[go: up one dir, main page]

WO2002072002A2 - Procedimiento para la preparación de mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reacción y kits que las contienen - Google Patents

Procedimiento para la preparación de mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reacción y kits que las contienen Download PDF

Info

Publication number
WO2002072002A2
WO2002072002A2 PCT/ES2002/000109 ES0200109W WO02072002A2 WO 2002072002 A2 WO2002072002 A2 WO 2002072002A2 ES 0200109 W ES0200109 W ES 0200109W WO 02072002 A2 WO02072002 A2 WO 02072002A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dried
reaction mixture
enzyme
reaction
totally
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2002/000109
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2002072002A3 (es
Inventor
Pedro Manuel Franco De Sarabia Rosado
Gemma LIMONES LÓPEZ
Antonio MADEJÓN SEIZ
María Dolores MARÍN ALBERDI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotools Biotechnological and Medical Laboratories SA
Original Assignee
Biotools Biotechnological and Medical Laboratories SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotools Biotechnological and Medical Laboratories SA filed Critical Biotools Biotechnological and Medical Laboratories SA
Priority to EP02714205.8A priority Critical patent/EP1374827B1/en
Priority to AU2002246125A priority patent/AU2002246125B2/en
Priority to JP2002570962A priority patent/JP4448280B2/ja
Priority to CA002408857A priority patent/CA2408857A1/en
Priority to BRPI0204479-0B1A priority patent/BR0204479B1/pt
Priority to IL152757A priority patent/IL152757A/en
Publication of WO2002072002A2 publication Critical patent/WO2002072002A2/es
Priority to US10/292,848 priority patent/US7919294B2/en
Publication of WO2002072002A3 publication Critical patent/WO2002072002A3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Definitions

