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WO2002078698A2 - Polarisation de cellules dendritiques (traitement des infections, du cancer et des maladies auto-immunes) par l'histamine - Google Patents

Polarisation de cellules dendritiques (traitement des infections, du cancer et des maladies auto-immunes) par l'histamine Download PDF

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WO2002078698A2
WO2002078698A2 PCT/FR2002/001052 FR0201052W WO02078698A2 WO 2002078698 A2 WO2002078698 A2 WO 2002078698A2 FR 0201052 W FR0201052 W FR 0201052W WO 02078698 A2 WO02078698 A2 WO 02078698A2
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WO
WIPO (PCT)
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dendritic cells
histamine
cells
use according
medicament
Prior art date
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PCT/FR2002/001052
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English (en)
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WO2002078698A3 (fr
Inventor
Gerssende Caron
Pascale Jeannin
Jean-Yves Bonnefoy
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pierre Fabre Medicament SA
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament SA
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Publication date
Application filed by Pierre Fabre Medicament SA filed Critical Pierre Fabre Medicament SA
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Publication of WO2002078698A3 publication Critical patent/WO2002078698A3/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants

Definitions

  • the present invention relates to the use of histamine to induce the polarization of dendritic cells, and more particularly to induce the polarization of dendritic cells into type 2 dendritic cells, useful in particular for the therapeutic and prophylactic treatment of pathologies associated with an excessive Thl response.
  • Histamine is a proinflammatory mediator released by activated mast cells and basophils. This mediator exists preformed in granules present in the cytoplasm of these cells and is released quickly after activation. Histamine is released in particular during the IgE-dependent activation of mast cells and basophils during allergic phenomena. It participates in clinical manifestations associated with the immediate hypersensitivity reaction such as vasodilation and bronchial secretion.
  • Histamine also exhibits immunoregulatory properties. Histamine increases the production of IL-6 and IL-8 by endothelial cells as well as the production of IL-1 and IL-6 by monocytes. Histamine has also been observed to reduce the production of IL-12 by monocytes from patients with atopy (van der Pouw Kraan et al, J Clin Invest 1998 Nov 15; 102 (10): 1866-73) .
  • Dendritic cells play a role in the development of an immune response and in the initiation of a specific T lymphocyte response (Steinman RM et al Immuno Rev (1997) 156, 25 & Sella M et al Curr Opin Immunol (1997) 9, 10).
  • Immature dendritic cells are located in non-lymphoid tissue. At the level of the skin, in all the epidermis except the intestine, they are then called Langerhans cells; dendritic cells, in smaller quantities, are also located in organs such as the lung, liver, intestine. These immature dendritic cells capture and digest antigens very efficiently.
  • the dendritic cells After antigenic stimulation in vivo or stimulation by proinflammatory molecules, the dendritic cells which have captured the antigens migrate into the secondary lymphoid organs. During this migration, the dendritic cells undergo functional and phenotypic modifications which are grouped under the term of maturation.
  • This maturation is characterized by an increase on the CD surface of molecules involved in the activation of T lymphocytes (such as CD40, CD54, CD58, CD86 and MHC class I / II), the production of proinflammatory cytokines (IL-1 and IL-6) and chemokines (such as TNF ⁇ , IL-8, MCP-1 and MlP-lalpha) and lose their ability to process ⁇ antigen.
  • Chemokines recruit inflammatory cells and promote the initiation of an immune response.
  • IL-8, MCP-1 and MlP-lalpha attract not only inflammatory cells but also naive and memory T lymphocytes.
  • CD by secreting chemokines increase their chances of coming into contact with T lymphocytes.
  • the proinflammatory cytokines and in particular IL-1 will also act by directly activating CD.
  • Th lymphocytes Two types of Th lymphocytes can be distinguished according to the profile of cytokines produced: Th lymphocytes of type 1 producing IFN- ⁇ and IL-2 and promoting the formation of IgG2a in mice, and Th lymphocytes of type 2 producing IL-4, IL-5 and IL-10 with formation of IgG1 in mice (Mosmann, TR and Sad S. Immunol. Today 1996, 17: 138).
  • CDl producers of IFNgamma
  • Th2 producers of IL4
  • mature CD were called CDl or CD2 respectively (Liu, YJ et al Curr. Top Microbiol Immunol 2000).
  • Myeloid CDs can polarize to CD1 or CD2 depending on the nature of the polarization factors that will influence the production of IL12 (a Thl-oriented cytokine).
  • IFNgamma induces the polarization of CD during maturation into CD1 (Hilkens, CM et al Blood 1997; Vieira, PL et al J Immunol 2000), prostaglandin E2 (Kalinski P, et al J Immunol 1997; Kalinski P , et al J Immunol 1998), cholera toxin (Gagliardi MC, et al European J Immunol 2000), and ATP (La Sala A, et al J Immunol 2001) promote the development of CD2.
  • These mature dendritic cells present the antigens to the T lymphocytes and initiate the specific T responses very efficiently, the costimulation molecules being expressed in large quantities on these cells.
  • the migrated dendritic cells As cells mature, they lose their ability to capture and process the antigen. In the thy o-dependent areas of the lymphoid organs, the migrated dendritic cells have acquired powerful immunostimulatory properties and will therefore very effectively activate the circulating naive T lymphocytes.
  • the authors of the present invention have demonstrated for the first time the link between histamine and the polarization of dendritic cells. More specifically, they demonstrated that histamine promotes the polarization of dendritic cells into CD2-type dendritic cells. This is all the more surprising since the person skilled in the art cannot distinguish the molecules promoting a Th2 response acting directly on naive T lymphocyte cells or acting via dendritic cells.
  • histamine will be used to name histamine, but also the histamine salts such as histamine dihydrochloride, histamine phosphate or other salts, esters or precursors histamine and histamine receptor agonists (Hl, H2, H3).
  • HTMT, Amthamine or Dimaprit, as well as other analogs or agonists of the histamine receptors described in US Pat. No. 5,728,378 are also included in the term "histamine”.
  • the present invention thus relates to the use of histamine and / or histamine receptor agonists to induce the polarization of dendritic cells, and more particularly to polarize dendritic cells into type 2 dendritic cells.
  • the present invention relates more particularly to the use of histamine and / or agonists of the histamine receptors for the manufacture of a medicament intended to induce the polarization of dendritic cells, preferably in dendritic cells of type 2 (DC2) .
  • DC2 dendritic cells of type 2
  • the histamine and / or the histamine receptor agonists according to the invention can serve to promote the polarization of the dendritic cells in vitro, the mature polarized cells can then be reinjected in vivo.
  • this medicament can serve to promote the polarization of dendritic cells in vitro, after contact with a biological agent.
  • the invention relates to the use according to the invention of histamine and / or agonists of histamine receptors and in addition of at least one agent biological for the manufacture of a medicament.
  • the latter may for example increase the immunological response to this biological agent.
  • This biological agent can be chosen from nucleic acids, proteins, lipids, lipopeptides or polysaccharides.
  • a tumor antigen is defined as a tumor protein or peptide, and in particular as an epitope, in particular a CTL epitope (peptide sequences interacting with class I molecules and presented to CD8 + T lymphocytes) or as the nucleic acid sequence encoding such proteins, peptides or epitopes.
  • tumor antigens may be mentioned, without limitation: MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV- TL3 and MOV18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA- 19-9, renal tumor-associated antigen G250, EGP-40 (or EpCAM), S100 (malignant melanoma - associated antigen), p53, prostate tumor-associated antigens (eg, PSA and PSMA) and p21ras.
