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WO2001021792A1 - Transporter genes oatp-b, c, d and e - Google Patents

Transporter genes oatp-b, c, d and e Download PDF

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Publication number
WO2001021792A1
WO2001021792A1 PCT/JP2000/006416 JP0006416W WO0121792A1 WO 2001021792 A1 WO2001021792 A1 WO 2001021792A1 JP 0006416 W JP0006416 W JP 0006416W WO 0121792 A1 WO0121792 A1 WO 0121792A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
dna
0atp
cell
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2000/006416
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jun-Ichi Nezu
Asuka Ose
Akira Tsuji
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Chugai Research Institute for Molecular Medicine Inc
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Chugai Research Institute for Molecular Medicine Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd, Chugai Research Institute for Molecular Medicine Inc filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority to EP00961115A priority Critical patent/EP1223217A4/en
Priority to AU73174/00A priority patent/AU7317400A/en
Priority to JP2001525350A priority patent/JP4838961B2/ja
Publication of WO2001021792A1 publication Critical patent/WO2001021792A1/ja
Priority to US10/101,921 priority patent/US7045316B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US11/337,061 priority patent/US20060121523A1/en
Priority to US12/759,605 priority patent/US8748128B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a transport family involved in transporting a substance from outside a cell to inside a cell or from inside a cell to outside a cell.
  • transporters present in biological membranes in the uptake mechanism of nutrients and endogenous substances into cells and the transport mechanism have been elucidated (Tsuji, A. and Tamai, I., Pharm. Res., 13, 963-977, 1996. All of these transporters have the ability to recognize the structure of the substance to be transported, and selectively transport the substance.However, in the case of a transporter whose structure recognition is relatively wide, it is essentially a xenobiotic. It is considered that certain drugs are misrecognized and actively transported into cells.
  • drug permeation through biological membranes follows simple diffusion, which depends on physicochemical properties such as molecular size, lipophilicity, and hydrogen bonding ability.
  • ionic drugs only non-dissociated -It was thought to permeate through biological membranes according to the distribution hypothesis.
  • kidney tubule, placenta, epithelial cells of the choroid plexus, hepatic parenchymal cells, blood-brain barrier, etc. which require efficient intracellular and extracellular substance exchange activities, many drugs are specific other than simple diffusion.
  • a transporter is used as a method for bringing organ selectivity to pharmacokinetics. That is, it is considered that organ-specific drug delivery (DDS) using a transporter is possible. Improving the absorption of drugs by relying on simple diffusion by increasing the lipophilicity is likely to increase the first-pass effect in the liver and nonspecifically increase organ transport.
  • drug design using the transporter's substrate specificity could increase drug absorption independently of lipophilicity (Kiyomi Hayashi et al .: Drug Delivery System ⁇ 11, 205). -213, 1996.).
  • it is essential to identify many transport proteins at the molecular level and conduct detailed analysis of their properties. Difficulty and function measurement Due to the complexity, identification at the molecular level is much slower than many membrane physiology studies.
  • 0CT2 was identified by homologous cloning based on the sequence of 0CT1 (Okuda, M, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, 500-507, 1996.).
  • 0CT1 and 0CT2 show a very high homology of 67% to each other (Gêtmann, D. et al., J. Biol. Chem. 272, 10408-10413, 1997.). In both cases, strong expression is observed in the kidney.
  • 0CT1 other expression is present in the liver, colon and small intestine, whereas 0CT2 is specific to the kidney and has a different tissue distribution.
  • This transporter is a protein that has the ability to transport various endogenous substances and foreign foreign substances independently of sodium ions. It is known that the substances transported by 0ATP-A include bromosulfophthalein, bile acids, and steroid hormones. PGT, which has the ability to transport prostaglandins, also shows significant homology to 0ATP-A,
  • An object of the present invention is to provide a novel transporter gene belonging to 0ATP family, a protein encoded by the gene, and use thereof.o
  • the present inventors query the sequence of human 0ATP transport protein (Gastroenterology 109 (4), 1274-1282 (1995)) (hereinafter referred to as OATP-A) in order to find a gene encoding a novel transporter.
  • Human EST Expressed Sequence Tag
  • NCBI National Center Biotechnology Information, URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/index.html
  • URL: http: //www.ri cbi .nlm.nih.gov / blast / blast.cgi As a result, several ESTs capable of encoding an amino acid sequence having significant homology to human 0ATP-A were found.
  • human 0ATP-A is a transporter protein that has the ability to transport various endogenous substances and foreign substances in a sodium ion-independent manner, and it includes promoters, broinosulfophthalein, bile acids, and steroid hormones. It is known to transport such things.
  • PGT which has the ability to transport prostaglandins, also shows significant homology to 0ATP-A.
  • the novel 0ATP family member found in the present invention also has a function of regulating a substance necessary for a living body or an in vivo concentration of an unnecessary substance.
  • the present inventors have revealed that 0ATP-C has the ability to transport a pharmaceutical // lactam antibiotic. From this, it is presumed that the drug which is originally a foreign substance from the outside of the body may be taken up or excreted into cells by the 0ATP family protein. Therefore, pharmacokinetics can be controlled, and drugs with higher absorbency can be rapidly designed or screened by using the transport characteristics such as the substrate specificity of the 0ATP family protein and its biodistribution. It is believed that there is.
  • 0ATP-E is highly expressed in various solid cancer cells, but extremely low in blood cells. If a screening system using the OATP-E gene is constructed and an anticancer agent that is specifically taken into cells by 0ATP-E can be obtained by performing screening using this gene, it will damage blood cells. Is expected to be a reduced anticancer agent.
  • the present inventors found the following three SNPs with amino acid changes in healthy individuals.
  • OATP-B gene polymorphism at codon 486 (tct: Ser or ttt: Phe)
  • 0ATP-C gene codon 174 Polymorphism (gtg: Val or gcg: Ala) in addition to these polymorphisms in the 0ATP family gene, which may be related to the phenotype.
  • a genetic diagnosis for detecting polymorphisms and mutations of the 0ATP family-one gene as described above.
  • genetic diagnosis can be performed by using the 0ATP family one gene itself, or by using a synthetic oligonucleotide prepared from its base sequence as a primer for PCR.
  • the gene structure has been improved by DNA chip technology or DNA array technology (Nat Ge net. 1999 volume 21 Supplement pp 1-60; Science 1999 Jan 1; 283 (5398): 83-7). And the amount of expression can be detected more easily.
  • These methods can also be carried out by using the 0ATP family one gene itself or by using a synthetic oligonucleotide prepared from the base sequence.
  • the present invention relates to novel transposable 0ATP-B, C, D, and E, and their genes, and their uses.
  • (c) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added; DNA.
  • the method for producing a protein or peptide according to (5) comprising a step of culturing the transformed cell according to (4) and recovering a protein expressed from the cell or a culture supernatant thereof.
  • a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7, or a complementary strand thereof,
  • nucleotide sequences of the novel human transporter "0ATP-B”, “0ATP-Cj,” 0ATP-D “, and” 0ATP-E "cDNAs isolated by the present inventors are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively.
  • 5, and 7 and the amino acid sequences of the proteins encoded by the cDNA are shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8, respectively. Both of these proteins have structural similarity to human 0ATP-A transpoin and are considered to form a family ("0ATP" family) with each other.
  • the transport system of the present invention has a function of adjusting the concentration of substances necessary for living organisms and unnecessary substances in vivo.
  • various drugs may be taken up or excreted into cells by the 0ATP family protein. Therefore, it is considered that pharmacokinetics can be controlled using the 0ATP family protein, and a drug with higher absorbability can be rapidly designed or screened.
  • the transporter proteins of the present invention include mutants of the above-mentioned human transporter “0ATP-B”, “0ATP-C”, “0ATP-D”, and “0ATP-E” proteins.
  • “Variant” is a native “0A TP-B”, “0ATP-C”, “0ATP-D”, or “0ATP-E” protein of SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 Refers to a protein having an amino acid sequence in which the amino acid is mutated by substitution, deletion, addition, insertion or the like in the amino acid sequence, but having transport activity. Amino acid mutations in proteins can be artificial or can occur in nature.
  • “having a transporter activity” means that a protein has an activity of transporting an organic compound.
  • the organic compound include estradiol-17B-glucuronide, estrone-3-sulfate, and benzyl. Nisillin, prostaglandin E2, and the like, but are not limited thereto.
  • the “transporting activity” includes not only the activity of transporting an organic compound from outside the cell to the inside of the cell, but also the activity of the organic compound from inside the cell to outside the cell. It is intended to include the activity of transporting.
  • the transporter proteins of the present invention include those having both of these activities and those having any one of these activities.
  • the activity of a protein to transport an organic compound can be measured, for example, by adding a labeled organic compound to cells and detecting its uptake or excretion. For example, it can be detected by the method described in the embodiment.
  • the present inventors have found the following three types of SNPs in a healthy subject during the cloning process of the 0ATP family gene, with the following three types of amino acid changes.
  • the transporter of the present invention includes a protein having the above mutation, that is, a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid at position 486 of SEQ ID NO: 2 is substituted with Phe.
  • proteins consisting of an amino acid sequence in which the amino acid at position 130 of SEQ ID NO: 4 is substituted with Asp, and proteins consisting of an amino acid sequence in which the amino acid at position 174 of SEQ ID NO: 4 is substituted with Ala .
  • polymorphisms other than the above exist in “0ATP-B”, “0ATP-C”, “0ATP-D”, and “0ATP-E”. -Includes polymorphisms B, 0ATP-C, 0ATP-D, and 0ATP-E. These polymorphisms affect the expression or activity of the transpo-ichii and may be related to the phenotype. However, if the relationship between the 0ATP family gene and its phenotypic trait becomes clearer, it will be possible to perform genetic diagnosis by detecting polymorphisms and mutations in the 0ATP family gene.
  • methods for modifying the amino acid include, for example, a site-directed mutagenesis system using PCR (GIBCO-BRL, Gaithersburg, Maryland), a site-specific method using an oligonucleotide. Mutagenesis (Kramer, W. and Fritz, HJ (1987) Methods in Enzymol., 154: 350-367), and the Kunkel method (Methods Enzymol. 85, 2763-2766 (1988)).
  • the number of amino acid mutations and mutation sites are not particularly limited, as long as the transporter activity of the protein of the present invention is maintained.
  • the number of mutations is usually within 10 amino acids, preferably within 6 amino acids, and more preferably within 3 amino acids.
  • the amino acid residue to be mutated is desirably mutated to another amino acid that preserves the properties of the amino acid side chain.
  • amino acid side chains include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, WY, V) and hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl-containing side chains (S, ⁇ , ⁇ ), sulfur-containing side chains
  • Amino acids having side chains H, F, Y, W
  • All brackets indicate one-letter amino acids).
  • the isolated proteins include fusion proteins comprising the human "0ATP-B”, “0ATP-C”, “0ATP-D”, or "0ATP-E” proteins.
  • the fusion protein is a fusion of the human ⁇ OATP-Bj, '' ⁇ 0ATP-C, '' ⁇ 0ATP-D, '' or ⁇ 0ATP-E '' protein with another peptide or protein, and is included in the present invention. .
  • the method for producing the fusion protein is based on the method of the present invention, wherein the human “0ATP-B”, “0ATP- (:),“ 0ATP-D ”or
  • the DNA encoding the “0ATP-E” protein and the DNA encoding the other peptide or protein may be ligated in such a way that their frames match, introduced into an expression vector, and expressed in the host. Techniques known to those skilled in the art can be used. Other peptides or proteins to be fused with the protein of the present invention are not particularly limited.
  • peptides to be fused to the protein of the present invention include, for example, FLAG (Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), and six His (histidine). 6 xHis, 10 xHis, influenza agglutinin (HA), human c-myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag ⁇ HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment
  • HA influenza agglutinin
  • human c-myc fragment c-myc fragment
  • VSV-GP fragment c-myc fragment
  • pl8HIV fragment agglutinin
  • T7-tag ⁇ HSV-tag ⁇ HSV-tag
  • E-tag SV40T antigen fragment
  • Well-known peptides such as lck tag, fragment of human tubulin, B-tag, and fragment of Protein C can be used.
  • proteins to be fused with the protein of the present invention include, for example, GST (glutathione-S-transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, galactosidase, MBP (Maltose binding protein).
  • a fusion protein can be prepared by fusing a commercially available DNA encoding the peptide or protein with the DNA encoding the protein of the present invention, and expressing the fusion DNA prepared thereby.
  • the transporter protein of the present invention has a high structural homology with the human “0ATP-B”, “0ATP-C”, “0ATP-D”, or “0ATP-E” protein, Proteins having porter activity are included.
  • proteins include, for example, human ⁇ -Bj, ⁇ -Cj, ⁇ -Dj, or “0ATP-E” Proteins from other mammals corresponding to the proteins are included.
  • Methods for isolating a protein having a high structural homology with the human ⁇ 0ATP-B '', ⁇ -Cj, ⁇ 0ATP-D '', or ⁇ -E j protein include, for example, hybridization technology (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed.
  • MAs from other mammals with high homology to this can be isolated by utilizing the affinity between DNAs, and the target protein can be prepared from the isolated DNAs.
  • Other organisms include, but are not limited to, monkeys, mice, rats, rabbits, egrets, sea lions, bush, dogs, cats, etc.
  • Hybridases for isolating such DNA An example of the conditions for the immobilization (stringent conditions) is as follows: "Prehybridization was performed at 55 ° C for 30 minutes or more using ExpressHyb Hybridization Solutionj (manufactured by CL0NTECH). After the labeled professional And then keeping the mixture at 37 ° C to 55 ° C for at least 1 hour to perform hybridization.After that, three washes for 20 minutes at room temperature in 2xSSC and 0.1% SDS, and then lxSSC Wash once in 0.1% SDS at 37 ° C for 20 minutes.
  • “ExpressHyb Hybridization Solutionj manufactured by CL0NTECH” is used. After performing prehybridization at 60 ° C. for 30 minutes or more, a labeled probe is added. Hybridization is performed by incubating for at least 1 hour at 60 ° C, followed by 3 washes in 2xSSC, 0.1% SDS for 20 minutes at room temperature, then in lxSSC, 0.13 ⁇ 4SDS at 50 ° C. Perform two 20 minute washes.
  • ExpressHyb Hybridization Solutionj manufactured by CL0NTECH
  • the labeled probe is added. 1 hour or less at ° C Hybridization is performed by keeping the temperature above. Then, wash three times in 2xSSC, 0.1% SDS at room temperature for 20 minutes, and then twice in O.lxSS 0.1% SDS at 50 ° C for 20 minutes.
  • a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize the same stringency by appropriately selecting these factors. It is possible.
  • Proteins isolated using such a hybridization technique—polymerase chain reaction technique are human “0ATP-B”, “0ATP-C”, “0ATP-D”, or
  • High homology is at least 80% or more, preferably 90% or more, and more preferably 95% or more homology at the amino acid level.
  • sequence homology refer to the literature (Wi lbur,
  • the protein of the present invention may vary in amino acid sequence, molecular weight, isoelectric point, presence / absence and form of sugar chains, etc., depending on the cell or host producing the protein or the purification method described below. However, as long as the obtained protein has transport activity, it is included in the present invention.
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein or as a natural protein by methods known to those skilled in the art. If it is a recombinant protein, a DNA encoding the protein of the present invention (for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) is inserted into an appropriate expression vector, and After recovering the transformant obtained by introducing into an appropriate host cell and obtaining an extract, Chromatography, ion exchange, reverse phase, gel filtration, or the like, or affinity chromatography in which an antibody against the protein of the present invention is immobilized on a column, or a combination of a plurality of these columns. It can be purified and prepared.
  • a DNA encoding the protein of the present invention for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7
  • an appropriate expression vector After recovering the transformant obtained by introducing into an appropriate host cell and obtaining an extract, Chromatography, ion exchange
  • the protein of the present invention is expressed in a host cell (for example, an animal cell or Escherichia coli) as a fusion protein with glutathione S-transferase protein or as a recombinant protein to which a plurality of histidines are added.
  • a host cell for example, an animal cell or Escherichia coli
  • the expressed recombinant protein can be purified using a glutathione column or a nickel column.
  • a region of the fusion protein other than the target protein can be cleaved with thrombin or factor-1Xa and removed.
  • the protein is a natural protein, a method known to those skilled in the art, for example, an antibody to which an antibody that binds to the protein of the present invention binds to an extract of a tissue or cell expressing the protein of the present invention, which will be described later. Isolation can be achieved by using a two-tea column for purification.
  • the antibody may be a polyclonal or monoclonal antibody.
  • the present invention also includes partial peptides of the protein of the present invention.
  • the partial peptide comprising an amino acid sequence specific to a protein of the present invention comprises at least 7 amino acids, preferably 8 amino acids or more, more preferably 9 amino acids or more.
  • the partial peptide can be used, for example, for producing an antibody against the protein of the present invention, screening for a compound that binds to the protein of the present invention, and for screening for a promoter or inhibitor of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the protein of the present invention includes, for example, a partial peptide comprising a functional domain of a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8.
  • hydrophobic and hydrophilic regions estimated from the hydrophobicity plot analysis
  • a partial peptide containing a plurality of regions may be used. These partial peptides may include a part or all of one hydrophobic region, or may include a part or all of one hydrophilic region.
  • the partial peptide of the present invention can be produced by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • the peptide may be synthesized by, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the DNA encoding the protein of the present invention is used for in vivo and in vitro production of the protein of the present invention as described above, and is also caused by, for example, an abnormality in the gene encoding the protein of the present invention. It is also conceivable to apply the present invention to gene therapy for diseases that are treated or diseases that can be treated by the protein of the present invention.
  • the DNA of the present invention may be in any form as long as it can encode the protein of the present invention. That is, it does not matter whether it is cDNA synthesized from mRNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA. Also, as long as it can encode the protein of the present invention, MA having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included.
  • the DNA of the present invention can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • a cMA library is prepared from cells expressing the protein of the present invention, and hybridized using a part of the DNA sequence of the present invention (eg, SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) as a probe. It can be prepared by carrying out a dissolution.
  • the cDNA library may be prepared, for example, by the method described in Sambrook, J. et al., Molecular Clonings Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), or a commercially available DNA library may be used.
  • A is prepared from cells expressing the protein of the present invention, converted into cDNA by reverse transcriptase, and added to the sequence of the DNA of the present invention (for example, SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7). It can also be prepared by synthesizing an oligo DNA based on the DNA and performing a PCR reaction using this as a primer to amplify cDNA encoding the protein of the present invention. Further, by determining the nucleotide sequence of the obtained cDNA, the translation region encoded by the cDNA can be determined, and the amino acid sequence of the protein of the present invention can be obtained. Genomic DNA can be isolated by screening a genomic DNA library using the obtained cDNA as a probe.