  • the invention relates to the preparation of stabilized reaction mixtures, totally or partially dried, comprising at least one enzyme, by adding a stabilizing mixture to a solution containing the reaction mixture, and subsequent removal of the all or part of the water present in the resulting solution, as well as the resulting reaction mixtures and which comprise said reaction mixtures.
  • Deoxyribonucleic acids and ribonucleic acids (RNA) are long linear acromolecules responsible for the storage and transmission of genetic information. They consist of monomer units called nucleotides, each of which is formed by a nitrogen, pyric or pyrimidine base, a simple sugar (deoxyribose in the case of DNA and ribose in the case of RNA), and an inorganic phosphate.
  • nucleotides In a nucleic acid, the nucleotides are linked together by phosphodiester bonds through the sugar of adjacent nucleotides.
  • the nitrogenous bases are covalently bound to the sugar-phosphate skeleton.
  • Each nucleic acid mainly has four distinct nitrogen bases, two pyrimidines and two purines.
  • the purine bases are the same for both DNA and RNA, containing both adenine (A) and guanine (G).
  • both nucleic acids contain cytosine (C), the ti ina (T) being specific to DNA and the uracil (U) characteristic of RNA.
  • C cytosine
  • T ti ina
  • U uracil
  • the sequence of these nitrogenous bases determines the genetic information carried by nucleic acids, as well as their three-dimensional conformation.
  • RNA generally occurs in Nature as a simple polynucleotide chain
  • DNA normally presents itself as a double polynucleotide chain in which both chains have an antiparallel sense associated by hydrogen bonds formed between a complementary pyric base and a pyrimidine. each.
  • Nucleic acid amplification is the most widely used tool for the precise identification of a particular nucleic acid, consisting of the exponential multiplication of the initial amount of a specific or characteristic segment of the nucleic acid. That amplified segment can be used in subsequent applications such as cloning and restriction analysis.
  • Nucleic acid sequencing consists in determining the nucleotide sequence of a particular nucleic acid fragment.
  • restriction enzymes a technique that consists of the identification or characterization of a nucleic acid based on the differential sizes caused by endonucleases enzymes called restriction enzymes.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the PCR consists of a cyclic DNA amplification procedure whereby one or more specific DNA sequences contained in a nucleic acid or in a mixture of nucleic acids is exponentially amplified using two oligonucleotide primers that are specifically bind, by complementarity of bases, two opposite regions of the problem DNA that has previously been denatured by heat.
  • Each of the problem DNA strands to which their corresponding primer has been bound can be copied to the complementary DNA form by the action of a DNA polymerase activity, using the oligonucleotide as a polymerization reaction primer.
  • the repetition of successive cycles of this process achieves an exponential enrichment of the DNA fragment problem between the hybridization points of the oligonucleotides.
  • the use of thermostable DNA polymerases allows successive cycles of denaturation, ringing of the oligonucleotide to the substrate DNA and elongation of the chain, without adding new polymerase activity in each cycle. In case of analyzing the presence of a DNA with a relative abundance this process is sufficient for its identification.
  • RNA polymerase activities that require DNA molecules as a substrate
  • direct analysis of RNA molecules requires a previous reverse transcription step (RT or reverse transcription) by which a copy DNA molecule (cDNA) is synthesized ) complementary to the RNA problem.
  • the cDNA thus obtained can then be used as a substrate for an amplification reaction (Mocharla et al., Gene 93: 271-275 (1990)).
  • the amplification system used may be a simple reaction (RT-PCR) or a nested amplification (RT-nested PCR), depending on the relative abundance of the original substrate RNA.
  • RT-PCR simple reaction
  • RT-nested amplification a nested amplification
  • thermostable polymerase enzymes obtained from various thermophilic microorganisms such as Thermus aquaticus (Kaledin et al., Biokhimiya 45, 644-651 (1980); Chien et al., J. Bacteriol 127: 1550-1557 (1976); US Patent 4,889,818), and Thermus thermophil us (Ruttimann et al. Eur. J. Biochem. 149: 41-46 (1985)), among others.
  • thermostable DNA polymerase enzymes for example, those derived from T.
  • Thermostable enzymes in contrast to mesophilic proteins, do not become denatured against heat, moreover, they require high temperatures to carry out their activity. This is mainly due to the modifications in its amino acid sequence, which are transferred to its global folding or tertiary structure. These modifications are not drastic, but thermostability arises as a result of the sum of small enthalpy and entropic interactions that contribute synergistically to obtain a more rigid and heat resistant tertiary structure.
  • thermostable enzymes for all the above, it is evident that the preservation of the tertiary structure of thermostable enzymes, and consequently their activity and functionality, involves the preservation of the integrity of the interactions of the protein with the surrounding aqueous molecules, even in greater extent than non-thermostable mesophilic enzymes.
  • restriction enzymes One type of these restriction enzymes, the so-called type II, have the property of recognizing a certain nucleotide sequence of the DNA, causing the rupture of the bonds that link the nucleotides with each other within that particular sequence, thereby cutting the same DNA in precise and reproducible fragments, generating what is called a restriction map.
  • Type II enzymes are widely used in various molecular biology techniques, such as cloning, identification of specific sequences and DNA fragments, and restriction map analysis, among others (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, J. Sambrock et al , 2 nd Ed. 1989).
  • the activity of enzymes and other biological macromolecules depends mainly on their three-dimensional conformation, called the tertiary structure, so that if this three-dimensional conformation is modified by any factor, the biological activity or functionality of The macromolecule can decrease or even disappear.
  • Water forms a protective envelope around the biological macromolecules, stabilizing the tertiary structure of the macromolecules through hydrophobic / hydrophilic interactions. These interactions also block the reactive chemical groups that can be found on the surface of macromolecules.
  • peripheral reactive chemical groups can occur even once the macromolecules are desiccated, due to the plasticity of the media in which they are found, which is why a decrease in the biological activity or functionality of the dried macromolecules can be observed with the pass of the time. Consequently, the replacement of the aqueous envelope surrounding the macromolecules with protective agents that effectively replace the water molecules in its mission of maintaining the tertiary structures of the macromolecules and in its mission of stabilization and protection of surface reactive groups.
  • the usual method of conservation and transport of DNA polymerase enzymes and restriction enzymes mentioned above, as well as other enzymes used in molecular biology and for the aforementioned uses, comprise their freezing at -20 ° C, stabilizing them to withstand those low temperatures by mainly adding glycerol to its watery form
  • This method preserves the activity of the enzymes for several months with hardly any loss of activity as long as the storage temperature does not rise from -20 ° C so it is vital to preserve the cold chain, registering significant activity losses or inactivating Enzymes if this cold chain is interrupted for a few hours.
  • each of the components involved in the reaction that is, the enzyme DNA polymerase, the reaction buffer containing reaction-enhancing additives or stabilizers, the chloride of magnesium, or manganese chloride in case of RT, the oligonucleotides used as reaction primers, deoxyribonucleotides (dATP, dCTP, dGTP and dTTP), and the sample containing the nucleic acid to be amplified, are found separately, preserved by freezing as explained above, and must be mixed prior to the completion of the reaction, it being necessary to add and mix very small amounts (microliters) of each of them, resulting in frequent errors in the administration and pipetting of each of the reagents mentioned , which ends up generating an uncertainty about the reproducibility of the results obtained by applying these techniques, uncertainty especially worrying in the case of human diagnosis.
  • aerosols are produced that frequently produce cross-contamination between samples to be analyzed (Kwok, S. et al., Nature, 339: 237-238 (1989), generating false positive results, of great importance also in the case of human diagnosis.
  • Lyophilization is the main of these techniques of preservation by drying described, and is a method in which the elimination of water is achieved by freezing the wet product and subsequent sublimation of the ice under low pressure conditions.
  • Sublimation is the process by which a solid evaporates without going through the liquid state, so the term low pressure indicated above refers to a value of vapor pressure less than the triple point of water, vapor pressure in which the Water coexists in the solid, liquid and vapor states.
  • the solution or the product to be freeze-dried must be completely frozen, at a temperature and speed that depend on the type of material to be freeze dried.
  • the equipment necessary to lyophilize is expensive, and the lyophilization process is relatively slow, so very often these economic factors advise against its use.
  • drying in a fluid bed drying at room temperature and atmospheric pressure, drying at room temperature and decreased pressure, drying at high temperature and atmospheric pressure, drying at high temperature and reduced pressure.
  • the choice of the drying method to be used depends on its degree of efficiency, its greater or lesser aggressiveness against the composition to be preserved by drying, and on economic factors.
  • Carpenter et al. (Cryobiology 24: 455-464 (1987)) indicate that the disaccharides maltose, sucrose, lactose and trehalose increase the stability of the activity of a purified preparation of the phosphofructokinase enzyme after drying.
  • European Patent Application EP 140489 from Wako Puré Chemichal Industries describes a method for protecting an immunoactive protein (an antibody) on a transporter (eg, a glass bead) against drying at room temperature by immersion in a sugary solution , optionally together with a protein such as bovine serum albumin.
  • a transporter eg, a glass bead
  • a protein such as bovine serum albumin.
  • sugars ribose, glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, sucrose (sucrose), lactose, as well as other oligosaccharides and polysaccharides
  • lactose, sucrose being preferred based on their greater protective effect. and dextrin solutions.
  • US Patent 4,891,319, assigned to Quadrant Bioresources Limited describes the use of trehalose as a protective agent against the desiccation of proteins, antibodies, and other biological macromolecules.
  • Patent application EP 91258 discloses a method of stabilizing tumor necrosis factor (TNF) by storage or lyophilization of purified TNF protein in the presence of a stabilizing protein such as bovine serum albumin or gelatin.
  • TNF tumor necrosis factor
  • Patent application WO 91/18091 describes a method of preserving biological substances in a dried state by using non-reducing glycosides from polyhydroxy compounds (preferably sorbitol or mannitol), such as maltitol, lactitol and both isomers of palatinitol, and a non-reducing oligosaccharide such as raffinose, stachyose and melezitose.
  • polyhydroxy compounds preferably sorbitol or mannitol
  • maltitol preferably lactitol and both isomers of palatinitol
  • a non-reducing oligosaccharide such as raffinose, stachyose and melezitose.
  • US Patent 5,955,448, assigned to Quadrant Holdings Cambridge Limited claims a method of stabilizing biological samples and macromolecules, including restriction endonuclease enzymes, dried by the addition of non-reducing carbohydrates and an inhibitor of condensation reactions between amino groups. and peripheral carbonyl. It is also known to stabilize the recombinant ⁇ -interferon by using a stabilizing agent such as a detergent or glycerol, and may also contain other proteins, sucrose, trehalose, and other polyhydroxylated carbohydrate derivatives, as additional stabilizing agents, especially dextrose.
  • a stabilizing agent such as a detergent or glycerol
  • US Patent 5,861,251 assigned to Bioneer Corporation, claims a process of preparing a ready-to-use reagent dried by lyophilization for DNA amplification by adding as glucose or sorbitol preservatives to a reaction mixture that it contains all the components necessary to carry out the reaction, that is, a thermostable DNA polymerase enzyme, a reaction buffer containing all the components necessary to carry out the reaction, and the triphosphate deoxynucleotides or triphosphate triphosphate necessary as reaction substrates polymerization, plus a water-soluble dye, not citing the addition of probes or oligonucleotide primers to the ready-to-use reagent.
  • US Patent 5,614,387 assigned to Gen-Probe Incorporated, describes a ready-to-use reagent dried by lyophilization for RNA amplification by adding as preservatives a non-reducing disaccharide, preferably trehalose or sucrose, and / or polyvinylpyrrolidone (PVP ), to a reaction mixture containing all the reagents necessary to perform nucleic acid amplification, including an RNA polymerase and / or a reverse transcriptase, not citing in its examples any thermostable enzyme, together with a reaction buffer containing all the components necessary to carry out the reaction, and the deoxynucleotides triphosphate or dideoxynucleotides triphosphate necessary as substrates of the polymerization reaction, plus a water-soluble dye.
  • a non-reducing disaccharide preferably trehalose or sucrose
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • the invention provides a process for preparing a fully or partially stabilized and dried reaction mixture, said mixture comprising at least one enzyme, hereinafter method of the invention, comprising:
  • step b) withdraw all or part of the water contained in said aqueous solution obtained in step a), until a totally or partially dried mixture comprising said enzyme and said stabilizing mixture is obtained and has a humidity degree equal to or less than 30%, to obtain a stabilized reaction mixture, totally or partially dried, comprising at least one enzyme.
  • the reaction mixture comprises one or more enzymes involved in one or more enzymatic reactions together with all or part of the reagents necessary for carrying out the enzymatic reactions in which said enzymes are involved.
  • the reaction mixture contains all the reagents necessary for carrying out the reaction or reactions involving the enzyme (s) present in the reaction mixture, mixed in convenient amounts in said container, such as a reaction tube or a well of a multiwell plate, in which subsequently, after rehydration and addition of the substrate or problem sample, the enzymatic reaction to be carried out will be carried out.
  • the enzyme or enzymes present in the reaction mixture can be any enzyme.
  • said enzyme is selected from the group consisting of nucleic acid amplification enzymes, both thermostable and thermolabile, of nucleic acids, both RNA and DNA, restriction enzymes, enzymes involved in the amplification, sequencing or characterization reactions of nucleic acids, and mixtures thereof.
  • the reaction mixture comprises an enzyme selected from nucleic acid amplification enzymes, restriction enzymes, enzymes involved in nucleic acid amplification, sequencing and characterization reactions, and mixtures thereof, together with all the reagents necessary for the carrying out of the reactions in which the above enzymes are involved, and which include cofactors, enzyme substrates and other additives that improve the enzymatic reactions, may also optionally include probes and oligonucleotide primers, labeled or unlabeled, for the embodiment of a specific amplification, for example, the detection of a certain pathogen or genetic mutation in a sample.
  • an enzyme selected from nucleic acid amplification enzymes, restriction enzymes, enzymes involved in nucleic acid amplification, sequencing and characterization reactions, and mixtures thereof, together with all the reagents necessary for the carrying out of the reactions in which the above enzymes are involved, and which include cofactors, enzyme substrates and other additives that improve the enzymatic reactions, may also optionally include probes and oligonu
  • the aqueous solution of the reaction mixture may be prepared outside the container and subsequently added thereto as it may be or formed directly in the container by adding and mixing the different components of the reaction mixture in the container itself.
  • the stabilizing mixture is composed of (i) at least one protective agent against drying, (ii) at least one inhibitor of the condensation reaction between carbonyl or carboxyl groups and amino or phosphate groups; and (iii) at least one inert polymer that, when dried, generates a mesh-like structure that prevents the mobility of the dried reagents.
  • the protective agent against desiccation is primarily aimed at stabilizing the tertiary structure of enzymes and nucleotides optionally present in the reaction mixture, during the drying process, replacing in this mission water molecules that form an aqueous solution the protective envelope that helps maintain the three-dimensional structure of macromolecules, also blocking the reactions that may occur among the reactive chemical groups that could be found on the surface of the macromolecules, which also have a stabilizing effect on the long-term preservation of the dried mixtures.
  • the drying agent may be a suitable non-reducing carbohydrate, in particular a non-reducing disaccharide or trisaccharide, or a mixture of said compounds.
  • the drying agent is selected from the non-reducing palatinitol (6--D-glucopyranosyl mannitol) and trehalose disaccharides, the raffinose and melezitose non-reducing trisaccharides, and mixtures thereof.
  • non-reducing carbohydrates such as sucrose (sucrose) have been shown to be effective in the drying of enzymes, but not in the joint drying of enzymes and oligonucleotides.
  • non-reducing compounds from the group of polyalcohols, have been tested as protective agents against drying and stabilizing the dried mixtures during storage, such as sorbitol and glycerol. Both are relatively effective in their independent use as protective agents for enzymes during the drying process and in their subsequent preservation, especially sorbitol.
  • the stabilizing mixture may optionally contain glycerol as a protective agent against drying.
  • the inhibitor of the condensation reactions has the mission of inhibiting the condensation reactions that can occur between the reactive groups carboxyl, carbonyl, amino and phosphate which are found on the surface of the macromolecules present in the reaction mixture to be dried, whereby It must be present in an amount sufficient to exert this inhibitory effect.
  • the reaction inhibitors to be used may be competitive or non-competitive.
  • various amino acids have been shown to be the most effective, highlighting the plant, arginine and tryptophan, and, among them, lysine.
  • betaine and aminoguanidine derivatives have been shown to be the most effective.
  • the choice of the non-competitive inhibitor depends on the non-reducing carbohydrate used, so in the presence of raffinosa the most effective non-competitive inhibitor is betaine, while in the presence of other carbohydrates, the most effective aminoguanidine derivatives are the most effective.
  • the stabilizing mixture contains a condensation reaction inhibitor between carbonyl or carboxyl groups and amino or phosphate groups selected from the group consisting of lysine, arginine, tryptophan, betaine, aminoguanidine derivatives, and mixtures thereof.
  • the inert polymer capable of generating a structure in mesh form that prevents the mobility of the dried reagents when the aqueous solution in which it is located is dried, has the main mission of improving the storage stability of the dried reaction mixture by generating a mesh that prevents the mobility of the different reagents which make up the reaction mixture, so that they are immobilized to a greater or lesser extent in the cells formed by the polymer and, consequently, these reagents cannot approach each other, avoiding the chemical reaction of their surface reactive groups.
  • the polymer must, on the one hand, not react with any of the reagents that make up the mixture.
  • said inert polymer is selected from the group consisting of polyvinylpyrrolidone (PVP), polyethylene glycol (PEG) of various degrees of polymerization, dextran, starch, the compound called FICOLL (non-ionic polymer synthesized from sucrose, from Pharmacia ), glycogen, gum arabic and mixtures thereof.
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • PEG polyethylene glycol
  • FICOLL non-ionic polymer synthesized from sucrose, from Pharmacia
  • glycogen and gum arabic are the inert polymers that have been most effective in their protective function.
  • This inert polymer is its use as a cryoprotectant for the macromolecules present in the reaction mixture to be dried by lyophilization, by generating an amorphous mesh that prevents water crystallization during the initial freezing process characteristic of that drying process.
  • the amount of inert polymer to be added to the desiccation mixture must be sufficient to ensure the generation of a dense enough mesh that prevents the mobility of macromolecules, without then interfering with the enzymatic reaction to occur after rehydration. of the dried reaction mixture.
  • the joint action of the three components of the stabilizing mixture causes the aforementioned reaction mixtures to be fully functional after drying and prolonged storage.
  • Non-reducing carbohydrates protective agents
  • the oligo-nucleotide probes or primers but not the reaction mixtures containing those oligonucleotides. It is also the case with the non-reducing sorbitol polyalcohol, which is shown separately as a good protector and stabilizer of the reaction mixture that contains all the necessary reagents except oligonucleotides, but which ceases to exert that protective effect when in the reaction mixture oligonucleotides are present.
  • the condensation reaction inhibitor used exclusively in the drying or in the presence of the inert polymer, is capable of protecting the reaction mixture without oligonucleotides during the drying process, showing a drop in the reaction performance when the mixture Reaction contains oligonucleotides.
  • the aqueous solution of the stabilizing mixture can be prepared outside the container and subsequently added to the same as it is or it can be formed directly in the container by adding and mixing the different components of the stabilizing mixture in the container itself.
  • an aqueous solution is formed comprising the reaction mixture comprising at least one enzyme, together with said stabilizing mixture.
  • all or part of the water contained in the aqueous solution resulting from the reaction mixture with the stabilizing mixture is removed, until a totally or partially dried mixture comprising the enzyme or enzymes in question together with said stabilizing mixture is obtained and has a degree of humidity equal to or less than 30%, obtaining a stabilized reaction mixture, totally or partially dried, comprising at least one enzyme.
  • the withdrawal of all or part of the water present in the aqueous solution obtained in the container after mixing the reaction mixture with the stabilizing mixture can be carried out by any conventional drying method, including, for example, lyophilization, drying in a fluid bed. , dried at room temperature and atmospheric pressure, dried at room temperature and decreased pressure, dried at high temperature and atmospheric pressure, dried at high temperature and decreased pressure.
  • the preferred drying method is drying at a temperature between 15 ° C and 60 ° C, and lower pressure than atmospheric.
  • Other methods, such as those mentioned above, can be applied in drying, although their higher cost or lower efficiency or greater aggressiveness against the components of the reaction mixture to be dried advise against their use.
  • the stabilized, dried reaction mixtures, provided by this invention have a degree of moisture equal to or less than 30%, preferably equal to or less than 20%.
  • the degree of drying chosen depends mainly on economic factors (cost of the process, time needed to reach a certain degree of drying, etc.) and on the relationship between the degree of drying and the stability of the reaction mixture. Therefore, in a particular embodiment, the percentage of relative humidity remaining in the stabilized and dried reaction mixture is between 1% and 20%.
  • additives that improve or modulate the enzymatic reaction so that the desired enzymatic reaction can be carried out after rehydration and addition of the substrate or problem sample, thus avoiding the need to preserve the cold chain in the transport and handling of these dried reaction mixtures, simplifying the usual handling necessary to perform the enzymatic reaction, for example, the amplification of nucleic acids, as it is not necessary to preserve and add each component of the reaction separately, preventing cross contamination and avoiding pipetting errors, thereby increasing the repeatability and reliability of the analyzes.
  • the stabilized reaction mixtures totally or partially dried, maintain their activity, without significant losses thereof, after transport and storage at room temperature.
