WO2002066982A1 - Analyse von modifizierungen und demodifizierungen von proteinen mit ubiquintin-verwandten proteinen mittels fret (fluorescence resonance energy transfer) - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Analyse von Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen und von Demodifizierungen von Proteinen, die mit Ubiquitin-verwandten Proteinen verknüpft sind. Desweiteren betrifft die Erfindung Verfahren zum Bestimmen von Stoffen, die diese Modifizierungen bzw. Demodifizierungen beeinflussen, sowie Verfahren zum Nachweis eines Defekts in diesen Modifizierungen bzw. Demodifizierungen. Schliesslich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Zielproteinen für die Modifizierung mit Ubiquitin-verwandten Proteinen als auch Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Darüber hinaus betrifft die Erfindung einen Kit, ein Fusionsprotein, eine Zelle und ein Isopeptidase-Substrat und deren Verwendungen in der Analytik und/oder Diagnostik von Ubiquitin-verwandten Modifizierung bzw. Demodifizierungen von Protein.

Description

  



   Analyse von Modifizierungen und Demodifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen mittels FRET (Fluorescence Resonance Ener gy Transfer) Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Analyse von Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen und von Demodifizierungen von Proteinen, die mit Ubiquitin-verwandten Proteinen verknüpft sind. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Bestimmen von Stoffen, die diese Modifizierungen bzw. Demodifizierungen beeinflussen, sowie Verfahren zum Nachweis eines Defekts in diesen Modifizierungen bzw. Demodifizierungen.



  Schliesslich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Zielproteinen für die Modifizierung mit Ubiquitin-verwandten Proteinen als auch Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Dar über hinaus betrifft die Erfindung einen Kit, ein Fusionsprotein, eine Zelle und ein Isopeptidase-Substrat und deren Verwendungen in der Analytik und/oder Diagnostik von Ubiquitin-verwandten Modifizierungen bzw. Demodifizierungen von Proteinen.



  Eine Vielzahl von Proteinen werden in ihrer Aktivität, Lokalisation und Stabilität durch kovalente Verknüpfung mit Ubiquitin oder Ubiquitin-verwandten Proteinen wie   SUMO1 oder Nedd8    beeinflusst (Hershko and Ciechanover, 1998 ; Hochstrasser, 1998 ; Jentsch and Pyrowolakis, 2000 ; Melchior, 2000 ; Yeh et al., 2000). Dabei wird in einer Kaskade von enzymatischen Schritten eine Isopeptidbindung zwischen dem Carboxy-terminalen Ende von Ubiquitin (oder dem Ubiquitinverwandten Protein) und der s-Aminogruppe in Lysin-Seitenketten des Zielproteins geknüpft. An der Verknüpfung beteiligt sind sog. E1 aktivierende Enzyme, E2 konjugierende Enzyme und (zum Teil) E3-Ligasen. Durch die Aktivität von Isopeptidasen, die diese Bindung wieder spalten können, sind diese posttranslationalen Modifizierungen reversibel (Chung and Baek, 1999 ; Wilkinson, 1997).

   Die  Ubiquitinierung (und der darauf folgende Abbau) und die entsprechende Modifizierung mit Ubiquitin-verwandten Proteinen scheinen für eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Zellzykluskontrolle, Signaltransduktion, intrazellulären Transport oder Apoptose, aber auch für viele pathologische Szenarien (Virusinfektionen, Tumorentstehung, Neurodegenerative Krankheiten etc.) von grosser Bedeutung zu sein (Bonifacino and Weissman, 1998 ; Pagano, 1997 ; Schwartz and Ciechanover, 1999). Sowohl die Modifizierung als auch Demodifizierung vieler Zielproteine unterliegt einer für das Zielprotein spezifischen Regulation (z. B. durch Zielprotein-spezifische E3-Ligasen und Isopeptidasen   und/oder    durch Zellzyklus-oder Stress-abhängige Phosphorylierung oder Dephosphorylierung).

   Daher bietet sich eine Diagnose der Modifizierung/Demodifizierung spezifischer Zielproteine sowie der Hemmung bzw. der Aktivierung dieser Reaktionen als Grundlage für eine Krankheitsbehandlung und entsprechende Diagnostik an.



  Die Modifizierung von Proteinen mit Ubiquitin oder Ubiquitin-verwandten Proteinen führt zu einer signifikanten Grössenänderung des Zielproteins und kann sowohl in vivo als auch in vitro analysiert werden. Bisher erfolgte die Analyse der Modifizierung in vivo üblicherweise durch Westernblot-Analyse von   Zellextrak-    ten mit Antikörpern gegen das zu untersuchende Protein oder durch Immunpräzipitation des modifizierten Proteins und nachfolgende   Westernblot-Analyse    mit Antikörpern gegen das Ubiquitin-verwandte Protein. Diese Analyse beinhaltet häufig eine vorhergehende Transfektion der Zellen mit Plasmiden, die entweder das Ubiquitin-verwandte Protein oder das zu modifizierende Protein kodieren.



  Eine in vitro-Rekonstitution von Ubiquitinierungen bzw. Modifizierungen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen wird bisher durchgeführt, indem gereinigte oder rekombinante Zielproteine, gereinigtes oder rekombinantes Ubiquitin oder Ubiquitin-verwandte Proteine und die entsprechenden gereinigten oder rekombinanten Enzyme (oder Zellextrakte, welche die notwendigen Enzyme enthalten) in Anwesenheit von ATP für eine definierte Zeit inkubiert werden. Die Analyse der  Modifizierung erfolgt anschliessend durch SDS-PAGE, gefolgt von Western Transfer und   Immunanfärbung,    oder (bei Verwendung von radioaktiv markierten Proteinen) durch SDS-PAGE gefolgt von Autoradiographie (siehe, z. B., Buschmann et al., 2000 ; Deng et al., 2000 ; Kaiser et al., 2000).



  Ein Verfahren zum Nachweis von Inhibitoren des Ubiquitin-abhängigen Abbaus von regulatorischen Proteinen des Zellzyklus wurde von Kirschner et al. (US 5,726,025) beschrieben. Dieses Dokument beschreibt u. a. ein quantitatives Testverfahren für das Mass der Ubiquitinierung. Es wird dabei vorgeschlagen, das zu ubiquitinierende Protein oder aber Ubiquitin mit einem Fusionsanteil zu versehen oder mit Biotin oder einem   Fluorochrom    zu markieren und es nach Ablauf der Reaktion aus den Zellen oder dem Reaktionsgemisch mittels sog."Pull downs" oder ELISA-verwandter Techniken zu entfernen und die Modifizierung nachzuweisen.

   Ein generelles Verfahren zum Nachweis von posttranslationalen Modifizierungen (u. a. der Modifizierung mit Ubiquitin oder Ubiquitin-verwandten Proteinen) mit Hilfe des sog."Fluorescence Resonance Energy Transfers" (FRET) wurde von Bastiaens und Parker (WO 00/43780) beschrieben. Die Autoren schlagen vor, das Zielprotein fluoreszent zu markieren und die Modifizierung mittels einer ebenfalls fluoreszent markierten Sonde, welche nur das modifizierte Protein erkennt (z. B. ein anti-Ubiquitin-Antikörper), nachzuweisen. Auch hierin wird vorgeschlagen, ein solches Verfahren in sog."Drug screenings"zu verwenden.



  Ähnlich schlagen Boisclair und Mitarbeiter vor, die FRET-Technologie für die Suche nach Inhibitoren der Ubiquitinierung zu verwenden, indem Sonden (Streptavidin und   Anti-Gst-Antikörper)    mit Donor-und Akzeptor-Chromophoren fluoreszent markiert werden (Boisclair et al., 2000). Obwohl diese Verfahren eine Vereinfachung gegenüber den üblicherweise verwendeten Verfahren darstellen, erfordern sie nach wie vor ein erhebliches Mass an Manipulationen, und sind durch die indirekte Nachweismethoden sehr störanfällig, in vivo schlecht durchführbar, und höchstens semiquantitativ. 



  Daher war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein quantitatives, schnelles und insbesondere vielseitiges Testsystem für die Analytik bzw. die Diagnostik von posttranslationalen Ubiquitin-verwandten Modifizierungen bzw. Demodifizierungen bereitzustellen, das sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden kann. Eine weitere der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist die Bereitstellung und Verwendung geeigneter Bestandteile dieses Testsystems.



  Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass quantitative und schnelle Testverfahren für posttranslationale Modifizierungen mit sowohl Ubiquitin als auch Ubiquitin-verwandten Proteinen bereitgestellt werden können. Diese Testverfahren und die für diese vorgeschlagenen universell einsetzbaren Bestandteile sind im Gegensatz zu den oben beschriebenen Verfahren beispielsweise nicht allein auf die Ermittlung von Inhibitoren für eine Ubiquitinierung beschränkt.



  Vielmehr erlauben die vorgeschlagenen Verfahren nunmehr sowohl in vitro als auch in vivo sog."High throughput drug screenings" (nachfolgend HTS Verfahren) und die Bereitstellung von diagnostischen Kits zum Nachweis von Defekten in der Modifizierung/Demodifizierung sowie insbesondere die Entdeckung von sowohl Inhibitoren als auch Aktivatoren, die an der Modifizierung und/oder Demodifizierung spezifischer Zielproteine beteiligt sind (z. B. E3 Ligasen, Isopeptidasen, Kinasen oder andere Bindungspartner).

   Darüber hinaus ist es auch zum ersten Mal möglich, neue Zielproteine für die Modifizierung mit Ubiquitin-verwandten Proteinen   im"High    throughput"Verfahren zu entdecken, für die dann anschliessend mit Hilfe der vorgeschlagenen Verfahren die entsprechenden Inhibitoren und/oder Aktivatoren ermittelt werden können, was wiederum ermöglicht, mittels der vorgeschlagenen weiteren Verfahren die Analyse der Modifizierungen und Demodifizierungen oder den Nachweis eines Defektes in der   Modifizierung/Demodifizierung    für dieses neue Zielprotein vorzunehmen. Diese systematische und praktische Herangehensweise ist besonders vorteilhaft, da sie eine lückenlose Kette von der Identifizierung über die Charakterisierung zu der Analytik und Diagnostik bereitstellt. 



  Die vorgeschlagenen Testsysteme machen sich die FRET-Technologie zunutzte (Periasamy and Day, 1999 ; Pollok and Heim, 1999) und nutzen in den unten beschriebenen Anwendungsbeispielen exemplarisch die von Tsien und Mitarbeitern beschriebenen fluoreszierenden Proteine"Yellow Fluorescent Protein" (YFP) und "Cyan Fluorescent Protein" (CFP) (US 5,981,200 ; US 5,998,204 ; Tsien, 1998).



  Keines der vorgenannten Dokumente beschreibt jedoch den Einsatz von FRET für die direkte und quantitative Analyse von kovalenten Modifikationen, wie es hierin vorgeschlagen wird.



  Mit dem   Begriff"quantitativ"wird    dabei zum Ausdruck gebracht, dass im Gegensatz zu anderen bisher beschriebenen Verfahren das zu messende Signal direkt proportional zum Mass der Verknüpfung ist, da weder Manipulationen nach erfolgter Reaktion, noch Sonden zur Detektion der Verknüpfung eingesetzt werden müssen. Die Fähigkeit von Sonden, das Reaktionsprodukt zu erkennen, ist abhängig von ihrer Affinität, sowie von der Zugänglichkeit des Produkts und ist damit nicht in jedem Konzentrationsbereich linear. Darüberhinaus sind die bisher beschriebenen Verfahren störanfällig, wenn zusätzliche Bindungspartner für die Reaktanden anwesend sind.



  Ein ganz erheblicher Vorteil gegenüber dem von Kirschner et al. vorgeschlagenen Verfahrens (siehe oben) ist darüberhinaus, dass Reaktionsabläufe kinetisch verfolgt werden können. Während das Verfahren von Kirschner die Analyse des Verknüpfungsgrads eines Reaktionsansatzes durch die erforderlichen Manipulationen nur zu einem gegebenen Zeitpunkt erlaubt   (Endpunktmessung),    ermöglicht unser Verfahren nicht-eingreifende"on-line"Messungen über den gesamten Zeitraum der Reaktion (100 Messungen eines einzelnen Reaktionsansatzes im Abstand von Sekunden oder Minuten sind ohne weiteres möglich).



  Da FRET von der Distanz und Orientierung der Chromophoren abhängig ist (mit maximaler Energieübertragung bei Distanzen unter 5 nm), war es zunächst überraschend, festzustellen, dass bei der Grösse der zu konjugierenden Proteine FRET hinreichend und zuverlässig detektierbar war. So wird hierin beschrieben, dass ein zuverlässiger FRET-Nachweis stattfindet, wenn Proteine von 10 bzw. 20 kDa zwischen exemplarische fluoreszierende Proteine eingefügt werden, während bei den von Tsien und Mitarbeitern vorgeschlagenen Verfahren zur Analyse von Proteasen ein Linkerpeptid von nur 5-50 Aminosäuren, das die gewünschte Protease-Erkennungssequenz trägt, zwischen die fluoreszierenden Proteine YFP und CFP gesetzt wurde (US 5,981,200).

