, bacteriophages, etc.
  • the device according to the invention can be advantageously used in the field of cell analysis by fixing a single biological object of interest to the reception zone which in fact constitutes a trap zone or by subsequent fixing of one or more several elements derived from the biological object of interest previously fixed, these derivatives including the products resulting from the possible lysis of the biological objects, from their treatment by localized PCR or any other biological, chemical or electrical treatment.
  • these derivatives correspond to nucleic acids, we speak of DNA chips and when these derivatives correspond to proteins, we speak of protein chips.
  • the matrix of reaction microcuvettes can be surmounted at least in part by one or more layers of insulating materials and / or by an attached biocompatible plastic grid, so as to form a matrix of microreservoirs, each microreservoir containing at least one microcuvette.
  • These microreservoirs can for example be produced by lithography of the layer of insulating material.
  • the insulating materials can for example be chosen from insulating polymers such as polyimides and resins such as, for example, SU-8 resins.
  • microreservoirs The size of the microreservoirs is defined so as to process, in a minimal volume, the single isolated biological object.
  • These microreservoirs generally have a width and / or a length of between 5 and 500 ⁇ m and preferably between 5 and 100 ⁇ m.
  • the miniature device can include alternating conductive layers (electrodes) and layers of insulating materials.
  • one face of the first electrode integrated into the device can constitute the bottom of the microcuvettes.
  • the bottom of the microcuvettes of the device consists of a layer of glass, plastic or silicon.
  • the device according to the invention When the device according to the invention has a second integrated electrode, it is deposited on a first layer of insulating material and is located in a plane spaced from the bottom of the microcuvettes.
  • the device according to the invention comprises a second external electrode
  • the latter may be integral with a cover or a cover, preferably consisting of one or more layers of insulating material. Consequently, one of the layers of insulating materials may not form an integral part of the device according to the invention, but be in the form of a removable insert (cover, cover, cover) which covers at least partially said device and containing optionally at least one electrode.
  • the device according to the invention may also include at least a third electrode integrated into the device, a second layer of insulating material being interposed between the second and the third electrode.
  • the device can comprise several second and / or third electrodes isolated from each other.
  • the device according to the invention can also be equipped with an integrated multiplexing circuit ⁇ 'at least some of said electrodes.
  • the multiplexing circuit integrated into this device can be used for different functions: fixing different reagents within the same device, heating isolated from the reception areas, local pH measurement, reading an electrical signal, etc.
  • at least one edge of one of the second and / or third electrodes and / or of one of the first and / or second layers of insulating material can constitute at least part of an edge d '' a microreservoir.
  • the first, second and third electrodes, as well as the external electrode are constituted by at least one metallic layer, for example made of chromium, gold or platinum. These metal layers generally have a thickness of between 0.1 and 10 ⁇ m.
  • a reagent capable of fixing the biological object to be isolated is fixed on at least part of the zone for receiving the reaction microcuvettes.
  • the nature of the reagent used for fixing biological objects may vary depending on the nature of the objects to be fixed and the nature of the bottom of the microcuvettes.
  • the reagent used is preferably chosen from conductive copolymers, such as for example polypyrroles, to which proteins, peptides or all are attached molecules specific to the type of biological object to be fixed, such as for example antibodies, receptors, glycoproteins, lectins, cell adhesion molecules ("Cell Adhesion Molecules”: CAM), laminin, fibronectin, integrins , sugars, etc ...
  • conductive copolymers such as for example polypyrroles, to which proteins, peptides or all are attached molecules specific to the type of biological object to be fixed, such as for example antibodies, receptors, glycoproteins, lectins, cell adhesion molecules (“Cell Adhesion Molecules": CAM), laminin, fibronectin, integrins , sugars, etc ...
  • the conductive copolymers are for example described in international application WO 94/22889.
  • poly pyrroles are particularly preferred according to the invention.
  • the specific molecules attached to the monomers of the conductive copolymer can in particular be chosen from protein A, protein G, fibronectin and more generally, from cell adhesion proteins and antibodies directed against surface receptors.
  • the specific molecules are attached directly to the monomers of a conductive polymer, said monomers carrying -NHS or aldehyde functions capable of reacting with the primary amine functions of the molecule used, - or the specific molecules are indirectly attached to the monomers of a conductive polymer carrying the biotin function, by means of a successive chemical stacking of streptavidin-biotin-specific molecule.
  • the device according to the invention is then treated collectively so as to carry out the copolymerization of the monomers of the conductive polymer carrying the biotin function, then to treat said device with streptavidin and then with a specific molecule linked to the biotin, to obtain pyrrole-biotin-streptavidin-biotin-specific molecule copolymers.
  • the reagent used to fix the biological object can be specific of this one to allow a direct interaction: reagent of the microcuvette-biological object.
  • the reagent used is not specific to the biological object. The latter must therefore be functionalized.
  • the biological objects to be fixed may, for example, be previously functionalized by specific antibodies which can react with the reagents used.
  • protein A or G fixed only on the trap zone via the conductive polymer will recognize the Fc fragment of the antibodies fixed beforehand on the objects to be immobilized.
  • the binding peptides specific for the membrane receptors on the surface of the biological object to be fixed such as for example peptides containing the arginine-glycine-aspartate sequence ( RGD) and which have an affinity for integrins (cell adhesion proteins on the surface of eukaryotic cells).
  • RGD arginine-glycine-aspartate sequence
  • the reagent used is preferably:
  • a polymer not specific to the type of object to be fixed such as for example poly-L-lysine or fibronectin; said polymer being deposited locally on the reception areas ("lift-off” technique: deposition of a photo-imageable resin, localized exposure then deposition of the polymer on the resin, then unblocking of the resin),
  • proteins and the peptides are fixed to the said glass, plastic or silicon layer covered with a layer of silane modified by -NHS or aldehyde functions on which is fixed said reagent; the proteins and peptides used in this case being of the same nature as those described above.
  • the zone for receiving the reaction microcuvettes does not comprise a reagent capable of fixing the biological object which it is desired to isolate.
  • This embodiment is particularly advantageous because it avoids the prior functionalization of the devices in accordance with the invention with a reagent capable of fixing the biological object to be isolated.
  • This embodiment is particularly well suited to the isolation and fixation of bacteria.
  • the device according to the invention may include several first and / or second and / or third electrodes. These electrodes can be either independent, microreservoir by microreservoir, to allow the reading of an electrical signal in response to a reaction which took place in the microcuvette, or connected together to allow an identical treatment in all the microcuvettes, such as for example the application of an electric field for lysis of biological objects or an electric field of copolymerization.
  • the different levels of electrodes can allow the specific fixation of biological objects, then once the objects are fixed in the microcuvettes, the lysis of these objects then, when it is for example biological cells, the fixation by electrical copolymerization of nucleic acid probes from a nucleotide amplification carried out directly in each of the microreservoirs, so as to obtain microreservoirs carrying nucleic acid probes in large quantities.
  • the device according to the invention is equipped with an integrated multiplexing circuit, it is then possible to provide for the fixing of different reagents in the microcuvettes of the same device and the processing of all the signals emitted by the electrodes. of each microreservoir.
  • the device according to the invention can therefore comprise microcuvettes containing different reagents so as to allow the attachment of biological objects of different types to a single device.
  • the presence of electrodes associated with an integrated multiplexing circuit also allows electrical detection at the level of a microcuvette or a microreservoir, this detection being for example associated with monitoring the electrical behavior of a biological object or the release of molecules. in response to chemical or physical aggression.
  • the miniature device according to the invention can be equipped with a closure means, such as for example a cover or a transparent film, making it possible to close all or all of the microreservoirs individually or collectively.
  • a closure means such as for example a cover or a transparent film
  • FIG. 1 shows a miniature device according to the invention, equipped with a support 7 and an electrical supply circuit 103, in which the bottom of each microcuvette 5 is constituted by a first electrode 1 forming a reception area 9 to which a reagent is optionally fixed, the first electrode 1 being surmounted by a first layer of insulating material 2 on which a second electrode 3 rests surmounted by a second layer of insulating material 4 forming microreservoirs 6, FIG.