  • the invention also provides a fully or partially stabilized and dried reaction mixture, with a humidity degree equal to or less than 30%, preferably comprised between 1% and 20%, comprising at least one enzyme, and a stabilizing mixture such as the one defined previously comprising (i) at least one protective agent against drying, (ii) at least one inhibitor of the condensation reaction between carbonyl or carboxyl groups and amino or phosphate groups, and (iii) at least, an inert polymer capable of generating a mesh-like structure that prevents the mobility of dried reagents.
  • a stabilizing mixture such as the one defined previously comprising (i) at least one protective agent against drying, (ii) at least one inhibitor of the condensation reaction between carbonyl or carboxyl groups and amino or phosphate groups, and (iii) at least, an inert polymer capable of generating a mesh-like structure that prevents the mobility of dried reagents.
  • said stabilized and totally or partially dried reaction mixture contains an enzyme selected from the group consisting of nucleic acid amplification enzymes, restriction enzymes, enzymes involved in the nucleic acid amplification, sequencing or characterization reactions, and mixtures thereof, together with all or part of the reagents necessary for carrying out the enzymatic reactions in which said enzymes are involved, preferably with the all of said reagents, which include cofactors, enzyme substrates and other additives that improve enzymatic reactions, may also optionally include probes and oligo-nucleotide primers, labeled or unlabeled, for the realization of a specific amplification, for example , the detection of a certain pathogen or genetic mutation in a sample.
  • an enzyme selected from the group consisting of nucleic acid amplification enzymes, restriction enzymes, enzymes involved in the nucleic acid amplification, sequencing or characterization reactions, and mixtures thereof, together with all or part of the reagents necessary for carrying out the enzymatic reactions in which said
  • the invention provides a fully or partially dried stabilized reaction mixture useful for amplification of one or more specific sequences of one or more nucleic acids, RNA or DNA, present in a sample.
  • Said reaction mixture comprises a DNA polymerase enzyme or a reverse transcriptase enzyme, thermostable or not, deoxynucleotide triphosphate, labeled or not by any of the known methods, all cofactors necessary for enzymatic activity and any other additive that improves or modulates said enzymatic activity.
  • the stabilized and dried reaction mixture may also contain the oligonucleotide reaction primers, labeled or unlabeled by any of the known methods, necessary for the specific amplification of the target nucleotide sequence, and / or the oligonucleotide probes, labeled or unlabeled. any of the known methods, necessary for the performance of a hybridization test, as well as any additive or adjuvant of the hybridization reaction.
  • Is stabilized and dried reaction mixture is in a single container, such as a reaction tube or a well of a multi-well plate, and for the performance of the desired reaction only rehydration of the reaction mixture by the addition of water is necessary distilled and the sample to be analyzed.
  • the drying method is as set forth above and contains the stabilizer mixture described.
  • the invention provides a stabilized and totally or partially dried reaction mixture useful for nucleic acid sequencing, in which the dideoxyyribonucleotides (ddNTPs) are also added to the stabilized and dried reaction mixture described above, eliminating the water soluble dye.
  • the drying method is as set forth above and contains the stabilizer mixture described.
  • the invention provides a stabilized and totally or partially dried reaction mixture useful for carrying out restriction analysis in multiwell plate, so that the sample to be analyzed is deposited on the well containing dried a reaction mixture that It contains a certain restriction enzyme with which it is desired to treat the sample, as well as all the cofactors and additives necessary for performing the restriction analysis, subsequently incubating the sample together with the rehydrated reaction mixture.
  • the drying method is as set forth above and contains the stabilizer mixture described.
  • the invention provides a stabilized and totally or partially dried reaction mixture for performing multi-well plate hybridizations, so that the sample to be hybridized is deposited on the container containing the dried oligonucleotide probes, labeled or unlabeled by any of the known methods, necessary for the performance of the hybridization assay, as well as any additive or adjuvant of the hybridization reaction, subsequently proceeding with the hybridization reaction.
  • the drying method is as set forth above and contains the stabilizer mixture described.
  • the stabilized reaction mixtures, totally or partially dried, provided by this invention are of the "ready-to-use" type and have numerous applications, among which are the diagnosis of diseases, the determination of the DNA sequence, or nucleic acid restriction analysis, according to the methods indicated below and are illustrated in the examples that accompany this description.
  • Stabilized reaction mixtures, totally or partially dried, provided by this invention can also be used as a "hot-start" reaction system.
  • Various studies carried out by the inventors have shown that the amplification reaction with tubes containing said stabilized reaction mixtures, totally or partially dried, proceeds with equal efficiency whether the contents of the tube are resuspended or not before proceeding with the PCR (see Example I). This could mean that the reagents of said stabilized reaction mixture, totally or partially dried, are effectively released during the first phases of the reaction, for example, during incubation at elevated temperature. This fact would make said stabilized reaction mixtures work, totally or partially, provided by this invention as a hot-start system.
  • the invention also provides a kit comprising a fully or partially stabilized and dried reaction mixture, with a moisture content equal to or less than 30%, preferably comprised between 1% and 20%, provided by this invention.
  • said kit is a kit suitable for the amplification of one or more specific sequences of one or more nucleic acids, RNA or DNA, present in a sample, or for performing a nucleic acid hybridization assay, or for nucleic acid sequencing, or for carrying out restriction analysis in multiwell plate, or for performing hybridizations in multiwell plate.
  • the kit of the invention contains, in addition to the stabilized reaction mixture, totally or partially dried, comprising at least one enzyme involved in an enzymatic reaction, all or part, preferably, all of the reagents, factors, additives and / or oligonucleotide sequences necessary for carrying out the enzymatic reaction in question.
  • thermostable DNA polymerase enzyme used in this and the following examples, unless otherwise indicated, is a recombinant Thermus thermophilus DNA polymerase expressed in Escherichia coli, property of Biotools B&M Labs SA, Spain, and purified by a non-chromatographic method developed by the same company (BIOTOOLS DNA Polymerase). After purification, the enzyme was stored at -20 ° C in a storage buffer containing 30 mM Tris HCl, pH 8, 25 mM glucose, 25 mM KC1, 0.5 mM PMSF, 0.25% Tween 20 and NP40 0 , 25%. A reaction buffer containing Tris HCl, pH 8, 750 mM, (NH 4 ) 2 S0 4 200 mM, 0.1% Tween 20 and 20 mM MgCl 2 was prepared.
  • the gelled content of the vial was resuspended by pipetting (5 times) in the 50 microliters of water, primers and DNA added. In the other half of the tubes, the gelled content of the vial was not resuspended. An incubation was performed at 94 ° C for 2 minutes
  • the result of the amplification reaction was analyzed in all cases on 2% agarose gel (weight / volume), and a single band of 359 bp was found in all cases in which the amplification was positive.
  • the activity of the dried reaction mixtures and the fresh mixtures was measured by densiometry of the band resulting from the amplification, using a TPR image analyzer model Gelprinter, using the Gelsuper software also developed by TDI.
  • the results of the activity of each dried tube are expressed semiquantitatively in relation to the results obtained with the fresh mixtures.
  • the dried mixtures were considered they had: maximum activity (+++ in Table 1) when the intensity of the band was 90% ⁇ 10% with respect to the fresh mixture; optimal activity (++ in Table 1) when the activity ranged from 90% to 50%, low activity (+ in Table 1) when it was less than 50%, and absence of activity (- in Table 1) when the result of the amplification reaction was negative.
  • thermostable reverse transcriptase enzyme used in this example was a recombinant Thermus thermophil us DNA polymerase with enhanced reverse transcriptase activity. with respect to the enzyme indicated in Example I, expressed in Escherichia coli, owned by Biotools B&M Labs SA (Spain), and purified by a non-chromatographic method developed by the same company (RETR0T00LS cDNA / DNA Polymerase). After purification, the enzyme was stored at -20 ° C in a storage buffer containing Tris C1H, 30 mM, pH 8, 25 mM glucose, 0.5mM PMSF, 0.25% Tween 20 and 0.25% NP40.
  • a reaction buffer for reverse transcription containing 75 mM Tris HCl, pH 8, (NH 4) 2 S0 4 200 mM, Tween 20 0.01%, MnCl 2 1.5 mM, and 0.125 mM each dNTP was prepared (dATP, dGTP, dTTP, dCTP).
  • the tubes thus prepared were dried in an Eppendorf model 5301 centrifugal evaporator, at temperatures between 10 ° C and 60 ° C, for a period of time between 30 and 120 minutes. The temperatures and times mentioned above vary according to the stabilizer mixture used. After drying, the tubes were stored at the temperatures and times indicated in Table 1.
  • the activity of the reaction mixtures, and those of the unwanted fresh mixtures was tested by the amplification reaction of a specific region of the mouse CD8 gene, of a size of 1,122 bp, rehydrating the dried mixture with 15 microliths of double-distilled water, adding 1.25 microliters of the reaction primers: II-1: 5'-CAAGGATGCTCTTGGCTCTT-3 '(SEQ ID NO: 3); and II-2: 5'-GTGGTAGCAGATGAGAGTGA-3 'SEC. ID. N °: 4), and 100 ng of messenger RNA extracted from the mouse to a final volume of 20 microliters.
  • the reverse transcription mixture thus reconstituted was incubated at 60 ° C for 30 minutes to synthesize the cDNA.
  • the dried tubes with the DNA amplification mixture were rehydrated with 30 ⁇ l of H 2 0.
  • the complete volume of rehydrated reaction buffer was added to the tubes in which the reverse transcription reaction had been performed.
  • 40 cycles of denaturation (94 ° C, 45 seconds), banding (55 ° C, 30 seconds) and extension (72 ° C, 1 minute) were performed, using an Eppendorf Mastercycler model thermal cycler.
  • the experiment was designed so that the tubes used for the reverse transcription reaction and the tubes used in the subsequent DNA amplification reaction had been dried and stored under the same conditions.
  • the amplification products were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis (weight / volume), being in all cases where the amplification was positive a single band of 1,122 bp.
  • the intensity of the amplification bands of all samples was measured by densiometry of the band resulting from the amplification, using a TPR image analyzer model Gelprinter, using the Gelsuper software also developed by TDI.
  • the activity results of each dried tube are expressed semiquantitatively in relation to the results obtained with the fresh mixtures.
  • the dried mixtures were considered to have: maximum activity (+++ in Table 1) when the intensity of the band was 90% ⁇ 10% with respect to the fresh mixture, optimal activity (++ in Table 1) when the activity ranged from 90% to 50%, low activity (+ in Table 1) when it was less than 50%, and absence of activity (- in Table 1) when the result of the amplification reaction was negative.
  • restriction enzymes such as Mbo, Bgl II, Rsa I, Ava I, Ava II, and Acc I were also tested with identical results.
  • EXAMPLE IV Drying in a tube and on a multiwell plate of a reaction mixture that includes oligonucleotide primers for the specific amplification of a given DNA sequence
  • a reaction mixture was prepared containing in addition to all the components specified in Example I, the reaction primers described in the Spanish patent application of invention No. P200100568 and which serve for the identification in a single amplification reaction multiplexed by a mechanism in a single step semi-nested reaction of the 4 Plasmodi um species that cause the development of malaria in humans, as well as human DNA, which serves as a positive reaction control.
  • samples of human DNA extracted from whole blood are analyzed by usual methods.
  • the simultaneous DNA amplification reaction of each of the 4 Plasmodium species and of the human DNA amplification control is performed by including in a separate reaction tube (0.2 ml or 0.5 ml) 25 ⁇ l of a mixture reaction with the following composition: 75 mM base trizma, 20 mM ammonium sulfate, 0.01% Tween 20, 5 mM MgCl 2 , 0.5 mM dATP, 0.5 mM dCTP, 0.5 mM dGTP, 0 dTTP, 5 mM, primer Hl (SEQ ID NO: 5) 0.04 ⁇ M, primer H2 (SEQ ID NO: 6) 0.04 ⁇ M, primer Pl (SEQ ID NO: 7) 2 , 25 ⁇ M, primer P2 (SEQ ID NO: 8) 0.01 ⁇ M, primer F (SEQ ID NO: 9) 0.6 mM, primer M (SEQ ID NO: 10) 0.15 ⁇ M, primer 0 (SEQ ID NO:
  • the tubes were stored at the temperatures indicated in Table 1. After the storage periods indicated in Table 1, their activity was tested after rehydration of the dried mixture with 20 microliths of double distilled water and 50 ng of DNA from of patients infected with different species of Plasmodi um, up to a final volume of 25 microliters. Likewise, and as a reference of the activity, tubes with fresh non-dried mixture were included in all experiments.
  • the amplification cycles used include an initial heating cycle at 85 ° C for 3 minutes followed by a denaturation step at 94 ° C for 7 minutes.
  • the amplification round itself is performed consisting of 40 repeated cycles each of which consists of a denaturation step at 94 ° C for 45 seconds, a hybridization step at 62 ° C for 45 seconds and a step of elongation at 72 ° C for 1 minute.
  • a final elongation step is performed at 72 ° C for 10 minutes.
  • the amplification reaction was performed in an Eppendorf Mastercycler brand thermal cycler. An electrophoresis of the result of the 2% agarose gel amplification reaction (weight / volume) was performed, and it was found in all cases in which the amplification was positive 2 bands of 395 bp and 231 bp corresponding to the products of amplification of P.
  • the activity of the dried reaction mixture was measured by densiometry of the band resulting from the amplification, using an image analyzer brand TDI Gelprinter model, using the Gelsuper software also developed by TDI.
  • the results of the activity of each dried tube are expressed semiquantitatively in relation to the results obtained with the fresh mixtures.
  • the dried mixtures were considered to have: maximum activity (+++ in Table 1) when the intensity of the band was 90% ⁇ 10% with respect to the fresh mixture, optimal activity (++ in Table 1) when the activity ranged from 90% to 50%, low activity (+ in Table 1) when it was less than 50%, and absence of activity (- in Table 1) when the result of the amplification reaction was negative.
  • reaction mixture that includes oligonucleotide primers for the specific amplification of a given RNA sequence
  • a reaction mixture was prepared containing in addition to all the components specified in Example II, the reaction primers described in Spanish patent application of invention No. P200100567 and which serve for the generic detection of the enterovirus genome by a reverse transcription coupled system followed by a semi-nested amplification reaction in a single tube or well.
  • each dNTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  • 10 picomoles of the EV1M primer 5'-ACCCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3 '(SEQ ID NO: 13) and 7.5 units of the DNA polymerase enzyme indicated in Example II
  • To carry out the DNA amplification reaction are prepared by each reaction 30 microliters of a mixture containing 75 mM Tris HCl, pH 8, (NH 4) 2 S0 4 20 mM, Tween 20 0.01%, EGTA 0, 75 mM, 2 mM MgCl 2 , 10 picomoles of the EV2P primer: 5 '-CAAGCATTCTGTTTCCCC-3' (SEQ ID NO: 14) and 0.5 picomoles of the EV1P primer: 5 '-CGGTACCTTTGTRCGCCTGTT-3 ' (SEC. ID No.: 15).
  • the tubes were stored at the temperatures and times indicated in Table 1. Their activity was tested at the times indicated also in Table 1, after rehydration of the dried reverse transcription mixture with 15 microliths of double-distilled water, adding 100 ng of RNA to a final volume of 20 microliters. 4 cycles of 48 ° C / 5 minutes and 60 ° C / 15 minutes were performed.
  • the dried mixtures were considered to have: maximum activity (+++ in Table 1) when the intensity of the band was 90% ⁇ 10% with respect to the fresh mixture, optimal activity (++ in Table 1) when the activity ranged between 90% and 50%, low activity (+ in Table 1) when it was less than 50%, and absence of activity (- in Table 1) when the result of the amplification reaction was negative.
  • the results of the activity obtained can be observed in the column "activity example V" of Table 1.
  • stabilizing mixtures can be considered correct by maintaining good activity after drying and subsequent storage of the reaction mixture, are those that contain melezitosa or palatinitol, in conjunction with lysine and glycogen or gum arabic, or raffinose with betaine and glycogen, which retain a higher activity.
  • EXAMPLE VI Drying in a tube and on a multi-well plate of a mixture
  • the reaction includes oligonucleotide primers for the specific amplification of a specific DNA sequence that is subsequently subjected to restriction analysis in a multi-well plate containing the restriction enzymes dried in each of the wells necessary for performing said analysis.
  • Said method consists of a first step of co-amplification of two regions of the viral genome: a 450 bp fragment of the Ll region conserved in the genome of all papillomaviruses, and a 250 bp fragment of the E6-E7 region that is It is present only in oncogenic papillomaviruses.
  • the amplification mixture contains 75 mM Trizma base, 20 mM ammonium sulfate, 0.01% Tween 20, 2 mM MgCl 2 , 0.2 mM dATP, dCTP
  • VI-1 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3 '(SEQ ID NO: 16), and
  • VI-2 5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3 '(SEQ ID NO: 17),
  • VI-4 5'-GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-3 '(SEQ ID NO: 19), and
  • the amplified band of 250 bp (corresponding to oncogenic genome) of HPV 16, HPV 18 and HPV 33 is digested only by Ava II, yielding in each case a different restriction pattern easily differentiable in agarose gels, that of
  • HPV 31 is digested by Rsa I, that of HPV 35 by Ava I, that of
  • HPV 52b for Bgl II and HPV 58 for Acc I It is also It is possible to typify non-oncogenic genotypes by the digestion pattern of the 450 bp band with the Rsa I activity.
  • tubes were prepared in the manner described above, and to each of them different volumes of the stabilizing mixtures indicated in Table 1 were added. Also tubes were prepared with each of the restriction enzymes mentioned above (1 unit of each enzyme per tube) and 1 microliter of the respective 10X reaction buffers. All tubes thus prepared were dried in an Eppendorf model 5301 centrifugal evaporator, at temperatures between 10 ° C and 60 ° C, for a period of time between 30 and 120 minutes. The temperatures and times mentioned above vary according to the stabilizer mixture used. After drying, the tubes were stored at the temperatures and times indicated in Table 1.
  • the activity of the dried reaction mixture was measured by densiometry of the band resulting from the amplification, using a TPR image analyzer Gelprinter model, using the Gelsuper software also developed by TDI.
  • the dried mixtures were considered to have: maximum activity (+++ in Table 1) when the Band intensity was 90% ⁇ 10% with respect to the fresh mix, optimal activity (++ in Table 1) when the activity ranged between 90% and 50%, low activity (+ in Table 1) when it was less than 50%, and absence of activity (- in Table 1) when the result of the amplification reaction was negative.
  • the tubes and wells dried with the restriction enzymes were resuspended with 10 microliters of the amplifications made with the fresh mixture. After incubating the mixtures at 37 ° C for 30 minutes, the digestion products were analyzed in 1.5% agarose. It is considered: optimal activity ("digestion” in Table 1) the complete digestion of the bands of 250 base pairs (bp), medium (“partial” activity in Table 1) partial digestion of the bands, and inactive ( "do not cut” in Table 1) the complete absence of digestion.
  • EXAMPLE VII Amplification on multiwell plate with covalently linked oligonucleotides and dried reaction mixture of a given DNA sequence that is subsequently analyzed by hybridization with a biotinynyl probe.
  • This system was used for amplification and identification of Plasmodium DNA from clinical samples.
  • multi-well polystyrene plates (Covalink NH Microwells, Nunc) were used. Each of the wells of the plate had previously been covalently linked to the generic Plasmodi um Pl primer indicated in Example IV, through its 5 'end, and which will serve as a primer in the subsequent amplification reaction.
  • To each well of the plates was added the reaction mixture described in Example IV as well as the different stabilizing mixtures as described in Example IV and in Table 1.
  • the reaction mixture was removed from each well, so that only the double band amplification product was attached to the well. Since one of the bands has been synthesized by elongation from the generic primer Pl, this band was covalently bound to the well. On the contrary, the other DNA band is linked to the first by complementary base pairing. Since for the subsequent hybridization reaction it is necessary to use single band DNA as a substrate, the plates were washed in order to remove the DNA band that is not covalently bound to the well and leave only the synthesized band from the oligonucleotide Pl. For this, a reaction buffer was prepared whose composition was 50% formamide, 5X SSC and 0.1% SDS. 50 microliters of this mixture was added to each well and incubated for 10 minutes at 80 ° C. Then, the mixture was removed and the washing process was repeated three times.
  • Hybridization reactions were performed using a biotinylated oligonucleotide. To do this, each well with 100 fmol of the probe in hybridization reaction buffer containing 4X SSC, 10X Denhart and 200 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA, for 2 hours at 60 ° C. Then, the hybridization mixture was removed and each well was washed twice with 200 ⁇ l of a 0.1X SSC dilution, followed by washing in a 100 mM maleic acid reaction buffer, pH 7.5, 150 mM NaCl and 0.3% Tween 20, and a Last wash in a 100 mM maleic acid blocking reaction buffer, pH 7.5, 150 mM NaCl and 0.1% BSA.
  • the dried mixtures were considered to have: maximum activity (+++ in Table 1) when the absorbance measure was 90% ⁇ 10% with respect to the fresh mixture, optimal activity (++ in Table 1) when it oscillated between 90% and 50%, low activity (+ in Table 1) when it was less than 50%, and absence of activity (- in Table 1) when the absorbance measure was similar to that obtained in wells that did not They had contained no reaction mixture.
  • thermostable reverse transcriptase enzyme used in this example was a Thermus thermophil us recombinant DNA polymerase with enhanced reverse transcriptase activity with with respect to the enzyme indicated in Example I, expressed in Escherichia coli, owned by Biotools B&M Labs, SA (Spain), and purified by a non-chromatographic method developed by the same company (RETROTOOLS cDNA / DNA polymerase).
  • Said enzyme exhibits reverse transcriptase activity in the presence of Mn 2+ ions, and DNA polymerase activity in the presence of Mg 2+ ions, both reactions being exclusive under conventional conditions.
  • the enzyme was stored at -20 ° C in a storage buffer containing 30 mM Tris HCl pH 8, 25 mM glucose, 0.5 mM PMSF, 0.25% Tween 20, and 0.25% NP 40 .
  • a reaction buffer was prepared for carrying out the PCR reaction containing 1.5 mM EGTA and 4 mM MgCl 2 .
  • the tubes thus prepared were dried in an Eppendorf model 5301 centrifugal evaporator, at temperatures between 10 ° C and 60 ° C, for a period of time between 30 and 120 minutes. The temperatures and times mentioned above vary according to the stabilizer mixture used. After drying, the tubes were stored at temperatures indicated in Table 1. After the conservation periods indicated in said Table 1 its activity was tested.
  • reaction buffer was prepared to perform reverse transcription containing 75 mM Tris HCl pH 8, (200 NH 4 ) 2 S0 4 200 mM, 0.01% Tween 20, 1.5 mM MnCl 2 , 0.125 mM of each dNTP ( dATP, dCTP, dGTP and dTTP), 5 units of Tth DNA polymerase (RETROTOOLS cDNA / DNA polymerase) and 20 pmol of each of primers II-1 and II-2 (described in Example II) that amplify a fragment of 1,122 bp of the mouse CD8 ⁇ gene RNA.
  • dNTP dATP, dCTP, dGTP and dTTP
  • Tth DNA polymerase RRROTOOLS cDNA / DNA polymerase
  • RNA For the activity test, 0.2 ml of the PCR mixture, 15 ⁇ l of the reverse transcription reaction mixture and 100 ng of mouse RNA were added to all 0.2 ml tubes, adjusting the final volume with H 2 0 up to 20 ⁇ l. In half of the tubes the gelled content of the tube was resuspended by pipetting, while in the other half it was not resuspended. As a control, a two-step RT-PCR reaction was included in all experiments, under the conditions described in Example II, in which no stabilizing mixture had been included.
  • the amplified products were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis (weight / volume), being in all cases in which the reaction was positive a single amplification band of 1,122 bp.
  • the activity of the reaction mixtures tested was determined by densitometry of the resulting amplification bands, using a TPR image analyzer model Gelprinter, using the Gelsuper software also developed by TDI.
  • the activity analysis of the amplification reactions showed that the reaction was inhibited in all those tubes in which the gelled mixture was resuspended by pipetting prior to performing the reverse transcription reaction, thus bringing MnCl 2 into contact, the EGTA and MgCl.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