   Desweiteren werden in den im Stand der Technik bekannten Verfahren nur die Sonden, nicht aber die eigentlichen Reaktanden mit fluoreszierenden Gruppen markiert. Es wurde demgegenüber überraschenderweise festgestellt, dass die direkte Verknüpfung der miteinander reagierenden Reaktionskomponenten des Testsystems, d. h. Zielprotein und Ubiquitinverwandtes Protein, mit den jeweiligen Chromophoren nicht zu einer Inhibierung derselben führt. Der entscheidende Durchbruch zu diesem technologischen Konzept gelang den Erfindern, als sie erfolgreich ein in vitro-Testsystem mit rekombinanten Komponenten etablieren konnten, in dem die quantitative Modifizierung eines Zielproteins sowie die Demodifikation eines modifizierten Zielproteins erzielt wurde.

   Auf der Grundlage der Befunde der Erfinder kann man nun analoge Modifikations-und Demodifikations-Systeme mit allen gewünschten Ubiquitinverwandten Proteinen und Zielproteinen entwickeln. Da Proteine der Ubiquitin Familie nicht nur die gleiche dreidimensionale Faltung besitzen, sondern darüberhinaus über konservierte Mechanismen an Zielproteine verknüpft werden (Jentsch und Pyrowolakis, 2000), kann der Fachmann jetzt z. B. davon ausgehen, dass Fusionsproteine zwischen einem fluoreszierenden Protein und einem Ubiquitin-verwandten Protein (inklusive Ubiquitin) in der FRET-Technologie einsetzbar sind. Dabei kann die Verknüpfung vorzugsweise so erfolgen, dass das Ubiquitinverwandte Protein an den C-Terminus des fluoreszierenden Proteins fusioniert ist (analog der Anwendungsbeispiele).

   Die Zielproteine zu den entsprechenden Ubiquitin-verwandten Proteinen sind zwar heterogener in Faltung und Grösse, aber es wird dem Fachmann angesichts der vorliegenden Offenbarung leicht möglich sein, ein Fusionsprotein oder anderweitig fluoreszenzmarkiertes Zielprotein so zu konstruieren, dass es sich für das Testsystem einsetzen lässt. In Frage kommen beispielsweise N-terminale oder C-terminale Fusionen mit fluoreszierenden Protei nen, die Integration des fluoreszierenden Proteins zwischen zwei Domänen eines Proteins, oder auch das Verknüpfen von Chromophoren an spezifische Aminosäuren im Zielprotein   (ggf.    nach Einführung geeigneter Seitenketten durch Mutage  nese    des Zielproteins).

   Dabei ist zu beachten, dass das Akzeptorchromophor möglichst nahe an die Modifikationsstelle im Zielprotein gebracht wird, um effizientes FRET zu erreichen. Dabei bezieht sich"nahe"nicht auf die Primärsequenz sondern auf die räumliche Nähe im gefalteten Protein. Auch wenn die Strukturdaten für ein Zielprotein nicht bekannt sein sollten, wird der Fachmann erkennen, dass sich nach den oben genannten Vorgaben ohne grossen experimentellen Aufwand ein geeignetes Zielprotein konstruieren lässt.



  In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) mindestens ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, (ii) mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, (iii) Enzyme, die die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem mindestens einem Zielprotein und dem mindestens einem Ubiquitin-verwandten Protein bewirken ;

   (iv) ATP und/oder ein ATP-Derivat, und Inkontaktbringen der Bestandteile (i)- (iv) unter Bedingungen, die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gebildetem Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares.



  Das Prinzip dieses auf FRET basierenden Testsystem für die Analyse von posttranslationalen Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen ist wie folgt. Ein mit einem Donor-Chromophor verknüpftes Zielprotein wird mit einem Akzeptor-Chromophor-verknüpften Ubiquitin-verwandten Protein in Anwesenheit der geeigeneten Enzyme und Energie in Form von ATP (oder ATP-Derivaten wie AMP-PNP) inkubiert. Durch die Ausbildung der Isopeptidbindung kommen Donor-und Akzeptorchromophore in unmittelbare Nachbarschaft, was FRET ermöglicht (s. a. Fig. 1). Dies wird mittels eines Fluoreszenzmessgerätes (z. B. in Mikrotiterplatten-Fluoreszenzmessgeräten) erfasst, indem das Donor-Chromophor durch Einstrahlung der geeigneten Wellenlänge angeregt wird, und sowohl Donor-als auch Akzeptorfluoreszenz in Abhängigkeit der Reaktionszeit gemessen werden.

   Die Änderung des Verhältnisses der Akzeptorfluo  reszenz    zu Donorfluoreszenz korreliert direkt mit der Änderung der Menge an Konjugation. Daher ist dieses Verfahren geeignet, Ubiquitin-verwandte Modifizierungen ohne weitere Manipulationen in in vitro-Testsystemen mit rekombinanten oder gereinigten Komponenten und/oder   Zellextrakten    schnell und quantitativ zu analysieren.



  In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Demodifizierungen von Proteinen, die mit Ubiquitin-verwandten Proteinen verknüpft sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) ein Isopeptidase-Substrat, das ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluoescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, umfasst ; wobei diese durch eine Isopeptidbindung zwischen der s-Aminogruppe eines Lysins des Zielproteins und der Cterminalen Carboxygruppe des mindestens einen Ubiquitin-verwandten Proteins miteinander verknüpft sind ;

   und (ii) mindestens ein Enzym, das die Spaltung der Isopeptidbindung des Isopeptidase-Substrats bewirkt ; und Inkontaktbringen der Bestandteile (i) und (ii) unter Bedingungen, die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gespaltenem Isopeptidase Substrat, d. h. des Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein, durch Bestimmen von FRET, insbesondere der Abnahme von FRET, zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares. 



  Bei der Ubiquitinierung handelt es sich um eine enzymatisch katalysierte Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem C-Terminus des 9-kDa umfassenden Polypeptids Ubiquitin mit den s-Aminogruppen in den Lysinen von Akzeptor bzw.



  Zielproteinen. Diese Modifikation ist reversibel, d. h. es kann eine Deubiquitinierung stattfinden, bei der der Ubiquitinanteil durch Deubiquitinierende Enzyme (Isopeptidasen) von dem Zielprotein abgespalten werden kann. Die hierein verwendeten Begriffe"Ubiquitinierung"und"Deubiquitinierung"beziehen sich daher in einem engeren Sinne auf Ubiquitin selbst, während in Hinsicht auf die mit Ubiquitin-verwandten Proteine in einem weiteren Sinn   von"Modifizierungen    von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen"bzw."Demodifizierungen von Proteinen, die mit Ubiquitin-verwandten Proteinen verknüpft sind"die Rede ist.



  Unter   einem"Ubiquitin-verwandten    Protein"wird hierin in einem weiteren Sinne ein Protein verstanden, dass strukturell mit Ubiquitin verwandt ist, und dessen Cterminales Ende durch enzymatische Reaktion mittels einer Isopeptidbindung an s-Aminogruppen in Lysinen der Zielproteine verknüpft wird bzw. werden kann.



  Dazu gehören in einem weiteren Sinne neben z. B. SUMO1 und seinen Homologen SUM02 und   SUM03,      Nedd8/Rubl,      Apgl2    oder Ucrp auch Ubiquitin selbst (zur Übersicht siehe Hershko and Ciechanover, 1998 ; Hochstrasser,   1998    ; Jentsch and Pyrowolakis, 2000 ; Melchior, 2000 ; Yeh et al., 2000). In einem engeren Sinne meint dieser Begriff derartige Ubiquitin-verwandte Proteine unter Ausschluss von Ubiquitin selbst.



  Unter einem"Zielprotein"wird hierin ein Protein verstanden, dass mittels der dafür geeigneten Enzyme durch die Bildung einer Isopeptidbindung mit Ubiquitin oder Ubiquitin-verwandten Proteinen verknüpft wird bzw. werden kann. Das Zielprotein ist üblicherweise mit einem ersten Chromophor eines Donor Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft, während das mindestens eine Ubiquitin-verwandte Protein mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist. Dem  Fachmann sind geeignete Verfahren zur Erzielung einer kovalenten Verknüpfung bekannt. Unter einem"Chromophor"wird hierin die"farbgebende"Gruppe eines Moleküls verstanden, d. h. der Teil eines Moleküls, der aufgrund seiner elektronischen Übergänge für die Lichtabsorption und Emission verantwortlich ist.

   Chromophore können sowohl niedermolekulare Substanzen, z. B. die Indocyanin Farbstoffe Cy3, Cy3.5,   Cy5,    Cy7 (erhältlich von   Amersham    International plc, GB) oder auch fluroeszierende Proteine sein, wie bestimmte GFPs ("Green Fluo  rescent    Protein") und mutante GFPs (erhältlich z. B. von Clontech Laboratories Inc, Palo Alto, CA, USA). Vorzugsweise handelt es sich bei dem ersten Chromophor um den FRET-Donor CFP ("Cyan Fluorescent Protein") und bei dem zweiten   Chormophor    um den FRET-Akzeptor YFP ("Yellow Fluorescent Protein").

   Bei dem sog."Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) kann bei der Überlappung des   Emissionsspektrums    eines Chromophors (Donor Chromophor oder FRET-Donor) mit dem Absorptionsspektrum des zweiten Chromophors (Akzeptor-Chromophor oder FRET-Akzeptor) nach Anregung des Donor-Chromophors durch Energieübertragung auch das Akzeptor-Chromophor angeregt werden, wenn sich beide Chromophore in unmittelbarer Nachbarschaft befinden. FRET ist nachweisbar durch die Abnahme/Verlust der Emission des Donor-Chromophors bei gleichzeitigem Auftreten einer Emission des Akzeptor Chromophors. In den Biowissenschaften wird eine Vielzahl von Chromophoren als Donor-Akzeptor-Paare für die FRET-Technologie eingesetzt, und diese sind damit auch für die nachfolgend beschriebenen Verfahren einsetzbar.

   Exemplarisch sollen hier Fluoreszein und Rhodamin genannt werden, die in aktivierter Form im Handel erhältlich sind und nach Standardprotokollen an Proteine gekoppelt werden können ; sowie CFP und YFP, die durch Standdardtechniken der Molekularbiologie und Biochemie als Fusionen mit anderen Proteinen erzeugt werden können (Plasmide, die YFP-und CFP-Proteine kodieren sind ebenfalls im Handel erhältlich). 



  Unter einem"Isopeptidase-Substrat"wird hierin ein Substrat für ein Enzym verstanden, welches Ubiquitin oder ein Ubiquitin-verwandtes Protein von einem mit Ubiquitin oder einem Ubiquitin-verwandten Protein verknüpften Zielprotein durch Spaltung der Isopeptidbindung entfernt. Üblicherweise umfasst dieses ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluoescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, wobei diese insbesondere durch eine Isopeptidbindung zwischen der s-Aminogruppe eines Lysins des Zielproteins und der C-terminalen Carboxygruppe des mindestens einen Ubiquitin-verwandten Proteins miteinander verknüpft sind.



  Bei dem Bereitstellen des Testsystems und dem Inkontaktbringen der Bestandteile unter Bedingungen die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlau  ben/ermöglichen,    kommt es, sofern dies nicht anders angegeben ist, nicht darauf an, dass die Bestandteile als separate Bestandteile vorliegen oder in einer bestimmten Reihenfolge gemischt bzw. miteinander in Kontakt gebracht werden.



  Vielmehr sollte sichergestellt sein, dass die jeweils erforderlichen Bestandteile des jeweiligen Testsystems vorliegen, und dass das Inkontaktbringen dieser Bestandteile derart erfolgt, dass die enzymatische Reaktion ablaufen kann und eine FRET Messung vorgenommen werden kann. Sofern ATP und/oder ein ATP-Derivat hierzu erforderlich sind, kann es sich bei Letzteren um die dem Fachmann bekannten Derivate handeln, insbesondere um AMP-PNP oder   ATPyS    (z. B. von Roche Diagnostics). Dem Fachmann wird es angesichts der vorliegenden Offenbarung ersichtlich sein, wie die für die zu untersuchende Reaktion geeigneten Bedingungen, z. B. in Bezug auf Temperatur oder pH-Wert, festzulegen sind.



  In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Zielprotein und/oder das Ubiquitin-verwandte Protein in Form eines Fusionsproteins mit einem fluoreszierenden Protein verwendet werden. Bei dem mindestens einen Zielprotein handelt es sich vorzugsweise um   RanGAPl    von Maus oder Mensch (SWISS-PROT : P46061 ; SWISS-PROT : P46060) und bei dem mindestens ein Ubiquitin-verwandten Protein um SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier), insbesondere um   SUMO1,    SUM02 und/oder SUM03. Die Zugangsnummern (SWISS-PROT) für die humanen SUMO-Proteine sind wie folgt : Q93068   (SUMO1)    ; P55854 (SUM02) und P55855   (SUMO3).    Diese Proteine sind für die Maus identisch (zur Übersicht siehe auch Melchior, 2000).