  • mRNA is isolated from cells, tissues, and organs that express the protein of the present invention.
  • mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), and AGPC method (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Prepare total MA using Biochem. (1987) 162, 156-159) and purify mRNA from total RNA using mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • CDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis can also be carried out using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Shi-Dai-gaku Kogyo) or the like.
  • the 5, -RACE method Frohman, MA
  • the 5, -Ampli FINDER RACE Kit manufactured by Clontech
  • the polymerase chain reaction polymerase chain reaction; PCR.
  • a target DNA fragment is prepared from the obtained PCR product, and ligated to vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into E. coli, etc., and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA can be confirmed by a known method, for example, a dideoxynucleotide chain-one-minute method.
  • a nucleotide sequence with higher expression efficiency can be designed in consideration of the codon usage of the host used for expression (Grantham, R. et al.). al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74).
  • the DNA of the present invention can be modified by using an original kit or a known method. Examples of the modification include digestion with a restriction enzyme, insertion of a synthetic oligonucleotide or an appropriate DNA fragment, addition of a linker, insertion of an initiation codon (ATG) and / or a termination codon (TM, TGA, or TAG). Is mentioned.
  • the DNA of the present invention is a DNA consisting of the base A at position 179 to the base G at position 2305 in the base sequence of SEQ ID NO: 1, and the base sequence of position A to position 2172 from base A at position 100 in the base sequence of SEQ ID NO: 3.
  • DNA consisting of the base T of SEQ ID NO: 5 DNA consisting of the base A at position 1 to base 2130 in the base sequence of SEQ ID NO: 5, and the base sequence consisting of base A at position 2257 to base 2257 of the base sequence of SEQ ID NO: 7 DNA consisting of C.
  • the DNA of the present invention is a DNA consisting of a nucleotide sequence in which C at position 1635 in the nucleotide sequence from nucleotide A at position 179 to nucleotide G at position 2305 in SEQ ID NO: 1 has been substituted with T, DNA consisting of a nucleotide sequence in which A at position 487 is replaced by G in the nucleotide sequence of nucleotide T from position A to nucleotide 2172, nucleotide sequence of nucleotide T from position 100 to nucleotide 2172 in SEQ ID NO: 3 And DNA comprising a nucleotide sequence in which T at position 620 is replaced with C.
  • the DNA of the present invention is a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7, and includes a DNA encoding a protein having transport enzyme activity.
  • the conditions for hybridization include the above conditions.
  • the hybridizing DNA is preferably a naturally occurring MA, such as a cDNA or a chromosomal DNA.
  • the present invention also provides a vector into which the DNA of the present invention has been inserted.
  • the vector of the present invention is useful for retaining the DNA of the present invention in a host cell or expressing the protein of the present invention.
  • a vector for example, when Escherichia coli is used as a host, the vector is amplified in large amounts in Escherichia coli (for example, JM109, DH5, HB10U XLlBlue) or the like and prepared in large quantities. Therefore, a drug resistant gene that has an “ori” to be amplified in Escherichia coli and that can be distinguished by a transformed Escherichia coli selection gene (eg, a drug (eg, ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol)) ) Is not particularly limited.
  • a drug eg, ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol
  • vectors examples include M13-based vectors, pUC-based vectors, pBR322, pBluescript ⁇ pCR-Script, and the like.
  • pGEM-T pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned in addition to the above vectors.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the expression vector may have the above-described characteristics such that the vector is amplified in E. coli, and may be used in a host such as JM109, DH5, HB10K XLl-Blue, etc.
  • promoters that can be efficiently expressed in Escherichia coli such as lacZ promoter overnight (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) ), AraB Promo Yuichi (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), or T7 Promo Yuichi is essential.
  • Such vectors include pGEX-5 ⁇ -1 (Pharmacia), QIAexpress systemj (Qiagen), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase in addition to the above vectors).
  • BL21 is preferred.
  • the signal sequence may include a signal sequence for polypeptide secretion.
  • the pelB signal sequence (Lei, SP, et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used for production in the periplasm of Escherichia coli.
  • the introduction of the vector into the host cell can be performed using, for example, the calcium chloride method or the electroporation method.
  • a mammalian expression vector for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen)
  • pEGF-BOS Nucleic Acids. Res.
  • Expression base Kuta one for example r Bac - to - BAC baculovirus expression systemj (GIBCO BRL Co., Ltd.), pBacPAK8) of origin, plant-derived expression vectors (for example ⁇ 1, pMH2), Kuta one base expression derived from animal viruses (for example, pHSV, pMV, pAdexLc), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (eg, rpichia Expression Kitj (manufactured by In vitrogen), pNVU, SP-Q01), Bacillus subtilis-based expression vectors (For example, pPL608, pKTH50).
  • plant-derived expression vectors for example ⁇ 1, pMH2
  • Kuta one base expression derived from animal viruses for example, pHSV, pMV, pAdexLc
  • retrovirus-derived expression vectors eg, pZIPneo
  • promoters necessary for expression in cells for example, SV40 Promoter (Muligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR promoter, EF1 hypromo Ichiichi (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CV promo Ichiichi, etc. It is more preferable to have a gene for selection of conversion (for example, a drug resistance gene that can be identified by a drug (neomycin, G418, etc.)). Examples of vectors having such characteristics include p band, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV ⁇ p0P13, and the like.
  • a vector having a DHFR gene complementing the nucleic acid synthesis pathway-deficient CH0 cell. Eg, pCHOI
  • MTX methotrexate
  • a gene expressing the SV40 T antigen is An example is a method in which COS cells on the chromosome are used to transform with a vector (such as pcD) having an SV40 origin of replication.
  • a vector such as pcD
  • the replication origin those derived from poliovirus, adenovirus, ⁇ papilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is used as a selection marker, and aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) Gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the DNA of the present invention is incorporated into an appropriate vector, and for example, a retrovirus method, a ribosome method, a cationic liposome method, an adenovirus method, or the like is used. And other methods.
  • a retrovirus method for example, a ribosome method, a cationic liposome method, an adenovirus method, or the like is used.
  • the vector used include, but are not limited to, an adenovirus vector (for example, pAdexlcw) and a retrovirus vector (for example, pZIPneo).
  • General genetic manipulations, such as the insertion of the DNA of the present invention into the vector can be performed in a conventional manner (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • Administration into a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.
  • the present invention also provides a transformed cell into which the DNA of the present invention or the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and for example, Escherichia coli and various animal cells can be used.
  • the transformed cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing the protein of the present invention.
  • Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems. Examples of the in vitro production system include a production system using eukaryotic cells and a production system using prokaryotic cells.
  • Animal cells include mammalian cells such as CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), COS, 3T3, Kazuma Mie, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, amphibian cells, such as African Drosophila oocytes (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340) or insect cells such as Sf9, Sf21, and Tn5 are known.
  • Examples of CH0 cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the vector can be introduced into a host cell by, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using Cationic ribosome D0TAP (manufactured by Boehringer Mannheim), an electoral poration method, or a lipofection method. is there. Purification of the recombinant protein from the obtained transformant can be performed by a conventional method, for example, a method described in the document “The Qiaexpressionist handbook, Qiagen, Hiden, Germany”.
  • Nicotiana tabacum As plant cells, for example, cells derived from Nicotiana tabacum (Nicotiana tabacum) are known as protein production systems, which can be cultured in callus.
  • Fungal cells include yeast, for example, the genus Saccharomyces, for example, Saccharomyces cerevisiae, filamentous fungi, for example, the genus Aspergillus, for example, Aspergillus niger gersp. are known.
  • bacteria cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • bacterial cells include Escherichia coli (E. coli), for example, JM109, 'DH5hi, HB101, and the like, and Bacillus subtilis.
  • the protein is obtained by transforming these cells with the desired DNA and culturing the transformed cells in vitro.
  • the culturing can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPM 11640, IMDM can be used as a culture solution of animal cells.
  • a serum supplement such as fetal calf serum (FCS) can be used together, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during culturing is preferably about 6-8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary.
  • examples of a system for producing a protein in vivo include a production system using an animal and a production system using a plant. These animals or plants are Introduce DNA to produce proteins in animals or plants and collect them.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mice When using animals, there are production systems using mammals and insects. As mammals, goats, bushes, hidges, mice, and mice can be used (Vicki Glasser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). When a mammal is used, a transgenic animal can be used.
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a protein that is specifically produced in milk, such as goat casein.
  • the DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transplanted into a female goat.
  • the target protein can be obtained from milk produced by the transgenic goat born from the goat that has received the embryo or its progeny. Hormones may optionally be used in transgenic goats to increase the amount of milk containing proteins produced by the transgenic goats (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699- 702).
  • silkworms can be used as insects, for example.
  • the target protein can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which DNA encoding the target protein has been inserted (Sus Awake, M. et al. ., Nature (1985) 315, 592-594).
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • the DNA encoding the target protein is introduced into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. I do.
  • This bacterium can be infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, to obtain the desired polypeptide from the leaves of this tobacco (Julian ⁇ -a et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
  • the protein of the present invention thus obtained can be isolated from the inside or outside of a transformed cell (such as a culture medium) and purified as a substantially pure and homogeneous protein.
  • the separation and purification of the protein may be performed by any of the separation and purification methods used in ordinary protein purification, and is not limited in any way. For example, chromatographic columns, filters, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. O Selection and combination can separate and purify proteins o
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion-exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reversed-phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein). Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographys can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. The present invention also includes highly purified proteins using these purification methods.
  • the protein can be arbitrarily modified or partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purifying the protein.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, glucosidase and the like are used.
  • the present invention also provides an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and includes a monoclonal antibody as well as a polyclonal antibody.
  • the protein of the present invention used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is not limited to the animal species from which it is derived, but is preferably a protein derived from a mammal, such as a human, a mouse or a rat, and particularly preferably a protein derived from a human. .
  • a human-derived protein can be obtained using the gene sequence or amino acid sequence disclosed herein.
  • the protein used as the sensitizing antigen may be a complete protein or a partial peptide of the protein.
  • partial peptides of the protein include amino (N) terminal fragments and protein (C) terminal fragments of proteins.
  • antibody refers to an antibody that reacts with the full length or fragment of a protein.
  • a gene encoding the protein of the present invention or a fragment thereof is inserted into a known expression vector system, and the vector is used to transform the host cell described in the present specification.
  • the fragment may be obtained by a known method, and these may be used as a sensitizing antigen.
  • cells expressing the protein, a lysate thereof, or a chemically synthesized protein of the present invention may be used as the sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. In general, rodents are used. Eyes, egrets, and primates are used.
  • mice for example, mice, rats, hamsters and the like are used.
  • a heronoid animal for example, a heron is used.
  • monkeys are used as primates.
  • monkeys of the lower nose for example, cynomolgus monkeys, macaques, baboons, chimpanzees, etc. are used.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, etc.
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • the sensitizing antigen mixed with an appropriate amount of the incomplete adjuvant is administered several times every 4 to 21 days.
  • a suitable carrier can be used at the time of immunization with the sensitizing antigen. After immunization in this manner, it is confirmed by a conventional method that the level of the desired antibody in the serum is increased. , 9 o
  • the blood of the mammal sensitized with the antigen is taken out.
  • the serum is separated from the blood by a known method.
  • a serum containing the polyclonal antibody may be used.
  • a fraction containing the polyclonal antibody may be further isolated from the serum and used. For example, using an affinity column to which the protein of the present invention is coupled, a fraction that recognizes only the protein of the present invention is obtained, and this fraction is further purified using a protein A or protein G column.
  • immunoglobulin G or M can be prepared.
  • the immune cells may be removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • preferred immune cells used for cell fusion include splenocytes in particular.
  • the other parent cell to be fused with the immunocyte is preferably a mammalian myeloma cell, more preferably a myeloma cell that has acquired the properties for fusion cell selection by a drug.
  • Cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed according to a known method, for example, the method of Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). It can be carried out.
  • the hybridoma obtained by cell fusion is selected by culturing in a conventional selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • the HAT Culture in the culture solution is carried out for a time sufficient to kill cells other than the desired hybridoma (non-fused cells), usually for several days to several weeks.
  • a conventional limiting dilution method is performed to screen and clone a hybridoma producing the desired antibody.
  • human lymphocytes for example, human lymphocytes infected with EB virus are sensitized in vitro with proteins, protein-expressing cells or lysates thereof. It is also possible to fuse a sensitized lymphocyte with a human-derived myeloma cell capable of permanent division, such as U266, to obtain a hybridoma that produces a desired human antibody having a protein binding activity (see 63-63). No. 17688).
  • the obtained hybridoma is transplanted into the peritoneal cavity of a mouse, ascites is collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody is subjected to, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G column, DEAE ion exchange chromatography, and the present invention. It can be prepared by purifying the above protein using an affinity column to which coupling has been applied.
  • the antibody of the present invention is used for purification and detection of the protein of the present invention, and is also a candidate for an agonist and an angelist of the protein of the present invention. It is also conceivable to apply this antibody to antibody therapy for diseases involving the protein of the present invention.
  • a human antibody or a humanized antibody is preferable in order to reduce immunogenicity.
  • a transgenic animal having a human antibody gene repertoire is immunized with a protein serving as an antigen, a protein-expressing cell or a lysate thereof to obtain an antibody-producing cell, and a hybridoma obtained by fusing the cell with a myeloma cell is obtained.
  • a protein serving as an antigen for example, a protein-expressing cell or a lysate thereof to obtain an antibody-producing cell, and a hybridoma obtained by fusing the cell with a myeloma cell is obtained.
  • Can be used to obtain human antibodies against the protein see International Publication Nos. W092-03918, W093-2227, W094-02602, W094-25585, W096-33735, and W096-34096).
  • cells in which immune cells such as sensitized lymphocytes that produce antibodies are immortalized with oncogenes may be used.
  • the monoclonal antibody thus obtained can also be obtained as a recombinant antibody produced using a genetic recombination technique (for example, Borrebaeck, CAK and Larrick, J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in see the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • Recombinant antibodies are produced by cloning DNA encoding the same from immune cells such as hybridomas or sensitized lymphocytes that produce the antibody, inserting the DNA into an appropriate vector, and introducing this into a host.
  • the present invention includes this recombinant antibody.
  • the antibody of the present invention may be an antibody fragment or a modified antibody thereof as long as it binds to the protein of the present invention.
  • an antibody fragment Fab, F (ab ') 2, Fv or a single chain Fv (scFv) obtained by linking Fvs of an H chain and an L chain with an appropriate linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883).
  • an antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragment is constructed and introduced into an expression vector.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • the modified antibody an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used.
  • the “antibody” of the present invention also includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by subjecting the obtained antibody to chemical modification. These methods are already established in this field.
  • the antibody of the present invention can be prepared by using a chimeric antibody comprising a non-human antibody-derived variable region and a human antibody-derived constant region or a non-human antibody-derived CDR (complementarity determining region) and a human It can be obtained as a humanized antibody consisting of antibody-derived FR (framework region) and constant region.
  • the antibody obtained as described above can be purified to homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody used in the present invention may be performed by the separation and purification methods used for ordinary proteins.
  • antibodies can be separated by appropriately selecting and combining chromatographic columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but are not limited thereto.
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by absorbance measurement or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • Columns used for affinity chromatography include Protein A column and Protein G column.
  • columns using a protein A column include Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia), etc.
  • chromatography other than affinity chromatography examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Characterization). Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographys can be performed using liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • Methods for measuring the antigen-binding activity of the antibody of the present invention include, for example, measurement of absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), EIA (enzyme-linked immunosorbent assay), and RIA (radioimmunoassay). Immunoassay) or a fluorescent antibody method can be used.
  • the protein of the present invention is added to a plate on which the antibody of the present invention is immobilized, and then a sample containing the target antibody, for example, a culture supernatant of antibody-producing cells or a purified antibody is added.
  • a secondary antibody that recognizes an enzyme for example, an antibody labeled with alkaline phosphatase
  • incubate the plate wash the plate
  • add an enzyme substrate such as P-nitrophenyl phosphate
  • Activity can be assessed.
  • a protein fragment for example, a C-terminal fragment or an N-terminal fragment thereof may be used.
  • BIAcore Pharmacia
  • the antibody of the present invention is brought into contact with a sample expected to contain the protein of the present invention contained in the sample, and an immune complex of the antibody and the protein is detected or measured.
  • the method for detecting or measuring the protein of the present invention can be carried out. Since the protein detection or measurement method of the present invention can specifically detect or measure a protein, it is useful for various experiments and the like using proteins.
  • the present invention also provides a MA (SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7) encoding human "0ATP-B", “0ATP-C”, “0ATP-D”, or “0ATP-E” protein or Provide a polynucleotide comprising at least 15 nucleotides complementary to the complementary strand.
  • the term "complementary strand” refers to the other strand of one strand of a double-stranded DNA consisting of A: T, G: C base pairs. Refers to the chain.
  • complementary is not limited to a case where the sequence is completely complementary to at least 15 contiguous nucleotide regions, but is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably 95% or more base It suffices if they have sequence homology.
  • the algorithm described in this specification may be used as an algorithm for determining homology.
  • Such DNA includes probes and primers used for detection and amplification of the DNA encoding the protein of the present invention, nucleotides or nucleotide derivatives for suppressing the expression of the protein of the present invention (for example, antisense oligonucleotides). Nucleotides). Such DNA can also be used for producing DNA chips.
  • the region on the 3 ′ side can be complemented, and a restriction enzyme recognition sequence or a fragment can be added to the 5 ′ side.
  • Antisense oligonucleotides include, for example, antisense oligonucleotides that hybridize to the bases of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7, or any other positions.
  • This antisense oligonucleotide is preferably an antisense oligonucleotide to at least 15 or more consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7. More preferably, derivatives or modifications thereof can be used as antisense oligonucleotides in which at least 15 consecutive nucleotides contain a translation initiation codon.
  • modified product examples include a modified lower alkyl phosphonate such as a methylphosphonate type or an ethylphosphonate type, a phosphorothioate modified product, a phosphoroamidate modified product, and the like.
  • Antisense oligonucleotides include not only those whose nucleotides corresponding to nucleotides constituting a predetermined region of DNA or mRNA are all complementary sequences, but also that of DNA or mRNA and oligonucleotides having SEQ ID NO: 1, 3, 5, Alternatively, one or more nucleotide mismatches may be present as long as they can specifically hybridize to the nucleotide sequence shown in 7.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention acts on cells producing the protein of the present invention to inhibit transcription or translation thereof by binding to MA or mAA that encodes the protein, By suppressing the expression of the protein of the present invention, for example, by promoting the degradation of mRNA, it has the effect of suppressing the action of the protein of the present invention.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be mixed with a suitable base material which is inactive against the derivative to prepare an external preparation such as a liniment or a poultice.