El procedimiento comprende poner en contacto en un mismo contenedor una solución acuosa de una mezcla de reacción que comprende, al menos, una enzima, con una solución acuosa de un mezcla estabilizante compuesta por (i) al menos, un agente protector frente a la desecación, (ii) al menos, un inhibitor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato, y (iii) al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados ; y retirar la totalidad o parte del agua contenida en la solución acuosa resultante. De aplicación en la realización de reacciones enzimáticas, por ejemplo, amplificación, secuenciación y caracterización de ácidos nucleicos, ensayos de hibridación y análisis de restricción.

Description

PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE MEZCLAS DE REACCIÓN ESTABILIZADAS, TOTAL O PARCIALMENTE DESECADAS, QUE COMPRENDEN, AL MENOS, UNA ENZIMA, MEZCLAS DE REACCIÓN Y KITS QUE LAS CONTIENEN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se relaciona con la preparación de mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mediante la adición de una mezcla estabilizante a una solución que contiene la mezcla de reacción, y la posterior retirada de la totalidad o parte del agua presente en la solución resultante, asi como a las mezclas de reacción resultantes y a its que comprenden dichas mezclas de reacción.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los ácidos desoxirribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) son largas acromoléculas lineales responsables del almacenamiento y transmisión de la información genética. Constan de unidades monoméricas denominadas nucleótidos, cada uno de los cuales está formado por una base nitrogenada, púrica o pirimidínica, un azúcar simple (desoxirribosa en el caso del ADN y ribosa en el caso de ARN) , y un fosfato inorgánico. En un ácido nucleico, los nucleótidos están unidos entre si mediante enlaces fosfodiéster a través del azúcar de nucleótidos adyacentes. Las bases nitrogenadas están unidas covalentemente al esqueleto azúcar-fosfato. Cada ácido nucleico posee principalmente cuatro bases nitrogenadas distintas, dos pirimidinas y dos purinas. Las bases purinas son iguales tanto para el ADN como para el ARN, conteniendo ambos adenina (A) y guanina (G) . Con respecto a las bases pirimidinicas, ambos ácidos nucleicos contienen citosina (C) , siendo la ti ina (T) especifica del ADN y el uracilo (U) propio del ARN. La secuencia de estas bases nitrogenadas determina la información genética que portan los ácidos nucleicos, así como su conformación tridimensional. Mientras que el ARN generalmente se presenta en la Naturaleza como una cadena polinucleotídica simple, el ADN normalmente se presenta como una doble cadena polinucleotídica en las que ambas cadenas de disponen en sentido antiparalelo asociadas por puentes de hidrógeno formados entre una base púrica y una pirimidínica complementarias entre sí.
La amplificación de ácidos nucleicos es la herramienta más ampliamente utilizada para la identificación precisa de un ácido nucleico determinado, consistiendo en la multiplicación exponencial de la cantidad inicial de un segmento específico o característico del ácido nucleico. Ese segmento amplificado puede ser utilizado en aplicaciones posteriores tales como el clonaje y el análisis de restricción. La secuenciación de ácidos nucleicos consiste en la determinación de la secuencia nucleotídica de un fragmento de ácido nucleico determinado. La amplificación y secuenciación de ácidos nucleicos, así como el análisis de fragmentos de restricción, técnica que consiste en la identificación o caracterización de un ácido nucleico en base a los tamaños diferenciales que provocan en ellos unas enzimas endonucleasas denominadas enzimas de restricción, son técnicas ampliamente utilizadas en la investigación biomédica, en el diagnóstico médico y veterinario de enfermedades contagiosas y hereditarias, en el análisis genético humano y animal, en el análisis de alimentos, en el control medioambiental, y en el análisis forense y criminalístico, entre otros posibles usos. Existen varios métodos para la síntesis y amplificación in vi tro de ácidos nucleicos. El más conocido y utilizado es la reacción en cadena de la polimerasa, denominada comúnmente por sus siglas inglesas PCR (Polymerase Chain Reaction)
(Saiki et al., Science, 230, 1350-1354 (1985), Mullís et al., patentes norteamericanas US 4.683.195, US 4.683.202 y US 4.800.159). En su forma más simple, la PCR consiste en un procedimiento cíclico de amplificación de ADN por el cual una o más secuencias de ADN específicas contenidas en un ácido nucleico o en una mezcla de ácidos nucleicos es amplificada exponencialmente utilizando para ello dos cebadores oligonucleotídicos que se unen de forma específica, por complementariedad de bases, a dos regiones enfrentadas del ADN problema que previamente ha sido desnaturalizado por calor. Cada una de las cadenas de ADN problema a la que se ha unido su correspondiente cebador puede ser copiada a la forma de ADN complementario mediante la acción de una actividad ADN polimerasa, utilizando el oligonucleótido como cebador de la reacción de polimerización. La repetición de ciclos sucesivos de este proceso consigue un enriquecimiento exponencial del fragmento de ADN problema comprendido entre los puntos de hibridación de los oligonucleótidos . La utilización de ADN polimerasas termoestables permite realizar ciclos sucesivos de desnaturalización, anillamiento del oligonucleótido al ADN substrato y elongación de la cadena, sin adición de nueva actividad polimerasa en cada ciclo. En caso de analizar la presencia de un ADN con una relativa abundancia este proceso es suficiente para su identificación. Sin embargo, es frecuente analizar muestras en las que la abundancia del ADN problema se encuentra por debajo de los límites de una PCR simple. Para el análisis de estas muestras se ha desarrollado la técnica de amplificación anidada o nested-PCR. En este sistema se realizan dos procesos de amplificación acoplados, el segundo de los cuales utiliza como substrato el producto amplificado de una primera PCR. Para incrementar la especificidad del proceso los oligonucleótidos utilizados en la segunda reacción de amplificación son diferentes a los utilizados en la primera e hibridan con zonas internas del producto de la primera amplificación. Dado que la reacción de amplificación utiliza actividades ADN polimerasas que requieren como substrato moléculas de ADN, el análisis directo de moléculas de ARN precisa un paso previo de transcripción reversa (RT o reverse transcription) mediante el cual se sintetiza una molécula de ADN copia (ADNc) complementaria al ARN problema. A continuación el ADNc así obtenido puede ser utilizado como substrato de una reacción de amplificación (Mocharla et al., Gene 93:271-275(1990)). El sistema de amplificación utilizado podrá ser una reacción simple (RT-PCR) o una amplificación anidada (RT-nested PCR) , dependiendo de la abundancia relativa del ARN substrato original. El desarrollo de actividades ADN polimerasas modificadas con actividad transcriptasa en reverso permite la realización del proceso de RT-amplificación utilizando una única actividad enzimática en condiciones de alta astringencia.
Los métodos de amplificación cíclica de ácidos nucleicos antes descritos utilizan enzimas polimerasas termoestables, obtenidas a partir de diversos microorganismos termófilos tales como Thermus aquaticus (Kaledin et al., Biokhimiya 45, 644-651(1980); Chien et al., J.Bacteriol. 127:1550- 1557(1976); patente US 4.889.818), y Thermus thermophil us (Ruttimann et al. Eur. J. Biochem. 149:41-46 (1985)), entre otros. Varias de estas enzimas ADN polimerasas termoestables, por ejemplo, la procedente de T. aqua ticus (Jones et al., Nucleic Acids Research 17:8387-8388(1989)), al igual que algunas enzimas ADN polimerasas esófilas tales como la ADN polimerasa I de Escherichia coli (Karkas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 70:3834-3838 (1973); Leob et al., Nature New Biol. 242:66-69 (1973)) presentan una doble actividad enzimática ADN polimerasa y transcriptasa en reverso, dependiendo del cofactor presente en la mezcla de reacción, de modo que en presencia de ion magnesio presenta actividad ADN polimerasa, mientras que en presencia de ion manganeso presenta actividad transcriptasa en reverso.
Las enzimas termoestables, en contraste con las proteínas mesófilas, no se desnaturalizan frente al calor, es más, requieren de altas temperaturas para llevar a cabo su actividad. Ello se debe, principalmente, a las modificaciones en su secuencia de aminoácidos, que se trasladan a su plegamiento global o estructura terciaria. Estas modificaciones no son drásticas, sino que la termoestabilidad surge como consecuencia de la suma de pequeñas interacciones de tipo entálpico y entrópico que contribuyen de forma sinérgica a obtener una estructura terciaria más rígida y resistente al calor. Entre estas modificaciones destacan los cambios de aminoácidos, que conducen a una estructura terciaria más rígida (Menéndez-Arias y Argos, J.Mol.Biol., 206:397-406 (1989)), o bien la eliminación de los residuos que son sensibles a degradación por desamidación (Asn, Gln) u oxidación (Met, Cys) , especialmente en las zonas más sensibles de la proteína, tales como los bucles o loops
(Watanabe y col., J.Biol .Chem. , 266:24287-24294 (1991)). La formación de puentes de hidrógeno y formación de redes extensas entre ellos, tanto entre aminoácidos de la proteína como con moléculas de agua del medio (Pace y col., FASEB J., 10:75-83 (1996)) es otra de las modificaciones que conducen a la termoestabilidad, al igual que la formación de puentes salinos entre residuos cargados de la superficie, o como forma de neutralizar los residuos polares que permanecen en el interior hidrofóbico de la proteína (Yip y col., Structure, 3:1147-1158 (1995)). Otras modificaciones de este tipo son la formación de estructuras secundarias, especialmente -hélices mediante la estabilización de su dipolo interno (Rentier-Delrue y col., J.Mol.Biol., 229:85- 93) ) y la formación de puentes de hidrógeno (Warren y Petsko, Prot.Eng., 8:905-913 (1995)), así como el aumento del empaquetamiento en el interior hidrofóbico, es decir, hacer la proteína más compacta (Matthews, FASEB J., 10:35- 41(1996)). Por todo lo anterior, resulta evidente que la preservación de la estructura terciaria de las enzimas termoestables, y en consecuencia su actividad y funcionalidad, pasa por la preservación de la integridad de las interacciones de la proteína con las moléculas acuosas que la rodean, incluso en mayor medida que las enzimas mesófilas no termoestables.
Es bien conocido que productos tales como la gelatina, la albúmina de suero bovino (BSA) , el sulfato de amonio y el Thesit, entre otros, estabilizan a las enzimas polimerasas y a los dNTPs, y que surfactantes no iónicos tales como el NP40 y el Tween 20 mejoran las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (Saiki et al., Science, 239:487-491 (1988)). Las enzimas de restricción son enzimas endonucleasas que rompen los enlaces fosfodiéster dentro de la doble cadena del ADN. Un tipo de estas enzimas de restricción, las denominadas de tipo II, tienen la propiedad de reconocer una determinada secuencia de nucleótidos del ADN, causando la ruptura de los enlaces que unen los nucleótidos entre sí dentro de esa determinada secuencia, cortando en consecuencia un mismo ADN en fragmentos precisos y reproducibles, generando lo que se denomina un mapa de restricción. Las enzimas de tipo II son ampliamente utilizadas en diversas técnicas de biología molecular, tales como clonaje, identificación de secuencias específicas y fragmentos de ADN, y análisis de mapas de restricción, entre otras (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, J. Sambrock et al, 2nd Ed. 1989) .
Muy frecuentemente, la actividad de las enzimas y de otras macromoléculas biológicas, incluyendo antígenos y anticuerpos, depende principalmente de su conformación tridimensional, denominada estructura terciaria, de manera que si esta conformación tridimensional es modificada por cualquier factor, la actividad o funcionalidad biológica de la macromolécula puede disminuir o incluso desaparecer. El agua forma una envoltura protectora alrededor de las macromoléculas biológicas, estabilizando la estructura terciaria de las macromoléculas mediante interacciones hidrofóbicas/hidrofílicas . Estas interacciones también bloquean los grupos químicos reactivos que se pueden encontrar en la superficie de las macromoléculas. Al quitar esta envoltura acuosa protectora, lo que sucede por ejemplo en cualquier proceso de desecación, se pueden producir distorsiones en la estructura terciaria de las macromoléculas, quedando modificada, y también los grupos químicos reactivos (grupos amino, fosfato, carboxilo, etc.) quedan libres para reaccionar entre sí o con otros grupos reactivos de otras macromoléculas próximas, pudiendo contribuir a la pérdida de la estructura terciaria original e incluso a formar agregados entre diversas macromoléculas iguales o diferentes entre sí, lo cual también supone generalmente la disminución o incluso la pérdida de la actividad o funcionalidad biológica de las macromoléculas, al igual que las modificaciones de sus estructuras terciarias. Estas reacciones entre grupos químicos reactivos periféricos pueden producirse incluso una vez desecadas convenientemente las macromoléculas, debido a la plasticidad de los medios en los que se encuentran, razón por la cual puede observarse una disminución en la actividad o funcionalidad biológica de las macromoléculas desecadas con el paso del tiempo. En consecuencia, es de gran importancia la sustitución de la envoltura acuosa que rodea a las macromoléculas por agentes protectores que sustituyan eficazmente a las moléculas de agua en su misión de mantenimiento de las estructuras terciarias de las macromoléculas y en su misión de estabilización y protección de los grupos reactivos superficiales .
El método habitual de conservación y transporte de las enzimas ADN polimerasas y enzimas de restricción antes mencionadas, así como de otras enzimas utilizadas en biología molecular y para los usos antes citados, comprende su congelación a -20°C, estabilizándolas para soportar esas bajas temperaturas mediante, principalmente, la adición de glicerol a su forma acuosa. Este método preserva la actividad de las enzimas durante varios meses sin apenas pérdida de actividad siempre y cuando la temperatura de conservación no suba de -20°C por lo que es de vital importancia preservar la cadena de frío, registrándose importantes pérdidas de actividad o inactivándose las enzimas si esta cadena de frío queda interrumpida durante algunas horas. Incluso utilizando este método de transporte y conservación mediante congelación a -20°C, es desaconsejable la expedición y conservación de todos los componentes de la reacción en un mismo contenedor, vial o tubo, puesto que pueden darse reacciones químicas o bioquímicas indeseables entre los diversos componentes que pueden llegar a provocar su inactivación o la generación de artefactos que pueden interferir o enmascarar la interpretación de los resultados experimentales. De lo anterior se deduce que sería de gran conveniencia económica disponer de un sistema que posibilitara la conservación y transporte de las macromoléculas citadas a temperatura ambiente, pudiendo evitarse de esta manera la necesaria preservación de la cadena de frío, máxime si este sistema de conservación permitiera expedir al mercado en un único contenedor todos los elementos necesarios (enzimas, cofactores, aditivos, etc.) necesarios para realización de la reacción enzimática deseada. En la amplificación de ácidos nucleicos mediante las técnicas antes descritas, cada uno de los componentes que intervienen en la reacción, es decir, la enzima ADN polimerasa, el tampón de reacción conteniendo aditivos mejorantes de la reacción o estabilizantes, el cloruro de magnesio, o cloruro de manganeso en caso de RT, los oligonucleótidos utilizados como cebadores de la reacción, los desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) , y la muestra conteniendo el ácido nucleico a amplificar, se encuentran por separado, conservados mediante congelación como se ha explicado anteriormente, y deben ser mezclados previamente a la realización de la reacción, siendo necesario añadir y mezclar cantidades muy pequeñas (microlitros) de cada uno de ellos, produciéndose frecuentes errores en la administración y pipeteo de cada uno de los reactivos citados, lo que acaba generando una incertidumbre acerca de la reproducibilidad de los resultados obtenidos mediante la aplicación de estas técnicas, incertidumbre especialmente preocupante en el caso del diagnóstico humano. Esta variabilidad por la posibilidad de error en el pipeteo de los diversos reactivos a añadir a la reacción de amplificación también afecta a la sensibilidad de la técnica, lo cual genera una nueva incertidumbre acerca de la aplicación de estas técnicas en el diagnóstico humano de enfermedades, y especialmente en la determinación de niveles de infección y de niveles de expresión génica.
Además, durante el pipeteo y adición a la mezcla de reacción de la muestra a analizar, se producen aerosoles que frecuentemente producen contaminaciones cruzadas entre muestras a analizar (Kwok, S. et al., Nature, 339:237 238 (1989) , generándose resultados falsos positivos, de gran transcendencia también en el caso del diagnóstico humano.
Diversas técnicas han sido descritas y utilizadas para la preservación mediante desecación de macromoléculas biológicas, y su utilidad y aplicabilidad vienen condicionadas por su capacidad de preservación de las características funcionales del producto sobre el que se aplica.
La liofilización es la principal de estas técnicas de preservación mediante desecación descritas, y es un método en el que se consigue la eliminación del agua mediante la congelación del producto húmedo y la posterior sublimación del hielo en condiciones de baja presión. Sublimación es el proceso por el cual un sólido se evapora sin pasar por el estado líquido, por lo que el término baja presión indicado anteriormente hace referencia a un valor de presión de vapor inferior al punto triple del agua, presión de vapor en el que el agua coexiste en los estados sólido, líquido y vapor. Para la realización de la liofilización debe procederse a la congelación completa de la disolución o del producto a liofilizar, a una temperatura y velocidad que dependen del tipo de material a liofilizar. Los equipamientos necesarios para liofilizar son costosos, y el proceso de liofilización es relativamente lento, por lo que muy a menudo estos factores económicos desaconsejan su utilización. Otros sistemas de desecación son bien conocidos, tales como desecado en lecho fluido, desecado a temperatura ambiente y presión atmosférica, desecado a temperatura ambiente y presión disminuida, desecado a alta temperatura y presión atmosférica, desecado a alta temperatura y presión disminuida. La elección del método de desecación a utilizar depende de su grado de eficiencia, de su mayor o menor agresividad frente a la composición a preservar mediante desecación, y de factores económicos.
Diversas soluciones se han propuesto para preservar la integridad de las macromoléculas biológicas durante el proceso de desecación, así como para estabilizar y preservar la funcionalidad de los desecados durante el proceso de conservación y almacenamiento.
Clegg et al. describen en Criobiology 19:306-316 (1982) el efecto protector del glicerol y de la trehalosa sobre la respuesta celular a la desecación.
Crowe et al. describen en Cryobiology 20:346-356 (1983), en Archives Biochem. Biophysies 232:400-497 (1984) y en Biochimia & Biophysica Acta 769:141-150 (1984), la acción de diversos carbohidratos sobre la estabilización de membranas celulares, indicando el efecto protector significativamente superior del disacárido no reductor conocido como trehalosa (α-D-glucopiranosil-α-D-glucopiranósido) en la desecación de los organelos celulares.
Carpenter et al. (Cryobiology 24:455-464 (1987)) indican que los disacáridos maltosa, sacarosa, lactosa y trehalosa incrementan la estabilidad de la actividad de una preparación purificada de la enzima fosfofructoquinasa tras su desecación.
La solicitud de patente europea EP 140489 de Wako Puré Chemichal Industries describe un procedimiento para proteger una proteína inmunoactiva (un anticuerpo) sobre un transportador (por ejemplo, una perla de cristal) frente a la desecación a temperatura ambiente mediante su inmersión en una solución azucarada, opcionalmente junto a una proteína tal como albúmina de suero bovino. Se menciona un considerable número de azúcares (ribosa, glucosa, fructosa, mañosa, galactosa, maltosa, sacarosa (sucrosa) , lactosa, así como otros oligosacáridos y polisacáridos) , siendo los preferidos en base a su mayor efecto protector la lactosa, la sacarosa y las soluciones de dextrinas. La patente norteamericana US 4.891.319, asignada a Quadrant Bioresources Limited, describe el empleo de trehalosa como agente protector frente a la desecación de proteínas, anticuerpos, y otras macromeléculas biológicas.
O. Tooru et al. describen en Chemical Abstracts 95:517 (1981) el efecto protector de los azúcares y de los azúcares alcohoxílicos frente a la desnaturalización y la desecación de fibras musculares de los peces .
La solicitud de patente EP 91258 revela un método de estabilización del factor de necrosis tumoral (TNF) mediante almacenamiento o liofilización de la proteína TNF purificada en presencia de una proteína estabilizante tal como la albúmina de suero bovina o la gelatina.
La solicitud de patente WO 91/18091, de Quadrant Holdings Cambridge Limited, describe un método de preservar sustancias biológicas en un estado desecado mediante la utilización de glicósidos no reductores procedentes de compuestos polihidroxilados (preferentemente sorbitol o manitol) , tales como el maltitol, el lactitol y ambos isómeros del palatinitol, y un oligosacárido no reductor tal como la rafinosa, la estaquiosa y la melezitosa.
Igaki et al. en J. JPN. Diabetes Soc, 34:403-407 (1991) señala a la L-lisina como un inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos amino y carbonilo situados en la periferia de las macromoléculas biológicas.
La patente US 5.955.448, asignada a Quadrant Holdings Cambridge Limited, reivindica un método de estabilización de muestras y macromoléculas biológicas, incluyendo enzimas endonucleasas de restricción, desecadas mediante la adición de carbohidratos no reductores y un inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos amino y carbonilo periféricos. Se conoce, además, la estabilización del β- interferón recombinante mediante la utilización de un agente estabilizante tal como un detergente o glicerol, pudiendo además contener otras proteínas, sacarosa, trehalosa, y otros derivados polihidroxilados de los carbohidratos, como agentes estabilizantes adicionales, especialmente dextrosa.
Otras referencias acerca de métodos de desecación y de preservación frente a la desecación de macromoléculas biológicas pueden encontrarse en Pikal M.J., BioPharm 3:18- 20, 22-23, 26-27 (1990), Carpenter et al., Cryobiology 25:459-470 (1988), Roser B., Biopharm 4:47-53 (1991), Colaco et al, Bio/Technol. 10:1007-1011 (1992), y Carpenter et al., Cryobiology 25:244-255 (1988). Por otra parte, la patente US 5.861.251, asignada a Bioneer Corporation, reivindica un proceso de preparación de un reactivo listo para usar desecado mediante liofilización para la amplificación de ADN mediante la adición como preservantes de glucosa o sorbitol a una mezcla de reacción que contiene todos los componentes necesarios para llevar a cabo la reacción, es decir, una enzima ADN polimerasa termoestable, un tampón de reacción conteniendo todos los componentes necesarios para llevar a cabo la reacción, y los desoxinucleótidos trifosfato o didesoxinucleótidos trifosfato necesarios como sustratos de la reacción de polimerización, más un colorante soluble en agua, no citando la adición de sondas ni cebadores oligonucleotídicos al reactivo listo para usar. La patente US 5.614.387, asignada a Gen-Probe Incorporated, describe un reactivo listo para usar desecado mediante liofilización para la amplificación de ARN mediante la adición como preservantes de un disacárido no reductor, preferentemente trehalosa o sacarosa, y/o polivinilpirrolidona (PVP) , a una mezcla de reacción que contiene todos los reactivos necesarios para realizar la amplificación del ácido nucleico, incluyendo una ARN polimerasa y/o una transcriptasa en reverso, no citando en sus ejemplos ninguna enzima termoestable, junto a un tampón de reacción conteniendo todos los componentes necesarios para llevar a cabo la reacción, y los desoxinucleótidos trifosfato o didesoxinucleótidos trifosfato necesarios como sustratos de la reacción de polimerización, más un colorante soluble en agua. La patente US 5.935.834, asignada a Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha, reivindica un reactivo listo para usar obtenible por desecación y preservación en presencia de trehalosa y que contiene todos los elementos necesarios para realizar una transcripción reversa del ARN procedente de un virus .
