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WO2001023576A1 - Proteinproduktion mit ashbya gossypii - Google Patents

Proteinproduktion mit ashbya gossypii Download PDF

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Publication number
WO2001023576A1
WO2001023576A1 PCT/EP2000/008648 EP0008648W WO0123576A1 WO 2001023576 A1 WO2001023576 A1 WO 2001023576A1 EP 0008648 W EP0008648 W EP 0008648W WO 0123576 A1 WO0123576 A1 WO 0123576A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
microorganism
nucleotide
ashbya
cellulase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2000/008648
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Henning ALTHÖFER
Markus Pompejus
Jose L. Revuelta Doval
Maria Santos
Alberto Jiminez
Rocio Benito
Ramon Santamaria
Jose Fernandez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of WO2001023576A1 publication Critical patent/WO2001023576A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)

Definitions

  • the present invention relates to microorganisms from the genus Ashbya for the biotechnological production of proteins.
  • Proteins especially enzymes, are widely used in numerous areas of daily life and are therefore of great economic interest.
  • Proteins can be produced either chemically or microbiologically. However, the product yields that can be achieved in chemical synthesis are unsatisfactory. In addition, the processes for the chemical production of proteins are usually extremely time-consuming and cost-intensive and, due to the not inconsiderable use of auxiliaries, are often extremely polluting.
  • yeasts or organisms that grow like yeasts represent a widely described system of choice for the production of eukaryotic
  • the present invention relates to the biotechnological production of proteins with a microorganism from the genus Ashbya. According to the invention, both the production of cell-specific and foreign cells is possible.
  • the microorganism used is characterized in that it has a gene structure such that it has a protein synthesis output (net productivity) which is changed, in particular increased, compared to that of a wild type of the Ashbya gossypii ATCC 10895 species.
  • the present invention further relates to a microorganism which synthesizes proteins which the wild type of the species Ashbya gossypii ATCC 10895 does not produce.
  • the microorganism according to the invention preferably synthesizes cellulase.
  • the microorganism is a fungus of the Ashbya gossypii species.
  • a celluiase gene from Streptomyces halstedii with the EMBL accession no. Z12157 for use.
  • a cellulase gene is preferably used with a nucleotide sequence coding for an amino acid sequence or an essentially equivalent DNA sequence for the nucleotide sequence coding for an amino acid sequence given in nucleotide 2912 to nucleotide 4190.
  • regulatory gene sequences are assigned to the celluiase gene and operatively linked to it.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of, for example, the promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended in the expression of the coding sequence.
  • the cellulase gene is preceded by a promoter which enables expression in a microorganism of the genus Ashbya.
  • any promoter that can control the expression of foreign genes in Ashbya is suitable as a promoter.
  • the promoter of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase from Ashbya gossypii is preferred.
  • the promoter of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase from Ashbya gossypii with the DNA sequence given in SEQ ID No 1 from nucleotide 2549 to nucleotide 2908 or an essentially equivalent nucleotide sequence is particularly preferred.
  • functional variants of the promoter are also conceivable, the function of which is weakened or enhanced compared to the output sequence.
  • the celluiase gene is followed by a nucleotide sequence which enables a termination of the transcription in a microorganism of the genus Ashbya.
  • any terminator that can control the transcription of foreign genes in Ashbya is suitable as a transcription terminator.
  • the transcription terminator of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase from Ashbya gossypii is preferred.
  • the transcription terminator of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase from Ashbya gossypii with the DNA sequence given in SEQ ID No 1 from nucleotide 4191 to nucleotide 4840 or an essentially equivalent nucleotide sequence is particularly preferred. Functional variants of the transcription terminator are also conceivable here, the function of which is weakened or enhanced compared to the starting sequence.
  • the present invention relates to a gene structure containing a cellulase gene of the type described above and to this gene associated regulatory gene sequences which enable expression in a microorganism from the Ashbya genus.
  • the gene structure according to the invention contains, from the nucleotide sequence of the glyceraldehyde phosphate dehydrogenase from Ashbya gossypii, a promoter with the nucleotide sequence from nucleotides 2549 to 2908 and a transcription terminator with the nucleotide sequence from nucleotide 4191 to 4840 or nucleotide sequences with essentially the same effect.
