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WO2002076921A1 - Derives de l'acide gallique et utilisation pour l'exploration de la coagulation endogene - Google Patents

Derives de l'acide gallique et utilisation pour l'exploration de la coagulation endogene Download PDF

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WO2002076921A1
WO2002076921A1 PCT/FR2002/001020 FR0201020W WO02076921A1 WO 2002076921 A1 WO2002076921 A1 WO 2002076921A1 FR 0201020 W FR0201020 W FR 0201020W WO 02076921 A1 WO02076921 A1 WO 02076921A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
equal
formula
cation
coagulation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/001020
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Paul Roisin
Stéphane Steurs
Gérard Quentin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Diagnostica Stago SAS
Original Assignee
Diagnostica Stago SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to BR0204494-3A priority Critical patent/BR0204494A/pt
Priority to CA002407779A priority patent/CA2407779A1/fr
Priority to HK03105405.5A priority patent/HK1054737A1/zh
Priority to JP2002576184A priority patent/JP4563648B2/ja
Priority to MXPA02011565A priority patent/MXPA02011565A/es
Priority to HU0302136A priority patent/HUP0302136A3/hu
Application filed by Diagnostica Stago SAS filed Critical Diagnostica Stago SAS
Priority to EP02722368A priority patent/EP1280758A1/fr
Priority to PL02357449A priority patent/PL357449A1/xx
Publication of WO2002076921A1 publication Critical patent/WO2002076921A1/fr
Priority to US10/302,649 priority patent/US7208266B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/42—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/44—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C235/50—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/70—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups and doubly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/82—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups and doubly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
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    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/74—Esters of carboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C07C69/757—Esters of carboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/76—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/84—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of monocyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of a six-membered aromatic ring
    • C07C69/88—Esters of carboxylic acids having a carboxyl group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring of monocyclic hydroxy carboxylic acids, the hydroxy groups and the carboxyl groups of which are bound to carbon atoms of a six-membered aromatic ring with esterified carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines

Definitions

  • the present application relates to compounds which activate endogenous coagulation and to their use for its exploration.
  • Coagulation initiated by the "endogenous route” results in vitro from the exposure of blood to contact with a negatively charged surface. In vivo, it secondarily enhances the growth of the fibrin clot.
  • endogenous coagulation The exploration of coagulation initiated by the “endogenous pathway” (hereinafter referred to as “endogenous coagulation”) is used in the context of tests for in vitro detection, coagulation abnormalities or for monitoring of patients treated with substances with anticoagulant activity.
  • the endogenous coagulation pathway is initiated in vitro by the activation of factor XII (F.XII) in contact with negative charges.
  • factor XII factor XII
  • F.XII pre-Kalikrein
  • KHPM high molecular weight kininogens
  • factor IX F. IX
  • F.VIIIc cofactor, anti-hemophilic factor A
  • PF3 platelet phospholipids
  • Ca ++ calcium
  • FX factor II
  • F. II factor II
  • PF3 platelet factor
  • FV cofactor, factor V
  • the exploration of coagulation is practiced to look for in a patient, a biological anomaly which can participate in a hemorrhagic syndrome or to follow the consequences of a pathology at the level of coagulation or also to ensure a follow-up of medical treatment likely to directly or indirectly modify coagulation.
  • APTT Activity Partial Thromboplastin Time
  • the APTT test is used in particular for the detection of the most frequent constitutional bleeding disorders, namely Willebrand's disease and hemophilia A and B. This test is also frequently used for the control of heparin therapy.
  • an APTT test consists in adding to the plasma sample tested, an activator of factor XII negatively charged (contact activator) and, a substitute for phospholipids of the platelet membrane as well as calcium ions.
  • the measured coagulation time corresponds to the period between the addition of the contact activator, the platelet substitute, calcium, and the appearance of a coagulum. This is the time required to transform 1% of the plasma prothrombin into thrombin. The fibrin training which then takes place takes place over a short period of time. Calcium is the trigger for the system.
  • activators suitable for carrying out APTT tests include, for example, solid activators such as silica, glass or kaolin, or liquid activators, such as ellagic acid and its derivatives or sulfatides.
  • Liquid activators are an alternative to solid activators.
  • Sulfatides have also been proposed as activating compounds for intrinsic coagulation.
  • their level of activity has not always been considered sufficient, and these compounds also have the disadvantage of being relatively expensive compared to the other available activators.
  • the invention is concerned with such alternative contact activators capable of participating in the endogenous coagulation pathway and in the production of systems and tests making it possible to explore this endogenous coagulation pathway and to detect abnormalities therein.
  • the invention also relates to the use of these activators in an endogenous coagulation exploration test, of the APTT type.
  • the endogenous coagulation activator is associated with compounds which make it possible to modulate the response sensitivity of a reagent used in APTT, with respect to certain coagulation time anomalies encountered in pathologies.
  • the inventors have been interested, in the context of the search for substances capable of activating endogenous coagulation, in compounds having advantageous solubility properties compared to the compounds used until now as activators of coagulation in APTT tests and in particular have sought, from gallic acid, derivatives capable of activating endogenous coagulation.
  • patent application DE 2750560 A1 describes esters obtained by esterification of gallic acid with ethylene glycol or various polyethylene glycols. These esters are used as protective material for glass fibers incorporated into a cement-based composite material.
  • the reagents in question are contact activators of the endogenous coagulation pathway, capable of having a procoagulant activity, that is to say of activating factor XII into activated factor Xlla, after incubation of a plasma sample, 37 ° C in the presence of PF3 and calcium.
  • these compounds are soluble or capable of being made soluble if necessary after modification.
  • the subject of the invention is therefore a compound of formula
  • n being an integer between 1 and
  • AA being a natural or exotic amino acid and r being an integer between 1 and 10.
  • the invention relates, according to a particular embodiment, those which have the advantage of being able to be put in solution and in particular in aqueous solution. Preferably, they are completely soluble.
  • n is preferably equal to or greater than 1 and less than or equal to 170.
  • n is between 1 and 50, for example between 1 and 30, advantageously between 1 and 20.
  • n is equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10.
  • a first family of preferred compounds according to the invention is defined by the following formula:
  • R represents or
  • n being an integer between 1 and
  • AA being a natural or exotic amino acid and r being an integer between 1 and 10.
  • R represents
  • R represents with n being an integer between 1 and 170 and preferably between 1 and 10.
  • This preferred form of the compound (II) according to the invention corresponds to the oxidized form of the polyethylene glycol gallates.
  • This oxidized form is the quinone form resulting from the oxidation in an alkaline medium of one of the -OHs of the aromatic nucleus present in formula (II).
  • the compounds of the invention can also be found to constitute a family corresponding to the following formula corresponding to an ionized form of formula (III), associated with mono or bivalent cations defined within the framework of the invention:
  • n being an integer between 1 and 170 and
  • This second particular family of compounds according to the invention corresponding to formula (III) comprises, in addition to the quinone in position 4, the 2 -OH functions (in positions 3 and 5) in ionized form (sodium alcoholate) formed when the pH middle is greater than pKa.
  • the invention relates to the oxidized mono- or polyethylene glycol gallate, in its basic form, said compound being associated with cations, in an alkaline medium.
  • This basic form of oxidized ethylene glycol gallate is soluble in water.
  • the pH of the composition obtained must be lowered to a physiologically acceptable value for its use.
  • the shift in balance to sodium quinone (according to formula III) at physiological pH can be accelerated and stabilized by the addition of cations giving it immediate coagulant properties.
  • the invention advantageously relates to the compounds corresponding to the following definition:
  • - R is - CH 2 - CH 2 - OH.
  • M q + being a cation
  • q being equal to 1 or 2
  • These compounds are respectively the acid form of oxidized ethylene glycol gallate and the basic or salified form of oxidized ethylene glycol gallate.
  • the basic salted quinone form is characterized by a yellow color detectable at a wavelength of 355 nm and is particularly advantageous because of its solubility in aqueous medium.
  • the cation M q + is advantageously a metal cation, in particular Mn 2+ or Cu 2+ or Co 2 + -
  • a non-metallic cation such as a counterion which is provided during the preparation of the compounds of the invention by heating in an alkaline medium.
  • a preparation process is defined in the following pages and the cation M q + is advantageously Na + , K + or NH + .
  • the cation concentration can be defined as a function of the coagulation time which it is desired to observe for a normal control sample.
  • this concentration is between 5 and 15 ⁇ M, preferably around 10 ⁇ M.
  • the invention relates to a family of compounds corresponding to formula (I)
  • - R represents NH-CH 2 -CH 2 -NH 2 with n being an integer between 1 and 170. - "n
  • n is between 1 and 50, for example between 1 and 30, advantageously between 1 and 20.
  • a preferred form of the polyethylene diamine gallate is the quinone form resulting from the oxidation of one of the -OHs of the aromatic ring. It corresponds to the following formula j_
  • n is an integer between 1 and 170; preferably between 1 and 50, for example between 1 and 30, advantageously 1 and 20.
  • n is equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10.
  • the compounds of the invention can also be in the form associated with mono or bivalent cations in particular with metal cations. These compounds correspond to the following formula:
  • n is an integer between 1 and 170.
  • n is between 1 and 50, for example between 1 and 30, advantageously between 1 and 20.
  • n is equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10.
  • the invention relates to a compound characterized in that it corresponds to formula (I)
  • the compounds of the invention are in the quinone form resulting from the oxidation of one of the -OHs of the aromatic ring:
  • a preferred amino acid for the production of the above compounds is serine wherein
  • the compound of the invention advantageously has the following formula:
  • the subject of the invention is also a composition, characterized in that it comprises a mixture of several compounds, in particular a mixture of at least two compounds among those identified previously, whether they are compounds belonging to the same family. or to the same group or, on the contrary, to compounds belonging to families or to groups different from those defined above.
