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WO2002070134A1 - Moyens pour l'extraction de produits a analyser et leurs applications en diagnostic et analyse - Google Patents

Moyens pour l'extraction de produits a analyser et leurs applications en diagnostic et analyse Download PDF

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WO2002070134A1
WO2002070134A1 PCT/FR2002/000762 FR0200762W WO02070134A1 WO 2002070134 A1 WO2002070134 A1 WO 2002070134A1 FR 0200762 W FR0200762 W FR 0200762W WO 02070134 A1 WO02070134 A1 WO 02070134A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tube
capillary
extraction
analysis
products
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/000762
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre Commercon
Henri-Pierre Deliou
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Scp Dosagene R & D
Original Assignee
Scp Dosagene R & D
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scp Dosagene R & D filed Critical Scp Dosagene R & D
Priority to EP02708442A priority Critical patent/EP1370359A1/fr
Priority to US10/469,681 priority patent/US20040247487A1/en
Publication of WO2002070134A1 publication Critical patent/WO2002070134A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N35/1079—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices with means for piercing stoppers or septums
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5021—Test tubes specially adapted for centrifugation purposes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/046—Function or devices integrated in the closure
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
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    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1032—Dilution or aliquotting
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]

Definitions

  • the invention relates to means, devices, methods and kits, for the extraction of products to be analyzed contained in a layer situated in a gradient, continuous or discontinuous, of different products in liquid medium.
  • products covers products in solution and liquids.
  • the inventors have developed means of extraction, devices, methods and kits, from any fraction positioned anywhere in a continuous or discontinuous gradient of different products. From a separation based on the difference of density, real or apparent, these means make it possible to completely isolate any fraction, without mixing phenomenon.
  • the inventors have also developed injection means, devices, methods and kits, making it possible to deposit the layers in an analysis tube without mixing at the interfaces, the specific extraction of one or more layers then being carried out. according to a given technique, in particular as aimed according to the invention.
  • the invention therefore aims to provide such means for selective extraction of products to be analyzed contained in a layer of a density gradient.
  • the invention further relates to the applications of injection and / or extraction means for analysis and diagnosis, by exploiting their advantages of selectivity, reliability and simplicity.
  • the device for extracting one or more bands containing the products or constituents sought from an analysis tube (1) comprising a plurality of distinct bands, contiguous or overlapping, in a liquid medium, forming a continuous or discontinuous gradient density (2), is characterized in that it comprises
  • extraction capillary pre-positionable as a function of the layer to be extracted, and means for obtaining a laminar flow without aspiration of one or more strips from the tube, either by overpressure applied to the top of the liquid medium, with a fluid, gas or liquid of low density, or by exerting a centrifugal o'rce. Thanks to these provisions, it is possible to extract without mixing with this technique, successively and laminar, all the layers.
  • the invention also relates to a specific extraction process for one or more strips containing the desired products or constituents from an analysis tube as indicated above.
  • This process is characterized by the following stages: - an extraction capillary is introduced into a standard analysis tube by means of a guide ensuring its positioning in the space at the desired height relative to the strip to be extracted or, as a variant, an analysis tube is used with a capillary pre-positioned at the desired height, located inside or partially outside the tube, and - means are applied to obtain a laminar flow without aspiration, either by overpressure with a fluid, gas or liquid of low density, or by exerting a centrifugal force.
  • kits for performing said extractions are characterized in that they include all or part of the extraction device as defined above, and the products for implementing the extraction method of the invention, such as the separating medium and / or reagents allowing a selective separation of sought constituents.
  • the injection into a product analysis tube, in the form of successive layers, by introduction of predetermined quantities of products or liquids with different densities is carried out using a device characterized in that the analysis tube (1) comprises injection means allowing the tangential arrival of the products in predetermined quantities.
  • Such a device facilitates handling, standardizes the deposition of the layers at predetermined product heights and makes it possible to avoid mixing of the products at the interfaces, thus solving the fundamental difficulty of mixing the products with level of interfaces between the different layers.
  • the injection process using such a device also comes within the scope of the invention. This process is characterized in that the required quantities of products or liquids for a given layer are injected into the analysis tube, using a pipette or a calibrating distributor. so as to bring the product tangentially to the surface of the previous layer or, alternatively, said products or liquids are introduced into the analysis tube using a needle with a tangential injection tip, the penetration height being pre-determined according to the height of the layers previously formed.
  • kits for injecting successive layers of products into an analysis tube comprising all or part of an injection device as defined above and individual doses of products or liquids pre-calibrated according to the stack of layers to be produced.
  • the invention provides means of separation of high specificity of sought-after products for analysis and is in particular of great interest. for the separation of the different constituents of a mixture.
  • the invention relates in particular to the application of these devices and / or methods and / or kits for separating the constituents of a blood mixture in a separating medium containing, where appropriate, an anti-aggregan, and for recovering them selectively.
  • the invention relates especially to such an application for extracting fetal erythroblasts from maternal blood, which allows early detection of fetal genetic diseases during gestation. It is known that, in the separation of nucleated fetal cells from maternal cells, it is usual to use variations in cell density, for obvious reasons of simplicity.
  • Percoll® makes it possible to achieve a continuous density gradient. Given its accuracy, this method is often used to separate fetal cells from adult cells. Part of the Percoll® gradient is used to recover very pure fetal cells, but in very small quantities.
  • the Ficoll® technique allows discontinuous gradients and the recovery of more fetal erythroblasts. The problem with this method is the elimination of contaminating adult cells collected at the same time as the fetal cells.
  • the invention therefore relates to a method for separating the constituents of maternal blood during gestation, in an analysis tube containing a separating medium allowing a density gradient to be obtained, and advantageously diluted maternal blood, characterized in that incorporates into the tube a layer of separating medium diluted between the layer of blood and that of separating medium and the contents of the tube are subjected to centrifugation so as to separate the constituents of the blood into distinct layers.
  • FIGS. 1A to 1E of the devices for extracting by overpressure FIG. 2
  • FIG. 2 a device for extracting by centrifugal force
  • FIGS. 3A and 3B injection devices
  • the means capable of exerting an overpressure in the analysis tube (1) form a hermetically sealed system, at the time of extraction, with the density gradient (2) and the extraction capillary (3).
  • These means include, in a variant shown in FIG. 1A, a plug (4) intended to close the analysis tube (1) in a leaktight manner and a pressure relief tube (5) for entering said fluid.
  • said means comprise an element whose displacement makes it possible to vary the volume of the gas phase in the head part of the analysis tube, such as a piston, a membrane or a plug.
  • an extraction device comprising an extraction capillary (3) integral with a piston (8).
  • the piston (8) actuable by a pusher (9) is provided with a concealable exhaust (10). When the piston is put in place until it rests on a stop (11), this exhaust prevents the tube from being pressurized.
  • the extraction capillary (3) is flexible. Its end is weighted with a mass (12) so as to constitute a ludion.
  • the end of the extraction capillary is positioned in the liquid medium according to the apparent density of the ludion.
  • the apparent density of the ludion is determined as a function of that of the fraction to be extracted.
  • said means comprise a plug (4) intended to seal the analysis tube (1) and a heating element (not shown) placed in the upper part of the tube or in the plug, causing the expansion of the gas phase so as to obtain the overpressure.
  • said means allowing a laminar flow are means capable of exerting a centrifugal force and comprise a support tube (8) able to be placed with the analysis tube (1) in a centrifuge (not shown), the support tube (8) containing a recovery capillary (9) with a straight or spiral return branch (10).
  • the recovery capillary (9) is connected to the extraction capillary (3) and forms a siphon relative to this capillary.
  • Part or all of the strips present in the analysis tube, located above the mouth of the extraction capillary, can be contained in the recovery system (9). This system is for example a coil.
  • a mass forming a piston (not shown) is added to the analysis tube.
  • the extraction capillary (3) is able to be positioned at variable height in the analysis medium, vertically or not, or ' as a variant is fixed inside or outside the tube.
  • the extraction capillary forms a siphon.
  • the extraction capillary is provided with a tap (6).
  • the extraction capillary (3) is associated with a recovery capillary (7).
  • This recovery capillary is for example spiral or straight.
  • the extraction (3) or recovery (7) capillary can be marked or engraved by marks at positions determined according to the expected positioning of the fraction (s), and is possibly breakable at the marks.
  • the interior of the extraction (3) or recovery (7) capillary can be completely or partially filled with one or more biological and / or physical and / or chemical reagents. These are for example antigens, receptors, antibodies, proteins, molecular biology probes, lectins.
