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WO2002057462A1 - Vecteur pour l'introduction de molecules dans les cellules eucaryotes et molecules vectorisees par un tel vecteur - Google Patents

Vecteur pour l'introduction de molecules dans les cellules eucaryotes et molecules vectorisees par un tel vecteur Download PDF

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WO2002057462A1
WO2002057462A1 PCT/FR2002/000217 FR0200217W WO02057462A1 WO 2002057462 A1 WO2002057462 A1 WO 2002057462A1 FR 0200217 W FR0200217 W FR 0200217W WO 02057462 A1 WO02057462 A1 WO 02057462A1
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WO
WIPO (PCT)
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molecule
module
vector
peptide
vector according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/000217
Other languages
English (en)
Inventor
Denis Michel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Rennes 1
Original Assignee
Universite de Rennes 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Rennes 1 filed Critical Universite de Rennes 1
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Priority to US10/466,591 priority patent/US20040152195A1/en
Priority to CA002435094A priority patent/CA2435094A1/fr
Priority to EP02712014A priority patent/EP1352071A1/fr
Priority to JP2002558514A priority patent/JP2004522439A/ja
Publication of WO2002057462A1 publication Critical patent/WO2002057462A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
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    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Definitions

  • the invention relates to the field of biochemistry, cell biology and medicine. More specifically, the invention relates to a molecular tool, hereinafter called
  • vector intended to be used for the introduction of all types of molecules into eukaryotic cells.
  • the invention particularly finds its application for the intracellular incorporation of amino acids, or peptides of any size and sequence (dipeptides, tripeptides, polypeptides, proteins, etc.), which can be chemically modified.
  • the invention also relates to any molecule vectorized by such a vector.
  • vectorized molecule are understood to refer to the assembly constituted by the vector fused with the molecule to be transported in the cell.
  • the supply of molecules into eukaryotic cells can be carried out by fusing the molecule to be transported with cellular incorporation modules ("cell-permeable modules” CPM), such as membrane translocation polypeptides, capable of cross cell membranes and gain direct access to the cytoplasmic compartment of cells.
  • CPM cellular incorporation modules
  • membrane translocation polypeptides capable of cross cell membranes and gain direct access to the cytoplasmic compartment of cells.
  • CPMs are already known and used to introduce peptides and proteins, which do not spontaneously cross the membranes of eukaryotic cells.
  • CPMs can correspond to natural protein domains (Schwarze et al. 2000. Trends Cell Biol. 10, 290-295, Fujihara and Nadler 1999. EMBO J. 18, 411-419) or to peptides of artificial sequences ( Futaki et al. 2000. J. Biol. Chem. 276, 5836-5840; Ho et al. 2001. Cancer Res. 61, 474-477).
  • MDR drug resistance system
  • the main application of this prior art is the introduction of proteins or peptides into cells, by means of CPM consisting of translocation peptides.
  • the proteins or peptides (X) to be introduced into the cells are prepared in fusion with the CPMs via a peptide bond, in the form of recombinant CPM-X proteins.
  • These proteins are produced in appropriate expression systems, for example in bacteria, or else synthesized using peptide synthesizers.
  • the recombinant proteins CPM-X are fully incorporated by these cells, and part X can exercise the biological activity for which it is designed (Schwarze et al. 2000. Trends Cell Biol. 10 , 290-295).
  • the fact that the CPM remains associated with the molecule X after cellular incorporation can also prevent the appropriate subcellular locahsation of X.
  • many translocation peptides currently known have tendencies to accumulate in certain subcellular compartments (linked nuclear localization to an activity "NLS", re secretion etc.), bringing with them the molecule X.
  • fusion with a vector can prevent the functioning of certain localization sequences which would have been provided for in the transported molecule X, such as for example a N-terminal mitochondrial addressing signal.
  • - CPMs can present, beyond a certain concentration, a certain degree of toxicity for cells and the organism, so as to limit their use in cell and medical biology.
  • the possible toxicity can come from the destabilizing properties of the membranes of certain translocation peptides, such as for example fragments of viral envelope proteins or bacterial toxins, or else from the presence of electrically charged domains such as for example the translocation peptides rich in basic amino acids, or polyhistidine sequences, labeling and affinity purification for metals.
  • the various modules of the vectorized molecule other than the transported molecule X may present risks of immunogenicity. Such limitations of the state of the art constitute the drawbacks thereof.
  • the objective of the present invention is to propose a technique for introducing molecules into eukaryotic cells, using CPMs but presenting new advantages compared to the techniques of the prior art.
  • an objective of the present invention is to propose a vector making it possible to transport into eukaryotic cells any type of molecule and in particular any type of peptide, including very short peptides such as simple amino acids, dipeptides or tripeptides, and peptides whose first amino acid is not methionine.
  • a vector for the introduction into a eukaryotic cell of a molecule (X) having at least one amino-terminal end characterized in that it is constituted by the association of a cellular incorporation module allowing the membrane translocation, and an ubiquitin or other related conjugable peptide module, said vector having a carboxy-terminal end intended to be fused by peptide reason at the amino-terminal end of said molecule ( X).
  • UBL ubiquitin or other related conjugable peptides
  • SUMO Small Ubiquitin-related MOdifier
  • UCRP Ubiquitin Cross-Reacting Protein
  • RUB Related to UBiquitin
  • UBL is ubiquitin.
  • UBLs are naturally synthesized in fusion with carboxyl terminal extensions, consisting of simple amino acids, polypeptides or proteins. There are cellular enzymatic activities capable of cleaving precisely between the UBL domains and their C-terminal extensions.
  • the present invention takes advantage of the natural existence of these enzymes in cells for a new and original objective: the intracellular cleavage of molecules pre-synthesized outside the cells, after incorporation by the cells.
  • the presence of a UBL module at the N-terminal part of the transported molecule X in fact allows the cleavage between UBL and X, and therefore the release of the molecule X from the rest of the vector.
  • the C-terminal cleavage of UBL is only conditioned by the recognition of the amino acid sequence of the UBL module, located exclusively on the NH2 side of the cleavage site, which makes it possible to introduce any sequence on the COOH side.
  • This property makes it possible to impose no condition or restriction as to the nature of the X peptides.
  • very short peptides such as dipeptides, can be as efficiently transported according to this invention.
  • this amino acid may be different from a methionine, which is not the case for peptides synthesized from transgenes, after transcription and intracellular translation.
  • modified or shortened versions of UBL is possible if their ability to induce cleavage at their C-terminal end is preserved.
  • Very many types of molecules can be vectorized by the vector according to the invention and in particular simple amino acids and peptides of any size, and independently of any constraint of composition and sequence.
  • the vector according to the invention also makes it possible to vectorize chemically modified peptides.
  • the vector according to the invention can also be used for the cellular incorporation of non-peptide molecules, such as for example oligonucleotides or hydrophilic chemical compounds which will have been grafted beforehand at the carboxy-terminal end of an oligopeptide. It will also be noted that it will be possible to chemically modify the vector molecules, provided that the peptide bond between the vector molecule and the vector remains accessible for C-terminal hydrolases from PUBL. For example, a C-terminal acylation of the molecule (X) will allow its intracellular membrane anchoring.
  • the vector according to the present invention also has advantages compared to the peptides simply associated with membrane translocation peptides as stated previously.
  • the present invention allows the intracellular release of the molecules (X) transported, in a form completely free of any fusion after cleavage between UBL and X.
  • the physical dissociation between molecule X and the rest of the vector according to the present invention has several advantages: a- The absence of functional interference between the vector and molecule X. If molecule X must ensure a biological function in cells, the efficiency of this function can be considerably reduced if the other modules of the vectorized molecule remain associated with it (CPM, UBL and others). By steric hindrance, these modules can hinder:
  • the intracellular release mechanism induced by the UBL module makes it possible to deliver peptides of any size, composition and sequence into cells, in particular having the desired amino- and carboxy-terminal regions, including having an amino acid amino-terminal other than methionine.
  • peptides synthesized in situ from transgenes are necessarily synthesized with an initiating methionine in the amino-terminal position, and that the transgenes do not lend themselves well to the synthesis of small proteins and peptides.