  • the gene structure according to the invention of the type described above contains nucleotide sequences from the genome of Ashbya gossypii at both ends, ie flanking. These are preferably sequences of the Leu2 gene coding for 3-isopropyl malate dehydrogenase with a nucleotide sequence of nucleotides 9 to 435 and the gene SPL1, a factor involved in the maturation of the tRNA, with a nucleotide sequence of nucleotide 4841 to 5153
  • the gene SPL1 is organized in the Leu2 gene locus from Ashbya gossypii.
  • a The schematic representation of the gene structure according to the invention is shown in FIG. 1.
  • the invention furthermore relates to a vector comprising a celluiase gene and / or a promoter and / or a transcription terminator of the type described above or a gene structure of the type described above and additional regulation signals, for example for replication of the vector in the host cell or for integration into its genome.
  • a transformed microorganism from the genus Ashbya for the production of cellulase is the subject of the present invention.
  • the transformed microorganism in replicative form contains a gene structure or a vector of the type described above.
  • the present invention relates to a method for producing a protein-producing microorganism from the genus Ashbya, which is modified so that it has a protein synthesis performance (net productivity) which is different from that of a wild type of the species Ashbya gossypii ATCC10895.
  • the invention also relates to a method for producing a microorganism which produces proteins which the wild type of the species Ashbya gossypii ATCC10895 does not produce.
  • the method is characterized in that the enzyme is generated by the insertion of the cellulase gene.
  • the change in the organism can be caused by
  • a method can be achieved in which the promoter is replaced and / or the number of gene copies is increased.
  • the change in the microorganism takes place according to the invention using genetic engineering methods. Preferred here is the transfer of foreign DNA referred to as transformation into the host organism.
  • the present invention also includes the use of a gene structure or vector as previously described to produce such a microorganism.
  • the present invention relates to a method for the biotechnological production of proteins in which a microorganism of the genus Ashbya with the aforementioned properties is used.
  • This microorganism is used according to the invention for the production of proteins, preferably cellulase.
  • the proteins produced by such a method are also the subject of the invention.
  • the proteins are used in particular in the areas of the paper industry, medicine, food and feed industry, detergent industry or as catalysts.
  • the desired 5'-flanking fragment corresponds to the nucleotide sequence from nucleotide 9 to 435 given in SEQ ID No 1 and is thus 426 bp long.
  • the 3'-flanking sequence is obtained by a Pmel and Xhol digest and comprises a 312 bp nucleotide sequence corresponding to nucleotide 4841 to 5153 of the nucleotide sequence given in SEQ ID No 1.
  • the promoter and terminator sequence contained in the gene structure is isolated from the DNA sequence of the Glycerinaidehydphosphat-Dehydrogenase (GAP-DH) from Ashbya gossypii.
  • GAP-DH Glycerinaidehydphosphat-Dehydrogenase
  • the promoter sequence is obtained by a Sall / Ndel digestion and results in a 359 bp fragment from nucleotide 2549 to 2908 of the sequence shown in SEQ ID No 1.
  • the terminator sequence results from a restriction approach with Bglll and Sall. It comprises 649 bp corresponding to nucleotide 4191 to 4840 of the nucleotide sequence given in SEQ ID No 1.
  • the cellulase gene from Streptomyces halstedii (celA) used comprises a sequence from nucleotide 2912 (corresponding to A of the ATG codon) to nucleotide 4190 (corresponding to the untranslated 3 'region) and results from a restriction approach with BamHI and Ndel.
  • a nucleotide sequence that codes for resistance to the antibiotic kanamycin serves as a selection marker.
  • this sequence comprises nucleotides 442 to 2542 and is based on a DNA sequence from E. coli transposon 903, obtained by a Sall restriction digest.
  • the individual fragments are operatively linked by ligation according to common methods, in the following order: 5'-flanking sequence from Leu2 - kanamycin resistance (G418) - promoter (GAP-DH) - CelA - terminator (GAP-DH) - 3 ' flanking sequence from SPL1.
  • the gene construct is transferred into the Ashbya gossypii fungus by transformation according to the method of Wright and Phiiippsen, 1991, Gene, 109: 99-105.