  • the capillary is then assimilated to a liquid chromatographic column.
  • the lower layers serve as a pusher for the fractions contained in the capillary.
  • the diameter of the capillary influences the rheological properties of certain products.
  • certain products are more or less braked, thus making it possible to refine the quality of the separation.
  • the upper outlet of the extraction capillary (3), or if necessary of the recovery capillary (7) which is associated with it, can be connected to a fraction collector or directly to the input of an analyzer, for example a UV, mass, NMR spectrometer, an HPLC or a CPG (not shown).
  • an analyzer for example a UV, mass, NMR spectrometer, an HPLC or a CPG (not shown).
  • said means allowing a laminar flow defined above comprise an analysis tube (1) with at least two conductive strips subjected to a potential difference or, alternatively, the analysis tube is placed in a magnetic field.
  • This system can be in place, partially or completely, before the layers are separated. It makes it possible to continuously extract all or part of the constituents previously separated by density.
  • the various embodiments of the devices according to the invention are advantageously used to specifically extract one or more bands containing the desired products or constituents from an analysis tube comprising a plurality of bands as defined above.
  • the laminar flow of the strip to be recovered is ensured towards an extraction capillary, by exerting an overpressure in the hermetically closed analysis tube, the desired strip is recovered. from the extraction capillary, the operation being continued to obtain other bands if desired, going successively from the densest band to the least dense band, without re-mixing from bottom to top.
  • the overpressure is obtained by variation of pressure, temperature or volume.
  • the pressure variation is exerted by injecting a fluid into the analysis tube via a so-called overpressure tube.
  • a fluid an inert gas, air, or is used. still a low density liquid.
  • a variation in volume is exerted in the head part of the analysis tube using an element such as a piston, membrane or movable plug.
  • the piston (8) actuable by a pusher (9) is provided with a concealable exhaust (10).
  • a concealable exhaust 10
  • the piston When the piston is put in place until it rests on a stop (11), this exhaust prevents the tube from being pressurized.
  • the end of the extraction capillary is then positioned just above the fraction to be extracted. Then the exhaust - is closed in order to make the "tube-piston" system watertight.
  • the pressure exerted on the pusher is transmitted to the piston and to all the layers of the liquid located in the tube above " 1. ' end of the extraction capillary.
  • the fractions located below the end of the extraction capillary rise successively inside the extraction capillary and then in the recovery capillary.
  • Another variant consists in exerting a temperature variation by heating the head portion. After positioning the extraction capillary, the content of the analysis tube is then heated using a heating device which causes the expansion of the head portion of the analysis tube and generates the desired overpressure for 1 ' extraction of the tape to be recovered. The entire density gradient is then pushed down, the upper layers being supported uniformly on the lower layers.
  • the desired strip is recovered from the extraction capillary, the operation being continued to obtain other strips if desired, going successively from bottom to top, from the densest strip to the least dense strip, without re ⁇
  • the overpressure pushes all the fractions located above the lower mouth of the extraction capillary. They rise successively inside the capillary. They emerge from the capillary by siphon in increasing order of densities, real or apparent. (The densest comes out first).
  • the fraction to be extracted rises in the extraction capillary, without disturbing either the lower layer or the upper layers, which makes it possible to completely, successively and continuously extract, the different upper layers in reverse order (the most dense first) without contamination or mixing and without extracting the higher density downstream layers.
  • an extraction capillary comprising a tap is used, which makes it possible, by opening the tap, to receive the layer to be extracted. By then closing the tap, the extracted fraction is isolated from the atmosphere, at the outlet of the extraction capillary. The capillary is then gently removed from the analysis tube and the layer is recovered by expelling it by putting it into the atmosphere, then it is deposited on a support provided for this purpose.
  • This variant makes it possible to protect the isolated fraction from the air, to maintain it in its environment, and thus to ensure transport between the extraction device and the place of analysis.
  • a collecting capillary is connected to the extraction capillary, which makes it possible to specifically retain a part or a constituent of the fraction or to specifically retain a contaminant.
  • the laminar flow of the strip to be recovered is ensured by exerting a centrifugal force.
  • a support tube is placed comprising a fraction recovery system in a centrifuge next to the analysis tube, the recovery system being connected to the extraction capillary, and the two tubes are subjected to a centrifugal force ensuring the passage of the strips situated above the mouth of the extraction capillary in the recovery system, the operation being applied with different durations to other bands if desired.
  • the recovery system is removed from its support tube and the section or sections containing the desired strip or strips are cut. These sections can correspond to previously established benchmarks.
  • a coil is used as the recovery system.
  • the extraction is carried out in the presence of an electric field or a magnetic field.
  • the process of the invention is advantageously applied to separate layers using, for example, Ficoll®, Percoll®, albumin, cesium chloride, polyvinylpyrrolidone (PVP), glucose, glycerol or silica colloid.
  • Ficoll® Percoll®
  • Percoll® albumin
  • cesium chloride cesium chloride
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • glucose glycerol
  • silica colloid silica colloid
  • the injection means consist of a capillary (11) integral with the internal wall of the analysis tube, comprising notches perpendicular (12) to the tube analysis
  • the capillary is for example glued to the inside of the tube, or as a variant, is formed by extrusion during the manufacture of the tube.
  • the injection means are constituted by an injection needle (13) whose penetration height in the tube is predetermined and / or having a nozzle tangential injection (14).
  • the invention also relates to a method for injecting products into an analysis tube, in the form of successive layers.
  • This process is characterized by the successive introduction of predetermined quantities of said products so as to ensure a tangential arrival of these products on the previous layer.
  • This introduction is advantageously carried out by injecting into the capillary, using a pipette or a calibrating distributor, the required quantities of products or liquids for a given layer, so as to bring the product tangentially on the surface of the previous layer.
  • the products or liquids are added in order of increasing density, below the lower surface of the previous layer, or alternatively in order of decreasing density above the upper surface of the previous layer.
  • a needle is introduced into the analysis tube with a tangential injection tip, the penetration height being predetermined according to the height of the layers previously formed.
  • Ficoll Histo-paque consists of polysucrose and sodium diatrizotate, in variable quantities so as to obtain three isotonic liquids of different densities: 1.077, • 1.083; 1,119.
  • This reagent makes it possible to separate the mononuclear elements from whole blood.
  • FIG. 4A shows an analysis tube containing a lower layer (15) of 2 ml of pure Ficoll® of density 1.077 and an upper layer (16) of 1 ml of blood diluted with 1 ml of PBS. After centrifugation for 20 min. at 600 g, as shown in FIG. 4B, layers of red blood cells (17) and of polymorphonuclear cells (18) are obtained from bottom to top, a layer of Ficoll® (19), then a band of lymphocytes (20) surmounted a plasma band or fraction (21).
  • the red cells collect in "stacks of plates", constituting a “training roller”, which implies a profound modification of the charges of the red cells,
  • lymphocytes do not enter the Ficoll®, but are placed on it, at the interface with the serum,
  • Ficoll® 1,119 allows to have an interface between the red blood cells and the polynuclear cells, thus facilitating recovery of an erythrocytic pellet theoretically free of polymorphonuclear cells.
  • Ficoll® during the aggregation of red blood cells in a "formation roller", fetal erythroblasts and polymorphonuclear cells are randomly imprisoned.
  • the erythroblasts are not visible in the lymphocyte band.
  • the addition of 200 ⁇ l of pure fetal blood to the maternal blood collected between the 14th and 17th week of gestation shows a thin band of erythroblasts visible in grazing light on a black background. These erythroblasts appear individualized in a band located between the lymphocyte band and the Ficoll®.
  • Ficoll® As suitable separating medium, mention will be made of Ficoll®,
  • Percoll® glucose, albumin, cesium chloride, polyvinylpyrrolidone (PVD), glycerol or colloidal silica. Satisfactory results are obtained by using pure Ficoll® as a separating medium and for the separation of the doublet of phocytes-erythroblasts from Ficoll® diluted to 15-25%, in particular to 20%.
  • the pure Ficoll® advantageously has a density of 1.083 and the diluted Ficoll® of 1.069.
  • the blood sample is advantageously diluted with PBS or physiological saline.
  • FIG. 5A illustrates a tube containing, from bottom to top, the layers of pure Ficoll® (22), diluted Ficoll® (23) and diluted blood (16).
  • FIG. 5B shows the separation into different layers after centrifugation, namely from bottom to top, the layers of red blood cells (24), of pure Ficoll® (22), of erythroblasts (25), of diluted Ficoll® (23) , mph cells
  • the deposition of successive layers is advantageously; produced according to the techniques of the invention by first introducing the pure separating medium, then the diluted separating medium, and finally the diluted blood mixture, optionally containing an anti-aggregating agent.