   Vorteilhafterweise kann   RanGAPI    und/oder CFP in Form eines Fusionsproteins verwendet werden, insbesondere wobei die C Terminal Domäne von RanGAPl mit dem N-oder C-terminalen Ende von CFP fusioniert ist. In entsprechender Weise kann SUMO und/oder YFP in Form eines Fusionsproteins verwendet werden, insbesondere wobei die Aminosäuren 1-91 von   SUMO1,    die Aminosäuren von 1-92 von SUM02 oder die Aminosäuren 1-93 von SUMO3 mit dem C-terminalen Ende von YFP fusioniert sind.



  Praktischerweise kann das Zielprotein, das Ubiquitin-verwandte Protein und/oder die jeweiligen Enzyme in Form eines gereinigten Proteins (partiell oder bis zur Homogenität) und/oder eines Zellextrakts verwendet werden. Hierbei kann es sich insbesondere um einen Extrakt aus Säuger-, Insekten-, Hefe-und/oder Bakterienzellen handeln, den der Fachmann mittels geeigneter Techniken herstellen kann.



  Hierbei kann es sich insbesondere auch um ein Derivat des Zielproteins, des Ubiquitin-verwandten Proteins und/oder der Enzyme handeln. Unter dem Begriff "Derivat"wird hierin ein Proteine oder Polypeptid verstanden, das eine Sequenzhomologie, insbesondere eine Sequenzidentität zu den vorgenannten Proteinen von mindestens 50 % aufweist, wie mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder sogar 95%. Ferner zählen hierzu auch   Deletionen    der jeweiligen Proteine sowie Substitutionen und Additionen (z. B. K48R Ubiquitin, welches noch mit Zielproteinen verknüft werden kann, aber die über Lysin 48 verknüpften Ubiquitin-Ubiquitin Ketten nicht mehr bildet. Diese Mutante bietet daher einen klaren Vorteil gegenüber Wildtyp-Ubiquitin in der FRET-Analyse).

   Dementsprechend umfasst die vorliegende Offenbarung auch Nukleinsäuren, die für die vorgenann ten Proteine oder Polypeptide kodieren. Beispiele derartiger verwandter Nukleinsäuren sind Nukleinsäuren aus unterschiedlichen menschlichen Zellen bzw. Geweben oder allelische Varianten, sowie Nukleinsäuren die von verschiedenen menschlichen Individuen stammen können. Im weiteren Sinne versteht man unter einer Nukleinsäure, die ein derartiges Derivat kodiert, eine Nukleinsäure, die eine Homologie, insbesondere eine Sequenzidentität zu einer ein oben genanntes Protein kodierenden Nukleinsäure von mindestens 50%, wie mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder sogar 95% aufweisen.

   Dem Fachmann stehen geeignete Techniken und Verfahren zur Herstellung und Mutagenese von Nukleinsäuren sowie zur Genexpression und Proteinanalyse zur Verfügung (siehe die folgenden Handbücher : 1. Molecular Cloning : A Laboratory Manual (3. Auflage).



  Sambrook und Russell (2001). Cold Spring Harbour Press. 2. Current Protocol in Protein Science. Coligan, J. E. et al. (vierteljährlich aktualisiert). Verlag John Wiley  &  Sons. 3. Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel F. M. et al. (vierteljährlich aktualisiert). Verlag John Wiley  &  Sons.) Hinsichtlich der in dem jeweiligen Testsystem enthaltenden Enzyme wird der Durchschnittsfachmann leicht erkennen, welche Enzyme jeweils geeignet sind, den Ablauf der entsprechenden enzymatischen Reaktion zu ermöglichen (zur Übersicht siehe z. B. Hershko und A. Ciechanover, 1998 ; Yeh et al., 2000 ; Jentsch und Pyrowolakis, 2000.). Zur Veranschaulichung sei erwähnt, dass dies beispielsweise bei der Analyse von Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitinverwandten Proteinen die entsprechenden EI-und E2-Enzyme, wahlweise in Kombination mit mindestens einem E3-Enzym, sind.

   Für das Ubiquitin-verwandte Protein SUMO sind dies insbesondere das Aosl/Uba2-Heterodimer als El-Enzym und das   Ubc9-Protein    als E2-Enzym. Sofern ein noch nicht identifiziertes E3 Enzym existiert, kann dieses z. B. mittels des in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahrens isoliert und identifiziert werden, und dann   ggf.    in den vorgeschlagenen Testsystemen eingesetzt werden. Im Falle der Analyse von Deubiquitinierungen handelt es sich bei dem Enzym um eine der zahlreichen Ubiquitin-Isopeptidasen   (Übersichtsartikel von Chung und Baek, 1999).

   Für Proteine, die mit den Ubiqui tin-verwandten Proteinen SUMO verknüpft sind, handelt es sich dabei zum Bei spiel um die bisher bekannten SUMO-spezifischen Isopeptidasen Ulpl, Ulp2,
Suspl und/oder Senpl (Originalarbeiten zur Klonierung der SUMO-spezifischen
Isopeptidasen sind im Übersichtsartikel Melchior 2000 zitiert). Sofern bisher nicht identifizierte Isopeptidasen existieren, können diese z. B. mittels des in dieser
Anmeldung beschriebenen Verfahrens isoliert und identifiziert werden, und dann    ggf.    in den vorgeschlagenen Testsystemen eingesetzt werden.



  In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum
Bestimmen von Stoffen, die die Modifizierung eines Zielproteins mit Ubiquitin verwandten Proteinen beinflussen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) mindestens ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für
FRET (Flurescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, (ii) min destens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des
Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, (iii) Enzyme, die die Bildung einer
Isopeptidbindung zwischen dem mindestens einem Zielprotein und dem mindestens einem Ubiquitin-verwandten Protein bewirken, (iv) ATP und/oder ein ATP
Derivat, und (v) mindestens einen zu testenden Stoff ;

   und Inkontaktbringen der
Bestandteile (i)- (v) unter Bedingungen, die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlauben ; und (b) Nachweisen der Bildung von Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein und/oder Bestimmen der Menge an gebildetem
Konjugat durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten
Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Enzymen gemäss Schritt (a) (iii) um die entsprechenden EI-und E2-Enzyme, wahlweise in Kombination mit mindestens einem E3 Enzym. Im Falle von SUMO ist das EI-Enzym das Aosl/Uba2-Heterodimer und das E2-Enzym das Ubc9-Protein. 



  Bei dem mindestens einem zu testenden Stoff handelt es sich um ein Protein oder Polypeptid, insbesondere eine E3-Ligase, Isopeptidase, Kinase oder Phosphatase, oder ein wie vorstehend definiertes Derivat hiervon, oder eine niedermolekulare Substanz, insbesondere ein Inhibitor oder Aktivator. Die niedermolekulare Sub  stanz"kann    ein beliebiges anorganisches order organisches Molekül oder Ion sein, dass auf seine Fähigkeit getestet wird, die enzymatische Reaktion in dem beschriebenen Testsystem zu beeinflussen, insbesondere diese Reaktion zu aktivieren oder zu inhibieren. Die niedermolekulare Substanz hat insbesondere ein Molekulargewicht von höchstens 2500, insbesondere höchstens 2.250,2.000, 1.900,1.800,1.700,1.600,1.500,1.400,1.300,1.250,1.200,1.100,1.000,900, 800,750,700,600,500,450,400,350,300,250 und 200.

   Beispielsweise kann es sich hierbei um Moleküle mit einer linearen Struktur wie Peptide, insbesondere Oligopeptide, Peptoide, lineare Oligosaccharide, Nukleotide, insbesondere Oligonukleotide, und deren Analoge handeln, oder z. B. um Monomere, wie Heterozyklen, insbesondere   Stickstoffheterozyklen,    oder Moleküle mit einer nichtlinearen Struktur, wie verzweigte Oligosaccharide. Niedermolekulare anorganische Verbindungen können beispielsweise Arsen-und Antimonverbindungen sein.



  Angesichts der vorliegenden Beschreibung wird es für den Fachmann klar sein, dass das Protein oder das Derivat hiervon aus einer Expressionsbank (Büssow et al., 2000) und/oder die niedermolekulare Substanz oder einer kombinatorischen Bank, insbesondere einer kombinatorischen Peptid-, Non-Peptid-oder"Drug-like Small Molecule"-Bank (z. B. von Tecnogen S. C. p. A. Piana di Monte Verna, CE, Italien ;   ChemBridge    Corporation, San Diego, USA ; oder Advanced ChemTech Europe Ltd,   Cambridgeshire,    GB), oder aber aus einem Zellextrakt stammen kann   und/oder    in gereinigter Form, partiell oder bis zur Homogenität, vorliegen kann.



  Dem Fachmann sind geeignete kombinatorische Strategien für das Screening, insbesondere dem"High Throughput Screening", von zu testenden Substanzen bekannt, insbesondere die Verwendung von kombinatorischen Banken, die 100, 1000 oder sogar 1.000.000 verschiedene Verbindungen umfassen können (siehe zur Übersicht z. B. Meyers, Encyclopedia of Molecular Biology and Molecular Medicine, 1997). 



  Ein weiterer Aspekt betrifft ein Verfahren zum Bestimmen von Stoffen, die die Demodifizierung eines Proteins, das mit mindestens einem Ubiquitin-verwandten Protein verknüpft ist, beinflussen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) ein Isopeptidase Substrat, das ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor Akzeptor-Paares für FRET (Flurescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, umfasst ; wobei diese durch eine Isopeptidbindung zwischen der s-Aminogruppe eines Lysins des Zielproteins und der C-terminalen Carboxygruppe des mindestens einen Ubiquitin-verwandten Proteins miteinander verknüpft sind ;

   (ii) mindestens ein Enzym, das die Spaltung der Isopeptidbindung des Isopeptid-Substrats bewirkt ; und (iii) mindestens einen zu testenden Stoff ; und Inkontaktbringen der Bestandteile (i)- (iii) unter Bedingungen, die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gespaltenem Isopeptidase-Substrat, d. h. des Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein, durch Bestimmen von FRET, insbesondere der Abnahme von FRET, zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares. In einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym gemäss Schritt (a) um eine Isopeptidase, insbesondere Ulpl, Ulp2, SUSP1 und/oder Senpl (zur Übersicht siehe z. B. Melchior, 2000).



  Bei dem mindestens einem zu testenden Stoff kann es sich um ein Protein oder Polypeptid, insbesondere einen Bindungspartner für das Zielprotein, eine Kinase oder Phosphatase oder ein Derivat hiervon oder eine niedermolekulare Substanz, insbesondere einen Inhibitor oder Aktivator, handeln, wie sie vorstehend definiert sind. Dem Fachmann stehen geeignete quantitative und qualitative Tests, z. B.



  ELISA-Verfahren, Co-Immunopräzipitation,   Microcalorimetri    etc. zur Verfügung, um zu ermitteln, ob das Protein oder Polypeptid unspezifisch oder spezifisch an das Zielprotein bindet, und damit einen Bindungspartner für das Zielprotein darstellt (diverse Techniken sind z. B. beschrieben in Current Protocol in Protein Science. Coligan, J. E. et al. (vierteljährlich aktualisiert). Verlag John Wiley  &  Sons.). Insbesondere wird hierin eine Bindung als spezifisch angesehen, wenn die Bindungsaffinität mindestens 10-6 M vorzugsweise 10-7,   10-8,    10-9 oder   10-1  M    beträgt. Wie vorangehend beschrieben stehen dem Fachmann geeignete Verfahren und Materialien, z. B. kombinatorische Banken, für ein Screening, insbesondere ein   HTS-Screening,    von zu testenden Stoffen zur Verfügung.



  In einer besonderen Ausführungsform der beiden vorgenannten Verfahren zum Bestimmen von Stoffen, die die Modifizierung/Demodifizierung beeinflussen, ist das erste Chromophor ein erstes fluoreszierendes Protein und das zweite Chromophor ein zweites fluoreszierendes Protein, insbesondere ist das Chromophor der FRET-Donor CFP ("Cyan Fluorescent Protein") und das zweite Chromophor der FRET-Akzeptor YFP ("Yellow Fluorescent Protein"). Zweckmässigerweise kann das Zielprotein   und/oder    Ubiquitin-verwandte Protein in Form eines Fusionsproteins mit einem fluoreszierenden Protein verwendet werden. Dem Fachmann sind geeignete Verfahren zur Herstellung derartiger Fusionsproteine bekannt.

   In einer speziellen Ausführungsform ist das mindestens eine Zielprotein   RanGAPI    und das mindestens eine Ubiquitin-verwandte Protein SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier), insbesondere   SUMO1, SUMO2    und/oder SUM03.



  Hierbei kann es bevorzugt sein, ein Fusionsprotein aus   RanGAPl    und CFP zu verwenden, insbesondere wobei die C-terminale Domäne von   RanGAPl    mit dem N-oder C-terminalen Ende von CFP fusioniert ist. Auf ähnliche Weise kann ein Fusionsprotein aus SUMO und YFP verwendet werden, wobei insbesondere die Aminosäuren 1-91 von   SUMO1,    die Aminosäuren von 1-92 von SUM02 oder die Aminosäuren 1-93 von SUM03 mit dem C-terminalen Ende von YFP fusioniert sind. Das Zielprotein, das Ubiquitin-verwandte Protein und/oder die Enzyme können in Form eines gereinigten Proteins, partiell oder bis zur Homogenität, oder eines Zellextrakts verwendet werden. Ein solcher Extrakt kann mittels Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, aus Säuger-, Insekten-, Hefe-und/oder Bakterienzellen hergestellt werden.