  • composition is characterized in that it comprises at least two different compounds of formula:
  • the invention preferably relates to a composition characterized in that it comprises a mixture of compounds (IV) and (V), constituting respectively the acid and basic forms of the oxidized ethylene glycol gallate (GEGox), of the following formulas:
  • This composition therefore comprises a mixture of the acid and basic forms of oxidized ethylene glycol gallate, corresponding to the products of the keto-enolic equilibrium obtained from ethylene glycol gallate when it is heated in an alkaline medium, or put in the presence of metal cations.
  • the balance between the acid and basic forms of oxidized ethylene glycol gallate can be shifted to one or other of these forms by adjusting the reaction conditions, and in particular by modifying the pH or the concentration of cations. present in the reaction medium.
  • composition thus defined is characterized in that it is a solution and preferably an aqueous solution.
  • the subject of the invention is in particular, within the framework of the preceding definition, a composition in which the basic form corresponding to formula (V) of oxidized ethylene glycol gallate is predominant.
  • This basic, water-soluble form has entirely advantageous properties for constituting a composition which activates endogenous coagulation, in particular for carrying out an in vitro test for the exploration of endogenous coagulation.
  • the composition corresponding to one of the preceding definitions has a physiologically acceptable alkaline pH.
  • This pH is adjusted after oxidation of the GEG, for example in the presence of buffer molecules: MOPS ('acid - (/ V-Morpholino) propanesulfonic) or TRICINE: ( ⁇ / -Tris (hydroxymethyl) methyl-glycine).
  • MOPS buffer molecules
  • TRICINE TRICINE
  • the composition is characterized in that it comprises a mixture of the different forms of gallate, produced by the keto-enolic balance and corresponding to the formula:
  • the composition thus obtained is characterized in that the method further comprises the steps of: - stabilization of the keto-enolic balance obtained by adjusting the pH. - recovery of the compounds of formula (IV) and (V) in solution, at alkaline pH.
  • the oxidized forms of GEG are formed in the presence of sodium hydroxide and in particular, excess sodium hydroxide will be used to shift the keto-enolic balance to the basic form of oxidized ethylene glycol gallate.
  • the heating treatment is carried out at a temperature between 70 and 90 ° C, preferably a temperature of 80 ° C for a period of 24 hours.
  • the pH of the solution is an alkaline pH, and the action of the soda can be stopped by the addition of a buffer which contributes to stabilizing the keto-enolic balance obtained.
  • the pH of the composition according to the invention is between 7.6 and 7.8.
  • the added buffer can for example be a MOPS or TRIS buffer.
  • composition contains the compounds according to the invention in a concentration of between 100 and 1000 ⁇ M.
  • the compounds and compositions thus defined in the context of the invention are capable of activating endogenous coagulation on contact with a plasma sample, in other words are capable of activating factor XII into factor Xlla, after having was brought into contact and incubated with a plasma sample in the presence of PF3 and calcium, at a temperature of approximately 37 ° C.
  • the invention also relates to a reagent system which can be used for the in vitro examination of endogenous coagulation on a blood sample, which system comprises, among its reagents, a compound or composition as defined above.
  • a preferred reagent according to the invention comprises a salt of gallic acid
  • R represents or
  • n an integer between 1 and 170 or
  • n is between 1 and 50, for example between 1 and 30, advantageously between 1 and 20.
  • n is equal to 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10.
  • the determination of the concentrations of the compounds according to the invention takes account of the fact that in the APTT system, the expected coagulation times for plasmas originating from healthy subjects are generally between 28 and 40 seconds.
  • the concentration of the compounds according to the invention and of the other constituents used for the coagulation test can be defined from the coagulation time sought for samples of healthy plasmas.
  • the concentration of the compounds according to the invention can vary from 100 to 1000 ⁇ M.
  • the optimization of the concentrations of the main constituents of the reagent aims to obtain, on a sample library of plasmas from at least 30 healthy subjects, clotting times included in this interval.
  • the optimization of the biochemical environmental parameters of the active principles of the APTT reagent makes it possible, by lengthening the times, to specifically adjust the detection sensitivity of certain pathologies covered by an APTT test.
  • an extension of time compared to the healthy subject control will be sought, of at least 20% in the cases of Lupus Anticoagulant syndromes.
  • time extensions comprised in ratios of 1.5 to 3.0 times the control time will be sought.
  • hemophiliacs type A and B the greatest possible sensitivity is required and we will seek to obtain significant time extensions.
  • the reagent thus formed comprises activated ethylene glycol gallate.
  • the activity results from the keto-enolic balance obtained and from its stabilization at a physiologically acceptable pH.
  • the concentration of gallate, in particular, of ethylene glycol gallate in the composition or the reagent system described is advantageously between 100 and 1000 ⁇ M, preferably 100 ⁇ M.
  • the subject of the invention is also any compound or any composition among those defined above, for constituting a reagent for exploring endogenous coagulation, in particular for carrying out an APTT test, associated with a constituent having a modulation activity on the response sensitivity of the compound or composition of the invention.
  • the modulation of the sensitivity can consist of an attenuation of the lengthening of the coagulation time observed on samples of plasmas from patients affected by a pathology of the Lupus Anticoagulant type or from patients under anticoagulant treatment for example based on unfractionated heparin.
  • this sensitivity modulation can consist in lowering the coagulation time measured on samples of non-pathological plasmas.
  • One such modulator of the sensitivity of a reagent prepared with the compounds or compositions of the invention is a polyamino acid, preferably partially substituted, the substitution affecting the amino groups, which are substituted by succinyl groups (- CO-CH 2 -CH 2 -COOH) or glutaryl (-QC (CH 2 ) 3 CO).
  • the substitution must not affect the spatial conformation and / or the stability of the starting constituent, under conditions such that the substituted polyamino acid could no longer exert its sensitivity modulating effect. For these reasons, a fully substituted polyamino acid would be excluded a priori.
  • the modulator constituent is a substituted polylysine (either D- or L-polylysine or a mixture of these), in particular succinylated and for example it is L-polylysine substituted , advantageously succinylated L-polylysine.
  • the inventors notably used the succinylated L-polylysine available in the catalog of the SIGMA company (2001-2002). Glutarylated L-Polylysine can also be used.
  • succinylated L-polylysine is used, in a molecular weight range ranging from 20,000 to 300,000 Da, preferably from 50,000 to 300,000 Da.
  • the concentration, in the reagent prepared to carry out the APTT test, of the modulating component, and in particular of succinylated L-Polylysine is in the range of 10 to 100 ⁇ g / ml, preferably from 50 to 100 ⁇ g / ml.
  • the substituted polyamino acid, in particular succinylated polylysine can be added at any time during the preparation of the reagent intended for use in an endogenous coagulation exploration test, of the APTT type.
  • the reagent system according to the invention comprises, in addition to the contact activator of the endogenous coagulation pathway, a substitute for the phospholipids of the platelet membrane.
  • This substitute can be cephalin: suspension of phospholipids extracted from mammalian brains.
  • the invention also relates to a reagent system which further comprises, in a form separate from the other reagents, Ca + ions for triggering the activation of factors involved in the endogenous pathway.
  • reagents of the invention and, where appropriate, the other constituents used in the implementation of an APTT test can be combined in the form of a kit.
  • the use of the compounds, compositions or reagents according to the invention for the exploration of coagulation and more particularly of endogenous coagulation can be implemented for measuring the time of a blood sample and in particular a plasma sample.
  • partially activated thromboplastin (APTT) partially activated thromboplastin
  • use is advantageously made of the use of platelet-poor plasma.
  • the usual conditions for carrying out this test are implemented, in particular with regard to the preparation of the samples.
  • the sample of the plasma taken can initially have been treated for example with citrate so as to complex the Ca 2+ ions contained in the sample so that the sample can no longer coagulate.
  • the sample is then incubated with a compound or composition according to the invention as a coagulation activator and phospholipid substitutes. Ca 2+ ions are then added in an amount equivalent to that which has been complexed, to trigger coagulation.
  • the activity of the compounds or compositions according to the invention requires that their pH has a physiologically acceptable value.
  • the compounds, compositions or reagents according to the invention can also be used to determine the coagulation time for whole blood or the plasma coagulation time.
  • the invention therefore allows the use of a compound or a composition as described above, for the preparation of a reagent system for examining the coagulation factors involved in the endogenous pathway.
  • the factors concerned are mainly factors XII, XI, IX, VIII.
  • the invention relates for example to the detection of anomalies linked to von Willebrand disease, to hemophilia A and B or to the detection of anticoagulants. These anomalies lead to a measured APTT time outside of normal values, these usually being between 20 and 40 seconds.
  • the invention therefore also relates to a method for measuring the time of partially activated thromboplastin (APTT) comprising the steps of:
  • the plasma sample consists of a plasma poor in platelets and a coagulation activator is incubated with the plasma for a period of approximately 2 to 5 minutes, at 37 ° C.
  • the membrane phospholipid substitutes are either added at the start of the reaction, or mixed with the activator, or added individually during the reaction.
  • the calcium ions are added, in the form for example of calcium chloride with a concentration of between 20 mM and 25 mM. The time required for fibrin formation is then measured.
  • the time measured indicates, when it is outside the time interval corresponding to a normal coagulation situation (that is to say between 20 and 40 seconds), that one of the parameters of the endogenous coagulation pathway is at an abnormal level, including absent, or that there are anticoagulant compounds in the plasma tested.