  • the extraction techniques defined above the removal of the desired strip is carried out in a remarkably simple manner.
  • tinted red, - lymphocytes represent 10 to 30% of nucleated cells; their cores are tinted blue by MGG staining,
  • - fetal and adult erythroblasts represent 60 to 80% of the nucleated cells in the extracted layer.
  • the optical intensity of the layer with erythroblasts is proportional to the concentration of erythroblasts and red blood cells which are in large numbers, which suggests the formation of an erythroblast-red blood cell complex.
  • the technique of the invention makes it possible to considerably increase the concentration of erythroblasts in this layer, which thus passes from 10 " to 10 " 1 erythroblasts / red blood cells.
  • the technique can be further improved by activating the extraction or recovery capillary either to fix the fetal cells by using for example (anti CD71 antibodies, anti-fetal hemoglobin, anti-i ...), or by fixing the cells maternal contaminants (adult anti-hemoglobin antibody, anti-I, and lectins, for example Aplysia lectin gonad).
  • this technique can be extended to the isolation of cancer cells.
  • This process which makes it possible to fix fetal cells or to eliminate contaminating adult cells by fixation, can be generalized to isolation by fixation of cells.
  • cancerous using anti-i
  • removing contaminating healthy cells using anti-I or Aplysia Gonad Lectin
  • the red blood cells trapped in the "roll formation” are normal, that is, shaped like a flattened disc. This particular shape allows their stacking.
  • Observation under the microscope of "tracer red blood cells” (GRT) in the erythroblatic layer shows that they have escaped the "roll formation” process.
  • GRT trace red blood cells
  • Their shapes are characteristic, and are mostly spherical or “pear” shaped.
  • the morphologies of such GRTs obtained from the blood of patients with certain red blood cell abnormalities make it possible to characterize aged or sick cells, as observed for example in Minkowsky pathologies, or in the case of thalassemia, immature cells or those with anomalies in shape.
  • an anti-aggregant to the blood sample makes it possible to obtain a layer of red blood cells having reacted with the anti-aggregant, which provides means for studying the efficacy and dosage of blood anti-aggregants for the treatment of blood pathologies.
  • the invention thus provides the means of disposing of the various constituents of the blood in quantities and degrees of purity allowing analyzes and diagnostics to be carried out under particularly favorable conditions.
  • the invention thus relates in particular to the application of the layers of erythroblasts recovered for the establishment of prenatal diagnoses of genetic pathologies. It also relates to the use of the lymphocytair.es layers recovered for example in cytapheresis applications.
  • erythroblasts mixed with red blood cells located in the intermediate band, of approximately 150 to 200 ⁇ i v.
  • the layer containing the desired constituents is extracted into a maximum of 500 ⁇ l of Ficoll® using the extraction techniques described above and recovered . in a conical tube.
  • Washing comprising: - diluting the product layer in 2 ml of PBS + Albumin (FV) 0.5 g / 100 ml,
  • the recovered product is resuspended in pure PBS or PBS-A, QSP 0.5 ml. 250 ⁇ l are placed on 2 microscope slides, according to the usual cytospin technique. For the purposes of observation under the microscope, staining is carried out according to the usual technique M. G. G.
  • the extraction devices and methods defined above are advantageously applied in the fields of research, to establish a biological diagnosis, or to perform an analysis, or in general in the field of industrial production, of the drug. Mention will be made, by way of examples, of the DNA / RNA separations,

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Abstract

L'invention vise des moyens pour l'extraction de produits à analyser. Ces moyens comprennent un dispositif d'extraction d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse (1) comportant une pluralité de bandes distinctes, contigües ou chevauchantes, en milieu liquide, formant un gradient continu ou discontinu de densité (2), caractérisé en ce qu'il comprend: un tube d'analyse (1) standard, un tube ou capillaire d'extraction (3), pré-positionnable en fonction de la couche à extraire, et des moyens pour obtenir un écoulement laminaire d'une ou plusieurs bandes du tube sans aspiration, soit par surpression appliquée sur le dessus du milieu liquide avec un fluide, gaz ou liquide de faible densité, soit en exerçant une force centrifuge. Applications à l'extraction d'une ou plusieurs couches de constituants par exemple d'un mélange sanguin.

Description

MOYENS POUR L'EXTRACTION DE PRODUITS A ANALYSER ET LEURS APPLICATIONS EN DIAGNOSTIC ET ANALYSE.
L'invention se rapporte à des moyens, dispositifs, procédés et kits, pour l'extraction de produits à analyser contenus dans une couche située dans un gradient, continu ou discontinu, de différents produits en milieu liquide. Le terme "produits" couvre des produits en solution et des liquides.
Elle est également relative aux applications en analyse et en diagnostic de ces moyens, notamment au dépistage précoce des maladies génétiques fœtales .
L.' établissement d'un diagnostic impose souvent l'isolement par extraction des constituants recherchés, présents dans une couche séparée par gradient de densité. Dans la description et les revendications, les termes "couche", "bande" ou "fraction" seront utilisés indifféremment pour désigner les produits séparés suivant leur densité réelle ou apparente. Dans la pratique courante du laboratoire, cette couche est extraite par le technicien, à partir d'un tube d'analyse, par aspiration, par perçage ou par coupure de tube, ce qui pose au moins deux difficultés majeures : la bande désirée est isolée partiellement et elle est contaminée par les régions en amont et en aval à la suite d'un écoulement turbulent, source de remélange annihilant l'efficacité de la technique de séparation par densité. En effet, la dépression nécessaire à l'aspiration du produit provoque un vortex qui mélange les couches voisines. On notera que l'expression "tube .d'analyse" est utilisée dans son sens le plus général pour désigner tout récipient.
Pour remédier aux inconvénients ci -dessus, les inventeurs ont développé des moyens d'extraction, dispositifs, procédés et kits, de n'importe quelle fraction positionnée n'importe où dans un gradient continu ou discontinu de différents produits . A partir d'une séparation basée sur la différence de densité, réelle ou apparente, ces moyens permettent d'isoler totalement n'importe quelle fraction, sans phénomène de mélange.
Les inventeurs ont également mis au point des moyens d'injection, dispositifs, procédés et kits, permettant de déposer les couches dans un tube d'analyse sans mélange au niveau des interfaces, l'extraction spécifique d'une ou plusieurs couches étant ensuite réalisée selon une technique donnée, en particulier telle que visée selon l'invention.
L'invention a donc pour but de fournir de tels moyens d'extraction sélective de produits à analyser contenus dans une couche d'un gradient de densité.
Elle vise également à fournir des moyens d'injection de telles couches.
L'invention vise en outre les applications des moyens d'injection et/ou d'extraction pour l'analyse et le diagnostic, en mettant à profit leurs avantages de sélectivité, de fiabilité et 'de simplicité.
Le dispositif d'extraction d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse (1) comportant une pluralité de bandes distinctes, contiguës ou chevauchantes, en milieu liquide, formant un gradient continu ou discontinu de densité (2) , est caractérisé en ce qu'il comprend
- un tube d'analyse (1) standard, - un tube d'extraction (3), appelé ci-après capillaire d'extraction, pré-positionnable en fonction de la couche à extraire, et des moyens pour obtenir un écoulement laminaire sans aspiration d'une ou plusieurs bandes -du tube, soit par surpression appliquée sur le dessus du milieu liquide, avec un fluide, gaz ou liquide de faible densité, soit en exerçant une o'rce centrifuge . Grâce à ces dispositions, il est possible d'extraire sans mélange avec cette technique, successivement et laminairement, toutes les couches .
L'invention vise également un procédé d'extraction spécifique d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse comme indiqué plus haut .
Ce procédé est caractérisé par les étapes suivantes : - on introduit dans un tube d'analyse standard un capillaire d'extraction au moyen d'un guide assurant son positionnement dans 1 ' espace à la hauteur voulue par rapport à la bande à extraire ou, en variante, on utilise un tube d'analyse avec un capillaire pré-positionné à la hauteur voulue, situé à l'intérieur ou en partie à l'extérieur du tube, et - on applique des moyens pour obtenir un écoulement laminaire sans aspiration, soit par surpression avec un fluide, gaz ou liquide de faible densité, soit en exerçant une force centrifuge .