  • excipients may be added to tablets, splinters, granules, capsules, ribosome capsules, It can be a lyophilized agent such as a propellant, a liquid, a nasal drop and the like. These can be prepared according to a conventional method.
  • the antisense oligonucleotide derivative of the present invention is applied directly to an affected area of a patient, or is applied to a patient so as to be able to reach the affected area as a result of intravenous administration or the like.
  • an antisense-encapsulated material that enhances durability and membrane permeability can be used.
  • ribosome, poly-L-lysine, ribido, cholesterol, lipofectin, or derivatives thereof can be mentioned.
  • the dosage of the antisense oligonucleotide derivative of the present invention can be appropriately adjusted according to the condition of the patient, and a preferred amount can be used. For example, it can be administered in the range of 0.1 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 50 mg / kg.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention inhibits the expression of the protein of the present invention, and is therefore useful in suppressing the biological activity of the protein of the present invention. Further, the expression inhibitor containing the antisense oligonucleotide of the present invention is useful in that it can suppress the biological activity of the protein of the present invention. Controlling the absorption and pharmacokinetics of drugs in the body using porter proteins. Transport tamper of the present invention By analyzing the substrate specificity of proteins in detail, it is possible to design drugs that can be transported by this transporter, and thereby enhance the absorption of drugs through the transposable protein of the present invention. It is considered possible.
  • the drug to be designed does not require the conventional modification to increase lipophilicity, it is thought that a water-soluble drug that can be easily handled can be rapidly and efficiently developed.
  • organ-specific drug delivery is possible.
  • an ideal drug delivery system DDS
  • the substrate specificity of the transport protein of the present invention should be considered.
  • 0ATP-E is highly expressed in various solid cancer cells, but has extremely low expression in blood cells. If a screening system using the 0ATP-E gene is constructed and an anticancer agent that is specifically taken into the cell by the 0ATP-E can be obtained by performing screening using the gene, it will be applied to blood cells. It is expected that the anti-cancer drug can be used as an anti-cancer agent with reduced disorder.
  • the screening of the compound transported from the outside to the cell by the protein of the present invention can be performed, for example, as follows.
  • a cell that expresses the protein of the present invention on a cell membrane is provided.
  • a vector that expresses the protein of the present invention may be constructed and introduced into an appropriate cell.
  • the cell is contacted with a labeled test compound.
  • a labeled test compound for example, a low-molecular compound can be used.
  • the label of the test compound is not particularly limited as long as it can be detected, and examples thereof include a radiolabel and a fluorescent label.
  • the labeled test compound incorporated into the cells is detected.
  • Detection is based on radiolabeled compound
  • the radioactivity can be measured by a liquid scintillation counter or the like, and in the case of a fluorescently labeled compound, the fluorescence can be measured by a fluorometer or the like.
  • the amount of transport is measured by bioassay, which measures the biological activity (eg, cytotoxicity, cell growth promoting activity) of the compound taken up into cells by the protein of the present invention. be able to.
  • bioassay which measures the biological activity (eg, cytotoxicity, cell growth promoting activity) of the compound taken up into cells by the protein of the present invention. be able to.
  • a compound to be taken into the cell is selected. Specifically, this screening can be performed using, for example, the detection system for transport activity described in Example 3. The compound thus isolated can be used for the above-mentioned drug creation.
  • Another application of the present invention may be the development of drugs targeting the transporter protein of the present invention.
  • drugs targeting the transporter protein of the present invention Given the importance of transporters as a mechanism of absorption of nutrients and drugs, or as a mechanism of excretion of drugs and metabolites in the body, there are diseases caused by impaired functions or abnormally enhanced functions. It is thought that. For such diseases, compounds that inhibit or enhance the function of the transporter protein of the present invention, or that regulate the expression level or the protein level of the transporter gene of the present invention. Use of the compound as a drug is considered to be effective.
  • Screening of a compound that promotes or inhibits the transport activity of the protein of the present invention can be performed, for example, as follows. First, a cell that expresses the protein of the present invention on a cell membrane is provided. Next, the test compound and a labeled organic compound transported by the protein of the present invention are brought into contact with the cells. Examples of the organic compound to be used include, but are not limited to, estradiol-17B-glucuronide, estrone-3-sulfate, benzylpenicillin, prostaglandin E2, and the like. Next, the amount of the labeled organic compound incorporated into the cells is measured.
  • the Compounds that increase or decrease the amount of organic compound obtained are selected. Specifically, this screening can be performed, for example, by using the detection system for transport activity described in Example 3. As a result, if the amount of the labeled organic compound taken up into the cells by contact with the test compound increases, it is determined that the compound promotes the activity of transporting the protein organic compound of the present invention. . On the other hand, if the amount of the labeled organic compound taken up into the cell by contact with the test compound decreases, the compound is determined to inhibit the activity of the protein of the present invention to transport the organic compound.
  • the compound obtained by the screening of the present invention can be applied to drug treatment using the protein of the present invention, treatment through control of substance transport by the protein of the present invention, and the like.
  • a compound obtained by using the screening method of the present invention may have a part of its structure converted by addition, deletion and / or substitution.
  • the compound that binds to the protein of the present invention and the protein and its partial peptide of the present invention can be used in humans and mammals, such as mice, rats, guinea pigs, rabbits, chicks, cats, dogs, higgies, bush, When used as a medicament for pests, monkeys, baboons, and chimpanzees, besides directly administering the protein or the isolated compound itself to patients, formulating it by a known pharmaceutical method and administering it Is also possible.
  • tablets, capsules, elixirs, and micronized capsules which are sugar-coated as required, orally, or aseptic solution or suspension in water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of liquid injections.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically, sterile water or saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, flavoring agents, excipients, vehicles, Formulation may be made by combining with preservatives, binders, etc. as appropriate and mixing in unit dosage form as required by accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained.
  • Excipients that can be incorporated into tablets and capsules include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, and alginic acid.
  • Suitable leavening agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • the preparation unit form is forcepsel
  • the above-mentioned materials may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • a sterile composition for injection can be formulated using a potable vehicle such as distilled water for injection according to normal pharmaceutical practice.
  • Aqueous injection solutions include, for example, saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable solubilizing agents.
  • glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable solubilizing agents.
  • alcohols specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), and HCO-50 may be used in combination.
  • the oily liquid includes sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizer. It may also be combined with a buffer, for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • a buffer for example, a phosphate buffer, a sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, proforce hydrochloride, a stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, or an antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • Administration to patients can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., or intranasally, transbronchially, intramuscularly, transdermally, or orally by a method known to those skilled in the art. It can do better.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the compound can be encoded by DNA
  • the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy. Dosage and administration method depends on patient weight and age
  • the DNA of the present invention varies depending on age, symptoms, etc., and can be appropriately selected by those skilled in the art. Conceivable.
  • the DNA of the present invention When used for gene therapy, the DNA of the present invention is inserted into an adenovirus vector (for example, pAdexLcw) or retrovirus vector (for example, pZIPneo) and administered in vivo.
  • the administration method may be an ex vivo method or an in vivo method. It is also conceivable to administer the antisense synthetic DNA directly into a living body or by inserting the antisense synthetic DNA into the above-mentioned vector for administration. Further, application to diagnosis of a disease caused by abnormal activity or expression level of the protein of the present invention can be considered.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of examining the expression of each 0ATP family gene in human fetal tissues and adult tissues by RT-PCR.
  • Adult spleen 25.
  • Adult bone marrow 26
  • Adult lymph nodes 27.
  • Adult tonsils 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of examining the expression of each 0ATP family gene in human cancer cells by the RT-PCR method.
  • Breast cancer cells GI-101
  • LX-1 Lung cancer cells
  • CX-1 Colorectal adenoma cells
  • PC3 Prostate tumor cells
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of transport experiments on various label bodies.
  • Fig. 3 shows the transport activity of various labeled forms in HEK293 cells transfected with OA TP-C (0ATP-C) and HEK293 cells transfected only with the vector (mock).
  • FIG. 4 shows the PCG transport activity at various concentrations of HEK293 cells expressing 0ATP-C.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of various / lactam antibiotics on the PCG transport activity of HEK293 cells expressing 0ATP-C. The activity in the control (no inhibitor) is expressed as 100%.
  • FIG. 6 is a graph showing the requirements for sodium ion and chloride ion in estradiol-17? -Glucuronide transport activity.
  • 0ATP-C represents the transport activity of estradiol-17? -Glucuronide in HEK293 cells into which 0ATP-C has been introduced
  • “Mock” represents HEK293 cells into which only vector has been introduced.
  • W1 9504 and AI052501 which are ESTs that can encode amino acid sequences that show significant homology to human OATP-A
  • 0ABE-1 primers (5 'gatag ag ctt ctg tgt ggc cca aga aga act gac 3, / SEQ ID NO: 9)
  • 0ABE-6 primer (5, gat aag ctt tac tgc tgt ggc tgc tac tct tgg 3, / SEQ ID NO: 10) were prepared.
  • human adult brain polyA + RNA PCR was performed using the native cDNA as type III to amplify OATP-B cDNA containing all ORFs.
  • the OATP-B cDNA amplified by PCR was cut with a Hind 111 site added to a primer, and inserted into a HindIII site of a PCDNA3 vector (Invitrogen), an expression vector for mammalian cells.
  • a clone having no PCR error (pcDNA3 / 0ATP-B) was selected by sequencing a plurality of clones and used for expression experiments.
  • QATP-C QATP-C
  • Each primer was prepared from the following EST base sequence which can encode an amino acid sequence showing significant homology with human 0ATP-A.
  • human 0ATP-C was cloned into three fragments.
  • the 5, side fragments were cloned by the 5, RACE (Rapid Amplification cDNA Ends) method.
  • RACE Rapid Amplification cDNA Ends
  • human fetal liver-derived Marathon-Ready TM cDNA (CL0NTECH) was used as a ⁇ -type, and PCR was performed using a combination of the API primer, which is a linker primer attached to the kit, and the 2893-4 primer to obtain human OATP-C cDNA.
  • the 5, side fragment about 400 bp, was amplified.
  • This cDNA fragment was integrated into a pT7Blue-T vector (Novagen) by the TA cloning method, and the obtained subclones were subjected to multiple sequencing to determine the sequence on the 5 'side of the human OATP-C cDNA.
  • the 3 'side was similarly cloned by the 3' RACE method.
  • the human fetal liver-derived Marathon-Ready TM cDNA is type I, and the API primer, a linker-primer attached to the kit, is used.
  • the 1.5-kbp fragment of human OATP-C cDNA about 1.5 kbp, was amplified by PCR using a combination of the primer and the 3863-1 primer.
  • This cDNA fragment was incorporated into the pT7Blue-T vector by the TA cloning method, and the resulting subclones were subjected to multiple sequencing to determine the 3′-side sequence of human 0ATP-C cDNA. Further, the central part sandwiched between them was made into human adult liver-derived cDNA type III and amplified by PCR using a combination of primers 2893-1 and 9414-2. The obtained 1.2 kbp fragment was purified by gel filtration, and the sequence was determined by direct sequencing. By combining the sequences thus obtained, the sequence of cDNA containing all 0RF of human OATP-C was determined.
  • the plasmid for expression was constructed as follows. That is, human adult liver-derived cDNA was type III, and human 0ATP-C was amplified into two fragments by PCR using the following primer combinations.
  • 0AHC17 primer— (5, gat ggt acc aaa ctg age ate aac aac aaa aac 3- / Rokki Column No .: 15)
  • 0AHC18 primer— (5, gat ggt acc cat cga gaa tea gta gga gtt ate 3, / Rokki Column No .: 16)
  • the 0224-3 primer (5, cgc cct cgt ggt ttt tga tgt age 3, / SEQ ID NO: 19) was prepared from EST AA280224 capable of encoding an amino acid sequence showing significant homology with human OATP-A. . Furthermore, it has been found that can encode the amino acid sequence showing a human 15 chromosome q26. 1 significant homology with human Bok OATP- A part of the sequence derived from regions of the PAC clone (P DJ430il9).
  • PAC15 2 primer (5 ′ gcg gt g cct tac tct tct tct ctt 3 ′ / SEQ ID NO: 20) was prepared. Using human adult brain-derived cDNA as type III, PCR was performed using these primers, and a cDNA fragment of about l.lkbp was amplified. Using this as a probe, screening was performed by a plaque hybridization method on a 5′-STRETCH PL US cDAN library (CLONTECH) derived from human adult kidney.
  • the phage suspension of the obtained positive clones was designated as type II, and the primers described above or the primers specific to the 0ATPD gene prepared from the identified sequence, and the GT10 prepared from the sequence of the gt-10 vector S1 primer (5, ctt ttg age aag ttc age ct 3, / SEQ ID NO: 21) or GT10 A1 primer (5, aga ggt ggc tta tga gta tttt ctt 3, / SEQ ID NO: 22) PCR was performed in combination with the above, and the sequence was determined by directly sequencing the amplified fragment. Furthermore, by performing screening using a DNA fragment containing the newly obtained region as a probe, the region to be identified by the phage clone was extended, and the sequence of all 0RF was determined.
  • human adult kidney-derived 5, -STRETCH PLUS cDAN library (CL0NT ECH) was screened by the plaque hybridization method.
  • the phage suspension of the obtained positive clone was designated as type ⁇ , and was prepared from the above primer 1 or a 0ATP-E gene-specific primer prepared from the sequence identified and the gt-10 vector sequence.
  • PCR was performed using a combination of the GT10 S1 primer or the GT10 A1 primer, and the sequence was determined by directly sequencing the amplified fragment. Furthermore, by performing screening using a DNA fragment containing the newly obtained region as a probe, the region covered by the phage clone was extended, and the sequence of all 0RF was determined.
  • the plasmid for expression was constructed as follows. That is, human OATP-E was separated into 5 ′ and 3 ′ fragments by PCR using the following combination of primers and amplified. The 5'-side fragment was amplified using cDNA derived from human adult lung, and the 3'-side fragment was amplified from human fetal lung derived cDNA as type III.
  • the cDNA used as the type I PCR was prepared using SUPERSCRIPT TM II RNase H—Reverse Transcriptase (GI BCO BRL) according to the general method recommended by the manufacturer. That is, 10 A / g of total A or 2 g of poly A + RNA and about lg of oligo dT primer (GIBCO BRL) or about 0.5 ⁇ g of random hexamer primer (G IBCO (BRL), heated at 70 ° C. for 10 minutes, and cooled with ice.
  • SUPERSCRIPT TM II RNase H—Reverse Transcriptase GI BCO BRL
  • a first strand buffer (GIBCO BRL), a final concentration of 10 mM DTT, a final concentration of 0.5 mM dNTPs (GIBCO BRL), and 400 U to 800 U of SUPERSCRIPT TM II RNase H "reverse transcriptase.
  • 42 CDNA synthesis was performed by incubating at 1 ° C for 1 hour. Then, the mixture was heated at 70 ° C for 15 minutes, and a part thereof was used as a ⁇ type.
  • DNA fragments amplified by PCR, or Agarosu and DNA fragments were purified from the gel after electrophoresis, Ready-to Go DNA label ling beads (Pharmacia , Inc.) random primer method by Non - 32 P] using labeled dCTP Hybridization used as a probe was performed by using ExpressHyb Hybridization Solution (CLONTECH) and keeping the temperature at 68 ° C for 2 hours or more according to the method recommended by the manufacturer. After hybridization, the filters were washed twice in 2X SSC, 0.1% SDS solution for 20 minutes at room temperature, and then washed in 0.1X SSC, 0.1% SDS solution for 50 minutes. Washing was performed twice at 20 ° C for 20 minutes.
  • 0AA-1 primer 1 (5, aag aag agg tea aga agg aaa aat 3, / SEQ ID NO: 29)
  • OAA-2 primer (5 'gga gca tea agg aac agt cag gtc 3, / Rooster column number: 30)
  • 0224-4 primer (5, agg gtc aga gta gag gca aag aac 3, / SEQ ID NO: 35)
  • Upstream primer (5, TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT 3, / SEQ ID NO: 37)
  • Downstream primer (5, CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC 3, / SEQ ID NO: 38)
  • MTC TM Multiple Tissue cDNA
  • PCR was performed using an appropriate amount of cell-derived cDNA as type I and the above primer.
  • the amplified product was analyzed by agarose gel electrophoresis ( Figures 1 and 2).
  • 0ATP-A showed a relatively localized expression pattern in the brain and liver. It was also found that OATP-C is localized in the liver in both fetal and adult tissues.
  • 0ATP-B, OATP-D, and 0ATP-E were expressed in a relatively wide range of tissues, but especially in OATP-B and 0ATP-E, the expression was extremely low in peripheral blood leukocytes, thymus, and spleen Became clear. This strongly suggests that 0ATP-B and OATP-E have low expression in blood cells. On the other hand, expression in cancer cells was regulated. As a result (FIG. 2), it was revealed that 0ATP-D and 0ATP-E are frequently expressed in cancer cells.
  • PCDNA3 / 0ATP-C and pcDNA3 vector (mock) containing no insert as a control were introduced into the human embryonic kidney-derived cell line HEK293 cells by the calcium phosphate method. That is, plasmid DNA10 ⁇ g, Hepes buffer (137mM NaCl, 5m M KC1, 0.7mM Na 2 HP0 4, 6mM dextrin Toro Ichisu, 21 mM Hepes pH7. 1) lml, 2M CaCl 2 62.5 ⁇ 1 was mixed and left at room temperature for 30 minutes or more to form a calcium phosphate coprecipitate.
  • PBS Pho sphate buffered sine
  • Transport experiments were performed using cells into which plasmid DNA had been introduced, according to the following procedure. Remove the cells using rubber policeman from the plate, transponder over preparative buffer (125mM NaC 4.8mM KC1, 5.6mM ( +) - glucose, 1.2mM CaCl 2, 1. 2mM K3 ⁇ 4P0 4, 1.2mM MgS0 4, Bae to 25mM (PH 7.4) and pre-incubated for 20 minutes.
  • preparative buffer 125mM NaC 4.8mM KC1, 5.6mM ( +) - glucose, 1.2mM CaCl 2, 1. 2mM K3 ⁇ 4P0 4, 1.2mM MgS0 4, Bae to 25mM (PH 7.4)
  • the uptake was measured when various concentrations of [ 14 C] PCG were added (Fig. 4).