  • each microcuvette ⁇ 5 represents a miniature device according to the invention, equipped with a support 27 and an electrical supply circuit 103, in which the bottom of each microcuvette ⁇ 5 is constituted by a first electrode 21 forming a receiving zone 29 on which is optionally attached a reagent, the first electrode 21 being surmounted by a first layer of insulating material 22 on which a second layer rests of insulating material 24 forming microreservoirs 26, this device being equipped with an external electrode 28, - FIG.
  • FIG. 3 represents a miniature device according to the invention, equipped with a support 37 and an electrical supply circuit 103, in which the bottom of each microcuvette 35 is constituted by a first electrode 31 forming a receiving zone 39 to which a reagent is optionally fixed, the first electrode 31 being surmounted by a first layer of insulating material 32 on which a second electrode 33 rests surmounted by a second layer of insulating material 34 forming microreservoirs 36, this device being equipped with an external electrode 38, - Figure 4 shows a miniature device according to the invention, equipped with a support 47 and an electrical supply circuit 103, containing a plurality of first electrodes 41 electrically isolated between them and in which the bottom of each microcuvette 45 consists of a first electrode 41 forming a receiving area 49 to which a reagent is optionally attached, the first electrodes 41 being partly surmounted by a first layer of insulating material 42 on which a second electrode 43 surmounted by a second layer of insulating material 44 forming microreservoirs 46
  • each microcuvett e 55 consists of a first electrode 51 forming a receiving zone 59 to which a reagent is optionally fixed, the first electrodes 51 being partly surmounted by a first layer of insulating material 52 on which a second electrode 53 surmounted by a second layer of insulating material 54 forming microreservoirs 56, this device being equipped with an external electrode 58 and an integrated multiplexing circuit 104,
  • FIG. 6 represents a miniature device according to the invention, equipped with a support 67, in ⁇ equel the bottom of each microcuvette 65 is constituted by a first electrode 61 forming a reception zone 69 on which a reagent is optionally attached, the first electrode 61 being surmounted by a first layer of insulating material 62 on which rests a second electrode 63 surmounted by a second layer of insulating material 64 itself surmounted by a third electrode 101 on which rests a third layer of insulating material 102 forming microreservoirs 66,
  • FIG. 7 shows a miniature device according to the invention identical to that shown in Figure 1 except that it further comprises a removable closure means 100 for closing each of the microreservoirs 76
  • - Figure 8 shows a miniature device according the invention identical to that shown in FIG. 5 except that it further comprises a means of removable closure 100 making it possible to close each of the microreservoirs 86 in which an external electrode 88 is integrated,
  • FIG. 9 shows a miniature device according to the invention, equipped with a support 97 and an electrical supply circuit 103, in which the bottom of each microcuvette 95 is constituted by a layer of glass or silicon 93 forming a reception area 99 to which a reagent is fixed, said layer of glass or silicon 93 being surmounted by a first layer of insulating material 92 forming microreservoirs 96 on which a first electrode 91 rests itself surmounted by a second layer of insulating material 94, this device being equipped with an external electrode 98.
  • the invention also relates to the use of at least one miniature device in accordance with the invention for the isolation, separation, culture and / or analysis of biological objects.
  • the miniature devices in accordance with the invention can be used to fix a single biological object by microcuvette such as for example a biological cell, these cells then being cultured directly on the device to amplify cells by successive cell divisions.
  • a device is thus obtained comprising a homogeneous population of cells in each microreservoir.
  • the daughter cells from cell divisions can then be recovered while the mother cells remain fixed on the bottom of the microcuvettes.
  • the devices in accordance with the invention therefore make it possible to recover only daughter cells corresponding therefore only to cell lines capable of dividing. This use is advantageous insofar as it makes it possible to eliminate dead cells from a bacterial culture transformed by plasmids and treated with an antibiotic.
  • the devices in accordance with the invention can also be used as a means of analyzing the content of a heterogeneous panel of cells, by immobilizing different cells in an ordered matrix at the rate of one cell by microcuvette, then extraction of the macromolecules that the 'we want to analyze.
  • FIG. 9 Either use a device such as that of FIG. 9 comprising microcuvettes, the bottom of which consists of a glass layer carrying a chemical coupling function or a device such as those represented by the figures
  • the immobilization of the cells is then carried out for example by soaking the device in a heterogeneous cell culture or by successive soaking in different homogeneous cell cultures, the presence of reagents specific to each type of cell making it possible to order the cell matrix.
  • the second electrode present in all the devices used to immobilize these cells can either be collectively pre-functionalized (for example by specific antibodies (to extract from each cell type a type of protein), or more generally be used to electrochemically fix a product originating from the cell following, for example, a PCR reaction.
  • the devices illustrated in FIGS. 4 and 5 can also be used to carry out high throughput screening (HTS) of chemical or biological reagents on the cells.
  • HTS high throughput screening
  • the plurality of first independent electrodes allows individualized electrical measurement in response to the action of chemical or biological reagents on the cells in the microreservoirs.
  • HTS screens can be carried out on animal cells in culture and in this case, the surface of the bottom of the microcuvettes is equal to or less than the smallest section of the cells to be tested, ie approximately 100 ⁇ m 2 for conventional animal cells.
  • the devices according to the invention can be used to carry out fleeting electroporation of the cells.
  • the subject of the invention is also a method of separation and / or isolation of biological objects, characterized in that it consists: - in a first step, in bringing at least one miniature device as defined above, into contact with a solution of biological objects homogenized, in particular with a culture solution of biological cells, to allow the fixing of said objects at the bottom of the microcuvettes on the reception areas, at the rate of at most one biological object per microcuvette, - then in a second step, washing the unbound biological objects, so as to obtain a miniature device on which the objects to be isolated are immobilized.
  • the biological objects thus isolated and fixed on the device can then be studied according to the techniques described above, for example by measuring the variation in their electrical properties under the effect of an active principle.
  • the miniature device used according to this method comprises a multiplexing circuit, it is then possible to carry out individualized electrical measurements in each microcuvette.
  • the fixing of biological objects is carried out by means of an electric field.
  • devices are preferably used in which the first electrode integrated into the device constitutes the bottom of the microcuvettes.
  • the fixing of the biological objects is carried out by means of a reagent fixed on at least part of the bottom of the reaction microcuvettes.
  • the bottom of the microcuvettes may equally well be constituted by a first electrode or by a layer of glass, plastic or silicon.
  • the process according to the invention may possibly include a third step during which the objects fixed to the bottom of the microcuvettes, in particular when it is a question of biological cells, are lysed so as to release the genetic material which they contain in the microreservoir corresponding to the microcuvette where they were fixed.
  • the lysis of fixed objects can be carried out by electric shock, thermal shock or sonication.
  • the genetic material thus released can then, in a fourth step, be collectively amplified by PCR by introduction into the microcuvettes of the various reagents necessary for a PCR reaction, these reagents comprising in particular at least one primer functionalized with pyrrole groups.
  • the amplified sequences thus obtained are then fixed, in a fifth step, on an electrode by electropolymerization, collectively.
  • the third and fourth steps can be carried out simultaneously.
  • the starting cell culture is then an expression cell bank and the cells of the bank are immobilized as described above.
  • the devices used according to this variant are previously functionalized by the target at the level of an electrode.
  • the target may be a molecule such as a peptide, a protein, a nucleotide sequence, a peptidoglycan, a sugar or any other chemical molecule.
  • This target can also be functionalized by a pyrrole group and thus be fixed on an electrode by electropolymerization.
  • a recombinant protein will be expressed by the immobilized cell and released from the cell, either by secretion or by lysis of the cell. During this expression within each cell, it is possible to incorporate labeled protein precursors (such as for example methionine
  • Proteins showing affinity with the target will specifically bind to the electrode functionalized with the target. If the proteins have been labeled during their expression, they can then be detected. Otherwise, the detection of the protein / ligand interaction must be carried out according to an additional step consisting for example of reacting a labeled universal anti-epitope antibody, and in this case, an expression library expressing all the recombinant proteins must be used with this epitope universal Positive wells thus contain the potential protein ligands of the target.
  • the level of affinity of this ligand can for example be estimated by means of successive increasingly stringent washes or by competition with other known ligands.
