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WO2002073172A2 - Determination of analytes by means of fluorescence correlation spectroscopy - Google Patents

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WO2002073172A2
WO2002073172A2 PCT/EP2002/002582 EP0202582W WO02073172A2 WO 2002073172 A2 WO2002073172 A2 WO 2002073172A2 EP 0202582 W EP0202582 W EP 0202582W WO 02073172 A2 WO02073172 A2 WO 02073172A2
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carrier
measurement
probe
analyte
luminescence
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PCT/EP2002/002582
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WO2002073172A3 (en
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Rudolf Rigler
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Gnothis Holding SA
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Gnothis Holding SA
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Priority to US10/471,235 priority patent/US20040151631A1/en
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    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the invention relates to a method for determining an analyte in a sample by fluorescence correlation spectroscopy, the distance between the measurement volume in the sample and the optical excitation / detection direction being> 1 mm and the sample liquid being thermally insulated from the optical device.
  • the method is particularly suitable for measuring temperature-variable processes, e.g. the determination of nucleic acid hybridization melting curves or to carry out nucleic acid amplification reactions.
  • a device suitable for performing the method according to the invention is disclosed.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • DE-A-36 42 798 discloses a microscope with a tripod which is displaceably mounted on an object table, the drive device for vertically displacing the object table forming an independent support of the object table spaced apart from the guide device.
  • the temperature of the microscope can be regulated by supplying cooling air and by inserting heat protection filters. There is no reference to the use in fluorescence correlation spectroscopy.
  • GB-A-2 351 556 describes a method for measuring radiation, in which a plurality of confocal single-channel optical systems and photoelectric detectors are arranged in parallel in order to form a plurality of reading heads which are arranged next to one another in order to be able to simultaneously evaluate radiation from corresponding areas.
  • 10 x microscope objectives with a numerical aperture of 0.4, a focal length of about 8 mm and an aperture diameter of 5 mm can be used as focusing optics. There is no indication that the focusing optics can be thermally isolated from the sample.
  • DE-C-42 1 8 729 discloses a capillary electrophoresis device with an optical, spatially resolving detection system.
  • the temperature inside the capillary can be thermostatted. There is no reference to confocal fluorescence correlation spectroscopy.
  • DE-A-1 99 1 9 092 describes an arrangement for the optical evaluation of an object array, which are used for fluorescence analysis can. Again, there is no evidence of thermal insulation of the focusing optics and samples.
  • the object on which the present application is based was to provide methods and devices for carrying out fluorescence correlation spectroscopy which at least partially avoid these disadvantages of the prior art.
  • the invention thus relates to a method for determining an analyte in a sample by fluorescence correlation spectroscopy, comprising the steps:
  • Measuring volume characterized in that the distance between the measuring volume in the sample liquid and the focusing optics of the light source is> 1 mm and that the sample liquid is thermally insulated from the light source and in particular from the focusing optics.
  • thermoelectric device independent of the optical excitation or detection device and in particular its focusing optics, e.g. one or more micro lenses, can be set and changed.
  • the method can basically be carried out according to the method described in EP-B-0 679 251. This is preferably done the measurement of one or a few analyte molecules in a measurement volume, the concentration of the analyte molecules to be determined preferably being ⁇ 1 0 "14 l.
  • Substance-specific parameters are determined which are determined by luminescence measurement on the analyte molecules. These parameters can be translation diffusions - Coefficients, rotational diffusion coefficients or / and the excitation wavelength, the emission wavelength or / and the lifetime of an excited state of a luminescent molecule or the combination of one or more of these measured variables EP 0 679 251.
  • the distance between the measurement volume in the sample liquid and the focusing optics of the light source is 1 mm, preferably 1.5 to 10 mm and particularly preferably 2 to 5 mm. It is further preferred that a gas phase region is arranged between the carrier containing the sample liquid and the optical focusing device, which can contain air, protective gas or vacuum.
  • the carrier used to carry out the method according to the invention is preferably a microstructure which contains several, preferably separate containers for holding samples.
  • the volume of these containers is preferably in the range of 10 6 I and particularly preferably 10 8 I.
  • the carrier can comprise a microwave structure with several recesses for receiving sample liquid, which for example have a diameter between 10 and 1000 ⁇ m. Suitable microstructures are described, for example, in DE 100 23 421 .6 and DE 100 65 632.3
  • the carrier preferably comprises at least one temperature control element, for example a Peltier element, which enables temperature control of the carrier and / or individual sample containers therein.
  • the carrier used for the method is expediently designed such that it enables optical detection of the sample.
  • a carrier which is optically transparent at least in the region of the sample containers is therefore preferably used.
  • the carrier can either be completely optically transparent or contain an optically transparent base and an optically opaque cover layer with cutouts in the sample containers.
  • Suitable materials for supports are, for example, composite supports made of metal (for example silicon for the cover layer) and glass (for the base). Such supports can be produced, for example, by applying a metal layer to the glass with predetermined cutouts for the sample containers.
  • plastic carriers made, for example, of polystyrene or polymers based on acrylate or methacrylate can be used. It is further preferred that the carrier has a cover for the sample containers in order to provide a closed system which is essentially isolated from the surroundings during the measurement.
  • a carrier which contains a lens element which is arranged in the beam path between the measurement volume and the light source or detector of the optical device.
  • the lens element can be attached to the bottom of a microwave structure.
  • a lens element can be produced, for example, by heating and shaping a photoresist using a master mold, for example made of metal such as silicon, and then applied to the carrier.
  • the lens elements can be integrated into the carrier, for example when using carriers made of fully plastic structure, for example by injection molding during production.
  • the numerical aperture of the optical measuring arrangement can be enlarged by using a lens element, preferably a convex lens element. This numerical aperture is preferably in the range from 0.5 to 1.2.
  • the support is also preferably coated with a transparent anti-reflection coating in order to generate a higher refractive index.
  • a transparent anti-reflection coating for example, transparent oxides or nitrides can be used as antireflection coatings.
  • Anti-reflective coatings are preferably also used on the optics.
  • electric fields can be generated in the carrier, in particular in the area of the sample containers, in order to achieve a concentration of the analytes to be determined in the measurement volume.
  • Examples of electrodes which are suitable for generating such electric fields are e.g. described in DE 1 01 03 304.4.
  • the method according to the invention allows a determination to be carried out at a temperature different from the environment and, in particular, a change in the temperature during the measurement.
  • the spatial decoupling of carrier and optics allows a simplified scanning of carriers, in particular microwave structures with several separate sample containers.
  • the method according to the invention is basically suitable for the detection of any analytes.
  • One or more analyte-binding substances are preferably added to the sample, which carry a labeling group that can be detected by luminescence measurement, in particular a fluorescence labeling group.
  • the method according to the invention preferably comprises determining the binding of the labeling substance to the analyte to be detected. This detection can take place, for example, by changing the mobility of the labeling group due to the binding to the analyte or by changing the luminescence of the labeling group (intensity or / and decay time) due to the binding to the analyte or by using several labeling groups by means of the so-called cross-correlation.
  • the cross-correlation determination uses at least two different markings, in particular fluorescence markings, the correlated signal of which is determined within the measurement volume.
  • This cross-correlation determination is, for example, by Schwüle et al. (Biophys. J. 72 (1997), 1 878-1886) and Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1 998), 97-109).
  • the method according to the invention is particularly suitable for the detection of biomolecules, e.g. Nucleic acids, proteins or other analyte molecules occurring in living organisms, especially in mammals such as humans.
  • biomolecules e.g. Nucleic acids, proteins or other analyte molecules occurring in living organisms, especially in mammals such as humans.
  • analytes that have been generated in vitro from biological samples can also be detected, e.g. cDNA molecules which have been produced from mRNA by reverse transcription or proteins which have been produced from mRNA or from DNA by in vitro translation.
  • the method is also suitable for the detection of analytes which are present from elements of a library and have predetermined characteristics, e.g. Binding to the detection reagent. Examples of such libraries are phage libraries or ribosomal libraries.
  • the determination comprises nucleic acid hybridization, one or more luminescence-labeled probes binding to a target nucleic acid as analytes.
  • Such hybridization methods can be used, for example, to analyze gene expression, for example to determine a gene expression profile, to analyze mutations, for example single nucleotide polymorphisms (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphisms
  • the method according to the invention is also suitable for determining enzymatic reactions and / or for determining nucleic acid amplifications, in particular in one or more thermocycling processes.
  • Preferred methods for determining nucleic acid polymorphisms are in DE 100 56 226.4 and DE 100 65 631 .5.
  • a two-color or multi-color cross-correlation determination is particularly preferably carried out.
  • the determination comprises the detection of a protein-protein or protein-ligand interaction, the protein ligands being e.g. low molecular weight active substances, peptides, nucleic acids etc. can be used.
  • the protein ligands being e.g. low molecular weight active substances, peptides, nucleic acids etc. can be used.
  • a two- or multi-color correlation measurement is preferably carried out.
  • so-called “molecular beacon” probes or primers can be used, which - if they are in free form - give a different measurement signal in terms of luminescence intensity or / and decay time than in the bound state.
  • the determination can comprise the measurement of an energy transfer which is caused by at least one luminescence marker as an energy donor and at least one luminescence marker as an acceptor.
  • the donor and acceptor are present in a complex containing the analyte and one or more detection reagents, preferably at least 2 detection reagents.
  • Another object of the invention is a device for determining an analyte by means of fluorescence correlation spectroscopy (FCS), in particular for carrying out the method
  • a carrier with at least one container for holding a sample liquid which contains the analyte to be determined,
  • an optical excitation device comprising luminescence in a measurement volume that is part of the sample liquid and
  • an optical detection device for detecting luminescence from the measurement volume, characterized in that the distance between the focusing optics and the measurement volume is> 1 mm and that the carrier is thermally insulated from the excitation device.
  • the carrier is preferably a microstructure with a plurality of preferably at least 10 2 containers for holding a sample liquid, the sample liquid in the separate containers being able to come from one or more sources.
  • the sample liquid can be introduced into the containers of the carrier, for example by means of a piezoelectric liquid dispensing device.
  • the containers of the carrier are designed in such a way that they enable the detection reagent to be bound with the analyte in solution.
  • the containers are preferably depressions in the carrier surface, whereby these depressions can in principle have any shape, for example circular, square, diamond-shaped, etc.
  • the carrier can also comprise 10 3 or more separate containers.
  • the optical excitation device comprises a strongly focused light source, preferably a laser beam, which is focused on the measurement volume in the sample liquid by means of corresponding optical devices.
  • the light source can also contain two or more laser beams, which are then focused on the measurement volume by different optics before entering the sample liquid.
  • the detection device can contain, for example, a fiber-coupled avalanche photodiode detector or an electronic detector.
  • excitation and / or detection Matrices consisting of a dot matrix of laser dots generated by diffractive optics or a quantum well laser and a detector matrix generated by an avalanche photodiode matrix or an electronic detector matrix, for example a CCD camera, can be used.
  • the carrier can be provided in a prefabricated form, with luminescence-labeled n a c h w e i s r e a g e n zi e n, prior to sw ei s e l u m i n e sz m a r ki e rte hybridization probes or primers being filled into several separate containers of the carrier.
  • the carrier containing the detection reagents is then advantageously dried.
  • a prefabricated carrier which comprises a plurality of separate, e.g. Contains 100 containers in which different detection reagents, e.g. Reagents for detection of nucleic acid hybridization, such as primers and / or probes, are present.
  • This carrier can then be mixed with an organism to be examined, e.g. a human patient, sample can be filled so that different analytes are determined from a single sample in the respective containers.
  • Such carriers can be used, for example, to create a gene expression profile, e.g. for the diagnosis of diseases or for the determination of nucleic acid polymorphisms, e.g. for the detection of an above-defined genetic predisposition.
  • Another object of the invention is a method for the determination of nucleic acid polymorphisms. This method is preferably used in combination with the aforementioned fluorescence correlation spectroscopy method, but it can also be applied to other types of single-molecule detection or to conventional detection methods.
  • This procedure includes the steps: (a) Provision of a nucleic acid template to be examined and two probes that bind to the template under hybridization conditions, the probes being selected such that
  • nucleotides at the 3'-end of the first probe and / or at the 5'-end of the second probe are complementary to the respective positions on the template if this has a first predetermined variant of the polymorphism and not complementary to the respective one
  • the nucleic acid polymorphism is a single nucleotide polymorphism (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the polymorphism can also relate to two or more nucleotides.
  • DNA of any origin for example from natural sources, but also recombinantly produced DNA or synthetic DNA can be used as the nucleic acid template.
  • the DNA preferably originates from an organism in which nucleic acid polymorphisms occur which are to be determined by the method.
  • the DNA is preferably used in single-stranded form, for example as a single-stranded cDNA. However, it is also possible to use double-stranded DNA, which is separated into single-stranded DNA by heating and then used for hybridization with the probes.
  • the hybridization probes preferably consist at least partially of single-stranded DNA.
  • the 3 'end of the first probe must be ligatable to the 5' end of the second probe, preferably using a DNA ligase.
  • the probes can also be made partially from nucleic acid analogs, e.g. Peptide nucleic acids.
  • the first probe contains a free 3'-OH group at the 3 'end and the second probe contains a 5'-phosphate group at the 5' end.
  • the first and the second probe preferably each carry a different marking group, the joint occurrence of which can be proven by a cross-correlation determination.
  • ligation product The presence of both different labeling groups in a single molecule (ligation product) can be detected separately from the presence in two separate molecules (first and second probe).
  • first and second probe The size differences between the ligation product and individual probes result in very different hybridization melting points and thus in a high sensitivity of the method. For example, if you carry out a melting point curve measurement of the hybrids, the cross-correlation disappears above the lowest melting point of an individual probe during the individual probes, while the
  • Ligation product up to much higher temperatures gives a cross-correlated signal.
  • Fluorescent labels such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, CY3, CY5 or derivatives thereof, are preferably used as labeling groups.
  • the fluorescent labeling groups can be differentiated using the emission wavelength, the lifetime of the excited states or a combination thereof.
  • the detection can preferably be carried out by means of single molecule determination, e.g. done with location and / or time-resolved fluorescence spectroscopy, which is able to detect fluorescence signals down to single photon counting in a very small volume element, such as in a microchannel or in a microwave.
  • the detection can be carried out by means of confocal single-molecule detection, such as by fluorescence correlation spectroscopy.
  • the detection can also be carried out by a time-resolved decay measurement, a so-called time gating, the fluorescence molecules being excited within a measurement volume and then preferably at a time interval of> 100 ps, the detection interval being opened at the photodetector.
  • This measurement method is described, for example, by Rigler et al. in: "Ultrafast Phenomena" D.H. Auston, ed. Springer 1984.
  • Figure 1A the schematic representation of a carrier (2) suitable for carrying out the method according to the invention with a large number of containers (4) formed in the form of depressions on the carrier for receiving sample liquid.
  • a carrier with an area of 1-2 cm 2 can contain, for example, up to 10 4 wells.
  • an excitation and detection device preferably arranged under the carrier base can be used.
  • This device can be a light source (6), e.g. contain a laser with which light can be irradiated into a measurement volume (10) within the sample liquid via an optical focusing device (8).
  • the luminescence beam em emitted by the measurement volume is directed via a optical focusing device (8; 8a) to a detector (1 2).
  • the measuring volume (10) is arranged at a working distance (14) of> 1 mm and preferably> 1 mm from the focusing device (8).
  • the carrier (2) is thermally isolated from the optical excitation and detection device, e.g. in that a gas phase region is arranged between the optical focusing device (8) and the carrier (2).
  • FIG. 1B the schematic representation of a particularly preferred embodiment for a carrier (20) suitable for carrying out the method according to the invention.
  • the carrier (20) also has a large number of separate containers (22) for holding a sample liquid.
  • a preferably convex lens element (24) is arranged in the beam path between the optical excitation and detection device (not shown) and the measurement volume (not shown) contained in the sample liquid.
  • This lens element advantageously has an anti-reflective coating (26).
  • Figure 2 the schematic representation of a particularly preferred, suitable for carrying out the method according to the invention (30) with a plurality of separate containers (32) for receiving Sample liquids.
  • the carrier further contains a temperature control element (34), for example a Peltier element.
  • the temperature control element is preferably arranged at least partially around the carrier circumference.
  • the containers (32) are provided with a cover (36) from the surroundings, which essentially isolates the sample liquid from the surroundings. Seals (not shown) can be used for this purpose, for example.
  • Figure 3 a plan view of the carrier (30) shown in Figure 2 with the temperature control element (34). This arrangement can optionally be attached to a frame holder (36) using additional heating or cooling elements (not shown).
  • Figure 4 the filling of the sample in a carrier (40) with separate containers (42a; 42b) via entrances (44a, 44b).
  • the containers (42a) and (42b) are separated by a barrier (46).
  • the barrier can be used as a permanent barrier or as a valve, e.g. a hydrophobic membrane valve permeable by pressurization.
  • the sample liquid can be poured into several containers at the same time or - after filling the first container - into the second container via a valve (46).
  • Figure 5 a particularly preferred embodiment for filling sample liquid into the carrier.
  • the sample liquid is fed from a reservoir (50), optionally integrated on the carrier itself, into feed containers (52) in parallel into sample containers (54). If necessary, the sample liquid can be passed from the container (54) via a valve (56) into a further container (58), i.e. parallel filling can be combined with serial filling.