L'invention fournit également des kits permettant de réaliser lesdites extractions . Ces kits sont caractérisés en ce qu'ils comprennent tout ou partie du dispositif d'extraction tel que défini ci-dessus, et les produits pour la mise en œuvre du procédé d'extraction de l'invention, tels que le milieu séparateur et/ou des réactifs permettant une séparation sélective de constituants recherchés.-
. Le procédé d'extraction défini ci-dessus est avantageusement appliqué à des couches déposées., selon l'invention, à des hauteurs déterminées et selon une technique originale permettant d'éviter le mélange des produits au niveau des interfaces. Ainsi, conformément à l'invention, l'injection dans un tube d'analyse de produits, sous forme de couches successives, par introduction de quantités pré-déterminées de produits ou de liquides avec des densités différentes est réalisée à l'aide d'un dispositif caractérisé en ce que le tube d'analyse (1) comprend des moyens d'injection permettant l'arrivée tangentielle des produits en quantités pré-déterminées .
On observera avec intérêt qu'un tel dispositif facilite les manipulations, standardise le dépôt des couches à des hauteurs de produits pré-déterminées et permet d'éviter le mélange des produits au niveau des interfaces, résolvant ainsi la difficulté fondamentale du mélange des produits au niveau des interfaces entre les différentes couches. Le procédé d'injection à l'aide d'un tel dispositif entre également dans le champ de l'invention. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on procède à l'injection dans le tube d'analyse, à l'aide d'une pipette ou d'un distributeur calibrateur, des quantités requises de produits ou de liquides pour une couche donnée, de manière à amener le produit tangentiellement à la surface de la couche précédente ou, en variante, on introduit lesdits produits ou liquides dans le tube d'analyse à l'aide d'une aiguille avec un embout d'injection tangentielle, la hauteur de pénétration étant pré-déterminée selon la hauteur des couches préalablement formées .
Selon encore un autre aspect, l'invention vise des kits pour l'injection de couches successives de produits dans un tube d'analyse, ces kits comprenant tout ou partie d'un dispositif d'injection tel que défini plus haut et des doses individuelles de produits ou de liquides pré-calibrées en fonction de l'empilement des couches à réaliser.
Avec les dispositifs, procédés et kits décrits ci-dessus pour la préparation des couches de produits et 1 ' extraction des constituants recherchés, l'invention fournit des moyens de séparation de grande spécificité de produits recherchés pour une analyse et présente en particulier un grand intérêt pour la séparation des différents constituants d'un mélange. L'invention vise en particulier l'application de ces dispositifs et/ou procédés et/ou kits pour séparer les constituants d'un mélange sanguin dans un milieu séparateur contenant le cas échéant un anti-agrégan , et pour les récupérer de manière sélective.
L'invention vise tout spécialement une telle application pour extraire les érythroblastes fœtaux du sang maternel, ce qui permet un dépistage précoce des maladies génétiques fœtales au cours de la gestation. On sait que, dans la séparation des cellules fœtales nucléées, par rapport aux cellules maternelles, il est habituel d'utiliser les variations de densité cellulaire, pour des raisons évidentes de simplicité.
Les deux techniques les plus connues sont basées sur l'utilisation de Ficoll® ou de Percoll®. La technique au
Percoll® permet de réaliser un gradient continu de densité. Compte tenu de sa précision, cette méthode est souvent employée pour séparer les cellules fœtales des cellules adultes. Le prélèvement d'une partie du gradient Percoll® permet de récupérer des cellules fœtales très pures, mais en très faible quantité. La technique au Ficoll® permet de réaliser des gradients discontinus et de récupérer davantage d ' érythroblastes fœtaux. Le problème posé par cette méthode réside dans l'élimination des cellules adultes contaminantes prélevées en même temps que les cellules fœtales .
En se basant sur cette technique du Ficoll® simple, les inventeurs ont développé un procédé permettant d'obtenir les différents constituants d'un mélange sanguin et plus spécialement les constituants du sang maternel durant la gestation avec une concentration significative et une pureté élevée . L'invention vise donc un procédé pour séparer les constituants du sang maternel pendant la gestation, dans un tube d'analyse renfermant un milieu séparateur permettant d'obtenir un gradient de densité, et du sang maternel avantageusement dilué, caractérisé en ce qu'on incorpore dans le tube une couche de milieu séparateur dilué entre la couche de sang et celle de milieu séparateur et qu'on soumet le contenu du tube à une centrifugation de manière à séparer les constituants du sang en couches distinctes . Ce procédé permet de récupérer, séparément, des érythroblastes, des lymphocytes, des polynucléaires et des globules rouges. Les érythroblastes sont le cas échéant en mélange avec des globules rouges. On notera avec intérêt que ces différents produits présentent un degré de pureté jamais atteint à ce jour et que l'absence de contaminants leur confère des structures originales. Il s'agit donc de produits qui, en tant que tels, sont nouveaux. A ce titre, ces produits sont également visés par l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent avec référence aux figures, qui représentent, respectivement, les figures 1A à 1E des dispositifs d'extraction par surpression, la figure 2, un dispositif d'extraction par force centrifuge,
- les figures 3A et 3B, des dispositifs d'injection,
- les figures 4A et 4B, une séparation des éléments du sang au Ficoll® selon la technique classique, et les figures 5A et 5B, une séparation respectivement d' érythroblastes et de lymphocytes à partir de sang maternel en opérant selon l'invention. 1 - Exemples de dispositifs d'extraction
Selon un mode de réalisation de l'invention, les moyens capables d'exercer une surpression dans le tube d'analyse (1) forment un système hermétiquement clos, au moment de l'extraction, avec le gradient de densité (2) et le capillaire d' extraction (3 ) .
Ces moyens comprennent, dans une variante représentée sur la figure 1A, un bouchon (4) destiné à fermer le tube d'analyse (1) de manière étanche et un tube de surpression (5) d'entrée dudit fluide.
Dans une autre variante, lesdits moyens comprennent un élément dont le déplacement permet de faire varier le volume de la phase gazeuse dans la partie de tête du tube d'analyse, tel qu'un piston, une membrane ou un bouchon. Sur la figure 1B, on a représenté un dispositif d'extraction comportant un capillaire d'extraction (3) solidaire d'un piston (8) .
Le piston (8) actionnable par un poussoir (9) est muni d'un échappement (10) occultable. Lors de la mise en place du piston jusqu'en appui sur une butée (11) , cet échappement évite la mise en pression du tube.
Dans une autre variante représentée sur la figure 1C, le capillaire d'extraction (3) est souple. Son extrémité est lestée par une masse (12) de manière à constituer un ludion. L'extrémité du capillaire d'extraction se positionne dans le milieu liquide selon la densité apparente du ludion. La densité apparente du ludion est déterminée en fonction de celle de la fraction à extraire.
Dans encore une autre variante, lesdits moyens comprennent un bouchon (4) destiné à fermer de manière hermétique le tube d'analyse (1) et un élément chauffant (non représenté) placé dans la partie supérieure du tube ou dans le bouchon, provoquant la dilatation de la phase gazeuse de manière à obtenir la surpression .
Selon un autre mode de réalisation de l'invention représenté sur la figure 2, lesdits moyens autorisant un écoulement laminaire sont des moyens capables d'exercer une force centrifuge et comprennent un tube support (8) apte à être placé avec le tube d'analyse (1) dans une centrifugeuse (non représentée) , le tube support (8) contenant un capillaire de récupération (9) avec une branche de retour (10) droite ou spiralée. Le capillaire de récupération (9) est raccordé au capillaire d'extraction (3) et forme un siphon par rapport à ce capillaire. Une partie ou la totalité des bandes présentes dans le tube d'analyse, situées au-dessus de l'embouchure du capillaire d'extraction, peuvent être contenues dans le système de récupération (9) . Ce système est par exemple un serpentin.
Dans une variante de ce mode de réalisation, pour augmenter la poussée centrifuge, on ajoute dans le tube d'analyse une masse formant piston (non représentée) .
Le capillaire d'extraction (3) est apte à être positionné à hauteur variable dans le milieu d'analyse, verticalement ou non, ou 'en variante est fixé à l'intérieur ou à l'extérieur du tube.
Il peut être regroupé avec le tube de surpression (5), formant un seul tube à 2 voies .