  • the intracellular dissociation between the molecule X and the vector modules makes it possible to introduce an additional device into this vectorization system: the subsequent destruction of all the modules of the vectorized molecule other than the transported molecule X ( CPM, UBL and others).
  • the scheduled destruction of these modules is the second objective of the present invention. In the simplest case where all of the vector components are peptide in nature, this objective is achieved by the introduction of a module into the vectorized molecule.
  • destabilization modules can be used for this system, in particular destruction boxes ("destruction boxes”) present in certain naturally unstable proteins such as, for example, swans (Glotzer et al.
  • the N-terminal destabilization module (DN, "Destabilizing N-end") is located at the amino-terminal end of the vectorized molecule.
  • N-terminal destabilization module The nature of this type of N-terminal destabilization module is based on the observation that the half-life of intracellular proteins is very precisely determined by the nature of the N-terminal sequences and mainly by the nature of the first N-terminal amino acid (Bachmair et al. 1986. Science 234, 179-186). We propose to exploit this natural activity of eukaryotic cells in a new and original way, to program the intracellular destruction of a protein pre-synthesized outside the cells, then incorporated by the cells.
  • DN destabilization signals only take effect in the intracellular context, and therefore in no way affect the stability of the recombinant protein in extracellular fluids. This point is demonstrated by the existence of many extracellular proteins which are naturally very stable although having a destabilizing amino acid at their amino-terminal end, exposed after the chvage of the signal peptide secretion.
  • A- By enzymatic cleavage of the recombinant protein by a protease: - Or a protease, the recognition site of which is located exclusively on the NH 2 side of the storage site (such as factor Xa for example), having provided a destabilizing residue just downstream from its cleavage site (FIG. 3 A).
  • This method is complex but offers the advantage of guaranteeing that the destruction of the vector module will only occur after the C-terminal chvage of UBL, and therefore after the release of the transported molecule X.
  • a destabilizing amino acid dictating a very short protein half-life such as arginine for example.
  • methods A, B and D are used.
  • method B the presence of internal methionines in the recombinant protein must first be avoided.
  • the methionine corresponding to the first amino acid of UBL is replaced by a leucine.
  • UBL module Several molecules are known that can be used in the context of the present invention to constitute the UBL module, such as ubiquitin, SUMO, NEDD-8, UCRP, RUB or others (see Jentsch and Pyrowolakis, 2000. Trends Coll Biol. 10, 335-342).
  • modified or shortened versions of UBL in the context of the present invention is also possible if their capacity to induce cleavage at their C-terminal end is preserved.
  • this module is ubiquitin.
  • Several methods are known that can be used to constitute the intracellular destabilization module of the vector.
  • this module consists of an amino-terminal destabilizing acid followed by a region comprising one or more lysine residues.
  • the amino-terminal amino acid destabilizer is glutamine.
  • said incorporation module is preferably a membrane translocation peptide such as a peptide derived from the TAT protein of the AIDS virus (HIV), of natural or modified sequence.
  • the invention also relates to any vectorized molecule, characterized in that it is constituted by the fusion of a molecule (X) having at least one amino-terminal end of which said amino-terminal end is fused by peptide bond at the end carboxy-terminal of the vector as described above.
  • said molecule (X) is an amino acid or a peptide, optionally chemically modified. According to another variant, said molecule (X) is a non-peptide molecule grafted to the carboxy-terminal end of an oligopeptide.
  • an N-terminal protein destabilization module can be added to the amino-terminal end of the vectorized protein.
  • the modules of the system are of a polypeptide nature
  • bacteria bacteria
  • eukaryotes for example bacculovirus
  • the use of a eukaryotic production system requires ensuring that it does not include the enzymatic activities leading to the C-terminal chvage of UBL. Eventually, these activities, if they exist, must be deactivated beforehand. These problems do not arise for bacterial systems, predominantly lacking these enzymatic activities.
  • said vectorized molecule also comprises at least one labeling module.
  • this labeling module is a polypeptide such as poly-histidine.
  • Such a labeling module could in particular be used to facilitate the purification of the vectorized polypeptide, for example by affinity for metals in the case of polyhistidine.
  • said vectorized molecule additionally comprises at least one cell addressing module. It is indeed often desirable to vectorize molecules only in certain specific cell types. Translocation peptides are already known to be preferentially incorporated by certain cell types (Fujihara and Nadler, 1999), but most of the translocation peptides appear to be effective in all tissues (Schwarze et al. 2000. Trends Cell Biol. 10 , 290-295). However, even in this case, addressing to certain defined cells can be specified for this vectorization system, by adding additional modules to the vectorized molecule. For example, it has been shown that the presence of a tripeptide RGD (Arginine - Glycine - Aspartate), allows preferential addressing of metastatic cancer cells, overexpressing ⁇ v / ⁇ 3 integrins.
  • RGD Arginine - Glycine - Aspartate
  • FIG. 1 shows a vector molecule according to the invention
  • FIG. 2 schematically shows the operation of the invention
  • FIG. 3 schematically represents methods A B, C and D to expose an amino acid particuher at the N-terminal end of the vectorized molecule (see above);
  • a vectorized molecule is constituted by the fusion, of NH2 into COOH, of an intracellular destabilization module 2, of a cellular incorporation module 3 which can for example be constituted by peptide derived from the protein TAT of the AIDS virus (HIV), of an ubiquitin module or other related conjugable peptide (UBL) 4 and of a molecule to be transported 5.
  • the vectorized molecule is cleaved between 4 and 5 by a specific hydrolase 6.
  • the molecule to be transported 5 can then exercise the biological activity for which it was designed. After release of the molecule to be transported 5, the rest of the vectorized molecule 2-3-4 is destroyed by an intracellular enzymatic system 7 recognizing the destabilization module 2.
  • the vectorized molecule 1 is introduced into the extracellular medium A. Thanks to the module of cellular incorporation module 2 which it contains, this molecule crosses the cell membrane C and is found in cytoplasm B. Thanks to a specific hydrolase 6, the peptide bond between molecule 5 and UBL 4 is broken and molecule 5 is released with its free amino-terminal end. This molecule can exert there the biological activity for which it was designed 8.
  • the future of the vector l ' constituted by the fusion of the modules 2,3,4, does not have any more influence on the function the transported molecule 5.
  • the presence of a destabilization module 2 induces the destruction of the vector l 'by intracellular machinery.
  • the invention offers a wide range of applications, from basic research to therapy. Since it does not impose any conditions on the nature of molecule X, it allows the introduction into polypeptides of both natural and artificial sequences. Natural sequence polypeptides can for example correspond to domains of existing proteins. Peptides of artificial sequences can be selected as specific ligands of known regulatory proteins, through screening strategies for random peptide banks, direct or reverse double hybrid, or even computer-aided modeling.
  • the UBL module provided in the vector can be used, in which case its C-terminal extension can be any.
  • the invention is also directly adaptable to the screening of random peptide banks, which offer billions of possible configurations.
  • a library can be constructed by directly using the vector described above, by inserting random nucleotide sequences 3 'to the region encoding the UBL.
  • the molecular tools defined in the present invention intracellular release of the transported molecule X and programmed destruction of the other modules of the molecule vectorized, are adaptable to already identified translocation modules or in future developments. They are also adaptable to the administration modalities which will be defined for the cellular incorporation modules.
  • the present invention is adaptable to the treatment of any type of pathology, from the moment when effective transported X molecules can be defined for these pathologies.
  • the present invention takes advantage of duly confirmed cellular activities in various fields of biology, so that its functionality is largely assured.
  • the functionalities of the present invention are set out below. Exposure of any amino acid after cleavage by factor Xa:
  • factor Xa The possibility of using factor Xa to expose the desired amino acid at the N-terminal end of a recombinant protein, is guaranteed by its specificity of chvage of this protease.
  • the cleavage of FXa is directed by the recognition of a sequence of four amino acids (preferably IEGR) entirely contained on the NH2 side of its cleavage site, which does not impose any condition on the nature of the next amino acid.
  • Factor Xa is commercially available and widely used. Release of the molecule transported X inside the eukaryotic cells:
  • intracellular ligases graft a destabilizing supernumerary amino acid (often arginine) to the N-terminal end of the proteins to be destroyed.