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Abstract

The invention relates to a method for determining an analyte in a sample by means of fluorescence correlation spectroscopy. The distance between the measuring volumes in the sample and the optical stimulation/detection direction is ≥ 1 mm and the sample liquid is thermally isolated from the optical device. The inventive method is especially suitable for measuring temperature-changeable processes, e.g. determining nucleic acid hybridisation melting curves, or for carrying out nucleic acid amplification reactions. The invention also relates to a device for carrying out the inventive method.

Description

Bestimmung von Analyten durch Fluoreszenz-KorrelationsspektroskopieDetermination of analytes by fluorescence correlation spectroscopy

Beschreibungdescription

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, wobei der Abstand zwischen dem Messvolumen in der Probe und der optischen Anregungs-/ Detektionsrichtung > 1 mm beträgt und die Probenflussigkeit von der optischen Einrichtung thermisch isoliert ist. Das Verfahren eignet sich besonders zur Messung von temperaturveränderlichen Prozessen, z.B. der Bestimmung von Nukleinsäure-Hybridisierungsschmelzkurven oder zur Durchführung von Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen. Weiterhin wird eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung offenbart.The invention relates to a method for determining an analyte in a sample by fluorescence correlation spectroscopy, the distance between the measurement volume in the sample and the optical excitation / detection direction being> 1 mm and the sample liquid being thermally insulated from the optical device. The method is particularly suitable for measuring temperature-variable processes, e.g. the determination of nucleic acid hybridization melting curves or to carry out nucleic acid amplification reactions. Furthermore, a device suitable for performing the method according to the invention is disclosed.