Selon une disposition de l'invention, le capillaire d'extraction forme un siphon. Dans une autre disposition représentée sur la figure 1D, le capillaire d'extraction est muni d'un robinet (6) . Selon encore une autre disposition représentée sur la figure 1E, le capillaire d'extraction (3) est associé à un capillaire de récupération (7) . Ce capillaire de récupération est par exemple spirale ou droit. Le capillaire d'extraction (3) ou de récupération (7) peut être marqué ou gravé par des repères à des positions déterminées en fonction du positionnement attendu de la ou des fractions, et est éventuellement sécable au niveau des repères. L'intérieur du capillaire d'extraction (3) ou de récupération (7) peut être garni totalement ou partiellement d'un ou de plusieurs réactifs biologiques et/ou physiques et/ou chimiques. Il s'agit par exemple d'antigènes, de récepteurs, d'anticorps, de protéines, de sondes de biologie moléculaire, de lectines . Il est ainsi possible de retenir spécifiquement dans le capillaire une partie ou un constituant de la fraction, ou de retenir spécifiquement un contaminant. Le capillaire s'assimile alors à une colonne chromatographique en phase liquide. Les couches inférieures servent de pousseur aux fractions contenues dans le capillaire.
Le diamètre du capillaire influence les propriétés rhéologiques de certains produits. Ainsi, en fonction du diamètre et de la longueur du capillaire, certains produits sont plus ou moins freinés, permettant ainsi d'affiner la qualité de la séparation.
On observera que la sortie supérieure du capillaire d'extraction (3) , ou le cas échéant du capillaire de récupération (7) qui lui est associé, peut être reliée à un collecteur de fractions ou directement à l'entrée d'un analyseur, par exemple d'un spectromètre UV, de masse, RMN, d'un HPLC ou d'un CPG (non représentés) .
Pour augmenter la sélectivité de la séparation, lesdits moyens autorisant un écoulement laminaire définis ci-dessus comprennent un tube d'analyse (1) avec au moins deux bandes conductrices soumises à une différence de potentiel ou, en variante, le tube d'analyse est placé dans un champ magnétique.
On observera que le système d'extraction est indépendant du tube d'analyse et peut s'ajouter extemporanëment sur n'importe quel tube d'analyse.
Ce système peut être en place, partiellement ou totalement, avant la séparation des couches. Il permet d'extraire en continu l'ensemble ou une partie des constituants séparés préalablement par densité.
' Les différentes formes de réalisation des dispositifs selon l'invention sont avantageusement mises en œuvre pour extraire spécifiquement une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse comprenant une pluralité de bandes telles que définies plus haut .
Conformément à un mode de réalisation de l'invention, on assure à cet effet l'écoulement laminaire de la bande à récupérer vers un capillaire d'extraction, en exerçant une surpression dans le tube d'analyse hermétiquement fermé, on récupère la bande désirée à partir du capillaire d'extraction, l'opération étant continuée pour obtenir d'autres bandes si souhaité, en allant successivement de la bande la plus dense à la bande la moins dense, sans re-mélange de bas en haut.
La surpression est obtenue par variation de pression, de température ou de volume .
La variation de pression est exercée en injectant dans le tube d'analyse un fluide par l'intermédiaire d'un tube dit de surpression. Comme fluide, on utilise un gaz inerte, de l'air, ou. encore un liquide de faible densité.
En variante, on exerce une variation de volume dans la partie de tête du tube d'analyse à l'aide d'un élément tel que piston, membrane ou bouchon mobile.
Le piston (8) actionnable par un poussoir (9) est muni d'un échappement (10) occultable. Lors de la mise en place du piston jusqu'en appui sur une butée (11), cet échappement évite la mise en pression du tube. L'extrémité du capillaire d'extraction est alors positionnée juste au-dessus de la fraction à extraire. Puis 1 ' échappement - est obturé afin de rendre le système "tube- piston" étanche . La pression exercée sur le poussoir se transmet au piston et à toutes les couches du liquide situées dans le tube au-dessus de "1.' extrémité du capillaire d'extraction.
Ainsi, les fractions situées en dessous de l'extrémité du capillaire d'extraction remontent successivement à l'intérieur du capillaire d'extraction puis dans le capillaire de récupération.
L'extrémité du capillaire d'extraction, solidairement au piston, s ' enfonce dans le liquide au fur et à mesure de l'extraction des fractions.
Les fractions comprises entre 1 ' extrémité du tube d'extraction et le piston ne sont pas extraites du tube.
On peut aussi utiliser un capillaire d'extraction simple terminé, à son extrémité, par une masse formant ludion, qui se positionne dans le milieu liquide selon la densité apparente du ludion, celle-ci étant déterminée en fonction de celle de la fraction à extraire.
Une autre variante consiste à exercer une variation de température en chauffant la partie de tête. Après avoir positionné le capillaire d'extraction, on chauffe alors le contenu du tube d'analyse à l'aide d'un dispositif chauffant qui provoque la dilatation de la partie de tête du tube d'analyse et engendre la surpression recherchée pour 1 ' extraction de la bande à récupérer . L'ensemble du gradient de densité est alors poussé vers le bas, les couches supérieures s ' appuyant uniformément sur les couches inférieures .
• On récupère la bande désirée à partir du capillaire d'extraction, l'opération étant continuée pour obtenir d'autres bandes si souhaité, en allant successivement de bas en haut, de la bande la plus dense- à la bande la moins dense, sans re¬
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La surpression pousse toutes les fractions situées au dessus de l'embouchure basse du capillaire d'extraction. Elles remontent successivement à l'intérieur du capillaire. Elles ressortent du capillaire par siphon dans l'ordre croissant des densités, réelles ou apparentes. (La plus dense ressort en premier) .
Ainsi, la fraction à extraire remonte dans le capillaire d'extraction, sans perturbation ni de la couche basse, ni des couches supérieures, ce qui permet d'extraire totalement, successivement et en continu, les différentes couches supérieures par ordre inverse (les plus denses en premier) sans contamination, ni mélange et sans extraire les couches en aval de densité supérieures.
Dans une variante, on utilise un capillaire d'extraction comportant un robinet, ce qui permet en ouvrant le robinet de recevoir la couche à extraire. En fermant ensuite le robinet, on isole de l'atmosphère, en sortie du capillaire d'extraction, la fraction extraite. On sort alors le capillaire délicatement du tube d'analyse et on récupère la couche en l'expulsant par sa mise à l'atmosphère, puis on la dépose sur un support prévu à cet effet.
Cette variante permet de protéger la fraction isolée de l'air, de la maintenir dans son environnement, et d'assurer ainsi un transport entre le dispositif d'extraction et le lieu d'analyse.
Dans encore une autre variante, on raccorde un capillaire récupérateur au capillaire d'extraction, ce qui permet de retenir spécifiquement une partie ou un constituant de la fraction ou de retenir spécifiquement un contaminant. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, on assure 1 ' écoulement laminaire de la bande à récupérer en exerçant une force centrifuge. On place à cet effet un tube support comportant un système de récupération de fraction dans une centrifugeuse à côté du tube d'analyse, le système de récupération étant raccordé au capillaire d'extraction, et on soumet les deux tubes à une force centrifuge assurant le passage des bandes situées au-dessus de l'embouchure du capillaire d'extraction dans le système récupérateur, l'opération étant appliquée avec des durées différentes à d'autres bandes si souhaité .
On enlève le système de récupération de son tube support et on coupe la ou les sections renfermant la ou les bandes recherchées. Ces sections peuvent correspondre à des repères préalablement établis.
On utilise par exemple un serpentin comme système de récupération .
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, on réalise l'extraction en présence d'un champ électrique ou d'un champ magnétique.
Le procédé de l'invention est avantageusement appliqué à des couches séparées à l'aide, par exemple, de Ficoll®, de Percoll®, d'albumine, de chlorure de césium, de polyvinylpyrrolidone (PVP) , de glucose, glycérol ou silice colloïdale.
2 - Exemples de dispositifs d'injection selon l'invention (non représentes) .
Dans un mode de réalisation de l'invention représenté sur la figure 3A, les moyens d'injection sont constitués par un capillaire (11) solidaire de la paroi interne du tube d'analyse, comportant des encoches perpendiculaires (12) au tube d'analyse
(1) , à des hauteurs pré-établies en fonction des quantités de produits à injecter dans le tube d'analyse, ce qui permet une arrivée tangentielle de produit à la surface de la couche précédente . Le capillaire est par exemple collé à l'intérieur du tube, ou en variante, est formé par extrusion lors de la fabrication du tube .
Dans un autre mode de réalisation de l'invention représenté sur la figure 3B, les moyens d'injection sont constitués par une aiguille d'injection (13) dont la hauteur de pénétration dans le tube est prédéterminée et/ou comportant un embout d'injection tangentielle (14) .