   Wenn beispielsweise kombinatorische Banken eingesetzt werden, um Stoffe darauf zu testen, ob sie die enzymatische Reaktion beeinflussen, kann es erwünscht sein, in einem weiteren Schritt die Identität des zu testenden Stoffes bzw. des getesteten Stoffes zu verifizieren und/oder zu ermitteln. Hierzu stehen dem Fachmann geeignete molekularbiologische, biochemische und/oder biophysikalische Verfahren, wie z. B. die Protein-und/oder Nukleinsäuresequenzanalyse und z. B. die verschiedenen Verfahren der Massenspektrometrie, wie die Matrix-unterstützte   Laserdesorptions/Ionisations-Massenspektrometrie    (MALDI-MS) zur Verfügung.

   In bestimmten Fällen kann es auch erwünscht sein, ein wie vorstehend definiertes Derivat des Zielproteins, des Ubiquitin-verwandten Proteins und/oder der Enzyme zu verwenden, beispielsweise um bestimmte Mutanten des Zielproteins auf ihre Modifizierung und/oder Demodifizierung zu untersuchen.



  Eine besondere Ausführungsform ist ein sog."cell based assay". Hierbei wird das Inkontaktbringen der entsprechenden Bestandteile in einer Zelle, insbesondere einer Zelle ausserhalb des menschlichen oder tierischen Körpers bewirkt, wobei Säuger-oder Hefezellen bevorzugt sind. Beispielsweise kann hierzu das Fusionsprotein aus Zielprotein und dem ersten fluoreszierenden Protein und/oder das Fusionsprotein aus dem Ubiquitin-verwandten Protein und dem zweiten fluoreszierenden Protein in der Zelle exprimiert werden. Der mindestens eine zu testende Stoff kann dabei ebenfalls in der Zelle exprimiert werden, vorzugsweise indem die Zelle mit einer für diesen Stoff kodierenden   cDNA    transfiziert wird, und/oder die Zelle wird mit dem mindestens einem zu testenden Stoff inkubiert.



  In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Defekts in der Modifizierung von Protein mit Ubiquitinverwandten Protein bzw. in der Demodifizierung von Proteinen, die mit Ubiquitin-verwandten Proteinen verknüpft sind. Es ist zu vermuten, dass Defekte in der  Modifizierung und Demodizierung spezifischer Zielproteine an einer Vielzahl von Krankheiten beteiligt sind, da unter den Zielproteinen für diese posttranslationale Modifikation Wachstumsfaktoren, Tumorsuppressoren und Protoonkogene sind.



  Defekte in der Ubiquitinierung von Zielproteinen sind bereits in einer Reihe von Krankheiten wie Von Hippel Lindau Syndrom, Angelman Syndrom, oder Cervicalem Krebs impliziert worden (Übersichtsartikel : Schwartz und Ciechanover, 1999 ; Vu und Sakamoto, 2000) Zum Beispiel scheinen Mutationen in Parkin, einer E3 Ubiquitin Ligase, zur Entstehung einer Form der Parkinsonschen Krankheit beizutragen.



  Das Verfahren zum Nachweis eines Defekts in der Modifizierung von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen umfasst die folgenden Schritte : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) mindestens ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Flurescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und (ii) mindestens ein Ubiquitinverwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor Paares kovalent verknüpft ist ; (iii) mindestens einen zu testenden Zellextrakt ; und Inkontaktbringen der Bestandteile (i)- (iii) unter Bedingungen, die die Bildung von Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gebildetem Konjugat durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares.



  Das Verfahren zum Nachweis eines Defekts in der Demodifizierung von Proteinen, die mit Ubiquitin-verwandten Proteinen verknüpft sind, umfasst die folgenden Schritt : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) ein Isopeptidase Substrat, das ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor Akzeptor-Paares für FRET (Flurescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, umfasst ; insbesondere wobei diese durch eine Isopeptidbindung zwischen der   s-    Aminogruppe eines Lysins des Zielproteins und der C-terminalen Carboxygruppe des mindestens einen Ubiquitin-verwandten Proteins miteinander verknüpft sind ; und (ii) mindestens einen zu testenden Zellextrakt ;

   und Inkontaktbringen der Bestandteile (i)- (ii) unter Bedingungen, die die Spaltung von Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gespaltenem Konjugat durch Bestimmen von FRET, insbesondere der Abnahme von FRET, zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares.



  Der zu testende Zellextrakt kann jeweils aus Zellen von Gewebe eines zu untersuchenden Individuums   und/oder    aus Zellen aus Zellkultur stammen. Dem Fachmann sind geeignete Verfahren zur Herstellung derartiger Zellextrakte bekannt.



  In wiederum einem weiteren Aspekt wird ein neuartiges Verfahren zur Identifizierung von Zielproteinen für die Modifizierung mit Ubiquitin-verwandten Proteinen vorgeschlagen, dass die folgenden Schritt umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) mindestens ein zu testendes Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Flurescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, (ii) mindestens ein Ubiquitinverwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor Paares kovalent verknüpft ist, (iii) Enzyme, die die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem mindestens einem Zielprotein und dem mindestens einem Ubiquitin-verwandten Protein bewirken ;

   (iv) ATP und/oder ein ATP-Derivat ; und Inkontaktbringen der Bestandteile (i)- (iv) unter Bedingungen, die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlauben ; und (b) Nachweisen der Bildung von Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein und/oder Bestimmen der Menge an gebildetem Konjugat durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares.



  Dieses Verfahren erlaubt ein Screening auf Zielproteine für bestimmte Ubiquitinverwandte Proteine. Dabei kann das Inkontaktbringen der vorangehenden Bestandteile des Testsystems in einer Zelle, insbesondere in einer Zelle ausserhalb des menschlichen oder tierischen Körpers, bewirkt werden, wobei eine Säugeroder Hefezelle bevorzugt ist. Das mindestens eine zu testende Zielprotein kann in Form eines Fusionsproteins mit einem ersten fluoreszierenden Protein, vorzugsweise einem Fusionsprotein mit dem FRET-Donor CFP, verwendet werden. In einer besonders praktischen Ausführungsform stammt ein solches Fusionsprotein aus einer Expressionbank und kann z. B. mittels einer für dieses Fusionsprotein kodierenden   cDNA    in eine Zelle eingebracht und darin exprimiert werden.

   Auf dieses Weise ist es dem Fachmann aufgrund der im Stand der Technik bekannten kombinatorischen Techniken und Verfahren leicht möglich, eine sehr grosse Anzahl von potentiellen Zielproteinen zu screenen. Besonders vorteilhaft ist, wenn das zweite Chromophor ein zweites fluoreszierendes Protein, vorzugsweise der FRET-Akzeptor YFP, ist und beispielsweise das mindestens eine Ubiquitinverwandte Protein in Form eines Fusionsproteins mit dem zweiten   fluoreszieren-    den Protein in einer Zelle exprimiert wird. Ein Beispiel für ein Ubiquitinverwandtes Protein ist SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier), insbesondere   SUMO1,    SUM02 und/oder SUM03.

   Vorteilhafterweise kann ein Fusionsprotein umfassend SUMO und YFP verwendet werden, wobei insbesondere die Aminosäuren   1-91    von   SUMO1,    die Aminosäuren 1-92 von SUM02 oder die Aminosäuren 1-93 von SUMO3 mit dem C-terminalen Ende von YFP fusioniert sind.



  Dem Fachmann sind die entsprechenden Enzyme gemäss Schritt (a) (ii) des vorgenannten Verfahrens bekannt (siehe auch Hershko and Ciechanover, 1998 ; Hochstrasser, 1998 ; Jentsch and Pyrowolakis, 2000 ; Melchior, 2000 ; Yeh et al., 2000). So wird er entsprechende EI-und E2-Enzyme, wahlweise in Kombination mit mindestens einem E3-Enzym, einsetzen. Im Falle von SUMO kann als E1 Enzym das   Aosl/Uba2-Heterodimer    und als E2-Enzym das Ubc9-Protein eingesetzt werden.



  Zweckmässigerweise kann das Zielprotein, das Ubiquitin-verwandte Protein und/oder die Enzyme in Form eines gereinigten Proteins, entweder partiell oder bis zur Homogenität gereinigt, oder eines   Zellextraktes    eingesetzt werden, wobei ein Extrakt aus Säuger-, Insekten-, Hefe-und/oder Bakterienzellen bevorzugt ist.



  Bei dem mindestens einem zu testenden Zielprotein kann es sich auch um ein Derivat, wie vorangehend definiert, eines bekannten Zielproteins handeln, beispielsweise um bestimmte Mutanten. Wahlweise oder alternativ dazu kann auch ein entsprechend definiertes Derivat des Ubiquitin-verwandten Proteins und/oder der Enzyme verwendet werden. Sollte es gewünscht sein, die Identität des Zielproteins zu verifizieren (beispielsweise wenn eine kombinatorische Bank aus mutanten Zielproteinen gescreent wird, die mittels des sog."DNA-shufflings"erhalten wurde) oder die Identität des Zielproteins zu ermitteln (z. B. bei dem Screening einer Expressionbank mit potentiellen Zielproteinen), kann dies mittels dem Fachmann bekannter molekularbiologischer, biochemischer und/oder biophysikalischer Verfahren wie vorstehend beschrieben geschehen.



  In einem weiteren Aspekt schlagen die Erfinder einen Kit zum Nachweis von Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen vor, der die folgenden Bestandteile   umfasst    : (i) mindestens ein Zielprotein   und/oder    Derivat hiervon, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Flurescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und/oder eine hierfür kodierende Nukleinsäure ; und (ii) mindestens ein Ubiquitinverwandtes Protein und/oder Derivat hiervon, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, und/oder eine hierfür kodierende Nukleinsäure ; sowie wahlweise (iii) Enzyme, die die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem mindestens einem Zielprotein und dem mindestens einem Ubiquitin-verwandten Protein bewirken ;

   und/oder mindestens eine hierfür kodierende Nukleinsäure ; und/oder (iv) ATP und/oder ein ATP-Derivat. Vorteilhafte Ausführungsformen der genannten Bestandteile sind aus der vorangehenden Beschreibung ersichtlich.  In einem weiteren Aspekt wird ein Fusionsprotein bereitgestellt, das SUMO und ein fluoreszierende Protein, vorzugsweise YFP,   umfasst,    wobei insbesondere die Aminosäuren 1-91 von SUMO1, die Aminosäuren 1-91 von SUM02 oder die Aminosäuren 1-93 von SUM03 mit dem C-terminalen Ende von YFP fusioniert sind. Des weiteren wird auch ein Fusionsprotein vorgeschlagen, das   RanGAPI    und ein fluoreszierendes Protein, vorzugsweise CFP, umfasst, wobei beispielsweise die C-terminale Domäne von RanGAPl mit dem N-oder C-terminalen Ende von CFP fusioniert sein kann.

   Für die genannten Fusionsproteine kodierende Nukleinsäuren sind ebenfalls vorgesehen. Weiterhin wird eine Zelle bereitgestellt, insbesondere eine Säugerzelle ausserhalb des menschlichen oder tierischen Körpers oder eine Hefezelle, die eines oder beide der vorgenannte Fusionsproteine exprimiert.



  In einem weiteren Aspekt wird ein Isopeptidase-Substrat bereitgestellt, das ein Zielprotein umfasst, welches mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor Paares für FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und ein Ubiquitin-verwandtes Protein, dass das Zielprotein modifiziert und mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, wobei das Zielprotein und das Ubiquitin-verwandte Protein über mindestens eine Isopeptidbindung verknüpft sind. Bei den letzteren beiden Proteinen kann es sich auch um Derivate im Sinne der vorangehenden Definition handeln. Insbesondere besteht die mindestens eine Isopeptidbindung zwischen mindestens einer   s-    Aminogruppe eines Lysins des Zielproteins und der C-terminalen Carboxygruppe des Ubiquitin-verwandten Proteins.

   In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Ubiquitin-verwandten Protein um SUMO, insbesondere   SUMO1, SUMO2    oder SUM03. Das Zielprotein für SUMO kann eines der nachfolgenden Proteine, oder ein noch zu identifizierendes Protein sein : RanGAPI, RanBP2, PML,   SplO0,      IKBs,,    D. melanogaster Dorsal, p53, c-Jun, HIPK2, S. cerevisiae Cdc3, S. cerevisiae Cdcll, S. cerevisiae Sep7/Shsl,   hCMV    IE1,   hCMV    IE2, D. melanogaster Tramtrack, Topoisomerase   I,      Glutl,    Glut4 und Mdm2 (siehe Melchior, 2000, Tabelle I).