Die Verwendung der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum Nachweis von Analyten ist bekannt. EP-B-0 679 251 offenbart Verfahren und Vorrichtungen zur Detektion von Analyten mittels Fluoreszenz- Spektroskopie, wobei die Bestimmung in einem Messvolumen durchgeführt wird, das Teil der zu untersuchenden Probe ist und wobei das Messvolumen in einem Arbeitsabstand von 1000 μ von einer optischen Fokussiervorrichtung angeordnet ist. Weiterhin steht die Fokussiereinrichtung entweder direkt mit der Probe in Kontakt oder ist lediglich durch eine optisch durchlässige Folie von der Probe getrennt. Bisher wurde angenommen, dass der geringe Abstand und der unmittelbare Kontakt zwischen Probe und optischer Vorrichtung ein notwendiges Merkmal bei der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie darstellt. Diese Anordnung hat jedoch den Nachteil, dass Prozesse, die mit einer Temperaturänderung der Probe einhergehen, nur unter großen Schwierigkeiten untersucht werden können. DE-A-36 42 798 offenbart ein Mikroskop mit einem Stativ, das auf einem Objekttisch verschiebbar gelagert ist, wobei die Antriebseinrichtung zur Vertikalverschiebung des Objekttisches eine unabhängige, von der Führungsvorrichtung beabstandete Abstützung des Objekttisches bildet. Die Temperatur des Mikroskops kann durch Zufuhr von Kühlluft und durch Einsetzen von Wärmeschutzfiltern reguliert werden. Es findet sich kein Hin weis auf die Verwendung in der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie.The use of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) for the detection of analytes is known. EP-B-0 679 251 discloses methods and devices for the detection of analytes by means of fluorescence spectroscopy, the determination being carried out in a measurement volume which is part of the sample to be examined and the measurement volume being at a working distance of 1000 μ from an optical focusing device is arranged. Furthermore, the focusing device is either in direct contact with the sample or is only separated from the sample by an optically transparent film. It has previously been assumed that the short distance and the direct contact between the sample and the optical device are a necessary feature in fluorescence correlation spectroscopy. However, this arrangement has the disadvantage that processes associated with a change in the temperature of the sample can only be examined with great difficulty. DE-A-36 42 798 discloses a microscope with a tripod which is displaceably mounted on an object table, the drive device for vertically displacing the object table forming an independent support of the object table spaced apart from the guide device. The temperature of the microscope can be regulated by supplying cooling air and by inserting heat protection filters. There is no reference to the use in fluorescence correlation spectroscopy.

GB-A-2 351 556 beschreibt ein Verfahren zur Messung von Strahlung, wobei mehrere konfokale optische Einzelkanalsysteme und fotoeiektrische Detektoren parallel angeordnet sind, um mehrere Ableseköpfe zu bilden, die nebeneinander angeordnet sind, um gleichzeitig Strahlung aus entsprechenden Bereichen auswerten zu können. Als Fokussieroptiken können 1 0 x Mikroskop-Objektive mit einer numerischen Apertur von 0,4, einer fokalen Länge von etwa 8 mm und einem Aperturdurchmesser von 5 mm verwendet werden. Es befindet sich keinerlei Hinweis darauf, dass die Fokussieroptiken von der Probe thermisch isoliert sein können.GB-A-2 351 556 describes a method for measuring radiation, in which a plurality of confocal single-channel optical systems and photoelectric detectors are arranged in parallel in order to form a plurality of reading heads which are arranged next to one another in order to be able to simultaneously evaluate radiation from corresponding areas. 10 x microscope objectives with a numerical aperture of 0.4, a focal length of about 8 mm and an aperture diameter of 5 mm can be used as focusing optics. There is no indication that the focusing optics can be thermally isolated from the sample.

DE-C-42 1 8 729 offenbart ein Kapillarelektrophoresegerät mit einem optischen ortsauflösenden Detektionssystem. Die Temperatur innerhalb der Kapillare kann thermostatisiert werden. Ein Hinweis auf die konfokale Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie findet sich nicht.DE-C-42 1 8 729 discloses a capillary electrophoresis device with an optical, spatially resolving detection system. The temperature inside the capillary can be thermostatted. There is no reference to confocal fluorescence correlation spectroscopy.

DE-A-1 97 48 21 1 beschreibt ein optisches System mit einem Linsenarray, das für die Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie eingesetzt werden kann. Zur Erzeugung konfokaler Volumenelemente in den Proben werden Linsen mit einer Brennweite von f = 7,5 und einer numerischen Apertur von 0,6 eingesetzt. Es findet sich keinerlei Hinweis auf eine thermische Isolierung der Fokussieroptik von der Probe.DE-A-1 97 48 21 1 describes an optical system with a lens array which can be used for fluorescence correlation spectroscopy. Lenses with a focal length of f = 7.5 and a numerical aperture of 0.6 are used to generate confocal volume elements in the samples. There is no indication of thermal isolation of the focusing optics from the sample.

DE-A-1 99 1 9 092 beschreibt eine Anordnung zur optischen Auswertung eines Gegenstandsarrays, die für die Fluoreszenzanalyse eingesetzt werden kann. Auch hier findet sich keinerlei Hinweis auf eine thermische Isolierung von Fokussieroptik und Proben.DE-A-1 99 1 9 092 describes an arrangement for the optical evaluation of an object array, which are used for fluorescence analysis can. Again, there is no evidence of thermal insulation of the focusing optics and samples.

Die der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung der Fluoreszenz- Korrelationssprektroskopie bereitzustellen, die diese Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise vermeiden.The object on which the present application is based was to provide methods and devices for carrying out fluorescence correlation spectroscopy which at least partially avoid these disadvantages of the prior art.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, umfassend die Schritte:The invention thus relates to a method for determining an analyte in a sample by fluorescence correlation spectroscopy, comprising the steps:

(a) Bereitstellen einer Probenflussigkeit in einem Träger,(a) providing a sample liquid in a carrier,

(b) Durchführen einer Lumineszenzmessung durch optische Anregung von lumineszierenden Molekülen in einem(b) performing a luminescence measurement by optical excitation of luminescent molecules in one

Messvolumen, das Teil der Probenflussigkeit ist, unterMeasurement volume, which is part of the sample liquid, below

Verwendung einer Lichtquelle mit Fokussieroptik und einesUse of a light source with focusing optics and one

Detektors zum Auffangen von Emissionsstrahlung aus demDetector for collecting emission radiation from the

Messvolumen, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen in der Probenflussigkeit und der Fokussieroptik der Lichtquelle > 1 mm beträgt und dass die Probenflussigkeit von der Lichtquelle und insbesondere von der Fokussieroptik thermisch isoliert ist.Measuring volume, characterized in that the distance between the measuring volume in the sample liquid and the focusing optics of the light source is> 1 mm and that the sample liquid is thermally insulated from the light source and in particular from the focusing optics.

Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Temperatur des Trägers und somit der Probe unabhängig von der optischen Anregungs- bzw. Detektionsvorrichtung und insbesondere deren Fokussieroptik, z.B. einem oder mehreren Mikroobjektiven, eingestellt und verändert werden kann.An important advantage of the method according to the invention is that the temperature of the carrier and thus of the sample is independent of the optical excitation or detection device and in particular its focusing optics, e.g. one or more micro lenses, can be set and changed.

Ansonsten kann das Verfahren grundsätzlich nach der in EP-B-0 679 251 beschriebenen Methode durchgeführt werden. Dabei erfolgt vorzugsweise die Messung von einem oder wenigen Analytmolekülen in einem Messvolumen, wobei die Konzentration der zu bestimmenden Anaiytmoleküle vorzugsweise < 1 0"14 l ist. Es werden stoffspezifische Parameter bestimmt, die durch Lumineszenzmessung an den Analytmolekülen ermittelt werden. Bei diesen Parametern kann es sich um Translationsdiffusions-Koeffi- zienten , Rotationsdiffusions-Koeffizienten oder/und um d ie Exzitationswellenlänge, die Emissionswellenlänge oder/und die Lebensdauer eines angeregten Zustandes eines lumineszierenden Moleküls oder die Kombination von einer oder mehrerer dieser Messgrößen handeln. Auf Einzelheiten zu apparativen Details wird auf die Offenbarung von EP 0 679 251 verwiesen.Otherwise, the method can basically be carried out according to the method described in EP-B-0 679 251. This is preferably done the measurement of one or a few analyte molecules in a measurement volume, the concentration of the analyte molecules to be determined preferably being <1 0 "14 l. Substance-specific parameters are determined which are determined by luminescence measurement on the analyte molecules. These parameters can be translation diffusions - Coefficients, rotational diffusion coefficients or / and the excitation wavelength, the emission wavelength or / and the lifetime of an excited state of a luminescent molecule or the combination of one or more of these measured variables EP 0 679 251.

Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen in der Probenflüssig- keit und der Fokussieroptik der Lichtquelle 1 mmm, vorzugsweise 1 ,5 bis 1 0 mm und besonders bevorzugt 2 bis 5 mm beträgt. Weiterhin ist bevorzugt, dass zwischen dem die Probenflussigkeit enthaltenden Träger und der optischen Fokussiereinrichtung ein Gasphasenbereich angeordnet ist, der Luft, Schutzgas oder Vakuum enthalten kann.An essential feature of the method according to the invention is that the distance between the measurement volume in the sample liquid and the focusing optics of the light source is 1 mm, preferably 1.5 to 10 mm and particularly preferably 2 to 5 mm. It is further preferred that a gas phase region is arranged between the carrier containing the sample liquid and the optical focusing device, which can contain air, protective gas or vacuum.