  • MAGE-2 MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA), TAG-72, ovarian-associated antigens OV- TL3 and MOV18
  • TUAN alpha-feto protein
  • OFP alpha-feto protein
  • OFP alpha-feto protein
  • the biological agent can also be chosen from a lysate of autologous and / or heterologous tumor cells.
  • autologous tumor cells means tumor cells belonging to the subject who will receive the compositions according to the invention.
  • heterologous tumor cells should be understood to mean cells originating from tumors originating from an individual different from that for which the composition according to the invention is intended.
  • the use of heterologous cells makes it possible to obtain pharmaceutical compositions which make it possible in particular to treat patients suffering from cancer from whom the removal of tumor cells is not possible.
  • the use of heterologous cells also makes it possible to obtain compositions according to the invention standardized comprising antigens found in many types of cancer and thus usable in a majority of patients.
  • Tumor cells can be obtained from a sample of cancerous tissue, for example following a biopsy or surgical resection. These cells can then be used as they are or can be cultured before being lysed.
  • a cell lysate can be defined within the meaning of the present invention as a mixture of intracellular and / or membrane antigens, preferably intra and membrane.
  • Said autologous and / or heterologous tumor cell lysate according to the invention can be obtained by mechanical, chemical or enzymatic lysis of tumor cells. In order to lyse the cells mechanically, mention may in particular be made of the techniques known to those skilled in the art, namely in particular sonication, ultrasonication or freezing / thawing.
  • freeze / thaw particularly preferred is freeze / thaw, and most particularly the use of multiple freeze / thaw cycles.
  • the cells can also be lysed using chemical compounds or enzymes, such as for example digitonin lysis buffer, triton X-100 or Nonidet P40. Any method of breaking the cell membrane of tumor cells can be used to obtain a lysate.
  • the dendritic cells are thus modified using these antigens or cell lysates so that they express tumor antigens.
  • said drug can be injected at the same time as the dendritic cells or preferably said drug can be used in vitro, in order to promote the polarization of the dendritic cells before reinjecting them into patients.
  • dendritic cells in the presence of histamine and / or histamine receptor agonists may be used to generate anticancer CTL responses (Nestlé FO et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332).
  • This approach called “ex vivo” therefore consists in loading the dendritic cells ex vivo with the antigen of interest (peptides or cell lysate) in the presence of histamine and / or agonists of the histamine receptors and in reimplanting these cells in the patient.
  • a step of washing the dendritic cells so as to remove the histamine and / or the agonists of the histamine receptors from the medium containing the dendritic cells can be carried out before reimplanting these cells in the patient.
  • Another approach according to the invention consists in transfecting ex vivo the dendritic cells with the gene coding for the antigen of interest and in particular with a gene coding for a bacteria, virus, yeast, parasite, fungus antigens, or for a tumor antigen, such as those described above, and / or with a gene encoding a cytokine or a growth factor, such as those described below, and to put the dendritic cells, before and / or during and / or after transfection, in the presence of histamine and / or histamine receptor agonists and to reinject these transfected cells (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46, 82- 87).
  • a step of washing the dendritic cells so as to remove the histamine and / or the histamine receptor agonists from the medium containing the dendritic cells can be carried out before re-implanting these cells in the patient.
  • Such approaches have been successfully used in mice and in humans (Hsu F.J. et al., 1996, Nat. Med., 2, 52-58).
  • the medicament according to the invention can comprise, in a preferred embodiment of the invention, also a factor for the maturation of dendritic cells.
  • the latter may in particular be chosen from LPS, TNF ⁇ , and all compounds bacterial or viral inducing the maturation of immature dendritic cells, such as for example LPS (lipopolysaccharides), OmpA, oligonucleotides or monophosphoril A.
  • This maturation factor may in particular be used prior to histamine, so as to mature the immature dendritic cells. It is also possible, preferably, to simultaneously use histamine and the maturation factor to mature and polarize the dendritic cells.
  • the medicament according to the invention can also further comprise a cytokine or a growth factor, in particular interferon alpha or gamma, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-4, IL-6 and IL-18, an HSP (Heat Shock Protein) such as for example hsp70, hsp90, hsp96, which makes it possible to potentiate the immune response; and / or fibroblasts genetically modified so as to release a cytokine or a growth factor.
  • HSP Heat Shock Protein
  • Mention may be made of fibroblasts expressing GM-CSF sold by the company Immune Response Corporation.
  • Histamine and / or histamine receptor agonists with at least one biological agent associated with TNF alpha can be used for the manufacture of a medicament intended to increase the proliferation of T lymphocytes.
  • the medicament according to the invention may also comprise an adjuvant making it possible to increase the immune response, in particular chosen from the group of adjuvant comprising MPL-A, Quil-A, ISCOM, CpG, Leif, CT (cholera toxin) or LT (Heat labile enterotoxin), just like the detoxified versions of CT or LT, or bacterial membrane proteins such as OMPC from Neisseria meningitidis (Vella et al ., Infect. Immun. 60, 1992, 4977-4983), TraT of Escherichia coli (Croft et al., J. Immunol.
  • an adjuvant comprising MPL-A, Quil-A, ISCOM, CpG, Leif, CT (cholera toxin) or LT (Heat labile enterotoxin), just like the detoxified versions of CT or LT, or bacterial membrane proteins such as OMPC from Neisseria meningitidis (Vella et al
  • PorB of Neisseria meningitidis (Fusco et al., J Infect. Dis. 175, 1997, 364-372), and preferably an OmpA of a bacteria of the genus Klebsiella, major protein of the outer membrane called P40, having an adjuvant activity for peptide subunit antigens (WO 95/27787 and WO 96/14415; Haeuw et al., Eur. J. Biochem. 255, 1998, 446-454; Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol. 73, 1999, 5637-5645).
  • the medicament according to the invention can also comprise a pharmaceutically acceptable medium.
  • the pharmaceutically acceptable medium is the medium in which the compounds of the invention are administered, preferably a medium injectable into humans. It can consist of water, an aqueous saline solution or an aqueous solution based on dextrose and / or glycerol.
  • the medicament according to the invention can also be conveyed in a form making it possible to improve its stability and / or its immunogenicity; thus, it can be conveyed in the form of liposomes, virosomes, nanospheres, microspheres or microcapsules.
  • the drug or the combination of histamine and / or histamine receptor agonists - biological agent may also be in an easily administered form such as an ointment, a lotion, a solution or even in the form of an adhesive composition: plaster or "patch".
  • the medicament according to the invention may be used in particular for the treatment of: - microbial infections, in particular chronic type infections associated with the development of an ineffective specific immune response (virus: for example the human immunodeficiency virus (HIV) ), the hepatic viruses, in particular the hepatic viruses A, B, C and D and the parainfluenza virus, bacteria, parasites and yeasts),
  • virus for example the human immunodeficiency virus (HIV)
  • HIV human immunodeficiency virus
  • hepatic viruses in particular the hepatic viruses A, B, C and D and the parainfluenza virus, bacteria, parasites and yeasts
  • - cancers in particular in subjects carrying HIV and / or suffering from myelomas, lymphomas, leukemias, melanomas, carcinomas, of the kidney, brain, prostate, rectum, pancreas, ovaries, lung, shed, for example.
  • the invention particularly relates to cellular immunotherapy using anti-cancer and anti-infectious vaccines in particular, by generating in vitro autologous polarized dendritic cells, by introducing a tumor antigen there and by reinjecting them after a step optional washing. Exposure of dendritic cells in vitro to histamine and / or histamine receptor agonists and optionally to a maturation factor, will increase the polarization of dendritic cells and therefore increase the effectiveness of the vaccine .
  • the present invention relates particularly to the use according to the invention of histamine and / or histamine receptor agonists for the preparation of a medicament for increasing the immunological response vis-à-vis an agent biological as defined above.