L'invention vise également un procédé d'injection de produits dans un tube d'analyse, sous forme de couches successives. Ce procédé est caractérisé par l'introduction successive de quantités pré-déterminées desdits produits de manière à assurer une arrivée tangentielle de ces produits sur la couche précédente . Cette introduction est avantageusement réalisée en procédant à l'injection dans le capillaire, à l'aide d'une pipette ou d'un distributeur calibrateur, des quantités requises de produits ou de liquides pour une couche donnée, de manière à amener le produit tangentiellement à la surface de la couche précédente. Les produits ou liquides sont incroduits par ordre de densité croissante, en dessous de la surface inférieure de la couche précédente, ou en variante par ordre de densité décroissante au-dessus de la surface supérieure de la couche précédente . En variante, on introduit dans le tube d'analyse une aiguille avec embout d'injection tangentielle, la hauteur de pénétration étant pré-déterminée selon la hauteur des couches préalablement formées . 3 Séparation des constituants d'un mélange sanguin : applications à partir d'un prélèvement de sang maternel pendant la gestation.
Le Ficoll Histo-paque est constitué de polysucrose et de diatrizotate de sodium, en quantités variables de manière à obtenir trois liquides isotoniques de densités différentes : 1,077 ,• 1,083 ; 1,119. Ce réactif permet de séparer les éléments mononucléés à partir de sang total. On a représenté sur la figure 4A, un tube d'analyse contenant une couche inférieure (15) de 2 ml de Ficoll® pur de densité 1,077 et une couche supérieure (16) de 1 ml de sang dilué avec 1 ml de PBS . Après centrifugation pendant 20 min. à 600 g, comme représenté sur la figure 4B, on obtient de bas en haut des couches de globules rouges (17) et de polynucléaires (18), une couche de Ficoll® (19), puis une bande de lymphocytes (20) surmontée d'une bande ou fraction de plasma (21) .
Une séparation complexe au Ficoll , pour obtenir des érythroblastes purs exempts de toute contamination lymphocytaires a été rapportée par Bhat et al . 1983 J.Immunol. Methods 158:277-280. Cette technique repose sur l'emploi de trois couches de Ficoll® de densités différentes (1,119 ; 1,107 ; 1,077) . Elle permet de récupérer des érythroblastes purs, mais les rendements sont tellement faibles que cette technique ne fonctionne qu'avec des prélèvements importants contenant de grandes quantités d' érythroblastes .
Avec des prélèvements maternels adéquats de 5 ml, on ne réussit pas à isoler d ' érythroblastes foetaux par cette technique .
Ce résultat est confirmé par Huber K. et al . , 1996, Prenat . Diag. 16:1011-1019, qui obtiennent 1 % de récupération après triple Ficoll® selon cette méthode. L'étude réalisée par les inventeurs sur une séparation des éléments mononucléés à partir de sang total a amené à dégager les observations suivantes :
- les globules rouges se rassemblent en "piles d'assiettes", constituant une " rouleau formation", ce qui implique une modification profonde des charges des globules rouges,
- les lymphocytes ne rentrent pas dans le Ficoll®, mais sont posés dessus, à l'interface avec le sérum,
- les polynucléaires sédimentent à la surface du culot de globules rouges : avant centrifugation, l'addition dans le fond du tube d'une petite quantité de Ficoll® 1,119 permet d'avoir une interface entre les globules rouges et les polynucléaires, facilitant ainsi la récupération d'un culot êrythrocytaire théoriquement exempt de polynucléaires . On note par ailleurs, qu'en présence de Ficoll®, lors de l'agrégation des globules rouges en "rouleau formation", des érythroblastes fœtaux et des polynucléaires sont aléatoirement emprisonnés .
- les érythroblastes ne sont pas discernables de visu dans la bande lymphocytaire . En revanche, l'adjonction de 200 μl de sang pur de fœtus au sang maternel prélevé entre la 14ème et la 17ème semaine de gestation montre une fine bande d' érythroblastes visible en lumière rasante sur fond noir. Ces érythroblastes apparaissent individualisés en une bande située entre la bande lymphocytaire et le Ficoll®.
Des observations du même type sont dégagées avec d'autres milieux séparateurs tels que mentionnés plus haut.
Ces études ont amené les inventeurs à développer un procédé pour séparer les constituants du sang maternel pendant la gestation, dans un tube d'analyse renfermant un milieu séparateur permettant d'obtenir un gradient de densité, et du sang maternel avantageusement dilué, caractérisé en ce qu'on incorpore dans le tube une couche de milieu séparateur dilué entre la couche de sang et celle de milieu séparateur et qu'on soumet le contenu du tube à une centrifugation de manière à séparer les constituants du sang en couches distinctes . La dilution du milieu séparateur est choisie pour obtenir une augmentation de l'espace séparant le doublet lymphocytes- érythroblastes .
Comme milieu séparateur approprié, on citera le Ficoll®, le
Percoll®, le glucose, l'albumine, le chlorure de césium, la polyvinylpyrrolidone (PVD), le glycerol ou la silice colloïdale. Des résultats satisfaisants sont obtenus en utilisant comme milieu séparateur du Ficoll® pur et pour la séparation du doublet ly phocytes-érythroblastes du Ficoll® dilué à 15-25% notamment à 20%. Le Ficoll® pur présente avantageusement une densité de 1,083 et le Ficoll® dilué de 1,069.
L'échantillon de sang est avantageusement dilué avec du PBS ou du sérum physiologique.
La figure 5A illustre un tube renfermant, de bas en haut, les couches de Ficoll® pur (22) , de Ficoll® dilué (23) et de sang dilué (16) . La figure 5B montre la séparation en différentes couches après centrifugation, à savoir de bas en haut, les couches de globules rouges (24) , de Ficoll® pur (22) , d' érythroblastes (25), de Ficoll® dilué (23), de l mphocytes
(26) et de plasma (21) . Cette succession de couches constitue une caractéristique de l'invention et entre donc dans son champ de protection.
Le dépôt des couches successives est avantageusement; réalisé selon les techniques de l'invention en procédant d'abord à l'introduction du milieu séparateur pur, puis du milieu séparateur dilué, et enfin du mélange -de sang dilué, contenant le cas échéant un anti-agrégant . A l'aide des techniques d'extraction définies ci-dessus, le prélèvement de la bande recherchée est effectué de manière remarquablement simple.
Dans le cas par exemple d'une extraction opérée à partir de sang maternel prélevé entre la 14ième et la 17ième semaine de grossesse, l'examen microscopique de chaque bande montre les données suivantes :
- un tapis de globules rouges en "rouleau formation" au fond, teintés en rouge, - les lymphocytes représentent 10 à 30% des cellules nucléées ; leurs noyaux sont teintés en bleu par coloration MGG,
- les érythroblastes fœtaux et adultes représentent 60 à 80% des cellules nucléées dans la couche extraite. L'intensité optique de la couche avec les érythroblastes est proportionnelle à la concentration en érythroblastes et en globules rouges qui sont en nombre important, ce qui suggère la formation d'un complexe érythroblastes-globules rouges.
La technique de l'invention permet d'augmenter considérablement la concentration en érythroblastes dans cette couche, qui passe ainsi de 10" à 10"1 érythroblastes/globules rouges .
On peut encore améliorer la technique en activant le capillaire d'extraction ou de récupération soit pour fixer les cellules foetales en utilisant par exemple des (anticorps anti CD71, anti-hémoglobine foetale, anti-i...), soit en fixant les cellules maternelles contaminantes (anticorps anti-hémoglobine adulte, anti-I, et lectines par exemple Aplysia lectin gonad) .
Compte tenu de similitudes entre les cellules cancéreuses et les cellules foetales, on peut étendre cette technique à 1 ' isolement de cellules cancéreuses .
Ce procédé, permettant de fixer les cellules foetales ou d'éliminer les cellules adultes contaminantes par fixation, peut être généralisé à l'isolement par fixation des cellules cancéreuses (à l'aide d'anti-i) ou l'élimination des cellules 'saines contaminantes (à l'aide d'anti-I ou Aplysia Gonad Lectin) anti- I .
L'examen microscopique de ces cellules isolées a montré que ce complexe érythroblastes-globules rouges n'est pas une structure en "rouleau formation", ce qui explique la relative légèreté de cet ensemble par rapport à la très haute densité des globules rouges en "rouleau formation" déposés en fond de tube après séparation par gradient de densité. La répétition de cette expérience sur 1 ml de sang de femme enceinte donne une très fine bande rouge au niveau de la localisation érythroblastique . Cette coloration rouge est due à quelques globules rouges co-migrants qui servent alors de traceurs et favorisent la localisation de cette couche. II est possible d'augmenter les rendements au niveau de la bande érythroblastique, en enrichissant le sang maternel prélevé par des érythroblastes exogènes servant de traceurs, par exemple du sang de reptile, d'oiseau, de batracien ou de chameau.