  • the Km value was determined to be 983 ⁇ 289 ⁇ M by performing Lineweaver-Burk reciprocal plot on the amount of PCG uptake in cells expressing 0ATP-C.
  • the maximum reaction rate Vmax was determined to be 5.45 ⁇ 0.63 (nmol / mg / 15 min).

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Description

トランスポー夕一遺伝子 O A T P— B、 C、 D、 および E 技術分野
本発明は、 細胞外から細胞内へ、 あるいは細胞内から細胞外への物質の輸送に 関与するトランスポー夕一フアミリーに関する。 背景技術
栄養素や内因性物質の細胞内への取り込み機構において、 生体膜に存在する多 種の輸送担体 （トランスポーター） の関与と、 その輸送機構が最近明らかになり つつある（Tsuji, A. and Tamai , I . , Pharm. Res. , 13, 963-977, 1996 · )。 これ らのトランスポ一夕一には、 輸送される物質の構造認識能が備わっており、 物質 を選択的に輸送するが、 比較的その構造認識が広いトランスポーターの場合、 本 来は生体異物である医薬品などについても誤認識し、 積極的に細胞内へ輸送して しまうと考えられる。 基本的に薬物の生体膜透過は、 その分子サイズ、 脂溶性、 水素結合能などの物理化学的特性に依存する単純拡散に従っており、 特にイオン 性薬物の場合には、 非解離型分子のみが PH-分配仮説に従って生体膜を透過する と考えられていた。 しかし、 細胞内外の効率的な物質交換活性が必要な小腸、 腎 尿細管、 胎盤、 脳脈絡叢の上皮細胞や、 肝実質細胞、 血液脳関門などでは、 多く の薬物は単純拡散以外の特異的機構、 つまり トランスポーターによる能動的な輸 送により細胞膜を透過することが明らかとなってきた（玉井郁巳、 辻彰： フアル マシア、 31、 493-497、 1995.、 齋藤秀之、 乾賢一：医学のあゆみ、 179、 393-397 、 1996.、 玉井郁巳：薬物動態、 11、 642-650、 1996. )。 例えば、 非エステル型の 経口用 ラクタム抗生物質は生理的 pHにおいては両性または負に荷電し、 脂溶 性は極めて低いにも関わらず、 腸管からの吸収は良好であることが知られている 。 単離膜小胞系を用いた輸送研究により、 これらの薬物の吸収過程には、 刷子縁 膜に局在する H+駆動型べプチドトランスポー夕一が関与していることが示され るようになった（Okano， T. et al . ， J. Biol. Chem. 261, 14130-14134， 1986. ) 。 ぺプチド輸送系は、 ジあるいはトリべプチドを認識するが、 テトラべプチド以 上は認識できず、 ペプチドサイズについては極めて厳密であるものの、 非天然の アミノ酸からなるべプチドは認識するといつた比較的広い基質認識性を持つ。 ^ -ラク夕ム抗生物質のぺプチドトランスポー夕一による輸送も、 やはりこの広 い基質認識性ゆえの誤認識による輸送であり、 臨床的にはそれを図らずも利用し ていたことになる (Tsuji, A. , American Chemical Society (eds. Taylor, M. D . , Amidon, G. L. ) , Washington, D. C , 101-134, 1995. )。 さらには、 脂溶性の 高い脂肪酸のような物質の生体膜透過においても、 トランスポー夕一が関与して いる可能性が報告されている（Schaffer, J. and Lodish, Hリ Cell, 79, 427-43 6， 1994. )。
ところで、 様々なトランスポー夕一は各臓器、 細胞が持つ生理的役割に応じて 備わっているはずであり、 その分布や機能には臓器特異性が期待される。 従って 、 薬物動態に臓器選択性をもたらす手法としてトランスポーターを利用すること が期待できる。 すなわち、 トランスポーターを利用した臓器特異的薬物デリバリ 一 (DDS)が可能であると考えられる。 また、 脂溶性をあげることによる単純拡散 に頼った薬物の吸収性改善は、 肝臓における初回通過効果を増大させたり、 臓器 移行性を非特異的に増大させる可能性が高い。 しかし、 トランスポーターの基質 特異性を利用したドラッグデザインを行うことにより、 脂溶性とは無関係に薬物 の吸収性を高めることも可能であると考えられる（林喜代美 他： Drug Delivery System^ 11、 205-213、 1996. )。 このような目的のためには、 多くのトランスポ 一夕一を分子レベルで同定し、 その性質についての詳細な解析を行うことが必須 であるが、 トランスポー夕一はその生化学的な取り扱いの難しさと、 機能測定の 複雑さから、 膜生理学的な研究の多さに比較し、 分子レベルでの同定が非常に遅 れている。
最近になり、 外来遺伝子発現系であるァフリカツメガエル (Xenopus)卵母細胞 を用いた発現クローニング法によりいくつかのトランスポ一夕一の cDNAがク口 一二ングされるようになり、 構造上の類似性が存在することが明らかになつてき た（Fei， Y. -J. et al .， Nature, 368, 563-566, 1994. )。 例えば、 1994年に Ko epsellらによって、 基底膜型と推定される有機カチオントランスポ一夕一 0CT1 が発現クロ一ニング法によってクローニングされた（Grundemann, D. et al .， Na ture, 372, 549-552, 1994. )。 その後、 0CT1の配列をもとにしたホモロジ一ク ローニングによって 0CT2が同定された（Okuda, M, et al .， Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, 500-507, 1996. )。 0CT1と 0CT2はお互いに 67%という非常に 高い相同性を示す (Grundemann, D. et al.， J. Biol . Chem. 272, 10408-10413 , 1997. )。 両者とも腎臓に強い発現が見られるが、 0CT1の場合はそれ以外にも 肝臓、 結腸、 小腸に発現が存在するのに対し、 0CT2は腎臓に特異的であり、 組 織分布も異なっている。
また、 別のトランスポー夕一としては、 ヒト 0ATP トランスポーター （以降、
ΓΟΑΤΡ-Aj と称する。 Gastroenterology 109 (4), 1274-1282 ( 1995 )) が知られ ている。 このトランスポ一夕一はナトリウムイオン非依存的に様々な内因物質や 外来異物を輸送する能力を持つタンパクである。 0ATP-Aによって輸送される物 質にはブロモスルフオフ夕レイン （bromosulfophthalein) 、 胆汁酸、 ステロイ ドホルモンなどがあることが知られている。 また、 プロスタグランジンを輸送す る能力を持つ PGTも 0ATP- Aに有意な相同性を示し、 これらは遺伝子フアミリー
(0ATPファミリ一） を形成していると考えられる。
トランスポー夕一についての分子レベルでの同定については、 これら報告例を 含めわずかであり、 いまだ臨床上有用な多くの未知のトランスポー夕一が存在し ていると考えられる。 発明の開示
本発明は、 0ATPフアミリーに属する新規なトランスポーター遺伝子および該 遺伝子がコードするタンパク質、 並びにそれらの用途を提供することを課題とす る o
本発明者らは、 新規トランスポーターをコードする遺伝子を見いだす目的で、 ヒト 0ATP トランスポー夕一 (Gastroenterology 109 (4)， 1274-1282 ( 1995 )) (以下 OATP- Aとする） の配列をクエリ一とし、 アメリカ NCBI (National Cente r ror Biotechnology Information, URL: http://www.ncbi . nlm.nih.gov/index. html )のヒト EST (Expressed Sequence Tag) デ一夕ベース （URL : http://www.ri cbi .nlm.nih.gov/blast/blast. cgi )に対して tBLASTnサーチを試みた。 その結果 、 ヒト 0ATP-Aと有意な相同性を有するアミノ酸配列をコードし得る ESTがいく つか見いだされた。 次に、 これらの ESTの配列をクエリーとし再度デ一夕ペース をサーチしたところ、 既知であるヒト OATP- A遺伝子、 およびヒトプロス夕グラ ンジントランスポーター遺伝子 （J. Clin. Invest. 98 (5)， 1142-1149 ( 1996 ) ) (以下 PGTとする） 由来の ESTであると明らかに判定されるもの以外はいずれ も未知の遺伝子由来でありることが明らかとなり、 それらは未同定のトランスポ —夕一遺伝子由来の ESTであると考えられた。 そこで、 これらの ESTの配列を用 い、 その全長 cDNAのクロ一ニングを、 PCR法、 およびプラークハイブリダィゼ —シヨン法による cDNAライブラリーのスクリーニングにより試みた。 その結果 、 4つの新規なトランスポーター様タンパクをコードする遺伝子をクローニング することに成功した。 これらの遺伝子がコ一ドするタンパクはいずれもヒト 0AT P-Aに有意な相同性を示すことから、 これらの遺伝子をそれぞれ 0ATP-B， C， D, および Eと命名した。 tBLASTnサーチで見いだされていた ESTは、 全てヒト 0AT P-A, B, C, D, Eおよびヒト PGT遺伝子由来の ESTであることが判明した。 上述のように、 ヒト 0ATP-Aはナトリゥムイオン非依存的に様々な内因物質や 外来異物を輸送する能力を持つトランスポー夕一タンパク質であり、 プロモスル フオフ夕レイン （broinosulfophthalein) 、 胆汁酸、 ステロイ ドホルモンなどを 輸送することが知られている。 また、 プロスタグランジンを輸送する能力を持つ PGTも 0ATP- Aに有意な相同性を示す。 これらのトランスポーター遺伝子は遺伝 子ファミリー （0ATPファミリ一） を形成していると考えられ、 生体にとって不 要な物質の除去や、 様々な物質の生体内濃度の調節などに関与している可能性が 推測されている (J Biol Chem. 1998 Aug 28;273(35 ) :22395-401) 。
本発明において見いだされた新規 0ATPフアミリ一メンバーにおいても同様に 、 生体にとって必要な物質や、 あるいは不要な物質の生体内濃度を調節する機能 を持つことが推測される。 また、 本発明者らは、 0ATP-Cが医薬品である/?ラク タム系の抗生物質を輸送する能力を持つことを明らかにした。 このことから、 本 来は生体外異物である薬物も 0ATPフアミリータンパク質によって細胞内へ取り 込まれたり、 あるいは排出されている可能性が推測される。 従って、 0ATPファ ミリータンパク質の基質特異性などの輸送特性やその生体内分布を利用すること により、 薬物動態を制御したり、 より吸収性の高い薬物を迅速に設計、 あるいは スクリーニングすることが可能であると考えられる。 特に、 RT-PCR法による解 祈から、 0ATP-Eは様々な固形癌細胞に高発現しているが、 血球系細胞では極め て発現が少ないことが判明した。 OATP- E遺伝子を用いたスクリーニング系を構 築し、 これを用いたスクリーニングを行うことにより 0ATP-Eにより特異的に細 胞内へ取り込まれる抗癌剤を得ることができれば、 それは血球系細胞に対する障 害が軽減された抗癌剤となり得ることが期待される。
また、 0ATPフアミリータンパク質が薬物の生体内動態の制御に関与している とすると、 その遺伝的多型性により、 薬物動態が変化することが予想される。 既 に、 -塩基多型 (Single Nucleotide Polymorphism; SNP) などの遺伝子多型に より、 遺伝子の発現量や、 コードされるアミノ酸配列に個人差が生じることが知 られている (Nat Genet. 1999 Jul ;22(3) :231-8; Nat Genet. 1999 Jul ;22(3) :2 39-47) 。 OATPフアミリー遺伝子における遺伝子多型により、 輸送活性や基質特 異性などの輸送特性に個人差が生じ、 ひいては 0ATPフアミリーによって制御さ れている薬物などの生体内動態に個人差が生じることが予想される。 この様な個 人差により、 実際には、 特定の薬物の有効性、 反応性の差が生じることが推測さ れる。 よって、 0ATPフアミリー遺伝子における SNPなどの多型を詳細に調べ、 遺伝型と表現形質 （薬物に対する反応性） との関連に関する情報が蓄積されたな らば、 遺伝型を遺伝診断により調べることによって、 その個人の薬物に対する反 応性を推測することが可能になると考えられる。
実際、 本発明者らは、 0ATPファミリー遺伝子のクローニング過程において、 以下の 3種のアミノ酸変化を伴う SNPを健常人中に見いだした。
OATP- B遺伝子 486番目のコドンにおける多型 （tct： Ser、 あるいは ttt： Phe) OATP- C遺伝子 130番目のコドンにおける多型 （aat： Asn、 あるいは gat： Asp) 0ATP-C遺伝子 174番目のコドンにおける多型 （gtg : Val、 あるいは gcg : Ala) これら以外にも 0ATPフアミリー遺伝子中に多型が存在し、 表現形質と関連し ている可能性が推測される。
また、 この様な生体内における 0ATPフアミリータンパク質の重要な役割を鑑 みると、 その遺伝子変異による輸送機能の欠損に起因する疾患が存在することが 推測される。 実際、 有機カチオン卜ランスポー夕一の一つである 0CTN2 卜ランス ポ一夕一においては、 その遺伝子変異が全身性カルニチン欠乏症 （Systemic Car nitine Deficiency; SCD) の原因となっていることが明らかとなっており （Nat Genet. 1999 Jan;21( l ) : 91-4) s トランスポー夕一遺伝子の変異に起因する遺伝 性疾患が実際に存在することがわかっている。 この様なトランスポーター遺伝子 の変異に起因する遺伝性疾患については、 その原因となるトランスポーター遺伝 子を直接調べる遺伝子診断が臨床上非常に重要である。 本発明により明らかとなった 0ATPファミリ一遺伝子の構造を利用して、 以上 のような 0ATPファミリ一遺伝子の多型や変異を検出する遺伝子診断を行うこと が可能となった。 具体的には、 0ATPファミリ一遺伝子そのものを利用すること 、 あるいはその塩基配列から作製される合成オリゴヌクレオチドを PCRのプライ マーなどとして利用することにより遺伝子診断を実施することが可能である。 ま た、 最近では DNAチップ技術、 あるいは DNAアレイ技術と呼ばれる技術 （Nat Ge net. 1999 volume 21 Supplement pp 1 - 60; Science 1999 Jan 1 ;283( 5398) :8 3-7) により、 遺伝子の構造や発現量をより簡便に検出することが可能になって いる。 これらの方法も、 0ATPファミリ一遺伝子そのものを用いること、 あるい はその塩基配列から作製される合成オリゴヌクレオチドを用いることにより実施 することが可能である。
本発明は、 新規なトランスポ一夕一 0ATP-B、 C、 D、 および E、 およびその遺伝 子、 並びにそれらの用途に関し、 より具体的には、
1 . トランスポー夕一活性を有するタンパク質をコードする下記 （a ) から （ d ) のいずれかに記載の DNA
( a ) 配列番号： 2、 4、 6、 または 8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク 質をコードする DNA。
( b ) 配列番号： 1、 3、 5、 または 7に記載の塩基配列のコード領域を含む!） NA。
( c ) 配列番号： 2、 4、 6、 または 8に記載のアミノ酸配列において 1若しく は複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列か らなるタンパク質をコ一ドする DNA。
( d ) 配列番号： 1、 3、 5、 または 7に記載の塩基配列からなる DNAとハイブ リダィズする DNAo
2 . 配列番号： 2、 4、 6、 または 8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク 質の部分べプチドをコードする DNA、 3. (1) または （2) に記載の DNAが挿入されたぺク夕一、
4. (1) 若しくは （2) に記載の DNAまたは （3) に記載のベクタ一を保持 する形質転換細胞、 .