  • This medication can be a vaccine for the treatment or prevention of infectious diseases of viral origin - such as in particular HIV, hepatic viruses and parainfluenza virus -, bacterial, fungal, or caused by a yeast or a parasite.
  • the present invention also relates to the use according to the invention of histamine and / or histamine receptor agonists with at least one biological agent for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of cancers and particularly cancers among myelomas, lymphomas, leukemias, carcinomas of the kidney, brain, prostate, rectum, pancreas, ovaries, lung, and for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of skin cancers chosen from keratinomas and carcinomas.
  • the treatment of these cancers can also be envisaged by injecting dendritic cells.
  • autologous including autologous dendritic cells that have been modified to express tumor antigens.
  • the polarization of the dendritic cells will be ensured by histamine and / or the histamine receptor agonists. If immature dendritic cells are used, a maturation factor may also be used.
  • Another subject of the invention is the use of histamine and / or histamine receptor agonists for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase an immune response against pathologies associated with an excessive Th1 response. .
  • DC2-based immunotherapies are more particularly envisaged in the article by Yong-Jun et al, Blood, April 15, 2000, volume 95, number 8, 2482-2483.
  • the invention also relates to the use of histamine and / or histamine receptor agonists to induce polarization of dendritic cells in vitro, and more particularly to polarize dendritic cells into type 2 dendritic cells.
  • histamine and / or agonists of the histamine receptor, a maturation factor are also used to induce in polarization of dendritic cells, and more particularly for polarizing dendritic cells into type 2 dendritic cells.
  • the invention also relates to a device for polarizing dendritic cells, such as for example a kit, comprising at least histamine and / or receptor agonists. histamine.
  • the device for the polarization of dendritic cells such as for example a kit, further comprises a maturation factor. This kit can be adapted for the polarization of dendritic cells in vitro and can be used for example in research laboratories.
  • This kit may also contain histamine and / or histamine receptor agonists a maturation factor, immature dendritic cells and / or the means necessary to isolate immature dendritic cells, such as for example means of purification of blood mononuclear cells. It may thus include for example histamine and / or histamine receptor agonists, a maturation factor, different culture media, washing solutions, culture plates, reagents, controls such as by example of the antibodies, and an explanatory note for the implementation of the method according to the invention of maturation of the dendritic cells.
  • a kit according to the invention can also be adapted to the implementation of the therapeutic method mentioned above.
  • This kit can also contain histamine and / or histamine receptor agonists, a maturation factor, immature dendritic cells and / or the means necessary to isolate immature dendritic cells, such as for example means purifying blood mononuclear cells. It may thus include, for example, histamine and / or histamine receptor agonists, a maturation factor, different culture media, washing solutions, culture plates, reagents, controls, and a explanatory note for the implementation of the therapeutic method mentioned above. If necessary, it may also contain heterologous antigens or means for obtaining a lysate of autologous cells.
  • the legends of the figures and examples which follow are intended to illustrate the invention without in any way limiting its scope. These examples demonstrate the action of histamine on dendritic cells: histamine induces the maturation of immature human dendritic cells and gives them powerful stimulatory and antigen-presenting properties.
  • Figure 1 Histamine prevents the production of IL12 by mature CDs.
  • A&B CD maturation is induced by 10 ng / ml of LPS, in the absence or presence of increasing doses of IFNg and / or histamine. After 48 hours, mature CDs are stimulated with soluble CD40 ligand (A) or LPS + IFNg (B). The concentration of IL12 p70 in the supernatants was measured by ELISA after 24 hours. The results are representative of one of 3 experiments.
  • Figure 2 Histamine is a factor of polarization from CD to CD2.
  • CD was induced by a 2-day treatment with LPS (10 ng / ml), LPS (10 ng / ml) + INFg (100 ng / ml), LPS (10 ng / ml) + histamine (10 ⁇ 5 M), or LPS (10 ng / ml) + INFg (100 ng / ml) + histamine (10 ⁇ 5 M).
  • LPS (10 ng / ml) + INFg (100 ng / ml) + histamine (10 ⁇ 5 M) After an expansion induced by IL2, the T lymphocytes were stimulated with PMA + ionomycin for 5 hours and the production of IL4 and of IFNg was evaluated by FACS, after intracellular labeling. The percentage of positive cells is indicated in each dial. The data are representative among 3.
  • Histamine decreases the capacity of dendritic cells during maturation to produce IL12 after restimulation, even in the presence of IFN ⁇ .
  • Human dendritic cells are generated from monocytes isolated from peripheral blood.
  • the blood is taken by leukopheresis in the presence of an anticoagulant such as for example lithium heparinate.
  • Monocytes are purified by positive selection using a magnetic cell separator (MACS TM; Miltenyi Biotec, Bergisch
  • CMNs are incubated for 20 minutes at 4 ° C. with magnetic beads on which are fixed an anti-human CD14 monoclonal antibody. After washing, the cell suspension plus beads is placed on a column and subjected to a magnetic field. After three washes, the column is no longer subjected to the magnetic field and the monocytes are collected by gravitation. The purity of the monocytes is evaluated by cytofluorometry (FACScan cytofluorometer; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium) on the basis of the size-granulosity parameters of the cells. The purity is greater than 98%.
  • the monocytes are then cultured at a concentration of 10 6 cells / ml in the following medium (hereinafter called complete culture medium): RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (heating at 56 ° C. for 30 minutes), 2 mM L-glutamine, 50 U / ml of penicillin and 50 ug / ml of streptomycin (Life technologies) in 6-well culture plates (Nunc, Roskilde, Denmark) at a rate of 5 ml of medium per well.
  • complete culture medium hereinafter called complete culture medium: RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (heating at 56 ° C. for 30 minutes), 2 mM L-glutamine, 50 U / ml of penicillin and 50 ug / ml of streptomycin (Life technologies) in 6-well culture plates (Nunc, Roskilde, Denmark) at a rate of 5 ml of medium per well.
  • the cells are activated with 20 ng / ml of recombinant human IL-4 and 20 ng / ml of recombinant human GM-CSF (R&D Systems, Abingdon, United Kingdom). After 5 to 7 days of culture (37 ° C, 5% C0 2 in a humid atmosphere), the phenotype of the cells is defined by cytofluorometry. Briefly, an aliquot of the cell suspension is removed.
  • the cells are washed in FACS buffer (10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 1% bovine serum albumin and 0.01% sodium azide) and then distributed in wells of a 96-well culture plate at the bottom conical (Nunc) at the rate of 2 ⁇ 10 4 cells in a volume of 50 ⁇ l of FACS buffer.
  • FACS buffer 10 mM phosphate buffer pH 7.4 containing 1% bovine serum albumin and 0.01% sodium azide
  • CDla versus CD83 The analysis of the expression of CDla versus CD83 is evaluated by FACS. Only immature dendritic cells characterized by expression of the CDla molecule (mean fluorescence intensity (IMF)> 100) and the absence of expression of the CD83 molecule were used. After 7 days, immature CDs were stimulated with LPS (from Escherichia coli isotype 0111: B4, Sigma, Saint Louis, MO) alone, or in combination with IFNg (R&D Systems, Abingdon, UK) and or histamine (Sigma).
  • LPS from Escherichia coli isotype 0111: B4, Sigma, Saint Louis, MO
  • the mature CDs were washed and recultivated to 10 5 cells / 200 ⁇ l / well in 96-well culture plates and were or were not stimulated with 5 ⁇ g / ml of CD40 recombinant soluble ligand (Peprotech, Rocky Hill, NJ) or with LPS (10 ng / ml) + IFNg (100 ng / ml).