  • transmembrane transport properties are also duly confirmed for numerous translocation peptides according to the prior art.
  • plasmids have been manufactured for the production in bacteria of recombinant proteins according to the present invention. These plasmids are only nonlimiting examples of application of the present invention.
  • the plasmid described below allows the production in bacteria of a recombinant protein called "base”, comprising all the modules of the vector, but not of molecules transported X.
  • base a recombinant protein
  • the production of recombinant proteins for the transport of proteins or peptides X requires the insertion into this plasmid of the nucleotide sequence encoding these proteins or peptides, according to conventional techniques of nucleotide cloning.
  • the plasmid is made from the construction pQE-30 sold by the company QIAGEN for bacterial protein production.
  • the species of origin of the ubiquitin coding sequence can be freely chosen since it does not affect the derived amino acid sequence (ubiquitin is 100% conserved between vertebrates).
  • This plasmid makes it possible to produce in bacteria according to standard protocols, a basic protein, purified by affinity on Nickel.
  • the amino acid sequence of this protein is as follows, in letter code: l-MRGSHHHHHHGSKLIEGRQLGYGRKKRRQR-30 31-RRGGSASSHMQIFVKTLTGKTITLEVEPSD-60 61 -TIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLETLDHL 91-DHL 91-DHL
  • the recognition motif for factor Xa protease is ⁇ IEGR>.
  • the chvage site being located on the carboxy side of the residue R, the cleavage by factor Xa leads to exposing the amino acid glutamine ⁇ Q> at the end of the residual recombinant protein.
  • the destabilizing function of this amino acid can take effect due to the presence of lysine K residues nearby.
  • the translocation peptide is the TAT peptide derived from the HIN virus ⁇ YGRKKRRQRRR>
  • the UBL module is ubiquitin ⁇ MQIFVKTLTG KTITLEVEPS DTIE ⁇ VKAKI QDKEGIPPDQ QRLIFAGKQL EDGRTLSDY ⁇ IQKESTLHLV LRLRGG>
  • the transported molecule X is the dipeptide ⁇ AC>, without biological interest and intended to be replaced by additional peptides or proteins in peptides or proteins the plasmid.
  • the carboxy-terminal cysteine residue of this dipeptide is provided in the event that it is envisaged to graft on its thiol group, a non-peptide molecule according to claim 14. No other cysteine exists in the basic recombinant protein, so as to facilitate such a coupling reaction.
  • alanine ⁇ A> is a stabilizing amino acid.
  • the presence of a glutamine at the amino-terminal end will fix a half-life for the recombinant protein at approximately 10 minutes after its introduction into the cells, while the release of X is rehosed between 1 and 2 minutes after cellular incorporation.
  • a method for making a recombinant protein where the dipeptide AC is replaced by any peptide or protein is set out below.
  • the sequence encoding this peptide or protein is prepared in the form of double-stranded DNA having at the 5 ′ end of the coding region a cut with a blunt end, and on the 3 ′ side a cohesive end corresponding to one of the enzymes restriction present in the plasmid (in this case Kpn I, Sal I, or Pst I).
  • the plasmid is prepared by double cutting on the one hand with the enzyme Sfo I, and on the other hand with the enzyme whose cohesive end corresponds to that chosen for the insert.
  • the Sfo I double-stranded cleavage site is located precisely 3 'from the last codon of ubiquitin (marked v on the diagram below).
  • the following diagram represents the sequences encoding the COOH end of the basic protein:
  • the amino acids GG co-esponde at the COOH limit of ubiquitin.
  • Dipeptide AC is the C-terminal extension of ubiquitin in the base protein. * represents a "stop" codon (end of translation).
  • the following diagram shows the insertion of the sequence encoding any protein in C-terminal fusion with ubiquitin.
  • nucleotide sequence represented with "N" s
  • N the inserted nucleotide sequence
  • This ligation allows the production of proteins X in C-terminal fusion of ubiquitin, provided that care has been taken to preserve the translational reading phase between the coding sequence of ubiquitin and that of the C-terminal peptide.
  • the insert encoding molecule X may come from another plasmid, from a PCR reaction, or else from a nucleotide synthesis, in the case of peptides of reasonable size.
  • a variant construct was fabricated, where the wild-type TAT peptide is replaced by a modified version according to Ho et al. (2001. Cancer Res. 61, 474-477), the cell permeability properties of which are improved, and the amino acid sequence of which is YARAAARQARA.
  • This plasmid codes for the following protein: l-MRGSHHHHHHGSIEGRQKYARAAARQARAG-30 3 l-SASSHMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIEN-60 6 l-VEAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRT-90 91 -LSD YNIQKESTLHLV
  • Figure 5 To demonstrate intraceUular chvage of the recombinant protein at the C-terminal end of the ubiquitin module, thymocytes in primary culture were incubated or not with recombinant proteins TAT-Ubi- C-terminal extension coupled at FITC. Protein extracts were prepared from these cells, then subjected to a denaturing electrophoresis in polyaciylamide gel.
  • FITC recombinant protein
  • RP recombinant protein
  • C contaminating bacterial proteins
  • the recombinant protein is effectively incorporated by thymocytes - the recombinant protein is effectively cleaved at the C-terminal end of the ubiquitin domain.
  • the conjugation of ubiquitin on intracellular protein substrates requires that the authentic end of ubiquitin be exposed and stripped of its C-terminal extension.
  • Arginine-rich peptides An abundant source of membrane-permé peptides having potential as carriers for intraceUular protein delivery. J. Biol. Chem. 276, 5836-5840.

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Abstract

L'invention concerne un vecteur pour l'introduction d'une molécule (X) présentant au moins une extrémité amino-terminale dans une cellule eucaryote caractérisé en ce qu'il est constitué par l'association d'un module d'incorporation cellulaire permettant la translocation membranaire, et d'un module ubiquitine ou autre peptide conjugable apparenté, ledit vecteur présentant une extrémité carboxy-terminale destinée à être fusionnée par liaison peptidique à l'extrémité amino-terminale de ladite molécule (X) caractérisé en ce que ledit vecteur est rapidement détruit après séparation de ladite molécule (X). L'invention couvre également toute molécule vectorisée par un tel vecteur.

Description

VECTEUR POUR L ' INTRODUCTION DE MOLECULES DANS LES CELLULES EUCARYOTES ET MOLECULES VECTORISEES PAR UN TEL VECTEUR
L'invention concerne le domaine de la biochimie, de la biologie cellulaire et de la médecine. Plus précisément, l'invention concerne un outil moléculaire, ci-après dénommé
"vecteur", destiné à être utilisé pour l'introduction de tout type de molécules dans des cellules eucaryotes .
L'invention trouve tout particulièrement son application pour l'incorporation intracellulaire d'acides aminés, ou de peptides de tailles et de séquences quelconques (dipeptides, tripeptides, polypeptides, protéines ...), pouvant être modifiés chimiquement.
L'invention concerne également toute molécule vectorisée par un tel vecteur. On notera que l'on entend dans la présente description les termes "molécule vectorisée" comme visant l'ensemble constitué le vecteur fusionné avec la molécule à transporter dans la cellule. Selon l'ait antérieur, l'apport de molécules dans les cellules eucaryotes peut être effectué en fusionnant la molécule à transporter avec des modules d'incorporation cellulaire ("cell-permeable modules" CPM), comme des polypeptides de translocation membranaire, capables de traverser les membranes cellulaires et d'accéder directement au compartiment cytoplasmique des cellules.
Plusieurs CPM sont déjà connus et utilisés pour introduire des peptides et des protéines, qui ne traversent pas spontanément les membranes des cellules eucaryotes. Les CPM peuvent correspondre à des domaines de protéines naturelles (Schwarze et coll. 2000. Trends Cell Biol. 10, 290-295, Fujihara et Nadler 1999. EMBO J. 18, 411-419) ou bien à des peptides de séquences artificielles (Futaki et coll. 2000. J. Biol. Chem. 276, 5836-5840; Ho et coll. 2001. Cancer Res. 61, 474-477). Plusieurs propriétés de peptides de translocation décrites selon l'art antérieur, en font des outils prometteurs en biologie cellulaire et médicale, comme par exemple:
- un passage efficace à travers la barrière hémato-encéphalique(tight junctions), tout en préservant son intégrité.