  • this recovery can be done by simply culturing the device and pipetting the daughter cells into the positive wells as described above.
  • a duplication method consists, for example, in culturing the chip A and then transferring the daughter cells in a directed fashion to a new identical device (chip B), the microreservoirs of the chip A possibly being placed opposite each other with the microreservoirs of chip B, with stirring.
  • the cell expression bank is an expression bank, secretor of antibodies or of antibody subdomains.
  • the target fixed on the electrode is a protein, a peptide, a virus, an oligonucleotide, against which an antibody is sought.
  • the invention also comprises other provisions which will emerge from the description which follows, which refers to examples of immobilization of bacteria on miniature devices in accordance with the invention as well as an example describing the protocol for preparing a DNA chip on a device in accordance with the invention.
  • each microreservoir has a diameter of 230 ⁇ m and a depth of 40 ⁇ m; the bottom surface of each microcuvette being 40 ⁇ m 2 .
  • the device is then rinsed with a PBS solution.
  • the device is then rinsed thoroughly with PBS in order to remove the bacteria / antibody complexes which have not reacted with protein A.
  • a device is obtained on which E. Coli bacteria are immobilized, on the basis of a bacterium by microcuvette.
  • the miniature device according to the invention thus prepared can then be used in various biological applications.
  • EXAMPLE 2 ISOLATION AND FIXATION OF BACTERIA ON A MINIATURE DEVICE UNDER THE ACTION OF AN ELECTRIC FIELD
  • a suspension of E. Coli DH5 ⁇ bacteria is prepared in permuted water at the rate of 10 9 bacteria / ml.
  • a miniature device identical to that used above in Example 1 is then immersed in this suspension of bacteria.
  • the device is then rinsed with water and dried with a nitrogen blower.
  • a device is obtained on which E. Coli bacteria are immobilized, on the basis of a bacterium by microcuvette.
  • the miniature device according to the invention thus prepared can then be used in various biological applications.
  • This example describes the general protocol for preparing a DNA chip on a miniature device in accordance with the invention.
  • the miniature device is then rinsed with water and dried with a nitrogen blower.
  • This step is carried out by heating the bacteria at a temperature of 94 ° C for 2 minutes.
  • the chip is then immersed in the oil.
  • the PCR is carried out under the following conditions: 3 minutes at 94 ° C then 30 cycles at 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute and 30 seconds; then 72 ° C for 3 minutes and finally 25 ° C for 30 seconds.
  • the cycles are performed in a Hybaid thermal cycler.
  • the miniature device is then rinsed with water after the end of the PCR cycles.
  • the amplified DNA is fluorescently labeled with Streptavidin phycoerythrin.
  • the fluorescence is then visualized using a fluorescence microscope.

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Abstract

La présente Invention est relative à un dispositif miniature de séparation et d'isolement d'objets biologiques, à l'utilisation d'un tel dispositif pour l'isolement, la séparation, la culture et/ou l'analyse d'objets biologiques et à un procédé de séparation et d'isolement d'objets biologiques mettant en oeuvre ce dispositif.

Description

DISPOSITIF MINIATURE DE SÉPARATION ET D'ISOLEMENT D'OBJETS
BIOLOGIQUES ET UTILISATIONS
La présente Invention est relative à un dispositif miniature de séparation et d'isolement d'objets biologiques, à un procédé de séparation et d'isolement d'objets biologiques mettant en œuvre ce dispositif ainsi qu'à ses applications.
La biologie, et en particulier la génomique, connaît actuellement une révolution dans la façon de générer et de traiter les données de ses analyses. Alors que de plus en plus de données de séquences génétiques sont disponibles grâce aux grands projets de sequençages des organismes, les acteurs de la biologie, du monde médical et de l'industrie pharmaceutique cherchent à intégrer l'ensemble de ces données dans des analyses à grande échelle et multiparamétriques.
Le monde des microtechnologies, en particulier celui des microsystèmes, a les moyens de répondre à cette demande grâce à ses acquis en miniaturisation, en fonctionnalisation des surfaces, en micro fluidique et en techniques de fabrication à grande échelle et à faible coût.
Actuellement, le mariage de ces deux mondes a donné lieu à des outils d'analyse multiparamétriques connus sous le nom de puces à ADN. Ces outils sont dédiés à l'analyse de macromolécules biologiques (protéines et principalement ADN). ^
Il existe un nombre important de recherches de part le monde dans des domaines très variés qui intègrent, via les microtechnologies, des protocoles biologiques à des dimensions de plus en plus réduites.
Par exemple, les plaques de rnicrotitration sont passées d'un format standard de 96 puits à un format de 384 puis de 1536 puits au fur et à mesure des progrès de la robotique. L'utilisation de ces microtechniques de plus en plus miniaturisées permet de diminuer les volumes des réactifs utilisés et ainsi de réduire les coûts d'analyse.
Dans le cas particulier des puces à ADN, le principe d'analyse consiste à ordonner en matriçage X-Y des sondes nucléiques à des pas de plus en plus petits, de l'ordre de 20 μm. De même, l'étape de traitement des échantillons biologiques subit la course à la réduction de taille avec l'intégration de plus en plus commune de réactions de polymérisation en chaîne (PCR) dans des puces à ADN ou de fonction de lyse des cellules. C'est ainsi qu'il a déjà été proposé, notamment dans le brevet
US 6,071,394 de séparer et fixer des cellules sur des puces électroniques par diélectrophorèse, les cellules en suspension dans un tampon approprié étant séparées en fonction de leurs propriétés diélectriques. Cependant cette technique ne permet pas de séparer et d'isoler des objets biologiques uniques pour des analyses individualisées. La tendance actuelle qui passe par une réduction des volumes de réactifs utilisés a également pour conséquence l'utilisation de tests des analytes sur des réactifs biologiques fixés sur des surfaces solides, de façon à abandonner progressivement l'utilisation de tests en tubes avec des solutions homogènes.
C'est ainsi qu'il a déjà été proposé diverses solutions pour la fixation de molécules biologiques d'intérêt sur différents matériaux tels que le verre, le plastique ou le métal. Par exemple, pour la fixation des sondes nucléiques sur substrat, trois approches principales sont actuellement connues :
-^utilisation d'un substrat en verre recouvert de poly-L-lysine qui est un polymère présentant une affinité avec les sondes nucléiques (Schena M. et al., science, 1995, 270 (5235), 4θ* 70),
- l'utilisation de verre recouvert d'un silane fonctionnalisé, la sonde nucléique portant alors une fonction complémentaire de façon à former une liaison covalente avec le silane (O'Donnell MJ. et al, Anal. Chem., 1997, 69, 2438-2443),
- l'utilisation d'électrodes métalliques, en or par exemple, permettant la copolymérisation d'un monomère simple et d'un monomère porteur de la sonde nucléique.
De même, dans le domaine de la protéomique, il a notamment été rapporté la fixation de peptides par l'intermédiaire de polymères conducteurs portant des fonctions pyrroles (polypyrroles), (Livache T. et al, Biosensors & Bioelecrronics, 1998, 13, 629-634). Il est également possible de fixer des objets biologiques vivants tels que des bactéries ou des cellules eucaryotes sur des substrats solides par différentes techniques :
- greffage d'anticorps spécifiques de la cellule à fixer sur un substrat solide ; il existe en effet des anticorps contre les micro-organismes couramment utilisés en biologie moléculaire (bactéries, levures), tels que les anticorps anti-E. coli 1434 vendus par la société Fitzgerald Industries International, Inc., ainsi que des anticorps contre des récepteurs de surfaces (récepteurs CD) des cellules eucaryotes supérieures lymphoïdes, - greffage de peptides spécifiques de certains types cellulaires sur le support (Holland J. et al, Biomaterials, 1996, 17, 2147-2156),
- fonctionnalisation non spécifique du support par des polymères permettant l'adhésion cellulaire (Aframian D.J. et al, Tissue Εng., 2000, 6 (3), 209- 216). Ces techniques sont intéressantes dans la mesure où elles génèrent la formation de liaisons spécifiques entre l'objet biologique à fixer et le support, cependant elles nécessitent de nombreuses étapes de préparation et d'isolement avant que ceux-ci puissent enfin être fixés individuellement sur le support.