  • the IL12 was determined in the supernatants by ELISA (R&D Systems; sensitivity 0.5 pg / ml) the results are expressed in pg / ml as the mean ⁇ SD of four experiments
  • the maturation of dendritic cells is induced by a 2-day incubation with LPS in the presence or absence of IFNg and or histamine.
  • CD matured with LPS produce low levels of IL12 after stimulation with CD40 ligand or with LPS + IFNg.
  • the addition of IFNg generates mature CDs producing high levels of IL12 after restimulation.
  • the inhibitory effect of histamine on the production of IL12 by CD is mediated by the H1 and H2 receptors.
  • the CDs were generated and stimulated as before with the following modification: - in some experiments the CD were preincubated for 1 hour with H1, H2 and H3 receptor antagonists (mepyramine, cimetidine and thioperamide, respectively) used at 10 "5 M before addition of histamine - in other experiments the CDs were incubated not with histamine or H1 and H2 receptor agonists (HTMT dimaleate and amthamine dihydrobromide, respectively) (both marketed by Biomol, Plymouth Meeting, PA).
  • H1, H2 and H3 receptor antagonists mepyramine, cimetidine and thioperamide, respectively
  • Histamine polarizes the CD during maturation towards CD2 and this even in the presence of IFN ⁇ .
  • CDs were generated and stimulated as before.
  • the T cells were prepared and stimulated as follows. After rosetting and depletion of CD8 + T lymphocytes, the naive CD4 + CD45RA + T lymphocytes were purified by MACS (Miltenyi biotec, Bergisch Gladbach, Germany) by positive selection.
  • naive T lymphocytes (5 ⁇ 10 4 ) were cultured from irradiated allogeneic CD (2 ⁇ 10 4 ), the maturation of which was induced by LPS (10 ng / ml), LPS (10 ng / ml) plus IFNg (100 ng / ml ), LPS (10 ng / ml) + histamine (10 ⁇ 5 M) or LPS (10 ng / ml) + IFNg (100 ng / ml) + histamine (10 ⁇ 5 M). After 5 days, 50 U / ml of recombinant human IL2 (R&D Systems) were added and the cultures were maintained for 7 days. Then the T lymphocytes were washed and restimulated with 10 ng / ml of PMA (Sigma) + 1 ⁇ g / ml of ionomycin (Calbiochem, San Diego, CA) for 5 hours.
  • PMA Sigma
  • ionomycin Calbiochem
  • Brefeldin A (10 ⁇ g / ml, Sigma) was added during the last 2 hours of culture.
  • the cells were then fixed, permabilized and labeled with an FITC coupled anti-IFNg mAb (Pharmingen, San Diego, CA) and with a PE coupled anti-IL4 mAb (BD biosciences, Franklin Lakes, NJ), then analyzed with a FACScan. (Beckton Dickinson)
  • results show that the addition of histamine during the maturation of the CD generates CD2 which favor the development of lymphocytes of type Th2, characterized by an increase in the percentage of cells producing IL4 and a decrease in the percentage of cells producing IFNg.
  • CD2 which induces the differentiation of naive T lymphocytes into effector lymphocytes of the Th2 type. This is observed even in the presence of IFNg, a powerful Thl polarization factor.

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Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation de l'histamine pour induire la polarisation des cellules dendritiques, et plus particulièrement pour induire la polarisation des cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2, utiles notamment pour le traitement thérapeutique et prophylactique des pathologies associées à une réponse Th1 excessive.

Description

POLARISATION DE CELLULES DENDRITIQUES PAR L'HISTAMINE
La présente invention se rapporte à l'utilisation de 1' histamine pour induire la polarisation des cellules dendritiques, et plus particulièrement pour induire la polarisation des cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2, utiles notamment pour le traitement thérapeutique et prophylactique des pathologies associées à une réponse Thl excessive. L' histamine est un médiateur proinflammatoire libéré par les mastocytes et les basophiles activés. Ce médiateur existe préformé dans des granules présent dans le cytoplasme de ces cellules et est libéré rapidement après activation. L' histamine est libérée en particulier lors de l' activation dépendante de l'IgE des mastocytes et des basophiles au cours des phénomènes allergiques. Elle participe aux manifestations cliniques associées à la réaction d'hypersensibilité immédiate telles que vasodilatation et sécrétion bronchique.
Récemment il a été observé que l' histamine présentait également des propriétés immunorégulatrices. L' histamine augmente la production d' IL-6 et d' IL-8 par les cellules endothéliales ainsi que la production d'IL-1 et d' IL-6 par les monocytes. Il a également été observé que 1*histamine réduit la production d'IL-12 par les monocytes de patients atteints d'atopies (van der Pouw Kraan et al, J Clin Invest 1998 Nov 15;102(10) :1866-73) .
Les cellules dendritiques jouent un rôle dans le développement d'une réponse immune et dans l'initiation d'une réponse Iymphocytaire T spécifique (Steinman RM et al Immuno Rev (1997) 156, 25 & Sella M et al Curr Opin Immunol (1997) 9, 10). Les cellules dendritiques immatures sont localisées dans les tissus non lymphoïdes. Au niveau de la peau, dans tous les épidermes hormis l'intestin, elles sont alors appelées cellules de Langerhans ; des cellules dendritiques, en plus faible quantité, sont aussi localisées dans les organes tels que le poumon, le foie, l'intestin. Ces cellules dendritiques immatures captent et digèrent les antigènes de façon très efficace. Après une stimulation antigénique in vivo ou stimulation par des molécules proinflammatoires, les cellules dendritiques qui ont capté les antigènes migrent dans les organes lymphoïdes secondaires. Durant cette migration, les cellules dendritiques subissent des modifications fonctionnelles et phénotypiques qui sont regroupées sous le terme de maturation. Cette maturation se caractérise par une augmentation à la surface des CD de molécules impliquées dans l' activation des lymphocytes T (telles que CD40, CD54, CD58, CD86 et MHC classe I/II), la production de cytokines proinflammatoires (IL-1 et IL-6) et de chemokines (telles que TNFα, IL-8, MCP-1 et MlP-lalpha) et perdent leur capacité à processer lλantigène. Les chemokines recrutent des cellules inflammatoires et favorisent l'initiation d'une réponse immune. En particulier, l'IL-8, le MCP-1 et le MlP-lalpha attirent non seulement des cellules inflammatoires mais également des lymphocytes T naïfs et mémoires. Ainsi, les CD en sécrétant des chemokines augmentent leurs chances d'entrer en contact avec les lymphocytes T. Les cytokines proinflammatoires et en particulier l'IL-1 vont également agir en activant directement les CD.
La mise en place d'une réponse anticorps dirigée contre un antigène nécessite une série d'événements complexes. Elle met en jeu des cellules présentant l'antigène, des lymphocytes T régulateurs (Th pour T "helper") et des lymphocytes B producteurs d'anticorps. Deux types de lymphocytes Th peuvent être distingués selon le profil de cytokines produites : lymphocytes Th de type 1 produisant de l'IFN-γ et de 1 ' IL-2 et favorisant la formation d'IgG2a chez la souris, et lymphocytes Th de type 2 produisant de l'IL-4, IL-5 et IL-10 avec formation d'IgGl chez la souris (Mosmann, T.R. and Sad S. Immunol. Today 1996, 17:138). Par ailleurs, il a été montré que, pour un même antigène donné, c'est l'adjuvant qui oriente vers l'isotype majoritaire lors de la réponse anticorps (Toellner K.-M. et al. J. Exp. Med. 1998, 187:1193). Ainsi, il est connu que les sels d'aluminium, comme 1 'Alhydrogel, induisent chez la souris une réponse essentiellement de type Th2 (Allison A.C. In Vaccine design - The rôle of cytokine networks Vol. 293, 1-9 Plénum Press 1997) .