5. ( 1) または （2) に記載の DNAによりコードされるタンパク質またはぺプ チド、
6. (4) に記載の形質転換細胞を培養し、 該細胞またはその培養上清から発 現させたタンパク質を回収する工程を含む、 （5) に記載のタンパク質またはべ プチドの製造方法、
7. (5) に記載のタンパク質に結合する抗体、
8. 配列番号： 1、 3、 5、 または 7に記載の塩基配列からなる DNAまたはそ の相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
9. (5) に記載のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物を スクリーニングする方法であって、
(a) (5) に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に対し、 標識された披検化合物を接触させる工程、
(c) 該細胞内に取り込まれた、 標識された披検ィ匕合物を検出する工程、 および
(d) 該細胞内に取り込まれる化合物を選択する工程、 を含む方法、
10. (5) に記載のタンパク質のトランスポーター活性を促進または阻害す る化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) (5) に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に対し、 被検化合物および （5) に記載のタンパク質により輸送さ れる標識された有機化合物を接触させる工程、
(c) 該細胞内に取り込まれた、 標識された有機化合物の量を測定する工程、 お よび ( d ) 被検化合物非存在下において測定した場合 （対照） と比較して、 該細胞内 に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択 する工程、 を含む方法、 を提供するものである。
本発明者等により単離された新規なヒトトランスポーター 「0ATP-B」、 「0AT P-Cj、 「0ATP- D」 、 および 「0ATP- E」 cDNAの塩基配列をそれぞれ配列番号： 1 、 3、 5、 および 7に、 また、 該 cDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列 をそれぞれ配列番号： 2、 4、 6、 および 8に示す。 これらタンパク質は、 とも にヒト 0ATP- A 卜ランスポ一夕一と構造上の類似性を有しており、 互いにフアミ リー（ 「0ATP」 ファミリー）を形成していると考えられる。
本発明のトランスポー夕一は、 生体にとって必要な物質や不要な物質の生体内 濃度を調節する機能を持つことが推測される。 また、 様々な薬物も 0ATPフアミ リータンパク質によって細胞内へ取り込まれたり、 あるいは排出されている可能 性が推測される。 従って、 0ATPファミ リータンパク質を利用して薬物動態を制 御したり、 より吸収性の高い薬物を迅速に設計、 あるいはスクリーニングするこ とが可能であると考えられる。
本発明のトランスポータータンパク質には、 上記ヒトトランスポーター 「0AT P - B」、 「0ATP- C」、 「0ATP-D」 、 および「0ATP- E」 タンパク質の変異体が含ま れる。 「変異体」 とは、 配列番号： 2、 4、 6、 または 8に記載の天然型の 「0A TP-B」、 「0ATP- C」、 「0ATP-D」 、 または 「0ATP- E」 タンパク質のアミノ酸配列 においてアミノ酸が置換、 欠失、 付加、 挿入などにより変異したアミノ酸配列を 有するが、 トランスポー夕一活性を有しているタンパク質を指す。 タンパク質の アミノ酸の変異は人工的に行われたものでも、 自然界において生じたものでもよ い。
本発明において 「トランスポーター活性を有する」 とは、 タンパク質が有機化 合物を輸送する活性を有していることを指す。 有機化合物としては、 例えば、 ェ ス トラジオール- 17B-グルクロナイ ド、 エストロン- 3-スルフエ一ト、 ベンジルぺ ニシリン、 プロスタグランジン E2などが挙げられるが、 これらに制限されない また、 「輸送する活性」 には、 細胞外から細胞内へ有機化合物を輸送する活性 のみならず、 細胞内から細胞外へ有機化合物を輸送する活性をも含む意である。 本発明のトランスポータータンパク質には、 これら活性の双方を有するものおよ びいずれか一方を有するものが含まれる。 タンパク質の有機化合物を輸送する活 性は、 例えば、 標識した有機化合物を細胞に添加して、 その取りこみまたは排出 を検出することにより測定することができる。 例えば、 実施例記載の方法により 検出することが可能である。
本発明者らは、 0ATPファミリー遺伝子のクローニング過程において、 以下の 3 種のアミノ酸変化を伴う SNPを健常人中に見いだした。
0ATP- B遺伝子 486番目のコドンにおける多型 （tct： Ser、 あるいは ttt： Phe) 0ATP-C遺伝子 130番目のコドンにおける多型 （aat : Asn、 あるいは gat : Asp) OATP- C遺伝子 174番目のコドンにおける多型 （gtg： Val、 あるいは gcg： Ala) 本発明のトランスポーターには、 上記の変異を有するタンパク質、 すなわち、 配列番号： 2の 486位のアミノ酸が Pheに置換されたアミノ酸配列からなるタン パク質、 配列番号： 4の 130位のアミノ酸が Aspに置換されたアミノ酸配列から なるタンパク質、 および配列番号： 4の 174位のアミノ酸が Alaに置換されたァ ミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
「0ATP- B」、 「0ATP- C」、 「0ATP- D」 、 および 「0ATP- E」 には、 上記以外にも 多型が存在していると考えられ、 本発明には、 これら 「0ATP- B」、 「0ATP- C」、 「0ATP-D」 、 および 「0ATP- E」 の多型が含まれる。 これらの多型は、 トランスポ —夕一の発現量または活性に影響を及ぼし、 その表現形質と関連している可能性 が推測される。 、 0ATPファミリー遺伝子とその表現形質との関係がさらに明ら かとなれば、 0ATPファミリ一遺伝子の多型や変異を検出することにより遺伝子 診断を行うことが可能となると考えられる。 人為的にアミノ酸を改変する場合、 当業者に公知のアミノ酸を改変する方法と しては、 例えば、 PCRによる部位特異的変異誘発システム （GIBCO-BRL, Gaithers burg, Maryland) 、 オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法 （Kramer, W. and Fritz, HJ ( 1987) Methods in Enzymol . , 154:350-367)、 Kunkel法 (Method s Enzymol.85, 2763-2766( 1988)) などが挙げられる。 アミノ酸の変異数および変 異部位は本発明の夕ンパク質のトランスポーター活性が保持される限り特に制限 はない。 変異数は、 置換であれば、 通常、 10アミノ酸以内であり、 好ましくは 6 アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 3アミノ酸以内であると考えられる。 変異するアミノ酸残基においては、 アミノ酸側鎖の性質が保存されている別の アミノ酸に変異されることが望ましい。 例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎 水性アミノ酸 （A、 I、 L、 M、 F、 P、 W Y、 V) 、 親水性アミノ酸 （R、 D、 N、 C、 E 、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) 、 脂肪族側鎖を有するアミノ酸 （G、 A、 V、 L、 I、 P) 、 水 酸基含有側鎖を有するアミノ酸 （S、 Τ、 Υ) 、 硫黄原子含有側鎖を有するァミノ 酸 （C、 M) 、 カルボン酸及びアミ ド含有側鎖を有するアミノ酸 （D、 N、 E、 Q) 、 塩基含有側鎖を有するアミノ離 （R、 K、 Η) 、 芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W) を挙げることができる （括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記 を表す） 。
あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、 付加及び Z又 は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質が その生物学的活性を維持することはすでに知られている （Mark, D. F. et al .， Proc. Natl. Acad. Sci . USA ( 1984) 81， 5662-5666、 Zoller, . J. & Smith, M. Nucleic Acids Research ( 1982) 10， 6487-6500、 Wang, A. et al .， Sci en ce 224， 1431-1433、 Dalbadie-McFarland, G. et al .， Proc. Natl . Acad. Sc i. USA ( 1982) 79, 6409-6413) 。
ヒト 「0ATP- B」、 「0ATP-C」、 「0ATP-D」 、 または 「0ATP- E」 タンパク質のァ ミノ酸配列 （配列番号： 2、 4、 6、 または 8 ) に複数個のアミノ酸残基が付加 されたタンパク質には、 ヒト 「0ATP- B」、 「0ATP- C」、 「0ATP-D」 、 または 「0A TP- E」 タンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。 融合タンパク質は、 ヒト 「 OATP-Bj 、 「0ATP-C」、 「0ATP-D」 、 または 「0ATP- E」 タンパク質と他のぺプチ ド又はタンパク質とが融合したものであり、 本発明に含まれる。 融合タンパク質 を作製する方法は、 本発明のヒ卜 「0ATP- B」、 「0ATP- (：」 、 「0ATP-D」 、 または
「0ATP- E」 タンパク質をコ一ドする DNAと他のぺプチド又はタンパク質をコード する DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、 宿 主で発現させればよく、 当業者に公知の手法を用いることができる。 本発明の夕 ンパク質との融合に付される他のぺプチド又はタンパク質としては、 特に限定さ れない。
本発明の夕ンパク質との融合に付される他のぺブチドとしては、 例えば、 FLAG (Hopp, T. P. et al .， BioTechnology ( 1988) 6， 1204-1210) 、 6個の His (ヒ スチジン） 残基からなる 6 xHis、 10 xHis、 インフルエンザ凝集素 （HA) 、 ヒト c - mycの断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7- tagヽ HSV- tag、 E-tag、 SV40T 抗原の断片、 lck tag、 ひ- tubul inの断片、 B- tag、 Protein Cの断片等の公知の ペプチドを使用することができる。 また、 本発明のタンパク質との融合に付され る他のタンパク質としては、 例えば、 GST (グル夕チオン一 S—トランスフェラー ゼ） 、 HA (インフルエンザ凝集素） 、 ィムノグロブリン定常領域、 ガラクト シダーゼ、 MBP (マルトース結合タンパク質） 等が挙げられる。
市販されているこれらペプチドまたはタンパク質をコードする DNAを本発明の 夕ンパク質をコードする DNAと融合させ、 これにより調製された融合 DNAを発現 させることにより、 融合タンパク質を調製することができる。
また、 本発明のトランスポータータンパク質には、 上記ヒト 「0ATP-B」 、 「0A TP-C」、 「0ATP-D」 、 または 「0ATP- E」 タンパク質と構造上高い相同性を有し、 トランスポーター活性を有するタンパク質が含まれる。 このようなタンパク質と しては、 例えば、 ヒト ΓΟΑΤΡ-Bj、 ΓΟΑΤΡ-Cj、 ΓΟΑΤΡ-Dj 、 または 「0ATP- E」 タンパク質に対応する他の哺乳動物由来のタンパク質が含まれる。 ヒト 「0ATP-B 」、 ΓΟΑΤΡ-Cj、 「0ATP-D」 、 または ΓΟΑΤΡ-E j タンパク質と構造上高い相同性 を有するタンパク質を単離するための方法としては、 例えば、 ハイブリダィゼー シヨン技術 (Sambrook,J et al . , Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58,Cold Sp ring Harbor Lab. press, 1989) が挙げられる。 即ち、 上記ヒト 「0ATP - B」 、 「0A TP-Cj 、 ΓΟΑΤΡ-Dj 、 または ΟΑΤΡ-Ej タンパク質をコードする DNA配列 （配列 番号： 1、 3、 5、 もしくは 7 ) またはその一部を基に、 これと相同性の高い他 の哺乳動物由来の MAを、 DNA同士の親和性を利用して単離し、 単離した DNAか ら目的のタンパク質を調製することができる。 DNAの単離に用いる他の生物とし ては、 例えば、 サル、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ゥシ、 ブ夕、 ィヌ、 ネコなどが 挙げられるが、 これらに制限されない。 このような DNAを単離するためのハイブ リダイゼーションの条件 （ストリンジェントな条件） の例を示せば、 以下の如く である。 即ち、 「ExpressHyb Hybridization Solutionj (CL0NTECH社製）を用い 、 55°Cで 30分以上プレハイブリダィゼーシヨンを行った後、 標識したプロ一ブ を添加し、 37°Cから 55°Cで 1時間以上保温することによりハイプリダイゼーシ ヨンを行う。 その後、 2xSSC、 0.1% SDS中、 室温で 20分の洗浄を 3回、 次いで 、 lxSSC、 0.1% SDS中、 37°Cで 20分の洗浄を 1回行う。
より好ましい条件 （よりストリンジェン卜な条件） としては、 「ExpressHyb H ybridization Solutionj (CL0NTECH社製）を用い、 60°Cで 30分以上プレハイブ リダィゼ一シヨンを行った後、 標識したプローブを添加し、 60°Cで 1時間以上保 温することによりハイブリダィゼ一シヨンを行う。 その後、 2xSSC、 0.1% SDS中 、 室温で 20分の洗浄を 3回、 次いで、 lxSSC、 0.1¾ SDS中、 50°Cで 20分の洗浄 を 2回行う。
さらに好ましい条件 （さらにストリンジヱン卜な条件） としては、 「ExpressH yb Hybridization Solutionj (CL0NTECH社製）を用い、 68°Cで 30分以上プレハ ィプリダイゼ一ションを行った後、 標識したプローブを添加し、 68°Cで 1時間以 上保温することによりハイブリダィゼーシヨンを行う。 その後、 2xSSC、 0. 1% SD S中、 室温で 20分の洗浄を 3回、 次いで、 O. lxSS 0. 1% SDS中、 50°Cで 20分 の洗浄を 2回行う。 但し、 ハイブリダイゼ一ションのストリンジェンシ一に影響 する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、 当業者であればこれ ら要素を適宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能で ある。
また、 当業者であれば、 ハイブリダィゼ一シヨン技術以外にも、 例えば、 ポリ メラーゼ連鎖反応を利用した技術により、 同様に、 ヒト 「0ATP-B」 、 「0ATP- C」 、 「0ATP- D」 、 または 「0ATP-E」 遺伝子と高い相同性を有する遺伝子を単離し、 該遺伝子から目的のタンパク質を得ることが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術ゃポリメラ一ゼ連鎖反応技術を利用し て単離されるタンパク質は、 ヒト 「0ATP-B」、 「0ATP- C」、 「0ATP-D」 、 または
「0ATP-E」 タンパク質と高い相同性を有すると考えられる。 高い相同性は、 アミ ノ酸レベルにおいて、 少なくとも 80%以上、 好ましくは 90%以上、 さらに好ま しくは 95%以上の相同性である。 配列の相同性を決定するには、 文献 （Wi lbur,
W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl . Acad. Sci . USA ( 1983) 80， 726-730) に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明のタンパク質は、 後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法 により、 アミノ酸配列、 分子量、 等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る 。 しかしながら、 得られたタンパク質がトランスポー夕一活性を有している限り 、 本発明に含まれる。
本発明のタンパク質は、 当業者に公知の方法により、 組み換えタンパク質とし て、 また天然のタンパク質として調製することが可能である。 組み換えタンパク 質であれば、 本発明のタンパク質をコードする DNA (例えば配列番号： 1、 3、 5、 または 7に記載の塩基配列を有する DNA)を、 適当な発現ベクターに組み込 み、 これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、 抽出物を得た後 、 イオン交換、 逆相、 ゲル濾過などのクロマトグラフィー、 あるいは本発明の夕 ンパク質に対する抗体をカラムに固定したァフィ二ティークロマトグラフィーに かけることにより、 または、 さらにこれらのカラムを複数組み合わせることによ り精製し、 調製することが可能である。
また、 本発明のタンパク質をグル夕チオン S トランスフヱラーゼタンパク質と の融合タンパク質として、 あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパ ク質として宿主細胞 （例えば、 動物細胞や大腸菌など） 内で発現させた場合には 、 発現させた組み換えタンパク質はグル夕チオンカラムあるいはニッケルカラム を用いて精製することができる。
融合夕ンパク質の精製後、 必要に応じて融合夕ンパク質のうち目的の夕ンパク 質以外の領域を、 トロンビンまたはファクタ一 Xaなどにより切断し、 除去する ことも可能である。
天然のタンパク質であれば、 当業者に周知の方法、 例えば、 本発明のタンパク 質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、 後述する本発明のタンパク質に結 合する抗体が結合したァフィ二ティーカラムを作用させて精製することにより単 離することができる。 抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体 であってもよい。
本発明は、 また、 本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。 本発明の夕 ンパク質に特異的なァミノ酸配列からなる部分べプチドは、 少なくとも 7ァミノ 酸、 好ましくは 8ァミノ酸以上、 さらに好ましくは 9ァミノ酸以上のァミノ酸配 列からなる。 該部分ペプチドは、 例えば、 本発明のタンパク質に対する抗体の作 製、 本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、 本発明のタンパ ク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。 本発明のタンパク質の部 分ペプチドとしては、 例えば、 配列番号： 2、 4、 6、 または 8に示されるアミ ノ酸配列からなるタンパク質の機能ドメインからなる部分ペプチドなどが挙げら れる。 また、 疎水性プロット解析から推定される疎水性領域や親水性領域の 1つ あるいは複数の領域を含む部分べプチドが挙げられる。 これらの部分べプチドは 1つの疎水性領域の一部あるいは全部を含んでいてもよいし、 1つの親水性領域 の一部あるいは全部を含んでいてもよい。
本発明の部分ペプチドは、 遺伝子工学的手法、 公知のペプチド合成法、 あるい は本発明のタンパク質を適切なぺプチダ一ゼで切断することによって製造するこ とができる。 ペプチドの合成は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによ つてもよい。
本発明のタンパク質をコ一ドする DNAは、 上述したような本発明のタンパク質 の in vivo や in vitroにおける生産に利用される他、 例えば、 本発明のタン パク質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明のタンパク質により治 療可能な疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。 本発明の DNAは、 本発明 のタンパク質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。 即ち、 mRNA から合成された cDNAであるか、 ゲノム DNAであるか、 化学合成 DNAであるかな どを問わない。 また、 本発明のタンパク質をコードしうる限り、 遺伝暗号の縮重 に基づく任意の塩基配列を有する MAが含まれる。
本発明の DNAは、 当業者に公知の方法により調製することができる。 例えば、 本発明のタンパク質を発現している細胞より cMAライブラリ一を作製し、 本発 明の DNAの配列 （例えば、 配列番号： 1、 3、 5、 または 7 ) の一部をプローブ にしてハイブリダイゼーシヨンを行うことにより調製できる。 cDNAラィブラリ 一は、 例えば Sambrook, J. et al . , olecular Clonings Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989)に記載の方法により調製してもよいし、 市販の DNAラ イブラリーを用いてもよい。 また、 本発明のタンパク質を発現している細胞より Aを調製し、 逆転写酵素によって cDNAにした後、 本発明の DNAの配列 （例え ば、 配列番号： 1、 3、 5、 または 7 ) に基づいてオリゴ DNAを合成し、 これを プライマーとして用いて PCR反応を行い、 本発明のタンパク質をコードする cDN Aを増幅させることにより調製することも可能である。 また、 得られた cDNAの塩基配列を決定することにより、 それがコードする翻 訳領域を決定でき、 本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。 ま た、 得られた cDNAをプローブとしてゲノム DNAライブラリ一をスクリーニング することにより、 ゲノム DNAを単離することができる。
具体的には、 次のようにすればよい。 まず、 本発明のタンパク質を発現する細 胞、 組織、 臓器から、 mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al .， Biochemistry ( 1979) 18， 5294- 5299)、 AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N.， Anal . Biochem. ( 1987) 1 62, 156-159) 等により全 MAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia) 等を使用して全 RNAから mRNAを精製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) を用いることにより mRNAを直接調製することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生ィ匕学工業) 等を 用いて行うこともできる。 また、 本明細書に記載されたプライマー等を用いて、 5， - Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製）およびポリメラーゼ連鎖反応 （polyme rase chain reaction; PCR) を用いた 5， - RACE法 (Frohman, M. A. et al . , Proc . atl . Acad. Sci. U. S.A. ( 1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al . , Nu cleic Acids Res. ( 1989) 17， 2919-2932) にしたがい、 cDNAの合成および増幅 を行うことができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を調製し、 ベクタ一 DNAと連結する 。 さらに、 これより組換えベクターを作製し、 大腸菌等に導入してコロニーを選 択して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNAの塩基配列は、 公知の 方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェイン夕一ミネーシヨン法により確認 することができる。
また、 本発明の DNAにおいては、 発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮 して、 より発現効率の高い塩基配列を設計することができる （Grantham, R. et al . , Nucelic Acids Research ( 1981 ) 9, r43- 74) 。 また、 本発明の DNAは、 巿 版のキットや公知の方法によって改変することができる。 改変としては、 例えば 、 制限酵素による消化、 合成オリゴヌクレオチドや適当な DNAフラグメントの揷 入、 リンカ一の付加、 開始コドン （ATG) 及び/又は終止コドン （TM、 TGA、 又 は TAG) の挿入等が挙げられる。
本発明の DNAは、 具体的には、 配列番号： 1の塩基配列において 179位の塩基 Aから 2305位の塩基 Gからなる DNA、 配列番号： 3の塩基配列において 100位 の塩基 Aから 2172位の塩基 Tからなる DNA、 配列番号： 5の塩基配列において 1位の塩基 Aから 2130位の塩基 Aからなる DNA、 および配列番号： 7の塩基配 列において 92位の塩基 Aから 2257位の塩基 Cからなる DNAを包含する。
また、 本発明の DNAは、 配列番号： 1の 179位の塩基 Aから 2305位の塩基 G の塩基配列において 1635位の Cが Tに置換された塩基配列からなる DNA、 配列 番号： 3の 100位の塩基 Aから 2172位の塩基 Tの塩基配列において 487位の A が Gに置換された塩基配列からなる DNA、 配列番号： 3の 100位の塩基 Aから 21 72位の塩基 Tの塩基配列において 620位の Tが Cに置換された塩基配列からな る DNAを包含する。
本発明の DNAはまた、 配列番号： 1、 3、 5、 または 7に示す塩基配列からな る DNAとハイブリダィズする DNAであり、 トランスポー夕一活性を有するタンパ ク質をコードする DNAを含む。 ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 上記の 条件が挙げられる。 ハイブリダィズする DNAは、 好ましくは天然由来の MA、 例 えば cDNA又は染色体 DNAである。