- la capacité de contourner le système de résistance aux drogues (MDR), par lequel dés cellules tumorales deviennent résistantes à beaucoup d'agents anticancéreux.
- le passage direct dans le compartiment cytoplasmique, indépendant des phénomènes d'endocytose. Cette particularité, peu répandue parmi les autres modes de vectorisation non virale, permet une incorporation cellulaire efficace à basse température, et évite le problème de la sortie des endosomes vers le cytoplasme. - une vectorisation rapide dans toutes les régions de l'organisme peu de temps après l'injection intraveineuse, prévenant une présence prolongée dans le sang. - le couplage possible de ces peptides à des composés non peptidiques et à des acides nucléiques, qui sont hydrophiles et ne traversent pas spontanément les membranes cellulaires.
L'application principale de cet art antérieur est l'introduction de protéines ou de peptides dans les cellules, au moyen de CPM constitué de peptides de translocation. Selon cet art antérieur, les protéines ou peptides (X) à introduire dans les cellules sont préparés en fusion avec les CPM via une liaison peptidique, sous la forme de protéines recombinantes CPM-X. Ces protéines sont produites dans des systèmes d'expression appropriés, par exemple en bactéries, ou bien synthétisées à l'aide de synthétiseurs de peptides. Lorsqu'elles sont mises en contact avec les cellules, les protéines recombinantes CPM-X sont intégralement incorporées par ces cellules, et la partie X peut exercer une activité biologique pour laquelle elle est conçue (Schwarze et coll. 2000. Trends Cell Biol. 10, 290-295).
Les fusions simples CPM-X présentent plusieurs inconvénients :
- le fait que le CPM reste associé à la molécule X après incorporation cellulaire, peut empêcher le bon fonctionnement intracellulaire de la molécule transportée (X), en diminuant la spécificité et l'affinité d'interaction de X avec ses cibles intracellulaires, et en défavorisant son repliement tridimensionnel authentique. Ces interférences négatives sont particulièrement probables dans le cas ou X est de petite taille, tel qu'un peptide.
- le fait que le CPM reste associé à la molécule X après incorporation cellulaire peut aussi empêcher la locahsation subcellaire appropriée de X. Par exemple, beaucoup de peptides de translocation connus actuellement présentent des tendances à s'accumuler dans certains compartiments subcellulaires (localisation nucléaire liée à une activité "NLS", re sécrétion etc.), entraînant avec eux la molécule X. Inversement, la fusion avec un vecteur peut empêcher le fonctionnement de certaines séquences de localisation qui auraient été prévues dans la molécule transportée X, comme par exemple un signal N-terminal d'adressage mitochondrial.
- Les CPM peuvent présenter, au-delà d'une certaine concentration, un certain degré de toxicité pour les cellules et l'organisme, de nature à en limiter l'usage en biologie cellulaire et médicale. La toxicité possible peut provenir des propriétés déstabilisatrices des membranes de certains peptides de translocation, comme par exemple des fragments de protéines d'enveloppes virales ou de toxines bactériennes, ou bien de la présence de domaines chargés électriquement comme par exemple les peptides de translocation riches en acides aminés basiques, ou encore les séquences poly-histidines, d'étiquetage et de purification par affinité pour les métaux. Enfin, les différents modules de la molécule vectorisée autres que la molécule transportée X, peuvent présenter des risques d'immunogénicité. De telles limites de l'état de la technique en constituent les inconvénients. L'objectif de la présente invention est de proposer une technique d'introduction de molécules dans les cellules eucaryotes, utilisant des CPM mais présentant des avantages nouveaux par rapport aux techniques de l'art antérieur. Notamment, un objectif de la présente invention est de proposer un vecteur permettant d'acheminer dans les cellules eucaryotes tout type de molécule et en particulier tout type de peptide, y compris des peptides très courts tels que de simples acides aminés, des dipeptides ou des tripeptides, et des peptides dont le premier acide aminé n'est pas la méthionine. Ces objectifs sont atteints grâce à l'invention qui concerne un vecteur pour l'introduction dans une cellule eucaryote d'une molécule (X) présentant au moins une extrémité amino-terminale, caractérisé en ce qu'il est constitué par l'association d'un module d'incorporation cellulaire permettant la translocation membranaire, et d'un module ubiquitine ou autre peptide conjugable apparenté, ledit vecteur présentant une extrémité carboxy- terminale destinée à être fusionnée par Uaison peptidique à l'extrémité amino-terminale de ladite molécule (X).
On notera que l'on entend dans la présente description les termes "ubiquitine ou autres peptides conjugables apparentés", ci-après dénommés "UBL", comme désignant l'ubiquitine ou les peptides apparentés tels que NEDD-8, SUMO (Small Ubiquitin-related MOdifier), UCRP (Ubiquitin Cross-Reacting Protein), RUB (Related to UBiquitin) et d'autres (Jentsch et Pyrowolakis 2000. Trends Cell Biol. 10, 335-342). L'utilisation de versions modifiées ou raccourcies d'UBL dans le cadre de la présente invention est possible si leur capacité à induire le clivage à leur extrémité C-terminale est conservée. Préférentiellement, l'UBL est l'ubiquitine. Les UBL sont naturellement synthétisés en fusion avec des extensions carboxy- terminales, constituées de simples acides aminés, de polypeptides ou de protéines. H existe des activités enzymatiques cellulaires capables de cliver précisément entre les domaines UBL et leurs extensions C-terminales.
Dans le cas de l'ubiquitine, l'existence de telles activités est prouvée depuis longtemps (Lund et coll. 1985. J. Biol. Chem. 260, 7609-7613; Pickart et Rose 1985. J. Biol. Chem. 260, 7903-7910).
Des enzymes responsables ont été identifiées (Mayer et coll. 1989. Biochemistry 28, 166-172). Cependant, la connaissance et la possession des enzymes responsables de ces activités de clivage, ne sont nullement nécessaires pour la mise en oeuvre de la présente invention. Plusieurs usages de ces activités enzymatiques ont déjà été décrits dans le domaine de la biotechnologie. La présente invention tire profit de l'existence naturelle de ces enzymes dans les cellules pour un objectif nouveau et original : le clivage intracellulaire de molécules pré-synthétisées à l'extérieur des cellules, après incorporation par les cellules. Dans le cadre de la présente invention, la présence d'un module UBL à la partie N- terminale de la molécule transportée X, permet en effet le clivage entre UBL et X, et donc la libération de la molécule X du reste du vecteur.
L'utilisation du clivage C-terminal d'UBL pour atteindre cet objectif présente plusieurs avantages : - Les activités enzymatiques responsables de ces clivages sont répandues dans la plupart des cellules eucaryotes et constitutivement actives, ce qui permet de généraliser l'usage de ce système de vecteur.
- Le clivage C-terminal d'UBL n'est conditionné que par la reconnaissance de la séquence en acides aminés du module UBL, située exclusivement du côté NH2 du site de clivage, ce qui rend possible l'introduction de n'importe quelle séquence du côté COOH. Cette propriété permet de n'imposer aucune condition ou restriction quant à la nature des peptides X. En particulier, des peptides très courts, tels que des dipeptides, peuvent être aussi efficacement transportés selon cette invention.
- Le clivage ayant heu précisément à l'extrémité C-terminale des UBL, aucune contrainte n'existe quant à la nature de l'acide aminé N-terminal de la molécule X. En particulier, cet acide aminé peut être différent d'une méthionine, ce qui n'est pas le cas pour les peptides synthétisés à partir de transgènes, après transcription et traduction intracellulaire.
L'utilisation de versions modifiées ou raccourcies d'UBL est possible si leur capacité à induire le clivage à leur extrémité C-terminale est conservée.
De très nombreux types de molécules (X) peuvent être vectorisés par le vecteur selon l'invention et notamment de simples acides aminés et des peptides de taille quelconque, et indépendamment de toute contrainte de composition et de séquence. Le vecteur selon l'invention permet également de vectoriser des peptides chimiquement modifiés.