   In einer besonderen Ausführungsform ist das erste  Chromophor ein erstes fluoreszierendes Protein und das zweite Chromophor ein zweites fluoreszierendes Protein, wobei vorzugsweise das erste Chromophor der FRET-Donor CFP ("Cyan Fluorescent Protein") und das zweite Chromophor der FRET-Akzeptor YFP ("Yellow Fluorescent Protein") ist. Insbesondere wird das Zielprotein und/oder Ubiquitin-verwandte Protein in Form eines Fusionproteins mit einem fluoreszierenden Protein, z. B. in Form von CFP-RanGAPl   und/oder    YFP-SUMO verwendet.



  In wiederum einem anderen Aspekt der Erfindung schlagen die Erfinder die Verwendung eines Kits, eines Fusionsproteins, und/oder einer Zelle, wie jeweils vorstehend beschrieben, zur Analyse von Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen, zum Bestimmen von Stoffen, die die Modifizierung eines Zielproteins mit Ubiquitin-verwandten Proteinen beeinflussen, zur Identifizierung von Zielproteinen für die Modifizierung mit Ubiquitin-verwandten Proteinen und/oder zur Diagnose, insbesondere zum Nachweis eines Defekts in der Modifizierung von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen, vor.

   Gleichermassen wird die Verwendung des beschriebenen Isopeptidase-Substrats zur Analyse von Demodifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen, zum Bestimmen von Stoffen, die die Demodifizierung eines Zielproteins mit Ubiquitin-verwandten Proteinen beeinflussen, und/oder zur Diagnose, insbesondere zum Nachweis eines Defekts in der Demodifizierung von Proteinen mit Ubiquitinverwandten Proteinen, bereitgestellt.



  Abschliessend werden Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt. Das erste Verfahren umfasst in einer ersten Stufe die vorangehend beschriebenen Schritte zum Bestimmen von Stoffen, die (i) die Modifizierung eines Zielproteins mit Ubiquitin-verwandten Proteinen beeinflussen, oder (ii) die Demodifizierung eines Proteins, das mit mindestens einem Ubiquitinverwandten Protein verknüpft ist, beeinflussen, und in einer zweiten Stufe das Vermischen des getesteten und/oder identifizierten Stoffs mit einem dem Fachmann bekannten pharmazeutisch verträglichen Träger (siehe z. B. Sucker et al., 1991).

   Das zweite Verfahren umfasst in einer ersten Stufe die vorangehend beschriebenen Schritte zur Identifzierung eines Zielproteins für Ubiquitinverwandten Proteinen, und in einer zweiten Stufe das Vermischen des identifizierten Zielproteins oder eines Derivats hiervon mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Die vorliegende Offenbarung stellt somit wirksame Verfahren zur Idenfizierung von Agenzien, Verbindungen oder sog."lead compounds"für Arzneimittel bereit, die die Modifizierung bzw. Demodifizierung mit Ubiquitinverwandten Proteinen direkt oder indirekt betreffen. Die identifizierten Stoffe und/oder Zielproteine können mittels automatisierter und   kosteneffektiver    HTS Verfahren zum Screening von kombinatorischen Banken zum Bereitstellen von wirksamen Bestandteilen von Arzneimittel verwendet werden.

   Letztere werden dann mittels üblicher Verfahren auf ihre Aktivität und minimale Toxizität optimiert. Klinische Anwendungsgebiete schliessen die Behandlung von viral bedingten Krankheiten,   Neurodegenerativen    Krankheiten, Tumoren, Entzündungen und Krankheiten des Immunsystems ein.



  Die oben beschriebenen Ausführungsformen können entweder allein oder in Kombination mit anderen Ausführungsformen verwendet werden.



  Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie darauf zu beschränken. Die darauf folgenden Ansprüche werden hiermit durch Bezugnahme in den Text dieser Beschreibung mitaufgenommen.



  Beschreibung der Figuren Fig 1 zeigt das Prinzip und die Anwendungsmöglichkeiten der Testverfahren zur Bestimmung von posttranslationalen Modifizierungen bzw. Demodi fizierungen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen.



   Ubiquitin-verwandte Proteine werden in Enzym-vermittelten Reaktionen an eine Vielzahl von zellulären Proteinen kovalent angeheftet. Dabei wird mindestens eine Isopeptidbindung zwischen dem Ubiquitin verwandten Protein und dem Zielprotein ausgebildet. Isopeptidasen kön nen diese Bindung wieder spalten. Unter Ausnutzung von"Fluorescence
Resonance Energy Transfer" (FRET) kann sowohl die Verknüpfung  (Modifizierung) als auch die Spaltung (Demodifizierung) in Lösung ki netisch verfolgt werden.

   Diese Testverfahren eignen sich prinzipiell für die Analyse alle bekannten Paare von Zielprotein und Ubiquitin verwandten Proteinen, und können beispielsweise angewandt werden für :    l.    Die Identifizierung von modifizierten und demodifizierten Enzymen, sowie anderer Faktoren, die diese Modifikation/Demodifizierung beein flussen (Bindungspartner, Kinasen, Phosphatasen, etc). 2. Die Identifizie rung von pharmazeutisch relevanten Substanzen, die die Modifizierung/
Demodifizierung spezifischer Zielproteine inhibieren oder aktivieren. 3.



   Die Identifizierung und Analyse von Mutanten der Zielproteine, Ubiqui tin-verwandte Proteine und der erforderlichen Enzyme. 4. Die Identifizie rung von neuen Zielproteinen für ein bekanntes Ubiquitin-verwandtes
Protein. 5. Die Diagnostik.



  Fig. 2 zeigt die Rekonstitution der   SUMOl-Modifizierung    mit fluoreszierenden
Fusionsproteinen und rekombinanten Enzymen.



   Standard : das   El-Enzym-Heterodimer    His-Aosl/Uba2, das E2-Enzym
Ubc9, CFP-RanGAP (Aminosäuren (As.) 400-589), und YFP-SUMO1  (As. 1-97) wurden in Anwesenheit von ATP 30 min bei   30 C    inkubiert, anschliessend mit   Probenauftragspuffer    versetzt, mittels SDS-PAGE auf getrennt und durch Immunblot-Anfärbung mit   anti-RanGAPl-   
Antikörpern (oberer Teil von Fig.   1),    oder mit   anti-GFP-Antikörpern     (unterer Teil) analysiert.



   ATP : wie Standard, aber ohne ATP. 



   + SUMO : wie Standard, aber mit Überschuss an   nichtfluoreszierendem   
SUMO1.



     - Ubc9    : wie Standard, aber ohne Ubc9-Zugabe.



     - El    : wie Standard, aber ohne Zugabe von   Aosl/Uba2.   



   ** zeigt die Isopeptidbindung an.



  Fig. 3 zeigt den Nachweis der SUMO l-Modifizierung von fluoreszierenden
Fusionsproteinen durch FRET.



   Das   El-Enzym-Heterodimer      His-Aosl/Uba2,    das E2-Enzym Ubc9, CFP
RanGAP (As. 400-589), und YFP-SUMO1 (As. 1-97) wurden in Mikro titerplatten gemischt (Reaktionsvolumen 25   ul)    und die Modifizierungs reaktion durch Zugabe von 1 mM ATP gestartet. Die Proben wurden bei
430 nm angeregt, und die Emission wurde bei 485 nm und 527 nm in
Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Es sind die Primärdaten, d. h. Emis sionen bei 485 und 527 nm (Fig. 3A), und die prozessierten Daten, d. h. der Quotient der Emissionen bei 527 nm und 485 nm (Fig. 3B), gezeigt.



  Fig. 4 zeigt die Analyse von Inhibitoren der Modifizierung im FRET
Testsystem.



   His-Aosl/Uba2, Ubc9, CFP-RanGAP (As. 400-589), und YFP-SUMO1  (As. 1-97) wurden in Mikrotiterplatten gemischt (Reaktionsvolumen 25    111).    Zu den Proben in Fig. 4A wurden darüber hinaus ansteigende Men gen an nichtfluoreszierendem   RanGAPI    als Kompetitor gegeben ; zu
Proben in Fig. 4B wurden ansteigende Mengen an Gst-RanBP2 (As.



   7634-8806) gegeben, welches an das Enzym Ubc9 bindet und dieses da durch inhibiert. Durch Zugabe von 1 mM ATP wurden die Modifizie rungsreaktionen gestartet. Die Proben wurden bei 430 nm angeregt, und die Emission wurde bei 485 nm und 527 nm in Abhängigkeit von der
Zeit gemessen. Die Zugabe des Kompetitors (s. Fig. 4A) ändert die Rate und maximale Höhe des entstehenden Signals. Die Zugabe des nicht kompetitiven Inhibitors (s. Fig. 4B) ändert die Rate, aber nicht die maxi male Höhe des entstehenden Signals.



  Fig. 5 zeigt die Analyse der Isopeptidase-Aktivität im FRET-Testsystem.



   Jeweils 25   ul    Isopeptidase-Substrat, bestehend aus dem Konjugat von
CFP-RanGAP (As. 400-589) und YFP-SUMO1 (As. 1-97), wurden mit rekombinanter Isopeptidase (Gst-Ulpl) bei   37 C    inkubiert. Die Proben wurden bei 430 nm angeregt, und die Emission wurde bei 485 nm und
527 nm in Abhängigkeit von der Zeit gemessen. Die Spaltung der Iso peptidbindung führt zu einer Abnahme des FRET-Signals.



  Beispiele   1.    Herstellung von rekombinantem YFP-SUMO1   CFP-RanGAP,      SUMO1-   
Aktivierendem Enzym Aosl/Uba2, SUMOl-konjugierendem Enzym
Ubc9 und der Isopeptidase Ulpl Die C-terminale 20 kDa Domaine des   SUMOl-Target    Protein   RanGAPl    (Maus, As. 400-589 ; GenBank :   U08111    ; Mahajan et al., 1997) wurde in den Vektor pE  CFP (Clontech) kloniert, als Cyan Fluoreszent Protein (CFP)-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und über DEAE-Sepharose und Gelfiltration partiell aufgereinigt.



  SUMO1 (human, As. 1-97 ; GenBank : U67122 ; Mahajan et al., 1997) wurde in den Vektor   pE-YFP    (Clontech) kloniert, als Yellow Fluoreszent Protein (YFP) Fusionsprotein in E. coil exprimiert und daraus über DEAE Sepharose und Gelfiltration partiell gereinigt.



  Die kodierende Region von Ubc9 (Maus ; GenBank : U94402) wurde in die NdeIund BamHI-Schnittstellen des Vektor pET23a (Novagen, Madison, USA) kloniert, in E. coli exprimiert und über S-Sepharose und Gelfiltration gereinigt.



  Das E1 Heterodimer   Aosl/Uba2    (humanes Uba2, GenBank : AF090384 ; humanes Aosl, GenBank :   NM005500)    wurde durch simultane Expression beider Untereinheiten in E. coli von den Plasmiden   pETlld    (Uba2) und pET28a   (Aosl)    (Plasmide von Novagen, Madison, USA) erhalten. Dabei wurde Aosl mit einem N-terminalen His6-Tag exprimiert. Reinigung erfolgte zunächst über Binden anund Elution von   ProBond    Resin (Invitrogen, Groningen, Niederlande), dann über Gelfiltration und anschliessend Chromatographie über Q-Sepharose.



  Ulpl wurde als Gst-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und über Glutathion Sepharose und Gelfiltration gereinigt. Das Expressionsplasmid (Li und Hochstrasser. 1999) wurde von Dr. Mark Hochstrasser, Yale, USA zur Verfügung gestellt.



  2. in vitro-Modifizierungsreaktion Die unter 1. beschriebenen rekombinanten Proteine Aosl/Uba2, Ubc9, YFP SUMO1 und CFP-RanGAP wurden in 386-Well-Mirotiterplatten zusammengegeben, zum Reaktionsstart mit ATP versetzt, und in dem Fluoreszenz-Messgerät Fluoroskan Ascent FL der Firma Labsystems GmbH (Frankfurt, Deutschland) bei   38 C    für bis zu 120 Minuten alle 30 oder 60 Sekunden vermessen. Dabei wurde Licht der Wellenlänge 430 nm (optimale Anregungswellenlänge für CFP) einge strahlt und die Fluoreszenz bei den Wellenlängen 485 nm (Maximum der Emission von CFP) und 527 mn (Maximum der Emission von YFP) gemessen.

   Alternativ dazu wurden die Proben für 30 min inkubiert, in SDS-PAGE Probenauftragspuffer aufgenommen, und durch Westerblot-Analyse mit anti  RanGAPl    (Mahajan et al., 1997) oder anti-GFP-Antikörpern (erhältlich von Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) analysiert.



  3.   in vitro-Demodifìzierungsreaktion (Isopeptidase-Test !    Isopeptidase-Substrat, bestehend aus dem Konjugat von CFP-RanGAP (As. 400589) und YFP-SUMO1 (oder YFP-SUM02), wurde erzeugt, indem zunächst die unter 1. beschriebenen rekombinanten Proteine Aosl/Uba2, Ubc9, YFP-SUMO1 (oder YFP-SUM02) und CFP-RanGAP in Anwesenheit von   1mM    ATP bei   30 C    für 30 min inkubiert wurden, und der Reaktionsmix nach erfolgter Verknüpfung von YFP-SUMO und CFP-RanGAP über Gelfiltration von verbleibendem ATP befreit wurde.