  • the host cells successfully transformed with the gene construct are selected by plating out the transformation mixture on medium which contains 300 ⁇ g / ml kanamycin G418 as antibiotic. Mediated by the flanking sequences of the Leu2 locus at the 5 'and 3' end of the gene structure, this can integrate into the genome of Ashhya gossypii via homologous recombination. This destroys the host cell's Leu2 locus, so that the resulting recombinant cells have leucine auxotrophy, which is used as a selection marker. Furthermore, the leucine auxothrophic cells, which consequently only on Grow medium with leucine as a supplement, examined for its ability to produce cellulase.
  • the cells are cultivated on the medium MA2 (Forster, C, et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 9442-9448), but only 0.1% yeast extract and additionally 0.75% carboxymethyl -Cellulose (low viscosity, Sigma) contains.
  • the cells are incubated for 2 days at 28 ° C for growth.
  • the culture plates are then as described in Teather, RM and Wood, PJ, 1982, Appl. Environ. Microbiol., 43: 777-780 described stained with Congo red.
  • the recombinant cells show a clear lysis area (FIG. 2).
  • Fig. 1 Schematic representation of the gene construct for integration into the genome of Ashbya gossypii via homologous recombination
  • AgLeu2 Leu2 gene from Ashbya gossypii coding for the 3-isopropyl
  • G418 Kanamycin resistance gene
  • SEQ ID No 1 Nucleotide sequence of the gene structure according to the invention, comprising
  • Nucleotide 1 to 8 Pme I restriction site.
  • Nucleotide 9 to 435 Leu2 gene from Ashbya gossypii coding for the 3-isopropyl-malate dehydrogenase
  • Nucleotide 436 to 441 Sal I restriction site.
  • Nucleotide 442 to 2542 Kanamycin resistance gene.
  • Nucleotide 2543 to 2548 Sal I restriction site.
  • Nucleotide 2549 to 2908 promoter of Ashbya gossypii glyceraldehyde phosphate dehydrogenase
  • Nucleotide 2909 to 2914 Nde I restriction site.
  • Nucleotide 4841 to 5153 SPL1 gene from Ashbya gossypii coding for a factor involved in the maturation of the tRNA, organized in the Leu2 gene locus from Ashbya gossypii.
  • Nucleotide 5154 to 5161 Pme I restriction site

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya zur biotechnischen Herstellung von Proteinen, insbesondere Cellulase, ein Verfahren zur Herstellung der Proteine sowie deren Verwendung in Bereichen der Papierindustrie, Medizin, Nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie, Waschmittelindustrie oder als Katalysatoren.

Description

Proteiπproduktion mit Ashbya ossypii
Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen aus der Gattung Ashbya zur biotechnischen Herstellung von Proteinen.
Proteine, insbesondere Enzyme, finden in zahlreichen Bereichen des täglichen Lebens eine weite Anwendung und sind somit von großem wirtschaftlichen Interesse.
Die Herstellung von Proteinen kann entweder chemisch oder mikrobieil erfolgen. Die erreichbaren Produktausbeuten bei der chemischen Synthese sind jedoch wenig zufriedenstellend. Darüber hinaus sind die Verfahren zur chemischen Herstellung von Proteinen in der Regel extrem zeit- und kostenintensiv und durch den nicht unerheblichen Einsatz an Hilfsstoffen vielfach stark umweltbelastend.
Wesentlich ökonomischer ist daher die Herstellung von Proteinen mit biologischen Systemen, insbesondere Mikroorganismen, da diese in der Regel einfach zu handhaben sind und die gewünschten Zielprodukte in einstufigen Prozessen gewonnen werden können. Beispiele hierzu sind zahlreich in der Fachliteratur beschrieben.
Allerdings ist die Expression von eukaryotischen Proteinen in Prokaryonten aufgrund einer erhöhten Faltungsproblematik und fehlender Glykosylierung der exprimierten Proteine limitiert.
Demgegenüber stellen Hefen oder hefeartig wachsende Organismen ein vielfach beschriebenes System der Wahl zur Herstellung eukaryotischer
Proteine dar. Beispielhaft sei hierzu Sudbery, P. E., 1996, in Current Opinion in Biotechnology, p. 517-524 zitiert. Ferner sind Verfahren zur Herstellung von Exoenzymen in fiiamentös wachsenden Pilzen, wie beispielsweise Trichoderma oder Aspergillus beschrieben (Archer, D.B. et al., 1995, in Chapman & Hall, The Growing Fungus, p. 137-162).