Du fait de leur capacité à induire la polarisation des lymphocytes T naïfs en cellules effectrices Thl (producteurs d'IFNgamma) ou Th2 (producteurs d'IL4), les CD matures ont été appelées CDl ou CD2 respectivement ( Liu, YJ et al Curr. Top Microbiol Immunol 2000) . Les CD myeloïdes peuvent se polariser en CDl ou CD2 en fonction de la nature des facteurs de polarisation qui vont influencer la production d' IL12 (une cytokine à orientation Thl). Alors que l'IFNgamma induit la polarisation de CD en cours de maturation en CDl ( Hilkens, CM et al Blood 1997 ; Vieira, PL et al J Immunol 2000), la prostaglandine E2 (Kalinski P, et al J Immunol 1997 ; Kalinski P, et al J Immunol 1998), la toxine cholérique (Gagliardi MC, et al European J Immunol 2000), et l'ATP (La Sala A, et al J Immunol 2001) favorisent le développement de CD2. Ces cellules dendritiques matures présentent les antigènes aux lymphocytes T et initient les réponses T spécifiques de façon très efficace, les molécules de costimulation étant exprimées en quantité importante sur ces cellules . Les cellules en devenant matures perdent leur capacité à capter et processer, l'antigène. Dans les zones thy o- dépendantes des organes lymphoïdes, les cellules dendritiques qui ont migré ont acquis de puissantes propriétés immunostimulatrices et vont donc activer de façon très efficace les lymphocytes T naïfs circulants. Les auteurs de la présente invention ont mis en évidence pour la première fois le lien entre l' histamine et la polarisation des cellules dendritiques. Plus particulièrement, ils ont démontré que l'histamine favorisait la polarisation des cellules dendritiques en cellules dendritiques de type CD2. Cela est d'autant plus surprenant du fait que l'homme du métier ne peut distinguer les molécules favorisant une réponse Th2 agissant directement sur les cellules lymphocytes T naïfs ou agissant par l'intermédiaire des cellules dendritiques. Dans la suite de la présente description, l'expression « histamine » sera utilisée pour nommer l'histamine, mais aussi les sels d' histamine tels que le dihydrochlorure d' histamine, 1 'histamine phosphate ou d'autres sels, esters ou précurseurs d'histamine et les agonistes des récepteurs (Hl, H2, H3) de l'histamine. Le HTMT, l'Amthamine ou le Dimaprit, tout comme d'autres analogues ou agonistes des récepteurs de 1*histamine décrits dans le brevet US 5,728,378 sont aussi compris dans le terme "histamine".
La présente invention concerne ainsi l'utilisation d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de l'histamine pour induire la polarisation de cellules dendritiques, et plus particulièrement pour polariser les cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2.
La présente invention concerne plus particulièrement l'utilisation d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de 1' histamine pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la polarisation des cellules dendritiques, préférentiellement en cellules dendritiques de type 2 (DC2) .
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, 1' histamine et/ou les agonistes des récepteurs de l'histamine selon l'invention peuvent servir à favoriser la polarisation des cellules dendritiques in vitro, les cellules matures polarisées pouvant ensuite être réinjectées in vivo.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention ce médicament peut servir à favoriser la polarisation des cellules dendritiques in vitro, après mise en contact avec un agent biologique. Ainsi, l'invention concerne l'utilisation selon l'invention d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l' histamine et en outre d'au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament. Ce dernier pourra par exemple augmenter la réponse immunologique vis-à-vis de cet agent biologique.
Cet agent biologique peut être choisi parmi les acides nucléiques, les protéines, les lipides, les lipopeptides ou les polysaccharides .
Il peut être plus particulièrement choisi parmi les antigènes vaccinants et/ou les antigènes de bactéries, de virus, de levures, de parasites, de champignons. Plus préférentiellement, l'agent biologique est un antigène tumoral. Au sens de la présente invention, un antigène tumoral est défini comme une protéine ou un peptide tumoral, et notamment comme un épitope, notamment un épitope CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe I et présentés aux lymphocytes T CD8+) ou comme la séquence nucléique codant pour de tels protéines, peptides ou épitopes. On peut citer à titre non limitatif les antigènes tumoraux suivants : MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, GD2, carcinoembryonic antigen (CEA) , TAG-72, ovarian-associated antigens OV-TL3 et MOV18, TUAN, alpha-feto protein (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA- 19-9, rénal tumor-associated antigen G250, EGP-40 (ou EpCAM) , S100 (malignant melanoma-associated antigen) , p53, prostate tumor-associated antigens (e.g., PSA and PSMA) et p21ras.
L'agent biologique peut encore être choisi parmi un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues . Au sens de la présente invention on entend par cellules tumorales autologues, des cellules de tumeurs appartenant au sujet qui va recevoir les compositions selon l'invention. Par cellules tumorales hétérologues, il faut comprendre des cellules issues de tumeurs provenant d'un individu différent de celui à qui la composition selon l'invention est destinée. L'utilisation de cellules hétérologues permet d'obtenir des compositions pharmaceutiques permettant notamment de traiter des patients atteints de cancer chez qui un prélèvement de cellules tumorales n'est pas possible. L'utilisation de cellules hétérologues permet aussi d'obtenir des compositions selon l'invention standardisées comprenant des antigènes retrouvés dans de nombreux types de cancer et ainsi utilisables chez une majorité de patients. Les cellules tumorales peuvent être obtenues suite à un prélèvement de tissus cancéreux, par exemple suite à une biopsie ou résection chirurgicale. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées telles qu'elles ou être mises en culture avant d'être lysées. Un lysat cellulaire peut être défini au sens de la présente invention comme un mélange d' antigènes intracellulaires et/ou membranaires, préférentiellement intra et membranaires. Ledit lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues selon l'invention peut-être obtenu par une lyse mécanique, chimique ou enzymatique de cellules tumorales. Pour lyser les cellules de façon mécanique on peut notamment citer les techniques connues de l'homme de métier, à savoir notamment la sonication, l'ultrasonication ou la congélation/décongélation. On préfère tout particulièrement la congélation/décongélation, et tout particulièrement l'utilisation de plusieurs cycles de congélation/décongélation. On peut aussi lyser les cellules en utilisant des composés chimiques ou des enzymes, comme par exemple un tampon de lyse à digitonine, du triton X-100 ou du Nonidet P40. Toute méthode permettant de rompre la membrane cellulaire des cellules de tumeurs pourra être utilisée afin d'obtenir un lysat.
Les cellules dendritiques sont ainsi modifiées en utilisant ces antigènes ou lysats cellulaires de sorte qu'elles expriment des antigènes tumoraux. Ainsi, ledit médicament pourra être injecté en même temps que les cellules dendritiques ou de façon préférée ledit médicament pourra être mis en oeuvre in vitro, afin de favoriser la polarisation des cellules dendritiques avant de les réinjecter aux patients.
Ainsi, grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques en présence d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de 1' histamine pourront être utilisées pour générer des réponses CTL anticancéreuses (Nestlé F.O. et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332) . Cette approche, dénommée "ex vivo" consiste donc à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) en présence d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de l'histamine et à réimplanter ces cellules chez le patient. Une étape de lavage des cellules dendritiques de manière à supprimer l' histamine et/ou les agonistes des récepteurs de 1 'histamine du milieu contenant les cellules dendritiques pourra être effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient.