Der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Träger ist vorzugsweise eine MikroStruktur, die mehrere, vorzugsweise separate Behältnisse zur Aufnahme von Proben enthält. Das Volumen dieser Behältnisse liegt vorzugsweise im Bereich von 10"6 I und besonders bevorzugt 10'8 I. So kann der Träger eine Mikrowellstruktur mit mehreren Vertiefungen zur Aufnahme von Probeflüssigkeit umfassen, die beispielsweise einen Durchmesser zwischen 10 und 1 000 μm aufweisen. Geeignete MikroStrukturen sind z.B. in DE 100 23 421 .6 und DE 100 65 632.3 beschrieben. Weiterhin umfasst der Träger vorzugsweise mindestens ein Temperatur-Steuerungselement, z.B. ein Peltier-Element, welches eine Temperaturregelung des Träger oder/und einzelner Probenbehältnisse darin ermöglicht. Weiterhin ist der für das Verfahren verwendete Träger zweckmäßigerweise so ausgestaltet, dass er eine optische Detektion der Probe ermöglicht. Vorzugsweise wird daher ein zumindest im Bereich der Probenbehältnisse optisch transparenter Träger verwendet. Der Träger kann dabei entweder vollständig optisch transparent sein oder eine optisch transparente Basis und eine optisch undurchlässige Deckschicht mit Aussparungen in den Probenbehältnissen enthalten. Geeignete Materialien für Träger sind beispielsweise Verbundstoffträger aus Metall (z.B. Silizium für die Deckschicht) und Glas (für die Basis) . Derartige Träger können beispielsweise durch Aufbringen einer Metallschicht mit vorgegebenen Aussparungen für die Probenbehältnisse auf das Glas erzeugt werden. Alternativ können Plastikträger, z.B. aus Polystrol oder Polymeren auf Acrylat- oder Methacrylatbasis eingesetzt werden . Weiterhin ist bevorzugt, dass der Träger eine Abdeckung für die Probenbehältnisse aufweist, um während der Messung ein geschlossenes und von der Umgebung im Wesentlichen isoliertes System bereitzustellen.The carrier used to carry out the method according to the invention is preferably a microstructure which contains several, preferably separate containers for holding samples. The volume of these containers is preferably in the range of 10 6 I and particularly preferably 10 8 I. For example, the carrier can comprise a microwave structure with several recesses for receiving sample liquid, which for example have a diameter between 10 and 1000 μm. Suitable microstructures are described, for example, in DE 100 23 421 .6 and DE 100 65 632.3 Furthermore, the carrier preferably comprises at least one temperature control element, for example a Peltier element, which enables temperature control of the carrier and / or individual sample containers therein. Furthermore, the carrier used for the method is expediently designed such that it enables optical detection of the sample. A carrier which is optically transparent at least in the region of the sample containers is therefore preferably used. The carrier can either be completely optically transparent or contain an optically transparent base and an optically opaque cover layer with cutouts in the sample containers. Suitable materials for supports are, for example, composite supports made of metal (for example silicon for the cover layer) and glass (for the base). Such supports can be produced, for example, by applying a metal layer to the glass with predetermined cutouts for the sample containers. Alternatively, plastic carriers made, for example, of polystyrene or polymers based on acrylate or methacrylate can be used. It is further preferred that the carrier has a cover for the sample containers in order to provide a closed system which is essentially isolated from the surroundings during the measurement.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Träger verwendet, der ein Linsenelement enthält, das im Strahlengang zwischen Messvolumen und Lichtquelle bzw. Detektor der optischen Vorrichtung angeordnet ist. Beispielsweise kann das Linsenelement am Boden einer Mikrowellstruktur angebracht sein. Ein derartiges Linsenelement lässt sich beispielsweise durch Erhitzen und Formen eines Fotoresists unter Verwendung einer Master-Form, z.B. aus Metall wie Silizium, erzeugen und dann auf den Träger aufgebracht werden. Alternativ können - z.B. bei Verwendung von Trägern aus Vollplastikstruktur - die Linsenelemente in den Träger integriert, z.B. während der Herstellung durch Spritzgießen erzeugt werden. Durch Verwendung eines Linsenelements, vorzugsweise eines konvexen Linsenelements, kann die numerische Apertur der optischen Messanordnung vergrößert werden. Diese nummerische Apertur liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 1 ,2. Der Träger ist weiterhin vorzugsweise mit einem transparenten Antirefle- xionsüberzug beschichtet, um einen höheren Brechungsindex zu erzeugen. Als Antireflexionsüberzüge können beispielsweise transparente Oxide oder Nitride eingesetzt werden. Antireflexionsbeschichtungen werden vorzugsweise auch auf der Optik verwendet.In a particularly preferred embodiment, a carrier is used which contains a lens element which is arranged in the beam path between the measurement volume and the light source or detector of the optical device. For example, the lens element can be attached to the bottom of a microwave structure. Such a lens element can be produced, for example, by heating and shaping a photoresist using a master mold, for example made of metal such as silicon, and then applied to the carrier. Alternatively, the lens elements can be integrated into the carrier, for example when using carriers made of fully plastic structure, for example by injection molding during production. The numerical aperture of the optical measuring arrangement can be enlarged by using a lens element, preferably a convex lens element. This numerical aperture is preferably in the range from 0.5 to 1.2. The support is also preferably coated with a transparent anti-reflection coating in order to generate a higher refractive index. For example, transparent oxides or nitrides can be used as antireflection coatings. Anti-reflective coatings are preferably also used on the optics.

Weiterhin können im Träger elektrische Felder, insbesondere im Bereich der Probenbehältnisse erzeugt werden, um eine Konzentrierung der zu bestimmenden Analyten im Messvolumen zu erreichen. Beispiele für Elektroden, die zur Erzeugung solcher elektrischer Felder geeignet sind, sind z.B. in DE 1 01 03 304.4 beschrieben.Furthermore, electric fields can be generated in the carrier, in particular in the area of the sample containers, in order to achieve a concentration of the analytes to be determined in the measurement volume. Examples of electrodes which are suitable for generating such electric fields are e.g. described in DE 1 01 03 304.4.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt aufgrund der thermischen Entkopplung von Träger und Optik die Durchführung einer Bestimmung bei einer von der Umgebung verschiedenen Temperatur und insbesondere eine Veränderung der Temperatur während der Messung. Die räumliche Entkopplung von Träger und Optik erlaubt ein vereinfachtes Scannen von Trägern, insbesondere Mikrowellstrukturen mit mehreren separaten Probenbehältnissen.Due to the thermal decoupling of carrier and optics, the method according to the invention allows a determination to be carried out at a temperature different from the environment and, in particular, a change in the temperature during the measurement. The spatial decoupling of carrier and optics allows a simplified scanning of carriers, in particular microwave structures with several separate sample containers.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich zum Nachweis beliebiger Analyten geeignet. Vorzugsweise werden eine oder mehrere Analyt- bindende Substanzen der Probe zugegeben, die eine durch Lumineszenzmessung nachweisbare Markierungsgruppe, insbesondere Fluoreszenz- Markierungsgruppe tragen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst in diesem Fall vorzugsweise eine Bestimmung der Bindung der Markierungssubstanz an den nachzuweisenden Analyten. Dieser Nachweis kann beispielsweise durch Mobilitätsänderung der Markierungsgruppe auf Grund der Bindung an den Analyten bzw. durch Änderung der Lumineszenz der Markierungsgruppe (Intensität oder/und Abklingzeit) auf Grund der Bindung an den Analyten bzw. bei Verwendung mehrerer Markierungsgruppen durch die sogenannte Kreuzkorrelation erfolgen. Bei der Kreuzkorrelationsbestimmung werden mindestens zwei unterschiedliche Markierungen, insbesondere Fluoreszenzmarkierungen, eingesetzt, deren korreliertes Signal innerhalb des Messvolumens bestimmt wird. Diese Kreuzkorrelationsbestimmung ist beispielsweise bei Schwüle et al. (Biophys. J. 72 (1997), 1 878-1886) und Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 ( 1 998), 97-109) beschrieben.The method according to the invention is basically suitable for the detection of any analytes. One or more analyte-binding substances are preferably added to the sample, which carry a labeling group that can be detected by luminescence measurement, in particular a fluorescence labeling group. In this case, the method according to the invention preferably comprises determining the binding of the labeling substance to the analyte to be detected. This detection can take place, for example, by changing the mobility of the labeling group due to the binding to the analyte or by changing the luminescence of the labeling group (intensity or / and decay time) due to the binding to the analyte or by using several labeling groups by means of the so-called cross-correlation. at The cross-correlation determination uses at least two different markings, in particular fluorescence markings, the correlated signal of which is determined within the measurement volume. This cross-correlation determination is, for example, by Schwüle et al. (Biophys. J. 72 (1997), 1 878-1886) and Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1 998), 97-109).

Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, z.B. Nukleinsäuren, Proteinen oder anderen, in lebenden Organismen, insbesondere in Säugern wie dem Menschen vorkommenden, Analytmolekülen. Darüber hinaus können auch Analyten nachgewiesen werden, die in vitro aus biologischen Proben erzeugt worden sind, z.B. cDNA-Moleküle, die durch Reverse Transskription aus mRNA hergestellt worden sind, oder Proteine, die durch in vitro Translation aus mRNA bzw. aus DNA hergestellt worden sind. Weiterhin eignet sich das Verfahren zum Nachweis von Analyten, die aus Elemente einer Bibliothek vorliegen und vorbestimmte Charakteristika, z.B. Bindung an das Nachweisreagenz, zeigen sollen. Beispiele solcher Bibliotheken sind Phagenbibliotheken oder ribosomale Bibliotheken.The method according to the invention is particularly suitable for the detection of biomolecules, e.g. Nucleic acids, proteins or other analyte molecules occurring in living organisms, especially in mammals such as humans. In addition, analytes that have been generated in vitro from biological samples can also be detected, e.g. cDNA molecules which have been produced from mRNA by reverse transcription or proteins which have been produced from mRNA or from DNA by in vitro translation. The method is also suitable for the detection of analytes which are present from elements of a library and have predetermined characteristics, e.g. Binding to the detection reagent. Examples of such libraries are phage libraries or ribosomal libraries.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bestimmung eine Nukleinsäurehybridisierung, wobei eine oder mehrere lumineszenzmarkierte Sonden an eine Zielnukleinsäure als Analyten binden. Derartige Hybridisierungsverfahren können beispielsweise zur Analyse der Gen- expression, z.B. zur Ermittlung eines Genexpressionsprofils, zur Analyse von Mutationen, z.B. Einzelnukleotidpolymorphismen (SNP) eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich jedoch auch zur Bestimmung enzymatischer Reaktionen oder/und zur Bestimmung von Nukleinsäureamplifikationen, insbesondere in einem oder mehreren Thermocycling-Prozessen. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäure-Polγmorphismen sind in DE 100 56 226.4 und DE 100 65 631 .5 beschrieben. Dabei wird besonders bevorzugt eine Zwei- oder Mehrfarben-Kreuzkorrelationsbestimmung durchgeführt.In a particularly preferred embodiment, the determination comprises nucleic acid hybridization, one or more luminescence-labeled probes binding to a target nucleic acid as analytes. Such hybridization methods can be used, for example, to analyze gene expression, for example to determine a gene expression profile, to analyze mutations, for example single nucleotide polymorphisms (SNP). However, the method according to the invention is also suitable for determining enzymatic reactions and / or for determining nucleic acid amplifications, in particular in one or more thermocycling processes. Preferred methods for determining nucleic acid polymorphisms are in DE 100 56 226.4 and DE 100 65 631 .5. A two-color or multi-color cross-correlation determination is particularly preferably carried out.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bestimmung den Nachweis einer Protein-Protein- oder Protein-Ligand- Wechselwirkung, wobei als Proteinliganden z.B. niedermolekulare Wirkstoffe, Peptide, Nukleinsäuren etc. eingesetzt werden können. Auch für derartige Bestimmungen wird bevorzugt eine Zwei- oder Mehrfarbenkorre- lationsmessung durchgeführt.In a further particularly preferred embodiment, the determination comprises the detection of a protein-protein or protein-ligand interaction, the protein ligands being e.g. low molecular weight active substances, peptides, nucleic acids etc. can be used. For such determinations, a two- or multi-color correlation measurement is preferably carried out.

In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform können sogenannte "Molecular Beacon" Sonden oder Primer eingesetzt werden, die - wenn sie in freier Form vorliegen - ein hinsichtlich der Lumineszenzintensität oder/und -abklingzeit verschiedenes Messignal als in gebundenem Zustand ergeben.In an alternative preferred embodiment, so-called "molecular beacon" probes or primers can be used, which - if they are in free form - give a different measurement signal in terms of luminescence intensity or / and decay time than in the bound state.

In noch einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann die Bestimmung die Messung eines Energietransfers umfassen, der von mindestens einem Lumineszenzmarker als Energiedonor und mindestens einem Lumineszenzmarker als Akzeptor hervorgerufen wird. Donor und Akzeptor liegen in einem Komplex, enthaltend den Analyten und ein oder mehrere Nachweisreagenzien, vorzugsweise mindestens 2 Nachweisreagenzien, vor.In yet another alternative preferred embodiment, the determination can comprise the measurement of an energy transfer which is caused by at least one luminescence marker as an energy donor and at least one luminescence marker as an acceptor. The donor and acceptor are present in a complex containing the analyte and one or more detection reagents, preferably at least 2 detection reagents.

Ein weiterer Gegenstand der Erfinung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten mittels Fluoresznez-Korrelationsspektroskopie (FCS), insbesondere zur Durchführung des Verfahrens, umfassendAnother object of the invention is a device for determining an analyte by means of fluorescence correlation spectroscopy (FCS), in particular for carrying out the method

(a) einen Träger mit mindestens einem Behältnis zur Aufnahme einer Probenflussigkeit, die den zu bestimmenden Analyten enthält, (b) eine optische Anregungseinrichtung . umfassend eine Lumineszenz in einem Messvolumen, das ein Teil der Probenflussigkeit ist und(a) a carrier with at least one container for holding a sample liquid which contains the analyte to be determined, (b) an optical excitation device. comprising luminescence in a measurement volume that is part of the sample liquid and

(c) eine optische Detektionseinrichtung zum Nachweis von Lumineszenz aus dem Messvolumen, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen der Fokussieroptik und dem Messvolumen > 1 mm ist und dass der Träger von der Anregungseinrichtung thermisch isoliert ist.(c) an optical detection device for detecting luminescence from the measurement volume, characterized in that the distance between the focusing optics and the measurement volume is> 1 mm and that the carrier is thermally insulated from the excitation device.

Der Träger ist vorzugsweise eine MikroStruktur mit mehreren vorzugsweise mindestens 1 02 Behältnissen zur Aufnahme einer Probeflüssigkeit, wobei die Probeflüssigkeit in den separaten Behältnissen aus einer oder mehreren Quellen stammen kann. Das Einbringen der Probeflüssigkeit in die Behältnisse des Trägers kann z.B. mittels einer piezoelektrischen Flüssigkeitsabgabe-Vorrichtung erfolgen.The carrier is preferably a microstructure with a plurality of preferably at least 10 2 containers for holding a sample liquid, the sample liquid in the separate containers being able to come from one or more sources. The sample liquid can be introduced into the containers of the carrier, for example by means of a piezoelectric liquid dispensing device.

Die Behältnisse des Trägers sind so ausgestaltet, dass sie eine Bindung des Nachweisreagenz mit dem Analyten in Lösung ermöglichen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Behältnissen um Vertiefungen in der Trägeroberfläche, wobei diese Vertiefungen grundsätzlich eine beliebige Form aufweisen können, z.B. kreisförmig, quadratisch, rautenförmig etc. Der Träger kann auch 103 oder mehr separate Behältnisse umfassen.The containers of the carrier are designed in such a way that they enable the detection reagent to be bound with the analyte in solution. The containers are preferably depressions in the carrier surface, whereby these depressions can in principle have any shape, for example circular, square, diamond-shaped, etc. The carrier can also comprise 10 3 or more separate containers.

Die optische Anregungseinrichtung umfasst eine stark fokussierte Lichtquelle, vorzugsweise einen Laserstrahl, der mittels entsprechender optischer Einrichtungen auf das Messvolumen in der Probenflussigkeit fokussiert wird. Die Lichtquelle kann auch zwei oder mehrere Laserstrahlen enthalten, die dann jeweils vor Eintritt in die Probeflüssigkeit durch unterschiedliche Optiken auf das Messvolumen fokussiert wird. Die Detektionseinrichtung kann beispielsweise einen fasergekoppelten Avalanche-Fotodiodendetektor oder einen elektronischen Detektor enthalten. Es können jedoch auch Anregungs- oder/und Detektions- Matrices, bestehend aus einer Punktmatrix von Laserpunkten, erzeugt durch eine Diffraktionsoptik oder einen Quanten-Well-Laser sowie einer Detektormatrix, erzeugt durch eine Avalanche-Fotodiodenmatrix oder eine elektronische Detektormatrix, z.B. eine CCD-Kamera, verwendet werden.The optical excitation device comprises a strongly focused light source, preferably a laser beam, which is focused on the measurement volume in the sample liquid by means of corresponding optical devices. The light source can also contain two or more laser beams, which are then focused on the measurement volume by different optics before entering the sample liquid. The detection device can contain, for example, a fiber-coupled avalanche photodiode detector or an electronic detector. However, excitation and / or detection Matrices consisting of a dot matrix of laser dots generated by diffractive optics or a quantum well laser and a detector matrix generated by an avalanche photodiode matrix or an electronic detector matrix, for example a CCD camera, can be used.