Aunque se han propuesto diversas soluciones para preservar la integridad de las macromoléculas biológicas durante el proceso de desecación, así como para estabilizar y preservar la funcionalidad de los desecados durante el proceso de conservación y almacenamiento, sigue existiendo la necesidad de desarrollar soluciones alternativas que incrementen el potencial de medios para satisfacer tales fines. La presente invención proporciona una solución a dicha necesidad.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un procedimiento para preparar una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, comprendiendo dicha mezcla, al menos, una enzima, en adelante procedimiento de la invención, que comprende :
a) poner en contacto en un único contenedor:
i) una solución acuosa de una mezcla de reacción que comprende, al menos, una enzima; y
ii) una solución acuosa de una mezcla estabilizante compuesta por
- al menos, un agente protector frente a la desecación;
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato; y
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados;
para obtener una solución acuosa que comprende dicha mezcla de reacción junto con dicha mezcla estabilizante; y
b) retirar la totalidad o parte del agua contenida en dicha solución acuosa obtenida en la etapa a) , hasta obtener una mezcla total o parcialmente desecada que comprende dicha enzima y dicha mezcla estabilizante y tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%, para obtener una mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, que comprende, al menos, una enzima.
La mezcla de reacción comprende una o más enzimas que intervienen en una o varias reacciones enzimáticas junto con la totalidad o parte de los reactivos necesarios para la realización de las reacciones enzimáticas en las que intervienen dichas enzimas. En una realización particular, la mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios para la realización de la reacción o reacciones en las que intervienen la(s) enzima (s) presentes en la mezcla de reacción, mezclados en las cantidades convenientes en dicho contenedor, tal como un tubo de reacción o un pocilio de una placa multipocillo, en el que posteriormente, tras rehidratación y adición del sustrato o muestra problema se llevará a cabo la reacción enzimática a realizar.
La enzima o enzimas presentes en la mezcla de reacción pueden ser cualquier enzima. En una realización particular, dicha enzima se selecciona del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, tanto termoestables como termolábiles, de ácidos nucleicos, tanto ARN como ADN, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas. Por tanto, en una realización particular, la mezcla de reacción comprende una enzima seleccionada entre enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación y caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas, junto con todos los reactivos necesarios para la realización de las reacciones en las que intervienen las enzimas anteriores, y que incluyen cofactores, sustratos de las enzimas y otros aditivos que mejoran las reacciones enzimáticas, pudiendo asimismo incluir, opcionalmente, sondas y cebadores oligonucleotídicos, marcados o sin marcar, para la realización de una amplificación específica, por ejemplo, la detección de un determinado patógeno o mutación genética en una muestra. La solución acuosa de la mezcla de reacción puede prepararse fuera del contenedor y añadirse posteriormente al mismo tal cual o bien puede formarse directamente en el contenedor mediante la adición y mezcla de los distintos componentes de la mezcla de reacción en el propio contenedor. La mezcla estabilizante está compuesta por (i) al menos, un agente protector frente a la desecación, (ii) al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato; y (iii) al menos, un polímero inerte que, al desecarse, genera una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados.
El agente protector frente a la desecación tiene por misión principalmente estabilizar la estructura terciaria de las enzimas y de los nucleótidos opcionalmente presentes en la mezcla de reacción, durante el proceso de desecación, sustituyendo en esta misión a las moléculas de agua que en solución acuosa forman la envoltura protectora que ayuda a mantener la estructura tridimensional de las macromoléculas, bloqueando además las reacciones que pudieran producirse entre los grupos químicos reactivos que pudieran encontrarse en la superficie de las macromoléculas, con lo cual presentan también un efecto de estabilización en la conservación a largo plazo de las mezclas desecadas. El agente protector frente a la desecación puede ser un carbohidrato no reductor adecuado, en particular, un disacárido o trisacárido no reductor, o una mezcla de dichos compuestos. En una realización particular, el agente protector frente a la desecación se selecciona entre los disacáridos no reductores palatinitol (6- -D-glucopiranosil-manitol) y trehalosa, los trisacáridos no reductores rafinosa y melezitosa, y sus mezclas. Otros carbohidratos no reductores, tales como la sacarosa (sucrosa) , se han mostrado efectivos en la desecación de enzimas, pero no así en la desecación conjunta de las enzimas y oligonucleótidos.
Se han ensayado diversos compuestos no reductores, del grupo de los polialcoholes, como agentes protectores frente a la desecación y estabilizantes de las mezclas desecadas durante su almacenamiento, tales como el sorbitol y el glicerol. Ambos se muestran relativamente efectivos en su utilización independiente como agentes protectores de las enzimas durante el proceso de desecación y en su posterior conservación, especialmente el sorbitol. En el proceso de desecación conjunta de mezclas de reacción conteniendo enzimas y oligonucleótidos junto con la mezcla estabilizante conteniendo carbohidratos no reductores, inhibidores de las reacciones de condensación y polímeros inertes, se aprecia que mientras que el glicerol presenta un efecto protector beneficioso en todos los casos en conjunción con los componentes de la mezcla estabilizante, especialmente en conjunción con los carbohidratos no reductores melezitosa, palatinitol, trehalosa y sacarosa, el sorbitol no presenta ningún efecto beneficioso, sino que, al contrario, llega a inhibir el efecto protector de los elementos citados. La utilización de sorbitol como agente protector frente a la desecación y estabilizante durante la conservación de las mezclas de reacción es efectiva cuando en esas mezclas de reacción no están presentes oligonucleótidos, no presentando ninguna acción protectora ni estabilizante cuando en esas mezclas están presentes cadenas oligonucleotídicas . Por tanto, además de uno o varios carbohidratos no reductores, la mezcla estabilizante puede contener, opcionalmente, glicerol como agente protector frente a la desecación. El inhibidor de las reacciones de condensación tiene por misión inhibir las reacciones de condensación que pueden producirse entre los grupos reactivos carboxilo, carbonilo, amino y fosfato que se encuentran en la superficie de las macromoléculas presentes en la mezcla de reacción a desecar, por lo que debe estar presente en una cantidad suficiente como para ejercer este efecto inhibidor. Los inhibidores de reacción a utilizar pueden ser competitivos o no competitivos. Entre los inhibidores competitivos, diversos aminoácidos se han mostrado como los más efectivos, destacando la usina, la arginina y el triptófano, y, entre ellos, la lisina. Entre los no competitivos, la betaína y los derivados de la aminoguanidina se han mostrado como los más eficaces. La elección del inhibidor no competitivo depende del carbohidrato no reductor utilizado, de modo que en presencia de rafínosa el inhibidor no competitivo más efectivo es la betaína, mientras que en presencia de otros carbohidratos son los derivados de la aminoguanidina los más efectivos. Por tanto, en una realización particular, la mezcla estabilizante contiene un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato seleccionado del grupo formado por lisina, arginina, triptófano, betaína, derivados de aminoguanidina, y sus mezclas.
El polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impida la movilidad de los reactivos desecados al desecarse la solución acuosa en donde se encuentra, tiene por misión principal el mejorar la estabilidad frente al almacenamiento de la mezcla de reacción desecada al generar una malla que impide la movilidad de los diferentes reactivos que componen la mezcla de reacción, de manera que quedan inmovilizados en mayor o menor medida en las celdillas que forma el polímero y, en consecuencia, estos reactivos no pueden aproximarse entre sí, evitándose la reacción química de sus grupos reactivos superficiales. El polímero debe, por un lado, no reaccionar con ninguno de los reactivos que componen la mezcla . de reacción, y, por otro lado, debe crear un entramado lo suficientemente fino y moldeable como para atrapar en su malla macromoléculas individualizadas sin distorsionar su estructura terciaria o cuaternaria al desecarse. En una realización particular, dicho polímero inerte se selecciona del grupo formado por polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG) de diversos grados de polimerización, dextrano, almidón, el compuesto denominado FICOLL (polímero no iónico sintetizado a partir de la sacarosa, de Pharmacia) , glucógeno, goma arábiga y sus mezclas. En general, el glucógeno y la goma arábiga son los polímeros inertes que se han mostrado más efectivos en su función protectora. Una misión adicional de este polímero inerte es su utilización como crioprotector de las macromoléculas presentes en la mezcla de reacción a desecar mediante liofilización, al generar una malla amorfa que impide la cristalización del agua durante el proceso inicial de congelación característico de ese proceso de desecado. La cantidad de polímero inerte a añadir a la mezcla de desecación debe ser la suficiente como para asegurar la generación de una malla lo suficientemente tupida que impida la movilidad de las macromoléculas, sin que luego interfiera en la reacción enzimática a producirse tras la rehidratación de la mezcla de reacción desecada.
La actuación conjunta de los tres componentes de la mezcla estabilizante (agente protector, inhibidor de las reacciones de condensación y polímero inerte) , provoca que las mezclas de reacción citadas antes sean completamente funcionales tras su desecación y almacenamiento prolongado. La adición de uno o dos de los componentes citados, sin la presencia de los otros dos o del restante componente, genera mezclas de reacción que o bien no son activas tras la desecación o bien su actividad desaparece a los pocos días de su desecación, presentando, en consecuencia, una estabilidad muy reducida durante el almacenamiento. Los carbohidratos no reductores (agentes protectores), en conjunción o no con el inhibidor de las reacciones de condensación, pueden proteger eficazmente frente a la desecación y estabilizar durante el almacenamiento a las enzimas y a las mezclas de reacción que contienen todos los reactivos necesarios para su realización excepto las sondas o los cebadores oligo-nucleotídicos, pero no así a las mezclas de reacción que contienen esos oligonucleótidos. Igualmente sucede con el polialcohol no reductor sorbitol, el cual se muestra por separado como un buen protector y estabilizante de la mezcla de reacción que contiene todos los reactivos necesarios excepto los oligonucleótidos, pero que deja de ejercer ese efecto protector cuando en la mezcla de reacción están presentes oligonucleótidos. El inhibidor de las reacciones de condensación, utilizado de manera exclusiva en la desecación o en presencia del polímero inerte, es capaz de proteger la mezcla de reacción sin oligonucleótidos durante el proceso de desecación, apreciándose una caída en el rendimiento de la reacción cuando la mezcla de reacción contiene oligonucleótidos .
La solución acuosa de la mezcla estabilizante puede preparase fuera del contenedor y añadirse posteriormente al mismo tal cual o bien puede formarse directamente en el contenedor mediante la adición y mezcla de los distintos componentes de la mezcla estabilizante en el propio contenedor. Tras la mezcla en el contenedor de la solución acuosa de la mezcla de reacción con la mezcla estabilizante se forma una solución acuosa que comprende la mezcla de reacción que comprende, al menos, una enzima, junto con dicha mezcla estabilizante. A continuación, se retira la totalidad o parte del agua contenida en la solución acuosa resultante de la mezcla de reacción con la mezcla estabilizante, hasta obtener una mezcla total o parcialmente desecada que comprende la enzima o enzimas en cuestión junto con dicha mezcla estabilizante y tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%, obteniéndose una mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, que comprende, al menos, una enzima.
La retirada de la totalidad o parte del agua presente en la solución acuosa obtenida en el contenedor tras la mezcla de la mezcla de reacción con la mezcla estabilizante puede realizarse por cualquier método de desecación convencional, incluyendo, por ejemplo, liofilización, desecado en lecho fluido, desecado a temperatura ambiente y presión atmosférica, desecado a temperatura ambiente y presión disminuida, desecado a alta temperatura y presión atmosférica, desecado a alta temperatura y presión disminuida. El método de desecación preferido es el desecado a una temperatura comprendida entre 15°C y 60°C, y presión disminuida inferior a la atmosférica. Otros métodos, como los anteriormente nombrados, pueden ser aplicados en la desecación, aunque su mayor coste o menor eficiencia o mayor agresividad frente a los componentes de la mezcla de reacción a desecar desaconsejan su utilización.
Las mezclas de reacción estabilizadas, desecadas, proporcionadas por esta invención, tienen un grado de humedad igual o inferior al 30%, preferentemente igual o inferior al 20%.
Las mezclas de reacción completamente desecadas, es decir, con una presencia de agua residual igual o inferior al 1%, tienden a tener una estabilidad durante el almacenamiento inferior a aquellas que contienen un mayor porcentaje de agua, apreciándose en las completamente desecadas una significativa disminución en los rendimientos de la reacción tras rehidratación y adición del sustrato de reacción. Por otra parte, en las mezclas desecadas que contienen porcentajes de agua residual comprendidos entre el 1% y el 20%, las macromoléculas presentan una movilidad que puede provocar reacciones químicas o enzimáticas indeseables, a pesar de la presencia del polímero inerte que impide su movilidad completa, por lo que si bien presentan una estabilidad de varias semanas a temperatura ambiente (25°C) , deben almacenarse preferentemente a temperaturas comprendidas entre 4°C y 10°C para asegurar su correcta funcionalidad a lo largo del tiempo. El grado de desecación elegido depende principalmente de factores económicos (coste del proceso, tiempo necesario para alcanzar un determinado grado de desecación, etc.) y de la relación existente entre el grado de desecación y la estabilidad de la mezcla de reacción. Por ello, en una realización particular, el porcentaje de humedad relativa remanente en la mezcla de reacción estabilizada y desecada está comprendido entre el 1% y el 20%.
Mediante el procedimiento de la invención se obtienen mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que en un único tubo o pocilio de una placa contienen todos los elementos necesarios , (por ejemplo, enzimas, cofactores, sustratos, cebadores oligonucleotídicos de reacción y otros aditivos que mejoran o modulan la reacción enzimática) para que se pueda llevar a cabo la reacción enzimática deseada tras su rehidratación y adición del sustrato o muestra problema, evitándose de esta manera la necesidad de preservar la cadena de frío en el transporte y manipulación de estas mezclas de reacción desecadas, simplificando la manipulación habitual necesaria para realizar la reacción enzimática, por ejemplo, la amplificación de ácidos nucleicos, al no ser necesario conservar y añadir cada componente de la reacción por separado, previniéndose contaminaciones cruzadas y evitándose errores de pipeteo, aumentándose, en consecuencia, la repetibilidad y fiabilidad de los análisis. Las mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas mantienen su actividad, sin pérdidas significativas de la misma, tras su transporte y conservación a temperatura ambiente. La invención también proporciona una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, con un grado de humedad igual o inferior al 30%, preferentemente comprendido entre 1% y 20%, que comprende al menos, una enzima, y una mezcla estabilizante tal como la definida previamente que comprende (i) al menos, un agente protector frente a la desecación, (ii) al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato, y (iii) al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados.
En una realización particular, dicha mezcla de reacción estabilizada y total o parcialmente desecada contiene una enzima seleccionada del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas, junto con la totalidad o parte de los reactivos necesarios para la realización de las reacciones enzimáticas en las que intervienen dichas enzimas, preferentemente con la totalidad de dichos reactivos, que incluyen cofactores, sustratos de las enzimas y otros aditivos que mejoran las reacciones enzimáticas, pudiendo asimismo incluir, opcionalmente, sondas y cebadores oligo-nucleotídicos, marcados o sin marcar, para la realización de una amplificación específica, por ejemplo, la detección de un determinado patógeno o mutación genética en una muestra. De este modo se obtienen mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que en un único tubo o pocilio de una placa contienen todos los elementos necesarios
(es decir, enzimas, cofactores, sustratos, cebadores oligonucleotídicos de reacción y otros aditivos que mejoran o modulan la reacción enzimática) para que se pueda llevar a cabo la reacción deseada tras su rehidratación y adición del sustrato o muestra problema.
En una realización particular, la invención proporciona una mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, útil para la amplificación de una o más secuencias específicas de uno o varios ácidos nucleicos, ARN o ADN, presentes en una muestra. Dicha mezcla de reacción comprende una enzima ADN polimerasa o una enzima transcriptasa en reverso, termoestable o no, desoxinucleótidos trifosfato, marcados o no por cualquiera de los métodos conocidos, todos los cofactores necesarios para la actividad enzimática y cualquier otro aditivo que mejora o modula dicha actividad enzimática. La mezcla de reacción estabilizada y desecada puede también contener los cebadores oligonucleotídicos de reacción, marcados o sin marcar mediante cualquiera de los métodos conocidos, necesarios para la amplificación específica de la secuencia nucleotídica objetivo, y/o las sondas oligonucleotídicas, marcadas o sin marcar por cualquiera de los métodos conocidos, necesarias para la realización de un ensayo de hibridación, así como cualquier aditivo o coadyuvante de la reacción de hibridación. Esta mezcla de reacción estabilizada y desecada se encuentra en un único contenedor, tal como un tubo de reacción o un pocilio de una placa multipocillos, y para la realización de la reacción deseada únicamente es necesaria la rehidratación de la mezcla de reacción mediante la adición de agua destilada y de la muestra a analizar. Preferiblemente, el método de desecación es el anteriormente expuesto y contiene la mezcla estabilizante descrita.
En otra realización particular, la invención proporciona una mezcla de reacción estabilizada y total o parcialmente desecada útil para la secuenciación de ácidos nucleicos, en la que a la mezcla de reacción estabilizada y desecada antes descrita se le añaden también didesoxirribonucleótidos (ddNTPs), eliminándose el colorante soluble en agua. Preferiblemente, el método de desecación es el anteriormente expuesto y contiene la mezcla estabilizante descrita.
En otra realización particular, la invención proporciona una mezcla de reacción estabilizada y total o parcialmente desecada útil para la realización de análisis de restricción en placa multipocillo, de manera que la muestra a analizar se deposita sobre el pocilio que contiene desecados una mezcla de reacción que contiene una determinada enzima de restricción con la cual se desea tratar la muestra, así como todos los cofactores y aditivos necesarios para la realización del análisis de restricción, procediéndose posteriormente a la incubación de la muestra junto a la mezcla de reacción rehidratada. Preferiblemente, el método de desecación es el anteriormente expuesto y contiene la mezcla estabilizante descrita. En otra realización particular, la invención proporciona una mezcla de reacción estabilizada y total o parcialmente desecada para la realización de hibridaciones en placa multipocillo, de manera que la muestra a hibridar es depositada sobre el contenedor que contiene desecadas las sondas oligonucleotídicas, marcadas o sin marcar por cualquiera de los métodos conocidos, necesarias para la realización del ensayo de hibridación, así como cualquier aditivo o coadyuvante de la reacción de hibridación, procediéndose posteriormente a la realización de la reacción de hibridación. Preferiblemente, el método de desecación es el anteriormente expuesto y contiene la mezcla estabilizante descrita.
Las mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, proporcionadas por esta invención, son del tipo "listas para usar" (ready-to-use) y presentan numerosas aplicaciones, entre las que se encuentran el diagnóstico de enfermedades, la determinación de la secuencia de ADN, o el análisis de restricción de ácidos nucleicos, de acuerdo con los métodos que se indican más adelante y se ilustran en los ejemplos que acompañan a esta descripción.
Mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, proporcionadas por esta invención, pueden ser utilizadas, además, como sistema de reacción "hot-start". Diversos estudios realizados por los inventores han puesto de manifiesto que la reacción de amplificación con tubos conteniendo dichas mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, transcurre con igual eficiencia tanto si se resuspende como si no el contenido del tubo antes de proceder a efectuar la PCR (véase el Ejemplo I). Esto podría significar que los reactivos de dicha mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, se liberan de forma efectiva durante las primeras fases de la reacción, por ejemplo, durante la incubación a temperatura elevada. Este hecho haría funcionar a dichas mezclas de reacción estabilizadas, total o parcilalmente descadas, proporcionadas por esta invención como sistema hot-start. Este aspecto tiene gran importancia por varios motivos ya que: a) desde un punto de vista práctico facilita la manipulación del sistema evitando la resuspensión de la mezcla [de hecho, para volúmenes de muestra grande (20 o más tubos) la resuspensión individual de cada uno de ellos conlleva mucho trabajo, hasta el punto de que puede ser más largo que hacer una mezcla convencional]; mientras que, al contrario, el no tener que efectuar la resuspensión acorta de forma drástica el trabajo a realizar; y b) desde un punto de vista científico los sistemas hot- start son ideales en los sistemas de amplificación, ya que incrementan la especificidad del sistema; en este sentido, el sistema proporcionado por esta invención permitiría trabajar de forma cómoda con los tubos en hielo y garantizar la liberación de los reactivos en caliente.