Une autre approche selon l'invention consiste à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l'antigène d'intérêt et notamment avec un gène codant pour un antigènes de bactérie, de virus, de levure, de parasite, de champignon, ou pour un antigène tumoral, tels que ceux décrits ci-dessus, et/ou avec un gène codant pour une cytokine ou un facteur de croissance, tels que ceux décrits ci- dessous, et de mettre les cellules dendritiques, avant et/ou pendant et/ou après la transfection, en présence d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de 1 'histamine et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87). Une étape de lavage des cellules dendritiques de manière à supprimer l' histamine et/ou les agonistes des récepteurs de l'histamine du milieu contenant les cellules dendritiques pourra être effectuée avant de réimplanter ces cellules chez le patient. De telles approches ont été utilisées avec succès chez la souris et chez l'homme (Hsu F.J. et al., 1996, Nat. Med., 2, 52-58).
Le médicament selon l'invention peut comprendre, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, en outre un facteur de maturation des cellules dendritiques . Ce dernier pourra notamment être choisi parmi les LPS, le TNFα, et tout composés bactériens ou viraux induisant la maturation des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des LPS (lipopolysaccharides) , des OmpA, des oligonucléotides ou du monophosphoril A. On pourra notamment utilisé ce facteur de maturation préalablement à 1 'histamine, de manière à maturer les cellules dendritiques immatures. On pourra également, de façon préféré, utiliser simultanément l'histamine et le facteur de maturation pour maturer et polariser les cellules dendritiques. Le médicament selon l'invention peut aussi comprendre en outre une cytokine ou un facteur de croissance, notamment l'interféron alpha ou gamma, le GM-CSF, l'IL-2, l'IL-12, l'IL-4, l'IL-6 et IL-18, une HSP (Heat Shock Protein) telle que par exemple l'hsp70, l'hsp90, l'hsp96, qui permet de potentialiser la réponse immunitaire; et/ou des fibroblastes modifiés génétiquement de façon à relarguer une cytokine ou un facteur de croissance. On peut citer les fibroblastes exprimant du GM-CSF commercialisés par la société Immune Response Corporation. L' histamine et/ou les agonistes des récepteurs de l'histamine avec au moins un agent biologique associé au TNF alpha peut être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné à augmenter la prolifération des lymphocytes T.
Le médicament selon l'invention peut comprendre en outre un adjuvant permettant d'augmenter la réponse immunitaire, notamment choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, les CpG, Leif, la CT (toxine cholérique) ou la LT (LT pour « Heat labile enterotoxin » entérotoxine labile à la chaleur) , tout comme les versions détoxifiées de la CT ou la LT, ou des protéines membranaires bactériennes telles que les OMPC de Neisseria meningitidis (Vella et al . , Infect. Immun. 60, 1992, 4977-4983), TraT d' Escherichia coli (Croft et al . , J. Immunol. 146, 1991, 793-798) ou PorB de Neisseria meningitidis (Fusco et al . , J. Infect. Dis. 175, 1997, 364-372), et préférentiellement une OmpA d'une bactérie du genre Klebsiella, protéine majeure de la membrane externe baptisée P40, présentant une activité adjuvante pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (WO 95/27787 et WO 96/14415 ; Haeuw et al . , Eur. J. Biochem. 255 ,1998, 446-454 ; Plotnicky-Gilquin et al . , J. Virol. 73, 1999, 5637-5645).
Le médicament selon l'invention peut encore comprendre un milieu pharmaceutiquement acceptable. Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
Le médicament selon l'invention peut en outre être véhiculé sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité; ainsi, il peut être véhiculé sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules. Le médicament ou l'association d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de l'histamine - agent biologique pourra aussi se présenter sous une forme facilement administrable telle qu'une pommade, une lotion, une solution ou encore sous forme d'une composition adhésive : emplâtre ou « patch ».
Le médicament selon l'invention pourra être utilisé notamment pour le traitement : - des infections microbiennes, en particulier les infections de type chronique associées au développement d'une réponse immune spécifique inefficace (virus : par exemple le virus de 1 ' immunodéficience humaine (VIH) , les virus hépatiques, en particulier les virus hépatiques A, B, C et D et le parainfluenza virus, bactéries, parasites et levures) ,
- des cancers, en particulier chez les sujets porteurs du VIH et/ou atteints de myélomes, lymphomes, leucémies, mélanomes, carcinomes, du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, de la remise, par exemple .
Comme décrit ci dessus, l'invention concerne particulièrement l'immunothérapie cellulaire utilisant des vaccins anti-cancéreux et anti-infectieux en particulier, en générant in vitro des cellules dendritiques autologues polarisées, en y introduisant un antigène tumoral et en les réinjectant après une étape de lavage facultative. L'exposition des cellules dendritiques in vitro à l' histamine et/ou aux agonistes des récepteurs de l'histamine et facultativement à un facteur de maturation, permettra d'augmenter la polarisation des cellules dendritiques et donc d'augmenter l'efficacité du vaccin.
Aussi, la présente invention concerne particulièrement l'utilisation selon l'invention d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine pour la préparation d'un médicament pour augmenter la réponse immunologique vis-à-vis d'un agent biologique tel que défini ci dessus. Ce médicament peut être un vaccin pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'origine virale -comme notamment le VIH, les virus hépatiques et le parainfluenza virus-, bactérienne, fongique, ou provoquées par une levure ou un parasite.
La présente invention concerne encore l'utilisation selon l'invention d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de l' histamine avec au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers et particulièrement des cancers parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, et pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers cutanés choisi parmi les kératinomes et les carcinomes.
Comme décrit ci dessus le traitement de ces cancers peut aussi être envisagé en injectant des cellules dendritiques autologues, et notamment des cellules dendritiques autologues qui ont été modifiées afin d'exprimer des antigènes tumoraux. La polarisation des cellules dendritiques sera assurée par 1' histamine et/ou les agonistes des récepteurs de l' histamine. Si l'on utilise des cellules dendritiques immatures, on pourra utiliser en outre un facteur de maturation.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de l'histamine pour la préparation d' une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre des pathologies associées à une réponse Thl excessive.
Comme exemples de telles pathologies, on peut particulièrement citer la thyroïdite d'Hashimoto, la sclérose en plaques, le diabète de type I, le rejet de greffe, la maladie de Crohn, l'arthrite rhumatoïde, la sarcoïdose et les maladies auto-immunes. Certaines immunothérapies à base de DC2 sont plus particulièrement envisagées dans l'article de Yong-Jun et al, Blood, 15 avril 2000, volume 95, number 8, 2482-2483.
L'invention concerne encore l'utilisation d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de l'histamine pour induire in vitro la polarisation de cellules dendritiques, et plus particulièrement pour polariser les cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2.
Dans un mode de réalisation de l'invention particulièrement préféré, on utilise en outre de l' histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de 1*histamine un facteur de maturation, pour induire in vitro la polarisation de cellules dendritiques, et plus particulièrement pour polariser les cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2. L'invention a encore pour objet un dispositif pour la polarisation des cellules dendritiques, tel que par exemple un kit, comprenant au moins de l' histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l' histamine. Dans un mode de réalisation de l'invention particulièrement préféré, le dispositif pour la polarisation des cellules dendritiques, tel que par exemple un kit, comprend en outre un facteur de maturation. Ce kit pourra être adapté pour la polarisation des cellules dendritiques in vitro et pourra être utilisé par exemple dans les laboratoires de recherche. Ce kit peut contenir en outre de l' histamine et/ou des agonistes des récepteurs de 1'histamine un facteur de maturation, des cellules dendritiques immatures et/ou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines. Il pourra ainsi comprendre par exemple de l' histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l'histamine, un facteur de maturation, différents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles tels que par exemple des anticorps, et une notice explicative pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention de maturation des cellules dendritiques. Un kit selon l'invention pourra aussi être adapté à la mise en oeuvre de la méthode thérapeutique ci-dessus mentionnée. Ce kit peut contenir en outre de l'histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l'histamine, un facteur de maturation, des cellules dendritiques immatures et/ou les moyens nécessaires à isoler des cellules dendritiques immatures, tels que par exemple des moyens de purification de cellules mononucléaires sanguines. Il pourra ainsi comprendre par exemple de l' histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l' histamine, un facteur de maturation, différents milieux de culture, des solutions de lavage, des plaques de culture, des réactifs, des contrôles, et une notice explicative pour la mise en œuvre de la méthode thérapeutique ci-dessus mentionnée. Le cas échéant il pourra encore contenir des antigènes hétérologues ou des moyens pour obtenir un lysat de cellules autologues. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Ces exemples démontrent l'action de l'histamine sur les cellules dendritiques: l' histamine induit la maturation des cellules dendritiques humaines immatures et leur confère de puissantes propriétés stimulatrices et présentatrice d'antigène.
Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes :
Figure 1 : L'histamine prévient la production d' IL12 par les CD matures .
A&B : la maturation des CD est induite par 10 ng/ml de LPS, en l'absence ou présence de doses croissantes d'IFNg et/ou histamine. Après 48 heures les CD matures sont stimulées avec du CD40 ligand soluble (A) ou LPS + IFNg (B) . La concentration d' IL12 p70 dans les surnageants a été mesurée par ELISA après 24 heures. Les résultats sont représentatifs d'une expérience parmi 3. C : des CD immatures ont été incubées du LPS (10 ng/ml) + de l'IFNg (100 ng/ml) et traitées ou non avec de l' histamine (10~5 M) , des antagonistes des récepteurs Hl, H2 ou H3 (Mepyramine, cimetidine, et thioperamide, respectivement) (tous à 5x10"5 M) 1 heure avant l'addition d'histamine (10~5 M), ou ont été traitées avec des agonistes des récepteurs Hl et H2 (HTMT et Amthamine, respectivement) (10~5 M) . Après 2 jours les CD matures ont été restimulés par du LPS + de l'IFNg et la production d' IL12 p70 a été dosée. Les résultats sont exprimés en pg/ml comme la moyenne ± SD de quatre expériences .
Figure 2 : l'histamine est un facteur de polarisation des CD vers les CD2.
Les lymphocytes T naïfs (CD4+ CD45Ra+) ont été cultivées pendant
5 jours avec les CD allogéniques matures. La maturation de ces
CD a été induite par un traitement de 2 jours avec du LPS (10 ng/ml), LPS (10 ng/ml) + INFg (100 ng/ml), LPS (10 ng/ml) + histamine (10~5 M), ou LPS (10 ng/ml) + INFg (100 ng/ml) + histamine (10~5 M). Après une expansion induite par l'IL2, les lymphocytes T ont été stimulées avec PMA + ionomycine pendant 5 heures et la production d' IL4 et d' IFNg a été évaluée par FACS, après marquage intracellulaire. Le pourcentage de cellules positives est indiqué dans chaque cadran. Les données sont représentatives parmi 3.
Exemple 1
L'histamine diminue la capacité des cellules dendritiques en cours de maturation à produire de l' IL12 après restimulation et ceci même en présence d'IFNγ.
1/ Matériels et Méthodes
Les cellules dendritiques humaines sont générées à partir de monocytes isolés du sang périphérique. Le sang est prélevé par leucophérèse en présence d'anticoagulant comme par exemple l'héparinate de lithium. Les cellules mononucléées (CMN) sont isolées de sujets sains par centrifugation sur un gradient de Ficoll-Hypaque (densité=l, 077) (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède) . Brièvement, les cellules du sang sont centrifugées à 1500 rpm pendant 30 minutes à température ambiante. Les CMN, localisées à l'interface Ficoll-plasma, sont récupérées et lavées deux fois en présence de milieu RPMI 1640
(Life technologies, Cergy Pontoise, France) . Les monocytes sont purifiés par sélection positive en utilisant un séparateur magnétique de cellules (MACS™; Miltenyi Biotec, Bergisch
Gladbach, Allemagne) en accord avec les instructions du fabriquant. Brièvement, les CMN sont incubées pendant 20 minutes à 4°C avec des billes magnétiques sur lesquelles sont fixées un anticorps monoclonal anti-CD14 humain. Après lavage, la suspension cellulaire plus billes est déposée sur une colonne et soumise à un champ magnétique. Après trois lavages, la colonne n' est plus soumise au champ magnétique et les monocytes sont collectés par gravitation. La pureté des monocytes est évaluée par cytofluorométrie (cytofluoromètre FACScan ; Becton Dickinson, Erembodegem, Belgique) sur la base des paramètres taille-granulosité des cellules. La pureté est supérieure à 98%. Les monocytes sont ensuite mis en culture à la concentration de 106 cellules/ml dans le milieu suivant (dénommé par la suite milieu de culture complet) : milieu RPMI 1640 supplémenté de 10% de sérum de veau foetal (chauffage à 56°C pendant 30 minutes) , 2 mM de L-glutamine, 50 U/ml de pénicilline et 50 ug/ml de streptomycine (Life technologies) dans des plaques de culture 6 puits (Nunc, Roskilde, Danemark) à raison de 5 ml de milieu par puits. Les cellules sont activées avec 20 ng/ml d' IL-4 humaine recombinante et 20 ng/ml de GM-CSF humaine recombinante (R&D Systems, Abingdon, Royaume Uni) . Après 5 à 7 jours de culture (37°C, 5% C02 en atmosphère humide), le phénotype des cellules est défini par cytofluorométrie. Brièvement, un aliquot de la suspension cellulaire est prélevé. Les cellules sont lavées dans du tampon FACS (tampon phosphate 10 mM pH 7,4 contenant 1 % de sérum albumine bovine et 0,01% d'azide de sodium) puis réparties dans des puits d'une plaque de culture 96 puits à fond conique (Nunc) à raison de 2xl04 cellules dans un volume de 50 μl de tampon FACS. Dans chaque puit est ajouté soit un anticorps anti- CDla humain marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson) soit un anticorps anti-CD83 humain non marqué révélé par un anticorps anti-immunoglobuline de souris marqué à la fluorescéine (Becton Dickinson). Après 20 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées trois fois avec 200 μl de tampon FACS puis sont remises en suspension dans 200 μl de ce même tampon. L'analyse de l'expression de CDla versus CD83 est évaluée par FACS. Seules les cellules dendritiques immatures caractérisées par une expression de la molécules CDla (intensité moyenne de fluorescence (IMF)>100) et l'absence d'expression de la molécule CD83 ont été utilisées. Après 7 jours, les CD immatures ont été stimulées avec du LPS (de Escherichia coli isotype 0111 : B4, Sigma, Saint Louis, MO) seul, ou en combinaison avec de l'IFNg (R&D Systems, Abingdon, UK) et ou histamine (Sigma) . Après 2 jours, les CD matures ont été lavées et recultivées à 105 cellules/200 μl/puits dans des plaques de cultures 96 puits et ont été ou non stimulées avec 5 μg/ml de CD40 ligand soluble recombinant (Peprotech, Rocky Hill, NJ) ou avec du LPS (10 ng/ml) + IFNg (100 ng/ml). Après 24 heures, l'IL12 a été dosée dans les surnageants par ELISA (R&D Systems ; sensibilité 0.5 pg/ml) les résultats sont exprimés en pg/ml comme la moyenne ± SD de quatre expériences
2/ Résultats
La maturation des cellules dendritiques est induite par une incubation de 2 jours avec du LPS en présence ou en l'absence d'IFNg et ou d'histamine.