  • the invention When the plasma studied comprises a factor from the endogenous coagulation pathway at an abnormal rate, the invention then allows a quantitative analysis of the factor in question, using a system depressed with this factor, and in which all the other parameters are also introduced in excess. In this system, after adding the plasma to be studied, only the factor to be measured is in a limiting quantity.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a compound of the following formula:
  • A represents one or more of the compounds chosen from the following formulas:
  • R represents o
  • n being an integer between 1 and
  • This process is preferably such that the esterification is carried out in the presence of ethylene glycol to form the ethylene glycol gallate, thereby making it possible to recover, at the end of the reactions implemented, the products of equilibrium keto-enolic including the acid and basic forms of oxidized ethylene glycol gallate and, where appropriate, a residual amount of ethylene glycol gallate.
  • the coagulation time is measured with APTT reagents manufactured according to the invention using various cations. Different types of plasmas are tested, normal on the one hand, and representative of pathologies covered by an APTT test on the other:
  • - pool N mixture in equivalent quantities of plasmas from healthy subjects
  • - CCN Coag. Normal Control: Plasma quality control normal level
  • - Heparinized plasmas from patients receiving anticoagulant treatment based on unfractionated heparin in the form of sodium or calcium salts
  • F City plasma of a patient with a f City deficiency (Hemophiliac A).
  • the measurements are carried out on a hemostasis machine (STA - Diagnostica Stago).
  • the coagulation times of different plasmas are determined from APTT reagents obtained from amides or esters of gallic acid.
  • - CCN Coag.
  • Control Normal quality control normal level
  • - CCP Coag.
  • Control Patho pathological level quality control
  • - Heparinized plasmas of patients receiving an anticoagulant treatment based on unfractionated heparin in the form of sodium or calcium salts.
  • the table below shows the activation kinetics of the molecule.
  • the stimulating activity of the ethylene glycol gallate solution is compared to that of a reference reagent: CK-PREST, APTT reagent whose activator is kaolin.
  • the device used to measure coagulation times is a STA Diagnostica Stago hemostasis machine (serial number 307)
  • the plasmas tested are quality control plasmas:
  • CCN Coag Normal Control.
  • CCP Coag Pathological Control lot n ° 980901.
  • APTT reagent produced Ethylene glycol gallate at 500 ⁇ M oxidized at 80 ° C + Tricin 50 mM, pH 7.00 + Cephalin (substitute for platelet phospholipids).
  • HEPES ⁇ / -2-Hydroxyethylpiperazine- / V-2-ethanesulfonic acid - MOPS: acid- (V-Morpholino) propanesulfonic
  • the Tricine buffer and MOPS are preferably used, because with TRIS, a precipitate appears during the activation of the ethylene glycol gallate, and with the HEPES buffer, it is necessary to conduct the heating for a longer period.
  • the performances obtained are recorded on 2 control plasmas (normal and pathological), 1 pool of plasmas from healthy donors and 4 plasmas representative of pathologies detectable in an APTT-type coagulation system;
  • LA plasma of patients with Lupus Anticoagulant syndrome
  • Hep Plasma of patients receiving anticoagulant treatment based on unfractionated heparin in the form of calcium salt. Two plasmas, with 2 heparinemia levels are tested: 0.09 and 0.34 International units per ml.
  • the coagulation times obtained are expressed in seconds.
  • the response sensitivity obtained with each of the reagents manufactured with the 4 buffers is objectified by the calculation of a ratio (R) carried out by dividing the coagulation time obtained on the patient's plasma, by that obtained with the normal pool, or the coagulation time of the pathological control (CCP) by that of the normal control (CCN).
  • R a ratio carried out by dividing the coagulation time obtained on the patient's plasma, by that obtained with the normal pool, or the coagulation time of the pathological control (CCP) by that of the normal control (CCN).
  • 15 factor to be dosed is then in limiting quantity. Its activity becomes quantifiable after comparison with a calibration curve beforehand established under the same conditions. Depending on the size of the deficit, the coagulation time is more or less extended (see example for the City factor).
  • the coagulating activity of an APTT reagent requires the joint action of two active ingredients:
  • a molecule activating the contact phase of the endogenous pathway is ethylene glycol gallate activated by heating to 80 ° C.
  • the optimal activity of the APTT reagent thus formed depends, however, on the concentrations of ethylene glycol and cephalin gailate.
  • the coagulation time is measured with APTT reagents produced according to the invention, and for which the concentration of chloride of
  • the plasmas tested are Quality Control plasmas. Two levels are used: a normal level and a pathological level. The commercial reagent CK Perst is tested in parallel and constitutes the reference.
  • the 10 ⁇ M concentration is used.
  • LA Plasma from patients with Lupus Anticoagulant Syndrome
  • Heparin Plasmas from patients receiving unfractionated heparin-based anticoagulation therapy
  • the molecular weight of succinylated L-polylysine is preferably in the range 50,000 - 300,000 Da and the concentration chosen preferably for this range is 50 ⁇ g / ml of reagent.

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Abstract

L'invention a pour objet des activateurs contact pour la voie endogène de la coagulation et leur utilisation pour explorer les anomalies de la coagulation. Les activateurs de l'invention sont des dérivés de l'acide gallique et de préférence des gallates de polyéthylène glycol.

Description

DERIVES DE L ' ACIDE GALLIQUE ET UTILISATION POUR L ' EXPLORATION DE LA COAGULATION ENDOGENE
La présente demande est relative à des composés activateurs de la coagulation endogène et à leur utilisation pour son exploration.
La coagulation initiée par la « voie endogène » résulte in vitro, de l'exposition du sang au contact d'une surface chargée négativement. In vivo, elle renforce secondairement la croissance du caillot de fibrine.
L'exploration de la coagulation initiée par la « voie endogène » (désignée ci-après par l'expression « coagulation endogène »), est utilisée dans le cadre de tests de détection in vitro, d'anomalies de la coagulation ou pour le suivi de patients traités avec des substances à activité anticoagulante.
La voie endogène de la coagulation est initiée in vitro par l'activation du facteur XII (F.XII) au contact de charges négatives. En présence d'autres facteurs enzymatiques tels que le facteur XI (F.XI), la pré-Kalikréine (PK), les kininogènes de haut poids moléculaire (KHPM), le facteur IX (F. IX) encore appelé facteur anti- hémophilique B et un cofacteur, le facteur anti-hémophilique A (F.VIIIc), une suite d'activations en cascade, de type enzymatique, s'enclenche en présence simultanément de phospholipides plaquettaires (PF3) et de calcium (Ca++). A l'issue de cette série d'activations, le facteur IX activé (F.IXa) amorce à son tour l'activation en cascade d'une seconde série d'enzymes, comprenant le facteur X
(F.X), le facteur II (F. Il) encore appelé prothrombine ; cette activation s'effectue en présence de facteur plaquettaire ( PF3) de calcium (Ca++) et d'un cofacteur, le facteur V (F.V). Cette seconde cascade d'activations aboutit à la formation de thrombine (Fila), qui transforme le fibrinogène en fibrine, constituant majeur du caillot sanguin ou plasmatique. Le schéma simplifié de la voie endogène (in vitro) de la coagulation peut être illustré comme suit :
F.XII
Charges négatives KHPM - PK F.XI
F.IX
FXIIa
Ca++
F.X
F. JXIa FVIIIc
PF3
F.IXa F.II
F.Xa
Ca++ Fibrinogène
F.V
PF3 F.IIa →
Fibrine
De façon générale, l'exploration de la coagulation est pratiquée pour rechercher chez un patient, une anomalie biologique pouvant participer à un syndrome hémorragique ou pour suivre les conséquences d'une pathologie au niveau de la coagulation ou également pour assurer un suivi de traitement médical susceptible de modifier directement ou indirectement la coagulation.
A cet effet, différents tests sont à ce jour proposés pour rechercher, à partir de l'observation qualitative ou quantitative de facteurs intervenant dans la voie endogène la coagulation, différentes anomalies affectant la formation de fibrine résultant de la transformation du fibrinogène par de la thrombine.
Différents tests sont disponibles sur le marché pour explorer la coagulation endogène (encore appelée coagulation intrinsèque) et en particulier on citera la méthode de détermination du temps de thromboplastine partiellement activée
(« Activated Partial Thromboplastine Time » ou APTT) qui permet de détecter sur un échantillon de plasma, des anomalies ou des déficits intervenant au niveau de facteurs impliqués dans la voie endogène, anomalies se traduisant par des temps de coagulation en dehors des limites de la normalité.
Le test APTT est notamment pratiqué pour le dépistage des affections hémorragiques constitutionnelles les plus fréquentes, à savoir la maladie de Willebrand et les hémophilies A et B. Ce test est également fréquemment utilisé pour le contrôle d'une thérapie par l'héparine.
Schématiquement, le principe d'un test APTT consiste à ajouter à l'échantillon de plasma testé, un activateur du facteur XII chargé négativement (activateur contact) et, un substitut des phospholipides de la membrane plaquettaire ainsi que des ions calcium.
Le temps de coagulation mesuré correspond à la période entre l'addition de l'activateur contact, du substitut plaquettaire, du calcium, et l'apparition d'un coagulum. C'est le temps nécessaire pour transformer 1% de la prothrombine du plasma, en thrombine. La fibrinoformation qui se déroule alors, intervient sur une courte période de temps. Le calcium est l'élément déclenchant du système.
Les activateurs convenant pour la réalisation de tests APTT sont relativement nombreux. Ceux-ci comprennent par exemple des activateurs solides tels la silice, le verre ou le kaolin, ou des activateurs liquides, tels l'acide ellagique et ses dérivés ou des sulfatides.