La invención también proporciona un kit que comprende una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, con un grado de humedad igual o inferior al 30%, preferentemente comprendido entre 1% y 20%, proporcionada por esta invención. En una realización particular, dicho kit es un kit adecuado para la amplificación de una o más secuencias específicas de uno o varios ácidos nucleicos, ARN o ADN, presentes en una muestra, o para la realización de un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos, o para la secuenciación de ácidos nucleicos, o para la realización de análisis de restricción en placa multipocillo, o para la realización de hibridaciones en placa multipocillo. El kit de la invención contiene, además de la mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, que comprende al menos una enzima implicada en una reacción enzimática, la totalidad o parte, preferentemente, la totalidad de los reactivos, factores, aditivos y/o secuencias oligonucleotídicas necesarios para la realización de la reacción enzimática en cuestión.
Los siguientes ejemplos explican en mayor medida la presente invención, y no deben ser interpretados como un límite en el alcance de la invención.
EJEMPLO I Desecación de la mezcla de reacción para amplificación de ADN La enzima ADN polimerasa termoestable usada en este y en los siguientes ejemplos, salvo indicación en caso contrario, es una ADN polimerasa recombinante de Thermus thermophilus expresada en Escherichia coli , propiedad de Biotools B&M Labs S.A., España, y purificada mediante un método no cromatográfico desarrollado por la misma empresa (BIOTOOLS DNA Polymerase) . Tras su purificación, la enzima fue guardada a -20°C en un tampón de almacenamiento conteniendo Tris HCl 30 mM, pH 8, glucosa 25 mM, KC1 25 mM, PMSF 0,5 mM, Tween 20 0,25% y NP40 0,25%. Se preparó un tampón de reacción conteniendo Tris HCl, pH 8, 750 mM, (NH4)2S04 200 mM, Tween 20 0, 1% y MgCl2 20 mM.
A cada tubo de reacción de 0,2 mi utilizado en el experimento se le añadió 1 microlitro de dicha enzima ADN polimerasa (1 U/μl) conservada en su tampón de almacenamiento, 5 microlitros del tampón de reacción, y 1 microlitro de una disolución que contiene en proporción equimolar los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs) que intervienen en la reacción de amplificación de ADN (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) . Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se le añadieron los volúmenes adecuados de cada una de las mezclas estabilizantes que se recogen en la Tabla 1. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según el volumen final de mezcla a desecar.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse los tiempos indicados en la Tabla 1, fue ensayada su actividad mediante la reacción de amplificación de una región específica del citocromo b, de un tamaño de 359 pares de bases (pb) , añadiendo 43 microlitos de agua bidestilada, 1 microlitro de cada uno de los cebadores de reacción
1-1: 5'-CCATCCATCTCAGCATGATGAAA-3' (SEC. ID. N° : 1); y 1-2: 5'-GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3' (SEC. ID. N° : 2), y 500 ng de ADN hasta un volumen final de 50 microlitros.
En la mitad de los tubos se resuspendió el contenido gelificado del vial mediante pipeteo (5 veces) en los 50 microlitros de agua, cebadores y ADN añadidos. En la otra mitad de los tubos, no se resuspendió el contenido gelificado del vial. Se realizó una incubación a 94°C durante 2 minutos
(aunque este ciclo de incubación no es estrictamente necesario, sino opcional), y, a continuación, se realizaron 35 ciclos de desnaturalización (94°C, 10 segundos), anillamiento (55°C, 30 segundos), y extensión (72°C, 40 segundos) , utilizando un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler . En paralelo, y para comprobar la evolución de la actividad de los tubos desecados, se amplificaron muestras de ADN utilizando una mezcla fresca, en las mismas condiciones de amplificación.
El resultado de la reacción de amplificación se analizó en todos los casos en gel de agarosa 2% (peso/volumen) , y se encontró en todos los casos en los que la amplificación fue positiva una única banda de 359 pb. La actividad de las mezclas de reacción desecadas y de las mezclas frescas fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI . Los resultados de la actividad de cada tubo desecado se expresan de forma semicuantitativa en relación a los resultados obtenidos con las mezclas frescas. Se consideró que las mezclas desecadas tenían: actividad máxima (+++ en la Tabla 1) cuando la intensidad de la banda era un 90% ± 10% con respecto a la mezcla fresca; actividad óptima (++ en la Tabla 1) cuando la actividad oscilaba entre el 90% y el 50%, actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y ausencia de actividad (- en la Tabla 1) cuando el resultado de la reacción de amplificación era negativo.
Los resultados de actividad obtenidos se pueden observar en la columna "actividad ejemplo I" de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad. En todos los casos se observó que la actividad obtenida en los tubos en los que se resuspendió el contenido gel del vial antes de la realización de la PCR, y la actividad obtenida en los tubos no resuspendidos fue similar. Este hecho parece demostrar que existe una liberación efectiva de los reactivos contenidos en la mezcla gelificada durante la incubación a alta temperatura, por lo que estaría actuando como sistema hot-start.
EJEMPLO II Desecación de la mezcla de reacción para transcripción reversa de ARN y posterior amplificación del ADNc
La enzima transcriptasa en reverso termoestable usada en este ejemplo fue una ADN polimerasa recombinante de Thermus thermophil us con actividad transcriptasa en reverso mejorada respecto a la enzima indicada en el Ejemplo I, expresada en Escherichia coli , propiedad de Biotools B&M Labs S.A. (España) , y purificada mediante un método no cromatográfico desarrollado por la misma empresa (RETR0T00LS cDNA/DNA Polymerase) . Tras su purificación, la enzima se guardó a - 20°C en un tampón de almacenamiento conteniendo Tris C1H, 30 mM, pH 8, glucosa 25 mM, PMSF 0,5mM, Tween 20 0,25% y NP40 0,25%. Se preparó un tampón de reacción para realizar la transcripción reversa conteniendo Tris HCl 75 mM, pH 8, (NH4)2S04 200 mM, Tween 20 0,01%, MnCl2 1,5 mM, y 0,125 mM de cada dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) .
A cada tubo de reacción de 0,2 mililitros utilizado en este experimento se añadieron 1,5 microlitros de dicha enzima (5 U/μl) conservada en tampón de almacenamiento, 4 microlitros del tampón de reacción para la transcripción reversa, y 1 microlitro de una disolución conteniendo en proporción equimolar dATP, dCTP, dGTP y dTTP. En otro tubo de 0,2 mi se añaden 6 microlitros del tampón de reacción que consta de Tris HCl 75 mM, pH 8, (NH4)2S04 20 mM, Tween 20 0,01%, EGTA 0,75 mM y MgCl2 2 mM. Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se les añadió una de las mezclas estabilizantes que se recogen en la Tabla 1. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada. Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1.
La actividad de las mezclas de reacción, y las de las mezclas frescas no desecadas fue ensayada mediante la reacción de amplificación de una región específica del gen CD8 de ratón, de un tamaño de 1.122 pb, rehidratando la mezcla desecada con 15 microlitos de agua bidestilada, añadiendo 1,25 microlitros de los cebadores de reacción: II-l: 5'-CAAGGATGCTCTTGGCTCTT-3' (SEC. ID. N° : 3); y II-2: 5'-GTGGTAGCAGATGAGAGTGA-3' SEC. ID. N° : 4), y 100 ng de ARN mensajero extraído de ratón hasta un volumen final de 20 microlitros. La mezcla de transcripción reversa así reconstituida se incubó a 60°C durante 30 minutos para sintetizar el ADNc. A continuación, los tubos desecados con la mezcla de amplificación de ADN se rehidrataron con 30 μl de H20. El volumen completo de tampón de reacción rehidratado se añadió a los tubos en los que se había realizado la reacción de transcripción reversa. A continuación, se realizaron 40 ciclos de desnaturalización (94°C, 45 segundos) , anillamiento (55°C, 30 segundos) y extensión (72°C, 1 minuto) , utilizando un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler . El experimento se diseñó de forma que los tubos utilizados para la reacción de transcripción reversa y los tubos utilizados en la reacción de amplificación de ADN subsiguiente hubieran sido desecados y almacenados en las mismas condiciones. Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa 1% (peso/volumen) , encontrándose en todos los casos en que la amplificación fue positiva una única banda de 1.122 pb. La intensidad de las bandas de amplificación de todas las muestras fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI. Los resultados de actividad de cada tubo desecado se expresan de forma semicuantitativa en relación con los resultados obtenidos con las mezclas frescas. Se consideró que las mezclas desecadas tenían: activdad máxima (+++ en la Tabla 1) cuando la intensidad de la banda era un 90% ± 10% con respecto a la mezcla fresca, actividad óptima (++ en la Tabla 1) cuando la actividad oscilaba entre el 90% y el 50%, actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y ausencia de actividad (- en la Tabla 1) cuando el resultado de la reacción de amplificación era negativo.
Los resultados de actividad obtenidos se pueden observar en la columna "actividad ejemplo II" de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, nuevamente son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.
EJEMPLO III Desecación de enzimas de restricción en conjunción con su tampón de corte Se colocaron en los tubos eppendorf de 1,5 mi utilizados en este experimento 1 microlitro de la enzima de restricción HindIII (1 U/ μl) comercializada por MBI Fermentas, Lituania, junto con 1 microlitro del tampón 10X de corte suministrado por el fabricante junto a la enzima. Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita y, a cada uno de ellos, se le añadió el volumen adecuado de cada una de las distintas mezclas estabilizantes recogidas en la Tabla 1. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas indicadas en la Tabla 1. Su actividad fue ensayada una vez trascurrido el periodo de tiempo correspondiente indicado en dicha Tabla 1 mediante la digestión a 37°C durante 2 horas de 0,3 microgramos de ADN (150 ng/μl) del fago lambda, tras su rehidratación con 8 microlitros de agua bidestilada. Se realizó una electroforesis del resultado de la reacción de digestión en gel de agarosa 1 % (peso/volumen) , en paralelo con una digestión con una preparación fresca de enzima realizada en las mismas condiciones de tiempo y temperatura. La actividad de las enzimas desecadas se dividió en tres categorías:
A) actividad óptima ("digestión" en la Tabla 1) cuando se obtenía la digestión completa del ADN, con un patrón de restricción idéntico al obtenido al digerir con la enzima fresca; B), actividad media ("parcial" en la Tabla 1) cuando se obtuvo un patrón de restricción diferente al obtenido con la enzima fresca, debido a la existencia de digestiones parciales; y
C) inactiva ("no corte" en la Tabla 1) cuando se observó la ausencia completa de digestión.
Los resultados de la comparación de la actividad de la enzima de restricción desecada junto a su tampón de corte respecto a la actividad que presenta una digestión de iguales características producida por una enzima fresca no desecada se pueden observar en la columna "actividad ejemplo III" de la Tabla 1. Como conclusión, nuevamente son aquellas mezclas estabilizantes que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que generan digestiones completas en tiempos de conservación más largos mientras que las otras mezclas ensayadas generan digestiones parciales o bien no cortan.
Otras enzimas de restricción tales como Mbo, Bgl II, Rsa I, Ava I, Ava II, y Acc I fueron igualmente ensayadas con idénticos resultados.
EJEMPLO IV Desecación en tubo y sobre placa multipocillo de una mezcla de reacción que incluye cebadores oligonucleotídicos para la amplificación específica de una secuencia determinada de ADN
Se preparó una mezcla de reacción conteniendo además de todos los componentes especificados en el Ejemplo I, los cebadores de reacción descritos en la solicitud de patente española de invención n° P200100568 y que sirven para la identificación en una única reacción de amplificación multiplexada mediante un mecanismo de reacción semianidada en un solo paso, de las 4 especies de Plasmodi um causantes del desarrollo de malaria en humanos, así como del ADN humano, el cual sirve de control positivo de reacción. En este método se analizan muestras de ADN humano extraído de sangre total mediante métodos habituales.
La reacción de amplificación simultánea del ADN de cada una de las 4 especies de Plasmodium y del control de amplificación de ADN humano se realiza incluyendo en un tubo de reacción separado (de 0,2 mi ó 0,5 mi) 25 μl de una mezcla de reacción con la siguiente composición: Trizma base 75 mM, sulfato amónico 20 mM, 0,01% Tween 20, MgCl2 5 mM, dATP 0,5 mM, dCTP 0,5 mM, dGTP 0,5 mM, dTTP 0,5 mM, cebador Hl (SEC. ID. N° : 5) 0,04 μM, cebador H2 (SEC. ID. N° : 6) 0,04 μM, cebador Pl (SEC. ID. N° : 7) 2,25 μM, cebador P2 (SEC. ID. N° : 8) 0,01 μM, cebador F (SEC. ID. N° : 9) 0,6 mM, cebador M (SEC. ID. N° : 10) 0,15 μM, cebador 0 (SEC. ID. N° : 11) 0,375 μM, cebador V (SEC. ID. N° : 12) 0,15 μM y 2 unidades de la ADN polimerasa (BIOTOOLS DNA polymerase) .
Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se les añadió una de las mezclas estabilizantes que se recogen en la Tabla 1, a diferentes concentraciones de cada uno de los elementos integrantes de las mezclas. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas indicadas en la Tabla 1. Tras los periodos de conservación indicados en dicha Tabla 1, se ensayó su actividad tras rehidratación de la mezcla desecada con 20 microlitos de agua bidestilada y 50 ng de ADN procedente de pacientes infectados con distintas especies de Plasmodi um, hasta un volumen final de 25 microlitros. Asimismo, y como referencia de la actividad, se incluyeron tubos con mezcla fresca no desecada en todos los experimentos. Los ciclos de amplificación utilizados incluyen un ciclo inicial de calentamiento a 85°C durante 3 minutos seguido de un paso de desnaturalización a 94°C durante 7 minutos. A continuación, se realiza la ronda de amplificación propiamente dicha consistente en 40 ciclos repetidos cada uno de los cuales consta de un paso de desnaturalización a 94°C durante 45 segundos, un paso de hibridación a 62°C durante 45 segundos y un paso de elongación a 72°C durante 1 minuto. Una vez finalizados los 40 ciclos de amplificación se realiza un último paso de elongación a 72°C durante 10 minutos. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler . Se realizó una electroforesis del resultado de la reacción de amplificación en gel de agarosa 2% (peso/volumen) , y se encontró en todos los casos en los que la amplificación fue positiva 2 bandas de 395 pb y 231 pb correspondientes a los productos de amplificación de P. falciparum y ADN humano respectivamente. La actividad de la mezcla de reacción desecada fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI . Los resultados de la actividad de cada tubo desecado se expresan de forma semicuantitativa en relación a los resultados obtenidos con las mezclas frescas. Se consideró que las mezclas desecadas tenían: actividad máxima (+++ en la Tabla 1) cuando la intensidad de la banda era un 90% ± 10% con respecto a la mezcla fresca, actividad óptima (++ en la Tabla 1) cuando la actividad oscilaba entre el 90% y el 50%, actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y ausencia de actividad (- en la Tabla 1) cuando el resultado de la reacción de amplificación era negativo.
Los resultados de actividad obtenidos se pueden observar en la columna "actividad ejemplo IV" de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.
Igual procedimiento analítico se siguió depositando sobre cada pocilio de una placa multipocillo de poliestireno marca Nunc la mezcla de reacción citada previamente conteniendo los cebadores oligonucleotídicos, desecando la placa mediante su introducción en un desecador y haciendo vacío mediante una bomba. Se preparó una placa para cada punto de temperatura y tiempo analizados posteriormente. Asimismo, se prepararon en cada experimento pocilios frescos no desecados como referencia de actividad. Los condiciones de amplificación y análisis de resultados fueron iguales a los descritos anteriormente. Los resultados de la medición de la actividad de la muestra desecada coinciden plenamente con los obtenidos para el caso de los tubos antes citados.
EJEMPLO V
Desecación en tubo y sobre placa multipocillo de una mezcla de reacción que incluye cebadores oligonucleotídicos para la amplificación específica de una secuencia determinada de ARN Se preparó una mezcla de reacción conteniendo además de todos los componentes especificados en el Ejemplo II, los cebadores de reacción descritos en la solicitud de patente española de invención n° P200100567 y que sirven para la detección genérica del genoma de enterovirus mediante un sistema acoplado de transcripción reversa seguido de una reacción de amplificación semi-anidada en un único tubo o pocilio.
Para la realización de la reacción de transcripción reversa se preparan por cada reacción 20 microlitros de una mezcla que contiene Tris HCl 75 mM, (NH4)2S04 20 mM, Tween 20 0,01%, MnCl2 1,5 mM, 0,125 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) y 10 picomoles del cebador EV1M: 5'- ACCCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3 ' (SEC. ID. N° : 13) y 7,5 unidades de la enzima ADN polimerasa indicada en el Ejemplo II. Para la realización de la reacción de amplificación de ADN se preparan por cada reacción 30 microlitros de una mezcla que contiene Tris HCl 75 mM, pH 8, (NH4)2 S04 20 mM, Tween 20 0,01%, EGTA 0,75 mM, MgCl2 2 mM, 10 picomoles del cebador EV2P: 5 '-CAAGCATTCTGTTTCCCC-3 ' (SEC. ID. N° : 14) y 0,5 picomoles del cebador EV1P: 5 '-CGGTACCTTTGTRCGCCTGTT-3 ' (SEC. ID. N° : 15) .
Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se les añadió volúmenes distintos de cada una de las mezclas estabilizantes que aparecen en la Tabla 1. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Su actividad fue ensayada en los tiempos indicados también en la Tabla 1, tras rehidratación de la mezcla de transcripción reversa desecada con 15 microlitos de agua bidestilada, añadiendo 100 ng de ARN hasta un volumen final de 20 microlitros. Se realizaron 4 ciclos de 48°C/5 minutos y 60°C/15 minutos. Se resuspendió en 30 microlitros de agua bidestilada el tubo de 0,2 mi que se utilizó en la posterior reacción de amplificación del ADN, el cual contiene la misma mezcla estabilizante que su homólogo utilizado para la transcripción reversa, y su volumen se añadió sobre el tubo de 0,2 mi que contiene el producto de la transcripción reversa. Se realizaron 35 ciclos de desnaturalización (94°C, 1 minuto), anillamiento (48°C, 1 minuto) y extensión (72°C, 1 minuto), utilizando un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler . Se realizó una electroforesis del resultado de la reacción de amplificación en gel de agarosa 2% (peso/volumen) , y se encontró en todos los casos que la amplificación fue positiva mostrando dos bandas de 390 y 489 pb. En todos los experimentos se incluyeron tubos con mezcla fresca que fueron utilizados como referencia de la actividad. La actividad de las mezclas de reacción desecadas y frescas fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI . Se consideró que las mezclas desecadas tenían: máxima actividad (+++ en la Tabla 1) cuando la intensidad de la banda era un 90% ± 10% con respecto a la mezcla fresca, actividad óptima (++ en la Tabla 1) cuando la actividad oscilaba entre el 90% y el 50%, actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y ausencia de actividad (- en la Tabla 1) cuando el resultado de la reacción de amplificación era negativo. Los resultados de la actividad obtenidos se pueden observar en la columna "actividad ejemplo V" de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.
Igual procedimiento analítico se siguió depositando sobre cada pocilio de una placa multipocillo de poliestireno marca Nunc la mezcla de reacción citada conteniendo los cebadores oligonucleotídicos, desecando la placa mediante su introducción en un desecador y haciendo vacío mediante una bomba. Se preparó una placa para cada punto de temperatura y tiempo analizados posteriormente. Asimismo, se prepararon en cada experimento pocilios frescos no desecados como referencia de la actividad. Los condiciones de amplificación y análisis de resultados fueron iguales a los descritos anteriormente. Los resultados de la medición de la actividad de la muestra desecada coinciden plenamente con los obtenidos para el caso de los tubos antes citados.
EJEMPLO VI Desecación en tubo y sobre placa multipocillo de una mezcla de reacción que incluye cebadores oligonucleotídicos para la amplificación específica de una secuencia determinada de ADN que posteriormente es sometida a análisis de restricción en una placa multipocillo que contiene desecadas en cada uno de los pocilios las enzimas de restricción necesarias para la realización de dicho análisis
Este sistema fue ensayado utilizando un método de identificación y tipado de papilomavirus. Dicho método consiste en un primer paso de co-amplificación de dos regiones del genoma viral: un fragmento de 450 pb de la región Ll conservada en el genoma de todos los papilomavirus, y un fragmento de 250 pb de la región E6-E7 que se encuentra presente únicamente en los papilomavirus oncogénicos. La mezcla de amplificación contiene Trizma base 75 mM, sulfato amónico 20 mM, 0,01% Tween 20, MgCl2 2 mM, dATP 0,2 mM, dCTP
0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, 2,5 pmol de los cebadores:
VI-1: 5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3' (SEC. ID. N° : 16), y
VI-2: 5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3' (SEC. ID. N° : 17),
1,25 pmol de los cebadores: VI-3: 5'-TGTCAAAAACCGTTGTGTCC-3' (SEC. ID. N° : 18), y
VI-4: 5'-GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-3' (SEC. ID. N° : 19), y
1 unidad de la enzima ADN polimerasa indicada en el Ejemplo
I. El análisis de los productos de esta amplificación permite identificar la presencia de papilomavirus (banda de 450 pb) así como determinar si existe alguna especie oncogénica (250 pb) . A continuación, la digestión con 5 enzimas de restricción (Rsa I, Acc I, Ava I, Ava II y Bgl II) permite caracterizar la especie de papiloma presente en cada muestra.
Así, la banda amplificada de 250 pb (correspondiente a genoma oncogénico) de HPV 16, HPV 18 y HPV 33 es digerida únicamente por Ava II, rindiendo en cada caso un patrón de restricción diferente fácilmente diferenciable en geles de agarosa, la de
HPV 31 es digerida por Rsa I, la de HPV 35 por Ava I, la de
HPV 52b por Bgl II y la de HPV 58 por Acc I. Asimismo es posible tipificar los genotipos no oncogénicos por el patrón de digestión de la banda de 450 pb con la actividad Rsa I.