Les Inventeurs se sont donc fixés pour but de pourvoir à un nouveau dispositif miniature de séparation et d'isolement d'objets biologiques permettant de conserver une approche matricielle à grand nombre de points dans laquelle chaque point contient un et un seul type ou catégorie d'objet biologique, mais dans lequel les opérations préalables de préparation, de séparation ou d'isolement peuvent être évitées ou réduites, diminuant ainsi considérablement le nombre de manipulations et de pipetages de l'objet biologique à traiter.
La présente Invention a donc pour objet un dispositif miniature de séparation et/ou d'isolement d'objets biologiques, comportant au moins une première électrode intégrée au dispositif, constitué par une structure pourvue d'une matrice de microcuvettes réactionnelles, chaque microcuvette comportant un fond à constituant une zone de réception, caractérisé en ce ledit fond est dépourvu de trou et que la surface maximale dudit fond de chaque microcuvette est définie de manière à isoler un objet biologique unique, ladite structure étant liée à un circuit d'alimentation pour créer une différence de potentiel entre ladite première électrode et au moins une deuxième électrode intégrée ou externe au dispositif.
Grâce à ce dispositif, il est désormais possible de ne fixer qu'un seul objet biologique par microcuvette étant donné que la surface d'accroché de l'objet biologique à fixer recouvre totalement la zone de réception, chaque microcuvette ne contenant donc qu'un seul type d'objet biologique sélectionné et fixé qui peut ensuite être traité collectivement.
Par conséquent, selon l'Invention, la zone d'accroché de l'objet biologique à fixer a soit une surface sensiblement identique à la surface de la zone de réception, soit une surface supérieure à la surface de la zone de réception.
Selon l'Invention, la surface maximale du fond de chaque microcuvette est de préférence inférieure ou égale à deux fois la plus petite surface de l'objet biologique à isoler. Dans une forme de mise en œuvre préférée de l'Invention, la surface dudit fond est inférieure ou égale à la plus petite surface de l'objet biologique à isoler.
Plus particulièrement, cette surface est généralement comprise entre 1 μm2 et 400 μm2, notamment entre 1 et 50 μm2.
Selon l'Invention, la surface maximale du fond de chaque microcuvette est de préférence inférieure à la plus petite surface de l'objet biologique à isoler.
Selon l'Invention, un objet biologique est caractérisé par son contenant et son contenu. Le contenant correspond à tout élément permettant de compartimenter le contenu. Le contenant peut par exemple être la paroi d'une cellule bactérienne, l'enveloppe d'un virus, la membrane d'une cellule, une double couche lipidique, des micelles, une bicouche phospho lipidique traversée par des protéines intrinsèques, etc. le contenu correspond au matériel biologique isolé dans un compartiment qu'est le contenant. Le contenu peut par exemple correspondre à des acides nucléiques, des protéines, des ribosomes, des vésicules membranaires ou à un mélange complexe de ceux-ci. A titre d'exemple d'objet biologique, on peut citer toute cellule, saine ou non, qu'elle soit procaryote ou eucaryote, les virus, les liposomes, etc.. A titre d'exemple de cellule, on peut citer les bactéries, les levures, les champignons, les microalgues et également des cellules d'origine végétale, animales et humaines.
A titre d'exemple de virus, on peut citer le virus HIV, les bactériophages, etc ..
Le dispositif conforme à l'Invention peut être avantageusement utilisé dans le domaine de l'analyse cellulaire par fixation d'un seul objet biologique d'intérêt sur la zone de réception qui constitue en fait une zone piège ou par fixation ultérieure d'un ou plusieurs éléments dérivés de l'objet biologique d'intérêt préalablement fixé, ces dérivés incluant les produits issus de la lyse éventuelle des objets biologiques, de leur traitement par PCR localisée ou tout autre traitement biologique, chimique ou électrique. Lorsque ces dérivés correspondent à des acides nucléiques, on parle de puces à ADN et lorsque ces dérivés correspondent à des protéines, on parle de puces à protéines. La matrice de microcuvettes réactionnelles peut être surmontée au moins en partie d'une ou plusieurs couches de matériaux isolants et/ou d'une grille en plastique biocompatible rapportée, de façon à former une matrice de microréservoirs, chaque microréseçyoir contenant au moins une microcuvette. Ces microréservoirs peuvent par exemple être réalisés par lithogravure de la couche de matériau isolant. Les matériaux isolants peuvent par exemple être choisis parmi les polymères isolants tels que les polyimides et les résines telles que par exemple les résines SU- 8.
La taille des microréservoirs est définie de manière à traiter, dans un volume minimal, l'objet biologique unique isolé. Ces microréservoirs ont généralement une largeur et/ou une longueur comprise entre 5 et 500 μm et préférentiellement entre 5 et 100 μm.
Selon une forme de réalisation particulière de l'Invention, le dispositif miniature peut être comporter une alternance de couches conductrices (électrodes) et de couches de matériaux isolants. Selon une forme de réalisation de l'Invention, une face de la première électrode intégrée au dispositif peut constituer le fond des microcuvettes. Selon une autre forme de réalisation de l'Invention, le fond des microcuvettes du dispositif est constitué par une couche en verre, en plastique ou en silicium.
Lorsque le dispositif conforme à l'Invention comporte une deuxième électrode intégrée, celle-ci est déposée sur une première couche de matériau isolant et est située dans un plan espacé du fond des microcuvettes.
Lorsque le dispositif conforme à l'Invention comporte une deuxième électrode externe, celle-ci peut être solidaire d'un capot ou d'un couvercle, de préférence constitué par une ou plusieurs couches de matériau isolant. Par conséquent une des couches de matériaux isolants peut ne pas faire partie intégrante du dispositif conforme à l'Invention mais se présenter sous la forme d'une pièce rapportée amovible (cache, capot, couvercle) venant recouvrir au moins en partie ledit dispositif et contenant éventuellement au moins une électrode.
Le dispositif conforme à l'Invention peut aussi comporter au moins une troisième électrode intégrée au dispositif, une deuxième couche de matériau isolant étant interposée entre la deuxième et la troisième électrode. Dans ce cas, et selon une variante de l'Invention, le dispositif peut comporter plusieurs deuxièmes et/ou troisièmes électrodes isolées entre elles.
Le dispositif conforme à l'Invention peut également être équipé d'un circuit intégré de multiplexage^'au moins certaines desdites électrodes.
Le circuit de multiplexage intégré à ce dispositif peut servir à différentes fonctions : fixation de différents réactifs au sein d'un même dispositif, chauffage isolé des zones de réception, mesure locale de pH, lecture d'un signal électrique, etc. Dans les dispositifs conformes à l'Invention, au moins un bord d'une des deuxièmes et/ou troisièmes électrodes et/ou d'une des premières et/ou deuxièmes couches de matériaux isolant peut constituer au moins une partie d'un bord d'un microréservoir.
Selon l'Invention, les premières, deuxièmes et troisièmes électrodes, ainsi que l'électrode externe sont constituées par au moins une couche métallique par exemple en chrome, en or ou en platine. Ces couches métalliques ont en général une épaisseur comprise entre 0,1 et 10 μm.
Selon une forme de réalisation de l'Invention, un réactif apte à fixer l'objet biologique à isoler est fixé sur au moins une partie de la zone de réception des microcuvettes réactionnelles.
La nature du réactif utilisé pour la fixation des objets biologiques peut varier en fonction de la nature des objets à fixer et de la nature du fond des microcuvettes.
En effet, lorsque le fond des microcuvettes est constitué par une électrode telle que décrite ci-dessus, le réactif utilisé est de préférence choisi parmi les copolymères conducteurs, tels que par exemple les polypyrroles, sur lesquels sont fixés des protéines, des peptides ou toutes molécules spécifiques du type d'objet biologique à fixer telles que par exemple des anticorps, des récepteurs, des glycoprotéines, des lectines, des molécules d'adhésion cellulaire ("Cell Adhésion Molécules" : CAM), la laminine, la fibronectine, les intégrines, les sucres, etc...