Bien que les réactifs à base d'activateurs solides restent largement utilisés, ceux-ci ne sont pas sans présenter certains inconvénients. Ainsi, les particules de kaolin ou de silice qu'ils contiennent ont tendance à sédimenter durant le test de coagulation. Il est donc nécessaire de fournir une agitation continue, d'où un problème d'instabilité des réactifs et des difficultés pour la réalisation de tests dans des dispositifs automatisés. De plus, des activateurs tels que le kaolin ne permettent pas d'effectuer des mesures optiques de la coagulation.
Les activateurs liquides sont une alternative aux activateurs solides.
Cependant, on sait que les activateurs tels que l'acide ellagique sont susceptibles d'induire des variations dans les résultats des tests. De plus, leur sensibilité est diminuée par rapport à celle des précédents. Aussi, des associations diverses ont été proposées pour améliorer les performances de tels réactifs. Par exemple dans la demande de brevet WO 91/16453 on préconise un réactif à base d'acide ellagique, de phénol et d'un ion métallique, préferentiellement associé à du sulfate de dextran. D'autres activateurs contact en solution ont été décrits notamment dans le brevet EP 0525035 pour lequel l'activateur contact est un composé aromatique hydroxy-substitué choisi entre le gallate de propyle ou du tannin, dans la demande de brevet WO 98/44352 pour laquelle l'activateur contact peut notamment être l'acide ellagique ou dans le brevet américain US 5,550,028 dans lequel l'activateur de contact est la tétrahydroxy-1 ,4-quinone.
Les sulfatides ont également été proposés comme composés activateurs de la coagulation par la voie intrinsèque. Toutefois, leur niveau d'activité n'a pas toujours été jugé suffisant, et ces composés présentent en outre l'inconvénient d'être relativement chers par rapport aux autres activateurs disponibles. II y a donc encore un besoin de disposer de réactifs de coagulation nouveaux ou d'améliorer des réactifs préexistants pour parvenir à des produits qui, tout en restant intéressants au plan économique, possèdent une stabilité et une sensibilité suffisantes, induisent des temps d'activation courts et soient utilisables sur des automates d'analyse pour la réalisation de tests en grandes séries.
L'invention s'intéresse à de tels activateurs contact alternatifs capables de participer à la voie endogène de la coagulation et à la réalisation de systèmes et de tests permettant d'explorer cette voie endogène de la coagulation et d'y détecter des anomalies. L'invention concerne également l'utilisation de ces activateurs dans un test d'exploration de la coagulation endogène, de type APTT.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'activateur de la coagulation endogène est associé à des composés qui permettent de moduler la sensibilité de réponse d'un réactif utilisé en APTT, par rapport à certaines anomalies du temps de coagulation rencontrées dans des pathologies. Les inventeurs se sont intéressés, dans le cadre de la recherche de substances susceptibles d'activer la coagulation endogène, à des composés ayant des propriétés de solubilité intéressantes par rapport aux composés utilisés jusqu'à présent en tant qu' activateurs de la coagulation dans des tests APTT et en particulier, ont recherché à partir de l'acide gallique, des dérivés susceptibles d'activer la coagulation endogène.
Dans, un domaine sans rapport avec celui de l'invention, la demande de brevet DE 2750560 A1 décrit des esters obtenus par estérification de l'acide gallique avec l'éthylèneglycol ou divers polyéthylèneglycols. Ces esters sont utilisés comme matière protectrice des fibres de verre incorporées à un matériau composite à bas de ciment.
Encore dans un autre domaine, celui des composés antioxydants utilisables contre la détérioration des graisses et des huiles dans l'alimentation, Weetall H. H. (Applied Biochemistry and Biotechnology vol. 1 1 , 1985) propose de synthétiser des esters d'acide gallique en utilisant des alcools ou des diols particuliers. La publication précise que si des esters et des diols esters ont effectivement été synthétisés en présence de tannase d'Aspergillus niger, la nature précise des produits reste à déterminer.
Les réactifs en question sont des activateurs contact de la voie endogène de la coagulation, capables d'avoir une activité procoagulante, c'est à dire d'activer le facteur XII en facteur activé Xlla, après incubation d'un échantillon de plasma, à 37°C en présence de PF3 et de calcium.
De façon préférée pour la réalisation de l'invention, ces composés sont solubles ou susceptibles d'être rendus solubles le cas échéant après modification. L'invention a donc pour objet un composé de formule
R
A
(I) dans laquelle :
- A est choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000007_0001
Mq+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2,
- R représente ou
Figure imgf000007_0002
m étant égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et
170 ou,
Figure imgf000007_0003
AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
Parmi les composés ainsi définis, l'invention concerne, selon un mode de réalisation particulier, ceux qui ont l'avantage de pouvoir être mis en solution et en particulier en solution aqueuse. De préférence, ils sont totalement solubles.
La chaîne latérale constituée par R et dont la signification a été donnée ci- dessus est telle que la valeur de n est de préférence égale ou supérieure à 1 et inférieure ou égale à 170. En particulier, n est compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement entre 1 et 20.
De façon particulièrement préférée, n est égal à 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10. Une première famille de composés préférés selon l'invention est définie par la formule suivante :
Figure imgf000008_0001
dans laquelle
R représente ou
Figure imgf000008_0002
m étant égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et
170 ou,
— AAι-AA2- -AAr
AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10. Selon un premier mode de réalisation préféré de l'invention, dans l'une des formules (I) ou (II) précédentes, R représente
Figure imgf000008_0003
m et n répondant aux définitions données précédemment.
Avantageusement dans le cadre de l'invention, le composé de formule (II) est tel que :
R représente avec n étant un nombre entier entre 1 et 170
Figure imgf000008_0004
et de préférence entre 1 et 10.
Cette forme préférée du composé (II) selon l'invention correspond à la forme oxydée des gallates de polyethylene glycol.
Cette forme oxydée est la forme quinonique résultante de l'oxydation en milieu alcalin d'un des -OH du noyau aromatique présent dans la formule (II).
Selon un autre aspect , les composés de l'invention peuvent également se trouver constituer une famille répondant à la formule suivante correspondant à une forme ionisée de formule (III), associée à des cations mono ou bivalents définis dans le cadre de l'invention :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle : R représente
Figure imgf000009_0002
m étant égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 et
Mq+ est un cation avec q égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2.
Cette deuxième famille particulière, de composés selon l'invention répondant à la formule (III) comprend outre la quinone en position 4, les 2 fonctions -OH (en position 3 et 5) sous forme ionisée (alcoolate de sodium) formée lorsque le pH du milieu est supérieur au pKa. En particulier, l'invention concerne le gallate de mono- ou poly-éthylène glycol oxydé, dans sa forme basique, ledit composé étant associé à des cations, en milieu alcalin.
De préférence, il s'agit de la forme basique du gallate d'éthylène glycol dans laquelle R a la signification donnée ci-dessus avec m=2 et n=1.
Cette forme basique du gallate d'éthylène glycol oxydé est soluble dans l'eau.
Le pH de la composition obtenue doit être abaissé à une valeur physiologiquement acceptable en vue de son utilisation. Le déplacement de l'équilibre vers la quinone sodée (selon la formule III) à pH physiologique peut être accéléré et stabilisé par l'ajout de cations lui conférant des propriétés coagulantes immédiates.
Parmi les composés répondant à la formule (I) identifiés ci-dessus, l'invention a avantageusement pour objet les composés répondant à la définition suivante :
Figure imgf000010_0001
dans lequel
- A est :
Figure imgf000010_0002
- R est - CH2- CH2 - OH.
Mq+ étant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2. Ces composés sont respectivement la forme acide du gallate d'éthylène glycol oxydé et la forme basique ou salifiée du gallate d'éthylène glycol oxydé.
La forme basique quinone salifiée se caractérise par une couleur jaune détectable à une longueur d'onde de 355 nm et est particulièrement intéressante du fait de sa solubilité en milieu aqueux.
Pour, la réalisation des composés selon l'invention tels qu'ils sont définis précédemment et aussi dans les pages suivantes, le cation Mq+ est avantageusement un cation métallique, en particulier Mn2+ ou Cu2+ou Co2+-
Il peut alternativement être constitué par un cation non métallique tel qu'un contre-ion qui est apporté lors de la préparation des composés de l'invention par chauffage en milieu alcalin. Un tel procédé de préparation est défini dans les pages qui suivent et le cation Mq+ est avantageusement Na+, K+ ou NH +.
La concentration en cation peut être définie en fonction du temps de coagulation que l'on souhaite observer pour un échantillon témoin normal. Avantageusement, pour les cations métalliques, cette concentration est comprise entre 5 et 15 μM, de préférence autour de 10 μM.
Selon une autre forme de réalisation particulière, l'invention a pour objet une famille de composés répondant à la formule (I)
Figure imgf000011_0001
dans laquelle
A est choisi parmi les formules suivantes
Figure imgf000011_0002
Mq+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2,
- R représente NH-CH2-CH2 -NH2 avec n étant un nombre entier entre 1 et 170. -" n
En particulier dans le cadre de la définition de R, n est compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement entre 1 et 20.
Une forme préférée du gallate de polyethylene diamine est la forme quinonique résultante de l'oxydation d'un des -OH du noyau aromatique. Elle correspond à la formule suivante j_
Figure imgf000012_0001
dans laquelle n est un nombre entier entre 1 et 170 ; de préférence compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement 1 et 20.
De façon particulièrement préférée dans les formules ci-dessus,, n est égal à 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10. Avantageusement, il s'agit du gallate d'éthylène diamine (n =1).
Les composés de l'invention peuvent également se trouver sous la forme associée à des cations mono ou bivalents en particulier à des cations métalliques. Ces composés répondent à la formule suivante:
Figure imgf000013_0001
- dans laquelle n est un nombre entier entre 1 et 170.
- Mq+ est un cation, q est égal à 1 ou 2 et p est tel que p x q = 2.
En particulier, n est compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement entre 1 et 20.