本発明は、 また、 本発明の DNAが挿入されたべクタ一を提供する。 本発明のベ クタ一としては、 宿主細胞内において本発明の DNAを保持したり、 本発明のタン パク質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、 例えば、 大腸菌を宿主とする場合には、 ベクターを大腸菌 (例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB10U XLlBlue) などで大量に増幅させ大量調製する ために、 大腸菌で増幅されるための 「ori」 をもち、 さらに形質転換された大腸 菌の選抜遺伝子 （例えば、 なんらかの薬剤 （アンピシリンやテトラサイクリン、 カナマイシン、 クロラムフエ二コール） により判別できるような薬剤耐性遺伝子 ) を有すれば特に制限はない。 ベクターの例としては、 M13系べクタ一、 pUC系 ベクタ一、 pBR322, pBluescriptヽ pCR- Scriptなどが挙げられる。 また、 cDNAの サブクローニング、 切り出しを目的とした場合、 上記ベクターの他に、 例えば、 pGEM- T、 pDIRECT, pT7などが挙げられる。 本発明のタンパク質を生産する目的 においてベクタ一を使用する場合には、 特に、 発現べクタ一が有用である。 発現 ベクタ一としては、 例えば、 大腸菌での発現を目的とした場合は、 ベクタ一が大 腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、 宿主を JM109、 DH5ひ、 HB10K XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、 大腸菌で効率よく発現できるよ うなプロモーター、 例えば、 lacZプロモ一夕一 （Wardら， Nature ( 1989) 341, 544-546； FASEB J. ( 1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモー夕一 (Betterら， Sc ience ( 1988) 240， 1041-1043) 、 または T7プロモー夕一などを持っていること が不可欠である。 このようなベクターとしては、 上記ベクターの他に pGEX- 5Χ- 1 (Pharmacia社製） 、 「QIAexpress systemj (Qiagen社製） 、 pEGFP、 または p ET (この場合、 宿主は T7 RNAポリメラ一ゼを発現している BL21が好ましレ、）など が挙げられる。
また、 ぺク夕一には、 ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていて もよい。 タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズム に産生させる場合、 pelBシグナル配列 (Lei, S. P. et al J. Bacteriol . ( 198 7) 169， 4379) を使用すればよい。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば塩化 カルシウム法、 エレクトロポレーシヨン法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、 例えば、 本発明のタンパク質を製造するためのベクターとし ては、 哺乳動物由来の発現ベクター (例えば、 pcDNA3 ( Invitrogen社製） や、 p EGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18( 17), p5322)、 pEF、 pCDM8) 、 昆虫細胞 由来の発現べクタ一 (例えば rBac - to - BAC baculovirus expression systemj ( GIBCO BRL社製） 、 pBacPAK8) 、 植物由来の発現ベクター （例えば ρΜΗ1、 pMH2) 、 動物ウィルス由来の発現べクタ一 （例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLc ) 、 レトロ ウィルス由来の発現ベクター （例えば、 pZIPneo) 、 酵母由来の発現ベクター （ 例えば、 rpichia Expression Kitj ( In vitrogen社製）、 pNVU、 SP-Q01) 、 枯草菌由来の発現ベクター (例えば、 pPL608、 pKTH50) が挙げられる。
CH0細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、 細胞内で発現させるために必要なプロモーター、 例えば SV40プロモー夕一 （M ulliganら， Nature ( 1979) 277, 108) 、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1ひプロモ 一夕一 （Mizushimaら， Nucleic Acids Res. ( 1990) 18, 5322) 、 C Vプロモ一 夕一などを持つていることが不可欠であり、 細胞への形質転換を選抜するための 遺伝子 （例えば、 薬剤 （ネオマイシン、 G418など） により判別できるような薬 剤耐性遺伝子） を有すればさらに好ましい。 このような特性を有するベクターと しては、 例えば、 p匪、 pDR2、 pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSVヽ p0P13などが挙げら れる。
さらに、 遺伝子を安定的に発現させ、 かつ、 細胞内での遺伝子のコピー数の増 幅を目的とする場合には、 核酸合成経路を欠損した CH0細胞にそれを相補する D HFR遺伝子を有するベクター （例えば、 pCHOIなど） を導入し、 メ トトレキセー ト （MTX) により増幅させる方法が挙げられ、 また、 遺伝子の一過性の発現を目 的とする場合には、 SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を 用いて SV40の複製起点を持つベクター （pcDなど） で形質転換する方法が挙げ られる。 複製開始点としては、 また、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥ シパピローマウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることもできる。 さらに、 宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクタ一は選択マ一カーとして、 アミノグリコシドトランスフェラ一ゼ （APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラ一ゼ （Ecogpt ) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
一方、 動物の生体内で本発明の DNAを発現させる方法としては、 本発明の DNA を適当なベクターに組み込み、 例えば、 レトロウイルス法、 リボソーム法、 カチ ォニックリポソ一ム法、 アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法など が挙げられる。 これにより、 本発明のトランスポーター遺伝子の変異に起因する 疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。 用いられるベクターとしては 、 例えば、 アデノウイルスベクター （例えば pAdexlcw) やレトロウイルスべク 夕一 (例えば pZIPneo) などが挙げられるが、 これらに制限されない。 ベクタ一 への本発朋の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、 常法に従って行うことが 可能である （Molecular Cloning , 5.61-5.63) 。 生体内への投与は、 ex vivo法 であっても、 in vivo法であってもよい。
また、 本発明は、 本発明の DNAまたは本発明のベクターが導入された形質転換 細胞を提供する。 本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はな く、 例えば、 大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。 本発明の 形質転換細胞は、 例えば、 本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系とし て使用することができる。 タンパク質製造のための産生系は、 in vitroおよび i n vivo.の産生系がある。 in vitroの産生系としては、 真核細胞を使用する産生 系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、 例えば、 動物細胞、 植物細胞、 真菌細胞を宿主に用 いることができる。 動物細胞としては、 哺乳類細胞、 例えば、 CHO (J. Exp. Med . ( 1995) 108, 945)、 COS、 3T3、 ミエ口一マ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero、 両生類細胞、 例えばアフリカヅメガエル卵母細胞 （Valle, et al .， Nature ( 1981 ) 291, 358-340) 、 あるいは昆虫細胞、 例えば、 Sf9、 Sf21、 Tn5 が知られている。 CH0細胞としては、 特に、 DHFR遺伝子を欠損した CH0細胞であ る dhfr-CHO (Proc. Natl . Acad. Sci . USA ( 1980) 77, 4216-4220) や CHO K-l (Proc. Natl . Acad. Sci. USA ( 1968) 60, 1275) を好適に使用することができ る。 動物細胞において、 大量発現を目的とする場合には特に CH0細胞が好ましい 。 宿主細胞へのベクターの導入は、 例えば、 リン酸カルシウム法、 DEAEデキス トラン法、 カチォニックリボソーム D0TAP (ベーリンガーマンハイム社製） を用 いた方法、 エレクト口ポレーシヨン法、 リポフエクシヨンなどの方法で行うこと が可能である。 得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精製は、 常法、 例 えば、 文献 「The Qiaexpressionist handbook, Qiagen, Hi 1 den, Germany」 記載の 方法を用いて行うことが可能である。
植物細胞としては、 例えば、 ニコチアナ '夕バカム （Nicotiana tabacum) 由 来の細胞がタンパク質生産系として知られており、 これをカルス培養すればよい 。 真菌細胞としては、 酵母、 例えば、 サッカロミセス （Saccharomyces) 属、 例 えば、 サッカロミセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae) 、 糸状菌、 例 えば、 ァスペルギルス （Aspergillus) 属、 例えば、 ァスペルギルス ·ニガ一 （A spergillus niger) が知られている。
原核細胞を使用する場合、 細菌細胞を用いる産生系がある。 細菌細胞としては 、 大腸菌 （E. coli) 、 例えば、 JM109、' DH5ひ、 HB101等が挙げられ、 その他、 枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とする DNAにより形質転換し、 形質転換された細胞を in vitroで培養することによりタンパク質が得られる。 培養は、 公知の方法に従い 行うことができる。 例えば、 動物細胞の培養液として、 例えば、 DMEM、 MEM, RPM 11640、 IMDMを使用することができる。 その際、 牛胎児血清 （FCS) 等の血清補 液を併用することもできるし、 無血清培養してもよい。 培養時の pHは、 約 6〜8 であるのが好ましい。 培養は、 通常、 約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、 必要 に応じて培地の交換、 通気、 攪拌を加える。
一方、 in vivoでタンパク質を産生させる系としては、 例えば、 動物を使用す る産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。 これらの動物又は植物に S的と する DNAを導入し、 動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、 回収する。 本 発明における 「宿主」 とは、 これらの動物、 植物を包含する。
動物を使用する場合、 哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。 哺乳類動物と しては、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 マウス、 ゥシを用いることができる （Vicki Glas er, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993) 。 また、 哺乳類動物を用い る場合、 トランスジエニック動物を用いることができる。
例えば、 目的とする DNAを、 ャギ ?カゼインのような乳汁中に固有に産生され るタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。 次いで、 この 融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ移植する。 胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する 乳汁から、 目的のタンパク質を得ることができる。 トランスジエニックャギから 産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、 適宜ホルモンをトラン スジエニックャギに使用してもよい （Ebert， K.M. et al .， Bio/Technology ( 19 94) 12, 699-702) 。
また、 昆虫としては、 例えばカイコを用いることができる。 カイコを用いる場 合、 目的のタンパク質をコ一ドする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに 感染させることにより、 このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることがで きる (Sus醒, M. et al.， Nature ( 1985) 315， 592-594) 。
さらに、 植物を使用する場合、 例えばタバコを用いることができる。 タバコを 用いる場合、 目的とするタンパク質をコードする DNAを植物発現用ベクター、 例 えば pMON 530に揷入し、 このべクタ一をァグロバクテリウム ·ッメファシェン ス （Agrobacterium tumefaciens) のようなバクテリアに導入する。 このバクテ リアをタバコ、 例えば、 ニコチアナ '夕バカム （Nicotiana tabacum) に感染さ せ、 本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる （Julian Κ· - a et al .， Eur. J. Immunol . ( 1994) 24, 131-138) 。 これにより得られた本発明のタンパク質は、 形質転換細胞内または細胞外 （培 地など） から単離し、 実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することがで きる。 タンパク質の分離、 精製は、 通常のタンパク質の精製で使用されている分 離、 精製方法を使用すればよく、 何ら限定されるものではない。 例えば、 クロマ トグラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 溶媒沈殿、 溶媒抽出、 蒸留 、 免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 等電点電気泳動法、 透析、 再結晶等を適宜選択、 組み合わせればタンパク質を分離、 精製することができる o
クロマトグラフィーとしては、 例えばァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 ィ オン交換ク口マトグラフィ一、 疎水性ク口マトグラフィー、 ゲル濾過、 逆相ク口 マトグラフィ一、 吸着クロマトグラフィ一等が挙げられる （Strategies for Pro tein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual . Ed D aniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996) 。 こ れらのクロマトグラフィーは、 液相クロマトグラフィー、 例えば HPLC、 FPLC等 の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。 本発明は、 これらの精製 方法を用い、 高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、 タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させ ることにより、 任意に修飾を加えたり部分的にぺプチドを除去することもできる 。 タンパク質修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 リシル エンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グルコシダーゼなどが用いられる。 本発明は、 また、 本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。 本発明の抗 体の形態には、 特に制限はなく、 ポリクローナル抗体の他、 モノクローナル抗体 も含まれる。 また、 ゥサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た 抗血清、 すべてのクラスのポリクロ一ナル抗体およびモノクローナル抗体、 さら にヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。 抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、 その由来となる 動物種に制限されないが哺乳動物、 例えばヒト、 マウス又はラット由来のタンパ ク質が好ましく、 特にヒト由来のタンパク質が好ましい。 ヒト由来のタンパク質 は、 本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができ る。
本発明において、 感作抗原として使用されるタンパク質は、 完全なタンパク質 であってもよいし、 また、 タンパク質の部分ペプチドであってもよい。 タンパク 質の部分ペプチドとしては、 例えば、 タンパク質のアミノ基 （N) 末端断片や力 ルポキシ （C) 末端断片が挙げられる。 本明細書で述べる 「抗体」 とはタンパク 質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現べクタ一系 に挿入し、 該ベクタ一で本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、 該形質転換 細胞内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、 これらを感作 抗原として用いればよい。 また、 タンパク質を発現する細胞又はその溶解物ある いは化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般的に は、 げっ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター等が使用され る。 ゥサギ目の動物としては、 例えば、 ゥサギが使用される。 霊長目の動物とし ては、 例えば、 サルが使用される。 サルとしては、 狭鼻下目のサル （旧世界ザル ) 、 例えば、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マントヒヒ、 チンパンジー等が使用さ れ
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 一般的方 法としては、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。 具体的には、 感 作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline) や生理食塩水等で適当量に希釈、 懸濁したものに対し、 所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイント完全 アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳動物に投与する。 さらに、 その後、 フ 口イント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、 4-21日毎に数回投与 することが好ましい。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができ る。 このように免疫し、 血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確 。、 9 る o
ここで、 本 ¾明のタンパク質に対するポリクロ一ナル抗体を得るには、 血清中 の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、 抗原を感作した哺乳動物の血 液を取り出す。 この血液から公知の方法により血清を分離する。 ポリクローナル 抗体としては、 ポリクロ一ナル抗体を含む血清を使用してもよいし、 必要に応じ この血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、 これを使用して もよい。 例えば、 本発明のタンパク質をカップリングさせたァフィ二ティーカラ ムを用いて、 本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、 さらにこの画分を プロテイン Aあるいはプロティン Gカラムを利用して精製することにより、 免疫 グロブリン Gあるいは Mを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、 上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望 の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、 哺乳動物から免疫細胞を取り出し、 細胞融合に付せばよい。 この際、 細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として 、 特に脾細胞が挙げられる。 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、 好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、 より好ましくは、 薬剤による融合細胞選 別のための特性を獲得したミエ口一マ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、 例えば、 ミルスティンらの方法（Galfre， G. and Milstein, C , Methods Enzymol . ( 1981 ) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。 細胞融合により得られたハイプリ ド 一マは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT培養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテ リンおよびチミジンを含む培養液） で培養することにより選択される。 当該 HAT 培養液での培養は、 目的とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅 するのに十分な時間、 通常、 数日〜数週間継続して行う。 次いで、 通常の限界希 釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスクリーニングおよ びクロ一ニングを行う。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリ ドーマを得る他に、 ヒ卜 リンパ球、 例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroでタンパク質 、 タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久 分裂能を有するミエローマ細胞、 例えば U266と融合させ、 タンパク質への結合 活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイプリ ドーマを得ることもできる （特 閧昭 63-17688号公報） 。
次いで、 得られたハイプリ ドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水 を回収し、 得られたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫安沈殿、 プロテイン A、 プロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 本発明のタンパク 質をカツプリングしたァフィ二ティ一カラムなどにより精製することで調製する ことが可能である。 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質の精製、 検出に用いら れる他、 本発明のタンパク質のァゴニストやアン夕ゴニス卜の候補になる。 また 、 この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考 えられる。 得られた抗体を人体に投与する目的 （抗体治療） で使用する場合には 、 免疫原性を低下させるため、 ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、 ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗 原となるタンパク質、 タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細 胞を取得し、 これをミエローマ細胞と融合させたハイプリ ドーマを用いてタンパ ク質に対するヒト抗体を取得することができる （国際公開番号 W092-03918、 W09 3-2227、 W094- 02602、 W094- 25585、 W096- 33735および W096-34096参照） 。
ハイプリ ドーマを用いて抗体を産生する以外に、 抗体を産生する感作リンパ球 等の免疫細胞を癌遺伝子 （oncogene) により不死化させた細胞を用いてもよい。 このように得られたモノクローナル抗体はまた、 遺伝子組換え技術を用いて産 生させた組換え型抗体として得ることができる （例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. Wリ THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。 組換え型抗体は 、 それをコードする DNAをハイプリ ドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の 免疫細胞からクローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入 し産生させる。 本発明は、 この組換え型抗体を包含する。
さらに、 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質に結合する限り、 その抗体断片 や抗体修飾物であってよい。 例えば、 抗体断片としては、 Fab、 F(ab' )2、 Fv又 は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカーで連結させたシングルチェイン Fv(scFv) ( Huston, J. S. et al . , Proc. Natl . Acad. Sci. U. S.A. ( 1988) 85, 5879-5883 ) が挙げられる。 具体的には、 抗体を酵素、 例えば、 パパイン、 ペプシンで処理 し抗体断片を生成させるか、 又は、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し 、 これを発現ベクターに導入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co , M. S. et al . , J. Immunol . ( 1994) 152, 2968-2976 ； Better, . and Horwi tz， A. H.， Methods Enzymol. ( 1989) 178， 476-496 ； Pluckthun, A. and Sker ra, Aリ Methods Enzymol . ( 1989) 178, 497-515 ； Lamoyi, E.， Methods Enzym ol. ( 1986 ) 121, 652-663 ； Rousseaux, J. et al . , Methods Enzymol . ( 1986) 121, 663-669 ； Bird, R. E. and Walker, B. W. , Trends Biotechnol . ( 1991 ) 9, 132- 137参照）。