Les copolymères conducteurs sont par exemple décrits dans la demande internationale WO 94/22889.
L.es poly pyrroles sont particulièrement préférés selon l'Invention.
Les molécules spécifiques fixées sur les monomères du copolymère conducteur peuvent notamment être choisies parmi la protéine A, la protéine G, la fibronectine et plus généralement, parmi les protéines d'adhésion cellulaire et les anticorps dirigés contre des récepteurs de surface.
La fixation de ces molécules sur les monomères du copolymère conducteur et en particulier sur les monomères pyrroles peut être effectuée suivant différentes techniques :
- soit les molécules spécifiques sont fixées directement sur les monomères d'un polymère conducteur lesdits monomères étant porteurs de fonctions -NHS ou aldéhydes capables de réagir avec les fonctions aminés primaires de la molécule utilisée, - soit les molécules spécifiques sont fixées indirectement sur les monomères d'un polymère conducteur porteur de la fonction biotine, au moyen d'un empilement chimique successif streptavidine-biotine-molécule spécifique. Pour réaliser cet empilement chimique, le dispositif conforme à l'Invention est alors traité collectivement de façon à réaliser la copolymérisation des monomères du polymère conducteur porteur de la fonction biotine, puis à traiter ledit dispositif par de la streptavidine puis avec une molécule spécifique liée à la biotine, pour obtenir des copolymères pyrrole-biotine-streptavidine-biotine-molécule spécifique.
Dans une première forme de mise en œuvre, le réactif utilisé pour fixer l'objet biologique peut être spécifique de celui-ci pour permettre une interaction directe : réactif de la microcuvette-objet biologique.
Dans une deuxième forme de mise en œuvre, le réactif utilisé n'est pas spécifique de l'objet biologique. Ce dernier devra donc être fonctionnalisé.
A cet effet, les objets biologiques à fixer pourront, par exemple, être préalablement fonctionnalisés par des anticorps spécifiques pouvant réagir avec les réactifs utilisés. Dans ce cas, la protéine A ou G fixée uniquement sur la zone piège par l'intermédiaire du polymère conducteur, va reconnaître le fragment Fc des anticorps fixés préalablement sur les objets à immobiliser.
Parmi les peptides pouvant être fixés sur les monomères du copolymère conducteur, on peut notamment citer les peptides de liaison spécifiques des récepteurs membranaires de surface de l'objet biologique à fixer, tels que par exemple des peptides contenant la séquence arginine-glycine-aspartate (RGD) et qui ont une affinité pour les integrines (protéines d'adhésion cellulaire à la surface des cellules eucaryotes).
Lorsque le fond des microcuvettes est constitué par une couche en verre, en plastique ou en silicium, le réactif utilisé est de préférence :
- un polymère non spécifique du type d'objet à fixer tel que par exemple de la poly-L-lysine ou de la fibronectine ; ledit polymère étant déposé localement sur les zones de réception (technique "lift-off ' : dépôt d'une résine photo- imageable, insolation localisée puis dépôt du polymère sur la résine, puis déblocage de la résine),
- une protéine ou un peptide ; dans ce cas les protéines et les peptides sont fixés à ladite couche en verre, en plastique ou en silicium recouverte d'une couche de silane modifié par des fonctions -NHS ou aldéhydes sur lesquelles est fixé ledit réactif ; les protéines et les peptides utilisés dans ce cas étant de même nature que ceux décrits ci-dessus.
Selon une deuxième forme de réalisation de l'Invention, la zone de réception des microcuvettes réactionnelles ne comporte pas de réactif apte à fixer l'objet biologique que l'on désire isoler.
Dans ce cas, la fixation des objets biologiques est directement réalisée par l'intermédiaire d'un champ électrique.
Cette forme de réalisation est particulièrement avantageuse car elle évite la fonctionnalisation préalable des dispositifs conformes à l'Invention par un réactif apte à fixer l'objet biologique à isoler. Cette forme de réalisation est tout particulièrement bien adaptée à l'isolement et à la fixation de bactéries.
Ainsi que décrit ci-dessus, le dispositif conforme à l'Invention peut comporter plusieurs premières et/ou deuxièmes et/ou troisièmes électrodes. Ces électrodes peuvent être soit indépendantes, microréservoir par microréservoir, pour permettre la lecture d'un signal électrique en réponse à une réaction ayant eu lieu dans la microcuvette, soit reliées entre elles pour permettre un traitement identique dans toutes les microcuvettes, tel que par exemple l'application d'un champ électrique de lyse des objets biologiques ou un champ électrique de copolymérisation.
Les différents niveaux d'électrodes peuvent permettre la fixation spécifique des objets biologiques, puis une fois les objets fixés dans les microcuvettes, la lyse de ces objets puis, lorsqu'il s'agit par exemple de cellules biologiques, la fixation par copolymérisation électrique des sondes nucléiques issues d'une amplification nucléotidique effectuée directement dans chacun des microréservoirs, de façon à obtenir des microréservoirs porteurs de sondes nucléiques en grande quantité. Lorsque le dispositif conforme à l'Invention est équipé d'un circuit intégré de multiplexage, il est alors possible de prévoir la fixation de réactifs différents dans les microcuvettes d'un même dispositif et le traitement de l'ensemble des signaux émis par les électrodes de chaque microréservoir.
Lorsqu'il est équipé d'un circuit intégré de multiplexage, le dispositif conforme à l'Invention peut donc comporter des microcuvettes renfermant des réactifs différents de façon à permettre la fixation d'objets biologiques de types différents sur un seul dispositif. La présence d'électrodes associées à un circuit intégré de multiplexage permet également la détection électrique au niveau d'une microcuvette ou d'un microréservoir, cette détection étant par exemple associée au suivi du comportement électrique d'un objet biologique ou du relargage de molécules en réponse à une agression chimique ou physique.
Le dispositif miniature conforme à l'Invention peut être équipé d'un moyen de fermeture, tel que par exemple un capot ou un film transparent, permettant d'obturer individuellement ou collectivement tous les microréservoirs.