Le vecteur selon l'invention peut aussi être utilisé pour l'incorporation cellulaire de molécules non peptidiques, comme par exemple des oligonucleotides ou des composés chimiques hydrophiles qui auront été greffés préalablement à l'extrémité carboxy-terminale d'un oligopeptide. On notera aussi qu'il sera possible de modifier chimiquement les molécules vectorisées, à condition que la liaison peptidique entre la molécule vectorisée et le vecteur reste accessible pour les hydrolases C-terminales d'UBL. À titre d'exemple, une acylation C-terminale de la molécule (X) permettra son ancrage membranaire intracellulaire.
Le vecteur selon la présente invention présente aussi des avantages par rapport aux peptides simplement associés à des peptides de translocation membranaires tels qu'énoncés précédemment.
Plus précisément, la présente invention permet le largage intracellulaire des molécules (X) transportées, sous une forme totalement libre de toute fusion après clivage entre UBL et X.
La dissociation physique entre la molécule X et le reste du vecteur selon la présente invention présente plusieurs intérêts: a- L'absence d'interférences fonctionnelles entre le vecteur et la molécule X. Si la molécule X doit assurer une fonction biologique dans les cellules, l'efficacité de cette fonction peut être considérablement amoindrie si les autres modules de la molécule vectorisée y restent associés (CPM, UBL et autres). Par encombrement stérique, ces modules peuvent gêner :
-> la spécificité et l'affinité d'interaction de la molécule X avec des molécules endogènes de la cellule, comme des cibles thérapeutiques. Ce dernier point est particulièrement probable dans le cas où X est un peptide.
-> le repliement tridimensionnel authentique de la molécule X. -> la localisation subcellulaire appropriée de la molécule X. Beaucoup de peptides de translocation connus actuellement présentent des tendances à se diriger vers certaines localisations (locahsation nucléaire par activité NLS ("Nuclear Localization Signal"), re-sécrétion etc.), entraînant avec eux les molécules transportées X. Inversement, la fusion avec un vecteur peut empêcher le fonctionnement de certaines séquences de locahsation qui auraient été prévues dans la molécule X, comme par exemple un signal N- terminal d'adressage mitochondrial. b- Dans le cas où la molécule X est un peptide, ce système permet une totale liberté de choix sur la nature de ce peptide. Le mécanisme de largage intracellulaire induit par le module UBL, permet de délivrer dans les cellules des peptides de taille, composition et séquence quelconques, en particuher présentant les régions amino- et carboxy-terminales que l'on souhaite, y compris présentant un acide aminé amino-terminal autre qu'une méthionine. Rappelons à titre de comparaison que des peptides synthétisés in situ à partir de transgènes, sont obligatoirement synthétisés avec une méthionine initiatrice en position amino-terminale, et que les transgènes se prêtent mal à la synthèse de petites protéines et de peptides. c- Enfin, la dissociation intracellulaire entre la molécule X et les modules du vecteur rend possible l'introduction d'un dispositif supplémentaire dans ce système de vectorisation: la destruction ultérieure de tous les modules de la molécule vectorisée autres que la molécule transportée X (CPM, UBL et autres). La destruction programmée de ces modules constitue le second objectif de la présente invention. Dans le cas le plus simple où l'ensemble des composants du vecteur est de nature peptidique, cet objectif est atteint par l'introduction d'un module dans la molécule vectorisée.
Plusieurs catégories de modules de déstabilisation peuvent être utilisées pour ce système, notamment des boîtes de destruction ("destruction boxes") présentes dans certaines protéines naturellement instables comme par exemple les cychnes (Glotzer et coll.
1991. Nature 349, 132-138), ou bien une extrémité amino-terminale exposant un acide aminé déstabilisateur suivi d'une région comportant une ou plusieurs lysines.
Préférentiellement, c'est ce dernier type de module de déstabilisation qui est utilisé. Le module de déstabilisation N-terminale (DN, "Destabilizing N-end") est situé à l'extrémité amino-terminale de la molécule vectorisée.
La nature de ce type de module de déstabilisation N-terminale repose sur la constatation que la demi-vie des protéines intracellulaires est très précisément déterminée par la nature des séquences N-terminales et principalement par la nature du premier acide aminé N-terminal (Bachmair et coll. 1986. Science 234, 179-186). Nous proposons d'exploiter cette activité naturelle des cellules eucaryotes de manière nouvelle et originale, pour programmer la destruction intracellulaire d'une protéine pré-synthétisée à l'extérieur des cellules, puis incorporée par les cellules.
Selon le DN choisi, il est possible de programmer la destruction, après le largage de la molécule transportée X, du reste de la protéine recombinante (comprenant au moins DN- CPM-UBL).
Il est important de noter que les signaux de déstabilisation DN ne prennent effet que dans le contexte intracellulaire, et n'affectent donc nullement la stabilité de la protéine recombinante dans les fluides extracellulaires. Ce point est démontré par l'existence de nombreuses protéines extracellulaires naturellement très stables bien que présentant un acide aminé déstabilisateur à leur extrémité amino-terminale, exposé après le chvage du peptide signal de sécrétion.
Nous proposons plusieurs méthodes pour exposer des acides aminés déstabilisateurs à l'extrémité N-terminale de la protéine vectorisée:
A- Par clivage enzymatique de la protéine recombinante par une protéase: - soit une protéase dont le site de reconnaissance est localisé exclusivement du côté NH2 du site de chvage (comme par exemple le facteur Xa), en ayant prévu un résidu déstabilisateur juste en aval de son site de coupure (Figure 3 A).
- soit une protéase coupant à l'intérieur de son motif de reconnaissance, mais choisie parce que l'acide aminé faisant partie de son site de reconnaissance et situé juste en aval de son site de coupure, se trouve être un résidu déstabilisateur.
B - Par clivage chimique, par exemple avec le bromure de cyanogène (CNBr), au niveau d'une méthionine de la protéine recombinante purifiée, en ayant prévu un acide aminé déstabilisateur juste en aval dans la molécule vectorisée. Une condition préalable à cette méthode est que la protéine recombinante soit conçue de telle manière qu'elle ne contienne pas d'autres méthionines (Figure 3B).
C - Par élimination enzymatique de la méthionine initiatrice N-terminale de la protéine recombinante purifiée, par une memionine-aminopeptidase (MAP) appropriée
(Figure 3C). D - Alternativement, l'exposition d'un acide aminé N-terminal déstabilisateur peut être réalisée non pas lors de la préparation de la protéine recombinante comme précédemment, mais par les cellules réceptrices elles-mêmes. Pour cela, un module UBL supplémentaire est inséré dans la protéine recombinante juste en amont du DN (Figure
3D). Cette méthode est complexe mais offre l'avantage de garantir que la destruction du module vecteur ne se produira qu'après le chvage C-terminal d'UBL, et donc après la libération de la molécule transportée X. Dans ce cas, il est possible de choisir un acide aminé déstabilisateur dictant une demi-vie protéique très courte (comme par exemple l'arginine).
PréférentieUement, les méthodes A, B et D sont utilisées. Dans le cas de la méthode B, il convient au préalable d'éviter la présence de méthionines internes dans la protéine recombinante. En particuher, la méthionine correspondant au premier acide aminé de UBL est remplacée par une leucine.
On peut s'assurer que la dégradation du module vecteur sera bien différée par rapport au largage de la molécule transportée, de deux manières: a- par le choix d'un DN et en particuher d'un acide aminé N-terminal, induisant la déstabilisation dans un délai significativement supérieur au délai d'action des hydrolases C- terminales d'UBL. b- par la stratégie d'exposition du DN par clivage d'une UBL placée en amont selon le point D des méthodes d'insertion d'un DN, illustré dans la Figure 3D. Dans cette méthode, le module UBL supplémentaire n'est pas détruit dans les cellules, mais est totalement inoffensif dans la mesure où il est identique à des UBL normales endogènes cellulaires.
On connaît plusieurs molécules susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la présente invention pour constituer le module UBL, telles que l'ubiquitine, SUMO, NEDD-8, UCRP, RUB ou d'autres (voir Jentsch et Pyrowolakis, 2000. Trends Coll. Biol. 10, 335- 342). Comme déjà indiqué ci-dessus l'utilisation de versions modifiées ou raccourcies d'UBL dans le cadre de la présente invention est aussi possible si leur capacité à induire le clivage à leur extrémité C-terminale est conservée.