   [Angesichts dieser Offenbarung ist der Fachmann in der Lage, auf entsprechende Weise andere Isopeptidase-Substrate aus den geeigneten Bestandteilen herzustellen.] Jeweils   25 gel    dieses Isopeptidase-Substrates wurden in 386-Well Mikrotiterplatten mit ansteigenden Konzentrationen der Isopeptidase Ulpl versetzt, und im Fluoreszenz-Messgerät Fluoroskan Ascent FL der Firma Labsystems (Firma, Ort, Staat) bei   37 C    für bis zu 120 Minuten alle 60 Sekunden vermessen.



  Dabei wurde Licht der Wellenlänge 430 nm (optimale Anregungswellenlänge für CFP) eingestrahlt und die Fluoreszenz bei den Wellenlängen 485 nm (Maximum der Emission von CFP) und 527 nm (Maximum der Emission von YFP) gemessen. Alternativ dazu wurden die Proben für 30 min inkubiert, in SDS-PAGE Probenauftragspuffer inkubiert, und durch Westerblot-Analyse mit   anti-RanGAPI    (Mahajan et al., 1997) oder anti-GFP-Antikörpern (erhältlich von Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) analysiert. 



  4. Quantitativer Nachweis der   Modifizierung/Demodizierung    eines Ubiqui tin-verwandten Proteins und des Einflusses von Inhibitoren auf diese Re aktion Die generelle Anfwendbarkeit des auf FRET basierenden Testverfahrens wird nachfolgend anhand eines spezifischen Paares von"Zielprotein"und"Ubiquitinverwandtem Protein"demonstriert.



  RanGAPl, ein am Transport von Proteinen in den   Zellkern    beteiligtes Protein, wird kovalent mit dem Ubiquitin-verwandten Protein SUMO1 verknüpft (Mahajan et al., 1997 ; Mahajan et al., 1998). Diese Modifizierung ändert die cytoplasmatische Lokalisation des umnodifiziereten RanGAPI, indem sie eine stabile Assoziation des   RanGAPI    mit dem Kernporenkomplex-Protein RanBP2 ermöglicht. Die Modifizierung von   RanGAPI    mit SUMO1 kann in vitrorekonstituiert werden, indem als Enzymquelle entweder Extrakte von Säugerzellen oder gereinigte (rekombinante) Enzyme verwendet werden und die Modifizie  rungsreaktion    wie in Beispiel 2 gezeigt, gestartet und gemessen wird.

   Wie durch Westernblot Analyse demonstriert (Fig. 2), wurde das CFP-RanGAP Fusionsprotein quantitativ mit dem   YFP-SUMOl-Fusionsprotein    verknüpft. Dabei war diese Reaktion abhängig von Energie (hier wurde ATP verwendet), von Ubc9, und von dem Heterodimer   Aosl/Uba2.    Die Zugabe eines Überschusses an unfusioniertem SUMO (As. 1-97) verhindert durch Kompetition die Verknüpfung mit   YFP-SUMO1.   



  Das Auftreten von FRET ist gekennzeichnet durch Verlust von Akzeptor Fluoreszenz bei gleichzeitigem Anstieg der Donor-Fluoreszenz, wie nach Zusammengeben aller in Beispiel 1 beschriebenen Komponenten und ATP beobachtet werden kann, während bei Abwesenheit von ATP FRET nicht auftritt. Fig.



  3A zeigt die tatsächlich gemessenen Daten, und Fig. 3B den Quotienten der Emis sionen bei 527 nm und 485 nm. Ein Anstieg des Quotienten   korrelierte    unter allen getesteten Umständen strikt mit dem Auftreten der Konjugation, und ist daher abhängig von der Anwesenheit und Konzentration der geeigneten Enzyme (entweder rekombinant oder in Form von   Zellextrakten),    und von Energie (in Form von ATP oder anderen verwendbaren Nukleotiden).



  Ein FRET-Signal konnte beispielsweise verhindert werden durch einen Inhibitor der Enzyme (z. B. N-Ethylmaleimid) oder nichtfluoreszierende Kompetitoren (z. B. rekombinantes   RanGAP1    oder   SUMO1).    Ein bereits entstandenes FRET-Signal konnte zerstört werden, wenn nach Entfernen von ATP durch die Hexokinase und Glukose Zellextrakte mit Isopeptidase-Aktivität zugegeben wurden. Fig. 4 zeigt exemplarisch die Signalveränderungen in Abhängigkeit eines kompetitiven Inhibitors   (RanGAPl    ; Fig. 4A) und eines nichtkompetitiven Inhibitors (Gst-RanBP2, Fig. 4B ; dieses Protein bindet sehr stabil an Ubc9 und entzieht es dadurch der Reaktion).



  Darüberhinaus konnten mit diesem Verfahren Mutanten von SUMO1 und Ran GAP1 auf ihre Fähigkeit zur Konjugation untersucht werden, indem die Mutanten als nichtfluoreszierende   Kompetitoren    zugegeben wurden. Konjugationsfähige Mutanten reduzierten/oder verhinderten FRET, während bestimmte Mutanten, die nicht zur Konjugation fähig sind, FRET nicht beeinflussten.



  Die umgekehrte Reaktion, das heisst die Spaltung der Isopeptidbindung durch Isopeptidasen, führt zur Abnahme des FRET Signals. Fig. 5 zeigt beispielhaft die Demodifizierung durch die Hefe-Isopeptidase Ulpl. Weiterhin konnte die Isopeptidaseaktivität in Gesamtextrakten und in Zellfraktionen von   HeLA    Zellen mit dem FRET-Verfahren quantitativ bestimmt werden (Daten nicht gezeigt).



  Zusammengenommen demonstrieren diese Daten die Eignung der FRET Testverfahren für die kinetische Analyse der Modifizierung und/oder der Demodifizierung von   RanGAPI    mit SUMO1 und SUM02. Prinzipiell lassen sich daher für jedes Paar von Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein solche Testerfahren aufbauen. Dabei sollte darauf geachtet werden, durch die geeignete Wahl von Chromophoren, der verwendeten   Proteindomainen    und der Verknüpfung mit dem Chromophor die Donor-und Akzeptor-Chromophore nach kovalenter Verknüpfung in ausreichende Nähe für FRET zu bringen. Angesichts der vorliegenden Offenbarung wird der Fachmann die geeigneten Materialien und Verfahren leicht erkennen.



  5. Bestimmen von Proteinen, die die Modifizierung eines bekannten Ziel proteins beeinflussen Die oben   demonstrierten    in vitro Testverfahren, aber im Prinzip auch Verfahren in vivo können zur systematischen Identifizierung von Proteinen benutzt werden, die die Modifizierung eines definierten Ubiquitin-verwandten Proteins mit einem definierten Zielprotein inhibieren oder aktivieren. Dazu gehören neben putativen E3 Ligasen und Isopeptidasen auch Kinasen, Phosphatasen und andere Bindungspartner.



  In vitro-Verfahren : Dies kann zum Beispiel so erfolgen, dass alle für die in vitro Modifizierung bereitzustellenden Bestandteile einschliesslich des Akzeptormarkierten Ubiquitin-verwandten Proteins und des entsprechenden Donormarkiertem Zielproteins in Mikrotiterplatten vorgelegt werden, und unbekannte rekombinante Proteine, z. B.   gewonnen    aus Expressionsbanken in"High Throughput Screening" (HTS)-Verfahren (z. B. bei Verwendung von N-terminalen His-tags an den Fusionsproteinen), oder   Zellextraktfraktionen    bzw. gereinigte Proteine dazugegeben werden. Änderungen in der Reaktionskinetik deuten auf einen Einfluss des unbekannten Proteins auf die Modifizierung hin. 



  In vivo-Verfahren : Die Identifierung derartige Proteine in vivo kann beispielsweise darüber erfolgen, dass eine Zelllinie, die das Akzeptor-markierte Ubiquitinverwandte Protein und das Donor-markierte Zielprotein simultan stabil oder transient exprimiert, mit cDNAs   transfiziert    wird, die zur Expression unbekannter Proteine führen. Die Abnahme oder Verstärkung des (steady state) FRET-Signals deuten auf einen Einfluss des zu testenden Proteins auf die Modifizierung hin.



  6. Identifizierung von niedermolekularen Substanzen, die die Modifizierung eines bekannten Zielproteins beeinflussen Die in Beispiel 5 beschriebenen in vivo-und in vitro-Testverfahren können gleichermassen zur systematischen Identifizierung von Substanzen benutzt werden, die die Modifizierung eines definierten Ubiquitin-verwandten Proteins mit einem definierten Zielprotein inhibieren oder aktivieren.



  In vitro-Verfahren : Dies kann beispielsweise derart erfolgen, dass alle für die in vitro-Modifizierung bereitzustellenden Bestandteile einschliesslich des Akzeptormarkierten Ubiquitin-verwandten Proteins und des entsprechenden Donormarkierten Zielproteins in Mikrotiterplatten vorgelegt werden, und unbekannte Substanzen, z. B. aus einer sog. kombinatorischen"Small Molecule Library", im HTS-Verfahren für einen Effekt auf die Reaktionskinetik getestet werden.



  In vivo-Verfahren : Die Identifizierung derartiger Substanzen in vivo kann z. B. darüber erfolgen, dass eine Zelllinie, die das Akzeptor-markierte Ubiquitinverwandte Protein und das Donor-markierte Zielprotein simultan stabil oder transient exprimiert, mit diesen Substanzen inkubiert wird. Die Abnahme oder Verstärkung des FRET-Signals deutet auf einen Einfluss der zu testenden Substanz auf die Modifizierung hin. 



  7. Analyse und/oder Identifizierung von Mutanten Die vorstehend beschriebenen in vivo-und in vitro-Testverfahren können gleichermassen zur Analyse und/oder Identifizierung von Mutanten von bekannten Ubiquitin-verwandten Proteinen, bekannten Zielproteinen, und/oder den modifi  zierenden/demodifizierenden    Enzymen verwendet werden.



  8. Verwendung der Testverfahren in der Diagnostik Varianten der oben beschriebenen Testverfahren können in der Diagnostik verwendet werden. Dies ist z.   B.    dann wünschenswert, wenn Defekte in der Modifizierung eines bestimmten (Ziel-) Proteins zu bestimmten Krankheitsbildern beitragen bzw. mit bestimmten Krankheiten und/oder Störungen assoziiert sind. Beispielsweise kann die Fähigkeit verschiedener Zellextrakte (z. B. hergestellt aus Gewebe oder aus Zellkulturen) zur Modifizierung eines bestimmten Zielproteins quantitativ ermittelt werden, indem das entsprechende Paar von FRET-Donorund FRET-Akzeptor-markierten Proteinen mit definierten Mengen eines zu testenden Extraktes inkubiert und das Auftreten des FRET-Signals zeitabhängig ermittelt wird.



  9. Identifizierung von Zielproteinen für die Modifizierung mit Ubiquitin verwandten Proteinen Die hierin beschriebenen in vivo-und in vitro-Testverfahren können zur systematischen Identifizierung von neuen Zielproteinen für die Modifizierung von Ubiquitin-verwandten Proteinen verwendet werden, indem statt eines bekannten Ziel protein zu testende unbekannte und/oder unidentifizierte Donor-Chromophormarkierte Proteine, z. B. aus einer Expressionsbank oder einer kombinatorischen Bank, in Kombination mit dem Akzeptor-Chromophor-markierten Ubiquitinverwandten Protein eingesetzt werden.



  Identifizierung mittels in vitro-Verfahren : Dies kann z. B. erfolgen, dass alle für die in vitro-Modifizierung bereitzustellenden Bestandteile einschliesslich eines YFPmarkierten Ubiquitin-verwandten Proteins in Mikrotiterplatten vorgelegt werden, und unbekannte rekombinante CFP-Fusionsproteine dazugegeben werden. FRET Signale sollten hier nur entstehen, wenn das unbekannte Protein kovalent mit dem   YFF-markierten    Ubiquitin-verwandten Protein verknüpft wird (hier entsteht FRET nur in Abhängigkeit von Energie-und Enzymzugabe) oder nicht kovalent (Energie-und Enzym unabhängig) mit ihm interagiert. Unbekannte rekombinante CFP-Fusionsproteine können beispielsweise aus Expressionsbanken in HTS Verfahren gewonnen werden (z. B. bei Verwendung von N-terminalen His-tags an den Fusionsproteinen).



  Identifizierung mittels in vivo-Verfahren : Beispielsweise kann dies dadurch erfolgen, dass Zellen, die das YFP-Ubiquitin-verwandte Protein stabil oder transient exprimieren, mit cDNAs transfiziert werden, die zur Expression unbekannter Proteine in Fusion mit CFP führen. Die Analyse erfolgt dann z. B. in Mikrotiterplatten-Fluoreszenzmessgeräten und/oder mit Fluoreszenzmikroskopen, die mit den entsprechenden FRET-Filtern ausgerüstet sind. Das Auftreten von FRET Signalen deutet auf die Verknüpfung des unbekannten Proteins mit dem bekannten Ubiquitin-verwandten Protein hin. Dies kann zusätzlich durch entsprechende Kontrollen unabhängig verifiziert werden (z. B. Mobilitätsänderung im SDS-Gel und Verwendung von mutanten Proteinen, die nicht mehr verknüpft werden können).