D'autres caractéristiques du dispositif miniature conforme à l'Invention apparaissent sur les 1 à 9 annexées dans lesquelles :
- la figure 1 représente un dispositif miniature selon l'Invention, équipé d'un support 7 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, dans lequel le fond de chaque microcuvette 5 est constitué par une première électrode 1 formant une zone de réception 9 sur laquelle est éventuellement fixé un réactif, la première électrode 1 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 2 sur laquelle repose une deuxième électrode 3 surmontée d'une deuxième couche de matériau isolant 4 formant des microréservoirs 6, r la figure 2 représente un dispositif miniature selon l'Invention, équipé d'un support 27 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, dans lequel le fond de chaque microcuvetté^5 est constitué par une première électrode 21 formant une zone de réception 29 sur laquelle est éventuellement fixé un réactif, la première électrode 21 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 22 sur laquelle repose une deuxième couche de matériau isolant 24 formant des microréservoirs 26, ce dispositif étant équipé d'une électrode externe 28, - la figure 3 représente un dispositif miniature selon l'Invention, équipé d'un support 37 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, dans lequel le fond de chaque microcuvette 35 est constitué par une première électrode 31 formant une zone de réception 39 sur laquelle est éventuellement fixé un réactif, la première électrode 31 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 32 sur laquelle repose une deuxième électrode 33 surmontée d'une deuxième couche de matériau isolant 34 formant des microréservoirs 36, ce dispositif étant équipé d'une électrode externe 38, - la figure 4 représente un dispositif miniature selon l'Invention, équipé d'un support 47 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, contenant une pluralité de premières électrodes 41 électriquement isolées entres elles et dans lequel le fond de chaque microcuvette 45 est constitué par une première électrode 41 formant une zone de réception 49 sur laquelle est éventuellement fixé un réactif, les premières électrodes 41 étant en partie surmontées par une première couche de matériau isolant 42 sur laquelle repose une deuxième électrode 43 surmontée d'une deuxième couche de matériau isolant 44 formant des microréservoirs 46, ce dispositif étant équipé d'une électrode externe 48, - la figure 5 représente un dispositif miniature selon l'Invention, équipé d'un support 50 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, contenant une pluralité de premières électrodes 51 électriquement isolées entres elles et dans lequel le fond de chaque microcuvette 55 est constitué par une première électrode 51 formant une zone de réception 59 sur laquelle est éventuellement fixé un réactif, les premières électrodes 51 étant en partie surmontées par une première couche de matériau isolant 52 sur laquelle repose une deuxième électrode 53 surmontée dîme deuxième couche de matériau isolant 54 formant des microréservoirs 56, ce dispositif étant équipé d'une électrode externe 58 et d'un circuit intégré de multiplexage 104,
- la figure 6 représente un dispositif miniature selon l'Invention, équipé d'un support 67, dans^equel le fond de chaque microcuvette 65 est constitué par une première électrode 61 formant une zone de réception 69 sur laquelle est éventuellement fixé un réactif, la première électrode 61 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 62 sur laquelle repose une deuxième électrode 63 surmontée d'une deuxième couche de matériau isolant 64 elle-même surmontée par une troisième électrode 101 sur laquelle repose une troisième couche de matériau isolant 102 formant des microréservoirs 66,
- la figure 7 représente un dispositif miniature selon l'Invention identique à celui représenté sur la figure 1 sauf qu'il comporte en outre un moyen de fermeture amovible 100 permettant de fermer chacun des microréservoirs 76, - la figure 8 représente un dispositif miniature selon l'Invention identique à celui représenté sur la figure 5 sauf qu'il comporte en outre un moyen de fermeture amovible 100 permettant de fermer chacun des microréservoirs 86 dans lequel est intégré une électrode externe 88,
- la figure 9 représente un dispositif miniature selon l'Invention, équipé d'un support 97 et d'un circuit d'alimentation électrique 103, dans lequel le fond de chaque microcuvette 95 est constitué par une couche de verre ou de silicium 93 formant une zone de réception 99 sur laquelle est fixé un réactif, ladite couche de verre ou de silicium 93 étant surmontée par une première couche de matériau isolant 92 formant des microréservoirs 96 sur laquelle repose une première électrode 91 elle- même surmontée par une deuxième couche de matériau isolant 94, ce dispositif étant équipé d'une électrode externe 98.
Il est bien sûr entendu que les dispositifs illustrés sur ces figures correspondent à des formes particulières de réalisation de l'Invention et n'en constituent en aucune façon une limitation.
Les procédés de fabrication de tels dispositifs sont connus et décrits par exemple dans la demande de brevet FR-A-2 781 886.
L'Invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un dispositif miniature conforme à l'Invention pour l'isolement, la séparation, la culture et/ou l'analyse d'objets biologiques.
A titre d'exemple, les dispositifs miniatures conformes à l'Invention, et en particulier les dispositifδ^du type de ceux représentés par la figure 2 peuvent être utilisés pour fixer un objet biologique unique par microcuvette tel que par exemple une cellule biologique, ces cellules étant ensuite cultivées directement sur le dispositif pour amplifier les cellules par divisions cellulaires successives. On obtient ainsi un dispositif comportant une population homogène de cellules dans chaque microréservoir. Les cellules filles issues des divisions cellulaires peuvent ensuite être récupérées alors que les cellules mères restent fixées sur le fond des microcuvettes.
Les dispositifs conformes à l'Invention permettent donc de ne récupérer que des cellules filles correspondant par conséquent uniquement aux lignées cellulaires capables de se diviser. Cette utilisation est intéressante dans la mesure où elle permet d'éliminer les cellules mortes d'une culture bactérienne transformées par des plasmides et traitées par un antibiotique. Les dispositifs conformes à l'Invention peuvent également être utilisés comme moyen d'analyse du contenu d'un panel hétérogène de cellules, par immobilisation de cellules différentes dans une matrice ordonnée à raison d'une cellule par microcuvette, puis extraction des macromolécules que l'on souhaite analyser. Dans cette optique, on peut
- soit utiliser des dispositifs munis d'une pluralité de premières électrodes indépendantes tels que les dispositifs des figures 4 et 5, pour fixer, des réactifs différents spécifiques de chaque type de cellules à immobiliser,
- soit utiliser un dispositif tel que celui de la figure 9 comportant des microcuvettes dont le fond est constitué par une couche en verre porteur d'une fonction chimique de couplage ou un dispositif tel que ceux représentés par les figures
1 et 3, et pipeter localement des réactifs spécifiques en fonction de chaque type de cellule à immobiliser.
L'immobilisation des cellules se fait ensuite par exemple par trempage du dispositif dans une culture hétérogène de cellules ou par trempages successifs dans différentes cultures de cellules homogènes, la présence de réactifs spécifiques à chaque type de cellules permettant d'ordonner la matrice de cellules.
La deuxième électrode présente dans tous les dispositifs utilisés pour immobiliser ces cellules peut être soit pré-fonctionnalisée collectivement (par exemple par des anticorps spécifiques^pour extraire de chaque type cellulaire un type de protéine), soit plus généralement être utilisée pour fixer par électrochimie un produit issu de la cellule à la suite par exemple d'une réaction de PCR.
Les dispositifs illustrés sur les figures 4 et 5 peuvent également être utilisés pour réaliser un criblage à haut débit (High Throughput Screening : HTS) de réactifs chimiques ou biologiques sur les cellules. Dans ce cas, la pluralité de premières électrodes indépendantes permet une mesure électrique individualisée en réponse à l'action de réactifs chimiques ou biologiques sur les cellules dans les microréservoirs.
Ces criblages HTS peuvent être effectués sur des cellules animales en culture et dans ce cas, la surface du fond des microcuvettes est égale ou inférieure à la plus petite section des cellules à tester, soit environ 100 μm2 pour des cellules animales classiques. De plus, les dispositifs conformes à l'Invention peuvent être utilisés pour effectuer une électroporation fugace des cellules.
L'Invention a aussi pour objet un procédé de séparation et/ou d'isolement d'objets biologiques caractérisé en ce qu'il consiste : - dans une première étape, à mettre en contact au moins un dispositif miniature tel que défini précédemment, avec une solution d'objets biologiques homogénéisée, en particulier avec une solution de culture de cellules biologiques, pour permettre la fixation desdits objets au fond des microcuvettes sur les zones de réception, à raison d'au plus un objet biologique par microcuvette, - puis dans une deuxième étape, à laver les objets biologiques non fixés, de façon à obtenir un dispositif miniature sur lequel sont immobilisées les objets à isoler.
Les objets biologiques ainsi isolés et fixés sur le dispositif peuvent ensuite être étudiés selon les techniques décrites précédemment, par exemple par mesure de la variation leurs propriétés électriques sous l'effet d'un principe actif.
Lorsque le dispositif miniature utilisé selon ce procédé comporte un circuit de multiplexage, il est alors possible d'effectuer des mesures électriques individualisées dans chaque microcuvette.
Selon une première forme de réalisation du procédé conforme à l'Invention, la fixation des objets biologiques est réalisée par l'intermédiaire d'un champ électrique. Dans ce cas, on utilise de préférence des dispositifs dans lesquels la première électrode intégrée au dispositif constitue le fond des microcuvettes.
Selon une deuxième forme de réalisation du procédé conforme à l'Invention, la fixation des objets biologiques est réalisée par l'intermédiaire d'un réactif fixé sur au moins une partie du fond des microcuvettes réactionnelles. Dans ce cas le fond des microcuvettes peut aussi bien être constitué par une première électrode ou par une couche en verre, en plastique ou en silicium.
Le procédé conforme à l'Invention peut éventuellement comporter une troisième étape au cours de laquelle les objets fixés au fond des microcuvettes, notamment lorsqu'il s'agit de cellules biologiques, sont lysés de façon à libérer le matériel génétique qu'ils contiennent dans le microréservoir correspondant à la microcuvette où ils ont été fixés. La lyse des objets fixés peut être effectuée par choc électrique, choc thermique ou sonication.