Préférentiellement ce module est l'ubiquitine. On connaît plusieurs méthodes susceptibles d'être utilisées pour constituer le module de déstabilisation intracellulaire du vecteur.
Préférentiellement ce module est constitué d'un acide amino-terminal déstabilisateur suivi d'une région comportant un ou des résidus lysine. Préférentiellement, l'acide aminé amino-terminal déstabihsateur est la glutamine. On notera par ailleurs que dans le cadre de la présente invention, ledit module d'incorporation est préférentiellement un peptide de translocation membranaire tel qu'un peptide dérivé de la protéine TAT du virus du sida (HIV), de séquence naturelle ou modifiée.
L'invention concerne également toute molécule vectorisée, caractérisée en ce qu'eUe est constituée par la fusion d'une molécule (X) présentant au moins une extrémité amino- terminale dont ladite extrémité amino-terminale est fusionnée par liaison peptidique à l'extrémité carboxy-terminale du vecteur tel que décrit ci-dessus.
Selon une variante, ladite molécule (X) est un acide aminé ou un peptide, éventuellement chimiquement modifié. Selon une autre variante, ladite molécule (X) est une molécule non peptidique greffée à l'extrémité carboxy-terminale d'un oligopeptide.
Selon une autre variante, un module N-terminal de déstabilisation protéique peut être ajouté à l'extrémité amino-terminale de la protéine vectorisée.
Dans le cas le plus simple où les modules du système sont de nature polypeptidique, il est possible de produire l'ensemble comme une protéine recombinante en systèmes d'expression appropriés, procaryotes (bactéries) ou eucaryotes {par exemple bacculovirus). Cependant, l'utihsation d'un système de production eucaryote impose de s'assurer qu'il ne comporte pas les activités enzymatiques conduisant au chvage C-terminal d'UBL. Éventuellement, ces activités si elles existent, devront être préalablement inactivées. Ces problèmes ne se posent pas pour les systèmes bactériens, majoritairement dépourvus de ces activités enzymatiques. Alternativement, il est possible de synthétiser chimiquement la molécule vectorisée au moyen de synthétiseurs peptidiques.
Selon une variante de l'invention, ladite molécule vectorisée comprend de plus au moins un module d'étiquetage. Préférentiellement, ce module d'étiquetage est un polypeptide tel la poly-histidine.
Un tel module d'étiquetage pourra notamment être utilisé pour faciliter la purification du polypeptide vectorisé par exemple par affinité pour les métaux dans le cas de la poly- histidine.
On notera que l'intégration d'un tel module d'étiquetage dans le vecteur n'est absolument pas obhgatoire. Il peut notamment être retiré après la préparation de la molécule vectorisée, avant son utilisation.
Selon une autre variante de l'invention, ladite molécule vectorisée comprend de plus au moins un module d'adressage cellulaire. Il est en effet souvent souhaitable de ne vectoriser des molécules que dans certains types cellulaires particuliers. Des peptides de translocation sont déjà connus pour être incorporés de manière préférentielle par certains types cellulaires (Fujihara et Nadler, 1999), mais la plupart des peptides de translocation semble efficace dans tous les tissus (Schwarze et al. 2000. Trends Cell Biol. 10, 290-295). Cependant, même dans ce cas, un adressage vers certaines cellules définies peut être spécifié pour ce système de vectorisation, par adjonction de modules supplémentaires dans la molécule vectorisée. Par exemple, il a été montré que la présence d'un tripeptide RGD (Arginine - Glycine - Aspartate), permet l'adressage préférentiel des cellules cancéreuses métastatiques, surexprimant des intégrines αv/β3.
Ensemble, les dispositifs spécifiques de ce système (largage et destruction programmée du vecteur) coopèrent pour aboutir au résultat net suivant : des peptides naturels de composition et séquence quelconques, sont acheminés au sein même des cellules, débarrassées de toutes molécules annexes, et sans altération de l'organisme.
L'invention sera mieux comprise grâce aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 représente une molécule vectorisée selon l'invention;
- la figure 2 représente schématiquement le fonctionnement de l'invention; - la figure 3 représente schématiquement des méthodes A B, C et D pour exposer un acide aminé particuher à l'extrémité N-terminale de la molécule vectorisée (voir ci- dessus);
- la figure 4 représente un spectre traduisant l'incorporation de protéines TAT-Ubi couplées au FITC, en thymocytes ; - la figure 5 représente un gel de polyacrylamide transféré sur membrane observé sur un lecteur de fluorescence En référence à la figure 1, une molécule vectorisée est constituée par la fusion, de NH2 en COOH, d'un module de déstabilisation intracellulaire 2, d'un module d'incorporation cellulaire 3 pouvant par exemple être constituée par peptide dérivé de la protéine TAT du virus du Sida (HIV), d'un module ubiquitine ou autre peptide conjugable apparenté (UBL) 4 et d'une molécule à transporter 5. Une fois incorporée dans les cellules, la molécule vectorisée est clivée entre 4 et 5 par une hydrolase spécifique 6. La molécule à transporter 5 peut alors exercer l'activité biologique pour laquelle elle a été conçue. Après libération de la molécule à transporter 5, le reste de la molécule vectorisée 2-3-4 est détruit par un système enzymatique intracellulaire 7 reconnaissant le module de déstabilisation 2. En référence à la figure 2, la molécule vectorisée 1 est introduite dans le milieu extracellulaire A. Grâce au module module d'incorporation cellulaire 2 qu'elle contient, cette molécule franchit la membrane cellulaire C et se retrouve dans le cytoplasme B. Grâce à une hydrolase spécifique 6, la liaison peptidique entre la molécule 5 et l'UBL 4 est rompue et la molécule 5 est larguée avec son extrémité amino-terminale libre. Cette molécule peut y exercer l'activité biologique pour laquelle elle a été conçue 8. Le devenir du vecteur l', constitué par la fusion des modules 2,3,4, n'a quant à lui plus d'influence sur la fonction de la molécule transportée 5. Selon une variante, la présence d'un module de déstabilisation 2 induit la destruction du vecteur l' par des machineries intracellulaires.
L'invention offre une large gamme d'applications, depuis la recherche fondamentale à la thérapie. Puisqu'elle n'impose aucune condition sur la nature de la molécule X, elle permet l'introduction en cellules de polypeptides de séquences aussi bien naturelles qu'artificielles. Des polypeptides de séquence naturelle peuvent par exemple correspondre à des domaines de protéines existantes. Des peptides de séquences artificielles peuvent être sélectionnés comme des ligands spécifiques de protéines régulatrices connues, à travers des stratégies de criblage de banques peptidiques aléatoires, de double hybride direct ou inverse, ou encore de modélisation assistée par ordinateur.
Dans le cas particulier ou les peptides que l'on souhaite transporter dans les cellules sont précisément des UBL normales ou mutées, comme par exemple les ubiquitines mutées au niveau de résidus lysine, le module UBL prévu dans le vecteur peut être utilisé, auquel cas son extension C-terminale peut être quelconque.
L'invention est aussi directement adaptable au criblage de banques peptidiques aléatoires, qui offrent des milliards de configurations possibles. Pour cela, une banque peut être construite en utilisant directement le vecteur décrit ci-dessus, en insérant des séquences nucléotidiques aléatoires en 3' de la région codant l'UBL. Les outils moléculaires définis dans la présente invention : largage intracellulaire de la molécule transportée X et destruction programmée des autres modules de la molécule vectorisée, sont adaptables à des modules de translocation déjà identifiés ou en développements futurs. Il sont également adaptables aux modahtés d'administration qui seront définies pour les modules d'incorporation cellulaire.
Dans le domaine de la médecine, la présente invention est adaptable au traitement de tout type de pathologie, à partir du moment où des molécules X transportées efficaces pourront être définies pour ces pathologies.