Les globules rouges piégés dans la "formation en rouleau" sont normaux, c'est-à-dire en forme de disque aplati. Cette forme particulière permet leur empilement. L'observation au microscope de, "globules rouges traceurs" (GRT) dans la couche érythroblatique montre qu'ils ont échappé au processus de "rouleau formation". Leurs formes sont caractéristiques, et sont pour la plupart sphériques ou en "poire" . Les morphologies de tels GRT obtenus à partir de sang de patients ayant certaines anomalies des globules rouges permettent de caractériser les cellules vieillies ou malades, telles qu'observées par exemple dans les pathologies de Minkowsky, ou dans le cas de thalassémie, les cellules immatures ou celles présentant des anomalies de forme.
On notera que l'addition d'un anti-agrégant à l'échantillon sanguin permet d'obtenir une couche de globules rouges ayant réagi avec 1 ' anti-agrégan , ce qui fournit des moyens d'étude de l'efficacité et du dosage des anti-agrêgants sanguins pour le traitement des pathologies sanguines.
L'invention fournit ainsi les moyens de disposer des différents constituants du sang selon des quantités et des degrés de pureté permettant de réaliser des analyses et diagnostics dans des conditions .particulièrement favorables.
L'invention vise ainsi notamment l'application des couches d' érythroblastes récupérées pour l'établissement de diagnostics pré-nataux de pathologies génétiques. Elle vise également l'utilisation des couches lymphocytair.es récupérées par exemple dans des applications en cytaphérèse.
On donne ci-après à titre illustratif un exemple de séparation de sang au Ficoll®. Préparation :
On utilise 4 ml de sang dilué à 50/50 dans 4 ml de PBS et du Ficoll® pur de densité 1,083, et du Ficoll® dilué à 20% pour obtenir une densité de 1,069.
Dépôt des couches : Dans un tube de 4 ml, on dépose
-4 ml de Ficoll® de densité 1,083,
- 2 ml de Ficoll® de densité 1,069, et
- 8 ml du sang dilué . Séparation des couches : On effectue une centrifugation à 600 g pendant 20 minutes. On obtient de bas en haut :
- des globules rouges séparés dans le culot du tube,
- la couche de Ficoll® de densité 1,083,
- une couche d' érythroblastes en mélange avec des globules rouges situés dans la bande intermédiaire, d'environ 150 à 200 μi v .
- la couche de Ficoll® dilué de densi té 1 , 069 , - une couche de lymphocytes situés au-dessus de la couche d -Ficoll® dilué, surmontée,
- d'une couche de plasma. Extraction : La couche contenant les constituants recherchés est extraite dans un maximum de 500 μl de Ficoll® en utilisant les techniques d'extraction décrites ci-dessus et récupérée .dans un tube conique .
Lavage comprenant : - la dilution de la couche de produit, dans 2 ml de PBS + Albumine (FV) 0,5 g/100 ml,
- le mélange sous faible agitation, et
- le culottage en centrifugeuse à 500 g pendant environ 7 minutes, suivi de la décantation du culot. Ces étapes sont répétées si nécessaire.
• Préparation du Produit aux fins d'analyse :
. Le produit récupéré est remis en suspension dans PBS pur ou PBS-A, QSP 0,5 ml. On dépose 250 μl sur 2 lames de microscope, selon la technique habituelle de cytospin. Pour les besoins d'observation au microscope, on procède à une coloration selon la technique habituelle M. G. G.
.4 - Exemples de séparations de constituants présents dans des mélanges. Taux de pureté des érythroblastes 10~—à 10~
Les dispositifs et les procédés d'extraction définis ci- dessus sont avantageusement appliqués dans les domaines de la recherche, pour établir un diagnostic biologique, ou pour effe.ctuer une analyse, ou d'une manière générale dans le domaine de la production industrielle, du médicament. On citera, à titre d'exemples, - les séparations d'ADN / ARN,
' - en biochimie des protéines, la séparation des immunoglobulines sur gradient de sucrose selon Ito T. et al dans Pediatr .Nephrol . 15 Nov.2000 (l-2):90-5, de macromolécules complexes selon Hutchinson W.L. et al dans Mol.Med. 6 juin 2000 (6):482-483, des enzymes de haut poids moléculaire sur gradient de glycerol selon Mo J. et al dans Biochemistry 20 juin 2000/39 (24) : 7245-54, de protéines membranaires sur gradient de sucrose selon Geng L. et al dans Biochim. Biophys .Acta 15 Dec.2000,-1535 (1) :21-35, les séparations d'organites ou fractions (cellulaires, bactériennes, parasitaires dont oocytes, mycosiques ou virales) sur gradient de Percoll® (Pertoft H., J Biochem Biophys Methods 10 juillet 2000; 44 (l-2):l-30), de cellules, d'immuns complexes, de lipoprotéines selon Bakalova R.A. et al, Gen . Physio. Biophys. 2000 March 19 (1):103-13, de différents mucus sur gradient de chlorure de césium selon Montagne L. et al, J. Dairy Sci 2000 Mars,- 83 (3):507-17, de drogues naturelles, de produits de synthèse partielle ou totale, en cytologie et cancérologie, l'isolement de cellules cancéreuses de la prostate à partir de sang total (Wang Z.P. et al, Cancer 2000, 15 juin,- 88 (12 ) : 2787-95 ) , - en biologie de la reproduction, la séparation de spermatozoïdes (Zini A. et al, Urology 20 décembre 20Q0/56 (6) :1081-4) , en galénique, la séparation de liposomes, émulsions, micelles, lipocores, nanocapsules (Perkins W.R.et al, Int.J.Pharm.25 avril 2000 ,- 200 (1) : 27-39 ou Mosqueira V.C., J.Pharm. Sci., Mai 2000; 89 (5) : 614-26) ,
- en zoologie, l'isolement des ovocytes de Xénope (Richter H. P. et al, Biol.Cell. 1995 ; 84 (3 ): 129-38) ,
- en parasitologie, l'isolement des oeufs de Opisthorchis viverrini (J.Helminthol . Décembre 1998; 72 (4) : 359-61, l'isolement de Dirofilaria immitis (Exp . Parasitol, Août 1995/81 (1) : 63-71; la séparation du mucus de porc infecté par
Ascaris suu (Vet . Parasitol . Sep .1988 ;29 (2-3) : 143-58) .
A titre indicatif, on rapporte ci-après des exemples de gradients tels que donnés dans Centrifuge (a) 2nd édition, A practical approach, D. Rickwood (Ed.) Kontron (1987) selon les produits à séparer.
(Dans les tableaux suivan ts , l ' indication (ex. ) signifie « par exemple » , et (pdt) « pendant ») Tableau 1. Applications de différents types de gradient isopycnicrue
Figure imgf000025_0001
La classification est comme sui t : + + + bon; + + satisfaisant; + application limi tée; - inapplicable
Tableau 2. Densités apparentes de particules biologiques dans des solutions de sucrose
Figure imgf000025_0002
Tableau 3 . Densi tés apparentes de cellules et virus dans des gradients de Ficoll®
Figure imgf000026_0001
Tableau 4. Densités apparentes de particules biologiques dans des gradients iodés (Hinton R.H. et Mullock B. M. (19-76) / Rickwood D. (ed.) ,iIRL press, Oxford et Washington et Rickwood D., éd. (1983), IRL press Oxford et Washington
Figure imgf000027_0001
Tableau 5. Densité et conditions de séparation pour l'isolement de cellules, Virus et particules subcellulaires dans un gradient de Percoll® (Wakefield J.S.J.et al (1982) Biochem.J. ,202,795; Pertfot H. et al, (1979) Pergamon press, Londres et New York, p 67; et Pertoft H. et al (1979) Biochem.Vol .9 , Reid E . (éd. ) , Ellis
Figure imgf000028_0001

Claims

R E V EN D I CAT I O i o
1/ Dispositif d'extraction d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés à partir d'un tube d'analyse (1) comportant une pluralité de bandes distinctes, contigues ou chevauchantes, en milieu liquide, formant un gradient continu ou discontinu de densité (2) , caractérisé en ce qu'il comprend
- un tuoe d'analyse (1) standard,
- un tube ou capillaire d ' extraccion '3), pré-positionnable en fonction de la couche à extraire, et
- des moyens pour obtenir un écoule^enc laminaire d'une ou plusieurs bandes du tube sans aspiration, soit par surpression appliquée sur le dessus du milieu liquide avec un fluide, gaz ou liquide de faible densité, so t en exerçant une force centrifuge
2/ Dispositif selon la revendication 1, caraccéπsé en ce que les moyens capables d'exercer une surpression comprennent un Douchon (4) destiné à fermer de Tanière nermétique le tuoe d'analyse et an tube de surpression (5) d'entrée dudit fluide, l'ensemble formant avec le capillaire d'axcraction (3) et le gradient de densité (2) un système nerme iquement clos au moment de l'extraction
3/ Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits moyens de surpression comprennent un élément dont le déplacement assure une variation de volume de la phase gazeuse dans la partie de tête du tube d'analyse (1), tel qu'un piston, une membrane ou un bouchon
4/ Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens capables d'exercer une surpression comprennent un bouchon (4) destiné à fermer de manière hermétique le tube d'analyse (1) et un élément chauffant placé dans la partie supérieure du tube ou dans le bouchon, provoquant la dilatation de"la phase gazeuse de manière à obtenir la surpression.