Der Träger kann in vorgefertigter Form bereit gestellt werden, wobei in mehrere separate Behältnisse des Trägers lumineszenzmarkierte N a c h w e i s r e a g e n zi e n , v o rzu g sw ei s e l u m i n e sze n zm a r ki e rte Hybridisierungssonden bzw. -primer eingefüllt werden. Anschließend wird der die Nachweisreagenzien enthaltende Träger günstigerweise getrocknet.The carrier can be provided in a prefabricated form, with luminescence-labeled n a c h w e i s r e a g e n zi e n, prior to sw ei s e l u m i n e sz m a r ki e rte hybridization probes or primers being filled into several separate containers of the carrier. The carrier containing the detection reagents is then advantageously dried.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein vorgefertigter Träger bereitgestellt, der eine Vielzahl von separaten, z.B. 100 Behältnissen enthält, in die jeweils unterschiedliche Nachweisreagenzien, z.B. Reagenzien zum Nachweis einer Nukleinsäurehybridisierung wie Primer oder/und Sonden eingefüllt vorliegen. Dieser Träger kann dann mit einer aus einem zu untersuchenden Organismus, z.B. einem menschlichen Patienten, stammenden Probe gefüllt werden, so dass in den jeweiligen Behältnissen unterschiedliche Analyten aus einer einzigen Probe bestimmt werden. Derartige Träger können beispielsweise zur Erstellung eines Genexpressionsprofils, z.B. für die Diagnostik von Krankheiten, oder zur Bestimmung von Nukleinsäurepolymorphismen, z.B. zum Nachweis einer Obestimmten genetischen Prädisposition, verwendet werden.In a preferred embodiment of the invention, a prefabricated carrier is provided which comprises a plurality of separate, e.g. Contains 100 containers in which different detection reagents, e.g. Reagents for detection of nucleic acid hybridization, such as primers and / or probes, are present. This carrier can then be mixed with an organism to be examined, e.g. a human patient, sample can be filled so that different analytes are determined from a single sample in the respective containers. Such carriers can be used, for example, to create a gene expression profile, e.g. for the diagnosis of diseases or for the determination of nucleic acid polymorphisms, e.g. for the detection of an above-defined genetic predisposition.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäurepolymorphismen. Dieses Verfahren wird vorzugsweise in Kombination mit dem zuvor genannten Fluoreszenz- Korrelationssprektroskopie-Verfahren verwendet, es kann jedoch auch auf andere Arten des Einzelmolekülnachweises oder auf konventionelle Nachweisverfahren angewendet werden.Another object of the invention is a method for the determination of nucleic acid polymorphisms. This method is preferably used in combination with the aforementioned fluorescence correlation spectroscopy method, but it can also be applied to other types of single-molecule detection or to conventional detection methods.

Dieses Verfahren umfasst die Schritte: (a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Nukleinsäurematrize und zwei an die Matrize unter Hybridisierungsbedingungen bindenden Sonden, wobei die Sonden so gewählt werden, dassThis procedure includes the steps: (a) Provision of a nucleic acid template to be examined and two probes that bind to the template under hybridization conditions, the probes being selected such that

(i) sie unmittelbar nebeneinander an die Matrize binden, so dass das 3'-Ende der ersten Sonde direkt dem 5'-Ende der zweiten Sonde benachbart ist, (ii) für das 3'-Ende der ersten Sonde oder/und das 5'-Ende der zweiten Sonde solche Positionen gewählt werden, an denen das Auftreten eines Polymorphismus auf der Matrize zu erwarten ist,(i) bind them directly next to one another so that the 3 'end of the first probe is directly adjacent to the 5' end of the second probe, (ii) for the 3 'end of the first probe or / and the 5th At the end of the second probe, positions are selected at which a polymorphism is to be expected on the matrix,

(iii) die Nukleotide am 3'-Ende der ersten Sonde oder/und am 5'-Ende der zweiten Sonde komplementär zu den jeweiligen Positionen auf der Matrize sind, wenn diese eine erste vorbestimmte Variante des Polymorphismus ausf weist und nicht komplementär zu den jeweiligen(iii) the nucleotides at the 3'-end of the first probe and / or at the 5'-end of the second probe are complementary to the respective positions on the template if this has a first predetermined variant of the polymorphism and not complementary to the respective one

Positionen auf der Matrize sind, wenn diese eine andere Variante des Polymorphismus aufweist,Positions on the matrix, if it has another variant of the polymorphism,

(b) Hybridisieren der Sonden an die Matrize,(b) hybridizing the probes to the template,

(c) Behandeln des Hybridisierungskomplexes, umfassend die Matrize und die daran gebundenen ersten und zweiten Sonden mit einer Ligase unter Bedingungen, dass eine Ligation der ersten und zweiten Sonden selektiv nur dann erfolgt, wenn das Nukleotid am 3'-Ende der ersten Sonde und das Nukleotid am 5'-Ende der zweiten Sonde komplementär zu den jeweiligen Positionen der Matrize sind, und(c) treating the hybridization complex comprising the template and the first and second probes bound thereto with a ligase under conditions that the first and second probes are only ligated selectively if the nucleotide at the 3 ′ end of the first probe and the Nucleotide at the 5 'end of the second probe are complementary to the respective positions of the template, and

(d) Nachweisen, ob eine Ligation zwischen den ersten und zweiten Sonden stattgefunden hat, um die auf der Matrize vorliegende Variante des Polymorphismus zu bestimmen.(d) Evidence of ligation between the first and second probes to determine the variant polymorphism present on the template.

Bei dem Nukleinsäurepolymorphismus handelt es sich im einfachsten Fall um einen Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP). Der Polymorphismus kann aber auch zwei oder mehrere Nukleotide betreffen. Als Nukleinsäurematrize kann DNA beliebiger Herkunft, beispielsweise aus natürlichen Quellen, aber auch rekombinant hergestellte DNA oder synthetische DNA verwendet werden. Vorzugsweise stammt die DNA aus einem Organismus, bei dem Nukleinsäurepolymorphismen vorkommen, die durch das Verfahren bestimmt werden sollen. Die DNA wird bevorzugt in einzelstränger Form verwendet, z.B. als einzelsträngige cDNA. Es ist jedoch auch möglich, doppelsträngige DNA einzusetzen, die durch Erhitzen in einzelsträngige DNA aufgetrennt und dann zur Hybridisierung mit den Sonden eingesetzt wird.In the simplest case, the nucleic acid polymorphism is a single nucleotide polymorphism (SNP). The polymorphism can also relate to two or more nucleotides. DNA of any origin, for example from natural sources, but also recombinantly produced DNA or synthetic DNA can be used as the nucleic acid template. The DNA preferably originates from an organism in which nucleic acid polymorphisms occur which are to be determined by the method. The DNA is preferably used in single-stranded form, for example as a single-stranded cDNA. However, it is also possible to use double-stranded DNA, which is separated into single-stranded DNA by heating and then used for hybridization with the probes.

Die Hybridisierungssonden bestehen bevorzugt zumindest teilweise aus einzelsträngiger DNA. Auf jeden Fall muss das 3'-Ende der ersten Sonde an das 5'-Ende der zweiten Sonde ligierbar sein, vorzugsweise unter Verwendung einer DNA-Ligase. Die Sonden können jedoch auch teilweise aus Nukleinsäureanaloga, z.B. Peptidnukleinsäuren, ausgebildet sein. Vorzugsweise enthält die erste Sonde eine freie 3'-OH Gruppe am 3'-Ende und die zweite Sonde eine 5'-Phosphatgruppe am 5'-Ende.The hybridization probes preferably consist at least partially of single-stranded DNA. In any event, the 3 'end of the first probe must be ligatable to the 5' end of the second probe, preferably using a DNA ligase. However, the probes can also be made partially from nucleic acid analogs, e.g. Peptide nucleic acids. Preferably, the first probe contains a free 3'-OH group at the 3 'end and the second probe contains a 5'-phosphate group at the 5' end.

Vorzugsweise tragen die erste und die zweite Sonde jeweils eine unterschiedliche Markierungsgruppe, deren gemeinsames Auftreten durch eine Kreuzkorrelationsbestimmung nachweisbar ist. Dies heißt, dass dasThe first and the second probe preferably each carry a different marking group, the joint occurrence of which can be proven by a cross-correlation determination. This means that

Vorhandensein beider unterschiedlicher Markierungsgruppen in einem einzigen Molekül (Ligationsprodukt) getrennt vom Vorhandensein in zwei separaten Molekülen (erste und zweite Sonde) nachweisbar ist. Die Größenunterschiede zwischen Ligationsprodukt und einzelnen Sonden resultieren in stark unterschiedlichen Hybridisierungs-Schmelzpunkten und somit in einer hohen Empfindlichkeit des Verfahrens. Wenn man beispielsweise eine Schmelzpunktkurvenmessung der Hybride durchführt, verschwindet bei den Einzelsonden die Kreuzkorrelation schon oberhalb des niedrigsten Schmelzpunkts einer Einzelsonde, während dasThe presence of both different labeling groups in a single molecule (ligation product) can be detected separately from the presence in two separate molecules (first and second probe). The size differences between the ligation product and individual probes result in very different hybridization melting points and thus in a high sensitivity of the method. For example, if you carry out a melting point curve measurement of the hybrids, the cross-correlation disappears above the lowest melting point of an individual probe during the individual probes, while the

Ligationsprodukt noch bis zu wesentlich höheren Temperaturen (bis zu seinem Schmelzpunkt, der vorzugsweise > 10°C höher ist) ein kreuzkorreliertes Signal ergibt.Ligation product up to much higher temperatures (up to its melting point, which is preferably> 10 ° C higher) gives a cross-correlated signal.

Vorzugweise werden als Markierungsgruppen Fluoreszenzmarkierungen verwendet, wie etwa Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, CY3, CY5 oder Derivate davon. Die Unterscheidung der Fluoreszenzmarkierungsgruppen kann über die Emissionswellenlänge, über die Lebensdauer der angeregten Zustände oder über eine Kombination davon erfolgen.Fluorescent labels, such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, CY3, CY5 or derivatives thereof, are preferably used as labeling groups. The fluorescent labeling groups can be differentiated using the emission wavelength, the lifetime of the excited states or a combination thereof.