Durch die Produktion von Vitaminen, insbesondere Vitamin B2 (Riboflavin) gewinnt der Pilz Ashbya gossypii zunehmend wirtschaftliches Interesse. Entsprechende Verfahren zur Herstellung und Überexpression von Riboflavin mit Ashbya gossypii sind in DE 195 25 281 und DE 195 45 468 offenbart.
Eine Herstellung von Proteinen, insbesondere Cellulase mit Ashbya gossypii ist bislang nicht beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die biotechnische Herstellung von Proteinen mit einem Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya. Hierbei ist erfindungsgemäß sowohl die Herstellung zelleigener als auch zellfremder Proteine möglich.
Erfindungsgemäß zeichnet sich der eingesetzte Mikroorganismus dadurch aus, daß er eine derartige Genstruktur aufweist, daß er eine Proteinsyntheseleistung (Nettoproduktivität) aufweist, die gegenüber derjenigen eines Wildtyps der Species Ashbya gossypii ATCC 10895 verändert, insbesondere erhöht ist.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus der Proteine synthetisiert, die der Wildtyp der Species Ashbya gossypii ATCC 10895 nicht produziert. Vorzugsweise synthetisiert der erfindungsgemäße Mikroorganismus Cellulase.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem Mikroorganismus um einen Pilz der Spezies Ashbya gossypii. Bei der Expression zellfremder Proteine kommt erfindungsgemäß ein Celluiase-Gen aus Streptomyces halstedii mit der EMBL Accession-No. Z12157 zum Einsatz. Bevorzugt wird ein Cellulase-Gen mit einer für die in SEQ ID No 1 von Nukleotid 2912 bis Nukleotid 4190 angegebenen für eine Aminosäuresequenz kodierenden Nukleotidsequenz oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz eingesetzt.
Hierbei sind dem Celluiase-Gen erfindungsgemäß regulatorische Gensequenzen zugeordnet und mit diesem operativ verknüpft. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Erfindungsgemäß ist dem Cellulase-Gen ein Promotor vorgeschaltet, der eine Expression in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya ermöglicht.
Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Ashbya steuern kann. Bevorzugt ist der Promotor der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii. Besonders bevorzugt ist der Promotor der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii mit der in SEQ ID No 1 von Nukleotid 2549 bis Nukleotid 2908 angegebenen DNA- Sequenz oder einer im wesentlichen gleichwirkenden Nukleotidsequenz. Hierbei sind auch funktionelle Varianten des Promotors denkbar, deren Funktion, verglichen mit der Ausgaπgssequenz, abgeschwächt oder verstärkt ist. Außerdem ist dem Celluiase-Gen erfindungsgemäß eine Nukleotidsequenz nachgeschaltet, die eine Termination der Transkription in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya ermöglicht. Als Transkriptions-Terminator ist grundsätzlich jeder Terminator geeignet, der die Transkription von Fremdgenen in Ashbya steuern kann. Bevorzugt ist der Transkriptions-Terminator der Glyzerinaldehydphosphat- Dehydrogenase aus Ashbya gossypii. Besonders bevorzugt ist der Transkriptions-Terminator der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii mit der in SEQ ID No 1 von Nukleotid 4191 bis Nukleotid 4840 angegebenen DNA-Sequenz oder einer im wesentlichen gleichwirkenden Nukleotidsequenz. Hierbei sind auch funktionelle Varianten des Transkriptions-Terminators denkbar, deren Funktion, verglichen mit der Ausgangssequenz, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine Genstruktur enthaltend ein Cellulase-Gen der zuvor beschriebenen Art sowie diesem Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen, die eine Expression in einem Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya ermöglichen. Hierbei enthält die Genstruktur erfindungsgemäß aus der Nukleotidsequenz der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii einen Promotor mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 2549 bis 2908 und einen Transkriptions-Terminator mit der Nukleotidsequenz von Nukleotid 4191 bis 4840 oder im wesentlichen gleich wirkenden Nukleotidsequenzen. Ferner enthält die erfindungsgemäße Genstruktur der zuvor beschriebenen Art an beiden Enden, also flankierend, Nukleotidsequenzen aus dem Genom von Ashbya gossypii. Bevorzugt handelt es sich dabei um Sequenzen des Gens Leu2 kodierend für die 3- Isopropyi-Malat-Dehydrogenase mit einer Nukleotidsequenz von Nukleotid 9 bis 435 und des Gens SPL1 , einem an der Reifung der tRNA beteiligten Faktor, mit einer Nukleotidsequenz von Nukleotid 4841 bis 5153. Das Gen SPL1 ist im Leu2-Genlocus von Ashbya gossypii organisiert. Eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Genstruktur ist in Fig. 1 dargestellt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Vektor enthaltend ein Celluiase- Gen und/oder einen Promotor und/oder einen Transkriptions-Terminator der zuvor beschriebenen Art oder eine Genstruktur der zuvor beschriebenen Art sowie zusätzliche Regulationssignale beispielsweise zur Replikation des Vektors in der Wirtszelle oder zur Integration in dessen Genom.