De façon particulièrement préférée, n est égal à 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10.
Selon une troisième forme de réalisation, l'invention a pour objet un composé caractérisé en ce qu'il répond à la formule (I)
Figure imgf000013_0002
dans laquelle
- A est choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000013_0003
Mq+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2. - R est un reste d'acide aminé ou un peptide. De préférence, comme indiqué dans le cas des deux premiers modes de réalisation de l'invention, les composés de l'invention sont sous la forme quinonique résultant de l'oxydation d'un des -OH du noyau aromatique:
Figure imgf000014_0001
ou, sous la forme associée à des cations mono-, ou bivalents:
Figure imgf000014_0002
dans laquelle M, q et p ont les définitions précédentes.
Un acide aminé préféré pour la réalisation des composés ci-dessus est la serine où
O
II = — NH-CH-C-OH I
CH2 I OH
Dans ce cas le composé de l'invention a avantageusement la formule suivante :
Figure imgf000014_0003
M, q et p répondant aux définitions précédentes.
L'invention a également pour objet une composition caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de plusieurs composés, en particulier un mélange d'au moins deux composés parmi ceux identifiés précédemment, qu'il s'agisse de composés appartenant à la même famille ou au même groupe ou au contraire de composés appartenant à des familles ou à des groupes différents parmi ceux définis précédemment.
En particulier, une composition est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux composés différents de formule :
Figure imgf000015_0001
ces composés étant identiques ou différents pour le groupement A et étant identiques ou différents pour le groupement R, A et R ayant les significations données ci-dessus. L'invention concerne de préférence une composition caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de composés (IV) et (V) , constituant respectivement les formes acide et basique du Gallate d'Ethylène Glycol oxydé (GEGox), de formules suivantes :
Figure imgf000015_0002
M, q et p ayant les définitions indiquées ci-dessus. Cette composition comprend donc un mélange des formes acide et basique du gallate d'éthylène glycol oxydé, correspondant aux produits de l'équilibre céto- énolique obtenu à partir du gallate d'éthylène glycol lorsqu'il est soit chauffé en milieu alcalin, soit mis en présence de cations métalliques. L'équilibre entre les formes acide et basique du gallate d'éthylène glycol oxydé peut être déplacé vers l'une ou l'autre de ces formes en aménageant les conditions de la réaction, et en particulier en modifiant le pH ou la concentration en cations présente dans le milieu de réaction.
Avantageusement, la composition ainsi définie est caractérisée en ce qu'il s'agit d'une solution et de préférence d'une solution aqueuse.
L'invention a en particulier pour objet, dans le cadre de la définition précédente, une composition dans laquelle la forme basique répondant à la formule (V) du gallate d'éthylène glycol oxydé est prédominante.
Cette forme basique, hydrosoluble, présente des propriétés tout à fait avantageuses pour constituer une composition activatrice de la coagulation endogène notamment pour réaliser un test in vitro pour l'exploration de la coagulation endogène.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition répondant à l'une des définitions précédentes, a un pH alcalin physiologiquement acceptable. Ce pH est ajusté après oxydation du GEG, par exemple en présence de molécules tampon: MOPS ('acide-(/V-Morpholino)propanesulfonique) ou TRICINE: (Λ/-Tris(hydroxymethyl)methyl-glycine). Avantageusement, la molécule MOPS est choisie.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition est caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange des différentes formes du gallate, produites par l'équilibre céto-énolique et répondant à la formule :
Figure imgf000017_0001
M, q et p répondant à l'une des définitions ci-dessus.
La présence de l une ou l'autre des formes de l'énolate de l'ester de l'acide gallique est dépendante des conditions de la réaction et l'équilibre céto-énolique peut donc être déplacé pour obtenir une quantité plus ou moins grande de l'une des formes du gallate produites.
On aura tendance dans le cadre de l'invention, à favoriser la présence de la forme basique du gallate oxydé, de formule (V).
Les composés et compositions préférés selon l'invention peuvent également être définis comme résultant de la mise en œuvre du procédé comprenant les étapes suivantes :
- Estérification de l'acide gallique avec l'éthylène glycol et récupération d'un des produits de la réaction constitué par le gallate d'éthylène glycol (GEG) de formule:
Figure imgf000017_0002
- Déplacement de l'équilibre céto-énolique par mise en contact du GEG avec un milieu alcalin et chauffage à une température comprise entre 70 et 90 °C. La réaction de formation de l'équilibre céto-énolique est conduite avantageusement pendant une durée de 24 h à 80°C. La préparation selon le procédé ci-dessus conduit à un mélange des 3 formes du gallate, ledit mélange pouvant être déplacé vers les formes oxydées.
De façon préférée, la composition ainsi obtenue est caractérisée en ce que le procédé comprend en outre les étapes de : - stabilisation de l'équilibre céto-énolique obtenu par l'ajustement du pH. - récupération des composés de formule (IV) et (V) en solution, à pH alcalin.
Les formes oxydées du GEG sont formées en présence de soude et en particulier, on utilisera de la soude en excès pour déplacer l'équilibre céto- énolique vers la forme basique du gallate d'éthylène glycol oxydé. Le traitement par chauffage est réalisé à une température comprise entre 70 et 90°C, de préférence une température de 80°C pendant une durée de 24h.
Le pH de la solution est un pH alcalin, et l'action de la soude peut être arrêtée par l'addition d'un tampon qui contribue à stabiliser l'équilibre céto- énolique obtenu. De façon particulièrement préférée, le pH de la composition selon l'invention est compris entre 7,6 et 7,8.
Le tampon ajouté peut être par exemple un tampon MOPS ou TRIS.
La composition contient les composés selon l'invention dans une concentration comprise entre 100 et 1000 μM.
Les composés et compositions ainsi définis dans le cadre de l'invention, sont capables d'activer la coagulation endogène au contact d'un échantillon de plasma, en d'autres termes sont capables d'activer le facteur XII en facteur Xlla, après avoir été mis en contact et incubés avec un échantillon de plasma en présence de PF3 et de calcium, à une température d'environ 37°C.
L'invention a également pour objet un système de réactifs utilisable pour l'examen in vitro de la coagulation endogène sur un échantillon sanguin, lequel système comprend parmi ses réactifs, un composé ou une composition tels que définis précédemment.
Un réactif préféré selon l'invention comprend un sel de l'acide gallique
(gallate) sous forme activée, répondant à la formule:
Figure imgf000019_0001
M, q et p répondant aux définitions ci-dessus.
R représente ou
Figure imgf000019_0002
avec m égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 ou,
— AA-t-AAr -AAr AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
En particulier dans le cadre de la définition de R, n est compris entre 1 et 50, par exemple entre 1 et 30, avantageusement entre 1 et 20.
De façon particulièrement préférée dans les formules ci-dessus,, n est égal à 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10.
La détermination des concentrations des composés selon l'invention, tient compte du fait qu'en système APTT, les temps de coagulation attendus pour des plasmas issus de sujets sains, sont généralement compris entre 28 et 40 secondes. Dans ce cadre, la concentration des composés selon l'invention et des autres constituants mis en œuvre pour le test de la coagulation peut être définie à partir du temps de coagulation recherché pour des échantillons de plasmas sains. En particulier, la concentration des composés selon l'invention peut varier de 100 à 1000 μM. L'optimisation des concentrations des principaux constituants du réactif vise à obtenir sur une échantillothèque de plasmas issus d'au moins 30 sujets sains, des temps de coagulation compris dans cet intervalle.
En outre, l'optimisation des paramètres biochimiques d'environnement des principes actifs du réactif APTT, permet en allongeant les temps, d'ajuster spécifiquement la sensibilité de détection de certaines pathologies relevant d'un test APTT.. Ainsi, par exemple, il sera recherché un allongement de temps par rapport au témoin sujet sain, d'au moins 20% dans les cas de syndromes des Lupus Anticoagulants. Pour des plasmas issus de sujets traités aux anticoagulants de type héparine non fractionnées, ce sont des allongements de temps compris dans des ratios de 1 ,5 à 3,0 fois le temps témoin qui seront recherchés. Pour des plasmas d'hémophiles de type A et B, la plus grande sensibilité possible est requise et on cherchera à obtenir des allongements de temps importants.
De façon préférée, le réactif ainsi constitué comprend du gallate d'éthylène glycol activé. L'activité résulte de l'équilibre céto-énolique obtenu et de sa stabilisation à un pH physiologiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la concentration en gallate, en particulier, en gallate d'éthylène glycol dans la composition ou le système de réactifs décrit, est avantageusement comprise entre 100 et 1000 μM, de préférence 100 μM.
L'invention a aussi pour objet tout composé ou toute composition parmi ceux définis ci-dessus, pour la constitution d'un réactif d'exploration de la coagulation endogène, notamment pour la réalisation d'un test APTT, associé à un constituant ayant une activité de modulation sur la sensibilité de réponse du composé ou de la composition de l'invention.
La modulation de la sensibilité peut consister en une atténuation de l'allongement du temps de coagulation observé sur des échantillons de plasmas de patients affectés par une pathologie de type Lupus Anticoagulants ou de patients sous traitement anticoagulant par exemple à base d'héparine non fractionnée. Alternativement, cette modulation de sensibilité peut consister à abaisser le temps de coagulation mesuré sur des échantillons de plasmas non pathologiques.