Wie bereits ausgeführt, kann der Nachweis vorzugsweise mittels Einzelmolekülbestimmung, z.B. mit orts- oder/und zeitaufgelöster Fluoreszenz-Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement, wie etwa in einem Mikrokanal oder in einem Mikrowell, Fluoreszenzsignale bis hinunter zur Einzelphotonenzählung zu erfassen.As already stated, the detection can preferably be carried out by means of single molecule determination, e.g. done with location and / or time-resolved fluorescence spectroscopy, which is able to detect fluorescence signals down to single photon counting in a very small volume element, such as in a microchannel or in a microwave.

Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetektion, wie etwa durch Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie, erfolgen. Alternativ kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time-Gating erfolgen, wobei die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von > 100 ps das Öffnen eines Detektionsintervalls am Photodetektor erfolgt. Diese Messmethode ist beispielsweise von Rigler et al. in: "Ultrafast Phenomena" D. H. Auston, Hrsg. Springer 1984, beschrieben.For example, the detection can be carried out by means of confocal single-molecule detection, such as by fluorescence correlation spectroscopy. Alternatively, the detection can also be carried out by a time-resolved decay measurement, a so-called time gating, the fluorescence molecules being excited within a measurement volume and then preferably at a time interval of> 100 ps, the detection interval being opened at the photodetector. This measurement method is described, for example, by Rigler et al. in: "Ultrafast Phenomena" D.H. Auston, ed. Springer 1984.

Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden. Es zeigen:The present invention is further to be explained by the following figures. Show it:

Figur 1A: die schematische Darstellung eines zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Trägers (2) mit einer Vielzahl von in Form von Vertiefungen auf dem Träger ausgebildeten Behältnissen (4) zur Aufnahme von Probenflussigkeit. Ein Träger mit einer Fläche von 1 - 2 cm2 kann beispielsweise bis zu 1 04 Vertiefungen enthalten.Figure 1A: the schematic representation of a carrier (2) suitable for carrying out the method according to the invention with a large number of containers (4) formed in the form of depressions on the carrier for receiving sample liquid. A carrier with an area of 1-2 cm 2 can contain, for example, up to 10 4 wells.

Für den Nachweis eines Analyten in einem Behältnis (4) kann eine vorzugsweise unter der Trägerbasis angeordnete Anregungs- und Detektionsvorrichtung eingesetzt werden. Diese Vorrichtung kann eine Lichtquelle (6), z.B. einen Laser enthalten, mit der über eine optische Fokussiereinrichtung (8) Licht in ein Messvolumen ( 1 0) innerhalb der Probenflussigkeit eingestrahlt werden kann. Die vom Messvolumen emittierte Lumi neszenzstrahl un g wird über di e o ptisc he Fokussiereinrichtung (8;8a) zu einem Detektor ( 1 2) geleitet. Das Messvolumen (10) ist in einem Arbeitsabstand ( 14) von > 1 mm und vorzugsweise > 1 mm von der Fokussiereinrichtung (8) angeordnet. Weiterhin ist der Träger (2) von der optischen Anregungs- und Detektionsvorrichtung thermisch isoliert, z.B. dadurch, dass zwischen der optischen Fokussiereinrichtung (8) und dem Träger (2) ein Gasphasenbereich angeordnet ist.For the detection of an analyte in a container (4), an excitation and detection device preferably arranged under the carrier base can be used. This device can be a light source (6), e.g. contain a laser with which light can be irradiated into a measurement volume (10) within the sample liquid via an optical focusing device (8). The luminescence beam em emitted by the measurement volume is directed via a optical focusing device (8; 8a) to a detector (1 2). The measuring volume (10) is arranged at a working distance (14) of> 1 mm and preferably> 1 mm from the focusing device (8). Furthermore, the carrier (2) is thermally isolated from the optical excitation and detection device, e.g. in that a gas phase region is arranged between the optical focusing device (8) and the carrier (2).

Figur 1 B: die schematische Darstellung einer besonders bevorzugten Ausführungsform für einen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Träger (20). Auch der Träger (20) besitzt eine Vielzahl von separaten Behältnissen (22) zur Aufnahme einer Probenflussigkeit. Zusätzlich ist im Strahlengang zwischen der optischen Anregungs- und Detektionsvorrichtung (nicht gezeigt) und dem in der Probenflussigkeit enthaltenen Messvolumen (nicht gezeigt) ein vorzugsweise konvexes Linsenelement (24) angeordnet. Dieses Linsenelement weist günstigerweise einen anti-reflektierenden Überzug (26) auf.1B: the schematic representation of a particularly preferred embodiment for a carrier (20) suitable for carrying out the method according to the invention. The carrier (20) also has a large number of separate containers (22) for holding a sample liquid. In addition, a preferably convex lens element (24) is arranged in the beam path between the optical excitation and detection device (not shown) and the measurement volume (not shown) contained in the sample liquid. This lens element advantageously has an anti-reflective coating (26).

Figur 2: die schematische Darstellung eines besonders bevorzugten, für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Trägers (30) mit einer Vielzahl von separaten Behältnissen (32) zur Aufnahme von Probenflüssigkeiten. Der Träger enthält weiterhin ein Temperatursteuerungselement (34), z.B. ein Peltier-Element. Das Temperatursteuerungselement ist vorzugsweise zumindest teilweise um den Trägerumfang herum angeordnet. Um eine temperaturveränderliche Bestimmung zu ermöglichen, sind die Behältnisse (32) von der Umgebung mit einer Abdeckung (36) versehen, die die Probenflussigkeit im Wesentlichen von der Umgebung isoliert. Hierzu können beispielsweise Dichtungen (nicht gezeigt) eingesetzt werden.Figure 2: the schematic representation of a particularly preferred, suitable for carrying out the method according to the invention (30) with a plurality of separate containers (32) for receiving Sample liquids. The carrier further contains a temperature control element (34), for example a Peltier element. The temperature control element is preferably arranged at least partially around the carrier circumference. In order to enable a temperature-variable determination, the containers (32) are provided with a cover (36) from the surroundings, which essentially isolates the sample liquid from the surroundings. Seals (not shown) can be used for this purpose, for example.

Figur 3: eine Draufsicht auf den in Figur 2 dargestellten Träger (30) mit dem Temperatursteuerungselement (34) . Diese Anordnung kann gegebenenfalls unter Verwendung zusätzlicher Heiz- oder Kühlelemente (nicht gezeigt) auf einem Rahmenhalter (36) angebracht werden.Figure 3: a plan view of the carrier (30) shown in Figure 2 with the temperature control element (34). This arrangement can optionally be attached to a frame holder (36) using additional heating or cooling elements (not shown).

Figur 4: das Einfüllen der Probe in einen Träger (40) mit separaten Behältnissen (42a; 42b) über Zugänge (44a, 44b). Die Behältnisse (42a) und (42b) sind durch eine Barriere (46) getrennt. Die Barriere kann als permanente Barriere oder als Ventil, z.B. ein durch Druckbeaufschlagung permeables hydrophobes Membranventil, ausgebildet sein. Die Probenflussigkeit kann gleichzeitig in mehrere Behältnisse oder - nach Füllen des ersten Behältnisses - über ein Ventil (46) in das zweite Behältnis eingefüllt werden.Figure 4: the filling of the sample in a carrier (40) with separate containers (42a; 42b) via entrances (44a, 44b). The containers (42a) and (42b) are separated by a barrier (46). The barrier can be used as a permanent barrier or as a valve, e.g. a hydrophobic membrane valve permeable by pressurization. The sample liquid can be poured into several containers at the same time or - after filling the first container - into the second container via a valve (46).

Figur 5: eine besonders bevorzugte Ausführungsform für das Einfüllen von Probenflussigkeit in den Träger. Die Probenflussigkeit wird aus einem, gegebenenfalls auf dem Träger selbst integrierten, Reservoir (50) über Zuleitungen (52) jeweils parallel in Probenbehältnisse (54) geleitet. Gegebenenfalls kann die Probenflussigkeit aus dem Behältnis (54) über ein Ventil (56) in ein weiteres Behältnis (58) geleitet werden, d.h. die parallele Befüllung kann mit einer seriellen Befüllung kombiniert werden. Figure 5: a particularly preferred embodiment for filling sample liquid into the carrier. The sample liquid is fed from a reservoir (50), optionally integrated on the carrier itself, into feed containers (52) in parallel into sample containers (54). If necessary, the sample liquid can be passed from the container (54) via a valve (56) into a further container (58), i.e. parallel filling can be combined with serial filling.