Desweiteren ist ein transformierter Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya zur Herstellung von Cellulase Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Dabei enthält der transformierte Mikroorganismus in replikativer Form eine Gen-Struktur oder einen Vektor der zuvor beschriebenen Art.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteine produzierenden Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya, der so verändert wird, daß er eine Proteinsyntheseleistung (Nettoproduktivität) aufweist, die gegenüber derjenigen eines Wildtyps der Species Ashbya gossypii ATCC10895 verändert ist. Darüber hinaus ist ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus Gegenstand der Erfindung, der Proteine produziert, die der Wildtyp der Species Ashbya gossypii ATCC10895 nicht produziert. Dabei ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß durch die Einfügung des Cellulase-Gens das Enzym erzeugt wird.
Erfindungsgemäß kann die Veränderung des Organismus durch ein
Verfahren erzielt werden, bei dem ein Austausch des Promotors vorgenommen wird und/oder eine Erhöhung der Genkopienzahl erfolgt. Die Veränderung des Mikroorganismus erfolgt dabei erfindungsgemäß mittels gentechnischer Methoden. Bevorzugt ist hier die als Transformation bezeichnete Übertragung von Fremd-DNA in den Wirtsorganismus.
Die vorliegende Erfindung schließt außerdem die Verwendung einer wie zuvor beschriebenen Gen-Struktur oder eines Vektors zur Herstellung eines solchen Mikroorganismus ein.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Proteinen bei dem ein Mikroorganismus der Gattung Ashbya mit den zuvor genannten Eigenschaften eingesetzt wird. Dieser Mikroorganismus wird dabei erfindungsgemäß zur Herstellung von Proteinen, bevorzugt Cellulase verwendet. Ebenso sind die nach einem solchen Verfahren hergestellten Proteine Gegenstand der Erfindung. Die Proteine finden dabei insbesondere in Bereichen der Papierindustrie, Medizin, Nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie, Waschmittelindustrie oder als Katalysatoren Verwendung.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung durch Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend sind:
1. Herstellung des Genkonstrukts und Übertragung in Ashbya gossypii
Zur Herstellung der Genstruktur ist es zunächst erforderlich die verschiedenen DNA-Komponenten aus denen sie zusammengesetzt ist, herzustellen und zu isolieren. Dies erfolgt nach gängigen Methoden der Molekularbiologie, insbesondere mit Hilfe der PCR-Technik wie in Sambrook et al. (1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0- 87969-309-6) und PCR Protocolls, Guide to Methods and Applications, 1990 Acad. Press Inc. beschrieben. Dazu wird die jeweilige DNA einem Restriktionsverdau unterzogen. Anschließend werden die erhaltenen DNA-Fragmente mittels einer Gel-Elektrophorese nach Größen aufgetrennt und die gewünschten Fragmente isoliert. Zur Isolierung der flankierenden Sequenzen aus dem Genom von Ashbya gossypii wird DNA, die für das Leu2-Gen kodiert einem Restriktionsverdau mit Pmel und Sall unterworfen. Das gewünschte 5'-flankierende Fragment entspricht der in SEQ ID No 1 angegebenen Nukleotidsequenz von Nukleotid 9 bis 435 und ist somit 426 bp lang. Die 3'-flankierende Sequenz wird durch einen Pmel und Xhol-Verdau erhalten und umfaßt eine 312 bp lange Nukleotidsequenz entsprechend Nukleotid 4841 bis 5153 der in SEQ ID No 1 angegebenen Nukleotidsequenz.