Un tel constituant modulateur de la sensibilité d'un réactif préparé avec les composés ou les compositions de l'invention est un poly-aminoacide, de préférence substitué en partie, la substitution affectant les groupements aminés, qui sont substitués par des groupements succinyl (-CO-CH2-CH2-COOH) ou glutaryl (-QC(CH2)3CO). La substitution ne doit pas affecter la conformation spatiale et/ou la stabilité du constituant de départ, dans des conditions telles que le polyaminoacide substitué ne pourrait plus exercer son effet modulateur de sensibilité. Pour ces raisons, un polyaminoacide totalement substitué serait a priori exclu.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le constituant modulateur est une Polylysine substituée (soit la D- ou L-polylysine ou un mélange de celles-ci), notamment succinylée et par exemple il s'agit de L- Polylysine substituée, avantageusement la L-polylysine succinylée. Les inventeurs ont notamment utilisé la L-polylysine succinylée disponible dans le catalogue de la société SIGMA (2001-2002). La L-Polylysine glutarylée peut également être employée.
De préférence, on utilise la L-polylysine succinylée, dans un intervalle de poids moléculaire allant de 20 000 à 300 000 Da, de préférence de 50 000 à 300 000 Da.
La concentration, dans le réactif préparé pour réaliser le test APTT, du constituant modulateur, et en particulier de la L-Polylysine succinylée est dans l'intervalle de 10 à 100 μg/ml, de préférence de 50 à 100 μg/ml. Le Polyaminoacide substitué, en particulier la Polylysine succinylée, peut être ajouté à tout moment de la préparation du réactif destiné à être utilisé dans un test d'exploration de la coagulation endogène, de type APTT.
Le système de réactifs selon l'invention comprend, outre l'activateur contact de la voie endogène de la coagulation, un substitut des phospholipides de la membrane plaquettaire. Ce substitut peut être de la céphaline : suspension de phospholipides extraits de cervelles de mammifères. L'invention concerne aussi un système de réactifs qui comprend en outre, sous forme séparée des autres réactifs, des ions Ca + pour déclencher l'activation des facteurs impliqués dans la voie endogène.
Les réactifs de l'invention et le cas échéant les autres constituants utilisés à la mise en œuvre d'un test APTT peuvent être associés sous la forme d'un kit.
L'utilisation des composés, compositions ou réactifs selon l'invention pour l'exploratiort de la coagulation et plus particulièrement de la coagulation endogène, peut être mise en œuvre pour mesurer sur un échantillon sanguin et en particulier un échantillon de plasma, le temps de thromboplastine partiellement activée (APTT). A cet égard, on a avantageusement recours à l'utilisation de plasma pauvre en plaquettes.
Dans le cadre de cette mesure, les conditions habituelles de réalisation de ce test sont mises en œuvre, en particulier en ce qui concerne la préparation des échantillons. Ainsi, l'échantillon du plasma prélevé peut dans un premier temps avoir été traité par exemple avec du citrate de façon à complexer les ions Ca2+ contenus dans l'échantillon de sorte que l'échantillon ne peut plus coaguler. L'échantillon est ensuite incubé avec un composé ou une composition selon l'invention en tant qu'activateur de la coagulation et des substituts de phospholipides. Des ions Ca2+ sont ensuite ajoutés en quantité équivalente à celle qui a été complexée, pour déclencher la coagulation.
L'activité des composés ou compositions selon l'invention nécessite que leur pH ait un valeur physiologiquement acceptable.
Les composés, compositions ou réactifs selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisés pour déterminer le temps de coagulation du sang complet ou le temps de coagulation du plasma .
L'invention permet donc l'utilisation d'un composé ou d'une composition selon la description qui en a été donnée précédemment, pour la préparation d'un système de réactifs pour l'examen des facteurs de coagulation impliqués dans la voie endogène de la coagulation. Les facteurs concernés sont principalement les facteurs XII, XI, IX, VIII. Dans ce cadre, l'invention concerne par exemple la détection d'anomalies liées à la maladie de Willebrand, aux hémophilies A et B ou la détection d'anticoagulants. Ces anomalies entraînent un temps mesuré d'APTT en dehors des valeurs normales celles-ci étant habituellement situées entre 20 et 40 secondes.
L'invention a donc aussi pour objet une méthode de mesure du temps de thromboplastine partiellement activée (APTT) comprenant les étapes de :
- mise en contact d'un échantillon de plasma pauvre en plaquettes avec des composés ou compositions selon l'invention, en présence de substituts des phospholipides de la membrane plaquettaire, dans des conditions permettant l'activation de la voie endogène de la coagulation,
- addition d'ions Ca2+ en quantité équivalente à la quantité de ces ions complexés dans l'échantillon de plasma.
- mesure du temps nécessaire à la transformation du fibrinogène en fibrine. En particulier, dans le cadre de la mise en œuvre de la méthode précédente, l'échantillon de plasma est constitué par un plasma pauvre en plaquettes et un activateur de coagulation est incubé avec le plasma pendant une durée de 2 à 5 minutes environ, à 37 °C. Les substituts de phospholipides membranaires sont soit ajoutés dès le début de la réaction, soit mélangés à l'activateur, soit ajoutés individuellement au cours de la réaction.
Puis les ions calcium sont ajoutés, sous la forme par exemple de chlorure de calcium de concentration comprise entre 20 mM et 25 mM. Le temps nécessaire à la formation de fibrine est alors mesuré.
Le temps mesuré indique, quand il est compris en dehors de l'intervalle de temps correspondant à une situation de coagulation normale (c'est à dire entre 20 et 40 secondes), qu'un des paramètres de la voie endogène de la coagulation est à un taux anormal, y compris absent, ou qu'il existe des composés anticoagulants dans le plasma testé.
Quand le plasma étudié comporte un facteur de la voie endogène de la coagulation à un taux anormal, l'invention permet alors une analyse quantitative du facteur en question, en utilisant un système dépiété en ce facteur, et dans lequel tous les autres paramètres sont par ailleurs introduits en excès . Dans ce système, après avoir ajouté le plasma à étudier, seul le facteur à doser se trouve en quantité limitante.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un composé de formule suivante :
Figure imgf000024_0001
dans laquelle
A représente un ou plusieurs des composés choisis parmi les formules suivantes :
Figure imgf000024_0002
Mq+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2.
R représente o ,
Figure imgf000024_0003
m étant égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et
170 ou,
— AA-ι-AA2- -AAr AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10. le dit procédé comprenant les étapes de :
- estérification de l'acide gallique, en présence d'un composé ayant au moins une fonction alcool ou amidation de l'acide gallique en présence d'un composé ayant au moins une fonction aminé,
- mise en. contact du dérivé de l'acide gallique obtenu, avec des ions OH- pour former un composé de formule
Figure imgf000025_0001
addition d'un cation métallique Mq+ (avec q égal à 1 ou 2), dans des conditions permettant la formation d'un complexe de formule:
Figure imgf000025_0002
- stabilisation de l'équilibre obtenu, entre les composés (II) et (III) à un pH physiologiquement acceptable, par l'addition d'un tampon tel que MOPS ou TRICINE
- récupération de la solution obtenue.
Ce procédé est de préférence tel que l'estérification est réalisée en présence d'éthylène glycol pour former le gallate d'éthylène glycol, permettant de ce fait de récupérer, à l'issue des réactions mises en œuvre, les produits de l'équilibre céto-énolique comprenant notamment les formes acides et basiques du gallate d'éthylène glycol oxydé et le cas échéant également une quantité résiduelle de gallate d'éthylène glycol.
Les définitions des familles ou groupes préférés de composés ou de compositions selon l'invention, sont également concernées par la définition du procédé.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, on peut souhaiter récupérer principalement la forme basique de formule (V) du gallate d'éthylène glycol oxydé et pour ce faire, on peut avoir intérêt à déplacer l'équilibre vers cette forme basique. Une autre méthode a été mise au point par les inventeurs pour préparer un composé de formule A selon l'invention ayant des propriétés activatrices de la coagulation endogène. Ce procédé comprend les étapes de :
- estérification de l'acide gallique,
- chauffage de l'ester de l'acide gallique obtenu à une température comprise entre 70 et 90° C, de préférence à 80°C pendant une durée comprise entre
16h et 24h de préférence 24 h à pH alcalin, dans une solution tampon,
- récupération des différentes formes de l'ester de l'acide gallique présentes en solution.
D'autres propriétés et avantages de l'invention apparaissent à la lecture des exemples qui suivent qui constituent des modes de réalisation préférés de l'objet de l'invention.
EXEMPLE 1
Dans cet exemple, le temps de coagulation est mesuré avec des réactifs APTT fabriqués selon l'invention en utilisant divers cations. Différents types de plasmas sont testés, normaux d'une part, et représentatifs de pathologies relevant d'un test APTT d'autre part:
- CK - Prest = réactif APTT de référence dont l'activateur contact est du kaolin,
- pool N = mélange en quantités équivalentes de plasmas provenant de sujets sains, - CCN = Coag. Contrôle Normal : Plasma contrôle de qualité niveau normal,
- CCP = Coag. Contrôle Patho : Plasma contrôle de qualité niveau pathologique,
- Héparinés = plasmas issus de patient recevant un traitement anticoagulant à base d'héparine non fractionnée sous forme de sels sodiques ou calciques,
- Lupus = plasma de patient présentant le syndrome Lupus Anticoagulant,
- Def. F Ville = plasma de patient présentant un déficit en f Ville ( Hémophile A).
Les mesures sont effectuées sur un automate d'hémostase ( STA - Diagnostica Stago).
Figure imgf000027_0001
EXEMPLE 2:
Dans l'exemple suivant, les temps de coagulation de différents plasmas sont déterminés à partir de réactifs APTT obtenus à partir des amides ou des esters de l'acide gallique.
- Plasmas normaux = pool en quantités équivalentes de plasmas de sujets normaux,
- CCN = Coag. Control Normal : contrôle de qualité niveau normal, - CCP = Coag. Control Patho : contrôle de qualité niveau pathologique, - Héparinés = plasmas de patients recevant un traitement anticoagulant à base d'héparine non fractionnée sous forme de sels sodiques ou calciques.