La présente invention tire profit d'activités cellulaires dûment confirmées dans différents domaines de la biologie, de telle sorte que sa fonctionnalité est largement assurée. Les fonctionnalités de la présente invention sont exposées ci-après. Exposition d'une acide aminé quelconque après clivage par le facteur Xa:
La possibilité d'utiliser le facteur Xa pour exposer l'acide aminé que l'on souhaite à l'extrémité N-terminale d'une protéine recombinante, est garantie par sa spécificité de chvage de cette protéase. La coupure de FXa est dirigée par la reconnaissance d'une séquence de quatre acides aminés (préférentiellement IEGR) intégralement contenue du côté NH2 de son site de coupure, ce qui n'impose aucune condition sur la nature de l'acide aminé suivant. Le facteur Xa est disponible commercialement et largement utilisé. Largage de la molécule transportée X à l'intérieur des cellules eucaryotes:
Ce largage est assuré par chvage C-terminal d'UBL. L'efficacité et la spécificité des activités enzymatiques responsables de ces clivages, sont totalement garantis par leur importance biologique. En effet les extensions C-terminales des UBL doivent impérativement être éliminées pour permettre la conjugaison ultérieure des UBL sur leurs substrats. Destruction programmée du vecteur après incorporation cellulaire:
Aucune exception n'a été rapportée quant à l'efficacité de la dégradation intracellulaire des protéines présentant un acide aminé déstabilisateur à leur extrémité N- ter inale. Comme le chvage C-terminal d'UBL, ce mécanisme est un processus naturel de toute cellule eucaryote, assurant des fonctions physiologiques normales. Par exemple, ce mécanisme serait impliqué dans:
- la dégradation de protéines sécrétées qui seraient mal localisées dans le cytoplasme cellulaire, ou la dégradation de résidus de chvage protéique.
- la dégradation protéique à grande échelle dans des neurones lésés. Dans ce cas, des ligases intracellulaires greffent un acide aminé surnuméraire déstabilisateur (souvent l'arginine) à l'extrémité N-terminale des protéines à détruire.
Stabilité des molécules contenant un UBL et un DN dans le milieu extracellulaire: Les activités enzymatiques de chvage et de destruction protéiques, sollicitées respectivement par les modules UBL et DN, n'existent qu'à l'intérieur des cellules eucaryotes. H est donc exclu que la présence de ces modules entraîne une quelconque altération des molécules vectorisées tant qu'elles se trouvent dans le milieu extracellulaire. Perméabilité membranaire:
Les propriétés de transport transmembranaire sont également dûment confirmées pour de nombreux peptides de translocation selon l'art antérieur.
Des exemples de fabrication de systèmes de production des vecteurs selon la présente invention sont détaillés ci-après :
Plusieurs plasmides ont été fabriqués pour la production en bactéries de protéines recombinantes selon la présente invention. Ces plasmides ne sont que des exemples non limitatifs de mise en application de la présente invention.
- Premier plasmide.
Le plasmide décrit ci-après permet la production en bactéries d'une protéine recombinante dite "de base", comprenant tous les modules du vecteur, mais pas de molécules transportées X. La production de protéines recombinantes pour le transport de protéines ou peptides X désirés, nécessite l'insertion dans ce plasmide de la séquence nucléotidique codant ces protéines ou peptides, selon des techniques classiques de clonage nucléotidique.
Le plasmide est fabriqué à partir de la construction pQE-30 commercialisé par la société QIAGEN pour production protéique bactérienne.
Dans cette construction, la séquence codante de l'ubiquitine a été importée de
Xenopus laevis et non pas de mammifères, pour un meilleur usage de codons en bactéries.
L'espèce d'origine de la séquence codante de l'ubiquitine peut être choisie librement puisqu'elle n'affecte pas la séquence en acides aminés dérivée (l'ubiquitine est conservée à 100 % entre les vertébrés).
Ce plasmide permet de produire en bactérie selon les protocoles standards, une protéine de base, purifiée par affinité sur Nickel. La séquence en acides aminés de cette protéine est la suivante, en code une lettre : l-MRGSHHHHHHGSKLIEGRQLGYGRKKRRQR-30 31-RRGGSASSHMQIFVKTLTGKTITLEVEPSD-60 61 -TIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLE- 90 91-DGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGAC-117 Dans laquelle :
Le "tag poly-histidine", permettant de purifier sélectivement la protéine recombinante par affinité pour les métaux est la région <RGSHHHHH>. De plus, il existe des anticorps commerciaux spécifiques dirigés contre cet épitope (QUIAGEN). Le motif de reconnaissance de la protéase facteur Xa est <IEGR>. Le site de chvage se situant du côté carboxy du résidu R, la coupure par le facteur Xa conduit à exposer I acide aminé glutamine <Q> à l'extrémité de la protéine recombinante résiduelle. La fonction déstabilisatrice de cet acide aminé peut prendre effet en raison de la présence de résidus lysine K à proximité.
Le peptide de translocation est le peptide TAT dérivé du virus HIN <YGRKKRRQRRR>
Le module UBL est l'ubiquitine <MQIFVKTLTG KTITLEVEPS DTIEΝVKAKI QDKEGIPPDQ QRLIFAGKQL EDGRTLSDYΝ IQKESTLHLV LRLRGG> La molécule transportée X est le dipeptide <AC>, sans intérêt biologique et destiné à être remplacé par des peptides ou protéines bioactives, après insertion de séquences codantes supplémentaires dans le plasmide. Le résidu cystéine carboxy-terminal de ce dipeptide est prévu au cas où il serait envisagé de greffer sur son groupement thiol, une molécule non peptidique selon la revendication 14. Aucune autre cystéine n'existe dans la protéine recombinante de base, de manière à faciliter une telle réaction de couplage. Notons que l'alanine <A>, est un acide aminé stabilisateur.
Dans l'exemple choisi, la présence d'une glutamine à l'extrémité amino-terminale fixera une demi-vie pour la protéine recombinante à environ 10 minutes après son introduction dans les cellules, alors que le largage de X est réahsé entre 1 et 2 minutes après l'incorporation cellulaire.
Un procédé pour fabriquer une protéine recombinante où le dipeptide AC est remplacé par une peptide ou une protéine quelconque est exposé ci-après.
La séquence codant ce peptide ou protéine est préparée sous la forme d'un ADN double brin présentant à l'extrémité 5' de la région codante une coupure à bout franc, et du coté 3' un bout cohésif correspondant à l'une des enzymes de restriction présente dans le plasmide (en l'occurrence Kpn I, Sal I, ou Pst I). Le plasmide est préparé par double coupure d'une part avec par l'enzyme Sfo I, et d'autre part avec l'enzyme dont le bout cohésif correspond à celui choisi pour l'insert. Le site de coupure double-brin Sfo I est localisé précisément en 3' du dernier codon de l'ubiquitine (marqué v sur le schéma ci-dessous). Le schéma suivant représente les séquences codant l'extrémité COOH de la protéine de base :
Sfol
5' GGT GGC GCC TGT TGA GCT C 3'
3' CCA CCG CGG ACA ACT CGA G- -5'
NH2... G G A C * Les sites de coupure par les enzymes de restrictions utilisés pour le clonage sont marqués (v). Dans l'exemple choisi, le premier site (Sfo I), libère des extrémités à bouts francs, et le second site libère des extrémités à bouts cohésifs. Les acides aminés GG coπ-espondent à la limite COOH de l'ubiquitine. Le dipeptide AC est l'extension C- terminale de l'ubiquitine dans la protéine de base. * représente un codon "stop" (fin de traduction).
Le schéma suivant montre l'insertion de la séquence codant une protéine quelconque en fusion C-terminale avec l'ubiquitine.
Sfol
5' GGT GGC NNN NNN NNN NNN N-
3' CCA CCG NNN NNN NNN NNN N- •5'
NH2... G G X X X X -
Après coupure Sfo I, la séquence nucléotidique insérée, représentée avec des "N" est liée à la séquence codante de l'ubiquitine. Cette ligation permet la production de protéines X en fusion C-terminale de l'ubiquitine, à condition d'avoir veillé à conserver la phase de lecture traductionnelle entre la séquence codante de l'ubiquitine et celle du peptide C- terminal.
L'insert codant la molécule X peut provenir d'un autre plasmide, d'une réaction de PCR, ou bien d'une synthèse nucléotidique, dans le cas de peptides de taille raisonnable.
Deuxième plasmide.