Le matériel génétique ainsi libéré peut ensuite, dans une quatrième étape, être amplifié collectivement par PCR par introduction dans les microcuvettes des différents réactifs nécessaires à une réaction de PCR, ces réactifs comprenant notamment au moins une amorce fonctionnalisée par des groupements pyrrole. Les séquences amplifiées ainsi obtenues sont ensuite fixées, lors d'une cinquième étape, sur une électrode par électropolymérisation, de manière collective.
Selon une forme de réalisation particulière de ce procédé, les troisième et quatrième étapes peuvent être réalisées simultanément.
Selon encore une autre forme de réalisation particulière de l'Invention, et lorsque l'on utilise des dispositifs tels que ceux illustrés par les figures 1 et 3 ou un dispositif tel que celui représenté par la figure 9, il est possible d'utiliser ces dispositifs comme outil de criblage pour la recherche de ligands protéiques ou nucléotidiques d'une cible donnée.
Dans le cas de la recherche d'un ligand protéique, la culture cellulaire de départ est alors une banque cellulaire d'expression et on procède à l'immobilisation des cellules de la banque comme décrit précédemment.
Les dispositifs utilisés selon cette variante sont préalablement fonctionnalisés par la cible atà^niveau d'une électrode. La cible peut-être une molécule telle qu'un peptide, une protéine, une séquence nucléotidique, un peptidoglycane, un sucre ou encore toute autre molécule chimique. Cette cible peut également être fonctionnalisée par un groupement pyrrole et être ainsi fixée sur une électrode par électropolymérisation. Dans chaque microcuvette, une protéine recombinante va être exprimée par la cellule immobilisée et libérée de la cellule, soit par sécrétion, soit par la lyse de la cellule. Pendant cette expression au sein de chaque cellule, il est possible d'incorporer des précurseurs protéiques marqués (tels que par exemple la méthionine
S35) de façon à ce que la protéine ainsi exprimée soit, elle aussi, marquée. Les protéines montrant une affinité avec la cible vont se fixer spécifiquement sur l'électrode fonctionnalisée avec la cible. Si les protéines ont été marquées pendant leur expression, on peut alors procéder à leur détection. Sinon, la détection de l'interaction protéine/ligand doit être effectuée selon une étape supplémentaire consistant par exemple à faire réagir un anticorps anti-épitope universel marqué, et dans ce cas, il faut utiliser une banque d'expression exprimant toutes les protéines recombinantes avec cet épitope universel Les puits positifs contiennent ainsi les ligands protéiques potentiels de la cible. Le niveau d'affinité de ce ligand peut par exemple être estimé au moyen de lavages successifs de plus en plus stringents ou par compétition avec d'autres ligands connus.
Une fois la réaction telle que décrite ci-dessus effectuée, il reste à récupérer les clones correspondant aux puits positifs.
Si la cellule immobilisée est encore viable, cette récupération peut se faire par simple mise en culture du dispositif et pipetage des cellules filles dans les puits positifs comme décrit précédemment.
Si la réaction telle que décrite ci-dessus est délétère pour la division cellulaire, on aura pris soin au préalable de faire une duplication du dispositif initial contenant les cellules individualisées de la banque (puce A).
Une méthode de duplication consiste par exemple à mettre en culture la puce A puis de transférer de manière dirigée les cellules filles vers un nouveau dispositif identique (puce B), les microréservoirs de la puce A étant éventuellement mis en vis à Vis^avec les microréservoirs de la puce B, sous agitation.
La puce A subit alors le traitement tel que décrit précédemment afin de déteπniner les puits contenant le ligand protéique d'intérêt tandis que la puce B permet de récupérer les clones correspondant à ces puits positifs, par exemple par pipetage. A titre d'exemple de cette forme de réalisation particulière de l'Invention, la banque cellulaire d'expression est une banque d'expression, sécrétrice d'anticorps ou de sous-domaines d'anticorps. La cible fixée sur l'électrode est une protéine, un peptide, un virus, un oligonucléotide, contre lequel on cherche un anticorps. Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'immobilisation de bactéries sur des dispositifs miniatures conformes à l'Invention ainsi qu'à un exemple décrivant le protocole de préparation d'une puce à ADN sur un dispositif conforme à l'Invention.
EXEMPLE 1 : ISOLEMENT ET FIXATION DE BACTÉRIES SUR UN DISPOSITIF MINIATURE PAR L'INTERMÉDIAIRE DE PROTÉINES A On prépare une solution de protéine A à 0,1 mg/ml dans du tampon phosphate (PB S).
A l'aide d'une pipette, on dépose ensuite une goutte de cette solution de protéine A sur un dispositif miniature conforme à l'Invention et tel que décrit à la figure 1 annexée, de telle sorte que ladite goutte recouvre l'ensemble des microcuvettes.
Sur ce dispositif, chaque microréservoir présente un diamètre de 230 μm et une profondeur de 40 μm ; la surface du fond de chaque microcuvette étant de 40 μm2.
On applique ensuite pendant 10 secondes, un champ électrique entre les deux électrodes de la puce : potentiel de + 2,9 V sur l'électrode où l'on désire fixer la protéine A, l'autre électrode étant mise à la masse.
Lorsque la fixation est réalisée, le dispositif est alors rincé avec une solution de PBS.
Par ailleurs, on prépare une solution de PBS renfermant un complexe bactéries/anticorps^
Pour ce faire, on prépare d'abord une solution d'E. Coli DH5α dans du PBS (109 bactéries/ml), ainsi qu'une solution de l'anticorps correspondant Anti Ε. Coli (Dako) à 0,5 mg/ml.
Ces deux solutions sont ensuite mélangées (V/V) et laissées sous agitation à température ambiante pendant 1 heure et trente minutes afin de former le complexe bactéries/anticorps. Le complexe bactéries/anticorps est ensuite concentré par centrifugation, les anticorps en excès étant éliminés en retirant le surnageant. L'opération est répétée trois fois, après remise en solution du complexe bactéries/anticorps dans du PBS. A l'aide d'une pipette, on dépose ensuite une goutte de la solution contenant le complexe bactéries/anticorps sur le dispositif miniature fonctionnalisé par la protéine A, de telle sorte que ladite goutte recouvre l'ensemble des microcuvettes. Le dispositif miniature est ensuite laissé à incuber pendant 1 heure et 30 minutes à température ambiante, afin de permettre l'immobilisation du complexe bactérie/anticorps au fond des microcuvettes.
À l'issue de l'incubation, le dispositif est alors rincé abondamment au PBS afin d'éliminer les complexes bactéries/anticorps n'ayant pas réagi avec la protéine A.
On obtient un dispositif sur lequel sont immobilisées des bactéries E. Coli, à raison d'une bactérie par microcuvette.
Le dispositif miniature conforme à l'Invention ainsi préparé peut ensuite être utilisé dans diverses applications biologiques.
EXEMPLE 2 : ISOLEMENT ET FIXATION DE BACTÉRIES SUR UN DISPOSITIF MINIATURE SOUS L'ACTION D'UN CHAMP ÉLECTRIQUE
1) Fixation des bactéries par champ électrique
On prépare une suspension de bactéries E. Coli DH5α dans de l'eau permutée à raison de 109 bactéries/ml.
Un dispositif miniature identique à celui utilisé ci-dessus à l'exemple 1 est ensuite immergé dans cette suspension de bactéries.
On applique ensuite pendant 10 secondes, un champ électrique entre les deux électrodes de la puce : potentiel de + 0,9 V sur l'électrode où l'on désire fixer la bactérie, le potentiel de l'autee électrode étant fixé à - 2V.
Lorsque la fixation est réalisée, le dispositif est alors rincé à l'eau et séché à la soufflette d'azote.
On obtient un dispositif sur lequel sont immobilisées des bactéries E. Coli, à raison d'une bactérie par microcuvette. Le dispositif miniature conforme à l'Invention ainsi préparé peut ensuite être utilisé dans diverses applications biologiques.
EXEMPLE 3 : PRÉPARATION D'UNE PUCE A ADN PAR PCR A PARTIR D'UN DISPOSITIF MINIATURE CONFORME A L'INVENTION
Cet exemple décrit le protocole général de préparation d'une puce à ADN sur un dispositif miniature conforme à l'Invention.