- Lupus = plasma de patient présentant un syndrome Lupus Anticoagulants
- F VIII déf. = plasma de patient avec déficit en F Ville (hémophilie A)
Figure imgf000028_0001
D'après ce tableau, il apparaît donc que les résultats les plus proches de ceux obtenus avec le réactif de référence, le CK-Prest, sont ceux obtenus avec le gallate d'éthylène glycol.
EXEMPLE 3
Après chauffage pendant 24 heures à 80°C, le gallate d'éthylène glycol en solution
500 μM, tamponnée à pH 7,00, devient actif dans un test APTT de la coagulation.
Le tableau ci-dessous montre la cinétique d'activation de la molécule. L'activité procoaguiante de la solution de gallate d'éthylène glycol est comparée à celle d'un réactif de référence : le CK-PREST, réactif APTT dont l'activateur est du kaolin. L'appareil servant à mesurer les temps de coagulation est un automate d'hémostase STA Diagnostica Stago (n° série 307)
Parallèlement à l'apparition de l'activité coagulante, une coloration jaune mesurable à 355 nm, apparaît.
Les plasmas testés sont des plasmas de contrôle qualité :
CCN = Coag Contrôle Normal. CCP = Coag Contrôle Pathologique lot n° 980901. Réactif APTT réalisé = Gallate d'éthylène glycol à 500 μM oxydé à 80°C + Tricine 50 mM, pH 7.00 + Céphaline (substitut de phospholipides plaquettaires).
EXEMPLE 4 :
Diverses molécules tampons, choisies parmi celles habituellement utilisées dans les systèmes biologiques, permettent d'obtenir dans des délais raisonnables de chauffage (< 4 jours) des activités procoagulantes significatives et proches de
10 celles du réactif de référence CK-PREST. Il s'agit des molécules suivantes :
TRICINE :/V-Tris(hydroxymethyl)methyl-glycine
HEPES : acide Λ/-2-Hydroxyethylpiperazine-/V-2-ethanesulfonique - MOPS: acide-(V-Morpholino)propanesulfonique
- TRIS : [rr/s-(hydroxymethyl)aminométhane]
Le tampon Tricine et le MOPS sont utilisés de préférence, car avec le TRIS, un précipité apparaît durant l'activation du gallate d'éthylène glycol, et avec le tampon HEPES, il est nécessaire de mener le chauffage durant une période plus longue. Dans le tableau suivant, sont consignées les performances obtenues sur 2 plasmas contrôles (normal et pathologique), 1 pool de plasmas issus de donneurs sains et 4 plasmas représentatifs de pathologies détectables en système de coagulation de type APTT ;
* Pool N = pool de plusieurs plasmas normaux
* CCN = Coag. Control Normal : contrôle de qualité de niveau normal
* CCP = Coag. Control pathologique : contrôle de qualité de niveau pathologique,
* LA : plasma de patient présentant un syndrome Lupus Anticoagulant * Hep : Plasma de patients recevant un traitement anticoagulant à base d'héparine non fractionnée sous forme de sel calcique.Deux plasmas, à 2 niveaux d'héparinémie sont testés : 0,09 et 0,34 Unité internationale par ml.
* Déf. Ville = plasma d'hémophile A à 40% d'activité en facteur Ville.
Les temps de coagulation obtenus sont exprimés en secondes.
La sensibilité de réponse obtenue avec chacun des réactifs fabriqués avec les 4 tampons, est objectivée par le calcul d'un ratio (R) effectué en divisant le temps de coagulation obtenu sur le plasma du patient, par celui obtenu avec le pool normal, ou le temps de coagulation du contrôle pathologique (CCP) par celui du contrôle normal (CCN).
Temps de coagulation Patient
K "~
Temps de coagulation Pool N
Figure imgf000031_0001
EXEMPLE 5:
L'utilisation d'un réactif APTT peut se concevoir selon 2 finalités :
- exploration globale de la voie endogène de la coagulation sanguine, avec réponse de type normal-anormal ;
10 - exploration analytique et quantitative des facteurs de la coagulation impliqués dans la voie endogène de la coagulation : F XII-XI-IX-Vlllc.
- il est possible de doser dans un plasma de patient, un quelconque facteur coagulant de la voie endogène, en utilisant un système dépiété spécifiquement en ce facteur. Tous les autres paramètres étant introduits en excès, seul le
15 facteur à doser se trouve alors en quantité limitante. Son activité devient quantifiable après comparaison à une courbe de calibration préalablement établie dans les mêmes conditions. Selon l'importance du déficit, le temps de coagulation est plus ou moins allongé (voir exemple pour le facteur Ville).
Figure imgf000032_0002
Sensibilité du réactif APTT-gallate d'éthylène glycol, au déficit en FVHlc.comparée à la référence CK-Prest
Figure imgf000032_0001
20 40 60 80 100 120 140
F Ville (%) EXEMPLE 6:
L'activité coagulante d'un réactif APTT nécessite l'action conjointe de deux principes actifs :
- une molécule activatrice de la phase contact de la voie endogène. En l'occurrence, il s'agit du gallate d'éthylène glycol activé par chauffage à 80°C.
- un substitut des phospholipides de la membrane plaquettaire, la céphaline, préparation obtenue à partir d'une extraction chloroformique de cervelles de lapin.
- L'activité optimale du réactif APTT ainsi constitué dépend pour autant des concentrations en gailate d'éthylène glycol et de céphaline.
- Les tableaux suivants résument les résultats obtenus sur des plasmas représentatifs de différentes pathologies ainsi que sur des contrôles.
Figure imgf000033_0001
CK Prest lot n° 981201 34,2 47,6 38,3 57,1 121 ,5 38,9
Le choix peut être effectué pour des concentrations comprises entre 100 et 1000 μM. Notre préférence se situe à une concentration de 100 μM. Détermination de la dilution optimale de céphaline
Figure imgf000034_0001
CK Prest lot n° 981201 33,0 38,6 84,8 49,5
EXEMPLE 7 : Choix de concentration du chlorure de Manganèse
Dans cet exemple, le temps de coagulation est mesuré avec des réactifs APTT réalisés selon l'invention, et pour lesquels la concentration en chlorure de
Manganèse est variable.
Les plasmas testés sont des plasmas Contrôle Qualité. Deux niveaux sont utilisés : un niveau normal et un niveau pathologique. Le réactif commercial CK Prest est testé en parallèle et constitue la référence.
Figure imgf000034_0002
De préférence, c'est la concentration 10 μM qui est retenue.
EXEMPLE 8 :
Il peut être avantageux de pouvoir moduler la sensibilité de réponse d'un réactif APTT par rapport à certaines anomalies du temps de coagulation recontrées dans diverses situations physiopathologiques. Cette modulation vise à obtenir un réactif avec des caractéristiques spécifiques en terme de sensibilité de réponse, reproductibles d'un lot de fabrication à l'autre.
Les inventeurs ont observé qu'en ajoutant de la L-Polylysine succinylée dans le réactif APTT à base de gallate d'éthylène glycol, on pouvait atténuer les allongements de temps de coagulation observables sur les plasmas issus de patients présentant un syndrome des Lupus Anticoagulants ou de patients sous traitement anticoagulant à base d'héparine non fractionnée. De même, il a été observé que l'utilisation de L-Polylysine succinylée permet d'abaisser le temps de coagulation mesuré sur des plasmas issus d'une population normale. Ces observations peuvent être obtenues par l'utilisation d'un poly-aminoacide plus ou moins substitué au niveau des groupements aminés par des groupements succinyl ou glytaryl afin de définir le niveau de sensibilité du réactif. Une des préférences de l'invention consiste à utiliser la L-Polylysine partiellement succinylée. Les tableaux suivants résument les résultats obtenus sur les divers plasmas contrôle utilisés dans le cadre des exemples. • CCN : Coag Control Normal
CCP : Coag Control Pathologique
Pool N : Pool de plusieurs plasmas normaux
LA : Plasma de patient avec syndrome des Lupus Anticoagulant
Héparine : Plasmas de patients recevant un traitement anticoagulant à base d'héparine non fractionnée
• Déf. VIII C : Plasma d'hémophile A à 40% d'activité en F. VIII C.
Figure imgf000036_0001
Pour l'utilisation de L-polylysine succinylée dans le cadre de l'invention, le poids moléculaire de L-polylysine succinylée est de préférence dans l'intervalle 50 000 - 300 000 Da et la concentration retenue préferentiellement pour cette fourchette est 50 μg/ml de réactif.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé de formule suivante
Figure imgf000037_0001
dans laquelle
A est choisi parmi les formules suivantes
Figure imgf000037_0002
M+ représentant un cation et q peut être égal à 1 ou 2 et p est tel que p x q = 2 ou
Figure imgf000037_0003
m étant égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 ou,
— AA1-AA2- -AAr
AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10, étant entendu que le composé n'est pas
Figure imgf000037_0004
lorsque m est égal à 2, 3 ou 4.
2. Composé selon la revendication 1 , de formule suivante
Figure imgf000038_0001
dans laquelle R représente
Figure imgf000038_0002
n étant un nombre entier entre 1 et 170.
3. Composé selon la revendication 1 , de formule suivante
Figure imgf000038_0003
(III) dans laquelle
R représente avec n étant un nombre entier entre 1 et 17
Figure imgf000038_0004
- M+ est un cation, q est égal à 1 ou 2 et p est tel que p x q = 2.
4. Composé selon la revendication 2 ou la revendication 3 répondant à l'une des formules (II) ou (III) dans laquelle R représente
Figure imgf000039_0001
n étant un nombre entier entre 1 et 10.