Die in der Genstruktur enthaltende Promotor und Terminatorsequenz wird aus der DNA-Sequenz der Glyzerinaidehydphosphat-Dehydrogenase (GAP-DH) aus Ashbya gossypii isoliert. Die Promotorsequenz wird durch einen Sall/Ndel-Verdau erhalten und resultiert in einem 359 bp langen Fragment von Nukleotid 2549 bis 2908 der in SEQ ID No 1 dargestellten Sequenz. Die Terminatorsequenz resultiert aus einem Restriktionsansatz mit Bglll und Sall. Sie umfaßt 649 bp entsprechend Nukleotid 4191 bis 4840 der in SEQ ID No 1 angegebenen Nukleotidsequenz. Das verwendete Cellulase-Gen aus Streptomyces halstedii (celA) umfaßt eine Sequenz von Nukleotid 2912 (entsprechend A des ATG-Codons) bis Nukleotid 4190 (entsprechend der nicht translatierten 3'-Region) und resultiert aus einem Restriktionsansatz mit BamHI und Ndel. Als Selektionsmarker dient eine Nukleotidsequenz, die für eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Kanamycin kodiert. Diese Sequenz umfaßt in SEQ ID No 1 die Nukleotide 442 bis 2542 und geht auf eine DNA- Sequenz aus dem E. coli-Transposon 903, erhalten durch einen Sall- Restriktionsverdau, zurück.
Die einzelnen Fragmente werden nach gängigen Methoden durch Ligation operativ verknüpft und zwar in folgender Reihenfolge: 5'-flankierede Sequenz aus Leu2 - Kanamycin-Resistenz (G418) - Promotor (GAP-DH) - CelA - Terminator (GAP-DH) - 3'-flankierende Sequenz aus SPL1.
Die Übertragung des Genkonstrukts in den Pilz Ashbya gossypii erfolgt durch Transformation nach der Methode von Wright und Phiiippsen, 1991 , Gene, 109: 99-105.
2. Selektion eines rekombinanten und Cellulase-produzierenden Ashbya gossypii-Stammes
Durch Ausplattierung des Transformationsansatzes auf Medium, welches als Antibiotikum 300 μg/ml Kanamycin G418 enthält werden die erfolgreich mit dem Genkonstrukt transformierten Wirtszellen selektioniert. Vermittelt durch die flankierenden Sequenzen des Leu2-Locus am 5'- und 3'-Ende der Genstruktur kann diese via homologer Rekombination in das Genom von Ashhya gossypii integrieren. Dadurch wird der Leu2-Locus der Wirtszelle zerstört, so daß die resultierenden rekombinanten Zellen eine Leucin-Auxotrophie aufweisen, die als Selektionsmarker genutzt wird. Ferner werden die Leucin-auxothrophen Zellen, die folglich nur auf Medium mit Leucin als Supplement wachsen, auf ihre Fähigkeit zur Cellulase-Produktion untersucht. Dazu werden die Zellen auf dem Medium MA2 (Forster, C, et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:9442-9448) kultiviert, das allerdings nur 0,1 % Hefeextrakt und zusätzlich 0,75% Carboxy- Methyl-Cellulose (low viscosity, Sigma) enthält. Die Zellen werden zum Wachstum 2 Tage bei 28 °C inkubiert. Anschließend werden die Kulturplatten wie bei Teather, R.M. and Wood, P.J., 1982, Appl. Environ. Microbiol., 43:777-780 beschrieben mit Kongo-Rot angefärbt. Als Beweis der erfolgreichen Integration und Expression des Cellulase-Gens im Genom von Ashbya gossypii zeigen die rekombinanten Zellen einen deutlichen Lysehof (Fig. 2).
Beschreibung der Figuren:
Fig. 1 : Schematische Darstellung des Genkonstrukts zur Integration in das Genom von Ashbya gossypii via homologer Rekombination
AgLeu2: Leu2-Gen aus Ashbya gossypii kodierend für die 3-lsopropyl-
Malat-Dehydrogenase
G418: Kanamycin-Resistenz-Gen
GPDp Promotor der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus
A. gossypii celA Cellulase-Gen aus Streptomyces halstedii
GPDt Terminator der Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus A. gossypii
AgSPLI SPL1-Gen aus Ashbya gossypii kodierend für einen an der
Reifung der tRNA beteiligten Faktor, organisiert im Leu2-
Locus von A. gossypii
Fig. 2: Wachstum der rekombinanten und Cellulase exprimierenden Ashbya gossypi-Stämme Cel-1 und Cel-2 sowie des Wildtyps
ATCC 10895 auf einer Agarplatte enthaltend Carboxy-
Methyl-Cellulose. Durch Anfärbung mit Kongo-Rot wird die
Lyse der Carboxy-Methyl-Cellulose als Lysehof sichtbar.