1) Dépôt d'une amorce sens sur un dispositif miniature conforme à l'Invention On prépare une solution à 2,3" M d'une amorce sens modifiée en position 5' par un groupement pyrrole (0,77 μM) dans du perchlorate de lithium à 2,3"2 M.
Cette solution est déposée sur le dispositif miniature conforme à l'Invention et tel que préparé ci-dessus à l'exemple 2.
On applique ensuite pendant 3 secondes, un champ électrique entre les deux électrodes de la puce : potentiel de + 2,9 V appliqué sur l'électrode où l'on désire fixer l'amorce, l'autre électrode étant mise à la masse.
Le dispositif miniature est ensuite rincé à l'eau et séché à la soufflette d'azote.
2) Lyse des bactéries
Cette étape est réalisée par chauffage des bactéries à une température de 94°C pendant 2 minutes.
3) Réalisation de la PCR La PCR est réalisée en utilisant la solution suivante : Tris-HCL
1 mM, KC1 5 mM, MgCl2 2 mM, dNTP 0,8 mM ; amorce anti-sens marquée par la biotine en position 5' : 0,1 μM, BSA 1 mg/mL, Taq DNA polymerase de chez ROCHE à 0,02 um^tés/μl et amorce sens à 0,01 μM.
La puce est ensuite immergée dans l'huile. La PCR est^çalisée dans les conditions suivantes : 3 minutes à 94°C puis 30 cycles à 94°C pendant 30 secondes, 60°C pendant 30 secondes et 72°C pendant 1 minute et 30 secondes ; puis 72°C pendant 3 minutes et enfin 25°C pendant 30 secondes. Les cycles sont effectués dans un thermocycleur Hybaid.
Le dispositif miniature est ensuite rincé à l'eau après la fin des cycles PCR.
L'ADN amplifié est marqué par fluorescence par de la Streptavidine phycoérythrine.
La visualisation de la fluorescence est ensuite effectuée à l'aide d'un microscope à fluorescence.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif miniature de séparation et/ou d'isolement d'objets biologiques comportant au moins une première électrode intégrée au dispositif, constitué par une structure pourvue d'une matrice de microcuvettes réactionnelles, chaque microcuvette comportant un fond constituant une zone de réception, caractérisé en ce ledit fond est dépourvu de trou et que la surface maximale dudit fond de chaque microcuvette est définie de manière à isoler un objet biologique unique, ladite structure étant liée à un circuit d'alimentation pour créer une différence de potentiel entre ladite première électrode et au moins une deuxième électrode intégrée ou externe au dispositif.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la surface maximale du fond de chaque microcuvette est de préférence inférieure ou égale à deux fois la plus petite surface de l'objet biologique à isoler.
3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la surface dudit fond est inférieure ou égale à la plus petite surface de l'objet biologique à isoler.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés par levait que la surface maximale du fond de chaque microcuvette est comprise entre 1 μm2 et 400 μm2.
5. Dispositîrselon la revendication 4, caractérisée par le fait que la surface maximale du fond de chaque microcuvette est comprise entre 1 et 50 μm2.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la matrice de microcuvettes réactionnelles est surmontée au moins en partie d'une ou plusieurs couches de matériaux isolants et/ou d'une grille en plastique biocompatible rapportée, de façon à former une matrice de microréservoirs.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'une face de la première électrode intégrée au dispositif constitue le fond des microcuvettes.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que le fond des microcuvettes est constitué par une couche en verre, en plastique ou en silicium.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisé par le fait que les matériaux isolants sont choisis parmi les polyimides et les résines.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisé par le fait que les microréservoirs présentent une largeur et/ou une longueur comprise entre 5 et 500 μm.
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comporte plusieurs dites premières électrodes électriquement isolées entre elles.
12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la deuxième électrode est intégrée au dispositif et qu'elle est déposée sur une première couche de matériau isolant et située dans un plan espacé du fond desdites microcuvettes.
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une troisième électrode intégrée au dispositif, une deuxième couche de matériau isolant étant interposée entre la deuxième et la troisième électrode.
.
14. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé par le fait qu'il comporte plusieurs dites deuxièmes et/ou troisièmes électrodes isolées entre elles.
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que la deuxième électrode est externe est qu'elle est solidaire d'un capot ou d'un couvercle.
16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est équipé d'un circuit intégré de multiplexage d'au moins certaines desdites électrodes.
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'un réactif apte à fixer l'objet biologique à isoler est fixé sur au moins une partie de la zone de réception des microcuvettes réactionnelles.
18. Dispositif selon la revendication 17, en combinaison avec la revendication 7, caractérisé par le fait que ledit réactif est choisi parmi les copolymères conducteurs sur lesquels sont fixés des protéines, des peptides ou toutes molécules spécifiques du type de cellule à fixer.
19. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé par le fait que les copolymères conducteurs sont choisis parmi les polypyrroles.
20. Dispositif selon la revendication 18 ou 19, caractérisé par le fait que le réactif est un copolymère pyrrole-biotine-streptavidine-biotine-molécule spécifique.
21. Dispositif selon la revendication 17, prise en combinaison avec la revendication 8, caractérisé par le fait que ledit réactif est choisi parmi des polymères non spécifiques du type de cellule à fixer.
22. Dispositif selon la revendication 21, caractérisé par le fait que lesdits polymères sont de la poly-L-lysine.
23. Dispositif selon la revendication 17, prise en combinaison avec la revendication 8, caractérisé par le fait que le réactif est une protéine ou un peptide et que ladite couche en verre, en plastique ou en silicium est recouverte d'une couche de silane modifié par des fonctions -NHS ou aldéhydes sur lesquelles est fixé ledit réactif.
24. Dispositif selon la revendication 17, caractérisé par le fait qu'il comporte des microcuvettes renfermant des réactifs différents.
25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est équipé d'un moyen de fermeture.
26. Utilisation d'au moins un dispositif miniature tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, pour l'isolement, la séparation, la culture et/ou l'analyse d'objets biologiques.
27. Procédé de séparation et/ou d'isolement d'objets biologiques caractérisé en ce qu'il consiste :
- dans une première étape, à mettre en contact au moins un dispositif miniature tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 25 avec une solution d'objets biologiques homogénéisée, en particulier avec une solution de culture de cellules biologiques, pour permettre la fixation desdits objets au fond des microcuvettes sur les zones de réception, à raison d'au plus un objet biologique par microcuvette, - puis dans une deuxième à étape à laver les objets biologiques non fixés, de façon à obtenir un dispositif miniature sur lequel sont immobilisés les objets à isoler.
28. Procédé selon la revendication 27, caractérisé par le fait que la fixation des objets biologiques est réalisée par l'intermédiaire d'un champ électrique.
29. Procédé selon la revendication 27, caractérisé par le fait que la fixation des objets biologiques est réalisée par l'intermédiaire d'un réactif fixé sur au moins une partie du fond des microcuvettes réactionnelles.
30. Procédé selon l'une quelconque des revendications 27 à 29, caractérisé par le fait que l'on utilise un dispositif comportant des microréservoirs et qu'il comporte une troisième étape au cours de laquelle les objets fixés au fond des microcuvettes sont lysés de façon à libérer le matériel génétique qu'ils contiennent dans le microréservoir correspondant à la microcuvette où ils ont été fixés.
31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé par le fait qu'il comporte une quatrième étape au cours de laquelle le matériel génétique libéré est amplifié par PCR.
32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé par le fait que les troisième et quatrième étapes sont réalisées simultanément.
33. Procédé selon la revendication 31 ou 32, caractérisé par le fait que les séquences amplifiées So t fixées, lors d'une cinquième étape, sur une électrode par électropolymérisation.
34. Procédé selon l'une quelconque des revendications 27 à 33, caractérisé par le fait que le dispositif utilisé comporte un circuit de multiplexage et que des mesures électriques individualisées sont effectuées dans chaque microcuvette.
35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 27 à 34, caractérisé par le fait que le dispositif utilisé comporte un circuit de multiplexage et que les objets biologiques à isoler sont issus d'un panel hétérogène de cellules.
36. Utilisation d'au moins un dispositif tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 25, comme outil de criblage pour la recherche de ligands protéiques ou nucléotidiques d'une cible donnée.
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