抗体修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合した 抗体を使用することもできる。 本発明の 「抗体」 にはこれらの抗体修飾物も包含 される。 このような抗体修飾物を得るには、 得られた抗体に化学的な修飾を施す ことによって得ることができる。 これらの方法はこの分野において既に確立され ている。 また、 本発明の抗体は、 公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒ ト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来の CDR (相補性決 定領域） とヒト抗体由来の FR (フレームワーク領域） 及び定常領域からなるヒ ト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、 均一にまで精製することができる。 本発明で使 用される抗体の分離、 精製は通常のタンパク質で使用されている分離、 精製方法 を使用すればよい。 例えば、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等のクロマトグ ラフィーカラム、 フィルター、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動、 等電点電気泳動等を適宜選択、 組み合わせれば、 抗体を分離、 精 製することができる (Antibodies ： A Laboratory Manual . Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) が、 これらに限定されるもので はない。 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検 定法（Enzyme- linked immunosorbent assay； EL ISA) 等により行うことができる o
ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、 プロティン A力 ラム、. プロテイン Gカラムが挙げられる。 例えば、 プロテイン Aカラムを用いた カラムとして、 Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる ο
ァフィ二ティークロマトグラフィ一以外のクロマトグラフィ一としては、 例え ば、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性ク口マトグラフィ一、 ゲル濾過、 逆 相クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies fo r Protein Purification and Characterization ： A Laboratory Course Manual . Ed Daniel R. Marshak et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 )。 これらのクロマトグラフィーは HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用 いて行うことができる。 また、 本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 例えば、 吸光度の 測定、 酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme-linked immunosorbent assay； EL ISA) 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測定法） あるいは蛍光抗体法を用いる ことができる。 ELISAを用いる場合、 本発明の抗体を固相化したプレートに本発 明のタンパク質を添加し、 次いで目的の抗体を含む試料、 例えば、 抗体産生細胞 の培養上清や精製抗体を加える。 酵素、 例えば、 アルカリフォスファターゼ等で 標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレートをインキュベーションし、 次いで洗浄した後、 P-ニトロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定 することで抗原結合活性を評価することができる。 タンパク質としてタンパク質 の断片、 例えばその C末端からなる断片あるいは N末端からなる断片を使用して もよい。 本発明の抗体の活性評価には、 BIAcore(Pharmacia製）を使用すること ができる。
これらの手法を用いることにより、 本発明の抗体と試料中に含まれる本発明の タンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、 該抗体と該タンパク質 との免疫複合体を検出又は測定することからなる、 本発明のタンパク質の検出又 は測定方法を実施することができる。 本発明のタンパク質の検出又は測定方法は 、 タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、 タンパク質を用い た種々の実験等に有用である。
本発明はまた、 ヒト 「0ATP- B」、 「0ATP- C」、 「0ATP-D」 、 または 「0ATP- E」 タンパク質をコードする MA (配列番号： 1、 3、 5、 または 7 ) またはその相 補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する ここで 「相補鎖」 とは、 A:T、 G:Cの塩基対からなる 2本鎖 DNAの一方の鎖に 対する他方の鎖を指す。 また、 「相補的」 とは、 少なくとも 15個の連続したヌ クレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、 少なくとも 70%、 好ま しくは少なくとも 80%、 より好ましくは 90%、 さらに好ましくは 95%以上の塩基 配列上の相同性を有すればよい。 相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細 書に記載したものを使用すればよい。
このような DNAには、 本発明の夕ンパク質をコードする DNAの検出や増幅に用 いるプローブやプライマー、 本発明のタンパク質の発現を抑制するためのヌクレ ォチド又はヌクレオチド誘導体 （例えば、 アンチセンスオリゴヌクレオチドゃリ ボザィム等） が含まれる。 また、 このような DNAは、 DNAチヅプの作製に利用す ることもできる。
プライマーとして用いる場合、 3'側の領域を相補的にして、 5'側には制限酵素 認識配列や夕グなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 例えば、 配列番号： 1、 3、 5、 または 7の塩基配列中のレ、ずれかの箇所にハイブリダィズするアンチセンスオリ ゴヌクレオチドが含まれる。 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 好ましく は配列番号： 1、 3、 5、 または 7の塩基配列中の連続する少なくとも 15個以 上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 さらに好ま しくは、 連続する少なくとも 15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含む アンチセンスォリゴヌクレオチドとしては、 それらの誘導体や修飾体を使用す ることができる。 修飾体として、 例えばメチルホスホネート型又はェチルホスホ ネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、 ホスホロチォエート修飾体 又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA又は mRNAの所定の領域を構成する ヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、 DN A または mRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号： 1、 3、 5、 または 7に示 される塩基配列に特異的にハイプリダイズできる限り、 1又は複数個のヌクレオ チドのミスマッチが存在していてもよい。 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 本発明のタンパク質の産 生細胞に作用して、 該タンパク質をコ一ドする MA又は m Aに結合することに より、 その転写又は翻訳を阻害したり、 mRNAの分解を促進したりして、 本発明 のタンパク質の発現を抑制することにより、 結果的に本発明のタンパク質の作用 を抑制する効果を有する。
本究明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、 それらに対して不活性な 適当な基剤と混和して塗布剤、 パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、 必要に応じて、 賦形剤、 等張化剤、 溶解補助剤、 安定化剤、 防腐剤、 無 痛化剤等を加えて錠剤、 散財、 顆粒剤、 カプセル剤、 リボソームカプセル剤、 注 射剤、 液剤、 点鼻剤など、 さらに凍結乾燥剤とすることができる。 これらは常法 にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスォリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用する か、 又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用 する。 さらには、 持続性、 膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いること もできる。 例えば、 リボソーム、 ポリ- L-リジン、 リビヅド、 コレステロール、 リポフエクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、 患者の状態に応 じて適宜調整し、 好ましい量を用いることができる。 例えば、 0. 1 〜100mg/kg、 好ましくは 0. 1 〜50mg/kg の範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害 し、 従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用であ る。 また、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、 本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である 本発明の応用としては、 本発明のトランスポータータンパク質を利用した、 薬 物の体内吸収、 体内動態の制御が挙げられる。 本発明のトランスポー夕一タンパ ク質の基質特異性を詳細に解析することにより、 このトランスポーターによって 輸送され得る薬剤のドラッグデザィンが可能であり、 これにより本発明のトラン スポ一夕—タンパク質を介して薬物の体内吸収を高めることができると考えられ る。 デザィンされる薬物には従来の脂溶性をあげるような修飾は不要であるため 、 水溶性の扱いやすい薬物が迅速かつ効率的に開発できるようになると考えられ る。 また開発された薬物の吸収は基本的に本発明のトランスポー夕一夕ンパク質 の生体内分布に従うと考えられるため、 臓器特異的な薬物の送達が可能である。 特に本発明のトランスポー夕一夕ンパク質の体内分布が、 標的臓器と一致するよ うな薬物の場合、 理想的なドラッグデリパリ一システム（DDS)となると考えられ る。 また、 他のトランスポー夕一による薬物の吸収を期待しているが、 本発明の トランスポ一夕一タンパク質による吸収は望ましくない場合、 本発明のトランス ポー夕一夕ンパク質の基質特異性を考慮に入れたドラッグデザィンを行うことに より、 他のトランスポー夕一夕ンパク質に選択的な薬物の創造が行えると考えら れる。 例えば、 0ATP-Eは様々な固形癌細胞に高発現しているが、 血球系細胞で は極めて発現が少ないことが判明した。 0ATP- E遺伝子を用レ、たスクリーニング 系を構築し、 これを用いたスクリーニングを行うことにより 0ATP- Eにより特異 的に細胞内へ取り込まれる抗癌剤を得ることができれば、 それは血球系細胞に対 する障害が軽減された抗癌剤となり得ることが期待される。
本発明のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物のスクリー二 ングは、 例えば、 以下のように行うことができる。 まず、 本発明のタンパク質を 細胞膜上に発現する細胞を提供する。 例えば、 本発明のタンパク質を発現するべ クタ一を構築し、 これを適当な細胞に導入すればよい。 次いで、 該細胞に対し、 標識された被検ィ匕合物を接触させる。 被検化合物としては、 例えば、 低分子化合 物を用いることができる。 被検化合物の標識としては、 検出可能であれば特に制 限はなく、 例えば、 放射標識、 蛍光標識などが挙げられる。 次いで、 該細胞内に 取り込まれた、 標識された被検化合物を検出する。 検出は、 放射標識化合物の場 合は、 液体シンチレーシヨンカウンタ一などによる放射活性の測定、 蛍光標識化 合物の場合は蛍光光度計などによる蛍光光度の測定により行うことができる。 ま た、 標識化合物を使わない場合においても、 本発明のタンパク質により細胞内へ 取り込まれた化合物の生物活性 （例えば細胞毒性、 細胞増殖促進活性） などを指 標にしたバイオアツセィにより輸送量を測定することができる。 次いで、 上記検 出の結果、 該細胞内に取り込まれる化合物を選択する。 具体的には、 このスクリ 一二ングは、 例えば、 実施例 3に記載の輸送活性の検出系を利用して行うことが できる。 これにより単離された化合物は、 上述した薬物の創造に利用することが できる。
また、 他の本発明の応用としては、 本発明のトランスポータータンパク質を標 的とした薬物の開発が考えられる。 栄養物質や薬物の吸収機構として、 あるいは 薬物や生体内代謝物の排泄機構としてのトランスポーターの重要性を考えると、 その機能が損なわれること、 または異常に亢進することに起因する疾患が存在す ると考えられる。 そのような疾患に対しては、 本発明のトランスポ一夕一タンパ ク質の機能を阻害、 あるいは亢進する化合物や、 本発明のトランスポーター遺伝 子の発現量や、 タンパク量を調節するするような化合物を薬剤として用いると効 果的であると考えられる。
本発明のタンパク質のトランスポー夕一活性を促進または阻害する化合物のス クリーニングは、 例えば、 以下のように行うことができる。 まず、 本発明のタン パク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する。 次いで、 該細胞に対し、 被検化合 物および本発明のタンパク質により輸送される標識された有機化合物を接触させ る。 用いられる有機化合物としては、 例えば、 エストラジオール- 17B-グルクロ ナイ ド、 エストロン- 3-スルフェート、 ベンジルペニシリン、 プロスタグランジ ン E2などが挙げられるが、 これらに制限されない。 次いで、 該細胞内に取り込 まれた、 標識された有機化合物の量を測定する。 次いで、 被検化合物非存在下に おいて同様に測定した場合 （対照） と比較して、 該細胞内に取り込まれる標識さ れた有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択する。 具体的には、 こ のスクリーニングは、 例えば、 実施例 3に記載の輸送活性の検出系を利用して行 うことができる。 この結果、 被検化合物の接触により、 該細胞内に取り込まれる 標識された有機化合物の量が増加すれば、 該化合物は本発明の夕ンパク質の有機 化合物を輸送する活性を促進すると判定される。 一方、 被検化合物の接触により 、 該細胞内に取り込まれた標識された有機化合物の量が減少すれば、 該化合物は 本発明のタンパク質の有機化合物を輸送する活性を阻害すると判定される。 本発明のスクリーニングにより得られる化合物は、 本発明タンパク質を利用し た薬剤治療や、 本発明のタンパク質による物質輸送の制御を介した治療などへの 応用が考えられる。 本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 そ の構造の一部を、 付加、 欠失及び/又は置換により変換してもよい。
本発明の夕ンパク質に結合する化合物や本発明の夕ンパク質およびその部分べ プチドをヒトゃ哺乳動物、 例えばマウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ニヮト リ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーの医薬 として使用する場合には、 夕ンパク質や単離された化合物自体を直接患者に投与 する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である 。 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイク 口カプセル剤として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得 る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。 例え ば、 薬理学上許容される担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防 腐剤、 結合剤などと適宜組み合わせて、 一般に認められた製薬実施に要求される 単位用量形態で混和することによつて製剤化することが考えられる。 これら製剤 における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするもので ある。 錠剤、 カプセル剤に混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 —スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸のような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖又はサヅカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油又はチェリ一のような香味剤が用いられる 。 調剤単位形態が力プセルである場合には、 上記の材料にさらに油脂のような液 状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のよう なべヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、 例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液、 例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、 塩化ナト リウムが挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えばアルコール、 具体的にはェタノ一 ル、 ポリアルコール、 例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコ一ル、 非イオン性界面活性剤、 例えばポリソルベート 80 (TM)、 HCO-50と併用しても よい。
油性液としてはゴマ油、 大豆油があげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。 また、 緩衝剤、 例えばリン酸塩緩衝 液、 酢酸ナトリウム緩衝液、 無痛化剤、 例えば、 塩酸プロ力イン、 安定剤、 例え ばべンジルアルコール、 フエノール、 酸化防止剤と配合してもよい。 調製された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などのほか、 鼻 腔内的、 経気管支的、 筋内的、 経皮的、 または経口的に当業者に公知の方法によ り行いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当 業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNAによりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用ベクタ一に組込 み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年 齢、 症状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である 本発明の DNAは、 本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患 に対する遺伝子治療への応用も考えられる。 遺伝子治療に用いる場合には、 本発 明の DNAをアデノウイルスベクター （例えば、 pAdexLcw) やレトロウイルスべク 夕一 （例えば、 pZIPneo) などに挿入して、 生体内に投与する。 投与方法は、 ex vivo法であっても、 in vivo法であってもよい。 また、 アンチセンス合成 DNAを 生体内に直接、 または上記ベクターに挿入して投与して治療を行うことも考えら れる。 また、 本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患の診断 への応用も考えられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 RT-PCR法により、 ヒト胎児組織、 および成体組織における各 0ATPフ アミリー遺伝子の発現を調べた結果を示す写真である。 1 . 胎児脳、 2 . 胎児心 臓、 3 . 胎児腎臓、 4 . 胎児肝臓、 5 . 胎児肺、 6 . 胎児骨格筋、 7 . 胎児脾臓 、 8 . 胎児胸腺、 9 . 成体脾臓、 1 0 . 成体腎臓、 1 1 . 成体骨格筋、 1 2 . 成 体肝臓、 1 3 . 成体肺、 1 4 . 成体胎盤、 1 5 . 成体脳、 1 6 . 成体心臓、 1 7 . 成体末梢血白血球、 1 8 . .成体大腸、 1 9 . 成体小腸、 2 0 . 成体卵巣、 2 1 . 成体精巣、 2 2 . 成体前立腺、 2 3 . 成体胸腺、 2 4 . 成体脾臓、 2 5 . 成体 骨髄、 2 6 . 成体リンパ節、 2 7 . 成体扁桃腺。
図 2は、 RT- PCR法により、 ヒト癌細胞における各 0ATPファミリー遺伝子の発 現を調べた結果を示す写真である。 1 . 乳癌細胞 （GI- 101) 、 2 . 肺癌細胞 （L X-1) 、 3 . 大腸腺腫細胞 （CX-1) 、 4 . 肺癌細胞 （GI- 117) 、 5 . 前立腺腫細 胞 （PC3) 、 6 . 大腸腺腫細胞 （GI- 112) 、 7 . 卵巣癌細胞 (GI-102) 、 8 . 膝 臓腺腫細胞 (GI-103) 図 3は、 各種ラベル体に対する卜ランスポート実験の結果を示す図である。 OA TP- Cを導入した HEK293細胞 （0ATP-C) 、 およびベクターのみを導入した HEK293 細胞 （モック） における各種ラベル体の輸送活性を表す。
図 4は、 0ATP- Cを発現させた HEK293細胞の各種濃度における PCGの輸送活性 を示す図である。
図 5は、 0ATP- Cを発現させた HEK293細胞の PCG輸送活性に対する各種/?ラク タム系抗生物質の影響を示す図である。 コントロール （阻害剤無し） における活 性を 100%として表してある。
図 6は、 エストラジオール- 17 ?-グルクロナイ ド輸送活性におけるナトリウム イオン、 および塩素イオンの要求性を示す図である。 「0ATP- C」 は 0ATP- Cを導 入した HEK293細胞、 および 「モック」 はべクタ一のみを導入した HEK293細胞に おけるエストラジオール- 17 ?-グルクロナイ ドの輸送活性をそれぞれ表す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、 本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。 一般的な分子生物学的な実験操作に関しては、 基本 的に、 Sambrook, J.、 Fritsch, E.F.、 Maniatis, T.著 「Molecular Cloningj Co Id Spring Harbor Lab. (1989) などの一般的な実験書に記載の方法に従った。
[実施例 1 ] OATP- B , C , Dおよび E遺伝子の全オーブンリーディングフレー ム（0RF )を含む cDNAのクローニング
QATP-B
ヒト OATP- Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコ一ドし得る ESTである W1 9504および AI052501の塩基配列をもとに、 それぞれ 0ABE-1プライマ一 （5' ga t aag ctt ctg tgt ggc cca aga aga act gac 3，/配列番号： 9 ) および 0ABE- 6プライマー (5， gat aag ctt tac tgc tgt ggc tgc tac tct tgg 3，/配列番 号： 1 0 ) を作製した。 これらのプライマ一を用い、 ヒト成体脳 polyA+ RNA由 来 cDNAを錶型として PCRを行い、 全 ORFを含む OATP-B cDNAを増幅した。 PCR により増幅した OATP- B cDNAをブラィマーに付加した Hind 111サイ トにより切 断し、 哺乳動物細胞用発現べクタ一である PCDNA3ベクター（ Invitrogen社）の Hi nd I I Iサイ 卜に組み込んだ。 複数のクローンをシークェンシングすることによ り PCRエラーの無いクローン （pcDNA3/0ATP-B) を選択し、 発現実験に用いた。 QATP-C
ヒト 0ATP-Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコ一ドし得る以下の ESTの 塩基配列からそれぞれのプライマーを作製した。
EST H62893； 2893-4プライマー （5， aag ctt ccg tea ata aaa cca aca 3，/ 配列番号： 1 1 ) および 2893- 1プライマー （5， ctt etc ttg ttg gtt tta ttg acg 3' /配列番号 : 1 2 )
EST R29414； 9414-2プライマー （5， tgt aag tta ttc cat tgt ttc cac 3' / 配列番号： 1 3 )
EST T73863； 3863-1プライマー （5， ttg gtg ctt tta ctt atg tct tea 3，/ 配列番号： 1 4 )
これらのプライマ一を用い、 3つの断片に分けヒト 0ATP-Cのクローニングを 行った。
5，側断片は、 5， RACE (Rapid Amplification cDNA Ends) 法によりクローニン グした。 すなわち、 ヒト胎児肝臓由来 Marathon- Ready™ cDNA (CL0NTECH社） を 銪型とし、 キヅ卜に附属のリンカープライマーである APIプライマーと 2893-4 プライマーとの組み合わせによる PCRを行い、 ヒト OATP-C cDNAの 5，側断片、 約 400bpを増幅した。 この cDNA断片を pT7Blue-Tベクタ一 （Novagen社） に TA クロ一ニング法により組み込み、 得られたサブクローンを複数シークェンシング することによりヒト OATP- C cDNAの 5'側の配列を決定した。 また、 3'側も同様 に 3' RACE法によりクロ一ニングした。 すなわち、 ヒト胎児肝臓由来 Marathon- Ready™ cDNAを錡型とし、 キヅ卜に附属のリンカ一プライマ一である APIプライ マーと 3863-1プライマ一との組み合わせの PCRによりヒ卜 OATP-C cDNAの 3，側 断片、 約 1.5kbpを増幅した。 この cDNA断片を pT7Blue- Tベクターに TAクロ一 ニング法により組み込み、 得られたサブクローンを複数シークェンシングするこ とによりヒト 0ATP- C cDNAの 3'側の配列を決定した。 さらにこれらの間に挟ま れる中央部は、 ヒト成体肝臓由来 cDNAを鎵型とし、 2893- 1プライマーと 9414-2 プライマーとの組み合わせによる PCRにより増幅した。 得られた役 1.2kbpの断 片をゲル濾過法により精製し、 直接シークェンシングすることにより配列を決定 した。 この様にして得られた配列を組み合わせることにより、 ヒト OATP- Cの全 0RFを含む cDNAの配列を決定した。
発現用のプラスミ ドは以下のようにして構築した。 すなわち、 ヒト成体肝臓由 来 cDNAを錶型とし、 以下のプライマーの組み合わせによる PCRによりヒト 0AT P-Cを 2つの断片に分け増幅した。
5，側
0AHC17プライマ—— (5， gat ggt acc aaa ctg age ate aac aac aaa aac 3- /酉己 列番号： 1 5 )
0AHC18プライマ—— (5， gat ggt acc cat cga gaa tea gta gga gtt ate 3，/酉己 列番号： 1 6 )
3，側 .