SEQ ID No 1 : Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Gen- Struktur, enthaltend von
Nukleotid 1 bis 8: Pme I-Restriktionsschnittstelle Nukleotid 9 bis 435: Leu2-Gen aus Ashbya gossypii kodierend für die 3-lsopropyl-Malat-Dehydrogenase
Nukleotid 436 bis 441 : Sal I-Restriktionsschnittstelle Nukleotid 442 bis 2542: Kanamycin-Resistenz-Gen Nukleotid 2543 bis 2548: Sal l-Restriktionsschnittstelle Nukleotid 2549 bis 2908: Promotor der Glyzerinaldehydphosphat- Dehydrogenase aus Ashbya gossypii
Nukleotid 2909 bis 2914 Nde I-Restriktionsschnittstelle Nukleotid 2912 bis 4190 Cellulase-Gen aus Streptomyces halstedii Nukleotid 4191 bis 4840 Transkriptions-Terminator der
Glyzerinaidehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii
Nukleotid 4841 bis 5153: SPL1-Gen aus Ashbya gossypii kodierend für einen an der Reifung der tRNA beteiligten Faktor, organisiert im Leu2-Genlocus von Ashbya gossypii Nukleotid 5154 bis 5161 : Pme I-Restriktionsschnittstelle

Claims

Patentansprüche:
1. Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya zur biotechnischen Herstellung von Proteinen d a d u r c h g e k e n n ze i c h n et, daß er eine derartige Genstruktur aufweist, daß er eine Proteinsyntheseieistung aufweist, die gegenüber derjenigen eines Wildtyps der Species Ashbya gossypii ATCC10895 verändert ist.
2. Mikroorganismus nach Anspruch 1 d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß er Proteine synthetisiert, die der Wildtyp der Species Ashbya gossypii ATCC 10895 nicht produziert.
3. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 oder 2, d a d u rc h g eke n nzei c h net, daß er eine gegenüber dem Wildtyp der Species Ashbya gossypii ATCC 10895 erhöhte Proteinsyntheseieistung aufweist.
4. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß er Cellulase synthetisiert.
5. Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß er ein Pilz der Spezies Ashbya gossypii ist.
6. Cellulase-Gen zum Einsatz in einem Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einer für eine Aminosäuresequenz und deren Allelvariationen kodierenden Nukleotidsequenz aus Streptomyces halstedii.
Cellulase-Gen nach Anspruch 6 mit einer für die in SEQ ID No 1 von Nukleotid 2912 bis 4190 angegebenen für eine Aminosäuresequenz kodierenden Nukleotidsequenz oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA-Sequenz.
8. Cellulase-Gen nach einem der Ansprüche 6 oder 7 mit einem vorgeschalteten Promotor, der eine Expression in einem Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya ermöglicht.
9. Cellulase-Gen nach einem der Ansprüche 6 bis 8 mit diesem zugeordneten und operativ verknüpften regulatorischen Gensequenzen.
10. Promotor aus der Nukleotidsequenz kodierend für die Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii.
11. Promotor nach Anspruch 10 mit der in SEQ ID No 1 von Nukleotid 2549 bis Nukleotid 2908 angegebenen DNA-Sequenz oder einer im wesentlichen gleichwirkenden Nukleotidsequenz.
12. Transkriptions-Terminator aus der Nukleotidsequenz kodierend für die Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase aus Ashbya gossypii.
13. Transkriptions-Terminator nach Anspruch 12 mit der in SEQ ID No 1 von Nukleotid 4191 bis Nukleotid 4840 angegebenen DNA- Sequenz oder einer im wesentlichen gleichwirkenden Nukleotidsequenz.
14. Gen-Struktur enthaltend ein Ceilulase-Gen gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 sowie diesem Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen, die eine Expression in einem Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya ermöglichen.