   Für die in vivo-Modifizierung kommen alle Zellen in Frage, die die für die Verknüpfung geeigneten Enzyme enthalten (endogen oder aufgrund von Manipulationen). Eine Ubiquitinierung oder eine Modifizierung mit SUMO und seinen  Homologen kann daher beispielsweise sowohl in etablierten Kulturen von Säugerzellen auch auch in der Bäcker-oder Spalthefe untersucht werden.



  Zitierte Dokumente : Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D. Seidman, J. G., Smith, J. A. und Struhl, K. (vierteljährliche Aktualisierung) Current Protocols in Molecular Biology. Verlag John Wiley  &  Sons.



  Boisclair, M. D., C.   McClure,    S. Josiah, S. Glass, S.   Bottomley,    S. Kamerkar, und   I.    Hemmila. 2000. Development of a ubiquitin transfer assay for high throughput screening by fluorescence resonance energy transfer.   JBiomol Screen.    5 : 319-328.



  Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C., Lehrach, H., und G. Walter. 2000. A Human   cDNA    Library for High-Throughput Protein Expression Screening. Geno  mics 65,    1-8.



  Bonifacino, J. S., und A. M. Weissman. 1998. Ubiquitin and the control of protein fate in the   secretory    and   endocytic    pathways   (Review).    Annu Rev Cell Dev Biol.



  14 : 19-57.



  Buschmann, T., S. Y. Fuchs,   C.    C. Lee, Z. Q. Pan, und Z. Ronai. 2000. SUMO-1 modification of Mdm2 prevents its   self-ubiquitination    and increases Mdm2 ability to ubiquitinate p53. Cell.   101    : 753-762.



  Coligan ; J. E, Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W. und Wingfield, P. T.



  (vierteljährliche Aktualisierung) Current Protocols in Protein Science. Verlag John Wiley  &  Sons. 



  Chung, C. H., und S. H. Baek. 1999. Deubiquitinating enzymes : their diversity and emerging roles. Biochem Biophys Res Commun. 266 :   633-640.   



  Deng, L., C. Wang, E. Spencer, L. Yang, A. Braun, J. You, C. Slaughter, C. Pickart, und Z. J. Chen. 2000. Activation of the IkappaB kinase complex by TRAF6 requires a dimeric ubiquitin-conjugating enzyme complex and a unique polyubiquitin chain. Cell. 103 :   351-361.   



  Hershko, A., und A. Ciechanover. 1998. The ubiquitin system (Review). Annu Rev Biochem. 67 : 425-479.



  Hochstrasser, M. 1998. There's the rub : a novel ubiquitin-like modification linked to cell cycle regulation.   Genes Dev.    12 : 901-907.



  Jentsch, S., und G. Pyrowolakis. 2000. Ubiquitin and its kin : how close are the family ties ? Trends Cell Biol. 10 :   335-342.   



  Kaiser, P., K. Flick, C. Wittenberg, und S.   I.    Reed. 2000. Regulation of transcription by ubiquitination without proteolysis : Cdc34/SCF (Met30)-mediated inactivation of the transcription factor Met4. Cell. 102 : 303-314.



  Li SJ und M. Hochstrasser. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature 1999,398 : 246-51.



  Mahajan, R., C. Delphin, T. Guan, L. Gerace, und F. Melchior. 1997. A small ubiquitin-related polypeptide involved in targeting   RanGAPI    to nuclear pore   complex protein RanBP2. Cell.    88 : 97-107. 



  Mahajan, R., L. Gerace, und F. Melchior. 1998. Molecular characterization of the   SUMO-1    modification   of RanGAPl    and its role in nuclear envelope association. J Cell Biol. 140 : 259-270.



  Matunis, M. J., E. Coutavas, und G. Blobel. 1996. A novel ubiquitin-like modification modulates the partitioning of the Ran-GTPase-activating protein   RanGAPI    between the cytosol and the nuclear pore complex.   J Cell Biol. 135    : 1457-1470.



  Melchior, F. 2000. SUMO-nonclassical ubiquitin. Annu Rev Cell Genet Biol.



  16 : 591-626.



  Myers, R. A. (Hrsg.), Encyclopedia of Molecular Biology and Molecular Medicine, z. B. Band 4,90-100, und Band 5,516-524, VCH Verlag, 1997.



  Pagano, M. 1997. Cell cycle regulation by the ubiquitin pathway (Review). Faseb   J.    11 : 1067-1075.



  Periasamy, A., und R. N. Day. 1999. Visualizing protein interactions in living cells using digitized GFP imaging and FRET microscopy. Methods Cell Biol. 58 : 293314.



  Pollok, B. A., und R. Heim. 1999. Using GFP in FRET-based applications. Trends Cell Biol. 9 : 57-60.



  Sambrook, J. und Russell, D. 2001. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 3.



  Auflage. Cold Spring Harbour Press.



  Schwartz, A. L., und A. Ciechanover. 1999. The ubiquitin-proteasome pathway and pathogenesis of human diseases (Review). Annu Rev Med. 50 : 57-74. 



  Sucker, H. et al. (Hrsg.) Pharmazeutische Technologie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 2. Auflage, 1991.



  Tsien, R. Y. 1998. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67 : 509-544.



  Vu, P. K. und Sakamoto K. M. (2000) Ubiquitin-Mediated Proteolysis and Human Disease. Moecular Genetics and Metabolism 71 : 261-266 Wilkinson, K. D. 1997. Regulation of ubiquitin-dependent processes by deubiquitinating enzymes (Review). Faseb J. 11 :   1245-1256.   



  Yeh, E. T., L. Gong, und T. Kamitani. 2000. Ubiquitin-like proteins : new wines in new bottles. Gene. 248 : 1-14.



  US 5,726,025 (Kirschner M. W. et al.), veröffentlicht am 10.03.1998.



  US 5,981,200 (Tsien, R. Y. et al.), veröffentlicht am 09.11.1999.



  US 5,998,204 (Tsien, R. Y. und Miyawaki, A.), veröffentlicht am 07.12.1999.



  WO 00/43780 (Bastiaens, P. I. H. und Parker, P. J. J.), veröffentlicht am 27.07.2000.

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Analyse von Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin verwandten Proteinen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) mindestens ein Zielpro tein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kovalent ver knüpft ist, (ii) mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent ver knüpft ist, (iii) Enzyme, die die Bildung einer Isopeptidbindung zwi schen dem mindestens einem Zielprotein und dem mindestens einem Ubiquitin-verwandten Protein bewirken ;

(iv) ATP und/oder ein ATP Derivat, und in Kontakt bringen der Bestandteile (i)- (iv) unter Bedin gungen, die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gebildetem Konjugat aus Zielprotein und U biquitin-verwandtem Protein durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor Paares.

2. Verfahren zur Analyse von Demodifizierungen von Proteinen, die mit U biquitin-verwandten Proteinen verknüpft sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) ein Isopeptidase Substrat, das ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluoescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und mindestens ein Ubiquitin verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, umfasst ; wobei diese durch ei ne Isopeptidbindung zwischen der s-Aminogruppe eines Lysins des Zielproteins und der C-terminalen Carboxygruppe des mindestens ei nen Ubiquitin-verwandten Proteins miteinander verknüpft sind ; und (ii) mindestens ein Enzym, das die Spaltung der Isopeptidbindung des Isopeptidase-Substrats bewirkt ;

und Inkontaktbringen der Bestandteile (i) und (ii) unter Bedingungen, die den Ablauf der enzymatischen Re aktion erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gespaltenem Isopeptidase-Substrat durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chro mophor des Donor-Akzeptor-Paares.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das erste Chromophor ein erstes fluoreszierendes Protein und das zweite Chromophor ein zweites fluores zierendes Protein ist, insbesondere wobei das erste Chromophor der FRET-Donor CFP (Cyan Fluorescent Protein) und das zweite Chromophor der FRET-Akzeptor YFP (Yellow Fluorescent Protein) ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Zielprotein und/oder das Ubiquitin-verwandte Protein in Form eines Fusionsproteins mit einem fluoreszierenden Protein verwendet werden.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das mindes tens eine Zielprotein RanGAPI und das mindestens eine Ubiquitin verwandte Protein SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier) ist, insbe sondere SUMO1, SUM02 und/oder SUM03.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei RanGAPl und CFP in Form eines Fusionsproteins verwendet werden, insbesondere wobei die C-terminale Domäne von RanGAPI mit dem N-oder C terminalen Ende von CFP fusioniert ist.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei SUMO und YFP in Form eines Fusionsproteins verwendet werden, insbesondere wo bei die Aminosäuren 1-91 von SUMO1, die Aminosäuren 1-92 von SU M02 oder die Aminosäuren 1-93 von SUM03 mit dem C-terminalen Ende von YFP fusioniert sind.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Zielpro tein, das Ubiquitin-verwandte Protein und/oder die Enzyme in Form eines gereinigten Proteins und/oder eines Zellextrakts, insbesondere eines Ex trakts aus Säuger-, Insekten-, Hefe-und/oder Bakterien-Zellen, verwendet werden.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Derivat des Zielproteins, des Ubiquitin-verwandten Proteins und/oder der Enzyme verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3-9, wobei die Enzyme gemäss Schritt (a) (iii) von Anspruch 1 die E1-und E2-Enzyme sind, wahlweise in Kombination mit mindestens einem E3-Enzym, insbesondere wobei das El-Enzym das Aosl/Uba2-Heterodimer und das E2-Enzym Ubc9 ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-9, wobei das mindestens eine Enzym gemäss Schritt (a) von Anspruch 2 eine Isopeptidase ist (was ist mit C-terminalen Hydrolasen), insbesondere Ulpl, Ulp2, SUSP1 und/oder Senpl.

12. Verfahren zum Bestimmen von Stoffen, die die Modifizierung eines Ziel proteins mit Ubiquitin-verwandten Proteinen beinflussen, wobei das Ver fahren die folgenden Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) mindestens ein Zielpro tein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kovalent ver knüpft ist, (ii) mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent ver knüpft ist, (iii) Enzyme, die die Bildung einer Isopeptidbindung zwi schen dem mindestens einem Zielprotein und dem mindestens einem Ubiquitin-verwandten Protein bewirken, (iv) ATP und/oder ein ATP Derivat, und (v) mindestens einen zu testenden Stoff ;

und in Kontakt bringen der Bestandteile (i)- (v) unter Bedingungen, die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlauben ; und (b) Nachweisen der Bildung von Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin verwandtem Protein und/oder Bestimmen der Menge an gebildetem Konjugat durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Enzyme gemäss Schritt (a) (iii) von die EI-und E2-Enzyme sind, wahlweise in Kombination mit mindestens einem E3-Enzym, insbesondere wobei das El-Enzym das Aosl/Uba2 Heterodimer und das E2-Enzym Ubc9 ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei der mindestens eine zu tes tende Stoff ein Protein, insbesondere eine E3-Ligase, Isopeptidase, Kinase oder Phosphatase, oder Derivat hiervon ist oder eine niedermolekulare Substanz, insbesondere ein Inhibitor oder Aktivator.