Se prepararon diversos tubos de la forma antes descrita, y a cada uno de ellos se les añadieron distintos volúmenes de las mezclas estabilizantes indicadas en Tabla 1. Asimismo se prepararon tubos con cada una de las enzimas de restricción anteriormente señaladas (1 unidad de cada enzima por tubo) y 1 microlitro de los tampones 10X de reacción respectivos. Todos los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada. Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Una vez transcurridos los periodos de conservación indicados en dicha Tabla 1, se ensayó su actividad tras rehidratación de la mezcla desecada con 45 microlitos de agua bidestilada y 25 ng de ADN extraído de un paciente infectado con HPV 18, hasta un volumen final de 50 microlitros. Se realizaron 30 ciclos de desnaturalización (94°C, 30 segundos), anillamiento (50°C, 1 minuto) y extensión (72°C, 1 minuto) , usando un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler. Se realizó una electroforesis del resultado de la reacción de amplificación en gel de agarosa 2% (peso/volumen) , y se encontró en todos los casos en los que la amplificación fue positiva 2 bandas de 250 y 450 pb respectivamente. La actividad de la mezcla de reacción desecada fue medida mediante densiometría de la banda resultante de la amplificación, utilizando para ello un analizador de imágenes marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper desarrollado también por TDI . Se consideró que las mezclas desecadas tenían: actividad máxima (+++ en la Tabla 1) cuando la intensidad de la banda era un 90% ± 10% con respecto a la mezcla fresca, actividad óptima (++ en la Tabla 1) cuando la actividad oscilaba entre el 90% y el 50%, actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y ausencia de actividad (- en la Tabla 1) cuando el resultado de la reacción de amplificación era negativo.
A continuación, los tubos y pocilios desecados con las enzimas de restricción fueron resuspendidos con 10 microlitros de las amplificaciones realizadas con la mezcla fresca. Tras incubar las mezclas a 37°C durante 30 minutos, los productos de digestión se analizaron en agarosa al 1,5%. Se considera: actividad óptima ("digestión" en la Tabla 1) la digestión completa de las bandas de 250 pares de bases (pb) , actividad media ("parcial" en la Tabla 1) la digestión parcial de las bandas, e inactiva ("no corte" en la Tabla 1) la ausencia completa de digestión.
Los resultados densiométricos obtenidos tras la realización de las reacciones de amplificación se pueden observar en la columna "actividad ejemplo VI" de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.
Con respecto a la actividad de las enzimas de restricción se obtuvieron resultados óptimos con las cinco enzimas utilizadas, en los casos en los que la mezcla utilizada en la desecación de la enzima de restricción contiene melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno. Igual procedimiento analítico se siguió depositando sobre cada pocilio de una placa multipocillo de poliestireno marca Nunc la mezcla de reacción citada conteniendo los cebadores oligonucleotídicos, desecando la placa mediante su introducción en un desecador y haciendo vacío mediante una bomba. Se preparó una placa para cada punto de temperatura y tiempo analizados posteriormente. Asimismo, se prepararon en cada experimento pocilios frescos no desecados como referencia de actividad. Los condiciones de amplificación y análisis de resultados fueron iguales a los descritos anteriormente. Los resultados de la medición de la actividad de la muestra desecada coinciden plenamente con los obtenidos para el caso de los tubos antes citados.
EJEMPLO VII Amplificación sobre placa multipocillo con oligonucleótidos unidos covalentemente y mezcla de reacción desecada de una secuencia determinada de ADN que posteriormente es analizada mediante hibridación con una sonda biotinilida Se utilizó este sistema para la amplificación e identificación del ADN de Plasmodium de muestras clínicas. Para ello se utilizaron placas multipocillo de poliestireno (Covalink NH Microwells, Nunc) . A cada uno de los pocilios de la placa previamente se le había unido covalentemente el cebador genérico de Plasmodi um Pl indicado en el Ejemplo IV, a través de su extremo 5' , y que servirá como cebador en la reacción posterior de amplificación. A cada pocilio de las placas se le añadió la mezcla de reacción descrita en el Ejemplo IV así como los diferentes mezclas estabilizantes según se describen el Ejemplo IV y en la Tabla 1. Se prepararon tantas placas como puntos de temperatura y tiempos de almacenamiento se iban posteriormente a ensayar (Tabla 1) . Una vez preparadas las placas, éstas se desecaron mediante su introducción en un desecador y haciendo vacío mediante una bomba. Las muestras desecadas se rehidrataron con 20 microlitros de agua estéril, y se les añadió 5 microlitros de ADN procedente de pacientes infectados con Plasmodi um a una concentración de 10 ng/μl. Se procedió, a continuación, a realizar la reacción de amplificación en las condiciones descritas en el Ejemplo IV, utilizando un termociclador Eppendorf Gradient para placas multipocillo. En todos los casos se realizó una amplificación en las mismas condiciones utilizando una placa no desecada, para ser utilizada como referencia de actividad. Una vez finalizada la reacción se retiró de cada pocilio la mezcla de reacción, de forma que en el pocilio quedó únicamente unido el producto de amplificación de doble banda. Dado que una de las bandas se ha sintetizado por elongación a partir del cebador genérico Pl, esta banda quedó unida covalentemente al pocilio. Por el contrario la otra banda de ADN se encuentra unida a la primera mediante apareamiento de bases complementarias. Dado que para la subsiguiente reacción de hibridación es necesario utilizar como substrato ADN de banda simple, se procedió a lavar las placas con el objeto de eliminar la banda de ADN que no se encuentra covalentemente unida al pocilio y dejar únicamente la banda sintetizada a partir del oligonucleótido Pl . Para ello se preparó un tampón de reacción cuya composición era 50% formamida, 5X SSC y 0,1% SDS. Se añadieron 50 microlitros de esta mezcla a cada pocilio y se incubó durante 10 minutos a 80°C. A continuación, se retiró la mezcla y se repitió el proceso de lavado tres veces.
Las reacciones de hibridación se realizaron utilizando un oligonucleótido biotinilado. Para ello se incubó cada pocilio con 100 fmol de la sonda en tampón de reacción de hibridación que contenía 4X SSC, 10X Denhart y 200 μg/ml de ADN de esperma de salmón, durante 2 horas a 60° C. A continuación, se retiró la mezcla de hibridación y cada pocilio se lavó 2 veces con 200 μl de una dilución 0,1X SSC, seguido de un lavado en un tampón de reacción ácido maleico 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,3% de Tween 20, y un último lavado en un tampón de reacción de bloqueo ácido maleico 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,1% BSA. Una vez finalizados los bloqueos se añadió a cada pocilio 1:2000 en el tampón de reacción de bloqueo anteriormente descrito, de estreptoavidina conjugada con peroxidasa, y se incubó a 23°C durante 45 minutos. Finalmente los pocilios se lavaron tres veces con 200 microlitros de tampón de reacción ácido maleico 100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y 0,3% de Tween 20 y una vez con 200 microlitros de tampón de reacción ácido maleico 100 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM. Finalmente se añadió a cada pocilio 100 microlitros de TMB y se incubó 10 minutos en la oscuridad. Tras parar la reacción, se determinó la absorbancia a 450 nm, corrigiéndose todos los valores con el valor de absorbancia del plástico a 655 nm.
Se consideró que las mezclas desecadas tenían: actividad máxima (+++ en la Tabla 1) cuando la medida de absorbancia era un 90% ± 10% con respecto a la mezcla fresca, actividad óptima (++ en la Tabla 1) cuando oscilaba entre el 90% y el 50%, actividad baja (+ en la Tabla 1) cuando era inferior al 50%, y ausencia de actividad (- en la Tabla 1) cuando la medida de absorbancia era similar a la obtenida en pocilios que no habían contenido ninguna mezcla de reacción.
Los resultados de actividad obtenidos se pueden observar en la columna "actividad ejemplo VII" de la Tabla 1. Como conclusión, si bien varias mezclas estabilizantes pueden considerarse correctas al conservar una buena actividad tras la desecación y posterior almacenamiento de la mezcla de reacción, nuevamente son aquellas que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, las que conservan una mayor actividad.
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000051_0002
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000052_0002
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000054_0002
Figure imgf000055_0002
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000057_0002
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000059_0002
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
EJEMPLO VIII
Compartimentalización de reacciones secuenciales mediante utilización de sistemas mixtos de reacción fase líquida/gelificado La enzima transcriptasa en reverso termoestable utilizada en este ejemplo, al igual que en el Ejemplo II, fue una ADN polimerasa recombinante de Thermus thermophil us con actividad transcriptasa en reverso mejorada con respecto a la enzima indicada en el Ejemplo I, expresada en Escherichia coli , propiedad de Biotools B&M Labs, S.A. (España), y purificada mediante un método no cromatográfico desarrollado por la misma empresa (RETROTOOLS cDNA/DNA polymerase) . Dicha enzima presenta actividad transcriptasa en reverso en presencia de iones Mn2+, y actividad DNA polimerasa en presencia de iones Mg2+, siendo ambas reacciones excluyentes en condiciones convencionales. Tras su purificación, la enzima se guardó a -20°C en un tampón de almacenamiento conteniendo Tris HCl 30 mM pH 8, glucosa 25 mM, PMSF 0,5 mM, Tween 20 0,25%, y NP 40 0,25%. Se preparó un tampón de reacción para la realización de la reacción de PCR conteniendo EGTA 1,5 mM y MgCl2 4 mM. A cada tubo de 0,2 mi se le añadieron 10 μl de la mezcla anteriormente descrita, y se añadieron las mezclas estabilizantes que en los experimentos previos (Ejemplos I- VII) habían demostrado mejor actividad: melezitosa o palatinitol en conjunción con lisina o glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno. Los tubos así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según la mezcla estabilizante utilizada. Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las temperaturas indicadas en la Tabla 1. Tras los periodos de conservación indicados en dicha Tabla 1 se ensayó su actividad.
Finalmente se preparó un tampón de reacción para realizar la transcripción reversa conteniendo Tris HCl 75 mM pH 8, (NH4)2S04 200 mM, Tween 20 0,01%, MnCl2 1,5 mM, 0,125 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) , 5 unidades de Tth DNA polimerasa (RETROTOOLS cDNA/DNA polymerase) y 20 pmol de cada uno de los cebadores II-l y II-2 (descritos en el Ejemplo II) que amplifican un fragmento de 1.122 pb del RNA del gen CD8α de ratón.
Para el ensayo de actividad se añadió a todos los tubos de 0,2 mi en los que se había desecado la mezcla de PCR, 15 μl de la mezcla de reacción de transcripción en reverso y 100 ng de RNA de ratón, ajustando el volumen final con H20 hasta 20 μl . En la mitad de los tubos se resuspendió el contenido gelificado del tubo mediante pipeteo, mientras que en la otra mitad no se resuspendió. Como control, en todos los experimentos se incluyó una reacción de RT-PCR en dos pasos, en las condiciones descritas en el Ejemplo II, en la que no se había incluido ninguna mezcla estabilizante.
Todos los tubos se sometieron a una ronda de transcripción en reverso-amplificación en un solo paso, y sin inclusión de reactivos durante el proceso. Dicha reacción consistía en una incubación a 94°C durante 1 minuto seguido de una incubación a 60°C durante 30 minutos. A continuación, los tubos se sometieron a alta temperatura para permitir la liberación de los reactivos incluidos en las mezclas gelificadas no resuspendidas consistente en una incubación a 83°C durante 5 minutos seguido de una incubación a 94 °C durante 3 minutos. Finalmente se realizaron 40 ciclos repetidos cada uno de los cuales constaba de un paso de desnaturalización a 94°C durante 45 segundos, un paso de hibridación a 55°C durante 30 segundos y un paso de elongación a 72°C durante 1 minuto. Una vez finalizados los 40 ciclos de amplificación se realizó un último paso de elongación a 72°C durante 7 minutos. La reacción de amplificación se realizó en un termociclador marca Eppendorf modelo Mastercycler.
Los productos amplificados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (peso/volumen) , encontrándose en todos los casos en los que la reacción fue positiva una única banda de amplificación de 1.122 pb. La actividad de las mezclas de reacción ensayadas fue determinada mediante densitometría de las bandas de amplificación resultantes, utilizando para ello un analizador de imagen marca TDI modelo Gelprinter, usando el programa informático Gelsuper también desarrollado por TDI . El análisis de actividad de las reacciones de amplificación demostró que la reacción se inhibía en todos aquellos tubos en los que la mezcla gelificada se resuspendía por pipeteo previamente a la realización de la reacción de transcripción en reverso, poniendo así en contacto el MnCl2, el EGTA y el MgCl . Por el contrario, en los tubos en los que no se resuspendió la mezcla gelificada, se obtuvieron resultados positivos con una intensidad similar a la obtenida en las reacciones de transcripción en reverso y amplificación en dos pasos. Este hecho demuestra que la mezcla de MgCl2 y EGTA gelificada se había mantenido compartimentalizada, hasta su liberación por incubación a altas temperaturas, permitiendo la realización secuencial de dos reacciones excluyentes entre sí.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para preparar una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, comprendiendo dicha mezcla, al menos, una enzima, que comprende:
a) poner en contacto en un único contenedor:
i) una solución acuosa de una mezcla de reacción que comprende, al menos, una enzima; y
ii) una solución acuosa de una mezcla estabilizante compuesta por
- al menos, un agente protector frente a la desecación;
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato; y
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una . estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados;
para obtener una solución acuosa que comprende dicha mezcla de reacción junto con dicha mezcla estabilizante; y
b) retirar la totalidad o parte del agua contenida en dicha solución acuosa obtenida en la etapa a) , hasta obtener una mezcla total o parcialmente desecada que comprende dicha enzima y dicha mezcla estabilizante y tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%, para obtener una mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, que comprende, al menos, una enzima.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción comprende, al menos, una enzima que interviene en una reacción enzimática, junto con la totalidad o parte de los reactivos necesarios para la realización de dicha reacción enzimática en la que interviene dicha enzima.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha mezcla de reacción comprende, al menos, una enzima que interviene en una reacción enzimática, junto con la totalidad de los reactivos necesarios para la realización de dicha reacción enzimática en la que interviene dicha enzima.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha enzima se selecciona del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, tanto termoestables como termolábiles, de ácidos nucleicos, tanto ARN como ADN, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha mezcla de reacción comprende una enzima seleccionada del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, tanto termoestables como termolábiles, de ácidos nucleicos, tanto ARN como ADN, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas, junto con todos los reactivos necesarios para la realización de la reacción enzimática en la que interviene dicha enzima.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho contenedor es un tubo de reacción o un pocilio de una placa multipocillos .
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho agente protector frente a la desecación es un carbohidrato no reductor.
8. Procedimiento según, la reivindicación 7, en el que dicho agente protector frente a la desecación se selecciona del grupo formado por un disacárido no ' reductor, un trisacárido no reductor, y sus mezclas.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho agente protector frente a la desecación se selecciona del grupo formado por palatinitol ( 6- -D-glucopiranosil- manitol) , trehalosa, rafinosa, melezitosa, y sus mezclas.
10. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha mezcla estabilizante comprende, además, de un carbohidrato no reductor como agente protector frente a la desecación, glicerol.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato es un inhibidor competitivo o un inhibidor no competitivo.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato se selecciona del grupo formado por lisina, arginina, triptófano, betaína, derivados de aminoguanidina y sus mezclas .
13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impida la movilidad de los reactivos desecados se selecciona del grupo formado por polivinilpirrolidona (PVP) , polietilenglicol (PEG) , dextrano, almidón, el compuesto denominado FICOLL, glucógeno, goma arábiga y sus mezclas.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la retirada de la totalidad o parte del agua presente en la solución acuosa obtenida en la etapa a) se realiza por cualquier método de desecación convencional.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho método de desecación se selecciona entre liofilización, desecado en lecho fluido, desecado a temperatura ambiente y presión atmosférica, desecado a temperatura ambiente y presión disminuida, desecado a alta temperatura y presión atmosférica, y desecado a alta temperatura y presión disminuida.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho método de desecación es le método de desecado a una temperatura comprendida entre 15°C y 60°C, y presión disminuida inferior a la atmosférica.
17. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, obtenida tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%.
18. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción estabilizada, total o parcialmente desecada, obtenida tiene un grado de humedad comprendido entre el 1% y el 20%.
19. Una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, que comprende al menos, una enzima, y una mezcla estabilizante que comprende (i) al menos, un agente protector frente a la desecación, (ii) al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato, y (iii) al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados.
20. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente según la reivindicación 18, que tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%.
21. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, que tiene un grado de humedad comprendido entre 1% y 20%.
22. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, en el que dicha enzima se selecciona del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas .
23. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, que comprende una enzima seleccionada del grupo formado por enzimas de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de amplificación, secuenciación o caracterización de ácidos nucleicos, y sus mezclas, junto con la totalidad o parte de los reactivos necesarios para la realización de la reacción enzimática en la que interviene dicha enzima.
24. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 23, en la que dichos reactivos necesarios para la realización de la reacción enzimática en la que interviene dicha enzima se seleccionan del grupo formado por cofactores; sustratos de las enzimas; aditivos que mejoran o modulan las reacciones enzimáticas; dNTPs; ddNTPS; sondas y cebadores oligonucleotídicos, opcionalmente marcados; y sus mezclas.
25. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, que comprende una enzima ADN polimerasa o una enzima transcriptasa en reverso, termoestable o no, desoxinucleótidos trifosfato, opcionalmente marcados, los cofactores necesarios para la actividad enzimática y, opcionalmente, aditivos que mejoran o modulan dicha actividad enzimática.
26. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 25, que comprende, además, los cebadores oligonucleotídicos de reacción, opcionalmente marcados, necesarios para la amplificación específica de una secuencia nucleotídica objetivo, y/o sondas oligonucleotídicas, opcionalmente marcadas, necesarias para la realización de un ensayo de hibridación, junto con, opcionalmente, cualquier aditivo o coadyuvante de la reacción de hibridación.
27. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, que comprende, además, didesoxirribonucleótidos (ddNTPs) .
28. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, que comprende una enzima de restricción, junto con, opcionalmente, todos los cofactores y aditivos necesarios para la realización de un análisis de restricción.
29. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, presentada en una forma de presentación "lista para usar" (ready-to-use) .
30. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, en la que dicho agente protector frente a la desecación es un carbohidrato no reductor.
31. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 30, en la que dicho agente protector frente a la desecación se selecciona del grupo formado por un disacárido no reductor, un trisacárido no reductor, y sus mezclas.
32. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 30, en el que dicho agente protector frente a la desecación se selecciona del grupo formado por palatinitol (6-α-D-glucopiranosil-manitol) , trehalosa, rafinosa, melezitosa, y sus mezclas.
33. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, en la que dicha mezcla estabilizante comprende, además, de un carbohidrato no reductor como agente protector frente a la desecación, glicerol .
34. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, en la que dicho inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato es un inhibidor competitivo o un inhibidor no competitivo.
35. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 34, en la que dicho inhibidor de las reacciones de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato se selecciona del grupo formado por lisina, arginina, triptófano, betaína, derivados de aminoguanidina y sus mezclas.
36. Mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según la reivindicación 18, en la que dicho polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impida la movilidad de los reactivos desecados se selecciona del grupo formado por polivinilpirrolidona (PVP) , polietilenglicol (PEG) , dextrano, almidón, el compuesto denominado FICOLL, glucógeno, goma arábiga y sus mezclas.
37. Un kit que comprende una mezcla de reacción estabilizada y desecada total o parcialmente, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 36.
PCT/ES2002/000109 2001-03-12 2002-03-11 Procedimiento para la preparación de mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reacción y kits que las contienen Ceased WO2002072002A2 (es)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02714205.8A EP1374827B1 (en) 2001-03-12 2002-03-11 Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures
AU2002246125A AU2002246125B2 (en) 2001-03-12 2002-03-11 Process for preparing stabilized reaction mixtures which are partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures
JP2002570962A JP4448280B2 (ja) 2001-03-12 2002-03-11 部分的に乾燥した１つ以上の酵素を含む安定化された混合物の製造方法、混合物、および混合物を含有するキット
CA002408857A CA2408857A1 (en) 2001-03-12 2002-03-11 Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures
BRPI0204479-0B1A BR0204479B1 (pt) 2001-03-12 2002-03-11 processo para preparar misturas de reaÇço estabilizadas que sço total ou parcialmente secas, compreendendo pelo menos uma enzima, misturas de reaÇço e kits contendo as referidas misturas
IL152757A IL152757A (en) 2001-03-12 2002-03-11 Process for preparing stabilized, partially dried reaction mixtures containing at least one enzyme, reaction mixtures, and kits containing these mixtures
US10/292,848 US7919294B2 (en) 2001-03-12 2002-11-12 Process for preparing stabilized reaction mixtures which are partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP0100569 2001-03-12
ES200100569A ES2180416B1 (es) 2001-03-12 2001-03-12 Procedimiento para la preparacion de mezclas de reaccion estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reaccion y kits que las contienen.