0AHC21プライマー (5， gat ggt acc tac cct ggg ate tct gtt ttc taa 3，/酉己 列番号： 1 7 )
0AHC22プライマ—— (5， gat ggt acc gtt tgg aaa cac aga age aga agt 3，/酉己 列番号： 1 8 )
これらの断片をそれぞれ pT7Blue- Tベクタ一にサブクローニングし、 PCRエラ —のないクローンを選択した。 重なり合う領域に存在する Bgl I Iサイ 卜で両者 を連結した後、 両端に存在する Kpn Iサイ 卜で切断し、 pcDNA3ベクタ一の Κρη I サイ 卜に組み込み、 発現用プラスミ ド pcDNA3/0ATP-Cを得た。 OATP-D
ヒト OATP-Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコ一ドし得る EST AA280224 から 0224-3プライマ一 （5， cgc cct cgt ggt ttt tga tgt age 3，/配列番号： 1 9 ) を作製した。 さらに、 ヒト第 15番染色体 q26. 1 領域由来の PACクローン (PDJ430il9) の配列の一部もヒ卜 OATP- Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列を コードし得ることを見いだした。 この配列から PAC15卜 2プライマ一 （5' gcg gt g cct tac tct tct tct ctt 3' /配列番号： 2 0 ) を作製した。 ヒト成体脳由来 cDNAを銪型とし、 これらのプライマーを用いた PCRを行ったところ約 l . lkbpの cDNA断片が増幅された。 これをプローブとし、 ヒト成体腎臓由来 5' -STRETCH PL US cDANライブラリー （CLONTECH社） に対しプラークハイブリダィゼ一シヨン法 によるスクリーニングを行った。 得られたポジティブクローンのファージ懸濁液 を錶型とし、 上記のプライマー、 あるいは明らかになった配列から作製した 0AT P - D遺伝子特異的なプライマーと、 え gt-10ベクターの配列から作製した GT10 S 1プライマー （5， ctt ttg age aag ttc age ct 3，/配列番号： 2 1 ) 、 あるい は GT10 A1プライマ一 （5， aga ggt ggc tta tga gta ttt ctt 3，/配列番号： 2 2 ) との組み合わせによる PCRを行い、 増幅断片を直接シークェンシングする ことにより配列を決定した。 さらに、 新たに得られた領域を含む DNA断片をプロ ーブとして用いスクリーニングを行うことにより、 ファージクローンによりカノ、' 一される領域を延長していき、 全 0RFの配列を決定した。
0ATP-E
ヒト 0ATP-Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得る EST AI347130 から、 7130-1プライマ一 （5， tgt aca agg tgc tgg gcg tec tct 3' /配列番号 : 2 3 ) 、 および 7130-4プライマ一 (5， cga tcg ggt ata aaa cac att cta 3' /配列番号： 2 4 ) を作製した。 ヒト成体肺由来 cDNAを錡型とし、 これらのプ ライマーを用いた PCRを行ったところ約 400bpの cDNA断片が増幅された。 これ をプローブとし、 ヒト成体腎臓由来 5， -STRETCH PLUS cDANライブラリ一 （CL0NT E CH社） に対しプラークハイブリダィゼーシヨン法によるスクリーニングを行つ た。 得られたポジティブクローンのファージ懸濁液を銪型とし、 上記のプライマ 一、 あるいは明らかになつた配列から作製した 0ATP-E遺伝子特異的なブラィマ 一と、 え gt- 10ベクターの配列から作製した GT10 S1プライマー、 あるいは GT10 A1プライマーとの組み合わせによる PCRを行い、 増幅断片を直接シークェンシ ングすることにより配列を決定した。 さらに、 新たに得られた領域を含む DNA断 片をプローブとして用いスクリーニングを行うことにより、 ファージクローンに よりカバ一される領域を延長していき、 全 0RFの配列を決定した。
発現用のプラスミ ドは以下のようにして構築した。 すなわち、 以下のプライマ 一の組み合わせによる PCRによりヒト OATP- Eを 5'側および 3'側の つの断片に 分け増幅した。 5'側断片はヒト成体肺由来 cDNAを、 また 3'側断片はヒト胎児肺 由来 cDNAを錶型とし増幅した。
5，側
0AE17プライマー (5， gat aag ctt tgc gtg get gaa gcc tcg aag tea 3，/配 列番号： 2 5 )
0AE18プライマ—— (5， gat gga tec act ggt gca ttt ccg ccg etc tea 3， 酉己 列番号： 2 6 )
0AE21プライマ一 (5， gat aag ctt tct tea ccg ccg ttc cca tec ttg 3' /IB 列番号： 2 7 )
0AE22プライマ—— (5， gat gga tec act gtt ctg tea tea gga aat get 3， /西 3 列番号： 2 8 )
これらの断片をそれぞれ pcDNA3ベクタ一の Hind I I I / BamH Iサイ トにサブ クローニングし、 PCRエラーのないクローンを選択した。 重なり合う領域に存在 する BstP Iサイ 卜で両者を連結し、 発現用プラスミ ド pcDNA3/0ATP-Eを得た。 PCR PCRは基本的に以下に示す条件を基本とし、 適宜変更を加えて行った。
く反応液組成 >
錡型 DNA
10 X ExTaqバッファ一 （TaKaRa社） 5 1
2. 5mM dNTPs (TaKaRa社) 4ju l
ExTaq ( TaKaRa社） 0 1
TaqStart™ Antibody (CLONTECH) 0.5 / 1
センスプライマ一 10〜20pmol
アンチセンスプライマ一 10〜20pmol
/全量 50 1
く反応条件 >
一般的な PCR
94°C、 2分 （94°C、 30秒 55°C〜62°C、 30秒 72°C、 2〜3分） x 25-40 サイクル 72°C、 10分
RACE法
94° 2分→ (94°C、 30秒 68°C、 4分） x 5サイクル （94°C、 30秒 6 2°C 30秒 72°C、 2分） X 30サイクル 72° (、 10分
cDNAの合成
PCRの錡型として用いる cDNAは、 SUPERSCRIPT™ I I RNase H— 逆転写酵素 (GI BCO BRL社） を用い、 メーカ一推奨の一般的な方法に従って作製した。 すなわち 、 10 /gの全 A、 あるいは 2 gのポリ A+ RNAと、 約 l gのオリゴ dTプライ マ一 （GIBCO BRL社） 、 あるいは約 0. 5〃gのランダムへキサマ一プライマ一 （G IBCO BRL社） を混合し、 70°Cで 10分加温した後氷冷した。 これに f irst strand 緩衝液 （GIBCO BRL社） 、 終濃度 lOmMの DTT、 終濃度 0. 5mMの dNTPs (GIBCO BR L社) 、 および 400U〜800Uの SUPERSCRIPT™ I I RNase H" 逆転写酵素を加え、 42 °Cで 1時間保温することにより cDNA合成を行った。 次いで 70°Cで 15分間加温 し、 その一部を錶型として使用した。
ハイブリダイゼーシヨン
PCRにより増幅した DNA断片、 あるいはァガロース電気泳動後のゲルから精製 した DNA断片などを、 Ready-to Go DNA label ling beads (Pharmacia社）を用い たランダムプライマー法により [ひ -32P ] dCTPでラベルし、 プローブとして用いた ハイブリダィゼーシヨンは、 ExpressHyb Hybridization Solution (CLONTECH 社）を用い、 メーカー推奨の方法に従い、 68°Cで 2時間以上保温することにより 行った。 ハイブリダィゼーシヨンの後、 フィルターを、 2 X SSC, 0. 1% SDS溶液 中、 室温で、 20分、 2回洗浄し、 次いで、 0. 1 X SSC, 0. 1¾ SDS溶液中、 50°Cで 、 20分、 2回の洗浄を行った。
[実施例 2 ] RT- PCR法による解析
以下に示すそれぞれの遺伝子に特異的なプライマーを用い、 RT-PCR法による 各遺伝子発現の組織分布の解析を行った。
0ATP-A
0AA-1プライマ一 (5， aag aag agg tea aga agg aaa aat 3，/配列番号： 2 9 )
OAA-2プライマー (5' gga gca tea agg aac agt cag gtc 3，/酉己列番号： 3 0 )
0ATP-B
4742-1プライマ一 （5， cgt gcg gcc aag tgt gtt cca taa 3， Z配列番号： 3 1 )
4742-2プライマ一 （5， gaa gga gta gcc cca tag cca ate 3， Z配列番号： 3 2 )
0ATP-C 9414-1プライマ一 （5， tgt cat tgt cct ttt acc tat tat 3，/配列番号： 3 3 )
9414-2プライマー （前出 5， tgt aag tta ttc cat tgt ttc cac 3，/配列番号 ： 1 3 )
OATP-D
0224-2プライマ一 （5， etc aaa tec ttc gcc ttc ate ctg 3，/配列番号： 3 4 )
0224-4プライマー （5， agg gtc aga gta gag gca aag aac 3，/配列番号： 3 5 )
OATP-E
7130-2プライマ一 （5， cac ggc ggg cac tea gca ttt cct 3，/配列番号： 3 6 )
7130- 4プライマー （前出 5' cga tcg ggt ata aaa cac att cta 3，/配列番号 ： 2 4 )
G3PDH
Upstreamプライマ一 （5， TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT 3，/配列番号： 3 7 ) Downstreamプライマー （5， CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC 3，/配列番号： 3 8 ) Multiple Tissue cDNA (MTC™) Panel (CLONTECH社） に含まれる、 各種臓器、 細胞由来の cDNAの適当量を銪型として用い、 上記プライマ一を用いて PCRを行 つた。 増幅産物をァガロース電気泳動し解析を行った （図 1、 図 2 ) 。 0ATP - A は脳、 肝臓に比較的局限した発現パターンを示した。 また、 OATP- Cは胎児組織 においても成体組織においても、 肝臓に発現が局限していることが明らかとなつ た。 0ATP-B、 OATP-D, 0ATP-Eは比較的広範囲の組織において発現が見られたが 、 特に、 OATP- B、 0ATP-Eにおいては末梢血白血球や、 胸腺、 脾臓において発現 が極めて低いことが明らかとなった。 このことから、 0ATP-B、 OATP- Eは血球系 細胞における発現が低いことが強く示唆される。 一方、 癌細胞における発現を調 ベたところ （図 2 )、 0ATP-Dおよび 0ATP-Eは癌細胞において高頻度で発現して いることが明らかとなった。 この結果から、 0ATP- Eによって特異的に細胞に取 り込まれる抗癌剤を作ることが可能であれば、 それは造血細胞に対する副作用 （ 骨髄抑制など） が軽減した抗癌剤となり得ることが期待される。
[実施例 3 ] トランスポート実験
PCDNA3/0ATP-C, 及びコントロ一ルとしてィンサートを含まない pcDNA3ベクタ ― (モック） を、 リン酸カルシウム法によりヒト胎児腎臓由来細胞株 HEK293細 胞に導入した。 すなわち、 プラスミ ド DNA10〃g、 へぺス緩衝液（137mM NaCl、 5m M KC1、 0.7mM Na2HP04、 6mMデキス トロ一ス、 21mMへぺス pH7. 1 ) lml、 2M CaCl2 62.5 ζ 1を混合し、 30分以上室温で静置する事によりリン酸カルシウム共沈物 を生成させた。 10cmプレート 1枚あたり 1.5 X 106個の細胞を蒔き、 24時間培 養した後、 先のリン酸カルシウム共沈物を加え 24時間培養し、 その後 PBS (Pho sphate buffered sal ine) でプレートを洗浄し、 培地を加えさらに 24時間培養 した。
プラスミ ド DNAを導入した細胞を用いて以下の手順に従ってトランスポート実 験を行った。 プレートからラバーポリスマンを用いて細胞をはがし、 トランスポ ート緩衝液 (125mM NaC 4.8mM KC1、 5.6mM ( + ) -グルコース、 1.2mM CaCl2、 1. 2mM K¾P04、 1.2mM MgS04、 25mMへぺス pH7.4) に懸濁し、 20分間プレインキュ ベ一シヨンを行った。 ついで各種基質のラベル体 （[¾]メ ト トレキセート、 [ ] ジゴキシン、 [¾]ゥヮバイン、 [ ]プロスタグランジン E2、 [¾]ェストラジオ一 ル- 17 ? -グルクロナイ ド、 [ ]エストロン- 3-スルフェート、 [14C]PCGくべンジル ペニシリン >など） を適当量添加し、 37°Cにて一定時間インキュベートを行った 。 これを、 3M KC1層の上にシリコンオイルと液体パラフィンの混合物 （比重 =1. 022) を重層して作製したシリコンレイヤ一上に重層し、 遠心する事により細胞 を分離した。 細胞の放射活性を測定し、 細胞内へのトランスポート能とした。 な おこの際、 1 X 106個の細胞を 1ポイントとして用いた。 また、 HEK293細胞の培養は、 ダルベッコ MEM, 10% FCS (ゥシ胎児血清） を培 地とし、 5%二酸化炭素中、 37°Cで行った。
0ATP- Cを発現させた HEK293細胞における輸送活性を測定したところ、 エスト ラジオ一ル- 17 3 -グルクロナイ ド、 エストロン- 3-スルフェート、 PCGにおいて 明らかな輸送が観察された。 また、 メ トトレキセート、 ゥヮバイン、 プロスタグ ランジン E2においても弱い活性が観察された （図 3 ) 。
次に、 0ATP- Cの PCG輸送における Km (ミカエリス定数） 値を求めるために、 様々な濃度の [14C]PCGを加えた場合の取り込み量を測定した （図 4 ) 。 0ATP - C を発現させた細胞における PCGの取り込み量を Lineweaver-Burk逆数プロッ卜す ることにより、 Km値は 983±289〃Mであることが求められた。 また反応の最大 速度 Vmaxは 5.45±0.63 (nmol/mg/15 min) であることが求められた。
次に、 OATP- Cによる PCGの輸送に対する、 各種/?ラクタム系抗生物質の影響 を調べた （図 5 ) 。 4〃Mの [14C]PCGに対して各種/?ラクタム系抗生物質を lmM 添加してその輸送活性への影響を調べたところ、 セファゾリン、 セフオペラゾン 、 セフビラミ ド、 ナフシリンにおいて顕著な阻害活性が観察された。 また、 セフ ァロリジン、 セファレキシンによっても弱い阻害活性が観察された。 この結果よ り、 これらの/?ラクタム系抗生物質も、 同じ/?ラクタム系抗生物質である PCGと 同様に、 0ATPフアミリータンパクにより輸送され得ることが強く示唆される。 次に、 0ATP-Cによるェストラジオ一ル- 175-グルクロナイ ドの輸送における ナトリウムイオン、 および塩素イオンの要求性を調べた （図 6 ) 。 トランスポ一 ト緩衝液におけるナトリウムイオンを N-メチルグルカミンに変更した場合にお いても、 また、 塩素イオンをグルコネートに変更した場合においても、 エストラ ジオール- 17 ? -グルクロナイ ドの輸送は変化を受けなかった。 このことから、 OA TP- Cによる輸送はナトリウムイオン非依存的であることがわかった。 産業:上の ¾用の可直 ffi 本発明により、 新規なトランスポー夕一タンパク質およびその遺伝子が提供さ れた。 これらは、 本発明のトランスポー夕一タンパク質を介して輸送される新規 なデザィンの薬物の開発や本発明のトランスポー夕一タンパク質の発現異常や機 能異常などに起因する疾患の治療薬の開発に利用することが可能である。 さらに は遺伝子診断などの診断や遺伝子治療への応用も考えられる。 例えば、 本発明の トランスポ一夕一遺伝子の SNP診断などにより、 薬物の有効性に関する個人差を 考慮したテーラーメイ ドの治療計画が可能になる。

Claims

請求の範囲
1 . トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする下記 （a ) から （ d ) のいずれかに記載の DNA。
( a ) 配列番号： 2、 4、 6、 または 8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク 質をコードする DNA。
( b ) 配列番号： 1、 3、 5、 または 7に記載の塩基配列のコード領域を含む D
( c ) 配列番号： 2、 4、 6、 または 8に記載のアミノ酸配列において 1若しく は複数のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列か らなるタンパク質をコードする DNA。
( d ) 配列番号： 1、 3、 5、 または 7に記載の塩基配列からなる DNAとハイブ リダィズする DNA。
2 . 配列番号： 2、 4、 6、 または 8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク 質の部分べプチドをコードする DNA。
3 . 請求項 1または 2に記載の DNAが挿入されたベクター。
4 . 請求項 1若しくは 2に記載の MAまたは請求項 3に記載のベクタ一を保持 する形質転換細胞。
5 . 請求項 1または 2に記載の DNAによりコードされる夕ンパク質またはべプチ
6 . 請求項 4に記載の形質転換細胞を培養し、 該細胞またはその培養上清から 発現させたタンパク質を回収する工程を含む、 請求項 5に記載の夕ンパク質また はべプチドの製造方法。
7 . 請求項 5に記載の夕ンパク質に結合する抗体。
8 . 配列番号： 1、 3、 5、 または 7に記載の塩基配列からなる DNAまたはそ の相補鎖に相補的な少なくとも 15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
9. 請求項 5に記載のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物 をスクリーニングする方法であって、
(a) 請求項 5に記載の夕ンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に対し、 標識された披検化合物を接触させる工程、
(c) 該細胞内に取り込まれた、 標識された披検ィ匕合物を検出する工程、 および
(d) 該細胞内に取り込まれる化合物を選択する工程、 を含む方法。
10. 請求項 5に記載のタンパク質のトランスポーター活性を促進または阻害 する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) 請求項 5に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
(b) 該細胞に対し、 被検化合物および請求項 5に記載のタンパク質により輸送 される標識された有機化合物を接触させる工程、
(c) 該細胞内に取り込まれた、 標識された有機化合物の量を測定する工程、 お よび
(d) 被検化合物非存在下において測定した場合 （対照） と比較して、 該細胞内 に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択 する工程、 を含む方法。
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