5. Composé selon la revendication 4 dans lequel n est égal à 1.
6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 de formule suivante :
Figure imgf000039_0002
dans laquelle -A est
Figure imgf000039_0003
M+ étant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2, -Rest-CH2-CH2-OH.
7. Composé selon la revendication 1, de formule suivante :
Figure imgf000039_0004
dans laquelle : -A est
Figure imgf000040_0001
M+ étant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2, - R est un reste d'acide aminé naturel ou exotique ou un peptide, de préférence la serine.
8. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange d'au moins deux composés différents de formule :
Figure imgf000040_0002
les deux composés en question étant identiques ou différents pour le groupement A et étant identiques ou différents pour le groupement R, lesdits groupements A et R étant tels que : - A est choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000040_0003
M+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2;
R représente , ou
Figure imgf000040_0004
m étant égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 de préférence entre 1 et 50, 1 et 30 ou 1 et 20 ou,
Figure imgf000041_0001
AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de composés (IV) et (V) , constituant respectivement les formes acide et basique du Gallate d'Ethylène Glycol oxydé (GEGox), de formules suivantes :
Figure imgf000041_0002
dans lequel M+ est un cation, q est égal à 1 ou 2 et p est tel que p x q = 2.
10. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce qu'elle comprend les différentes formes du Gallate d'Ethylène Glycol produites par l'équilibre céto-énolique et répondant à la formule
Figure imgf000041_0003
dans laquelle
A est choisi parmi les formules suivantes
Figure imgf000042_0001
M+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2,
- R est - CH2 - CH2- OH.
11. Composé susceptible d'être obtenu par la mise en œuvre du procédé comprenant les étapes suivantes : estérification de l'acide gallique avec l'éthylène glycol et récupération d'un des produits de la réaction constitué par le gallate d'éthylène glycol (GEG) de formule :
Figure imgf000042_0002
- déplacement de l'équilibre céto-énolique par mise en contact du GEG avec un milieu alcalin, chauffage à une température comprise entre 70 et 90°C, pendant une durée de 24h.
12. Composé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que le procédé comprend en outre les étapes de :
- stabilisation de l'équilibre céto-énolique obtenu par l'ajustement du pH,
- récupération des composés de formule (IV) et (V) en solution, à pH alcalin.
13. Composé susceptible d'être obtenu par la mise en œuvre des étapes suivantes :
- estérification de l'acide gallique, - chauffage de l'ester de l'acide gallique obtenu à une température comprise entre 70 et 90 °C, pendant une durée comprise entre 16 et 24h à pH alcalin, dans une solution tampon,
- récupération des différentes formes de l'ester de l'acide gallique présentes en solution.
14. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, 11 à 13, caractérisé .en ce qu'il (elle) est sous la forme d'une solution aqueuse.
15. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de composés susceptibles d'être obtenus selon un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.
16. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce qu'elle comprend majoritairement du GEGox basique de formule :
Figure imgf000043_0001
M+ étant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2.
17. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 16, caractérisée en ce qu'elle contient sous la forme d'un équilibre stabilisé, les composés de formules (IV) et (V) et en ce qu'elle a un pH physiologiquement acceptable.
18. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 16, ou 17, caractérisée en ce qu'elle contient un mélange des composés de formules (IV) et (V) et en ce que son pH est compris entre 7,6 et 7,8.
19. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 16 à 18, capable d'activer la coagulation endogène au contact d'un échantillon de plasma, comprenant en outre un tampon choisi parmi les tampons MOPS ou TRICINE.
20. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 16 à
19, caractérisée en ce que les composés qu'elle contient sont en concentration suffisante pour activer la coagulation endogène au contact d'un échantillon de plasma.
21. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le cation est un cation métallique.
22. Composé selon la revendication 21 , caractérisé en ce que le cation métallique est choisi parmi Mn2+' Cu2+ ou Co2+-
23. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à
20, caractérisée en ce que le cation est un cation métallique.
24. Composition selon la revendication 23, caractérisée en ce que le cation métallique est choisi parmi Mn2+, Cu2+ ou Co2+.
25. Système de réactifs utilisable pour l'examen in vitro de la coagulation endogène, comprenant un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 11 à 14 ou 21 , 22 ou un composé répondant à la formule
Figure imgf000044_0001
dans lequel m est égal à 2, 3 ou 4, ou une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23, 24 dans des conditions telles qu'il (elle) constitue un activateur de la coagulation endogène, ledit système comprenant en outre un substitut des phospholipides de la membrane plaquettaire.
26. Système de réactifs selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'activateur de la coagulation endogène comprend du GEG sous forme activée répondant à la formule :
Figure imgf000045_0001
dans laquelle - M+ est un cation, q est égal à 1 ou 2 et p est tel que p x q = 2,
R représente
Figure imgf000045_0002
m étant égal à 2, 3, 4 ou 5 et n étant un nombre entier entre 1 et 170 ou,
— AAι-AA2- -AAr
AA étant un acide aminé naturel ou exotique et r étant un nombre entier entre 1 et 10.
27. Composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23, 24 ou réactifs selon l'une des revendications 25 ou 26, caractérisé en ce que sa concentration en GEG est comprise entre 100 et 1000 μM.
28. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou un composé répondant à la formule
Figure imgf000046_0001
dans lequel m est égal à 2, 3 ou 4, ou composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 24 ou 27 ou réactif selon l'une quelconque des revendications 25 à 26, associé avec un constituant capable de moduler sa sensibilité, ledit constituant étant un poly-aminoacide substitué.
29. Composé, composition ou réactif selon la revendication 28, associé avec la Polylysine succinylée.
30. Composé, composition ou réactif selon la revendication 29, associée avec la Polylysine succinylée ayant un poids moléculaire dans un intervalle de 20 000 à 300 000 Da.
31. Composé, composition ou réactif selon la revendication 28, associé avec la Polylysine glutarylée.
32. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'un composé répondant à la formule
Figure imgf000046_0002
dans lequel m est égal à 2,3 ou 4, ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23, 24 ou d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 25 à 27 ou d'une composition selon l'une des revendications 28 à 30, pour la préparation d'un test pour l'examen in vitro de la coagulation endogène.
33. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou d'un composé répondant à la formule
Figure imgf000047_0001
dans lequel m est égal à 2,3 ou 4, ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23, 24 ou d'un système de réactifs selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26 ou d'une composition selon l'une des revendication 28 à 30 pour l'exploration de la coagulation par la voie endogène.
34. Utilisation selon la revendication 33 dans laquelle on détermine le temps de thromboplastine partiellement activée (APTT).
35. Utilisation selon la revendication 32 dans laquelle on détermine le temps de coagulation du sang complet activé.
36. Utilisation selon la revendication 32 dans laquelle on détermine le temps de coagulation du plasma activé.
37. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou un composé répondant à la formule
Figure imgf000047_0002
dans lequel m est égal à 2,3 ou 4, ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23, 24 ou d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26 ou d'une composition selon l'une des revendications 28 à 30, pour l'examen des facteurs de coagulation impliqués dans la voie endogène de la coagulation.
38. Procédé de préparation d'un composé de formule suivante :
Figure imgf000048_0001
dans laquelle
A est choisi parmi les formules suivantes
Figure imgf000048_0002
M+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2 et
R représente
Figure imgf000048_0003
n étant un nombre entier entre 1 et 170, ledit procédé comprenant les étapes de :
- réaction de l'acide gallique, en présence d'un composé ayant une fonction alcool, mise en contact de l'ester de l'acide gallique obtenu, en milieu alcalin, pour former un composé de formule
Figure imgf000049_0001
addition d'un cation métallique Mq+ (avec q égal à 1 ou 2), dans des conditions permettant la formation d'un complexe de formule:
Figure imgf000049_0002
- stabilisation de l'équilibre obtenu, entre les composés (II) et (III) à un pH physiologiquement acceptable, par l'addition d'un tampon,
- récupération de la solution obtenue.
39. Procédé selon la revendication 38 caractérisé en ce que l'estérification est réalisée en présence d'éthylène glycol pour former le gallate d'éthylène glycol (GEG), et en ce que l'on récupère un mélange des formes du GEG impliquées dans l'équilibre céto-énolique.
40. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que l'on récupère la forme solublè du GEG répondant à la formule
Figure imgf000049_0003
[pMq+]
(V)
M+ étant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q = 2.
41. Procédé pour la préparation d'un composé de formule
R
A
(I) dans laquelle
A est choisi parmi les formules suivantes :
Figure imgf000050_0001
M+ représentant un cation, q étant égal à 1 ou 2 et p étant tel que p x q
= 2,
R représente -f-O-CH2-CH2-)-OH avec n étant un nombre entier entre 1 et 170 n comprenant les étapes de :
- estérification de l'acide gallique,
- chauffage de l'ester de l'acide gallique obtenu à une température comprise entre 70 et 90°C, pendant une durée comprise entre 16h et 24h à pH alcalin, dans une solution tampon,
- récupération des différentes formes de l'ester de l'acide gallique présentes en solution.
42. Méthode de mesure du temps de thromboplastine partiellement activée (APTT) comprenant les étapes de : la mise en contact d'un échantillon de plasma pauvre en plaquettes avec un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 11 à 14 ou 21 , 22 ou un composé répondant à la formule
Figure imgf000051_0001
dans lequel m est égal à 2,3 ou 4, ou une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 ou 15 à 20 ou 23, 24 ou un système de réactifs selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26, ou d'une composition selon l'une des revendications 28 à 30 en présence de substituts des phospholipides de la membrane plaquettaire, dans des conditions permettant l'activation de la voie endogène de la coagulation, - l'addition d'ions Ca2+ en quantité comprise entre 20 et 25 mM, - la mesure du temps nécessaire à la transformation du fibrinogène en fibrine.
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