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10/292,848 Continuation US7919294B2 (en) 2001-03-12 2002-11-12 Process for preparing stabilized reaction mixtures which are partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2002072002A2 true WO2002072002A2 (es) 2002-09-19
WO2002072002A3 WO2002072002A3 (es) 2002-11-28

Family

ID=8497049

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2002/000109 Ceased WO2002072002A2 (es) 2001-03-12 2002-03-11 Procedimiento para la preparación de mezclas de reacción estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reacción y kits que las contienen

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7919294B2 (es)
EP (1) EP1374827B1 (es)
JP (1) JP4448280B2 (es)
KR (1) KR20030036178A (es)
AU (1) AU2002246125B2 (es)
BR (1) BR0204479B1 (es)
CA (1) CA2408857A1 (es)
ES (1) ES2180416B1 (es)
IL (1) IL152757A (es)
WO (1) WO2002072002A2 (es)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2214144A1 (es) * 2003-02-26 2004-09-01 BIOTOOLS BIOTECHNOLOGICAL & MEDICAL LABORATORIES, S.A. Composicion estabilizada para ensayos fluorimetricos, colorimetricos o quimio-luminiscentes, kits que la contienen y procedimiento para su obtencion.
WO2011048227A1 (es) 2009-10-22 2011-04-28 Biotools Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. Composición, método y kit para la detección de bacterias mediante secuenciación
JP2011250792A (ja) * 2004-04-07 2011-12-15 Access Bio Inc 核酸検出システム
WO2013017702A1 (es) 2011-08-01 2013-02-07 2B Blackbio S.L. Método para la determinación del genotipo de secuencias múltiples
CN110093403A (zh) * 2019-03-19 2019-08-06 融智生物科技（青岛）有限公司 荧光pcr试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法
CN113308513A (zh) * 2021-05-27 2021-08-27 宁波瑞源生物科技有限公司 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6893877B2 (en) 1998-01-12 2005-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Methods for screening substances in a microwell array
US20020151040A1 (en) 2000-02-18 2002-10-17 Matthew O' Keefe Apparatus and methods for parallel processing of microvolume liquid reactions
US8277753B2 (en) 2002-08-23 2012-10-02 Life Technologies Corporation Microfluidic transfer pin
AU2003302264A1 (en) 2002-12-20 2004-09-09 Biotrove, Inc. Assay apparatus and method using microfluidic arrays
DE102004007526A1 (de) * 2004-02-17 2005-09-01 Oetjen, Georg-Wilhelm, Dr. Verfahren und Einrichtung zur Gefriertrocknung von Produkten
CA2559171A1 (en) 2004-03-12 2005-09-29 Biotrove, Inc. Nanoliter array loading
JP4896006B2 (ja) * 2004-04-08 2012-03-14 バイオマトリカ， インコーポレイテッド ライフサイエンスのためのサンプル保存とサンプル管理との統合
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
GB0414815D0 (en) * 2004-07-02 2004-08-04 Secr Defence Method for stabilising reagents which are useful for nucleic acid amplification
ATE415421T1 (de) * 2004-11-10 2008-12-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Deamidiertes interferon-beta
US20060242012A1 (en) * 2005-04-22 2006-10-26 Sumit Agarwal Determining or scoring properties to solicit to join ad network using advertiser or aggregated advertiser interest
US20070031914A1 (en) * 2005-08-05 2007-02-08 Wei Zhu Devices for analyte assays and methods of use
EP2210955A3 (en) * 2006-05-23 2010-09-15 Molecular Detection, Inc. Ambient temperature stable kits for molecular diagnostics
EP1870649A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-26 Octapharma AG Lyophilisation targetting defined residual moisture by limited desorption energy levels
US8900525B2 (en) * 2006-09-18 2014-12-02 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Preparation of glassified biological reagents
DE102006056790B3 (de) * 2006-12-01 2008-01-17 IfP Privates Institut für Produktqualität GmbH Laboreinmalartikel für Analyse und Diagnosik
US20100015628A1 (en) * 2007-02-28 2010-01-21 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Ambient temperature stable chemical/biological reagents on membranes or filters
US8097434B2 (en) 2007-10-19 2012-01-17 Becton, Dickinson And Company Methods for the detection of beta-lactamases
KR100978215B1 (ko) * 2008-02-28 2010-08-26 주식회사 인트론바이오테크놀로지 건조형태의 ｐｃｒ 반응용 조성물에 기반한 ｐｃｒ의 최적증폭 조건 탐색 및 설정에 활용될 수 있는 키트 및 그것의제조방법
EP2860260A1 (en) * 2008-04-11 2015-04-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
KR101008335B1 (ko) * 2008-05-28 2011-01-14 주식회사 썬제네틱스 핵산―관여 반응 촉매 효소의 반응혼합물
WO2010047778A1 (en) 2008-10-20 2010-04-29 Becton Dickinson And Company Compositions for the detection of intracellular bacterial targets and other intracellular microorganism targets
KR20110112301A (ko) 2008-11-18 2011-10-12 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트
WO2010107112A1 (ja) * 2009-03-19 2010-09-23 アークレイ株式会社 酵素乾燥時における活性低下の抑制方法
CN102803483B (zh) * 2009-06-12 2014-04-30 精密公司 用于微流体装置中taq 聚合酶的干燥储存的可再水合基质
AU2010258716B2 (en) 2009-06-12 2015-11-12 Revvity Health Sciences, Inc. Compositions and methods for dehydrated storage of on-board reagents in microfluidic devices
WO2011151473A1 (es) * 2010-06-02 2011-12-08 2B Blackbio S.L. Composición, método y kit para la detección de hongos y levaduras mediante secuenciación
US9376709B2 (en) 2010-07-26 2016-06-28 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing DNA and RNA in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
WO2012018639A2 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
KR20140143139A (ko) * 2012-03-08 2014-12-15 소니 주식회사 핵산 증폭 반응용 마이크로 칩의 제조 방법
CN102703429B (zh) * 2012-06-01 2013-09-18 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种可常温保存和运输的核酸等温扩增反应试剂
CN102703427B (zh) * 2012-06-01 2013-11-06 中国水产科学研究院黄海水产研究所 基于凝胶的核酸等温扩增试剂的保存方法
CN102703428B (zh) * 2012-06-01 2013-09-18 中国水产科学研究院黄海水产研究所 基于凝胶的多聚酶链式反应试剂保存方法及反应试剂
WO2014036520A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
WO2014100755A2 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Biomatrica, Inc. Formulations and methods for stabilizing pcr reagents
GB201301457D0 (en) 2013-01-28 2013-03-13 Fluorogenics Ltd Freeze-dried composition
EP3154338B1 (en) 2014-06-10 2020-01-29 Biomatrica, INC. Stabilization of thrombocytes at ambient temperatures
US9868944B2 (en) * 2014-12-19 2018-01-16 Roche Molecular Systems, Inc. Reaction mixtures
EP3303621B1 (en) * 2015-05-28 2025-07-02 Illumina Cambridge Limited Surface-based tagmentation
KR102787387B1 (ko) 2015-12-08 2025-03-26 바이오매트리카 인코포레이티드 적혈구 침강 속도의 감소
WO2017136782A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Mark Filipowsky Dried amplification compositions
RU2016114990A (ru) * 2016-04-18 2017-10-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Ниармедик Плюс" Стабилизированная смесь реагентов для молекулярной диагностики
DE112018002597B4 (de) 2017-05-19 2024-05-02 Gen-Probe Incorporated Getrocknete zusammensetzungen, die flap-endonuklease enthalten
WO2018226569A1 (en) * 2017-06-06 2018-12-13 Danisco Us Inc Use of betaine to stabilize and/or increase the activity of enzymes in stressful environments
WO2022104360A1 (en) * 2020-11-13 2022-05-19 Arnovick Travis J Freeze drying of aromatic plant matter

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0091258A2 (en) 1982-04-07 1983-10-12 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for stabilizing tumor necrosis factor and a stable aqueous solution or powder containing said factor
EP0140489A1 (en) 1983-08-05 1985-05-08 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for stabilizing immunologically active substances immobilized on an insoluble carrier and their use in the preparation of reagents for measuring physiologically active substances
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4891319A (en) 1985-07-09 1990-01-02 Quadrant Bioresources Limited Protection of proteins and the like
WO1991018091A1 (en) 1990-05-14 1991-11-28 Quadrant Holdings Cambridge Limited Stabilization of biological macromolecular substances and other organic compounds
WO1993000807A1 (en) 1991-07-03 1993-01-21 Cryolife, Inc. Method for stabilization of biomaterials
WO1996005809A1 (en) 1994-08-19 1996-02-29 Quadrant Holdings Cambridge Limited Improved method for stabilization of biological substances during drying and subsequent storage and compositions thereof
US5614437A (en) 1995-01-26 1997-03-25 Lsi Logic Corporation Method for fabricating reliable metallization with Ta-Si-N barrier for semiconductors
US5614387A (en) 1995-02-10 1997-03-25 Gen-Probe Incorporated Method of making stabilized enzyme compositions for nucleic acid amplification
US5861251A (en) 1996-10-15 1999-01-19 Bioneer Corporation Lyophilized reagent for polymerase chain reaction
US5935834A (en) 1994-11-11 1999-08-10 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Reverse transcriptase composition having improved storage stability
WO2001004135A2 (en) 1999-07-13 2001-01-18 The Regents Of The University Of Michigan Crosslinked dna condensate compositions and gene delivery methods

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2992237A (en) * 1961-07-11 Process for the production of com-
GB1261711A (en) * 1968-02-15 1972-01-26 Astra Ab Process for producing a penicillin acylose composition
US3892876A (en) * 1971-11-30 1975-07-01 Leiner & Sons Wales Limited P Process of preparing freeze-dried gelatin
US6290991B1 (en) * 1994-12-02 2001-09-18 Quandrant Holdings Cambridge Limited Solid dose delivery vehicle and methods of making same
GB9417211D0 (en) * 1994-08-25 1994-10-12 Solicitor For The Affairs Of H Nucleotide sequencing method
US5565318A (en) * 1994-09-02 1996-10-15 Pharmacia Biotech, Inc. Room temperature stable reagent semi-spheres
US5593824A (en) * 1994-09-02 1997-01-14 Pharmacia Biotech, Inc. Biological reagent spheres
US6964771B1 (en) * 1995-06-07 2005-11-15 Elan Drug Delivery Limited Method for stably incorporating substances within dry, foamed glass matrices
US6150094A (en) * 1996-05-23 2000-11-21 Qiagen Gmbh Use of an osmolyte for reducing or abolishing no-covalent interactions of biological molecules to inert surfaces
US5876992A (en) * 1996-07-03 1999-03-02 Molecular Biology Resources, Inc. Method and formulation for stabilization of enzymes
WO1998002532A1 (de) * 1996-07-16 1998-01-22 Invitek Gmbh Verfahren zur herstellung komplexer multienzymatischer lagerstabiler reaktionsgemische und deren verwendung
US6136578A (en) * 1997-03-12 2000-10-24 Novo Nordisk A/S Storage-stable liquid formulation comprising a laccase
US6436897B2 (en) * 1998-06-01 2002-08-20 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical formulations for IGF/IGFBP
US6225289B1 (en) * 1998-12-10 2001-05-01 Genvec, Inc. Methods and compositions for preserving adenoviral vectors
US6300073B1 (en) * 1999-10-01 2001-10-09 Clontech Laboratories, Inc. One step RT-PCR methods, enzyme mixes and kits for use in practicing the same

Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0091258A2 (en) 1982-04-07 1983-10-12 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Method for stabilizing tumor necrosis factor and a stable aqueous solution or powder containing said factor
EP0140489A1 (en) 1983-08-05 1985-05-08 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for stabilizing immunologically active substances immobilized on an insoluble carrier and their use in the preparation of reagents for measuring physiologically active substances
US4683202B1 (es) 1985-03-28 1990-11-27 Cetus Corp
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4891319A (en) 1985-07-09 1990-01-02 Quadrant Bioresources Limited Protection of proteins and the like
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683195B1 (es) 1986-01-30 1990-11-27 Cetus Corp
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
WO1991018091A1 (en) 1990-05-14 1991-11-28 Quadrant Holdings Cambridge Limited Stabilization of biological macromolecular substances and other organic compounds
WO1993000807A1 (en) 1991-07-03 1993-01-21 Cryolife, Inc. Method for stabilization of biomaterials
WO1996005809A1 (en) 1994-08-19 1996-02-29 Quadrant Holdings Cambridge Limited Improved method for stabilization of biological substances during drying and subsequent storage and compositions thereof
US5955448A (en) 1994-08-19 1999-09-21 Quadrant Holdings Cambridge Limited Method for stabilization of biological substances during drying and subsequent storage and compositions thereof
US5935834A (en) 1994-11-11 1999-08-10 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Reverse transcriptase composition having improved storage stability
US5614437A (en) 1995-01-26 1997-03-25 Lsi Logic Corporation Method for fabricating reliable metallization with Ta-Si-N barrier for semiconductors
US5614387A (en) 1995-02-10 1997-03-25 Gen-Probe Incorporated Method of making stabilized enzyme compositions for nucleic acid amplification
US5861251A (en) 1996-10-15 1999-01-19 Bioneer Corporation Lyophilized reagent for polymerase chain reaction
WO2001004135A2 (en) 1999-07-13 2001-01-18 The Regents Of The University Of Michigan Crosslinked dna condensate compositions and gene delivery methods

Non-Patent Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARCHIVES BIOCHEM. BIOPHYSICS, vol. 232, 1984, pages 400 - 497
CARPENTER ET AL., CRYOBIOLOGY, vol. 24, 1987, pages 455 - 464
CARPENTER ET AL., CRYOBIOLOGY, vol. 25, 1988, pages 244 - 255
CARPENTER ET AL., CRYOBIOLOGY, vol. 25, 1988, pages 459 - 470
CHIEN ET AL., J.BACTERIOL, vol. 127, 1976, pages 1550 - 1557
CLEGG, CRYOBIOLOGY, vol. 19, 1982, pages 306 - 316
COLACO ET AL., BIO/TECHNOL., vol. 10, 1992, pages 1007 - 1011
CROWE, BIOCHIMIA AND BIOPHYSICA ACTA, vol. 769, 1984, pages 141 - 150
CRYOBIOLOGY, vol. 20, 1983, pages 346 - 356
IGAKI, J. JPN. DIABETES SOC, vol. 34, 1991, pages 403 - 407
J. SAMBROCK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.", 1989
JONES ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 17, 1989, pages 8387 - 8388
KALEDIN ET AL., BIOKHIMIYA, vol. 45, 1980, pages 644 - 651
KARKAS ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 70, 1973, pages 3834 - 3838
KWOK, S. ET AL., NATURE, vol. 339, 1989, pages 237 - 238
LEOB ET AL., NATURE NEW BIOL., vol. 242, 1973, pages 66 - 69
MATTHEWS, FASEB J., vol. 10, 1996, pages 35 - 41
MEN6NDEZ-ARIAS; ARGOS, J. MOL. BIOL., vol. 206, 1989, pages 397 - 406
MOCHARLA ET AL., GENE, vol. 93, 1990, pages 271 - 275
O. TOORU, CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 95, 1981, pages 517
PACE ET AL., FASEB J., vol. 10, 1996, pages 75 - 83
PIKAL M.J., BIOPHARM, vol. 3, 1990, pages 18 - 20,22-23,26-27
RENTIER-DELRUE ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 229, pages 85 - 93
ROSER B., BIOPHARM, vol. 4, 1991, pages 47 - 53
RUTTIMANN ET AL., EUR. J. BIOCHEM, vol. 149, 1985, pages 41 - 46
SAIKI ET AL., SCIENCE, vol. 230, 1985, pages 1350 - 1354
SAIKI ET AL., SCIENCE, vol. 239, 1988, pages 487 - 491
WARREN; PETSKO, PROT. ENG., vol. 8, 1995, pages 905 - 913
WATANABE ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 266, 1991, pages 24287 - 24294
YIP ET AL., STRUCTURE, vol. 3, 1995, pages 1147 - 1158

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2214144A1 (es) * 2003-02-26 2004-09-01 BIOTOOLS BIOTECHNOLOGICAL & MEDICAL LABORATORIES, S.A. Composicion estabilizada para ensayos fluorimetricos, colorimetricos o quimio-luminiscentes, kits que la contienen y procedimiento para su obtencion.
WO2004076656A1 (es) * 2003-02-26 2004-09-10 Biotools Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. Composición estabilizada para ensayos fluorimétricos, colorimétricos o quimio-luminiscentes, kits que la contienen y procedimiento para su obtención
ES2214144B1 (es) * 2003-02-26 2005-09-01 BIOTOOLS BIOTECHNOLOGICAL & MEDICAL LABORATORIES, S.A. Composicion estabilizada para ensayos fluorimetricos, colorimetricos o quimio-luminiscentes, kits que la contienen y procedimiento para su obtencion.
JP2011250792A (ja) * 2004-04-07 2011-12-15 Access Bio Inc 核酸検出システム
WO2011048227A1 (es) 2009-10-22 2011-04-28 Biotools Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. Composición, método y kit para la detección de bacterias mediante secuenciación
WO2013017702A1 (es) 2011-08-01 2013-02-07 2B Blackbio S.L. Método para la determinación del genotipo de secuencias múltiples
CN110093403A (zh) * 2019-03-19 2019-08-06 融智生物科技（青岛）有限公司 荧光pcr试剂的冻干保护剂以及冻干芯片的制备方法
CN113308513A (zh) * 2021-05-27 2021-08-27 宁波瑞源生物科技有限公司 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL152757A0 (en) 2003-06-24
IL152757A (en) 2009-02-11
BR0204479B1 (pt) 2013-07-16
EP1374827B1 (en) 2016-12-21
KR20030036178A (ko) 2003-05-09
ES2180416A1 (es) 2003-02-01
JP2004519242A (ja) 2004-07-02
US20030119042A1 (en) 2003-06-26
CA2408857A1 (en) 2002-09-19
WO2002072002A3 (es) 2002-11-28
ES2180416B1 (es) 2004-06-01
AU2002246125B2 (en) 2008-02-07
BR0204479A (pt) 2004-02-17
JP4448280B2 (ja) 2010-04-07
EP1374827A2 (en) 2004-01-02
US7919294B2 (en) 2011-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2180416B1 (es) Procedimiento para la preparacion de mezclas de reaccion estabilizadas, total o parcialmente desecadas, que comprenden, al menos, una enzima, mezclas de reaccion y kits que las contienen.
JP3282819B2 (ja) 核酸増幅用の安定化された酵素組成物
EP2021508B1 (en) Ambient temperature stable kits for molecular diagnostics
US6294365B1 (en) Method and formulation for stabilization of enzymes
Reardon Human immunodeficiency virus reverse transcriptase: steady-state and pre-steady-state kinetics of nucleotide incorporation
ES3022638T3 (en) Recombinase polymerase amplification reagents
ES2478890T3 (es) Composición lista para usar seca y estabilizada que contiene enzimas de polimerización de ácidos nucleicos para aplicaciones en biología molecular
ES2717538T3 (es) Mezclas de reacción estables
WO2017184028A1 (en) Stabilized mixture of reagents for molecular diagnostics
Ono et al. Inhibitory effects of 9-β-D-arabinofuranosylguanine 5′-triphosphate and 9-β-D-arabinofuranosyladenine 5′-triphosphate on DNA polymerases from murine cells and oncornavirus
US20020039771A1 (en) Method for producing complex multienzymatical, storage resistant reaction mixtures and use thereof
WO1996015235A1 (en) Stably preservable reverse transcriptase composition
CN114606300A (zh) 一种用于核酸检测的冻干体系
Okano et al. Enhanced detection of RNA by MMLV reverse transcriptase coupled with thermostable DNA polymerase and DNA/RNA helicase
US20130280695A1 (en) Method, device and test kit for molecular-biological reactions
KR100436126B1 (ko) 개선된 안정성을 갖는 효소 반응 전혼합물
CN112481253A (zh) 用于pcr预混液的冻干保护处方
Hunt et al. Inhibition by aurintricarboxylic acid and polyethylene sulfonate of RNA transcription of vesicular stomatitis virus
Morgan et al. Pyridoxal phosphate as a probe of reovirus transcriptase
Tosi et al. Effect of trypsin on DNA methylation in isolated nuclei from developing sea urchin embryos
YOSHIDA et al. Arabinosylnucleoside 5′-triphosphate inhibits DNA primase of calf thymus
WO2022114981A1 (en) Production and use of a freeze-dried or ready-for-lyophilization human rnase inhibitor
US20100081176A1 (en) Enzyme-containing capsules and nucleic acid amplification kits
KR100857889B1 (ko) 건조 라이게이즈 조성물 및 이의 제조 방법
Miura et al. Immobilization of urea cycle enzymes. I. Characterization of immobilized carbamoylphosphate synthetase and ornithine carbamoyltransferase

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002246125

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 152757

Country of ref document: IL

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10292848

Country of ref document: US

Ref document number: 2408857

Country of ref document: CA

Ref document number: 1020027015148

Country of ref document: KR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2002714205

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002714205

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020027015148

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002714205

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642