15. Gen-Struktur nach Anspruch 14 enthaltend einen Promotor gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11 und/oder einen Transkriptions- Terminator gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 aus der
Nukleotidsequenz kodierend für die Glyzerinaldehydphosphat- Dehydrogenase aus Ashbya gossypii oder im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen.
16. Gen-Struktur nach einem der Ansprüche 14 oder 15 enthaltend an beiden Enden Nukleotidsequenzen aus dem Genom von Ashbya gossypii.
17. Vektor enthaltend ein Cellulase-Gen gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9 und/oder einen Promotor gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11 und/oder einen Transkriptions-Terminator gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 oder eine Gen-Struktur nach einem der Ansprüche 14 bis 16 sowie zusätzliche Regulationssignale zur Replikation des Vektors in der Wirtszelle oder zur Integration in dessen Genom.
18. Transformierter Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya zur Herstellung von Cellulase enthaltend in repiizierbarer Form eine Gen-Struktur nach einem der Ansprüche 14 bis 16.
19. Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 18 enthaltend einen Vektor nach Anspruch 17.
20. Verfahren zur Herstellung von Proteinen, dad u rch geke n nzeichnet, daß ein Mikoorganismus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 eingesetzt wird.
21. Verfahren zur Herstellung eines Proteine produzierenden Mikroorganismus aus der Gattung Ashbya, dad u rch geken n z e i c h n e t, daß er so verändert wird, daß er eine
Proteinsyntheseieistung aufweist, die gegenüber derjenigen eines Wildtyps der Species Ashbya gossypii ATCC10895 verändert ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeich ne t, daß der Mikroorganismus Proteine produziert, die der Wildtyp der Species Ashbya gossypii ATCC10895 nicht produziert.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 oder 22, dadurch geken nzeichnet, daß die Veränderung des Mikroorganismus mittels gentechnischer Methoden erfolgt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch geken nzeich net, daß die Veränderung des Organismus durch Austausch des Promotors und/oder Erhöhung der Genkopienzahl erzielt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch geken nzeichnet, daß durch die Einfügung des Cellulase-Gens das Enzym erzeugt wird.
26. Proteine d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et, daß sie nach einem Verfahren gemäß Anspruch 20 hergestellt werden.
27. Verwendung des Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5 sowie 18 und 19 zur Herstellung von Proteinen, insbesondere Cellulase.
28. Verwendung der Gen-Struktur nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Herstellung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche
1 bis 5 sowie 18 und 19.
29. Verwendung des Vektors nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 5 sowie 18 und 19.
30. Verwendung der Proteine in Bereichen der Papierindustrie, Medizin, Nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie, Waschmittelindustrie oder als Katalysatoren.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5541086A (en) * 1986-12-31 1996-07-30 Lucky, Ltd. Method for the production of porcine growth hormone using a synthetic gene in yeast cells
WO1999001544A1 (en) * 1997-07-04 1999-01-14 Novo Nordisk A/S FAMILY 6 ENDO-1,4-β-GLUCANASE VARIANTS AND CLEANING COMPOSIT IONS CONTAINING THEM
EP0927761A2 (de) * 1997-12-23 1999-07-07 Basf Aktiengesellschaft Gene der Purinbiosyntese aus Ashbya gossypii und deren Verwendung in der mikrobiellen Riboflavinsynthese

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5541086A (en) * 1986-12-31 1996-07-30 Lucky, Ltd. Method for the production of porcine growth hormone using a synthetic gene in yeast cells
WO1999001544A1 (en) * 1997-07-04 1999-01-14 Novo Nordisk A/S FAMILY 6 ENDO-1,4-β-GLUCANASE VARIANTS AND CLEANING COMPOSIT IONS CONTAINING THEM
EP0927761A2 (de) * 1997-12-23 1999-07-07 Basf Aktiengesellschaft Gene der Purinbiosyntese aus Ashbya gossypii und deren Verwendung in der mikrobiellen Riboflavinsynthese
WO1999033993A1 (de) * 1997-12-23 1999-07-08 Basf Aktiengesellschaft Promotor aus ashbya gossypii

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERNANDEZ-ABALOS ET AL.: "Cloning and nucleotide sequence of CelA1, and endo-beta-1,4-glucanase-encoding gene from Streptomyces halstedii JM8", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 174, no. 20, October 1992 (1992-10-01), pages 6368 - 6376, XP000981938 *

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