15. Verfahren zum Bestimmen von Stoffen, die die Demodifizierung eines Proteins, das mit mindestens einem Ubiquitin-verwandten Protein ver knüpft ist, beeinflussen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte um fasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) ein Isopeptidase Substrat, das ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und mindestens ein Ubiquitin verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, umfasst ; wobei diese durch ei ne Isopeptidbindung zwischen der s-Aminogruppe eines Lysins des Zielproteins und der C-terminalen Carboxygruppe des mindestens ei nen Ubiquitin-verwandten Proteins miteinander verknüpft sind ;

(ii) mindestens ein Enzym, das die Spaltung der Isopeptidbindung des Iso peptid-Substrats bewirkt ; und (iii) mindestens einen zu testenden Stoff ; und in Kontakt bringen der Bestandteile (i)- (iii) unter Bedingungen, die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gespaltenem Isopeptidase-Substrat durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chro mophor des Donor-Akzeptor-Paares.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das mindestens eine Enzym gemäss Schritt (a) eine Isopeptidase ist, inbesondere Ulpl, Ulp2, SUSP1 und/oder Senpl.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der mindestens eine zu tes tende Stoff ein Protein, insbesondere ein Bindungspartner für das Zielpro tein, eine Kinase oder Phosphatase, oder Derivat hiervon ist oder eine nie dermolekulare Substanz, insbesondere ein Inhibitor oder Aktivator.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-17, wobei das Protein oder De rivat hiervon und/oder die niedermolekulare Substanz aus einer Expressi onsbank oder einer kombinatorischen Bank, insbesondere einer kombina torischen Peptid-, non-Peptid-oder small Molecule-Bank, oder aus einem Zellextrakt stammt und/oder in gereinigter Form vorliegt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-18, wobei das erste Chromophor ein erstes fluoreszierendes Protein und das zweite Chromophor ein zweites fluoreszierendes Protein ist, insbesondere wobei das erste Chromophor der FRET-Donor CFP (Cyan Fluorescent Protein) und das zweite Chromophor der FRET-Akzeptor YFP (Yellow Fluorescent Protein) ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-19, wobei das Zielprotein und/oder das Ubiquitin-verwandte Protein in Form eines Fusionsproteins mit einem fluoreszierenden Protein verwendet werden.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-20, wobei das mindestens eine Zielprotein RanGAPI und das mindestens eine Ubiquitin-verwandte Pro tein SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier) ist, insbesondere SUMO1, SUM02 und/oder SUM03.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-21, wobei RanGAPl und CFP in Form eines Fusionsproteins verwendet werden, insbesondere wobei die C-terminale Domäne von RanGAPl mit dem N-oder C-terminalen Ende von CFP fusioniert ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-22, wobei SUMO und YFP in Form eines Fusionsproteins verwendet werden, insbesondere wobei die Aminosäuren 1-91 von SUM01, die Aminosäuren 1-92 von SUMO2 oder die Aminosäuren 1-93 von SUM03 mit dem C-terminalen Ende von YFP fusioniert sind.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-23, wobei das Zielprotein, das Ubiquitin-verwandte Protein und/oder die Enzyme in Form eines gerei nigten Proteins oder eines Zellextrakts, insbesondere eines Extrakts aus Säuger-, Insekten-, Hefe-und/oder Bakterien-Zellen, verwendet werden.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-24, wobei der zu testende Stoff in einem weiteren Schritt durch geeignete Verfahren, insbesondere mole kularbiologische, biochemische und/oder biophysikalische Verfahren, i dentifiziert wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-25, wobei ein Derivat des Ziel proteins, des Ubiquitin-verwandten Proteins und/oder der Enzyme ver wendet wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-14, und 18-26, wobei das in Kontakt bringen der Bestandteile (i)- (iv) in einer Zelle ausserhalb des menschlichen oder tierischen Körpers bewirkt wird, insbesondere in einer Säuger-oder Hefezelle ; insbesondere wobei das Fusionsprotein aus Ziel protein und dem ersten fluoreszierenden Protein und/oder das Fusionspro tein aus dem Ubiquitin-verwandtem Protein und dem zweiten fluoreszie rendem Protein in der Zelle exprimiert wird.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei der mindestens eine zu testende Stoff in der Zelle exprimiert wird, vorzugsweise indem die Zelle mit einer für diesen Stoff kodierenden cDNA transfiziert wird, und/oder wobei die Zelle mit dem mindestens einem zu testenden Stoff inkubiert wird.

29. Verfahren zum Nachweis eines Defekts in der Modifizierung von Protei nen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen, wobei das Verfahren die folgen den Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) mindestens ein Zielpro tein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kovalent ver knüpft ist, und (ii) mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist ; (iii) mindestens einen zu testenden Zellextrakt ; und in Kontakt bringen der Bestandteile (i)- (iii) unter Bedingungen, die die Bildung von Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gebildetem Konjugat durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor Akzeptor-Paares.

30. Verfahren zum Nachweis eines Defekts in der Demodifizierung von Pro teinen, die mit Ubiquitin-verwandten Proteinen verknüpft sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) ein Isopeptidase Substrat, das ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und mindestens ein Ubiquitin verwandtes Protein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, umfasst ; wobei diese durch ei ne Isopeptidbindung zwischen der s-Aminogruppe eines Lysins des Zielproteins und der C-terminalen Carboxygruppe des mindestens ei nen Ubiquitin-verwandten Proteins miteinander verknüpft sind ; und (ii) mindestens einen zu testenden Zellextrakt ;

und in Kontakt bringen der Bestandteile (i)- (ii) unter Bedingungen, die die Spaltung von Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin-verwandtem Protein erlauben ; und (b) Bestimmen der Menge an gespaltenem Konjugat durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares.

31. Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei der Zellextrakt aus Zellen von Gewebe eines zu untersuchenden Individuums und/oder aus Zellen aus Zellkultur stammt.

32. Verfahren zur Identifizierung von Zielproteinen für die Modifizierung mit Ubiquitin-verwandten Proteinen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst : (a) Bereitstellen eines Testsystems, umfassend (i) mindestens ein zu tes tendes Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, (ii) mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Pro tein, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, (iii) Enzyme, die die Bildung einer Isopeptid bindung zwischen dem mindestens einem Zielprotein und dem min destens einem Ubiquitin-verwandten Protein bewirken ;

(iv) ATP und/oder ein ATP-Derivat ; und in Kontakt bringen der Bestandteile (i) - (iv) unter Bedingungen, die den Ablauf der enzymatischen Reaktion erlauben ; und (b) Nachweisen der Bildung von Konjugat aus Zielprotein und Ubiquitin verwandtem Protein und/oder Bestimmen der Menge an gebildetem Konjugat durch Bestimmen von FRET zwischen dem erstem und dem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das in Kontakt bringen der Bestand teile (i)- (iv) in einer Zelle ausserhalb des menschlichen oder tierischen Körpers bewirkt wird, insbesondere in einer Säuger-oder Hefezelle.

34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, wobei das mindestens eine zu tes tende Zielprotein in Form eines Fusionsproteins mit einem erstem fluores zierenden Protein, vorzugsweise als Fusionsprotein mit dem FRET-Donor CFP, verwendet wird.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei das mindestens eine Fusionsprotein aus einer Expressionsbank stammt, insbesondere wobei eine für das Fusi onsprotein kodierende cDNA in eine Zelle eingebracht und darin expri miert wird.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 32-35, wobei das zweite Chro mophor ein zweites fluoreszierendes Protein, vorzugsweise der FRET Akzeptor YFP ist ; insbesondere wobei das mindestens eine Ubiquitin verwandte Protein in Form eines Fusionsproteins mit dem zweiten fluores zierenden Protein in einer Zelle exprimiert wird.

37. Verfahren nach einem der Ansprüche 32-36, wobei das mindestens eine Ubiquitin-verwandte Protein SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier) ist, insbesondere SUMO1, SUM02 und/oder SUM03.

38. Verfahren nach Anspruche 37, wobei ein Fusionsprotein umfassend SU MO und YFP verwendet wird, insbesondere wobei die Aminosäuren 1-91 von SUMO1, die Aminosäuren 1-92 von SUM02 oder die Aminosäuren 1-93 von SUM03 mit dem C-terminalen Ende von YFP fusioniert sind.

39. Verfahren nach einem der Ansprüche 32-38, wobei die Enzyme gemäss Schritt (a) (iii) von Anspruch 24 die EI-und E2-Enzyme, wahlweise in Kombination mit mindestens einem E3-Enzym, sind, insbesondere wobei das EI-Enzym das Aosl/Uba2-Heterodimer und das E2-Enzym Ubc9 ist.

40. Verfahren nach einem der Ansprüche 32-39, wobei das Zielprotein, das Ubiquitin-verwandte Protein und/oder die Enzyme in Form eines gerei nigten Proteins oder eines Zellextrakts, insbesondere eines Extrakts aus Säuger-, Insekten-, Hefe-und/oder Bakterien-Zellen, verwendet werden.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 32-40, wobei es sich bei dem min destens einen zu testenden Zielprotein um eine Derivat eines bekannten Zielproteins handelt, und/oder wobei ein Derivat des Ubiquitin verwandten Proteins und/oder der Enzyme verwendet wird.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 32-41, wobei das Zielprotein in einem weiteren Schritt durch geeignete Verfahren, insbesondere moleku larbiologische, biochemische und/oder biophysikalische Verfahren, identi fiziert wird.

43. Kit zum Nachweis von Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin verwandten Proteinen, umfassend : (i) mindestens ein Zielprotein und/oder Derivat hiervon, das mit ei nem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und/oder eine hierfür kodierende Nukleinsäure ; und (ii) mindestens ein Ubiquitin-verwandtes Protein und/oder Derivat hiervon, das mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor Paares kovalent verknüpft ist, und/oder eine hierfür kodierende Nukleinsäure ; sowie wahlweise (iii) Enzyme, die die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem mindestens einem Zielprotein und dem mindestens einem Ubiqui tin-verwandten Protein bewirken ; und/oder mindestens eine hierfür kodierende Nukleinsäure ; und/oder (iv) ATP und/oder einem ATP-Derivat.

44. Fusionsprotein, das SUMO und ein fluoreszierendes Protein, vorzugsweise YFP, umfasst, insbesondere wobei die Aminosäuren 1-91 von SUMO1, die Aminosäuren 1-92 von SUM02 oder die Aminosäuren 1-93 von SUM03 mit dem C-terminalen Ende von YFP fusioniert sind ; oder eine hierfür ko dierende Nukleinsäure.

45. Fusionsprotein, das RanGAPI und ein fluoreszierendes Protein, vorzugs weise CFP, umfasst, insbesondere wobei die C-terminale Domäne von RanGAPI mit dem N-oder C-terminalen Ende von CFP fusioniert sind ; oder eine hierfür kodierende Nukleinsäure.

46. Zelle, insbesondere eine Säugerzelle ausserhalb des menschlichen oder tierischen Körpers oder eine Hefezelle, die ein Fusionsprotein gemäss An spruch 44 und/oder 45 exprimiert.

47. Isopeptidase-Substrat, umfassend ein Zielprotein, das mit einem ersten Chromophor eines Donor-Akzeptor-Paares für FRET (Fluorescence Reso nance Energy Transfer) kovalent verknüpft ist, und ein Ubiquitin verwandtes Protein, das das Zielprotein modifiziert und mit einem zweiten Chromophor des Donor-Akzeptor-Paares kovalent verknüpft ist, wobei das Zielprotein und das Ubiquitin-verwandte Protein über mindestens eine I sopeptidbindung verknüpft sind.

48. Isopeptidase-Substrat nach Anspruch 47, wobei die mindestens eine Iso peptidbindung zwischen mindestens einer s-Aminogruppe eines Lysins des Zielproteins und der C-terminalen Carboxygruppe des Ubiquitin verwandten Proteins besteht, inbesondere wobei das Isopeptidase-Substrat ein Derivat des Zielproteins und/oder des Ubiquitin-verwandten Proteins umfasst.

49. Isopeptidase-Substrat nach Anspruch 47 oder 48, wobei das Ubiquitin verwandte Protein SUMO ist, insbesondere SUMO1, SUM02 oder SU M03.

50. Isopeptidase-Substrat nach Anspruch 49, wobei das Zielprotein für SUMO RanGAPl, RanBP2, PML, SplO0, IKBa, D. melanogaster Dorsal, p53, c Jun, HIPK2, S. cerevisiae Cdc3, S. cerevisiae Cdcll, S. cerevisiae Sep7/Shsl, hCMV IE1, hCMV IE2, D. melanogaster Tramtrack, Topoi somerase I, Glutl, Glut4 oder Mdm2 ist.

51. Isopeptidase-Substrat nach einem der Ansprüche 47-50, wobei das erste Chromophor ein erstes fluoreszierendes Protein und das zweite Chro mophor ein zweites fluoreszierendes Protein ist, insbesondere wobei das erste Chromophor der FRET-Donor CFP (Cyan Fluorescent Protein) und das zweite Chromophor der FRET-Akzeptor YFP (Yellow Fluorescent Protein) ist ; insbesondere wobei das Zielprotein und/oder das Ubiquitin verwandte Protein in Form eines Fusionsproteins mit einem fluoreszieren den Protein, besonders bevorzugt in Form von CFP-RanGAPI und/oder YFP-SUMO, verwendet werden.

52. Verwendung eines Kits gemäss Anspruch 43, eines Fusionsproteins gemäss Anspruch 44 und/oder 45, und/oder einer Zelle gemäss Anspruch 46 zur A nalyse von Modifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen, zum Bestimmen von Stoffen, die Modifizierung eines Zielpro teins mit Ubiquitin-verwandten Proteinen beeinflussen, zur Identifizierung von Zielproteinen für die Modifizierung mit Ubiquitin-verwandten Protei nen und/oder zur Diagnose, insbesondere zum Nachweis eines Defekts in der Modifizierung von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen.

53. Verwendung eines Isopeptidase-Substrats nach einem der Ansprüche 47 51 zur Analyse von Demodifizierungen von Proteinen mit Ubiquitin verwandten Proteinen, zum Bestimmen von Stoffen, die Demodifizierung eines Zielproteins mit Ubiquitin-verwandten Proteinen beeinflussen, und/oder zur Diagnose, insbesondere zum Nachweis eines Defekts in der Demodifizierung von Proteinen mit Ubiquitin-verwandten Proteinen.

54. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Verfahren nach einem der Ansprüche 12-28, und das Vermischen des getesteten und/oder identifizierten Stoffs mit einem phar mazeutisch verträglichen Träger.

55. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Verfahren nach einem der Ansprüche 32-42, und das Vermischen des identifizierten Zielproteins oder eines Derivats hiervon mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.