5/ Dispositif selon le revendication 1, caractérisé en ce que lesdits moyens capables d'exercer une force centrifuge comprennent un tube support (8) pouvant être placé avec le tube d'analyse (1) dans une centrifugeuse, et logé dans le tube support (8), un capillaire de récupération (9) avec une branche de retour (10), spiralée ou droite, ce système étan raccordé au capillaire d'extraction (3), comportant le cas échéant un robinet (6) , et capable de constituer un siphon par rapport à .ce capillaire, et de contenir la totalité des bandes présentes dans le • tube d'analyse situées au-dessus de l'embouchure du capillaire d'extraction, ledit tube d'analyse comportant le cas échéant une masse formant piston. 6/ Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le capillaire d'extraction
.(3) est apte à être positionné à hauteur variable dans le milieu d'analyse, verticalement ou non, ou en variante est fixé à l'intérieur ou à l'extérieur du tube. 7/ Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que' le capillaire d'extraction (3) est muni d'un robinet (S) ou est associé à un capillaire de récupération (7), spirale ou droit.
8/ Dispositif selon la revendication S ou 7, caractérisé en ce que le capillaire d'extraction (3)' ou de récupération (7) est marqué ou gravé par des repères à des positions déterminées en fonction du positionnement attendu' de la ou des fractions, et est éventuellement sécable au niveau des repères.
9/ Dispositif selon l'une quelconque des revendication 6 à 8, caractérisé en ce que l'intérieur du capillaire d'extraction
(3) 'ou de récupération (7) est garni totalement ou partiellement d'un ou de plusieurs réactifs physiques, chimiques ou biologiques . 10/ Dispositif selon l'une quelconque de revendications 1 à 9, -caractérisé en ce que le tube d'analyse (1) comprend au moins deux bandes conductrices soumises à une différence de potentiel, ou en variante est placé dans un 'champ magnétique. 11/ Procédé d'extraction spécifique d'une ou plusieurs bandes renfermant les produits ou constituants recherchés dans un tube d'analyse comportant une pluralité de bandes distinctes, contigùes ou chevauchantes, en milieu liquide, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - on introduit dans un tube d'analyse standard un capillaire d'extraction au moyen d'un guide assurant son positionnement dans l'espace à la hauteur voulue par rapport à la bande à extraire, ou en variante on utilise un tube d'analyse avec un capillaire pré-positionné à la hauteur voulue, situé à l'intérieur ou en partie à l'extérieur du tube, on applique des moyens pour obtenir un écoulement laminaire sans aspiration, soit par surpression par le dessus du milieu liquide avec un gaz ou un fluide de faible densité, soit en exerçant une force centrifuge. 12/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on assure l'écoulement laminaire de la bande à récupérer -vers un ' capillaire d'extraction, en exerçant une surpression dans le tube d'analyse hermétiquement fermé, et on 'récupère la bande désirée à partir du capillaire d'extraction, l'opération étant continuée pour obtenir d'autres bandes si souhaité, en allant successivement de bas en haut de la bande la plus dense à la bande la moins dense, sans re-mélange.
13/ Procédé selon la revendication il, caractérisé en ce que la surpression est obtenue par variation de pression, en injectant un fluide dans le tube d'analyse par l'intermédiaire d'un tube, par variation de volume, en déplaçant un élément tel que .piston, membrane ou bouchon mobile dans la partie de tête du tube d'analyse, ou par variation de température, en chauffant le contenu du tube d'analyse pour provoquer la dilatation de sa partie de tête .
14/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à
13, caractérisé en ce qu'on raccorde un capillaire récupérateur au capillaire d'extraction pour retenir spécifiquement une partie ou un constituant de la fraction, ou un contaminant.
15/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à
14, caractérisé en ce qu'on introduit dans le capillaire d'extraction ou dans le capillaire de récupération des réactifs chimiques, physiques ou 'biologiques .
16/ Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on assure l'écoulement laminaire de la bande à récupérer en exerçant une force centrifuge, en plaçant un tube support comportant un capillaire de récupération de fraction dans une centrifugeuse à côté du tube d'analyse, le capillaire de- récupération étant raccordé au capillaire d'extraction, et en soumettant les deux tubes à une force centrifuge assurant le passage des bandes situées au-dessus de l'embouchure du capillaire d'extraction dans le capillaire de récupération, l'opération étant appliquée avec des durées différentes à d'autres bandes, si souhaité.
•• 17/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à
16, caractérisé en ce qu'on réalise l'extraction en présence d'un champ électrique ou d'un champ magnétique. 18/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à
17, caractérisé en ce qu'il est .appliqué à des couches séparées dans du Ficoll®, Percoll®, glucose, chlorure de césium, albumine, polyvinylpyrrolidone, glycerol ou silice colloïdale.
19/ Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il est associé à un dispositif pour l'injection dans un tube d'analyse (1) de produits, sous forme de 'couches successives, par introduction de quantités pré- déterminées de produits ou de liquides avec des densités différentes, caractérisé en ce que le tube d'analyse (1) comprend des moyens d'injection permettant l'arrivée tangentielle des produits en quantités pré-déterminées 20/ Dispositif selon la revendication 19, caractérisé en ce que les moyens d' injection sont constitués par un capillaire '11) solidaire de la paroi interne du tube d'analyse, comportant des encoches perpendiculaires (12) au tube " d' analyse (1), à des hauteurs pré-établies en fonction des quantités de produits à injecter dans le tube d'analyse, ce qu permet une arrivée tangentielle de produit à la surface de la couche précédente
21/ Dispositif selon la revendication 19, caractérisé en ce que les moyens d'injection sont constitués par une aiguilla d'injection (13), dont la nauteur de pénétration dans le tube est prédéterminée et/ou comportant un embout d' injection tangentielle (14)
22/ Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13 caractérisé en ce qu'il corrporta en outre une étape d'injection dans un tube d'analyse de produits sous forme de couches successives, caractérisé par l'introduction de quantités pré-déterminées desdits produits de manière à assurer une arrivée tangentielle de ces produits sur la couche précédente, en procédant à l' injection dans le tube, à l'aide d'une pipette ou d'un distributeur calibrateur, des quantités requises de produits ou de liquides pour une couche donnée, de manière à amener le produit tangentiellement à la surface de la couche précédente ou, en variante, on introduit dans le tube d'analyse une aiguille avec un embout d'injection tangentielle, la hauteur de pénétration étant pré-déterminée selon la hauteur des couches préalablement formées
23/ Application de dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et/ou du procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 18 à l'extraction d'une couche ou de plusieurs couches de constituants d'un mélange sanguin dans un milieu séparateur contenant le cas échéant un anti-agrégant
24/ Application selon la revendication 23, caractérisée par l'incorporation dans un tube d analyse renfermant un milieu séparateur permettant d'obtenir un gradient de densité et du sang maternel dilué, prélevé pendant la gestation, d'une couche de milieu séparateur dilué entre la couche de sang et celle de milieu séparateur et qu'on soumet le contenu du tube à une centrifugation de manière à séparer les constituants du sang an couchas distinctes
25/ Application selon la revendication 24, à l'extraction ' érythroblastes foetaux du sang maternel et /ou de la coucha lymphocytaire et/ou .des polynucléaires et/ou du culot de globules rouges 25/ Application selon la revendication 24, 'à l'établissement d'un diagnostic prénatal de maladies génétiques fœtales
2~ Application selon la revendication 23, à l'extraction de cellules cancéreuses dans la sang d'origine sanguine ou t ssuiaire, comme la prostate, la sain, le ooumon, l'ovaire
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