Une construction variante a été fabriquée, où le peptide TAT de séquence sauvage est remplacé par une version modifiée selon Ho et coll. (2001. Cancer Res. 61, 474-477), dont les propriétés de perméabilité cellulaire sont améhorees, et dont la séquence en acides aminés est YARAAARQARA.
Ce plasmide code la protéine suivante : l-MRGSHHHHHHGSIEGRQKYARAAARQARAG-30 3 l-SASSHMQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIEN-60 6 l-VEAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRT-90 91 -LSD YNIQKESTLHLVLRLRGGAC- 113
Enfin une troisième version a été construite, ou le résidu méthionine correspondant au premier acide aminé de l'ubiquitine, est remplacé par une leucine (le codon ATG a été remplacé par CTG) . Cette construction est destinée à tester la possibilité d'exposer un acide aminé amino-terminal déstabilisateur par retrait de la méthionine initiatrice par la réaction au bromure de cyanogène, selon une variante de la méthode présentée sur la figure 3 B. À titre d'illustration de la présente invention, les expériences détaillées ci-après ont été menées.
Des protéines recombinantes "poly-Histidine-TAT-Ubiquitine-extension C- terminale" ont été incorporées efficacement par des cellules réputées réfractaires aux techniques classiques de transfection: des thymocytes normaux en culture primaire, extraits de souris de 4 semaines.
La bonne incorporation a été visualisée de deux manières:
- Par détection immunologique de la protéine recombinante dans des extraits cellulaires préalablement incubés avec les protéines recombinantes puis lavés. Cette détection a été réalisée par la technique de western blot en utilisant des anticorps primaires dirigés contre le peptide RGSHHHHHH (commercialisés par la société QUIAGEN).
- Par incorporation de fluorescence. Les protéines recombinantes "poly-Histidine- TAT-Ubiquitine-extension C-terminale" ont été couplées de manière covalente à la fluorescéine (FITC), puis débarrassées de la fluorescéine libre. Après incubation de thymocytes de souris avec ces protéines recombinantes fluorescentes, l'incorporation ceUulaire de la fluorescence a été mesurée par fluorimétrie (FACS Cahbur Becton Dickinson). Cette mesure a permis de vérifier que l'ensemble des thymocytes a incorporé la protéine, de manière homogène et rapide.
La libération intraceUulaire de l'extension C-terminale de l'ubiquitine a été vérifiée de la manière suivante: Des protéines extraites de thymocytes préalablement incubés avec la protéine "poly-Histidine-TAT-Ubiquitine-extension C-terminale" marquée au FÏTC, ont été soumis à une électrophorèse. L'examen de ce gel d'électrophorèse en fluorescence a révélé que l'ubiquitine fluorescente à été conjuguée de manière covalente sur des substrats protéiques cellulaires.
- Ce résultat confirme l'incorporation cellulaire de la protéine recombinante, puisque la conjugaison peptidique fait appel à des machineries intracellulaires.
- Ce résultat confirme le chvage C-terminal d'ubiquitine et donc le largage de son extension C-terminale. En effet, la conjugaison de l'ubiquitine n'est réalisable qu'après exposition de son extrémité C-terminale authentique, terminée par un dipeptide GG (Gly- Gly). Ces expériences seront mieux comprises grâce aux figures suivantes Figure 4 : Des thymocytes extraits de souriceaux âgés de 4 semaines, ont été incubés ou non (témoin) avec du FITC seul, ou de la protéine TAT-Ubi couplée au FTTC, pendant 15 minutes. Après lavage, les ceUules ont été analysées par cytométrie de flux. Le spectre représenté à la figure 4 montre que la protéine est incorporée rapidement et de manière homogène par les cellules de la population.
Figure 5 : Pour mettre en évidence le chvage intraceUulaire de la protéine recombinante au niveau de l'extrémité C-terminale du module ubiquitine, des thymocytes en culture primaire ont été incubés ou non avec des protéines recombinantes TAT-Ubi- extension C-terminale couplées au FITC. Des extraits protéiques ont été préparés à partir de ces cellules, puis soumis à un électrophorèse dénaturante en gel de polyaciylamide
(SDS-PAGE, ne maintenant que les liaisons covalentes). Le contenu du gel a été transféré sur membrane et observé sur un lecteur de fluorescence (scanner Storm, Molecular
Dynamics) Le résultat obtenu est représenté à la figure 5 sur laqueUe on peut distinguer différents canaux. Canal 1. Protéine recombinante TAT-Ubi-Extension C-terminale produite en bactérie et purifiée par affinité pour le Nickel, puis couplée à la fluorescéine
(FITC). La protéine recombinante est clairement visible (RP). Quelques protéines bactériennes contaminantes (C) de haut poids moléculaire sont visibles. Canal 2. Protéines extraites de thymocytes témoins.
Canal 3. Protéines extraites de thymocytes incubée avec la préparation de protéine recombinante montrée dans le canal 1. Une bande de taiUe équivalente à RP (flèche) est clairement détectée dans les cellules, mais la majorité de la fluorescence est retrouvée au niveau de protéines de plus haut poids moléculaire (CS). Ces bandes doivent correspondre à des substrats de conjugaison de d'ubiquitine fluorescente dérivée de la protéine recombinante. La bande très intense correspond à une protéine non identifiée, majoritaire dans les thymocytes. Ce résultat montre que :
- la protéine recombinante est effectivement incorporée par les thymocytes - la protéine recombinante est efficacement clivée à l'extrémité C-terminale du domaine ubiquitine. En effet, la conjugaison de l'ubiquitine sur des substrats protéiques intracellulaires nécessite que l'extrémité authentique de l'ubiquitine soit exposée et débarrassée de son extension C-terminale. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Vecteur pour l'introduction d'une molécule (X) présentant au moins une extrémité ajtτώ o-terminale dans une cellule eucaryote caractérisé en ce qu'il est constitué par l'association d'un module d'incorporation ceUulaire permettant la translocation membranaire, et d'un module UBL c'est-à-dire un module ubiquitine ou autre peptide conjugable apparenté ou d'une version d'UBL modifiée ou raccourcie, ledit vecteur présentant une extrémité carboxy-terminale destinée à être fusionnée par liaison peptidique à l'extrémité amino-terminale de ladite molécule (X)
2. Vecteur selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il contient un module de déstabiUsation intraceUulaire.
3. Vecteur selon la revendication 2 caractérisé en ce que ledit module de déstabilisation intracellulaire est constitué par une "boîte de destruction" ou par une extrémité amino-terminale exposant un acide aminé déstabilisateur suivi d'une région comportant une ou plusieurs lysines.
4 Vecteur selon la revendication 3 caractérisé en ce que ledit acide aminé amino-terminal est la glutamine.
5. Vecteur selon la revendication 3 caractérisé en ce qu'un acide aminé déstabihsateur est exposé à l'extrémité N-terminale après clivage par une protéase.
6. Vecteur selon la revendication 5 caractérisé en ce que ladite protéase est le facteur EXa.
7. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il contient un module d'étiquetage.
8. Vecteur selon la revendication 7 caractérisé en ce que ledit module d'étiquetage est un polypeptide.
9. Vecteur selon la revendication 8 caractérisé en ce que ledit module d'étiquetage est la poly-histidine.
10. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que ledit module d'incorporation est un peptide de translocation membranaire.
11. Vecteur selon la revendication 10 caractérisé en ce que ledit module d'incorporation est un peptide dérivé de la protéine TAT du virus du Sida (HIV).
12. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que le module UBL est un module ubiquitine.
13. Molécule vectorisée caractérisée en ce qu'eUe est constituée par la fusion d'une molécule (X) présentant au moins une extrémité amino-terminale dont ladite extrémité amino-terminale est fusionnée par liaison peptidique à l'extrémité carboxy-teπninale du vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Molécule vectorisée selon la revendication 13 caractérisée en ce que ladite molécule (X) est un acide aminé ou un peptide.
15. Molécule vectorisée selon la revendication 14 caractérisée en ce que ladite molécule (X) est un acide aminé ou un peptide chimiquement modifié.
16. Molécule vectorisée selon la revendication 15 caractérisée en ladite molécule (X) est une molécule non peptidique greffée à l'extrémité carboxy-terminale d'un oligopeptide.
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