Comme décrit précédemment (Vieira et al JI 2000) les CD maturées avec le LPS produisent de faibles taux d' IL12 après stimulation avec du CD40 ligand ou avec LPS +IFNg. Comme décrit précédemment (Vieira et al JI 2000) l'ajout d'IFNg génère des CD matures produisant de forts taux d' IL12 après restimulation.
Nos résultats montrent que quelque soit la concentration d'IFNg utilisée, l' histamine prévient la capacité des CD restimulées (par CD40 ligand ou par IFNg + LPS) à produire de l'IL12.
Exemple 2
L'effet inhibiteur de l'histamine sur la production d' IL12 par les CD est médiée par les récepteurs Hl et H2.
1/ Matériel et Méthodes
Les CD ont été générées et stimulées comme précédemment avec la modification suivante : - dans certaines expériences les CD ont été préincubées pendant 1 heure avec des antagonistes des récepteurs Hl, H2 et H3 (mepyramine, cimetidine et thioperamide, respectivement) utilisés à 10"5 M avant ajout de l' histamine - dans d' autres expériences les CD ont été incubées non avec de l' histamine ou des agonistes des récepteurs Hl et H2 (HTMT dimaléate et amthamine dihydrobromide, respectivement) (les 2 commercialisés par Biomol, Plymouth Meeting, PA) .
2/ Résultats
Les résultats montrent que l'effet inhibiteur de l' histamine sur la production d' IL12 est médiée par les récepteurs Hl et H2 mais pas H3. En effet les antagonistes Hl et H2 inhibent l'effet de l' histamine : de plus ces résultats sont confirmés par le fait que les agonistes des récepteurs Hl et H2 miment l'effet inhibiteur de l' histamine sur la production d'IL12.
Exemple 3
L'histamine polarise les CD en cours de maturation vers les CD2 et ceci même en présence d'IFNγ.
1/ Matériel et Méthodes Les CD ont été générées et stimulées comme précédemment.
Les lymphocytes T ont été préparés et stimulés de la façon suivante. Après rosetting et déplétion des lymphocytes T CD8+, les lymphocytes T naifs CD4+ CD45RA+ ont été purifiés par MACS (Miltenyi biotec, Bergisch Gladbach, Germany) par sélection positive.
Les lymphocytes T naifs purifiés (5xl04) ont été cultivées des CD allogéniques irradiées (2xl04) dont la maturation a été induite par du LPS (10 ng/ml), LPS (10 ng/ml) plus IFNg (100 ng/ml), LPS (10 ng/ml) + histamine (10~5 M) ou LPS (10 ng/ml) + IFNg (100 ng/ml) + histamine (10~5 M) . Après 5 jours, 50 U/ml d' IL2 humaine recombinante (R&D Systems) ont été ajoutés et les cultures ont été maintenues pendant 7 jours. Puis les lymphocytes T ont été lavés et restimulés avec 10 ng/ml de PMA (Sigma) + 1 μg/ml d' ionomycine (Calbiochem, San Diego, CA) pendant 5 heures.
De la brefeldine A (10 μg/ml, Sigma) a été ajoutée pendant les 2 dernières heures de culture.
Les cellules ont ensuite été fixées, permabilisées et marquées avec un mAb anti-IFNg couplé FITC (Pharmingen, San Diego, CA) et avec un mAb anti-IL4 couplé PE (BD biosciences, Franklin Lakes, NJ) , puis analysées avec un FACScan (Beckton Dickinson)
2/ Résultats
Comme attendu (Vieira et al JI 2000) , les lymphocytes T naïfs stimulées avec des CD maturées en présence de LPS se différencient en ThO, caractérisés un faible pourcentage de cellules produisant de l'IL4 et de l'IFNg.
Les résultats montrent que l'addition d'histamine durant la maturation des CD génère des CD2 qui favorisent le développement de lymphocytes de type Th2, caractérisés par une augmentation du pourcentage de cellules productrices d' IL4 et une diminution du pourcentage de cellules productrices d'IFNg.
Comme attendu (Vieira et al JI 2000) , les lymphocytes T stimulées par les CD maturées en présence de LPS et d' IFNg se différencient en Thl, caractérisés par un important pourcentage de cellules produisant de l'IFNg et un très faible pourcentage de cellules produisant de l'IL4.
Les résultats montrent que l'ajout d'histamine en plus du LPS et de l'IFNg à des CD immatures conduit à la génération de CD matures de type CD2 : en effet, après addition d'histamine, on observe une diminution du pourcentage de cellules produisant de l'IFNg.
Ainsi l'ajout d'histamine au cours de la maturation des CD conduit à des CD2 qui induisent la différenciation de lymphocytes T naïfs en lymphocytes effecteurs de type Th2. Ceci est observé même en présence d' IFNg, un puissant facteur de polarisation Thl.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de 1 'histamine pour la fabrication d'un médicament destiné à induire la polarisation de cellules dendritiques, et plus particulièrement à polariser les cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la polarisation des cellules dendritiques est effectuée in vitro.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la polarisation des cellules dendritiques est effectuée in vitro, les cellules matures polarisées étant ensuite réinjectées in vivo.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3 et en outre d'au moins un agent biologique pour la fabrication d'un médicament .
5. Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'agent biologique est choisi parmi les antigènes de bactérie, de virus, de levure, de parasite, de champignon, les antigènes tumoraux, et les lysats de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que les cellules dendritiques sont transfectées ex vivo avec un gène codant pour un antigène et/ou une cytokine ou un facteur de croissance.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le médicament contient en outre un facteur de maturation des cellules dendritiques, préférentiellement choisi parmi les LPS et le TNFα.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le médicament contient en outre une cytokine ou un facteur de croissance, préférentiellement l'interféron alpha ou gamma, le GM-CSF, l'IL-2, l'IL-4, l'IL-6 et IL-18 ou une HSP.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des maladies infectieuses d'origine virale, bactérienne, fongique ou provoquée par une levure, ou un parasite.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 pour la fabrication d'un médicament pour lutter contre un virus choisi parmi le VIH, les virus hépatiques et le parainfluenza virus.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention des cancers.
12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 pour la fabrication d'un médicament pour le traitement ou la prévention d'un cancer parmi les myélomes, lymphomes, leucémies, carcinomes du rein, du cerveau, de la prostate, du rectum, du pancréas, des ovaires, du poumon, les kératinomes et les carcinomes .
13. Utilisation d'histamine et/ou d' agonistes des récepteurs de l' histamine pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre des pathologies associées à une réponse Thl excessive.
14. Utilisation d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l' histamine pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre la thyroïdite d'Hashimoto, la sclérose en plaques, le diabète de type I, le rejet de greffe, la maladie de Crohn, l'arthrite rhumatoïde, la sarcoïdose et les maladies auto-immunes .
15. Utilisation d'histamine et/ou d'agonistes des récepteurs de l'histamine pour induire in vitro la polarisation de cellules dendritiques, et plus particulièrement pour polariser les cellules dendritiques en cellules dendritiques de type 2.
16. Utilisation selon la revendication 15 et en outre d'un facteur de maturation des cellules dendritiques, préferentiellement choisi parmi les LPS et le TNFα.
17. Kit pour la polarisation des cellules dendritiques caractérisé en ce qu'il contient au moins de l'histamine et/ou des agonistes des récepteurs de l'histamine.
18. Kit selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il contient en outre un facteur de maturation des cellules dendritiques, préferentiellement choisi parmi les LPS et le TNFα.
19. Kit selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce qu'il contient en outre des antigènes hétérologues ou des moyens pour obtenir un lysat de cellules autologues.
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