Claims

Ansprüche Expectations 1 . Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, umfassend die Schritte:1 . A method for determining an analyte in a sample by fluorescence correlation spectroscopy, comprising the steps: (a) Bereitstellen einer Probenflussigkeit in einem Träger,(a) providing a sample liquid in a carrier, (b) Durchführen einer Lumineszenzmessung durch optische Anregung von lumineszierenden Molekülen in einem Messvolumen, das Teil der Probenflussigkeit ist, unter Verwendung einer Lichtquelle mit Fokussieroptik und eines(b) performing a luminescence measurement by optical excitation of luminescent molecules in a measurement volume which is part of the sample liquid, using a light source with focusing optics and one Detektors zum Auffangen von Emissionsstrahlung aus dem Messvolumen, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen dem Messvolumen in der Probenflussigkeit und der Fokussiereinrichtung der LichtquelleDetector for collecting emission radiation from the measurement volume, characterized in that the distance between the measurement volume in the sample liquid and the focusing device of the light source ≥ 1 mm beträgt und dass die Probenflussigkeit von der Lichtquelle und insbesondere von der Fokussieroptik thermisch isoliert ist.≥ 1 mm and that the sample liquid is thermally isolated from the light source and in particular from the focusing optics. 2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand 1 bis 10 mm, vorzugsweise 2 bis 5 mm beträgt.2. The method according to claim 1, characterized in that the distance is 1 to 10 mm, preferably 2 to 5 mm. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Träger und der Fokussieroptik ein3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that between the carrier and the focusing optics Gasphasenbereich angeordnet ist.Gas phase area is arranged. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Linsenelement enthält, das im Strahlengang zwischen Messvolumen und Lichtquelle bzw. Detektor angeordnet ist. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the carrier contains a lens element which is arranged in the beam path between the measurement volume and the light source or detector. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Messanordnung eine numerische Apertur von 0,5 bis 1 ,2 aufweist.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the optical measuring arrangement has a numerical aperture of 0.5 to 1, 2. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger mehrere, vorzugsweise mindestens 102 separate Behältnisse zur Aufnahme von Proben enthält.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the carrier contains several, preferably at least 10 2 separate containers for holding samples. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Mikrowellstruktur mit mehreren Vertiefungen umfasst, die vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 1 0 und 1 000 μπ aufweisen.7. The method according to claim 6, characterized in that the carrier comprises a microwave structure with a plurality of depressions, which preferably have a diameter between 1 0 and 1 000 μπ. 8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger mindestens ein Temperatursteuerungselement umfasst.8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the carrier comprises at least one temperature control element. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung zumindest teilweise bei einer von der Umgebung verschiedenen Temperatur durchgeführt wird.9. The method according to claim 8, characterized in that the determination is carried out at least partially at a temperature different from the environment. 10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur während der Messung verändert wird. 10. The method according to claim 8 or 9, characterized in that the temperature is changed during the measurement. 1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung die Bindung von mindestens einem lumineszenzmarkierten Nachweisreagenz an den Analyten umfasst.1 1. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the determination comprises the binding of at least one luminescence-labeled detection reagent to the analyte. 1 2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung eine Nukleinsäure-Hybridisierung umfasst, wobei eine oder mehrere lumineszenzmarkierte Sonden an eine Zielnukleinsäure binden.1 2. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the determination comprises a nucleic acid hybridization, wherein one or more luminescence-labeled probes bind to a target nucleic acid. 1 3. Verfahren nach Anspruch 1 1 oder 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung die Messung eines kreuzkorrelierten Signals umfasst, das von einem, mindestens 2 unterschiedliche1 3. The method according to claim 1 1 or 1 2, characterized in that the determination comprises the measurement of a cross-correlated signal, the one of at least 2 different Lumineszenzmarkierungen enthaltenden, Komplex aus Analyt und Nachweisreagenz(ien) stammt.Containing luminescent labels, complex of analyte and detection reagent (s). 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung die Messung eines von mindestens einem lumineszenzmarkierten Nachweisreagenz stammenden Signals umfasst, wobei die Lumineszenzintensität oder/und -abklingzeit des Nachweisreagenz bei Bindung an den Analyten verschieden als im nichtgebundenen Zustand ist.14. The method according to any one of claims 1 1 to 1 3, characterized in that the determination comprises the measurement of a signal originating from at least one luminescence-labeled detection reagent, the luminescence intensity or / and decay time of the detection reagent when bound to the analyte being different than in the unbound Condition is. 1 5. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterschiede der Lumineszenzintensität oder/und - abklingzeit durch Quench- oder Energietransfervorgänge hervorgerufen werden. 1 5. The method according to claim 14, characterized in that the differences in the luminescence intensity or / and - decay time are caused by quench or energy transfer processes. 1 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung die Messung eines Energietransfers umfasst, der von mindestens einem Lumineszenzmarker als Donor und von mindestens einem Lumineszenzmarker als Akzeptor stammt, die in einem Komplex aus Analyt und einem oder mehreren Nachweisreagenzien vorliegen.1 6. The method according to any one of claims 1 1 to 1 5, characterized in that the determination comprises the measurement of an energy transfer that comes from at least one luminescent marker as a donor and from at least one luminescent marker as an acceptor, which is in a complex of analyte and a or more detection reagents are present. 1 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung eine enzymatische Reaktion umfasst.1 7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the determination comprises an enzymatic reaction. 1 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung eine Nukleinsäure-Amplifikation, insbesondere einen oder mehrere Thermocycling-Prozesse umfasst.1 8. The method according to any one of claims 1 2 to 1 7, characterized in that the determination comprises a nucleic acid amplification, in particular one or more thermocycling processes. 1 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung eine Mutationsanalyse bei Nukleinsäuren umfasst.1 9. The method according to any one of claims 1 2 to 1 8, characterized in that the determination comprises a mutation analysis for nucleic acids. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung eine Genexpressionsanalyse bei Nukleinsäuren umfasst.20. The method according to any one of claims 1 2 to 1 9, characterized in that the determination comprises a gene expression analysis for nucleic acids. 21 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 2 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung die Messung einer temperaturabhängigen21. Method according to one of claims 1 2 to 20, characterized in that the determination is the measurement of a temperature-dependent Schmelzkurve bei einer Nukleinsäure-Hybridisierung umfasst. Melting curve in a nucleic acid hybridization comprises. 22. Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten mittels Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie (FCS), insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , umfassend22. Device for determining an analyte by means of fluorescence correlation spectroscopy (FCS), in particular for carrying out the method according to one of claims 1 to 21, comprising (a) einen Träger mit mindestens einem Behältnis zur Aufnahme einer Probenflussigkeit, die den zu bestimmenden Analyten enthält,(a) a carrier with at least one container for holding a sample liquid which contains the analyte to be determined, (b) eine optische Anregungseinrichtung umfassend eine Lichtquelle und eine Fokussieroptik zur Anregung von Lumineszenz in einem Messvolumen, das ein Teil der Probeflüssigkeit ist und(b) an optical excitation device comprising a light source and focusing optics for excitation of luminescence in a measurement volume which is part of the sample liquid and (c) eine optische Detektionseinrichtung zum Nachweis von Lumineszenz aus dem Messvolumen, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand zwischen der Fokussieroptik und dem Messvolumen > 1 mm ist und dass der Träger von der(c) an optical detection device for the detection of luminescence from the measurement volume, characterized in that the distance between the focusing optics and the measurement volume is> 1 mm and that the carrier of the Anregungseinrichtung thermisch isoliert ist.Excitation device is thermally insulated. 23. Verfahren zur Bestimmung von Nukleinsäurepolymorphismen, umfassend die Schritte:23. A method for determining nucleic acid polymorphisms, comprising the steps: (a) Bereitstellen einerzu untersuchenden Nukleinsäurematrize und zwei an die Matrize unter Hybridisierungsbedingungen bindenden Sonden, wobei die Sonden so gewählt werden, dass (i) sie unmittelbar nebeneinander an die Matrize binden, so dass das 3'-Ende der ersten Sonde direkt dem 5'-Ende der zweiten Sonde benachbart ist,(a) providing a nucleic acid template to be examined and two probes binding to the template under hybridization conditions, the probes being selected such that (i) they bind to the template directly next to one another so that the 3 'end of the first probe is directly connected to the 5' -End of the second probe is adjacent, (ii) für das 3'-Ende der ersten Sonde oder/und das 5'-Ende der zweiten Sonde solche Positionen gewählt werden, an denen das Auftreten eines Polymorphismus auf der(ii) for the 3 'end of the first probe and / or the 5' end of the second probe, such positions are selected at which the occurrence of a polymorphism on the Matrize zu erwarten ist, (iii) die Nukleotide am 3'-Ende der ersten Sonde oder/und am 5'-Ende der zweiten Sonde komplementär zu den jeweiligen Positionen auf der Matrize sind, wenn diese eine erste vorbestimmte Variante des Polymorphismus ausfweist und nicht komplementär zu den jeweiligenDie is expected (iii) the nucleotides at the 3'-end of the first probe and / or at the 5'-end of the second probe are complementary to the respective positions on the template, if this shows a first predetermined variant of the polymorphism and not complementary to the respective one Positionen auf der Matrize sind, wenn diese eine andere Variante des Polymorphismus aufweist,Positions on the matrix, if it has another variant of the polymorphism, (b) Hybridisieren der Sonden an die Matrize,(b) hybridizing the probes to the template, (c) Behandeln des Hybridisierungskomplexes umfassend die Matrize und die daran gebundenen ersten und zweiten Sonden mit einer Ligase unter Bedingungen, dass eine Ligation der ersten und zweiten Sonden selektiv nur dann erfolgt, wenn das Nukleotid am 3'-Ende der ersten Sonde und das Nukleotid am 5'-Ende der zweiten Sonde komplementär zu den jeweiligen Positionen der Matrize sind, und(c) Treating the hybridization complex comprising the template and the attached first and second probes with a ligase under conditions that the first and second probes are only ligated selectively if the nucleotide at the 3 'end of the first probe and the nucleotide at the 5 'end of the second probe are complementary to the respective positions of the die, and (d) Nachweisen, ob eine Ligation zwischen den ersten und zweiten Sonden stattgefunden hat, um die auf der Matrize vorliegende Variante des Polymorphismus zu bestimmen. (d) Evidence of ligation between the first and second probes to determine the variant polymorphism present on the template.
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